ES2627744T3

ES2627744T3 - Producción de productos biofarmacéuticos a base de baculovirus sin viriones baculovíricos contaminantes

Info

Publication number: ES2627744T3
Application number: ES15168775.3T
Authority: ES
Inventors: Otto-Wilhelm Merten; Martin Marek; Monique Van Oers
Original assignee: Genethon
Current assignee: Genethon
Priority date: 2009-08-17
Filing date: 2010-08-05
Publication date: 2017-07-31
Anticipated expiration: 2030-08-05
Also published as: PT2933336T; EP3187589A2; ES2787706T3; EP3187589B1; DK2933336T3; US8993317B2; CA3050271A1; CN102686732A; ES2542740T3; PT3187589T; US20120149010A1; EP3187589A3; EP2933336A2; PL2467489T3; EP2467489B1; EP2933336A3; EP2467489A2; PL3187589T3; CA2771250A1; US11236307B2

Abstract

Procedimiento para la producción de un producto biofarmacéutico, que comprende: (a) infectar una célula de insecto productora de sustancia biofarmacéutica con al menos un baculovirus, dicho al menos un baculovirus comprende un genoma que codifica dicho producto biofarmacéutico, y (b) mantener la célula de insecto productora de sustancia biofarmacéutica en condiciones tales que se produce el producto biofarmacéutico, en donde el genoma de dicho al menos un baculovirus es deficiente para el gen vp1054 o en donde dicha célula de insecto productora de sustancia biofarmacéutica comprende un sistema de control de la expresión que permite la inactivación del gen vp1054.

Description

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puede, en particular, eliminar como se da a conocer en los ejemplos que vienen a continuación. En resumen, se pueden utilizar los sitios loxP mutantes descritos por Suzuki et al. (2005), reemplazando bien totalmente o en parte el gen esencial para el ensamblaje correcto de viriones baculovíricos por un gen indicador flanqueado por los sitios LoxP mutantes por recombinación. El gen indicador (por ejemplo, el gen que codifica la cloranfenicol acetiltransferasa (cat)) luego se escinde con la aplicación de una recombinación con la recombinasa Cre.

Esta realización se ilustra en los ejemplos que vienen a continuación y se detalla para los baculovirus cuyo genoma se ha modificado por deleción de un fragmento de 2074 pb del ORF de vp80 en el genoma de AcMNPV. Este genoma concreto no es parte de la presente invención.

Se debe observar que la construcción recombinante del genoma de baculovirus puede dar lugar a la inserción de varias secuencias como sitios de clonación o sitios de recombinación (por ejemplo, queda un sitio LoxP después de la recombinación con la recombinasa Cre). Esto es irrelevante en la medida en que el genoma resultante carezca del gen seleccionado como esencial para el ensamblaje correcto de los viriones baculovíricos.

En esta realización, en donde el genoma de al menos un baculovirus carece del gen vp1054, la producción de partículas recombinantes de baculovirus de gemación necesarias para la infección inicial de las células que producen las sustancias biofarmacéuticas requiere la aplicación de células especiales que rescatan el gen defectuoso, a saber, estas células que producen el baculovirus expresan el gen seleccionado. En otras palabras, la célula que produce el baculovirus expresa una copia que complementa el gen vp1054 que falta en el genoma del baculovirus. Por ejemplo, se podría plantear una línea celular procedente de Sf9 que produzca constitutivamente el producto del gen esencial para el ensamblaje correcto del virión de baculovirus. Esta línea de células recombinantes se utiliza para la producción de reservas de siembra de baculovirus, mientras que las líneas de células de insecto convencionales como Sf9, Sf21 o High-five, se pueden infectar con el baculovirus producido por la expresión heteróloga del producto biofarmacéutico. Por consiguiente, la invención también se refiere a una célula de insecto modificada para que exprese el gen vp1054, en donde dicho gen mutado en un baculovirus se utiliza para la producción de productos biofarmacéuticos, tal y como se define más arriba. Tal línea celular utilizada para la producción del vector baculovírico mutante construido en el procedimiento de la presente invención se denomina una «célula productora de baculovirus». Cuando el genoma del baculovirus carece de un gen esencial para el ensamblaje correcto de viriones baculovíricos, la célula de insecto productora de baculovirus debe proporcionar y expresar dicho gen para complementar la deficiencia y producir un baculovirus infeccioso. En una realización concreta, la célula de insecto utilizada para la producción de baculovirus se modifica mediante la transfección con un casete de expresión que codifica al menos un gen esencial para el ensamblaje correcto de viriones baculovíricos. En una realización, dicho casete de expresión se integra en el genoma de dicha célula. También se pueden utilizar células de insecto infectadas transitoriamente con al menos un plásmido que comprende el casete de expresión. La terminología «casete de expresión» se refiere a una construcción que comprende la secuencia codificante de un gen de interés unido funcionalmente a secuencias de control de la expresión. Tal casete de expresión puede ser un plásmido que comprende el ORF de un gen esencial para el ensamblaje correcto de los viriones baculovíricos bajo el control de un promotor funcional en la célula de insecto seleccionada, y no contiene secuencias del genoma baculovírico que no sean el gen esencial para que se complemente el ensamblaje correcto de viriones baculovíricos y opcionalmente se permita que la secuencia del promotor exprese dicho gen (en particular, un casete de expresión no es un bácmido ni cualquier otro genoma entero baculovírico). Las secuencias de control de expresión de ejemplo se pueden elegir entre promotores, potenciadores, aisladores, etc. En una realización, el gen para la complementación procede del genoma del baculovirus en el cual se ha inactivado el gen esencial para el ensamblaje correcto de los viriones baculovíricos. En otra realización, el gen para la complementación procede del genoma de una especie de baculovirus diferente a la del genoma del baculovirus utilizado para la producción de productos biofarmacéuticos. Por ejemplo, el baculovirus utilizado para la producción de productos biofarmacéuticos puede proceder del genoma de AcMNPV y el gen para la complementación introducido en la célula productora de baculovirus procede de BmNPV o SeMNPV. Más específicamente, el genoma del baculovirus se puede hacer que carezca de vp80, vp39, vp1054 y/o p6.9, y la célula productora de baculovirus puede comprender una copia de un gen de BmNPV o SeMNPV capaz de complementar estos genes (p. ej., como se da a conocer en los ejemplos, se elimina p6.9 en el genoma de AcMNPV y la célula productora de baculovirus proporciona una copia de rescate del gen p6.9 de SeMNPV).

Así pues, la invención también da a conocer un procedimiento para la producción de un baculovirus que carece del al menos un gen esencial para el ensamblaje correcto de viriones baculovíricos, que comprende la etapa de transfectar una célula de insecto que comprende un casete de expresión que codifica un gen esencial para el ensamblaje correcto de los viriones baculovíricos, con un bácmido que comprende un genoma baculovírico, en donde dicho genoma carece de un gen esencial para el ensamblaje correcto de los viriones baculovíricos, en donde el genoma de dicho baculovirus carece de vp1054, en donde el gen esencial para el ensamblaje correcto de los viriones baculovíricos en dicho bácmido es el gen codificado por el casete de expresión comprendido en dicha célula de insecto. De acuerdo con este procedimiento, el gen que falta en el genoma baculovírico se complementa con el gen que se expresa en la célula de insecto. Las células transfectadas con el bácmido se mantienen en condiciones tales que se producen los viriones baculovíricos. Estos viriones baculovíricos producidos, que comprenden un genoma en el que falta al menos un gen esencial para el ensamblaje correcto de los viriones baculovíricos, luego se

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recogen para su uso posterior para infectar células de insecto productoras de sustancias biofarmacéuticas para la producción de los productos biofarmacéuticos.

En la realización donde el genoma de baculovirus carece del al menos un gen esencial para el ensamblaje de los viriones baculovíricos, la célula de insecto productora de la sustancia biofarmacéutica debe ser incapaz de complementar la carencia de dicho gen. Por lo demás, la carencia sería rescatada por la célula productora de la sustancia biofarmacéutica y se podrían producir los BV y los ODV. La presencia o ausencia de un gen esencial para el ensamblaje correcto de baculovirus se puede monitorizar, por ejemplo, mediante la comprobación de dicha célula por una PCR específica de dicho gen o por la detección del producto de la proteína de este gen (por ejemplo, mediante transferencia Western con un anticuerpo específico de dicho producto génico). Hay que descartar como células productoras de productos biofarmacéuticos las células que expresan un producto funcional del gen esencial para el ensamblaje correcto de los viriones baculovíricos que se han hecho deficientes en el genoma del baculovirus construido con que se pretendía infectar dicha célula.

En otra realización de la invención, la expresión del gen esencial para el ensamblaje correcto de los viriones baculovíricos se controla mediante un sistema de control de la expresión. La terminología «sistema de control de la expresión» define una modificación del sistema de células de insecto productoras del baculovirus/sistema de células productoras de los productos biofarmacéuticos y/o aún otra adaptación del genoma vírico, lo que da lugar a la regulación específica del gen esencial para el ensamblaje correcto de viriones baculovíricos. Este sistema puede ser un sistema de expresión inducible (por ejemplo, Tet-On, Tet-Off, sistemas basados en ecdisona (Dai et al., 2005) o elementos que contienen la región homóloga (hr) del baculovirus, tal como el sistema hr2 descrito por Aslanidi et al., (2009), lo que permite la inducción o la represión a voluntad del gen esencial, una construcción que expresa un ARN interferente o una combinación de estos.

En una realización concreta, la expresión del gen esencial para el ensamblaje correcto de baculovirus está inactivado por el silenciamiento mediado por ARN o la interferencia por ARN (Salem y Maruniak, 2007, Kanginakudru et al., 2007). Preferiblemente, se establece una línea celular procedente de células de insecto, en particular una línea celular procedente de Sf9, mediante la transformación estable de tal célula con una construcción que codifica un ARN bicatenario (dsRNA) específico del gen para silenciar la expresión del gen esencial para el ensamblaje correcto del virión de baculovirus. Esta línea celular que expresa el dsRNA se utiliza para la expresión del producto biofarmacéutico después de la infección con el o los baculovirus recombinantes que llevan el gen que codifica dicho producto biofarmacéutico. En esta realización, se pueden generar uno o varios baculovirus recombinantes de reserva para siembra con las líneas celulares convencionales Sf9, Sf21 o High-Five (a saber, sin necesidad de una copia que complemente el gen de la célula), ya que, en este caso, el genoma del baculovirus comprende el gen de tipo silvestre esencial para el ensamblaje correcto del virión del baculovirus.

Aún en otra realización de la invención, el gen esencial para el ensamblaje correcto del virión de baculovirus se coloca bajo el control de un promotor inducible, lo que permite la expresión o bien la represión de dicho gen en condiciones controladas.

En un procedimiento descrito, el número de viriones baculovíricos producidos con el procedimiento de la presente invención se reduce en al menos el 50% en comparación con el número de baculovirus que de otro modo produciría la célula productora de la sustancia biofarmacéutica mediante el uso de un genoma de baculovirus que comprende todos los genes esenciales para el ensamblaje correcto de los viriones baculovíricos. Más preferiblemente, el número de viriones baculovíricos se reduce al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90% y lo más preferiblemente al menos un 95% en comparación con un genoma de baculovirus de tipo silvestre.

Tal y como se explicó más arriba, el uso de sistemas de células de insecto y baculovirus para producir los productos biofarmacéuticos en la técnica anterior se caracteriza por la coproducción de enormes cantidades de baculovirus recombinantes (y puede ser de más de 108 ufp/ml) en paralelo al producto biofarmacéutico, y que necesita desarrollar y optimizar cuidadosamente protocolos de procesamiento posteriores para inactivar y eliminar esta contaminación de baculovirus. La inactivación se puede realizar mediante la adición de una etapa de detergente que conduce a la desintegración de la capa lipídica del baculovirus contaminante, tal y como se utiliza para la purificación de las partículas similivíricas con el propósito de hacer vacunas (parvovirus porcino-VLP (Maranga et al. (2002)) o rotavirus-VLP (Mellado et al. (2008)) o la purificación de diferentes serotipos de AAV (Smith et al. 2009).

Se han utilizado más etapas de separación eficientes: centrifugación (Wang et al. (2000); Maranga et al. (2002); Mellado et al. (2008)), microfiltración (Tellez. (2005)), eliminación negativa de proteínas de baculovirus (p. ej., Mellado et al. (2008)) o cromatografía de afinidad positiva (retención/captura de una sustancia biofarmacéutica – por la que fluyen las proteínas contaminantes, tal como la captura de la proteína vp7 de rotavirus mediante la cromatografía con concanavalina A (Mellado et al. (2008), captura de las partículas víricas quiméricas e inmunógenas rVP2H de la bursitis infecciosa mediante cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (Wang et al. (2000)) o la captura de diferentes serotipos de AAV mediante cromatografía de inmunoafinidad con anticuerpos camélidos (Smith et al., 2009). En particular, debido al uso de inmunoligandos muy específicos, el uso de la inmunoafinidad permite separar completamente la sustancia biofarmacéutica a purificar (p. ej., AAV específico) de cualquier contaminante y, en el caso del sistema de baculovirus, de la enorme contaminación con baculovirus

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También se describe un procedimiento para cribar genes baculovíricos, cuya inactivación podría ser útil para producir productos biofarmacéuticos sin viriones baculovíricos contaminantes en un sistema de células de insecto y baculovirus tal y como se define más arriba, que comprende:

inactivar al menos un gen problema de un genoma baculovírico (por ejemplo, mediante la deleción de dicho gen problema en dicho genoma);

evaluar la expresión génica baculovírica muy tardía de dicho genoma baculovírico tal y como se define más arriba;

determinar la producción de viriones baculovíricos a partir de las células que contienen dicho genoma baculovírico;

en donde un gen se selecciona como potencialmente útil para la producción de productos biofarmacéuticos si su inactivación

reduce la producción de viriones baculovíricos, y

no afecta a la expresión génica muy tardía de dicho genoma baculovírico, tal y como se define más arriba.

En una variante concreta del procedimiento para cribar un gen baculovírico, cuya inactivación podría ser útil para producir sustancias biofarmacéuticas, la inactivación del gen problema se lleva a cabo con un dsRNA específico de dicho gen problema. En particular, el gen baculovírico candidato se puede identificar al silenciar su expresión mediante interferencia por ARN para analizar su función en la formación del virión.

Realizaciones particulares

Las realizaciones particulares de la invención se definen en las reivindicaciones.

La invención se ilustrará ahora con los siguientes ejemplos, que se proporcionan como realizaciones de ejemplo no limitantes de la invención.

Leyenda de las figuras

Figura 1. Cribado por silenciamiento génico mediado por dsRNA. Las células de insecto Sf9 se inocularon en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos (2 × 105 células/pocillo) en 1 ml de medio de cultivo Sf-900 II SFM a 28 ºC. Al cabo de dos horas, se retiró el medio de cultivo y las células se infectaron con baculovirus recombinantes que llevan el gen egfp bajo el control del promotor de la polihedrina (AcMNPV-EGFP) en condiciones estándares. (A) Determinación del nivel de expresión génica muy tardía mediante microscopia fluorescente. Las células se infectaron a una MDI = 10 unidades de TCID50/célula y la transfección con el dsRNA específico de gen para vp1054, vp39, vp80, dbp y ec-27 se realizó 1 h después de la infección (p.i.). El nivel de la expresión génica muy tardía se comprobó por fluorescencia específica de EGFP a 48 h p.i. Los dsRNA específicos de las secuencias de egfp y cat se utilizaron como controles de RNAi. (B) Medición del nivel de expresión génica muy tardía mediante un ensayo de inmunotransferencia. Las células se infectaron con AcMNPV-EGFP a una MDI = 1 y la transfección con el dsRNA específico de gen se realizó también 1 h p.i. El nivel de la expresión génica muy tardía se analizó con un antisuero policlonal anti-EGFP de conejo a las 48 h p.i. Se utilizaron anticuerpos anti-vp39 y anti-α-tubulina como controles internos. (C). Titulación y detección de los viriones de gemación que se producen en las células tratadas con dsRNA. Se recogieron los viriones de gemación a las 36 horas p.i. y se utilizaron para ensayos de dilución hasta el límite para medir los títulos de los viriones infecciosos, o bien para la detección por PCR para comprobar la presencia de las partículas víricas. (D) Presencia de viriones derivados por oclusión y estructuras con forma de bastoncillo en la células con represión de vp39 y vp80. Las células se recogieron 36 horas p.i., se lisaron y los lisados celulares se ultracentrifugaron a través de un colchón de solución de sacarosa al 40% (45.000 rpm durante 1 hora, Beckman SW55). Los sedimentos se resuspendieron en agua desmineralizada y se analizaron por microscopia electrónica con tinción negativa. Las barras representan 100 nm.

Figura 2. Construcción del bácmido de AcMNPV con vp80 anulado (vp80-null). (A) Estrategia para la construcción de un bácmido vp80-null que contiene una deleción completa del marco abierto de lectura de vp80 de AcMNPV por recombinación homóloga en E. coli. En la primera etapa, se delecionó un fragmento de 2.074 pb que abarca el ORF de vp80 y se reemplazó por un casete de secuencia que contiene el gen de resistencia al cloranfenicol (cat) flanqueado por los sitios loxP modificados (LE y RE). Posteriormente se eliminó el gen de resistencia al antibiótico (cat) de la secuencia del bácmido mediante el sistema de recombinación Cre/loxP. La secuencia del promotor del gen p48 y la señal de poliadenilación del gen he65 permanecieron intactas. En el análisis por PCR se utilizaron parejas de oligonucleótidos del locus de tipo silvestre y dos genotipos con vp80 anulado para confirmar la deleción del ORF de vp80 y la correcta inserción/deleción del casete del gen de resistencia al cloranfenicol, como se indica mediante las flechas unilaterales. Sus nombres se asignan de acuerdo con las coordenadas de la secuencia de nucleótidos. Los cebadores para la amplificación del casete del gen cat se denominan cat-F y cat-R. (B). Detección por PCR de la presencia o ausencia de modificaciones de secuencia en el locus de vp80 en los bácmidos de AcMNPV original (Ac-wt), Ac-vp80-null(+cat) y Ac-vp80null(–cat). La figura superior confirma la deleción del gen vp80 y la inserción del casete de cat en el locus de vp80 con las parejas de cebadores 90292/90889 y cat-F/cat-R.

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La figura inferior muestra la verificación por PCR de que la recombinación ocurrió correctamente en el locus de vp80 mediante la pareja de cebadores 89507/91713.

Figura 3. Capacidad de replicación vírica de las construcciones de bácmidos de AcMNPV con el vp80 anulado y reparado mediante los ensayos de transfección-infección. (A). Representación esquemática de los casetes de expresión transpuestos en el locus de la polihedrina. Se hicieron cuatro construcciones de reparación (vp80 impulsado por su promotor nativo, vp80 impulsado por el promotor de la polihedrina, vp80 etiquetado con FLAG en el extremo amino y vp80 etiquetado con FLAG en el extremo carboxilo, ambos expresados desde su promotor nativo). Los esqueletos del genoma del bácmido utilizados para los ensayos de transfección se indican a la izquierda. Como control positivo de la replicación vírica, se utilizó el bácmido de AcMNPV de tipo silvestre (bMON14272). El bácmido Ac-gp64null se utilizó como control negativo que representa un bácmido prototipo con un fenotipo de «infección de una sola célula». (B). Microscopia de fluorescencia con el transcurso del tiempo que muestra la propagación de la infección por las células Sf9 transfectadas con las construcciones de bácmidos indicadas. El progreso de la infección vírica se comprobó mediante la detección de EGFP a los tiempos indicados después de la transfección. A las 120 horas p.t. se recogieron los sobrenadantes de los cultivoa de células para iniciar una infección secundaria. (C) Ensayo de infección secundaria. La EGFP se detectó a las 72 horas p.i. para señalar el progreso de la infección.

Figura 4. Curvas de crecimiento de las construcciones generadas de bácmidos reparados de AcMNPV-vp80null en unos ensayos a lo largo del tiempo desde la transfección. Las células Sf9 se transfectaron con 5,0 µg de ADN de cada bácmido reparado. (a) vp80 impulsado por su promotor nativo, (b) vp80 impulsado por el promotor de la polihedrina, (c) vp80 etiquetado con FLAG en el extremo amino y (d) vp80 etiquetado con FLAG en el extremo carboxilo, ambos expresados desde el promotor de vp80. Los sobrenadantes de los cultivos de células se recogieron en los puntos de tiempo indicados después de la transfección y se les analizó la producción de virus de gemación infecciosos mediante un ensayo de dilución hasta el límite de la TCID50. La infectividad se determinó mediante la monitorización de la expresión de la EGFP. Los puntos indican el promedio de los títulos procedentes de tres transfecciones independientes y las barras de error representan la desviación estándar.

Figura 5. El mutante AcMNPV-vp80null es incapaz de producir ningún virión de gemación infeccioso o no infeccioso. Las células Sf9 se transfectaron independientemente con 20 µg del ADN de bácmido de Ac-∆vp80 (a), Ac-wt (b), Ac∆vp80-vp80 (c), Ac-∆vp80-pH-vp80 (d), Ac-∆vp80-FLAG-vp80 (e) o Ac-∆vp80-vp80-FLAG (f). Cinco días p.t., los sobrenadantes del cultivo de células enriquecidos en virus de gemación se ultracentrifugaron y los virus de gemación se observaron al microscopio electrónico con tinción negativa (A). Las barras representan 200 nm. En paralelo, los viriones de gemación recogidos también se separaron también en SDS-PAGE, se transfirieron, y se inmunodetectaron con anticuerpos anti-VP39 o se utilizaron para la detección por PCR de la presencia de las partículas víricas (B).

Figura 6. El bácmido mutante con el gen vp80 anulado forma un número pequeño de nucleocápsidas y no produce viriones derivados por oclusión. Las células Sf9 transfectadas con Ac-∆vp80 (A a D), o bien con Ac-∆vp80-vp80 (E, F) o bien con Ac-wt (G, H) se fijaron, se tiñeron, se incluyeron y se obtuvieron cortes finos tal y como se describe en Materiales y Métodos. (A). Visón general representativa de la célula Sf9 transfectada con el bácmido mutante Acvp80null. (B) El mutante Ac-vp80null forma un número menor de nucleocápsidas en el estroma virógeno (C), y tampoco ningún virión derivado por oclusión en la zona anular de las células transfectadas (D). Por otra parte, la construcción del bácmido de reparación Ac-∆vp80-vp80 regenera totalmente la formación de numerosas nucleocápsidas en el estroma virógeno (E), así como viriones derivados por oclusión que parecen normales en la zona anular de las células transfectadas (F). Imágenes representativas del estroma virógeno (G) y la zona anular (H) de las células transfectadas con el bácmido Ac-wt. Las barras representan 500 nm. Abreviaturas: Nc, nucleocápsida; MN, membrana nuclear; Nu, núcleo; RZ, zona anular; Mi, mitocondria; ODV, viriones derivados por oclusión; VS, estroma virógeno.

Figura 7. Complementación funcional del bácmido mutante Ac-vp80null con el gen vp80 actuando en trans. Las células Sf9 se transfectaron con el vector pIZ-flag-vp80 (A) o bien pIZ (B) y se sometieron a la selección mediante Zeocin™. Tres semanas después de la transfección, las poblaciones policlonales de células resistentes a Zeocin™ se inocularon en placas nuevas de 6 pocillos y se transfectaron con el bácmido mutante Ac-vp80null para comprobar la actividad de complementación. La propagación del virus se monitorizó mediante la fluorescencia específica de la EGFP a las 72 h y las 96 h p.t. A las 120 horas p.t. se recogió el sobrenadante de los cultivos de células para iniciar una infección secundaria en las células Sf9 sin tratar (tipo silvestre) (panel derecho). La EGFP se detectó a las 72 horas p.i. para señalar el progreso de la infección. La EGFP se detectó a las 120 horas p.i. para señalar el progreso de la infección.

Figura 8. Construcción de un bácmido de AcMNPV con vp39 anulado (vp39-null). (A) Estrategia para la construcción del bácmido vp39-null que contiene una deleción parcial del marco abierto de lectura del vp39 de AcMNPV mediante recombinación homóloga en E. coli. En la primera etapa se eliminó un fragmento interno de 498 pb del ORF de vp39 y reemplazó por un casete cuya secuencia contiene el gen de resistencia al cloranfenicol (cat) flanqueado por los sitios loxP modificados (LE y RE). Posteriormente, el gen cat se eliminó de la secuencia del bácmido mediante el sistema de recombinación Cre/loxP. La secuencia de los promotores de los genes lef-4 y cg-30 no se vio afectada.

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Las flechas indican las posiciones de las parejas de oligonucleótidos utilizadas para el análisis por PCR del locus de tipo silvestre y dos genotipos con el vp39 anulado para confirmar la deleción parcial del ORF de vp39 y la correcta inserción/deleción del casete del gen cat. Los nombres de los cebadores se designan de acuerdo con las coordenadas de la secuencia de nucleótidos. (B) Detección por PCR de la presencia o ausencia de las modificaciones de secuencia en el locus de vp39 de los bácmidos Ac-wt, Ac-vp39null(+cat) y Ac-vp39null(–cat). La figura muestra la verificación por PCR de que la recombinación ocurrió correctamente en el locus de vp39 mediante la pareja de cebadores 75834/76420.

Figura 9. Determinación de la capacidad de replicación vírica de las construcciones de los bácmidos de AcMNPV con vp39 anulado y reparado mediante los ensayos de transfección-infección. (A) Representación esquemática de los casetes de expresión, transpuestos mediante Tn7 en el locus de la polihedrina. (1) vp39 expresado por el promotor de la polihedrina, (2) un doble gen vp39 y lef-4, ambos impulsados por sus promotores nativos, (3) un doble gen vp39 y cg-30, ambos impulsados por el promotor de la polihedrina y, finalmente, (4) una construcción génica doble de vp39 etiquetado con FLAG en el extremo amino impulsado por el promotor de la polihedrina, y el ORF de cg-30 impulsado por su promotor nativo y también por el promotor de la polihedrina más arriba en la secuencia. Los esqueletos del genoma del bácmido parental utilizados para los ensayos de transfección se indican a la izquierda. El bácmido de AcMNPV de tipo silvestre (bMON14272) se utilizó como control positivo de la replicación vírica. (B) Microscopia de la fluorescencia a lo largo del tiempo que muestra la propagación de la infección en las células Sf9 transfectadas con las construcciones de los bácmidos indicadas. La progresión de los virus se comprobó mediante la detección de la EGFP en los tiempos indicados después de la transfección. A las 168 horas p.t. se recogió el sobrenadante de los cultivos celulares para iniciar una infección secundaria. (C) Ensayo de infección secundaria. La detección de la EGFP se realizó a las 72 h p.i. para medir el progreso de la infección.

Figura 10. Construcción de un bácmido de AcMNPV con el vp1054 anulado (vp1054-null). (A) Estrategia para la construcción de un bácmido vp1054-null que contiene una deleción del marco abierto de lectura de vp1054 de AcMNPV por recombinación homóloga en E. coli. Se eliminó una secuencia de 955 pb desde el extremo 3' del ORF de vp1054 y se reemplazó por un casete con la secuencia de cat flanqueada por los sitios loxP modificados (LE y RE). Al mismo tiempo se introdujo una sola mutación puntual para cambiar el primer codón de traducción ATG→Met por ACG→Thr, para impedir que se tradujera una proteína VP1054 con el extremo carboxilo truncado. Esto también significa que el codón AAT interno n.º 32 de lef-10 se mutó a AAC, y que ambos codifican una Asn. Posteriormente, el gen cat se eliminó con el sistema de recombinación Cre/loxP. La secuencia del promotor de vp1054/lef-10 no se vio afectada en la construcción del bácmido. Ya que se eliminó la señal de poliadenilación del gen lef-10, una nueva señal poli-A sintética combinada con el codón de parada (TAATAAA) se le introdujo en el extremo 3' del ORF de lef

10. Las flechas representan la posición de las parejas de oligonucleótidos utilizadas para el análisis por PCR del locus de tipo silvestre y dos genotipos con vp1054 anulado para confirmar la deleción del ORF de vp1054 y la correcta inserción/deleción del casete de cat. (B) Detección por PCR de la presencia o ausencia de las modificaciones de secuencia en el locus de vp1054 de los bácmidos Ac-wt, Ac-vp1054null(+cat) y Ac-vp1054null(– cat). La figura superior muestra la confirmación de la deleción del gen vp1054 y la inserción del casete de cat en el locus de vp1054 mediante las parejas de cebadores 90292/90889 y cat-F/cat-R. La figura inferior muestra la verificación por PCR de que la recombinación ocurrió correctamente en el locus de vp1054 mediante la pareja de cebadores 89507/91713.

Figura 11. Capacidad de replicación vírica de las construcciones de los bácmidos de AcMNPV con vp1054 anulado y reparado mediante los ensayos de transfección-infección. (A) Representación esquemática de los casetes de expresión transpuestos en el locus de la polihedrina. Los esqueletos del genoma de los bácmidos utilizados para los ensayos de transfección se indican a la izquierda. Se fabricaron dos construcciones procedentes de Ac-vp1054null: la primera construcción lleva solo el gen marcador egfp bajo el control del promotor de p10, y la segunda construcción lleva el marcador egfp y el locus de lef-10/vp1054 solapante impulsados por sus secuencias promotoras naturales (d). Como control positivo de la replicación vírica se utilizó el bácmido de AcMNPV de tipo silvestre (bMON14272) (a). El bácmido Ac-gp64null se utilizó como control negativo al representar un bácmido prototipo con un fenotipo de «infección de una sola célula» (b). (B) Microscopia de fluorescencia a lo largo del tiempo que muestra la propagación de la infección en las células Sf9 transfectadas con las construcciones de bácmidos indicadas. El progreso de la infección vírica se comprobó mediante la detección de la EGFP en los tiempos indicados después de la transfección. A las 120 horas p.t., el sobrenadante de los cultivos de células se recogió para iniciar una infección secundaria. (C) Ensayo de infección secundaria. Se detectó la EGFP a las 72 horas p.i. para señalar el progreso de la infección.

Figura 12. Construcción de un bácmido de AcMNPV con p6.9 anulado (p6.9-null). (A) Estrategia para la construcción de un bácmido p6.9-null que contiene una deleción completa del marco abierto de lectura de p6.9 de AcMNPV por recombinación homóloga en E. coli. Se eliminó un fragmento de 164 pb del ORF de p6.9 y se reemplazó por un gen de resistencia cat flanqueado por los sitios loxP modificados (LE y RE). Posteriormente, el gen cat se eliminó de la secuencia del bácmido por recombinación con Cre/loxP. La secuencia del promotor del gen p6.9 no se vio afectada, ya que su secuencia se solapa con el ORF de p40. Las flechas representan las posiciones de las parejas de cebadores utilizadas en el análisis por PCR del locus de tipo silvestre y dos genotipos con el p6.9 anulado. (B) Detección por PCR de la presencia o ausencia de las modificaciones de secuencia en el locus p6.9 de los bácmidos

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Figura 17. La nueva estrategia de la tecnología de células de insecto y baculovirus diseñada para producir sustancias biofarmacéuticas sin viriones baculovíricos contaminantes. (A) Manipulación genética de las células de insecto para que expresen un factor vírico esencial (vp80) que complementa una mutación de vp80 en el virus. Las células Sf9 transgénicas codifican el ORF de vp80 y un gen de resistencia que permite la selección con antibióticos de las células transgénicas. (B) Generación de un bácmido Ac-∆vp80 incapaz de producir viriones de BV y ODV. El bácmido carece de todo el ORF de vp80. (C) Producción de una reserva para inoculación de baculovirus mediante complementación en trans en las células Sf-vp80 manipuladas genéticamente. Las células Sf9-vp80 se transfectan con el bácmido Ac-∆vp80 para producir la progenie del virus por complementación en trans. Después de la propagación del virus de gemación, se producen reservas del virus de elevado título en las células para empaquetamiento de Sf9-vp80. (D) Expresión de la proteína recombinante con baculovirus. Las células Sf9 convencionales se infectan con la progenie de virus de gemación por complementación en trans. La proteína recombinante se expresa desde promotores baculovíricos muy tardíos (p10 o polh), lo que permite una expresión muy elevada, mientras que no se producen viriones baculovíricos (BV/ODV) contaminantes.

Ejemplos

Ejemplo I

Materiales y métodos

Células de insecto y virus

Las células de Spodoptera frugiperda (Sf9) se mantuvieron en el medio SF900-II sin suero (Invitrogen) en condiciones estándares. El virus AcMNPV procedente del bácmido recombinante (AcMNPV-EGFP) que lleva un gen indicador egfp bajo el control del promotor de la polihedrina, muy tardío, transpuesto en el locus de la polihedrina, se obtuvo de Pijlman et al. (2006). El virus se propagó y se determinaron sus títulos mediante un ensayo de dilución hasta el límite en las células Sf9.

Síntesis in vitro del dsRNA

El procedimiento utilizado para sintetizar el dsRNA es similar al descrito por Ramadan et al., (2007) con modificaciones menores. Todos los moldes de ADN se amplificaron por PCR con cebadores con extremos

. Las secuencias de los cebadores que se indican a continuación se ofrecen en la tabla 1. Para amplificar estos genes se utilizaron los siguientes cebadores: los cebadores vp39-F y vp39-R para vp39; los cebadores 45510 y 46235 para vp1054, los cebadores 90292 y 90889 para vp80; los cebadores ec-27-F y ec-27-R para odv-ec27; y los cebadores dbp-F y dbp-para dbp. Para analizar la eficacia de los estudios de RNAi, fabricamos dsRNA contra egfp con los cebadores gfp-F y gfp-R, y para tener un control negativo fabricamos dsRNA con los cebadores cat-F y cat-R para el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (cat).

Los productos de la PCR se purificaron con el kit GFX Illustra de purificación de banda en gel y de ADN de PCR (GE Healthcare, Buckinghamshire, Gran Bretaña) y se utilizaron como moldes para la síntesis in vitro del dsRNA con el sistema de RNAi T7 RiboMAXTM Express (Promega, Madison, WI, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, aproximadamente 1 μg de molde de ADN purificado se utilizó para la síntesis del ARN a 37 ºC durante 4 h. Después de la síntesis, se retiraron los moldes de ADN mediante digestión con ADNasa. Las hebras de ARN complementarias se hibridaron mediante incubación a 70 ºC durante 10 min y luego un enfriamiento lento a temperatura ambiente (aproximadamente 30 min). Las moléculas de ARN sin hibridar (monocatenarias) se degradaron mediante el tratamiento con la ARNasa A (30 min, 37 ºC). Finalmente, el dsRNA se precipitó con isopropanol, se resuspendió en agua estéril tratada con DEPC a una concentración final de 0,5-1 mg/ml y su pureza e integridad se comprobaron mediante electroforesis en gel de agarosa. El dsRNA se mantuvo a –80 ºC en alícuotas de 40 μl. Inmediatamente antes de la transfección, el dsRNA se descongeló en hielo.

Procedimiento de RNAi en las células de insecto infectadas con baculovirus

Las células Sf9 se inocularon en placas de cultivo de 24 pocillos (2 × 105 células/pocillo) en 1 ml del medio de cultivo Sf900-II sin suero a 28 ºC. Al cabo de dos horas se retiró el medio de cultivo y las células se infectaron con el baculovirus recombinante AcMNPV-EGFP a una multiplicidad de infección (MDI) de 10 unidades de TCID50/célula durante 1 h, en condiciones estándares. Una hora después de la infección (p.i.), el dsRNA (20 μg/pocillo) se introdujo en las células mediante transfección con CellfectinTM (Invitrogen) en medio sin suero de Grace. Al cabo de 4 h, la mezcla de transfección se reemplazó por el medio Sf900-II sin suero. Las células se incubaron en total 48 h

p.i. a 28 ºC y, a continuación, se recogieron por centrifugación a 1000×g durante 5 min para el análisis por microscopia electrónica y transferencia Western. Sin embargo, una quinta parte del medio de cultivo se recogió a 36 h p.i. y se utilizó para la titulación de viriones de gemación mediante ensayos de dilución de punto final o para la detección del ADN vírico por PCR. En todos los experimentos, el dsRNA que corresponde al gen cat se tomó como control negativo. Por otra parte, el dsRNA específico del gen egfp se utilizó como control positivo para el procedimiento de RNAi.

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positivos también se confirmaron por secuenciación del ADN.

Para recuperar la competencia de la transposición, el plásmido pMON7124 (Invitrogen) que codifica la transposasa cooperadora se volvió a introducir en las células de E. coli DH10β-bMON14272-vp80null. Finalmente, el gen indicador egfp se introdujo en el bácmido vp80-null para facilitar la observación de su comportamiento en las células de insecto. Brevemente, el gen indicador egfp se amplificó con los oligonucleótidos de PCR gfp-NheI-F y gfp-SphI-R (tabla 1) a partir del plásmido pEGFP-N3 (Clontech). El producto de la PCR se clonó en el plásmido pJet1.2/Blunt con el kit de clonación de productos de PCR CloneJETTM (Fermentas) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Posteriormente, el ORF de egfp se escindió del pJET1.2-egfp sin errores con NheI y SphI y se subclonó en el pFastBacDUAL (Invitrogen) digerido con NheI y SphI para generar el plásmido pFB-egfp. Un casete de expresión que contiene el gen indicador egfp bajo control transcripcional del promotor muy tardío de p10 se transpuso desde el pFB-egfp al locus de la polihedrina del bácmido vp80-null, tal y como se describe en el manual de Bac-to-Bac (Invitrogen). En el genoma resultante se ha retirado el ORF completo de vp80 (véase la figura 2). Esto corresponde a la deleción de 2074 pb de las posiciones de nucleótidos 89564 a 91637 en el genoma del clon C6 de AcMNPV dado a conocer en la SEQ ID n.º 1.

Construcción de los bácmidos vp80-null reparados

Para preparar los vectores donantes de reparación de vp80, modificamos el plásmido pFB-egfp (véase más arriba) por retirada del promotor de la polihedrina y su reemplazo por un fragmento que contiene la región del promotor de vp80 y el ORF de vp80. Primero se amplificó un fragmento de 2300 pb que contiene el promotor de vp80 y la secuencia del ORF mediante los cebadores pvp80-Stul-F y vp80-XbaI-R (tabla 1) del molde del bácmido bMON14272, y se clonó en el vector pJet1.2/Blunt (Fermentas) para formar el pJet1.2-pvp80-vp80. Después de la verificación de la secuencia de ADN, el casete de vp80 se escindió del pJet1.2-pvp80-vp80 mediante la doble digestión con StuI y XbaI y, a continuación, se subclonó en el pFB-egfp digerido con Bst1107I y XbaI y purificado en gel para generar el plásmido donante pFB-egfp-pvp80-vp80. En paralelo se construyó un plásmido donante pFBegfp-polh-vp80, en donde el ORF de vp80 está impulsado por el promotor muy tardío de la polihedrina (polh). Con este objetivo, un fragmento de 2105 pb que lleva el ORF de vp80 se amplificó con los cebadores vp80-SacI-F y vp80-XbaI-R (tabla 1) y se clonó en el pJet1.2/Blunt para generar el pJet1.2-vp80. En la etapa final, se escindió el ORF de vp80 (SacI/XbaI) del pJET1.2-vp80 y se subclonó en el pFB-egfp digerido con SacI y XbaI para crear el pFB-egfp-polH-vp80.

Para solucionar un problema asociado a que no se dispone del anticuerpo anti-VP80, se le añadió la etiqueta FLAG (fusión en el extremo amino y en el carboxilo) a VP80 para facilitar la inmunodetección. La secuencia de FLAG-vp80 fusionada en el extremo amino se generó mediante una estrategia de PCR de doble etapa, la llamada PCR de fusión. Primero, un fragmento de 259 pb que contiene el promotor de vp80 y la etiqueta FLAG se amplificó por PCR con los cebadores pvp80-StuI-F y vp80-FLAG-R1 a partir del bácmido molde bMON14272. Después de la purificación en gel y la cuantificación del ADN, se utilizó el fragmento de 259 pb como cebador directo en una segunda etapa de amplificación por PCR con el cebador inverso vp80-XbaI-R en el bácmido molde bMON14272. El producto final de la PCR (2324 pb) se clonó en el vector pJet1.2/Blunt (Fermentas) para formar el pJet1.2-pvp80FLAG-vp80. Después verificar la secuencia del ADN, el casete FLAG-vp80 se escindió de pJet1.2-pvp80-FLAG-vp80 mediante la doble digestión con StuI y XbaI y, a continuación, se subclonó en el pFB-egfp purificado en gel y digerido con Bst1107I y XbaI para generar el plásmido donante pFB-egfp-pvp80-FLAG-vp80. El casete vp80-FLAG con la fusión en el extremo carboxilo se amplificó con pvp80-Stul-F y vp80-FLAG-R a partir del bácmido molde bMON14272. El fragmento de 2324 pb se clonó en el pJet1.2/Blunt y posteriormente se transfirió al pFB-egfp de una manera similar a la de las construcciones anteriores.

Los insertos de todos los plásmidos donantes desarrollados se transpusieron en el bácmido vp80-null siguiendo el protocolo Bac-to-Bac (Invitrogen). El cribado de las construcciones donde se produjo la transposición en el locus de polh se hizo mediante el ensayo por PCR triple que emplea los cebadores directo e inverso de M13 y un cebador GenR específico del gen de resistencia a la gentamicina (tabla 1).

Ensayo de transfección-infección

Los ADN de los bácmidos se prepararon a partir de cultivos bacterianos de una noche en 1,5 ml inoculados con 2 a 3 colonias independientes que llevan el bácmido con el gen heterólogo insertado de acuerdo con el manual Bac-to-Bac (Invitrogen) y se analizaron en paralelo. Para las transfecciones se utilizó 1 μg de cada preparación de ADN de bácmido para transfectar 1 × 106 células Sf9 en una placa de 6 pocillos mediante el protocolo de transfección con CellfectinTM tal y como se describe en el manual Bac-to-Bac (Invitrogen). De 72 h a 120 h después de la transfección (p.t.), se comprobó la propagación vírica mediante microscopia de fluorescencia. A las 120 h p.t., el medio de cultivo celular se centrifugó durante 5 min a 2000×g para retirar los residuos celulares y este sobrenadante aclarado se utilizó para infectar 1,5 × 106 células Sf9 en las placas de 6 pocillos. Al cabo de 72 p.i., la diseminación de la infección del virus se monitorizó de nuevo mediante microscopia de fluorescencia. En todos los experimentos se utilizó como control positivo un bácmido bMON14272 de tipo silvestre que lleva el gen indicador egfp bajo control del promotor de p10. Un bácmido bMON14272-gp64null que también lleva el gen indicador egfp bajo control del promotor de p10 sirvió como control negativo porque había perdido la capacidad de transmisión de la infección de

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una célula a otra (Lung et al., 2002).

Caracterización a lo largo del tiempo de la propagación vírica en el cultivo celular

Se realizaron análisis a lo largo del tiempo para comparar la producción de virus de gemación del virus AcMNPVvp80null y las diferentes construcciones de reparación en comparación con el bácmido de AcMNPV de tipo silvestre (Ac-wt) que contiene egfp. Brevemente, las células Sf9 se inocularon en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos (1 × 106 células/pocillo en 1 ml de medio de cultivo Sf900-II sin suero a 28 ºC). Al cabo de dos horas se retiró el medio de cultivo y las células se transfectaron con 5 µg del ADN del bácmido, en las condiciones estándares que se recomiendan en el manual Bac-to-Bac (Invitrogen). Se recogieron los sobrenadantes de los cultivos celulares a las 24, 48, 72, 96 y 120 h p.t. y se les analizó la producción del virus de gemación infeccioso mediante un ensayo de dilución hasta el límite para determinar la dosis infecciosa 50 para el cultivo del tejido (TCID50). La infección se determinó mediante la monitorización de la expresión de egfp (a partir del promotor de p10). Se calcularon los valores promedio de los títulos infecciosos procedentes de tres transfecciones independientes y representaron en gráficos.

Microscopia electrónica de transmisión

Las células Sf9 de insecto se inocularon en un matraz 25T (3,5 × 106 células/matraz) y se transfectaron con 20 μg de las construcciones de bácmido Ac-∆vp80, el Ac-∆vp80-vp80 de rescate o Ac-wt. Al cabo de 48 h p.t., las células se recogieron y prepararon para la microscopia electrónica de transmisión tal y como se ha descrito previamente (van Lent et al., 1990). Se examinaron las muestras y se fotografiaron con un microscopio electrónico Philips CM12.

Ensayo de producción del virus de gemación

Las células Sf9 de insecto se inocularon en dos matraces 25T (3,5 × 106 células/matraz) y se transfectaron con 20 μg de las construcciones de bácmido Ac-∆vp80, Ac-∆vp80-vp80, Ac-∆vp80-pH-vp80, Ac-∆vp80-FLAG-vp80, Ac∆vp80-vp80-FLAG o Ac-wt. Cinco días p.t. se recogieron los sobrenadantes de los cultivos celulares enriquecidos en BV y se ultracentrifugaron a través de un colchón de una solución de sacarosa al 10% (25.000 rpm durante 1,5 horas, Beckman SW32). Los viriones de gemación sedimentados se resuspendieron en agua desmineralizada estéril y se prepararon para la microscopia electrónica de tinción negativa, o bien para la electroforesis en SDSpoliacrilamida, o bien para la detección por PCR (como se menciona más arriba).

Purificación de ODV y estructuras con forma de bastoncillo a partir de las células infectadas

Se analizó por microscopia electrónica (EM) la presencia de ODV y estructuras de tipo bastoncillo en las células de insecto infectadas/transfectadas. Con este propósito, las células de insecto se recogieron 48 p.i., se lisaron, y los lisados celulares se ultracentrifugaron (45.000 rpm durante 1 hora, Beckman SW55) a través de un colchón de sacarosa al 40% en tampón TE (Tris-HCl a 1 mM, pH 7,4, EDTA a 0,1 mM). Los sedimentos se resuspendieron en agua desmineralizada estéril y se analizaron mediante EM de tinción negativa tal y como se había descrito previamente (van Lent et al., 1990).

Desarrollo de la línea celular transgénica procedente de Sf9 que expresa vp80

Para desarrollar una línea celular que produce la proteína VP80, un fragmento de 2105 pb que lleva el ORF de vp80 se amplificó con los cebadores vp80-SacI-F y vp80-XbaI-R (tabla 1) y se clonó en el pJet1.2/Blunt para generar el pJet1.2-vp80. En la siguiente etapa se escindió el ORF de vp80 (SacI/XbaI) del pJet1.2-vp80 y se subclonó en el pIZ digerido con SacI y XbaI (Invitrogen) para crear el pIZ-vp80. El vector plasmídico resultante pIZ-vp80 se linealizó con Eco57I y se purificó en gel. Las células Sf9 se inocularon en placas de seis pocillos (1 × 106 células/pocillo) y se transfectaron con 10 μg del vector linealizado. Al cabo de 24 horas de la transfección, las células se seleccionaron mediante su cultivo en un medio que contiene ZeocinTM (300 μg/ml) durante 2 a 3 semanas hasta que ninguna célula Sf9 de control sobrevivió en las mismas condiciones. A continuación, las células se propagaron como una línea celular sin clonar.

Generación y caracterización de un bácmido de AcMNPV con vp39 anulado (vp39-null)

Para estudiar la importancia del gen vp39 en el contexto de la producción de la progenie vírica y el proceso de ensamblaje de las nucleocápsidas, construimos un bácmido de AcMNPV (bMON14272) con una deleción de vp39 por recombinación homóloga en E. coli de acuerdo con el mismo procedimiento que se observó anteriormente para la construcción del bácmido de AcMNPV vp80null. Ya que la secuencia del ORF de vp39 se solapa con las secuencias promotoras de los dos ORF flanqueantes (cg-30 y lef-4), sólo se pudo eliminar una parte interna del ORF de vp39 para evitar desregulaciones de la expresión de cg-30 y de lef-4. Para llegar a esto, un gen cat flanqueado por los sitios LoxP mutantes se amplificó con los cebadores de PCR vp39-KO-y vp39-KO-R (tabla 1) a partir de un plásmido que comprende un gen cat flanqueado por los sitios LoxP mutantes. El fragmento de PCR resultante, que contenía el gen cat flanqueado por los sitios LoxP mutantes y secuencias de aproximadamente 50 pb homólogas a una región interna del ORF de vp39, se trató con DpnI y se purificó en gel para eliminar el plásmido molde. A continuación, el producto de la PCR se introdujo por transformación en las células de E. coli DH10β que contienen el

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bácmido bMON14272 (Invitrogen) y el plásmido pKD46 productor de la recombinasa Lamda RED (Datsenko y Wanner, 2000) preparado de la manera mencionada más arriba. En la última etapa, las colonias resistentes a la kanamicina se analizaron por PCR con los cebadores 75834 y 76420 (tabla 1) para verificar la inserción o eliminación del gen cat del esqueleto del bácmido. Los clones positivos se verificaron adicionalmente por secuenciación del ADN de los productos obtenidos de la PCR. De acuerdo con este protocolo, se retiró una parte interna (498 nt = 166 aa) del ORF de vp39, coordenadas: 75894-76391 como se indica en la figura 9.

Construcción y análisis de los bácmidos vp39-null reparados

Para preparar un vector donante de reparación de vp39, modificamos el plásmido pFB-egfp (descrito más arriba) mediante la introducción del ORF de vp39 bajo el control del promotor de la polihedrina. Inicialmente, se amplificó un fragmento de 1.073 pb con los cebadores vp39-SacI-F y vp39-XbaI-R (véase la tabla 1 para la secuencia de los cebadores) a partir del molde bMON14272 y se clonó en el vector pJet1.2/Blunt (Fermentas) para formar el pJet1.2vp39. Después de la verificación de la secuencia del ADN, el ORF de vp39 se escindió de pJet1.2-vp39 por digestión doble con SacI/XbaI y, a continuación, se subclonó en el pFB-egfp digerido con SacI/XbaI y purificado en gel para generar el plásmido donante pFB-egfp-vp39. Después de un intento infructuoso para rescatar el vp39null de AcMNPV con pFB-egfp-vp39, se preparó una serie de plásmidos donantes nuevos. Primero, un fragmento de 2.498 pb que contenía los ORF de vp39 y lef-4 se generó por PCR con los cebadores vp39-StuI-F y lef-4-XbaI-R a partir del bácmido molde bMON14272 y se clonó en el vector pJet1.2/Blunt (Fermentas) para formar el pJet1.2-vp39-lef-4. Después de la confirmación de la secuencia del ADN, el fragmento con los ORF de vp39 y lef-4 se escindió del pJet1.2-vp39-lef-4 por digestión doble con StuI/XbaI y, a continuación, se subclonó en el pFB-egfp digerido con StuI/XbaI y purificado en gel para generar el plásmido donante pFB-egfp-vp39-lef-4.

En paralelo se construyó el plásmido donante pFB-egfp-vp39-cg30, en donde la ORF de vp39 y la de cg-30 las impulsaba el promotor muy tardío de la polihedrina, y el ORF de cg-30 también puede utilizar su promotor nativo situado en del extremo 3' del ORF de vp39. Brevemente, un fragmento de 1.868 pb que llevaba los ORF de vp39 y cg-30 se amplificó con los cebadores cg30-XbaI-F y vp39-XbaI-R (descritos más arriba) y se clonó en el pJet1.2/Blunt para generar el pJet1.2-vp39-cg30. El casete vp39/cg-30 se subclonó como SacI/XbaI en el pFB-egfp para crear el pFB-egfp-vp39-cg30. Adicionalmente se construyó un vector donante similar pFB-egfp-FLAG-vp39cg30, en donde el ORF de vp39 está etiquetado con FLAG en el extremo amino. Se empleó la misma estrategia para construir este vector, salvo que para amplificar el casete vp39/cg-30 se utilizó el cebador inverso vp39-FLAGSacI-R en vez del cebador vp39-XbaI-R.

Todos los plásmidos donantes construidos se transpusieron en el bácmido vp39-null según el protocolo del kit Bacto-Bac (Invitrogen) y se detectó selectivamente según se detalla más arriba para los bácmidos de reparación de vp80. El análisis funcional se realizó como se describe más arriba para las construcciones de vp80.

Generación y análisis del bácmido de AcMNV vp1054-null

Para verificar la función esencial del gen vp1054 en el contexto de la producción de la progenie vírica y el ensamblaje de las nucleocápsidas, construimos un bácmido de AcMNPV (bMON14272) con una deleción de vp1054 por recombinación homóloga en E. coli de acuerdo con el mismo procedimiento que para la construcción del bácmido vp80null con alteraciones menores. Ya que el ORF de vp1054 se solapa con el ORF esencial de lef-10, no pudimos retirar el ORF entero de vp1054 sino sólo una parte de 955 pb del extremo 3' del ORF. Para impedir la traducción del mutante VP1054 con el extremo carboxilo truncado en células de insecto, decidimos mutar el primer codón de traducción ATG →Met a ACG →Thr. Esta sustitución de un único nucleótido cambió también un codón interno, el n.º 32, de (AAT) a AAC en el ORF de lef-10, aunque ambos codifican el mismo aminoácido (Asn). Para cumplirlo, amplificamos el extremo en 5' del ORF de vp1054 con los cebadores vp1054-KO-F y vp1054-KO-R1 a partir del bácmido bMON14272 (Invitrogen). El producto de la PCR de 214 pb contenía una mutación del codón de inicio ATG del ORF de vp1054, introdujo una secuencia señal de parada/poli-A sintética para el ORF de lef-10, y tiene un extremo 3'-protuberante con homología al casete cat para facilitar la segunda PCR, y una secuencia de homología de 49 pb con el extremo en 5' del ORF de vp1054 para mediar la recombinación homóloga dirigida por Lambda RED en E. coli. Después de la purificación en gel y la cuantificación del ADN, el fragmento de 214 pb se utilizó como cebador directo en una PCR de segunda etapa con el cebador inverso vp1054-KO-R2 con un plásmido que comprende un gen cat flanqueado por los sitios LoxP mutantes como molde. El fragmento de PCR resultante de

1.230 pb, que contenía el gen cat flanqueado por los sitios LoxP mutantes, un extremo en 5' mutado del ORF de vp1054 y las secuencias de aproximadamente 50 pb homólogas a la región proximal en 5' o 3' del ORF de vp1054, se trató con DpnI y se purificó en gel para eliminar el plásmido molde. La recombinación de este producto de PCR con el bácmido bMON14272 se realizó tal y como se ha descrito más arriba para el mutante de vp80. Las colonias resistentes a la kanamicina se verificaron por PCR con las parejas de cebadores cat-F/cat-R, 45510/46235 y 45122 y 46441 para comprobar la inserción o eliminación del gen cat del esqueleto del bácmido. Los sitios de inserción también se confirmaron por secuenciación del ADN. Este procedimiento dio lugar a la deleción de 955 pb de las posiciones nucleotídicas 45365 a 46319 en el genoma del clon C6 de AcMNPV dado a conocer en la SEQ ID n.º 1. Todas las secuencias de cebadores se ofrecen en la tabla 1.

Construcción de un bácmido reparado de vp1054-null

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Teóricamente, una cierta cantidad de la proteína Flag.VP80 asociada al inóculo del virus complementado en trans está entrando en las células de insecto, pero esto ya no se detectaba en tiempos muy tardíos después de la infección y probablemente se degradaba por la actividad mediada por el proteasoma o bien por el lisosoma. En el mismo experimento no se registró ninguna liberación de BV a los sobrenadantes de los cultivos celulares

5 procedentes de las células Sf9 inoculadas con el inóculo del virus Ac-∆vp80 (figura 16C), lo que demuestra que no se había producido ni la generación de virus revertientes ni la contaminación del virus de tipo silvestre.

Resumen

En este estudio nos centramos en mejorar las herramientas convencionales de expresión en baculovirus con el objetivo de eliminar la progenie de baculovirus que contaminan la fabricación de proteínas recombinantes. Este

10 iniciativa está muy apoyada por las expectativas farmacéuticas, ya que los fármacos expresados en baculovirus recombinantes se usan cada vez más en la medicina humana y veterinaria. Por lo tanto, perseguimos identificar el gen o genes de baculovirus cuya acción selectiva da lugar a un baculovirus incapaces de producir viriones, pero que no afectan, o sólo afectan levemente, a la expresión génica muy tardía. De este modo, el alto nivel de expresión de los genes heterólogos quedará salvaguardado.

15 Una visión general resumida de la nueva tecnología con el gen vp80 como ejemplo se presenta en la figura 16. Con el uso de la manipulación genética mediante bácmidos, los inventores construyeron un genoma de AcMNPV que carecía del gen vp80 (figura 16B). La genómica funcional y los análisis por microscopia electrónica revelaron que la falta de vp80 impide la producción de los BV y de los ODV. En paralelo se construyeron células Sf9 para producir la VP80 que complementa en trans el bácmido Ac-∆vp80null (figura 14A,C). Finalmente, demostramos que el inóculo

20 de baculovirus incapaz de replicarse y complementado en trans es capaz de producir una cantidad de proteína recombinante similar a la producida mediante los vectores baculovíricos convencionales (figura 14D).

Tabla 1. Lista de cebadores para PCR en orden de aparición en el texto

SEQ ID n.º: Nombre del cebador Secuencia Orientación

2: vp39-F imagen21 Directo

3: vp39-R imagen22 Inverso

4: 45510 imagen23 Directo

5: 46235 imagen24 Inverso

6: 90292 imagen25 Directo

7: 90889 imagen26 Inverso

8: ec-27-F imagen27 Directo

9: ec-27-R imagen28 Inverso

10: dbp-F imagen29 Directo

11: dbp-R imagen30 Inverso

12: gfp-F imagen31 directo

13: gfp-R imagen32 Inverso

14: cat-F imagen33 Directo

15: cat-R imagen34 Inverso

16: vp80-ko-F imagen35 Directo

17: vp80-ko-R imagen36 Inverso

18: 89507 imagen37 Directo

19: 91713 imagen38 Inverso

20: gfp-NheI-F imagen39 Directo

21: gfp-SphI imagen40 Inverso

22: pvp80-Stul-F imagen41 Directo

23: vp80-XbaI-R imagen42 Inverso

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SEQ ID n.º: Nombre del cebador Secuencia Orientación

24: vp80-SacI-F imagen43 Directo

25: vp80-FLAG-R1 imagen44 Inverso

26: vp80-FLAG-R imagen45 Inverso

27: M13-F imagen46 Directo

28: M13-R imagen47 Inverso

29: GenR imagen48 Inverso

30: vp39-ko-F imagen49 Directo

31: vp39-ko-R imagen50 Inverso

32: vp39-SacI-F imagen51 Directo

33: vp39-XbaI-R imagen52 Inverso

34: vp39-StuI-F imagen53 Directo

35: lef-4-XbaI-R imagen54 Inverso

36: cg-30-XbaI-F imagen55 Directo

37: vp39-FLAG-SacI-R imagen56 Inverso

38: vp1054-ko-F imagen57 Directo

39: vp1054-ko-R1 imagen58 Inverso

40: vp1054-ko-R2 imagen59 Inverso

41: vp1054-Rep-F imagen60 Directo

42: vp1054-Rep-R imagen61 Inverso

43: p6.9-ko-F imagen62 Directo

44: p6.9-ko-R imagen63 Inverso

45: Ac-p6.9-F imagen64 Directo

46: Ac-p6.9-R imagen65 Inverso

47: Se-p6.9-F imagen66 Directo

48: Se-p6.9-R imagen67 Inverso

49: 86596 imagen68 Directo

50: 86995 imagen69 Inverso

51: 45122 imagen70 Directo

52: 46441 imagen71 Inverso

53: pp6.9-F imagen72 Directo

54: pp6.9-R imagen73 Inverso

55: 75834 imagen74 Directo

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Claims

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