ES2787706T3

ES2787706T3 - Producción de productos biofarmacéuticos a base de baculovirus sin viriones baculovíricos contaminantes

Info

Publication number: ES2787706T3
Application number: ES16205440T
Authority: ES
Inventors: Otto-Wilhelm Merten; Martin Marek; Oers Monique Van
Original assignee: Genethon
Current assignee: Genethon
Priority date: 2009-08-17
Filing date: 2010-08-05
Publication date: 2020-10-16
Anticipated expiration: 2030-08-05
Also published as: US20180127728A1; US20120149010A1; CA2771250A1; HUE025056T2; EP3187589A3; CA3050271A1; US11236307B2; DK2467489T3; DK2933336T3; US20150252335A1; EP3187589A2; EP2467489A2; EP2933336B1; ES2542740T3; WO2011020710A2; EP2467489B1; EP2933336A3; ES2627744T3; PT2933336T; WO2011020710A3

Abstract

Un método para la producción un producto biofarmacéutico, que comprende: (a) infectar una célula de insecto productora de sustancia biofarmacéutica con al menos un baculovirus, en donde dicho al menos un baculovirus comprende un genoma que codifica dicho producto biofarmacéutico, y (b) mantener la célula de insecto productora de sustancia biofarmacéutica en condiciones tales que se produce el producto biofarmacéutico, en donde el genoma de dicho al menos un baculovirus es deficiente para el gen de p6.9, o en donde dicha célula de insecto productora de sustancia biofarmacéutica comprende un sistema de control de expresión que permite la inactivación del gen de p6.9.

Description

DESCRIPCIÓN

Producción de productos biofarmacéuticos a base de baculovirus sin viriones baculovíricos contaminantes

La presente invención se refiere a los procedimientos para la producción de productos biofarmacéuticos por aplicación de un sistema basado en baculovirus. Estos procedimientos permiten ventajosamente la producción de productos biofarmacéuticos con poca o ninguna contaminación de viriones baculovíricos.

Durante los últimos veinte años, la tecnología de células de insecto y baculovirus se ha convertido en un sistema de expresión eucariota utilizado con mucha frecuencia para la producción de proteínas recombinantes, no sólo con propósitos científicos, sino que cada vez más para la medicina humana y veterinaria (Condreay y Kost, 2007, van Oers, 2006). En concreto, los baculovirus recombinantes procedentes del virus de la nucleopolihedrosis múltiple de Autographa californica (AcMNPV, por su nombre en inglés) se emplean ampliamente para la producción a gran escala de proteínas heterólogas en cultivos de células de insecto. Las principales razones para la frecuente aplicación de este sistema son: (1) un nivel de expresión elevado de las proteínas foráneas, (2) las células de insecto son capaces de crecer en un cultivo de suspensión y, por lo tanto, se escalan con facilidad, (3) las proteínas sintetizadas en las células de insecto se procesan y se modifican postraduccionalmente, (4) las técnicas de manipulación están bien desarrolladas para los vectores víricos, lo que da lugar a un sistema de expresión flexible, y (5) no es patógeno para los humanos, ya que el abanico de hospedadores de los baculovirus se limita a insectos e invertebrados. Los vectores baculovíricos recombinantes se están utilizando para la producción de proteínas individuales, por ejemplo, con el objetivo de hacer vacunas con subunidades, pero también para estructuras de orden superior que contienen una o más proteínas, tales como complejos enzimáticos, virus o partículas similivíricas.

Las partículas similivíricas (VLP, por su nombre en inglés) son estructuras muy organizadas que se autoensamblan a partir de proteínas estructurales procedentes de virus. Estas nanopartículas versátiles y estables poseen unas excelentes propiedades adyuvantes capaces de inducir las respuestas inmunitarias adquirida e innata (Ludwig y Wagner, 2007). Durante los últimos años, las VLP se han empleado en otras ramas de la biotecnología para sacarle partido a su estabilidad estructural y a que tolera la manipulación para portar y visualizar moléculas heterólogas, o servir de bloques fundamentales para nanomateriales nuevos. Para las aplicaciones inmunoterapéuticas y preventivas, se han producido exitosamente muchos tipos de partículas similivíricas (VLP) en las células de insecto infectadas con baculovirus (Noad y Roy, 2003, van Oers et al., 2006, Ramqvist et al., 2007). El primer logro comercial de la tecnología de las VLP de baculovirus para su uso en los humanos es la vacuna del virus del papiloma humano (HPV, por su nombre en inglés) recientemente comercializada por GlaxoSmithKline, que protege de las cepas de HPV 16 y 18. La proteína L1 de cada uno de estos tipos de HPV se expresó mediante un vector baculovírico recombinante y las VLP resultantes se combinaron para producir la vacuna Cervarix™ (Harper et al., 2006).

Hoy en día se están dedicando muchos recursos al desarrollo de partículas similivíricas de la gripe derivadas de baculovirus, así como vacunas con subunidades de la gripe, lo que constituiría una nueva generación de posibles vacunas basadas en cultivos de células que no sean de mamíferos y que no sean huevos. Las partículas similivíricas de la gripe incapaces de replicarse son eficaces a la hora de desencadenar una respuesta inmunitaria protectora, amplia, y que sirva en varios clados contra las proteínas de aislados emergentes de la gripe H5N1, lo que da lugar a un posible candidato de vacuna de la gripe pandémica para los humanos que se puede almacenar para ser usada en el caso de un brote de la gripe H5N1 (Bright et al., 2008). Una vacuna con subunidades de la gripe producida en las células de insecto está muy cerca de la autorización de la FDA (Cox y Hollister, 2009). En principio, se podrían aplicar estrategias parecidas para las vacunas contra la gripe pandémica, tal como el brote reciente de gripe porcina.

Con propósitos genoterápicos, la tecnología de células de insecto y baculovirus también se aplica a la producción de vectores de dependovirus (AAV, por su nombre en inglés) infecciosos (p. ej., Urabe et al., 2002) y vectores lentivíricos (Lesch et al., 2008). Para la producción de vectores de AAV, se coinfectan las células de insecto con tres baculovirus recombinantes: uno que produce proteínas de la replicasa (REP) de los AAV, uno que lleva las funciones CAP para producir las proteínas estructurales víricas de los AAV (VP1, VP2, VP3), y un tercer baculovirus que comprende un vector de AAV-ITR con la capacidad de portar y transferir transgenes. Recientemente se había publicado una versión mejorada para esta producción que se basa en el uso único de baculovirus recombinantes, en donde uno de ellos lleva las funciones REP y CAP de los AAV (Smith et al., 2009). El vector de AAV que se forma es indistinguible del producido en las células de mamífero basándose en sus propiedades físicas y biológicas. El rendimiento de las partículas de vector de AAV-ITR se acercó a 5 x 104 por célula de insecto Sf9, lo que demuestra que el sistema es capaz de producir grandes cantidades de vectores de AAV de una manera sencilla. En la actualidad están en marcha ensayos clínicos con vectores de AAV procedentes de baculovirus, por ejemplo, para la deficiencia de la lipoproteína lipasa (Amsterdam Molecular Therapeutics B. V.). Como alternativa, una estrategia escalable para producir vectores lentivíricos (Lesch et al., 2008), en la que las células 293T de mamífero se transdujeron simultáneamente con cuatro baculovirus recombinantes producidos en las células de insecto para expresar todos los elementos que se necesitaban para la generación de un vector lentivírico seguro. El título de lentivirus sin concentrar en el medio de cultivo de las células de mamífero era de promedio 2,5 x 106 UT ml-1, comparable al título de los lentivirus producidos mediante los procedimientos convencionales de transfección con cuatro plásmidos. Además, se está invirtiendo en general para convertir los procedimientos de producción de vectores lentivíricos en tecnologías basadas en células de insecto que se puedan escalar mejor.

Tjia et al., 1983, descubrieron que los BV se pueden internalizar en las células de mamíferos y que algunos de los ADN víricos incluso alcanzaron el núcleo de las células. Otros estudios demostraron que los baculovirus consiguen entrar en las células de mamífero y se ponen a expresar la cloranfenicol acetiltransferasa de Escherichia coli controlada por el promotor del virus del sarcoma de Rous (Carbonell et al., 1985). Estos hallazgos condujeron al desarrollo de nuevos vehículos baculovíricos para introducir genes en las células de mamífero (Boyce y Bucher, 1996, Hofmann et al., 1995, Condreay y Kost, 2007, Kaikkonen et al., 2008). Hoy en día, existen pruebas firmes de que los vectores baculovíricos para la introducción de genes son capaces de conseguir la expresión transitoria y estable de los genes foráneos en las células de mamífero después de la selección con antibióticos (Lackner et al., 2008).

Hay todavía se sabe poco de la actividad transcripcional de los promotores de baculovirus en las células de mamíferos. Se ha demostrado que la proteína transactivadora IE1 del AcMNPV es funcional en las células de mamíferos (Murges et al., 1997), así como el promotor de temprano a tardío (ETL, por su nombre en inglés) (Liu et al., 2006a,b). Entre las otras áreas poco exploradas se encuentra la interacción de los baculovirus con los componentes del sistema inmunitario de los mamíferos. El AcMNPV es capaz de inducir la producción de citocinas antivíricas, lo que protege a las células de la infección por el virus de la estomatitis vesicular y por el virus de la gripe (Abe et al., 2003, Gronowski et al., 1999). El AcMNPV también es reconocido por el receptor 9 de tipo Toll en las células dendríticas y en los macrófagos, y el AcMNPV induce inmunidad adquirida antitumoral (Kitajima y Takaku, 2008). Estos resultados sugieren que el AcMNPV tiene el potencial de ser un virus eficaz o un agente terapéutico antitumoral que induce las inmunidades innata y adquirida. A pesar de los efectos universalmente positivos del AcMNPV sobre los componentes de la inmunidad humoral y la adaptativa mediada por células en los ratones, la interacción de los baculovirus con el sistema inmunitario humano puede ser ligeramente diferente. Adicionalmente, las propiedades inmunoadyuvantes del AcMNPV se deberían separar completamente de la respuesta inmunitaria contra las deseadas vacuna/sustancias biofarmacéuticas que se producen en las células de insecto.

Estas peculiaridades de los baculovirus son muy desventajosas en los casos donde los baculovirus se utilizan para la producción de vacunas o vectores víricos con fines terapéuticos (p. ej., AAV, lentivirus). La contaminación de los productos biofarmacéuticos producidos con ambos tipos de viriones baculovíricos — viriones de gemación (BV, por su nombre en inglés) y viriones derivados por oclusión (ODV, por su nombre en inglés)— debe, por lo tanto, evitarse. En general, las proteínas recombinantes se pueden producir en las células de insecto como proteínas citosólicas, unidas a la membrana o secretadas al exterior celular. Estas últimas proteínas secretadas están muy «contaminadas» con los BV baculovíricos presentes en el medio de cultivo. Puede ser muy difícil separar los viriones baculovíricos indeseables de los productos biofarmacéuticos recombinantes producidos en algunas configuraciones de producción y purificación. Por ejemplo, se ha demostrado que estos BV pueden causar problemas durante el procedimiento de purificación de los vectores de AAV con la tecnología de células de insecto y baculovirus (comunicación personal de O. Merten, Genethon). Por otra parte, están también los ODV, que se forman siempre en el interior del núcleo de las células infectadas, en todos los sistemas convencionales de expresión en células de insecto con baculovirus, incluso si no se forman los cuerpos de oclusión debido a la sustitución del marco abierto de lectura de la polihedrina por un gen deseado. De forma análoga, estos viriones se pueden copurificar con proteínas recombinantes producidas dentro de la célula o las VLP durante el procedimiento de purificación.

En resumen, la separación de las proteínas recombinantes y, en concreto, las VLP, de las partículas baculovíricas requiere un gran esfuerzo y se produce con elevados costes. Además, reduce la eficacia de la producción de proteínas recombinantes. Por lo tanto, es muy deseable que se desarrolle una tecnología mejorada de células de insecto y baculovirus que permita que se expresen en gran cantidad las proteínas heterólogas al mismo tiempo que se elimina la producción de baculovirus BV y ODV, y es el tema de esta solicitud de patente. Tal sistema de producción sin viriones baculovíricos representaría una mejora significativa sobre los sistemas actuales para la producción de toda clase de productos biofarmacéuticos en las células de insecto.

La presente invención se basa en la identificación del los procedimientos que usan las células de insecto y baculovirus para producir productos biofarmacéuticos con poca o ninguna cantidad de viriones baculovíricos.

Así pues, un objeto de la presente invención da a conocer un procedimiento para la producción de una sustancia biofarmacéutica, que comprende:

(a) infectar una célula de insecto productora de la sustancia biofarmacéutica con al menos un baculovirus, en donde dicho al menos un baculovirus comprende un genoma que codifica dicha sustancia biofarmacéutica, y (b) mantener la célula de insecto productora de la sustancia biofarmacéutica en condiciones tales que se produce la sustancia biofarmacéutica,

en donde cada genoma de dicho al menos un baculovirus es deficiente para el gen p6.9 o en donde dicha célula de insecto productora de la sustancia biofarmacéutica comprende un sistema de control de expresión que permite la inactivación del gen p6.9.

En una realización, la invención se refiere al procedimiento anterior, en donde el gen p6.9 se hace deficiente en dicho genoma por mutación, por ejemplo, por medio de la sustitución, inserción o deleción de nucleótidos.

En otra realización, la invención se refiere al procedimiento de más arriba, en donde la célula de insecto productora de la sustancia biofarmacéutica es una célula de insecto recombinante que comprende una construcción que expresa un ARN bicatenario (dsRNA, por su nombre en inglés) específico del gen p6.9, en donde el dsRNA se expresa opcionalmente bajo el control de un promotor inducible.

En otra realización, la invención se refiere al procedimiento de más arriba, en donde el al menos un baculovirus se produce antes de la etapa (a) en una célula productora de baculovirus que expresa una copia que complementa al gen p6.9.

En otra realización, la invención se refiere al procedimiento de más arriba, en donde la deficiencia o la inactivación del gen p6.9 no afecta a la expresión génica muy tardía de dicho baculovirus en comparación con la expresión génica muy tardía del vector baculovírico de tipo silvestre.

Aún en otra realización, la invención se refiere al procedimiento de más arriba, en donde el al menos un baculovirus procede preferiblemente del AcMNPV o del NPV de Bombyx morí (Bm).

En otra realización más, la invención se refiere al procedimiento de más arriba, en donde el producto biofarmacéutico es una proteína recombinante, un virus recombinante, un vector procedente de virus o una partícula similivírica.

En otra realización, la invención se refiere al procedimiento de más arriba, en donde el producto biofarmacéutico es un vector recombinante de AAV. Además, la invención se refiere al procedimiento de más arriba, en donde el producto biofarmacéutico es una vacuna. Ejemplos representativos de vacunas que se pueden producir con el procedimiento de la presente invención incluyen, pero sin limitarse a ellas, vacunas con partículas similivíricas de la gripe o subunidades de la gripe, y vacunas contra el virus del papiloma humano.

En otra realización, la invención se refiere al procedimiento de más arriba, en donde el producto biofarmacéutico está codificado por al menos un gen introducido en el genoma del baculovirus recombinante bajo el control de un promotor del baculovirus, preferiblemente el promotor de p10 o de la polihedrina.

Otro objeto de la invención da a conocer el uso de un sistema de células de insecto y baculovirus para la producción de un producto biofarmacéutico, en donde el sistema de células de insecto y baculovirus comprende una célula de insecto productora de un producto biofarmacéutico con al menos un baculovirus recombinante, en donde:

- cada uno, o todos, los baculovirus recombinantes comprenden un genoma de baculovirus recombinante que codifica el producto biofarmacéutico o al menos un componente del producto biofarmacéutico, y - el genoma de baculovirus recombinante carece del gen p6.9 o la célula de insecto productora del producto biofarmacéutico comprende un sistema de control de la expresión que permite la inactivación del gen p6.9.

Aún otro objeto descrito en la presente memoria se refiere a un bácmido que comprende un genoma de baculovirus, en donde dicho genoma carece de un gen esencial para el correcto ensamblaje de los viriones baculovíricos, preferiblemente en donde el genoma de dicho baculovirus carece de vp80, vp39, p6.9 o vp1054. En un aspecto particular, dicho bácmido procede del AcMNPV y carece del ORF de vp80.

Otro objeto más descrito en la presente memoria se refiere a un vector baculovírico recombinante de AcMNPV, en donde el genoma de dicho baculovirus carece de un gen esencial para el ensamblaje correcto de viriones baculovíricos, preferiblemente en donde el genoma de dicho baculovirus carece de vp80, vp39, vp1054 o p6.9. En un aspecto particular, la invención se refiere a un baculovirus recombinante de AcMNPV que carece del ORF de vp80.

También se describe en la presente memoria una célula de insecto infectada con el baculovirus recombinante de AcMNPV mencionado más arriba.

Otro objeto descrito se refiere a una célula de insecto, que comprende una construcción que expresa un dsRNA específico de un gen esencial para el ensamblaje correcto de viriones baculovíricos, preferiblemente dirigida contra vp80, vp39, vp1054 y/o p6.9, en donde dicha construcción está preferiblemente integrada en el genoma de la célula de insecto.

Otro objeto más descrito en la presente memoria se refiere a una célula de insecto que comprende un casete de expresión que codifica un gen esencial para el ensamblaje correcto de viriones baculovíricos. En particular, la invención se refiere a dicha célula de insecto en la que el gen codificado por el casete de expresión es vp80, vp39, vp1054 y/o p6.9.

Otro objeto descrito en la presente memoria se refiere a un procedimiento para la producción de un baculovirus que carece de al menos un gen esencial para el ensamblaje correcto de viriones baculovíricos, que comprende la etapa de transfectar una célula de insecto que comprende un casete de expresión que codifica un gen esencial para el ensamblaje correcto de viriones baculovíricos, con un bácmido que comprende un genoma baculovírico, en donde dicho genoma carece de un gen esencial para el ensamblaje correcto de viriones baculovíricos, preferiblemente en donde el genoma de dicho baculovirus carece de vp80, vp39, p6.9 y/o vp1054, en donde el gen esencial para el ensamblaje correcto de viriones baculovíricos en dicho bácmido es el gen codificado mediante el casete de expresión comprendido en dicha célula de insecto.

La presente invención se refiere a la producción de productos biofarmacéuticos en las células de insecto mediante la aplicación de un sistema baculovírico, pero sin la coproducción de viriones baculovíricos contaminantes. Los procedimientos de la invención simplifican en gran medida el procesamiento posterior de los productos biofarmacéuticos producidos en las células de insecto.

Así pues, la invención se refiere a los procedimientos para la producción de un producto biofarmacéutico mediante la aplicación de un sistema baculovírico diseñado para evitar la producción de viriones baculovíricos contaminantes. El procedimiento de la presente invención comprende la infección de células de insecto que producen productos biofarmacéuticos con al menos un baculovirus que codifica dicha sustancia biofarmacéutica.

Los baculovirus son virus ADN y envueltos de los artrópodos, de los que dos miembros son vectores de expresión bien conocidos por producir proteínas recombinantes en los cultivos de células. Los baculovirus tienen genomas bicatenarios circulares (de 80 a 200 kpb) que se pueden manipular genéticamente para permitir la introducción de un gran contenido genómico en células concretas. Los virus utilizados como vector son por lo general el virus de la nucleopolihedrosis múltiple de Autographa californica (AcMNPV) o el NPV de Bombyx morí ((Bm)NPV) (Kato et al., 2010).

Los baculovirus se utilizan con frecuencia para infectar células de insecto y que expresen proteínas recombinantes. En particular, la expresión de genes heterólogos en los insectos se puede llevar a cabo como se describe en, por ejemplo, la patente de los EE. UU. 4.745.051; Friesen et al. (1986); patente europea EP 127.839; patente europea EP 155.476; Vlak et al. (1988); Miller et al. (1988); Carbonell et al. (1988); Maeda et al. (1985); Lebacq-Verheyden et al. (1988); Smith et al. (1985); Miyajima et al. (1987); y Martin et al. (1988). En Lockow et al. (1988), Miller et al. (1986); Maeda et al. (1985) y McKenna (1989) se describen numerosas cepas y variantes de baculovirus y las correspondientes células hospedadoras de insecto permisivas que se pueden utilizar para la producción de proteínas.

De acuerdo con la presente descripción, se puede utilizar cualquier genoma procedente de un baculovirus utilizado corrientemente para la expresión recombinante de proteínas y sustancias biofarmacéuticas. Por ejemplo, el genoma del baculovirus puede proceder de, pongamos por caso, AcMNPV, BmNPV, el NPV de Helicoverpa armigera (HearNPV) o el MNPV de Spodoptera exigua, preferiblemente de AcMNPV o BmNPV. En particular, el genoma del baculovirus puede proceder del clon C6 de AcMNPV (secuencia genómica: n.° de acceso de GenBank NC_001623.1, SEQ ID n.21).

La terminología «sustancia biofarmacéutica» y «producto biofarmacéutico» pretenden definir fármacos médicos producidos por biotecnología. Como tal, los productos biofarmacéuticos pueden corresponder a fármacos producidos por técnicas recombinantes, tales como proteínas recombinantes, especialmente hormonas recombinantes o proteínas recombinantes para ser usadas como vacunas, virus, por ejemplo AAV recombinante terapéutico u otros vectores víricos para ser usados en la genoterapia, así como partículas similivíricas (VLP). Tales productos biofarmacéuticos se pretende que se administren a un sujeto que los necesita para el tratamiento preventivo o el tratamiento curativo de una afección o enfermedad en dicho sujeto que puede ser de origen humano o animal. Un producto biofarmacéutico puede corresponder a una proteína o péptido monocatenario, por ejemplo, en el caso de una proteína recombinante terapéutica, o puede ser una estructura compleja, tal como un virus o una partícula similivírica. En los últimos dos casos, los componentes del complejo se pueden expresar a partir de varios baculovirus recombinantes, en donde cada uno lleva al menos un componente de la estructura compleja o a partir de un solo baculovirus cuyo genoma se ha modificado genéticamente mediante la inserción de secuencias que codifican todos los componentes del complejo. Por ejemplo, para la producción de un AAV recombinante, se puede utilizar un sistema que comprende tres baculovirus: un baculovirus que codifica la proteína REP de AAV, un baculovirus que codifica la proteína CAP de AAV, y un baculovirus que codifica el genoma de AAV-ITR que comprende un gen terapéutico entre las dos ITR del ^aA^v. Ahora también está disponible un sistema que comprende dos baculovirus, para lo cual las secuencias de ADN que codifican la proteína REP de AAV y la proteína CAP de AAV se producen desde un único baculovirus.

En la presente memoria se describe un método en el que el gen o genes heterólogos que codifican los productos biofarmacéuticos están colocados bajo el control de un promotor baculovírico. Por ejemplo, el gen o genes heterólogos se colocan bajo el control del promotor de la polihedrina o de p10, o de cualquier otro promotor baculovírico utilizado corrientemente para la expresión en una célula de insecto (p. ej., el promotor ie-1, p6.9, gp64 o el ie-2 del MNPV de Orchyia pseudotsugata (Op)). En una realización preferida de la invención, el promotor baculovírico se selecciona de promotores de expresión muy tardía, por ejemplo, los promotores de p10 y de la polihedrina, preferiblemente bajo el control del promotor de la polihedrina.

En el procedimiento descrito en la presente memoria, al menos un gen esencial para el ensamblaje correcto de viriones baculovíricos está ausente del genoma del o de los baculovirus construidos en el procedimiento descrito más arriba, o bien se impide su expresión. Los inventores han demostrado que la deleción o la inactivación de tales genes da lugar a la reducción, o incluso a la ausencia completa, de viriones de gemación y/o viriones derivados por oclusión, las dos formas de un baculovirus.

Un «gen esencial para el ensamblaje correcto de viriones baculovíricos» es un gen cuya deficiencia o inactivación en una célula que produce baculovirus afecta negativamente al número de BV y ODV producidos por dicha célula. Tal gen se puede identificar como se da a conocer en los ejemplos que vienen a continuación en la presente memoria. En particular, se pueden utilizar ARN bicatenarios (dsRNA) específicos de un gen baculovírico concreto para valorar el impacto de la ausencia de dicho gen concreto sobre la producción de BV y ODV, por ejemplo, mediante la detección de la expresión de un gen indicador presente en el genoma baculovírico en el cultivo celular y, así pues, determinar la diseminación o la ausencia la diseminación del baculovirus (fenotipo de una única infección). Otra alternativa es que se pueden detectar los viriones baculovíricos por la presencia de proteínas estructurales baculovíricas o de secuencias del genoma baculovírico en el medio de cultivo cuando se toman muestras para la producción de BV. Ambos tipos de viriones se pueden detectar por microscopia electrónica.

Dentro de la presente memoria se describe un procedimiento en el que el gen esencial para el ensamblaje correcto de viriones baculovíricos se selecciona de vp80, vp39, vp1054 y p6.9. Más preferiblemente, el gen se selecciona de vp80 y vp39, en donde dicho gen es preferiblemente vp80. En el procedimiento de la invención, el gen esencial para el ensamblaje correcto de viriones baculovíricos es el p6.9.

La presente descripción da a conocer la inactivación de genes esencial para el ensamblaje correcto de viriones baculovíricos. Se pueden implantar varias estrategias con este propósito y en particular: la mutación, por ejemplo mediante deleción, del gen o genes seleccionados del genoma baculovírico recombinante; o la reducción de la expresión del gen seleccionado mediante un sistema de control de la expresión proporcionado en la célula de insecto productora de la sustancia biofarmacéutica que se pretende infectar con el baculovirus. Preferiblemente, el sistema de control de la expresión mediante la interferencia por ARN conlleva la represión de la expresión de la proteína o proteínas codificadas por el gen o genes seleccionados.

En una realización de la presente descripción, el genoma de al menos un baculovirus construido en el procedimiento carece de al menos un gen esencial para el ensamblaje correcto de viriones baculovíricos, en particular, de un gen que codifica vp80, vp39, vp1054 y/o p6.9, preferiblemente vp80 y/o vp39, e incluso más preferiblemente vp80. Más en concreto, dicho genoma procede del AcMNPV, más en concreto de la secuencia genómica del clon C6 del AcMNPV (n.° de acceso de GenBank NC_001623.1, SEQ ID n.° 1). Por consiguiente, en un aspecto la presente descripción se da a conocer el procedimiento que se define más arriba, en donde el genoma baculovírico es un genoma de AcMNPV, en particular un genoma del clon C6 del AcMNPV, que carece del gen que codifica vp80, vp39, vp1054 y/o p6.9, preferiblemente vp80 y/o vp39, e incluso más preferiblemente vp80. Tal y como se conoce bien en la técnica y se especifica en el acceso de GenBank n.° NC_001623.1, estos genes se colocan como sigue en el genoma del clon C6 del AcMNPV (a saber, en la SEQ ID n.° 1): posiciones 89564-91639 para vp80; posiciones 75534-76577 para vp39 (secuencia complementara); posiciones 45222-46319 para vp1054; posiciones 86712 86879 para p6.9 (secuencia complementaria).

Se debe observar que, en el caso de que el producto biofarmacéutico sea un producto complejo que comprende diferentes subunidades, cada una codificada por diferentes baculovirus, los genomas de todos los baculovirus recombinantes implicados carecen del gen esencial seleccionado para evitar que un genoma complemente a otro. Es decir, cuando se utilizan varios baculovirus para infectar la misma célula de insecto productora de la sustancia biofarmacéutica, a cada uno de estos baculovirus le falta el mismo gen o genes esenciales para el ensamblaje correcto de los viriones baculovíricos.

De acuerdo con la presente invención, un gen puede hacerse defectuoso al mutar dicho gen. Una mutación de un gen esencial para el ensamblaje correcto de viriones baculovíricos es una modificación de dicho gen que da lugar a la total ausencia de un producto génico esencial y funcional. Por consiguiente, dicha mutación puede dar lugar a la introducción de uno o varios codones de parada en el marco abierto de lectura del ARNm transcrito desde el gen esencial para el ensamblaje correcto de los viriones baculovíricos, o puede corresponder a la deleción, total o parcial, del gen esencial para el ensamblaje correcto de los viriones baculovíricos. Un gen esencial para el ensamblaje correcto de los viriones baculovíricos se puede mutar por medio de la sustitución, inserción o deleción de nucleótidos en la secuencia de todo o parte del gen de tipo silvestre (por ejemplo, en la secuencia dada a conocer por el n.° de acceso de GenBank NC_001623.1, para un genoma procedente de AcMNPV). La mutación puede corresponder a la deleción completa del gen o a solo una parte de dicho gen. Por ejemplo, se pude eliminar al menos el 50%, más preferiblemente al menos el 60%, más preferiblemente al menos el 70%, más preferiblemente al menos el 80%, e incluso más preferiblemente al menos el 90% del gen esencial para el ensamblaje correcto de los viriones baculovíricos.

El genoma baculovírico muíante se puede producir mediante los procedimientos estándares bien conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis específica de sitio (véase, p. ej., Sambrook et al., (1989)) y la recombinación con Lambda RED (Datsenko y Wanner, 2000). El gen esencial para el ensamblaje correcto de viriones baculovíricos se puede, en particular, eliminar como se da a conocer en los ejemplos que vienen a continuación. En resumen, se pueden utilizar los sitios loxP mutantes descritos por Suzuki et al. (2005), reemplazando bien totalmente o en parte el gen esencial para el ensamblaje correcto de viriones baculovíricos por un gen indicador flanqueado por los sitios LoxP mutantes por recombinación. El gen indicador (por ejemplo, el gen que codifica la cloranfenicol acetiltransferasa (cat)) luego se escinde con la aplicación de una recombinación con la recombinasa Cre.

Esta realización se ilustra en los ejemplos que vienen a continuación y se detalla para los baculovirus cuyo genoma se ha modificado por deleción de un fragmento de 2074 pb del ^oR^fde vp80 en el genoma de AcMNPV. Este genoma concreto se ofrece a modo de ejemplo no limitante de lo que es un genoma baculovírico mutante de acuerdo con la presente descripción.

Se debe observar que la construcción recombinante del genoma de baculovirus puede dar lugar a la inserción de varias secuencias como sitios de clonación o sitios de recombinación (por ejemplo, queda un sitio LoxP después de la recombinación con la recombinasa Cre). Esto es irrelevante en la medida en que el genoma resultante carezca del gen seleccionado como esencial para el ensamblaje correcto de los viriones baculovíricos.

En esta realización, en donde el genoma de al menos un baculovirus carece de al menos un gen esencial para el ensamblaje correcto del virión baculovírico, la producción de partículas recombinantes de baculovirus de gemación necesarias para la infección inicial de las células que producen las sustancias biofarmacéuticas requiere la aplicación de células especiales que rescatan el gen defectuoso, a saber, estas células que producen el baculovirus expresan el gen seleccionado. En otras palabras, la célula que produce el baculovirus expresa una copia que complementa el al menos un gen esencial para el ensamblaje correcto de los viriones baculovíricos que falta en el genoma del baculovirus. Por ejemplo, se podría plantear una línea celular procedente de Sf9 que produzca constitutivamente el producto del gen esencial para el ensamblaje correcto del virión de baculovirus. Esta línea de células recombinantes se utiliza para la producción de reservas de siembra de baculovirus, mientras que las líneas de células de insecto convencionales como Sf9, Sf21 o High-five, se pueden infectar con el baculovirus producido por la expresión heteróloga del producto biofarmacéutico. Por consiguiente, la presente descripción también se refiere a una célula de insecto modificada para que exprese un gen esencial para el ensamblaje correcto de baculovirus, en donde dicho gen mutado en un baculovirus se utiliza para la producción de productos biofarmacéuticos, tal y como se define más arriba. Tal línea celular utilizada para la producción del vector baculovírico mutante construido en el procedimiento de la presente descripción se denomina una «célula productora de baculovirus». Cuando el genoma del baculovirus carece de un gen esencial para el ensamblaje correcto de viriones baculovíricos, la célula de insecto productora de baculovirus debe proporcionar y expresar dicho gen para complementar la deficiencia y producir un baculovirus infeccioso. En una realización concreta, la célula de insecto utilizada para la producción de baculovirus se modifica mediante la transfección con un casete de expresión que codifica al menos un gen esencial para el ensamblaje correcto de viriones baculovíricos. En una realización, dicho casete de expresión se integra en el genoma de dicha célula. También se pueden utilizar células de insecto infectadas transitoriamente con al menos un plásmido que comprende el casete de expresión. La terminología «casete de expresión» se refiere a una construcción que comprende la secuencia codificante de un gen de interés unido funcionalmente a secuencias de control de la expresión. Tal casete de expresión puede ser un plásmido que comprende el ORF de un gen esencial para el ensamblaje correcto de los viriones baculovíricos bajo el control de un promotor funcional en la célula de insecto seleccionada, y no contiene secuencias del genoma baculovírico que no sean el gen esencial para que se complemente el ensamblaje correcto de viriones baculovíricos y opcionalmente se permita que la secuencia del promotor exprese dicho gen (en particular, un casete de expresión no es un bácmido ni cualquier otro genoma entero baculovírico). Las secuencias de control de expresión de ejemplo se pueden elegir entre promotores, potenciadores, aisladores, etc. En una realización, el gen para la complementación procede del genoma del baculovirus en el cual se ha inactivado el gen esencial para el ensamblaje correcto de los viriones baculovíricos. En otra realización, el gen para la complementación procede del genoma de una especie de baculovirus diferente a la del genoma del baculovirus utilizado para la producción de productos biofarmacéuticos. Por ejemplo, el baculovirus utilizado para la producción de productos biofarmacéuticos puede proceder del genoma de AcMNPV y el gen para la complementación introducido en la célula productora de baculovirus procede de BmNPV o SeMNPV. Más específicamente, el genoma del baculovirus se puede hacer que carezca de vp80, vp39, vp1054 y/o p6.9, y la célula productora de baculovirus puede comprender una copia de un gen de BmNPV o SeMNPV capaz de complementar estos genes (p. ej., como se da a conocer en los ejemplos, se elimina p6.9 en el genoma de AcMNPV y la célula productora de baculovirus proporciona una copia de rescate del gen p6.9 de SeMNPV).

Así pues, la presente descripción también da a conocer un procedimiento para la producción de un baculovirus que carece de al menos un gen esencial para el ensamblaje correcto de viriones baculovíricos, que comprende la etapa de transfectar una célula de insecto que comprende un casete de expresión que codifica un gen esencial para el ensamblaje correcto de los viriones baculovíricos, con un bácmido que comprende un genoma baculovírico, en donde dicho genoma carece de un gen esencial para el ensamblaje correcto de los viriones baculovíricos, preferiblemente en donde el genoma de dicho baculovirus carece de vp80 o vp39, p6.9 y/o vp1054, en donde el gen esencial para el ensamblaje correcto de los viriones baculovíricos en dicho bácmido es el gen codificado por el casete de expresión comprendido en dicha célula de insecto. De acuerdo con este procedimiento, el gen que falta en el genoma baculovírico se complementa con el gen que se expresa en la célula de insecto. Las células transfectadas con el bácmido se mantienen en condiciones tales que se producen los viriones baculovíricos. Estos viriones baculovíricos producidos, que comprenden un genoma en el que falta al menos un gen esencial para el ensamblaje correcto de los viriones baculovíricos, luego se recogen para su uso posterior para infectar células de insecto productoras de sustancias biofarmacéuticas para la producción de los productos biofarmacéuticos.

En la realización donde el genoma de baculovirus carece de al menos un gen esencial para el ensamblaje de los viriones baculovíricos, la célula de insecto productora de la sustancia biofarmacéutica debe ser incapaz de complementar la carencia de dicho gen. Por lo demás, la carencia sería rescatada por la célula productora de la sustancia biofarmacéutica y se podrían producir los BV y los ODV. La presencia o ausencia de un gen esencial para el ensamblaje correcto de baculovirus se puede monitorizar, por ejemplo, mediante la comprobación de dicha célula por una PCR específica de dicho gen o por la detección del producto de la proteína de este gen (por ejemplo, mediante transferencia Western con un anticuerpo específico de dicho producto génico). Hay que descartar como células productoras de productos biofarmacéuticos las células que expresan un producto funcional del gen esencial para el ensamblaje correcto de los viriones baculovíricos que se han hecho deficientes en el genoma del baculovirus construido con que se pretendía infectar dicha célula.

En otra realización de la presente descripción, la expresión del gen esencial para el ensamblaje correcto de los viriones baculovíricos se controla mediante un sistema de control de la expresión. La terminología «sistema de control de la expresión» define una modificación del sistema de células de insecto productoras del baculovirus/sistema de células productoras de los productos biofarmacéuticos y/o aún otra adaptación del genoma vírico, lo que da lugar a la regulación específica del gen esencial para el ensamblaje correcto de viriones baculovíricos. Este sistema puede ser un sistema de expresión inducible (por ejemplo, Tet-On, Tet-Off, sistemas basados en ecdisona (Dai et al., 2005) o elementos que contienen la región homóloga (hr) del baculovirus, tal como el sistema hr2 descrito por Aslanidi et al., (2009), lo que permite la inducción o la represión a voluntad del gen esencial, una construcción que expresa un ARN interferente o una combinación de estos.

En una realización concreta, la expresión del gen esencial para el ensamblaje correcto de baculovirus está inactivado por el silenciamiento mediado por ARN o la interferencia por ARN (Salem y Maruniak, 2007, Kanginakudru et al., 2007). Preferiblemente, se establece una línea celular procedente de células de insecto, en particular una línea celular procedente de Sf9, mediante la transformación estable de tal célula con una construcción que codifica un ARN bicatenario (dsRNA) específico del gen para silenciar la expresión del gen esencial para el ensamblaje correcto del virión de baculovirus. Esta línea celular que expresa el dsRNA se utiliza para la expresión del producto biofarmacéutico después de la infección con el o los baculovirus recombinantes que llevan el gen que codifica dicho producto biofarmacéutico. En esta realización, se pueden generar uno o varios baculovirus recombinantes de reserva para siembra con las líneas celulares convencionales Sf9, Sf21 o High-Five (a saber, sin necesidad de una copia que complemente el gen de la célula), ya que, en este caso, el genoma del baculovirus comprende el gen de tipo silvestre esencial para el ensamblaje correcto del virión del baculovirus.

Aún en otra realización de la presente descripción, el gen esencial para el ensamblaje correcto del virión de baculovirus se coloca bajo el control de un promotor inducible, lo que permite la expresión o bien la represión de dicho gen en condiciones controladas.

En una realización preferida, el número de viriones baculovíricos producidos con el procedimiento de la presente descripción se reduce en al menos el 50% en comparación con el número de baculovirus que de otro modo produciría la célula productora de la sustancia biofarmacéutica mediante el uso de un genoma de baculovirus que comprende todos los genes esenciales para el ensamblaje correcto de los viriones baculovíricos. Más preferiblemente, el número de viriones baculovíricos se reduce al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90% y lo más preferiblemente al menos un 95% en comparación con un genoma de baculovirus de tipo silvestre.

Tal y como se explicó más arriba, el uso de sistemas de células de insecto y baculovirus para producir los productos biofarmacéuticos en la técnica anterior se caracteriza por la coproducción de enormes cantidades de baculovirus recombinantes (y puede ser de más de 108 ufp/ml) en paralelo al producto biofarmacéutico, y que necesita desarrollar y optimizar cuidadosamente protocolos de procesamiento posteriores para inactivar y eliminar esta contaminación de baculovirus. La inactivación se puede realizar mediante la adición de una etapa de detergente que conduce a la desintegración de la capa lipídica del baculovirus contaminante, tal y como se utiliza para la purificación de las partículas similivíricas con el propósito de hacer vacunas (parvovirus porcino-VLP (Maranga et al. (2002)) o rotavirus-VLP (Mellado et al. (2008)) o la purificación de diferentes serotipos de AAV (Smith et al. 2009).

Se han utilizado más etapas de separación eficientes: centrifugación (Wang et al. (2000); Maranga et al. (2002); Mellado et al. (2008)), microfiltración (Tellez. (2005)), eliminación negativa de proteínas de baculovirus (p. ej., Mellado et al. (2008)) o cromatografía de afinidad positiva (retención/captura de una sustancia biofarmacéutica - por la que fluyen las proteínas contaminantes, tal como la captura de la proteína vp7 de rotavirus mediante la cromatografía con concanavalina A (Mellado et al. (2008), captura de las partículas víricas quiméricas e inmunógenas rVP2H de la bursitis infecciosa mediante cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (Wang et al. (2000)) o la captura de diferentes serotipos de AAV mediante cromatografía de inmunoafinidad con anticuerpos camélidos (Smith et al., 2009). En particular, debido al uso de inmunoligandos muy específicos, el uso de la inmunoafinidad permite separar completamente la sustancia biofarmacéutica a purificar (p. ej., AAV específico) de cualquier contaminante y, en el caso del sistema de baculovirus, de la enorme contaminación con baculovirus debido a la producción concomitante de baculovirus en paralelo a la sustancia biofarmacéutica.

Estas referencias presentan con mucha claridad la necesidad de estas diferentes etapas de procesamiento para inactivar y eliminar los contaminantes residuales de baculovirus, ya que sin estas etapas, el producto biofarmacéutico todavía está considerablemente contaminado con diferentes proteínas de baculovirus y no se puede utilizar con fines clínicos.

El procedimiento de la presente invención permite una reducción significativa del número de viriones baculovíricos contaminantes o incluso su total ausencia. Como consecuencia, será necesario un pequeño número de etapas de purificación para conseguir una sustancia biofarmacéutica para propósitos clínicos (o incluso sin etapas de purificación si no se produce ningún virión baculovírico). Así pues, la producción biofarmacéutica y el protocolo de purificación se simplifican con el uso del procedimiento de la presente invención, y la necesidad de eliminar el virión de baculovirus residual se reduce enormemente. En caso de que aún haya que aplicar un protocolo de purificación simplificado, el experto en la técnica puede seleccionar al menos uno de los procedimientos y los protocolos identificados más arriba para obtener un producto biofarmacéutico purificado.

Preferiblemente, el gen esencial seleccionado es un gen cuya inactivación no afecta a la expresión génica muy tardía del baculovirus, en comparación con el vector baculovírico original. En el genoma del AcMNPV (y otros abaculovirus), los promotores de p10 y de la polihedrina son los promotores que se expresan más tarde y se debe observar que, en los sistemas de producción de células de insecto y baculovirus, el gen heterólogo se inserta con más frecuencia bajo el control de estos promotores muy fuertes, lo que permite la expresión de proteínas recombinantes en grandes cantidades. Así pues, se prefiere la inactivación de un gen esencial para el ensamblaje correcto del virión de baculovirus, que no afecta a la expresión génica muy tardía. La terminología «no afecta la expresión génica muy tardía» se refiere al hecho de que el nivel de expresión de la proteína recombinante a partir del promotor baculovírico muy tardío comprendido en el genoma de un baculovirus modificado de acuerdo con la invención es al menos del 70% en comparación con los niveles obtenidos de un genoma sin modificar, más preferiblemente de más del 80%, más preferiblemente de más del 90%. Se debe mencionar que el nivel de expresión de un producto biofarmacéutico a partir de un promotor baculovírico muy tardío podría incluso ser mayor del 100% del nivel obtenido con el vector no modificado en el procedimiento de la presente invención.

Entre los genes analizados por los inventores, el gen vp80 se prefiere particularmente ya que su deleción no afecta a la expresión muy tardía, mientras que impide por completo la producción de BV y da lugar a una reducción significativa del número de nucleocápsidas intracelulares, los precursores de los ODV.

La expresión muy tardía se puede evaluar al colocar un gen indicador, por ejemplo, un gen que codifica una GFP, en particular egfp o un gen de la luciferasa, bajo el control del promotor de la polihedrina o de p10 en un vector de AcMNPV de tipo silvestre y en un genoma mutante de AcMNPV en el cual se ha inactivado el gen esencial, y la comparación de la expresión del producto del gen indicador en ambos genomas. Preferiblemente, la expresión muy tardía del vector con un esqueleto de baculovirus mutado es al menos del 60% del nivel de expresión obtenido con el vector de AcMNPV de tipo silvestre y preferiblemente de más del 80%, más preferiblemente de más del 90%, según se mide a partir de un gen indicador bajo el control del promotor del gen de p10 o bien del gen de la polihedrina.

La presente descripción también se refiere a un procedimiento para cribar genes baculovíricos, cuya inactivación podría ser útil para producir productos biofarmacéuticos sin viriones baculovíricos contaminantes en un sistema de célula de insecto y baculovirus según se define más arriba, que comprende:

a) proporcionar un cultivo de células, o células, que contienen un genoma baculovírico;

b) poner en contacto dicho cultivo de células con medios para inactivar al menos un gen baculovírico problema de dicho genoma baculovírico, por ejemplo, con ARN interferentes; y

c) analizar la formación de viriones de dicho cultivo de células en comparación con la formación de viriones a partir de un cultivo de células que no ha estado en contacto con dichos medios;

en donde se selecciona un gen problema como potencialmente útil para producir productos biofarmacéuticos si su inactivación reduce la formación de viriones baculovíricos.

En una realización concreta, el procedimiento de cribado comprende además la etapa d) de analisis de la expresión génica muy tardía en el cultivo de células puesto en contacto con dichos medios en comparación con la expresión génica muy tardía a partir de un cultivo de células que no se ha puesto en contacto con dichos medios,

en donde un gen problema se selecciona como potencialmente útil para la producción de sustancias biofarmacéuticas si su inactivación reduce la formación de viriones baculovíricos y si no afecta a la expresión génica muy tardía de dicho genoma baculovírico.

La presente descripción también se refiere a un procedimiento para cribar genes baculovíricos, cuya inactivación podría ser útil para producir productos biofarmacéuticos sin viriones baculovíricos contaminantes en un sistema de células de insecto y baculovirus tal y como se define más arriba, que comprende:

- inactivar al menos un gen problema de un genoma baculovírico (por ejemplo, mediante la deleción de dicho gen problema en dicho genoma);

- evaluar la expresión génica baculovírica muy tardía de dicho genoma baculovírico tal y como se define más arriba;

- determinar la producción de viriones baculovíricos a partir de las células que contienen dicho genoma baculovírico;

en donde un gen se selecciona como potencialmente útil para la producción de productos biofarmacéuticos si su inactivación

- reduce la producción de viriones baculovíricos, y

- no afecta a la expresión génica muy tardía de dicho genoma baculovírico, tal y como se define más arriba.

En una realización concreta del procedimiento para cribar un gen baculovírico, cuya inactivación podría ser útil para producir sustancias biofarmacéuticas, la inactivación del gen problema se lleva a cabo con un dsRNA específico de dicho gen problema. En particular, el gen baculovírico candidato se puede identificar al silenciar su expresión mediante interferencia por ARN para analizar su función en la formación del virión.

Realizaciones particulares

En la presente memoria se describen, entre otras, las siguientes realizaciones particulares:

Realización 1. Un método para la producción de un producto biofarmacéutico, que comprende:

(a) infectar una célula de insecto productora de sustancia biofarmacéutica con al menos un baculovirus, en donde dicho al menos un baculovirus comprende un genoma que codifica dicho producto biofarmacéutico, y (b) mantener la célula de insecto productora de sustancia biofarmacéutica en condiciones tales que se produce el producto biofarmacéutico,

en donde el genoma de dicho al menos un baculovirus es deficiente para al menos un gen esencial para el ensamblaje adecuado de viriones de baculovirus, o en donde dicha célula de insecto productora de sustancia biofarmacéutica comprende un sistema de control de expresión que permite la inactivación de al menos un gen esencial para el ensamblaje adecuado de viriones de baculovirus.

Realización 2. El método de acuerdo con la realización 1, en donde dicho al menos un gen esencial para el ensamblaje adecuado de viriones de baculovirus se hace deficiente en dicho genoma por medio de la sustitución, inserción o deleción de nucleótidos.

Realización 3. El método de acuerdo con la realización 1, en donde la célula de insecto productora de sustancia biofarmacéutica es una célula de insecto recombinante que comprende una construcción que expresa un dsRNA específico de al menos un gen esencial para el ensamblaje adecuado de viriones de baculovirus, en donde el dsRNA se expresa opcionalmente bajo un promotor inducible.

Realización 4. El método de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 3, en donde el al menos un baculovirus se produce antes de la etapa (a) en una célula productora de baculovirus que expresa una copia complementaria del al menos un gen esencial para el ensamblaje adecuado de viriones de baculovirus.

Realización 5. El método de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 4, en donde el al menos un gen esencial para el ensamblaje adecuado de viriones de baculovirus se selecciona de vp80, vp39, vp1054 y p6.9. Realización 6. El método de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 5, en donde la deficiencia o la inactivación del al menos un gen esencial para el ensamblaje adecuado de viriones de baculovirus no afecta a la expresión muy tardía de dicho baculovirus en comparación con la expresión muy tardía del baculovirus de tipo silvestre.

Realización 7. El método de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 6, en donde el al menos un baculovirus procede de AcMNPV o BmNPV.

Realización 8. El método de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 7, en donde el producto biofarmacéutico es una proteína recombinante, un virus recombinante o una partícula similivírica.

Realización 9. El método de acuerdo con la realización 8, en donde el producto biofarmacéutico es un AAV recombinante.

Realización 10. El método de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 9, en donde el producto biofarmacéutico está codificado por al menos un gen introducido en el genoma baculovírico recombinante bajo el control del promotor de la polihedrina o de p10.

Realización 11. Utilización de un sistema de células de insecto y baculovirus para la producción de un producto biofarmacéutico, en donde el sistema de células de insecto y baculovirus comprende una célula de insecto productora de baculovirus infectada con al menos un baculovirus recombinante, en donde:

• el baculovirus recombinante, o cada uno de ellos, comprende un genoma baculovírico que codifica el producto biofarmacéutico, o al menos un componente del producto biofarmacéutico, y

• el genoma baculovírico recombinante, o cada uno de ellos, es deficiente para al menos un gen esencial para el ensamblaje adecuado de dicho baculovirus, o la célula de insecto productora de baculovirus comprende un sistema de control de expresión que permite la inactivación del al menos un gen esencial para el ensamblaje adecuado de viriones de baculovirus.

Realización 12. Un bácmido que comprende un genoma baculovírico, en donde dicho genoma es deficiente para un gen esencial para el ensamblaje adecuado de viriones de baculovirus, preferiblemente en donde el genoma de dicho baculovirus es deficiente para vp80, vp39, vp1054 o p6.9.

Realización 13. Un vector baculovírico recombinante, preferiblemente un vector baculovírico de AcMNPV, en donde el genoma de dicho baculovirus es deficiente para un gen esencial para el ensamblaje adecuado de viriones de baculovirus, preferiblemente en donde el genoma de dicho baculovirus es deficiente para vp80, vp39, vp1054 o p6.9. Realización 14. Una célula de insecto infectada con el vector baculovírico de acuerdo con la realización 13.

Realización 15. Una célula de insecto, que comprende una construcción que expresa un dsRNA específico de un gen esencial para el ensamblaje adecuado de viriones de baculovirus, preferiblemente dirigido contra vp80, vp39, vp1054 o p6.9, en donde dicha construcción está integrada preferiblemente en el genoma de la célula de insecto. Realización 16. Una célula de insecto que comprende un casete de expresión que codifica un gen esencial para el ensamblaje adecuado de viriones de baculovirus.

Realización 17. La célula de insecto de acuerdo con la realización 16, en donde dicho gen es vp80, vp39, vp1054 y/o p6.9.

Realización 18. Un método para la producción de un baculovirus deficiente para al menos un gen esencial para el ensamblaje adecuado de viriones de baculovirus, que comprende la etapa de transfectar una célula de insecto de acuerdo con la realización 16 o 17 con un bácmido de acuerdo con la realización 12, en donde el gen esencial para el ensamblaje adecuado de viriones de baculovirus para el cual dicho bácmido es deficiente es el gen codificado por el casete de expresión comprendido en dicha célula de insecto.

Realización 19. Un método para el cribado de genes baculovíricos cuya inactivación podría ser útil para producir sustancias biofarmacéuticas sin contaminación con viriones de baculovirus en un sistema células de insecto y baculovirus, que comprende:

a) dar a conocer un cultivo celular de células que contienen un genoma baculovírico;

b) poner en contacto dicho cultivo de células con medios para inactivar al menos un gen baculovírico problema de dicho genoma baculovírico, por ejemplo, con interferencia por ARN; y

c) comprobar la formación de viriones en dicho cultivo celular en comparación con la formación de viriones a partir de un cultivo celular que no ha estado en contacto con dichos medios;

en donde se selecciona un gen problema como potencialmente útil para producir sustancias biofarmacéuticas si su inactivación da lugar a una reducción de la formación de viriones baculovíricos.

Realización 20. El método de acuerdo con la realización 19, que además comprende la etapa d) de comprobar la expresión génica muy tardía del cultivo celular que estuvo en contacto con dichos medios en comparación con la expresión génica muy tardía de un cultivo celular que no estuvo en contacto con dichos medios;

en donde un gen problema se selecciona como potencialmente útil para la producción de sustancias biofarmacéuticas si su inactivación da lugar a la reducción de la formación de viriones baculovíricos y si no afecta a la expresión génica muy tardía de dicho genoma baculovírico.

La invención se ilustrará ahora con los siguientes ejemplos, que se proporcionan como realizaciones de ejemplo no limitantes de la invención.

Leyenda de las figuras

Figura 1. Cribado por silenciamiento génico mediado por dsRNA. Las células de insecto Sf9 se inocularon en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos (2 x 105 células/pocillo) en 1 ml de medio de cultivo Sf-900 II SFM a 28 °C. Al cabo de dos horas, se retiró el medio de cultivo y las células se infectaron con baculovirus recombinantes que llevan el gen egfp bajo el control del promotor de la polihedrina (AcMNPV-EGFP) en condiciones estándares. (A) Determinación del nivel de expresión génica muy tardía mediante microscopia fluorescente. Las células se infectaron a una MDI = 10 unidades de TCID5ü/célula y la transfección con el dsRNA específico de gen para vp1054, vp39, vp80, dbp y ec-27 se realizó 1 h después de la infección (p.i.). El nivel de la expresión génica muy tardía se comprobó por fluorescencia específica de EGFP a 48 h p.i. Los dsRNA específicos de las secuencias de egfp y cat se utilizaron como controles de RNAi. (B) Medición del nivel de expresión génica muy tardía mediante un ensayo de inmunotransferencia. Las células se infectaron con AcMNPV-EGFP a una MDI = 1 y la transfección con el dsRNA específico de gen se realizó también 1 h p.i. El nivel de la expresión génica muy tardía se analizó con un antisuero policlonal anti-EGFP de conejo a las 48 h p.i. Se utilizaron anticuerpos anti-vp39 y anti-a-tubulina como controles internos. (C). Titulación y detección de los viriones de gemación que se producen en las células tratadas con dsRNA. Se recogieron los viriones de gemación a las 36 horas p.i. y se utilizaron para ensayos de dilución hasta el límite para medir los títulos de los viriones infecciosos, o bien para la detección por PCR para comprobar la presencia de las partículas víricas. (D) Presencia de viriones derivados por oclusión y estructuras con forma de bastoncillo en la células con represión de vp39 y vp80. Las células se recogieron 36 horas p.i., se lisaron y los lisados celulares se ultracentrifugaron a través de un colchón de solución de sacarosa al 40% (45.000 rpm durante 1 hora, Beckman SW55). Los sedimentos se resuspendieron en agua desmineralizada y se analizaron por microscopia electrónica con tinción negativa. Las barras representan 100 nm.

Figura 2. Construcción del bácmido de AcMNPV con vp80 anulado (vp80-null). (A) Estrategia para la construcción de un bácmido vp80-null que contiene una deleción completa del marco abierto de lectura de vp80 de AcMNPV por recombinación homóloga en E. coli. En la primera etapa, se delecionó un fragmento de 2.074 pb que abarca el ORF de vp80 y se reemplazó por un casete de secuencia que contiene el gen de resistencia al cloranfenicol (cat) flanqueado por los sitios loxP modificados (LE y RE). Posteriormente se eliminó el gen de resistencia al antibiótico (cat) de la secuencia del bácmido mediante el sistema de recombinación Cre/loxP. La secuencia del promotor del gen p48 y la señal de poliadenilación del gen he65 permanecieron intactas. En el análisis por PCR se utilizaron parejas de oligonucleótidos del locus de tipo silvestre y dos genotipos con vp80 anulado para confirmar la deleción del ORF de vp80 y la correcta inserción/deleción del casete del gen de resistencia al cloranfenicol, como se indica mediante las flechas unilaterales. Sus nombres se asignan de acuerdo con las coordenadas de la secuencia de nucleótidos. Los cebadores para la amplificación del casete del gen cat se denominan cat-F y cat-R. (B). Detección por PCR de la presencia o ausencia de modificaciones de secuencia en el locus de vp80 en los bácmidos de AcMNPV original (Ac-wt), Ac-vp80-null(+cat) y Ac-vp80null(-cat). La figura superior confirma la deleción del gen vp80 y la inserción del casete de cat en el locus de vp80 con las parejas de cebadores 90292/90889 y cat-F/cat-R. La figura inferior muestra la verificación por PCR de que la recombinación ocurrió correctamente en el locus de vp80 mediante la pareja de cebadores 89507/91713.

Figura 3. Capacidad de replicación vírica de las construcciones de bácmidos de AcMNPV con el vp80 anulado y reparado mediante los ensayos de transfección-infección. (A). Representación esquemática de los casetes de expresión transpuestos en el locus de la polihedrina. Se hicieron cuatro construcciones de reparación (vp80 impulsado por su promotor nativo, vp80 impulsado por el promotor de la polihedrina, vp80 etiquetado con FLAG en el extremo amino y vp80 etiquetado con FLAG en el extremo carboxilo, ambos expresados desde su promotor nativo). Los esqueletos del genoma del bácmido utilizados para los ensayos de transfección se indican a la izquierda. Como control positivo de la replicación vírica, se utilizó el bácmido de AcMNPV de tipo silvestre (bMON14272). El bácmido Ac-gp64null se utilizó como control negativo que representa un bácmido prototipo con un fenotipo de «infección de una sola célula». (B). Microscopia de fluorescencia con el transcurso del tiempo que muestra la propagación de la infección por las células Sf9 transfectadas con las construcciones de bácmidos indicadas. El progreso de la infección vírica se comprobó mediante la detección de EGFP a los tiempos indicados después de la transfección. A las 120 horas p.t. se recogieron los sobrenadantes de los cultivoa de células para iniciar una infección secundaria. (C) Ensayo de infección secundaria. La EGFP se detectó a las 72 horas p.i. para señalar el progreso de la infección.

Figura 4. Curvas de crecimiento de las construcciones generadas de bácmidos reparados de AcMNPV-vp80null en unos ensayos a lo largo del tiempo desde la transfección. Las células Sf9 se transfectaron con 5,0 gg de ADN de cada bácmido reparado. (a) vp80 impulsado por su promotor nativo, (b) vp80 impulsado por el promotor de la polihedrina, (c) vp80 etiquetado con FLAG en el extremo amino y (d) vp80 etiquetado con FLAG en el extremo carboxilo, ambos expresados desde el promotor de vp80. Los sobrenadantes de los cultivos de células se recogieron en los puntos de tiempo indicados después de la transfección y se les analizó la producción de virus de gemación infecciosos mediante un ensayo de dilución hasta el límite de la TCID⁵⁰. La infectividad se determinó mediante la monitorización de la expresión de la EGFP. Los puntos indican el promedio de los títulos procedentes de tres transfecciones independientes y las barras de error representan la desviación estándar.

Figura 5. El muíante AcMNPV-vp80null es incapaz de producir ningún virión de gemación infeccioso o no infeccioso. Las células Sf9 se transfectaron independientemente con 20 pg del ADN de bácmido de Ac-Avp80 (a), Ac-wt (b), Ac-Avp80-vp80 (c), Ac-Avp80-pH-vp80 (d), Ac-A vp80-FLAG-vp80 (e) o Ac-A vp80-vp80-FLAG (f). Cinco días p.t., los sobrenadantes del cultivo de células enriquecidos en virus de gemación se ultracentrifugaron y los virus de gemación se observaron al microscopio electrónico con tinción negativa (A). Las barras representan 200 nm. En paralelo, los viriones de gemación recogidos también se separaron también en SDS-PAGE, se transfirieron, y se inmunodetectaron con anticuerpos anti-VP39 o se utilizaron para la detección por PCR de la presencia de las partículas víricas (B).

Figura 6. El bácmido mutante con el gen vp80 anulado forma un número pequeño de nucleocápsidas y no produce viriones derivados por oclusión. Las células Sf9 transfectadas con Ac-Avp80 (A a D), o bien con Ac-Avp80-vp80 (E, F) o bien con Ac-wt (G, H) se fijaron, se tiñeron, se incluyeron y se obtuvieron cortes finos tal y como se describe en Materiales y Métodos. (A). Visón general representativa de la célula Sf9 transfectada con el bácmido mutante Acvp80null. (B) El mutante Ac-vp80null forma un número menor de nucleocápsidas en el estroma virógeno (C), y tampoco ningún virión derivado por oclusión en la zona anular de las células transfectadas (D). Por otra parte, la construcción del bácmido de reparación Ac-Avp80-vp80 regenera totalmente la formación de numerosas nucleocápsidas en el estroma virógeno (E), así como viriones derivados por oclusión que parecen normales en la zona anular de las células transfectadas (F). Imágenes representativas del estroma virógeno (G) y la zona anular (H) de las células transfectadas con el bácmido Ac-wt. Las barras representan 500 nm. Abreviaturas: Nc, nucleocápsida; MN, membrana nuclear; Nu, núcleo; RZ, zona anular; Mi, mitocondria; ODV, viriones derivados por oclusión; VS, estroma virógeno.

Figura 7. Complementación funcional del bácmido mutante Ac-vp80null con el gen vp80 actuando en trans. Las células Sf9 se transfectaron con el vector plZ-flag-vp80 (A) o bien plZ (B) y se sometieron a la selección mediante Zeocin™. Tres semanas después de la transfección, las poblaciones policlonales de células resistentes a Zeocin™ se inocularon en placas nuevas de 6 pocillos y se transfectaron con el bácmido mutante Ac-vp80null para comprobar la actividad de complementación. La propagación del virus se monitorizó mediante la fluorescencia específica de la EGFP a las 72 h y las 96 h p.t. A las 120 horas p.t. se recogió el sobrenadante de los cultivos de células para iniciar una infección secundaria en las células Sf9 sin tratar (tipo silvestre) (panel derecho). La EGFP se detectó a las 72 horas p.i. para señalar el progreso de la infección. La EGFP se detectó a las 120 horas p.i. para señalar el progreso de la infección.

Figura 8. Construcción de un bácmido de AcMNPV con vp39 anulado (vp39-null). (A) Estrategia para la construcción del bácmido vp39-null que contiene una deleción parcial del marco abierto de lectura del vp39 de AcMNPV mediante recombinación homóloga en E. coli. En la primera etapa se eliminó un fragmento interno de 498 pb del ORF de vp39 y reemplazó por un casete cuya secuencia contiene el gen de resistencia al cloranfenicol (cat) flanqueado por los sitios loxP modificados (LE y RE). Posteriormente, el gen cat se eliminó de la secuencia del bácmido mediante el sistema de recombinación Cre/loxP. La secuencia de los promotores de los genes lef-4 y cg-30 no se vio afectada. Las flechas indican las posiciones de las parejas de oligonucleótidos utilizadas para el análisis por PCR del locus de tipo silvestre y dos genotipos con el vp39 anulado para confirmar la deleción parcial del ORF de vp39 y la correcta inserción/deleción del casete del gen cat. Los nombres de los cebadores se designan de acuerdo con las coordenadas de la secuencia de nucleótidos. (B) Detección por PCR de la presencia o ausencia de las modificaciones de secuencia en el locus de vp39 de los bácmidos Ac-wt, Ac-vp39null(+cat) y Ac-vp39null(-cat). La figura muestra la verificación por PCR de que la recombinación ocurrió correctamente en el locus de vp39 mediante la pareja de cebadores 75834/76420.

Figura 9. Determinación de la capacidad de replicación vírica de las construcciones de los bácmidos de AcMNPV con vp39 anulado y reparado mediante los ensayos de transfección-infección. (A) Representación esquemática de los casetes de expresión, transpuestos mediante Tn7 en el locus de la polihedrina. (1) vp39 expresado por el promotor de la polihedrina, (2) un doble gen vp39 y lef-4, ambos impulsados por sus promotores nativos, (3) un doble gen vp39 y cg-30, ambos impulsados por el promotor de la polihedrina y, finalmente, (4) una construcción génica doble de vp39 etiquetado con FLAG en el extremo amino impulsado por el promotor de la polihedrina, y el ORF de cg-30 impulsado por su promotor nativo y también por el promotor de la polihedrina más arriba en la secuencia. Los esqueletos del genoma del bácmido parental utilizados para los ensayos de transfección se indican a la izquierda. El bácmido de AcMNPV de tipo silvestre (bMON14272) se utilizó como control positivo de la replicación vírica. (B) Microscopia de la fluorescencia a lo largo del tiempo que muestra la propagación de la infección en las células Sf9 transfectadas con las construcciones de los bácmidos indicadas. La progresión de los virus se comprobó mediante la detección de la EGFP en los tiempos indicados después de la transfección. A las 168 horas p.t. se recogió el sobrenadante de los cultivos celulares para iniciar una infección secundaria. (C) Ensayo de infección secundaria. La detección de la EGFP se realizó a las 72 h p.i. para medir el progreso de la infección.

Figura 10. Construcción de un bácmido de AcMNPV con el vp1054 anulado (vp1054-null). (A) Estrategia para la construcción de un bácmido vp1054-null que contiene una deleción del marco abierto de lectura de vp1054 de AcMNPV por recombinación homóloga en E. coli. Se eliminó una secuencia de 955 pb desde el extremo 3' del ORF de vp1054 y se reemplazó por un casete con la secuencia de cat flanqueada por los sitios loxP modificados (LE y RE). Al mismo tiempo se introdujo una sola mutación puntual para cambiar el primer codón de traducción ATG^ Met por ACG^ Thr, para impedir que se tradujera una proteína VP1054 con el extremo carboxilo truncado. Esto también significa que el codón AAT interno n.° 32 de lef-10 se mutó a AAC, y que ambos codifican una Asn. Posteriormente, el gen cat se eliminó con el sistema de recombinación Cre/loxP. La secuencia del promotor de vp1054/lef-10 no se vio afectada en la construcción del bácmido. Ya que se eliminó la señal de poliadenilación del gen lef-10, una nueva señal poli-A sintética combinada con el codón de parada (TAATAAA) se le introdujo en el extremo 3' del ORF de lef-10. Las flechas representan la posición de las parejas de oligonucleótidos utilizadas para el análisis por PCR del locus de tipo silvestre y dos genotipos con vp1054 anulado para confirmar la deleción del ORF de vp1054 y la correcta inserción/deleción del casete de cat. (B) Detección por PCR de la presencia o ausencia de las modificaciones de secuencia en el locus de vp1054 de los bácmidos Ac-wt, Ac-vp1054null(+cat) y Ac-vp1054null(-cat). La figura superior muestra la confirmación de la deleción del gen vp1054 y la inserción del casete de cat en el locus de vp1054 mediante las parejas de cebadores 90292/90889 y cat-F/cat-R. La figura inferior muestra la verificación por PCR de que la recombinación ocurrió correctamente en el locus de vp1054 mediante la pareja de cebadores 89507/91713.

Figura 11. Capacidad de replicación vírica de las construcciones de los bácmidos de AcMNPV con vp1054 anulado y reparado mediante los ensayos de transfección-infección. (A) Representación esquemática de los casetes de expresión transpuestos en el locus de la polihedrina. Los esqueletos del genoma de los bácmidos utilizados para los ensayos de transfección se indican a la izquierda. Se fabricaron dos construcciones procedentes de Ac-vp1054null: la primera construcción lleva solo el gen marcador egfp bajo el control del promotor de p10, y la segunda construcción lleva el marcador egfp y el locus de lef-10/vp1054 solapante impulsados por sus secuencias promotoras naturales (d). Como control positivo de la replicación vírica se utilizó el bácmido de AcMNPV de tipo silvestre (bMON14272) (a). El bácmido Ac-gp64null se utilizó como control negativo al representar un bácmido prototipo con un fenotipo de «infección de una sola célula» (b). (B) Microscopia de fluorescencia a lo largo del tiempo que muestra la propagación de la infección en las células Sf9 transfectadas con las construcciones de bácmidos indicadas. El progreso de la infección vírica se comprobó mediante la detección de la EGFP en los tiempos indicados después de la transfección. A las 120 horas p.t., el sobrenadante de los cultivos de células se recogió para iniciar una infección secundaria. (C) Ensayo de infección secundaria. Se detectó la EGFP a las 72 horas p.i. para señalar el progreso de la infección.

Figura 12. Construcción de un bácmido de AcMNPV con p6.9 anulado (p6.9-null). (A) Estrategia para la construcción de un bácmido p6.9-null que contiene una deleción completa del marco abierto de lectura de p6.9 de AcMNPV por recombinación homóloga en E. coli. Se eliminó un fragmento de 164 pb del ORF de p6.9 y se reemplazó por un gen de resistencia cat flanqueado por los sitios loxP modificados (LE y RE). Posteriormente, el gen cat se eliminó de la secuencia del bácmido por recombinación con Cre/loxP. La secuencia del promotor del gen p6.9 no se vio afectada, ya que su secuencia se solapa con el ORF de p40. Las flechas representan las posiciones de las parejas de cebadores utilizadas en el análisis por PCR del locus de tipo silvestre y dos genotipos con el p6.9 anulado. (B) Detección por PCR de la presencia o ausencia de las modificaciones de secuencia en el locus p6.9 de los bácmidos Ac-wt, Ac-vp6.9null(+cat) y Ac-vp6.9null(-cat). La figura superior muestra la inserción del casete de cat en el locus de p6.9 mediante las parejas de cebadores cat-F/cat-R. La figura inferior muestra la verificación por PCR de que la recombinación ocurrió correctamente en el locus de p6.9 mediante la pareja de cebadores 86596/86995.

Figura 13. Capacidad de replicación vírica de las construcciones de los bácmidos de AcMNPV con p6.9 anulado y reparado mediante ensayos de transfección-infección. (A) Representación esquemática de los casetes de expresión transpuestos en el locus de la polihedrina. Se fabricaron dos construcciones de reparación (los genes p6.9 de AcMNPV y p6.9 de SeMNPV, ambos impulsados por el promotor del p6.9 de AcMNPV). Los esqueletos de los genomas de bácmido utilizados para los ensayos de transfección se indican a la izquierda. Como control positivo de la replicación vírica se utilizó el bácmido de AcMNPV de tipo silvestre (bMON14272). El bácmido Ac-gp64null se utilizó como control negativo al representar un bácmido prototipo con un fenotipo de «infección de una sola célula». (B) Microscopia de fluorescencia a lo largo del tiempo que muestra la propagación de la infección en las células Sf9 transfectadas con las construcciones de bácmido indicadas. El progreso de la infección vírica se comprobó mediante la detección de la EGFP en los tiempos indicados después de la transfección. A las 120 horas p.t. se recogieron los sobrenadantes de los cultivos celulares para iniciar una infección secundaria. (C) Ensayo de infección secundaria. La EGFP se detectó a las 72 horas p.i. para señalar el progreso de la infección. (D) Comparación de las curvas de crecimiento de las construcciones AcMNPV-p6.9null (a), AcMNPV-p6.9null rescatado con p6.9 de AcMNPV (b) y AcMNPV-p6.9null rescatado con p6.9 de SeMNPV (c) con el bácmido de tipo silvestre (Ac-wt). Las células Sf9 se transfectaron con 5,0 gg de ADN de cada bácmido, los sobrenadantes de los cultivos celulares se recogieron en los momentos de tiempo indicados después de la transfección y se les analizó la producción de virus de gemación infecciosos mediante un ensayo de dilución hasta el límite de la TCID⁵⁰. Se determinó la infectividad mediante la monitorización de la expresión de EGFP. Los puntos indican el promedio de los títulos procedentes de tres transfecciones independientes y las barras de error representan la desviación estándar.

Figura 14. Análisis por transferencia Western de Flag:vp80 en las células, de los BV y de los ODV

(A) Evolución temporal de la expresión de vp80 en las células de insecto infectadas. Las células Sf9 se infectaron con el virus de reparación Ac-Avp80-Flagvp80, y se recogieron en los momentos de tiempo indicados. La FlagVP80 se detectó mediante análisis por transferencia Western desde las 12 h a las 72 h p.i. como una banda de aproximadamente 95 kDa. Además, una segunda banda específica de FlagVP80 de aproximadamente 80 kDa se acumuló desde las 48 h hasta las 72 h p.i. Se utilizó la tubulina como control de carga interno. (B) La VP80 se asocia a la fracción de la nucleocápsida de los BV. Dos días p.i., los BV se purificaron por ultracentrifugación isocinética en un gradiente de sacarosa y se separaron en fracciones de nucleocápsida (Nc) y envoltura (Env) mediante la extracción con Nonidet-P40. La Flag VP80 se detectó en la fracción Nc como una doble banda con masas moleculares detectadas entre las dos variantes (80 kDa y 95 kDa) en las células Sf9 infectadas (panel superior). La separación correcta en las fracciones Nc y Env se comprobó mediante los anticuerpos anti-VP39 y anti-GP64 (paneles inferiores). (C) La VP80 también es un componente estructural de las nucleocápsidas de los ODV. Las células Sf9 se coinfectaron con los virus de la cepa E2 de AcMNPV (MDI = 5) y Ac-Avp80-Flagvp80 (MDI = 25). Cinco días p.i., los ODV se liberaron de los cuerpos de oclusión y posteriormente se separaron en las fracciones de nucleocápsida (Nc) y envoltura (Env). El análisis por transferencia Western mostró que la VP80 está presente en la fracción Nc de DV como una sola banda de aproximadamente 80 kDa. El fraccionamiento adecuado en las fracciones Nc y Env se comprobó mediante el antisuero anti-PIF-1 (panel inferior).

Figura 15. Complementación funcional mediante complementación en trans del bácmido Ac-vp80null incapaz de producir BV. (A) Detección de FLAG:VP80 en una línea de células procedentes de Sf9 transgénicas (Sf9-vp80) mediante análisis por transferencia Western. Se utilizó la tubulina como control de carga interno. (B) Microscopia de fluorescencia (de EGFP) a lo largo del tiempo para seguir la infección de las células Sf9-vp80 transfectadas (i) o infectadas (ii) con el bácmido Ac-Avp80 (a, b). A las 120 h p.t., los sobrenadantes de los cultivos celulares se recogieron para iniciar una infección secundaria en las células Sf9-vp80 (a) o en las Sf9 (b) (paneles de la derecha). Se propagó un control negativo Ac-Avp80 en las células Sf9 (c), y el Ac-wt propagado en las células Sf9 (d) se utilizó como control positivo. (C) Comparación de la liberación de viriones infecciosos de BV. Las células Sf9-vp80 se transfectaron con el bácmido Ac-Avp80 y las células Sf9 con el bácmido Ac-Avp80 (control negativo) o bien con el Ac-wt (control positivo). Los BV se cuantificaron en los sobrenadantes de los cultivos celulares a los 6 días p.t. mediante dilución hasta el límite. Se muestran los resultados representativos de tres análisis independientes con barras de error que muestran la DE.

Figura 16. Análisis de la expresión del gen foráneo mediante inoculación de baculovirus incapaces de replicarse, complementados en trans. Las células Sf9 se infectaron con inóculo del virus Ac-wt, Ac-Avp80-Flag:vp80 o Ac-Avp80 (MDI = 10, unidades de TCID⁵⁰por célula), en donde todos expresan egfp desde el promotor muy tardío de p10. (A) A las 48 h p.i., la presencia de EGFP, Flag:VP80 y GP64 se analizó por transferencia Western. Se utilizó la actina como control de carga interno. (B) Microfotografías de células que expresan la EGFP a las 72 h p.i. (superior) y la cantidad relativa de EGFP se midió por ELISA a las 48 y 72 h p.i. (inferior). (C) Microfotografías de células que expresan la EGFP a las 72 h p.i. (superior) y el análisis de la liberación de BV para comprobar los genotipos revertientes mediante la titulación de TCID⁵⁰(inferior). Los resultados de tres análisis independientes se muestran con barras de error (DE) (B y C).

Figura 17. La nueva estrategia de la tecnología de células de insecto y baculovirus diseñada para producir sustancias biofarmacéuticas sin viriones baculovíricos contaminantes. (A) Manipulación genética de las células de insecto para que expresen un factor vírico esencial (vp80) que complementa una mutación de vp80 en el virus. Las células Sf9 transgénicas codifican el ORF de vp80 y un gen de resistencia que permite la selección con antibióticos de las células transgénicas. (B) Generación de un bácmido Ac-Avp80 incapaz de producir viriones de BV y ODV. El bácmido carece de todo el ORF de vp80. (C) Producción de una reserva para inoculación de baculovirus mediante complementación en trans en las células Sf-vp80 manipuladas genéticamente. Las células Sf9-vp80 se transfectan con el bácmido Ac-Avp80 para producir la progenie del virus por complementación en trans. Después de la propagación del virus de gemación, se producen reservas del virus de elevado título en las células para empaquetamiento de Sf9-vp80. (D) Expresión de la proteína recombinante con baculovirus. Las células Sf9 convencionales se infectan con la progenie de virus de gemación por complementación en trans. La proteína recombinante se expresa desde promotores baculovíricos muy tardíos (p10 o polh), lo que permite una expresión muy elevada, mientras que no se producen viriones baculovíricos (BV/ODV) contaminantes.

Ejemplos

Ejemplo I

Materiales y métodos

Células de insecto y virus

Las células de Spodoptera frugiperda (Sf9) se mantuvieron en el medio SF900-II sin suero (Invitrogen) en condiciones estándares. El virus AcMNPV procedente del bácmido recombinante (AcMNPV-EGFP) que lleva un gen indicador egfp bajo el control del promotor de la polihedrina, muy tardío, transpuesto en el locus de la polihedrina, se obtuvo de Pijlman et al. (2006). El virus se propagó y se determinaron sus títulos mediante un ensayo de dilución hasta el límite en las células Sf9.

Síntesis in vitro del dsRNA

El procedimiento utilizado para sintetizar el dsRNA es similar al descrito por Ramadan et al., (2007) con modificaciones menores. Todos los moldes de ADN se amplificaron por PCR con cebadores con extremos protuberantes de veinticinco nucleótidos homólogos a la secuencia del promotor de la ARN polimerasa de T7 ^{,) ( j t . l (.1.u l . K . í j . ] ( , K „ i f . t , ]},]()<)() ^.). La secuencia de los cebadores que se indican a continuación se ofrecen en la tabla 1. Para amplificar estos genes se utilizaron los siguientes cebadores: los cebadores vp39-F y vp39-R para vp39; los cebadores 45510 y 46235 para vp1054, los cebadores 90292 y 90889 para vp80; los cebadores ec-27-F y ec-27-R para odv-ec27; y los cebadores dbp-F y dbp-R para dbp. Para analizar la eficacia de los estudios de RNAi, fabricamos dsRNA contra egfp con los cebadores gfp-F y gfp-R, y para tener un control negativo fabricamos dsRNA con los cebadores cat-F y cat-R para el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (cat).

Los productos de la PCR se purificaron con el kit GFX Illustra de purificación de banda en gel y de ADN de PCR (GE Healthcare, Buckinghamshire, Gran Bretaña) y se utilizaron como moldes para la síntesis in vitro del dsRNA con el sistema de RNAi T7 RiboMAX™ Express (Promega, Madison, WI, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, aproximadamente 1 qg de molde de ADN purificado se utilizó para la síntesis del ARN a 37 °C durante 4 h. Después de la síntesis, se retiraron los moldes de ADN mediante digestión con ADNasa. Las hebras de ARN complementarias se hibridaron mediante incubación a 70 °C durante 10 min y luego un enfriamiento lento a temperatura ambiente (aproximadamente 30 min). Las moléculas de ARN sin hibridar (monocatenarias) se degradaron mediante el tratamiento con la ARNasa A (30 min, 37 °C). Finalmente, el dsRNA se precipitó con isopropanol, se resuspendió en agua estéril tratada con DEPC a una concentración final de 0,5-1 mg/ml y su pureza e integridad se comprobaron mediante electroforesis en gel de agarosa. El dsRNA se mantuvo a -80 °C en alícuotas de 40 ql. Inmediatamente antes de la transfección, el dsRNA se descongeló en hielo.

Procedimiento de RNAi en las células de insecto infectadas con baculovirus

Las células Sf9 se inocularon en placas de cultivo de 24 pocillos (2 x 105 células/pocillo) en 1 ml del medio de cultivo Sf900-M sin suero a 28 °C. Al cabo de dos horas se retiró el medio de cultivo y las células se infectaron con el baculovirus recombinante AcMNPV-EGFP a una multiplicidad de infección (MDI) de 10 unidades de TCID5ü/célula durante 1 h, en condiciones estándares. Una hora después de la infección (p.i.), el dsRNA (20 qg/pocillo) se introdujo en las células mediante transfección con Cellfectin™ (Invitrogen) en medio sin suero de Grace. Al cabo de 4 h, la mezcla de transfección se reemplazó por el medio Sf900-M sin suero. Las células se incubaron en total 48 h p.i. a 28 °C y, a continuación, se recogieron por centrifugación a 1000xg durante 5 min para el análisis por microscopia electrónica y transferencia Western. Sin embargo, una quinta parte del medio de cultivo se recogió a 36 h p.i. y se utilizó para la titulación de viriones de gemación mediante ensayos de dilución de punto final o para la detección del ADN vírico por PCR. En todos los experimentos, el dsRNA que corresponde al gen cat se tomó como control negativo. Por otra parte, el dsRNA específico del gen egfp se utilizó como control positivo para el procedimiento de RNAi.

Electroforesis en SDS-poliacrilamida y transferencia Western

Para la inmunodetección, las células Sf9 se lisaron a 95 °C durante 10 min en Tris-HCl a 125 mM, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 2%, 2-mercaptoetanol al 5%, glicerol al 10%, azul de bromofenol al 0,001%, pH 6,8. Las proteínas se separaron en geles de SDS-poliacrilamida al 10% y posteriormente se transfirieron a membranas de Immobilon-P (Millipore) por electrotransferencia semiseca. Las membranas se bloquearon durante 30 min en PBS a 1X que contiene leche en polvo desnatada al 2%, seguido de la incubación durante 1 h a temperatura ambiente con antisuero policlonal anti-GFP de conejo (Molecular Probes), antisuero policlonal anti-VP39 de conejo o antisuerpo monoclonal anti-a-tubulina (Sigma-Aldrich), todos diluidos a 1/2000 en PBS a 1X que contiene leche en polvo al 0,2%. Después del lavado (3 x 10 min) en PBS a 1X, las membranas se incubaron con una dilución 1/4000 de anticuerpos de cabra anti-IgG de conejo o bien anticuerpos de conejo anti-IgG de ratón conjugados a la fosfatasa alcalina (Sigma). Después del lavado final (3 x 10 min) en tampón a P (Tris-Cl a 100 mM [pH 9,5], NaCl a 100 mM, MgCl²a 5 mM), las transferencias se revelaron con 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato nitroazul de tetrazolio (NBT)/5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (BCIP) (Bio-Rad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Preparación de ADN genómico de virus y su detección por PCR

Se recogieron 200 ql del medio de cultivo celular a las 36 h p.i. y se utilizaron para preparar el ADN vírico. Las células y los residuos celulares se retiraron de las muestras por centrifugación a 1000xg durante 5 min. Los sobrenadantes que contienen los viriones de gemación se transfirieron cuantitativamente a nuevos tubos estériles y se centrifugaron de nuevo a 12000xg durante 90 min. Los BV sedimentados se resuspendieron en 200 ql de tampón TE (Tris-HCl a 10 mM [pH 7,5], EDTA a 1 mM) con proteinasa K (540 qg/ml) y se incubaron a 55 °C durante 2 h. Posteriormente se realizó una extracción con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y una extracción con cloroformo. El ADN se precipitó por la adición de una cantidad igual de isopropanol y el sedimento se lavó con etanol al 70%. El sedimento de ADN se disolvió en 15 ql de agua estéril y 2 ql de la solución final de ADN se aplicaron a la detección por PCR de la secuencia del gen vp39 con los cebadores mencionados más arriba. Todas las reacciones de PCR se realizaron en un volumen de 25 ql que incluía: 2 ql de ADN, dNTP a 200 qM, 10 pmol de cada cebador, MgCl²a 1,5 mM, y 1,5 U de la ADN polimerasa GoTaq (Promega). Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: una desnaturalización inicial a 94 °C durante 2 min, y tras ella 30 ciclos de desnaturalización (30 s a 94 °C), hibridación de cebadores (20 s a 60 °C) y extensión de cebadores (25 s a 72 °C). El ciclo de terminación era de 7 min a 72 °C. Los controles negativos estaban incluidos en todas las amplificaciones por PCR para comprobar los contaminantes en los reactivos. Se analizaron alícuotas (3,0 ql) de los productos de PCR por electroforesis en geles de agarosa al 1,2% (p/v), con tampón TAE a 1X, teñido con bromuro de etidio (0,5 qg/ml).

Generación de un bácmido de AcMNPV con vp80 anulado (vp80-null) y sin el gen de resistencia a antibiótico

Para determinar si la proteína VP80 tiene una función esencial en el contexto de la producción de la progenie vírica, construimos un bácmido de AcMNPV (procedente de bMON14272 (de Invitrogen)) con una deleción del ORF de vp80 por recombinación homóloga en E. coli. Para llevar a cabo esto, se amplificó un gen cat flanqueado por los sitios LoxP mutantes (Suzuki et al., 2005) con los cebadores de PCR vp80-KO-F y vp80-KO-R (véase la tabla 1) a partir de un plásmido que comprende un gen cat flanqueado por los sitios LoxP mutantes. El fragmento de PCR resultante, que contenía el gen cat flanqueado por los sitios LoxP mutantes y secuencias de aproximadamente 50 pb homólogas al AcMNPV con la región proximal en 5' o 3' del ORF de vp80, se trató con DpnI y se purificó en gel para eliminar el plásmido molde. A continuación, el producto de la PCR se introdujo por transformación en las células de E. coli DH10p que contienen bMON14272 (Invitrogen) y el plásmido pKD46 productor de la recombinasa Lambda RED (Datsenko y Wanner, 2000), que se había preparado de la siguiente manera. Las células de E. coli transformadas DH10p-bMON14272/pKD46 se hicieron crecer en cultivos de 50 ml de LB (peptona al 2,0%, extracto de levadura al 0,5%, NaCl a 85,5 mM, [pH 7,0]) con kanamicina (50 gg/ml), ampicilina (100 gg/ml) y L-arabinosa (1,5 mg/ml) a 30 °C hasta una DO⁶⁰⁰de = 0,6 y, a continuación, se hicieron electrocompetentes mediante un procedimiento estándar. Las células electroporadas se incubaron a 37 °C durante 3 h en 3 ml de medio LB y se sembraron en placas en LB-agar con cloranfenicol a una concentración de 6,5 gg/ml. Después de incubar 48 h a 37 °C, las colonias resistentes al cloranfenicol se rasparon y sembraron en medio de LB-agar nuevo con cloranfenicol a 34 gg/ml. Las placas se incubaron a 37 °C durante una noche y se seleccionaron las colonias resistentes al cloranfenicol para otra confirmación del genotipo relevante por PCR. Se utilizaron los cebadores 90292 y 90889 para confirmar la ausencia del ORF de vp80 y los cebadores cat-F y cat-R se emplearon para verificar la presencia del casete cat en el bácmido (se detallan las secuencias en la tabla 1).

Para eliminar del esqueleto del bácmido el gen de resistencia a antibiótico introducido (cat), se empleó un sistema de recombinasa Cre/LoxP. Un plásmido pCRE que lleva la recombinasa Cre obtenido de Jeanine Louwerse (LUMC Leiden, Países Bajos) se introdujo en las células de E. coli DH10p-bMON14272-vp80null y la expresión de CRE se indujo posteriormente mediante la adición de isopropiltiogalactósido (IPTG). Brevemente, las células electroporadas se incubaron a 37 °C durante 3 h en 3 ml del medio LB (peptona al 2,0%, extracto de levadura al 0,5%, NaCl a 85,5 mM, [pH 7,0]) y se sembraron en placas con el medio LB-agar que contienen kanamicina a 50 gg/ml, ampicilina a 100 gg/ml e iPTG a 2 mM. Después de incubarlas 24 h, las colonias resistentes a kanamicina y ampicilina se seleccionaron para hacer otra verificación del genotipo deseado por PCR. En el análisis por PCR, los cebadores 89507 y 91713 (tabla 1) se utilizaron para verificar la eliminación del gen cat del esqueleto del bácmido. Los clones positivos también se confirmaron por secuenciación del ADN.

Para recuperar la competencia de la transposición, el plásmido pMON7124 (Invitrogen) que codifica la transposasa cooperadora se volvió a introducir en las células de E. coli DH10p-bMON14272-vp80null. Finalmente, el gen indicador egfp se introdujo en el bácmido vp80-null para facilitar la observación de su comportamiento en las células de insecto. Brevemente, el gen indicador egfp se amplificó con los oligonucleótidos de PCR gfp-NheI-F y gfp-Sphl-R (tabla 1) a partir del plásmido pEGFP-N3 (Clontech). El producto de la PCR se clonó en el plásmido pJet1.2/Blunt con el kit de clonación de productos de PCR CloneJETTM (Fermentas) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Posteriormente, el ORF de egfp se escindió del pJET1.2-egfp sin errores con NheI y SphI y se subclonó en el pFastBacDUAL (Invitrogen) digerido con NheI y SphI para generar el plásmido pFB-egfp. Un casete de expresión que contiene el gen indicador egfp bajo control transcripcional del promotor muy tardío de p10 se transpuso desde el pFB-egfp al locus de la polihedrina del bácmido vp80-null, tal y como se describe en el manual de Bac-to-Bac (Invitrogen). En el genoma resultante se ha retirado el ORF completo de vp80 (véase la figura 2). Esto corresponde a la deleción de 2074 pb de las posiciones de nucleótidos 89564 a 91637 en el genoma del clon C6 de AcMNPV dado a conocer en la SEQ ID n.° 1.

Construcción de los bácmidos vp80-null reparados

Para preparar los vectores donantes de reparación de vp80, modificamos el plásmido pFB-egfp (véase más arriba) por retirada del promotor de la polihedrina y su reemplazo por un fragmento que contiene la región del promotor de vp80 y el ORF de vp80. Primero se amplificó un fragmento de 2300 pb que contiene el promotor de vp80 y la secuencia del ORF mediante los cebadores pvp80-Stul-F y vp80-XbaI-R (tabla 1) del molde del bácmido bMON14272, y se clonó en el vector pJet1.2/Blunt (Fermentas) para formar el pJet1.2-pvp80-vp80. Después de la verificación de la secuencia de ADN, el casete de vp80 se escindió del pJet1.2-pvp80-vp80 mediante la doble digestión con StuI y XbaI y, a continuación, se subclonó en el pFB-egfp digerido con físf1107I y XbaI y purificado en gel para generar el plásmido donante pFB-egfp-pvp80-vp80. En paralo se construyó un plásmido donante pFB-egfppolh-vp80, en donde el ORF de vp80 está impulsado por el promotor muy tardío de la polihedrina (polh). Con este objetivo, un fragmento de 2105 pb que lleva el ORF de vp80 se amplificó con los cebadores vp80-SacI-F y vp80-XbaI-R (tabla 1) y se clonó en el pJet1.2/Blunt para generar el pJet1.2-vp80. En la etapa final, se escindió el ORF de vp80 (SacI/XbaI) del pJET1.2-vp80 y se subclonó en el pFB-egfp digerido con SacI y XbaI para crear el pFB-egfppolH-vp80.

Para solucionar un problema asociado a que no se dispone del anticuerpo anti-VP80, se le añadió la etiqueta FLAG (fusión en el extremo amino y en el carboxilo) a VP80 para facilitar la inmunodetección. La secuencia de FLAG-vp80 fusionada en el extremo amino se generó mediante una estrategia de PCR de doble etapa, la llamada PCR de fusión. Primero, un fragmento de 259 pb que contiene el promotor de vp80 y la etiqueta FLAG se amplificó por PCR con los cebadores pvp80-StuI-F y vp80-FLAG-R1 a partir del bácmido molde bMON14272. Después de la purificación en gel y la cuantificación del ADN, se utilizó el fragmento de 259 pb como cebador directo en una segunda etapa de amplificación por PCR con el cebador inverso vp80-XbaI-R en el bácmido molde bMON14272. El producto final de la PCR (2324 pb) se clonó en el vector pJet1.2/Blunt (Fermentas) para formar el pJet1.2-pvp80-FLAG-vp80. Después verificar la secuencia del ADN, el casete FLAG-vp80 se escindió de pJet1.2-pvp80-FLAG-vp80 mediante la doble digestión con StuI y XbaI y, a continuación, se subclonó en el pFB-egfp purificado en gel y digerido con físt1107I y XbaI para generar el plásmido donante pFB-egfp-pvp80-FLAG-vp80. El casete vp80-FLAG con la fusión en el extremo carboxilo se amplificó con pvp80-Stul-F y vp80-FLAG-R a partir del bácmido molde bMON14272. El fragmento de 2324 pb se clonó en el pJet1.2/Blunt y posteriormente se transfirió al pFB-egfp de una manera similar a la de las construcciones anteriores.

Los insertos de todos los plásmidos donantes desarrollados se transpusieron en el bácmido vp80-null siguiendo el protocolo Bac-to-Bac (Invitrogen). El cribado de las construcciones donde se produjo la transposición en el locus de polh se hizo mediante el ensayo por PCR triple que emplea los cebadores directo e inverso de M13 y un cebador GenR específico del gen de resistencia a la gentamicina (tabla 1).

Ensayo de transfección-infección

Los ADN de los bácmidos se prepararon a partir de cultivos bacterianos de una noche en 1,5 ml inoculados con 2 a 3 colonias independientes que llevan el bácmido con el gen heterólogo insertado de acuerdo con el manual Bac-to-Bac (Invitrogen) y se analizaron en paralelo. Para las transfecciones se utilizó 1 gg de cada preparación de ADN de bácmido para transfectar 1 x 106 células Sf9 en una placa de 6 pocillos mediante el protocolo de transfección con Cellfectin™ tal y como se describe en el manual Bac-to-Bac (Invitrogen). De 72 h a 120 h después de la transfección (p.t.), se comprobó la propagación vírica mediante microscopia de fluorescencia. A las 120 h p.t., el medio de cultivo celular se centrifugó durante 5 min a 2000xg para retirar los residuos celulares y este sobrenadante aclarado se utilizó para infectar 1,5 x 106 células Sf9 en las placas de 6 pocillos. Al cabo de 72 p.i., la diseminación de la infección del virus se monitorizó de nuevo mediante microscopia de fluorescencia. En todos los experimentos se utilizó como control positivo un bácmido bMON14272 de tipo silvestre que lleva el gen indicador egfp bajo control del promotor de p10. Un bácmido bMON14272-gp64null que también lleva el gen indicador egfp bajo control del promotor de p10 sirvió como control negativo porque había perdido la capacidad de transmisión de la infección de una célula a otra (Lung et al., 2002).

Caracterización a lo largo del tiempo de la propagación vírica en el cultivo celular

Se realizaron análisis a lo largo del tiempo para comparar la producción de virus de gemación del virus AcMNPV-vp80null y las diferentes construcciones de reparación en comparación con el bácmido de AcMNPV de tipo silvestre (Ac-wt) que contiene egfp. Brevemente, las células Sf9 se inocularon en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos (1 x 106 células/pocillo en 1 ml de medio de cultivo Sf900-II sin suero a 28 °C). Al cabo de dos horas se retiró el medio de cultivo y las células se transfectaron con 5 gg del ADN del bácmido, en las condiciones estándares que se recomiendan en el manual Bac-to-Bac (Invitrogen). Se recogieron los sobrenadantes de los cultivos celulares a las 24, 48, 72, 96 y 120 h p.t. y se les analizó la producción del virus de gemación infeccioso mediante un ensayo de dilución hasta el límite para determinar la dosis infecciosa 50 para el cultivo del tejido (TCID⁵⁰). La infección se determinó mediante la monitorización de la expresión de egfp (a partir del promotor de p10). Se calcularon los valores promedio de los títulos infecciosos procedentes de tres transfecciones independientes y representaron en gráficos.

Microscopia electrónica de transmisión

Las células Sf9 de insecto se inocularon en un matraz 25T (3,5 x 106 células/matraz) y se transfectaron con 20 gg de las construcciones de bácmido Ac-Avp80, el Ac-Avp80-vp80 de rescate o Ac-wt. Al cabo de 48 h p.t., las células se recogieron y prepararon para la microscopia electrónica de transmisión tal y como se ha descrito previamente (van Lent et al., 1990). Se examinaron las muestras y se fotografiaron con un microscopio electrónico Philips CM12. Ensayo de producción del virus de gemación

Las células Sf9 de insecto se inocularon en dos matraces 25T (3,5 x 106 células/matraz) y se transfectaron con 20 gg de las construcciones de bácmido Ac-Avp80, Ac-Avp80-vp80, Ac-Avp80-pH-vp80, Ac-Avp80-FLAG-vp80, Ac-Avp80-vp80-FLAG o Ac-wt. Cinco días p.t. se recogieron los sobrenadantes de los cultivos celulares enriquecidos en BV y se ultracentrifugaron a través de un colchón de una solución de sacarosa al 10% (25.000 rpm durante 1,5 horas, Beckman SW32). Los viriones de gemación sedimentados se resuspendieron en agua desmineralizada estéril y se prepararon para la microscopia electrónica de tinción negativa, o bien para la electroforesis en SDS-poliacrilamida, o bien para la detección por PCR (como se menciona más arriba).

Purificación de ODV y estructuras con forma de bastoncillo a partir de las células infectadas

Se analizó por microscopia electrónica (EM) la presencia de ODV y estructuras de tipo bastoncillo en las células de insecto infectadas/transfectadas. Con este propósito, las células de insecto se recogieron 48 p.i., se lisaron, y los lisados celulares se ultracentrifugaron (45.000 rpm durante 1 hora, Beckman SW55) a través de un colchón de sacarosa al 40% en tampón TE (Tris-HCl a 1 mM, pH 7,4, EDTA a 0,1 mM). Los sedimentos se resuspendieron en agua desmineralizada estéril y se analizaron mediante EM de tinción negativa tal y como se había descrito previamente (van Lent et al., 1990).

Desarrollo de la línea celular transgénica procedente de Sf9 que expresa vp80

Para desarrollar una línea celular que produce la proteína VP80, un fragmento de 2105 pb que lleva el ORF de vp80 se amplificó con los cebadores vp80-Sad-F y vp80-XbaI-R (tabla 1) y se clonó en el pJet1.2/Blunt para generar el pJet1.2-vp80. En la siguiente etapa se escindió el ORF de vp80 (SacI/XbaI) del pJet1.2-vp80 y se subclonó en el plZ digerido con SacI y XbaI (Invitrogen) para crear el plZ-vp80. El vector plasmídico resultante plZ-vp80 se linealizó con Eco57I y se purificó en gel. Las células Sf9 se inocularon en placas de seis pocillos (1 x 106 células/pocillo) y se transfectaron con 10 jg del vector linealizado. Al cabo de 24 horas de la transfección, las células se seleccionaron mediante su cultivo en un medio que contiene Zeocin™ (300 jg/ml) durante 2 a 3 semanas hasta que ninguna célula Sf9 de control sobrevivió en las mismas condiciones. A continuación, las células se propagaron como una línea celular sin clonar.

Generación y caracterización de un bácmido de AcMNPV con vp39 anulado (vp39-null)

Para estudiar la importancia del gen vp39 en el contexto de la producción de la progenie vírica y el proceso de ensamblaje de las nucleocápsidas, construimos un bácmido de AcMNPV (bMON14272) con una deleción de vp39 por recombinación homóloga en E. coli de acuerdo con el mismo procedimiento que se observó anteriormente para la construcción del bácmido de AcMNPV vp80null. Ya que la secuencia del ORF de vp39 se solapa con las secuencias promotoras de los dos ORF flanqueantes (cg-30 y lef-4), sólo se pudo eliminar una parte interna del ORF de vp39 para evitar desregulaciones de la expresión de cg-30 y de lef-4. Para llegar a esto, un gen cat flanqueado por los sitios LoxP mutantes se amplificó con los cebadores de PCR vp39-KO-F y vp39-KO-R (tabla 1) a partir de un plásmido que comprende un gen cat flanqueado por los sitios LoxP mutantes. El fragmento de PCR resultante, que contenía el gen cat flanqueado por los sitios LoxP mutantes y secuencias de aproximadamente 50 pb homólogas a una región interna del ORF de vp39, se trató con DpnI y se purificó en gel para eliminar el plásmido molde. A continuación, el producto de la PCR se introdujo por transformación en las células de E. coli DH10p que contienen el bácmido bMON14272 (Invitrogen) y el plásmido pKD46 productor de la recombinasa Lamda RED (Datsenko y Wanner, 2000) preparado de la manera mencionada más arriba. En la última etapa, las colonias resistentes a la kanamicina se analizaron por PCR con los cebadores 75834 y 76420 (tabla 1) para verificar la inserción o eliminación del gen cat del esqueleto del bácmido. Los clones positivos se verificaron adicionalmente por secuenciación del ADN de los productos obtenidos de la PCR. De acuerdo con este protocolo, se retiró una parte interna (498 nt = 166 aa) del ^oR^fde vp39, coordenadas: 75894-76391 como se indica en la figura 9.

Construcción y análisis de los bácmidos vp39-null reparados

Para preparar un vector donante de reparación de vp39, modificamos el plásmido pFB-egfp (descrito más arriba) mediante la introducción del ORF de vp39 bajo el control del promotor de la polihedrina. Inicialmente, se amplificó un fragmento de 1.073 pb con los cebadores vp39-SacI-F y vp39-XbaI-R (véase la tabla 1 para la secuencia de los cebadores) a partir del molde bMON14272 y se clonó en el vector pJet1.2/Blunt (Fermentas) para formar el pJet1.2-vp39. Después de la verificación de la secuencia del ADN, el ORF de vp39 se escindió de pJet1.2-vp39 por digestión doble con SacI/XbaI y, a continuación, se subclonó en el pFB-egfp digerido con SacI/XbaI y purificado en gel para generar el plásmido donante pFB-egfp-vp39. Después de un intento infructuoso para rescatar el vp39null de AcMNPV con pFB-egfp-vp39, se preparó una serie de plásmidos donantes nuevos. Primero, un fragmento de 2.498 pb que contenía los ORF de vp39 y lef-4 se generó por PCR con los cebadores vp39-StuI-F y lef-4-XbaI-R a partir del bácmido molde bMON14272 y se clonó en el vector pJet1.2/Blunt (Fermentas) para formar el pJet1.2-vp39-lef-4. Después de la confirmación de la secuencia del ADN, el fragmento con los ORF de vp39 y lef-4 se escindió del pJet1.2-vp39-lef-4 por digestión doble con StuI/XbaI y, a continuación, se subclonó en el pFB-egfp digerido con StuI/XbaI y purificado en gel para generar el plásmido donante pFB-egfp-vp39-lef-4.

En paralelo se construyó el plásmido donante pFB-egfp-vp39-cg30, en donde la ORF de vp39 y la de cg-30 las impulsaba el promotor muy tardío de la polihedrina, y el ORF de cg-30 también puede utilizar su promotor nativo situado en del extremo 3' del ORF de vp39. Brevemente, un fragmento de 1.868 pb que llevaba los ORF de vp39 y cg-30 se amplificó con los cebadores cg30-XbaI-F y vp39-XbaI-R (descritos más arriba) y se clonó en el pJet1.2/Blunt para generar el pJet1.2-vp39-cg30. El casete vp39/cg-30 se subclonó como SacI/XbaI en el pFB-egfp para crear el pFB-egfp-vp39-cg30. Adicionalmente se construyó un vector donante similar pFB-egfp-FLAG-vp39-cg30, en donde el ORF de vp39 está etiquetado con FLAG en el extremo amino. Se empleó la misma estrategia para construir este vector, salvo que para amplificar el casete vp39/cg-30 se utilizó el cebador inverso vp39-FLAG-SacI-R en vez del cebador vp39-XbaI-R.

Todos los plásmidos donantes construidos se transpusieron en el bácmido vp39-null según el protocolo del kit Bacto-Bac (Invitrogen) y se detectó selectivamente según se detalla más arriba para los bácmidos de reparación de vp80. El análisis funcional se realizó como se describe más arriba para las construcciones de vp80.

Generación y análisis del bácmido de AcMNPV vp1054-nu\\

Para verificar la función esencial del gen vp1054 en el contexto de la producción de la progenie vírica y el ensamblaje de las nucleocápsidas, construimos un bácmido de AcMNPV (bMON14272) con una deleción de vp1054 por recombinación homóloga en E. coli de acuerdo con el mismo procedimiento que para la construcción del bácmido vp80null con alteraciones menores. Ya que el ORF de vp1054 se solapa con el ORF esencial de lef-10, no pudimos retirar el ORF entero de vp1054 sino sólo una parte de 955 pb del extremo 3' del ORF. Para impedir la traducción del mutante VP1054 con el extremo carboxilo truncado en células de insecto, decidimos mutar el primer codón de traducción ATG ^M e t a ACG ^Thr. Esta sustitución de un único nucleótido cambió también un codón interno, el n.° 32, de (AAT) a AAC en el ORF de lef-10, aunque ambos codifican el mismo aminoácido (Asn). Para cumplirlo, amplificamos el extremo en 5' del ORF de vp1054 con los cebadores vp1054-KO-F y vp1054-KO-R1 a partir del bácmido bMON14272 (Invitrogen). El producto de la PCR de 214 pb contenía una mutación del codón de inicio ATG del ORF de vp1054, introdujo una secuencia señal de parada/poli-A sintética para el ORF de lef-10, y tiene un extremo 3'-protuberante con homología al casete cat para facilitar la segunda PCR, y una secuencia de homología de 49 pb con el extremo en 5' del ORF de vp1054 para mediar la recombinación homóloga dirigida por Lambda RED en E. coli. Después de la purificación en gel y la cuantificación del ADN, el fragmento de 214 pb se utilizó como cebador directo en una PCR de segunda etapa con el cebador inverso vp1054-KO-R2 con un plásmido que comprende un gen cat flanqueado por los sitios LoxP mutantes como molde. El fragmento de PCR resultante de 1.230 pb, que contenía el gen cat flanqueado por los sitios LoxP mutantes, un extremo en 5' mutado del ORF de vp1054 y las secuencias de aproximadamente 50 pb homólogas a la región proximal en 5' o 3' del ORF de vp1054, se trató con Dpnl y se purificó en gel para eliminar el plásmido molde. La recombinación de este producto de PCR con el bácmido bMON14272 se realizó tal y como se ha descrito más arriba para el mutante de vp80. Las colonias resistentes a la kanamicina se verificaron por PCR con las parejas de cebadores cat-F/cat-R, 45510/46235 y 45122 y 46441 para comprobar la inserción o eliminación del gen cat del esqueleto del bácmido. Los sitios de inserción también se confirmaron por secuenciación del ADN. Este procedimiento dio lugar a la deleción de 955 pb de las posiciones nucleotídicas 45365 a 46319 en el genoma del clon C6 de AcMNPV dado a conocer en la SEQ ID n.° 1. Todas las secuencias de cebadores se ofrecen en la tabla 1.

Construcción de un bácmido reparado de vp1054-null

Para preparar el vector donante de reparación de vp1054, modificamos el plásmido pFB-egfp (descrito más arriba) mediante la retirada del promotor de la polihedrina y su reemplazo por un fragmento que contiene la región del promotor de vp1054 y el ORF de vp1054. Primero, un fragmento de 1,714 pb que contiene el promotor de vp1054 y la secuencia del ORF se amplificó con los cebadores vp1054-Rep-F y vp1054-Rep-R a partir del bácmido molde bMON14272, y se clonó en el vector pJet1.2/Blunt (Fermentas) para formar el pJet1.2-pvp1054-vp1054. Después de la verificación de secuencia de ADN, el casete de vp1054 se escindió del pJet1.2-pvp1054-vp1054 mediante la digestión doble con StuI y XbaI y, a continuación, se subclonó en el pFB-egfp purificado en gel y digerido con físt1107l y Xbal para generar el plásmido donante pFB-egfp-pvp1054-vp1054. Los plásmidos donantes desarrollados se transpusieron en el bácmido vp1054-null según el protocolo de Bac-to-Bac (Invitrogen) y se detectaron selectivamente. Los bácmidos recombinantes se analizaron tal y como se detalló más arriba para los bácmidos de vp80.

Generación y análisis del bácmido de AcMNPV p6.9-null

Para verificar la función esencial de p6.9 en el contexto de la producción de la progenie vírica, construimos un bácmido de AcMNPV (bMON14272) con una deleción de p6.9 por recombinación homóloga en E. coli. Para conseguirlo, un gen de resistencia al cloranfenicol (cat) flanqueado por los sitios LoxP mutantes se amplificó con los cebadores para PCR p6.9-KO-F y p6.9-KO-R a partir de un plásmido que comprende este gen cat flanqueado por los sitios LoxP mutantes. Se obtuvieron virus mutantes siguiendo el mismo procedimiento que para los otros mutantes. Para el análisis por PCR de los clones mutantes obtenidos al final, las parejas de cebadores cat-F y cat-R y 86596 y 86995 se utilizaron para comprobar la inserción o eliminación del gen cat del esqueleto del bácmido. Los clones positivos también se confirmaron por secuenciación del ADN. Este procedimiento da lugar a la deleción de 164 pb de las posiciones nucleotídicas 86716 a 86879 en el genoma del clon C6 de AcMNPV dado a conocer en la SEQ ID n.° 1. Véase la tabla 1 para la secuencia de cebadores.

Construcción y análisis funcional de los bácmidos reparados de p6.9-null

Para preparar los vectores donantes de reparación de p6.9, se utilizó el vector pFB-GFP-p6.9, que fue construido por Marcel Westenberg (Universidad de Wageningen). Para fabricar este vector, la secuencia del promotor de p6.9 de AcMNOV se amplificó a partir del plásmido pAcMP1 (Hill-Perkins y Possee, 1990) con los cebadores pp6.9-F y pp6.9-R con el sistema de PCR de alta fidelidad de moldes largos Expand (Roche). El producto de la PCR se clonó como un fragmento Sa/I en el pFastBac1 (Invitrogen), del cual se delecionó el promotor de la polihedrina antes de fusionar el sitio fisf1107I al StuI para obtener el pFB1 -p6.9. El promotor p6.9 del pFB1 -p6.9 se volvió a clonar como el fragmento SnaBI/fíamHI en los sitios físt1107I y fíamHI del pFastBacDUAL (Invitrogen), con lo que se eliminó el promotor de la polihedrina. Posteriormente, el gen indicador egfp se clonó detrás del promotor de p10 en el sitio XmaI para obtener el pFB-GFP-p6.9. Finalmente, los genes p6.9 de AcMNPV y del MNPV de Spodoptera exigua (Se) se amplificaron por PCR del bácmido de AcMNPV (bMON14272) o bien del ADN genómico de SeMNPV con el sistema de PCR de alta fidelidad de moldes largos Expand y los cebadores que generan sitios EcoRI y Noñ en los extremos en 5' y 3', respectivamente (tabla 1). Los productos de la PCR se clonaron detrás del promotor de p6.9 entre los sitios EcoRI y NotI de pFB-GFP-p6.9. Todos los clones generados se secuenciaron para verificar las secuencias de p6.9 incorporadas.

Los casetes de expresión de ambos plásmidos donantes desarrollados se transpusieron en el bácmido p6.9-null siguiendo el protocolo Bac-to-Bac (Invitrogen). El cribado de las construcciones positivas para la transposición en el locus polh se realizó mediante el ensayo por PCR triple como se describe más arriba para las construcciones de vp80. El análisis se realizó como para las construcciones de vp80.

Resultados

El silenciamiento del vp80 de AcMNPV no afecta a la expresión génica muy tardía del baculovirus

Exploramos el efecto de transfectar las células Sf9 con diferentes dsRNA durante la infección con AcMNPV-GFP. Para desencadenar el silenciamiento inducido por el dsRNA sobre los genes baculovíricos seleccionados (vp1054, vp39, vp80, dbp y odv-ec27), generamos dsRNA específicos del gen mediante la síntesis in vitro con la ARN polimerasa de T7. Sin embargo, cuando empezamos estos estudios no estaba claro qué cantidad y qué momento de la transfección del dsRNA eran los más eficaces para silenciar los genes baculovíricos. Para determinar una cantidad óptima de dsRNA para los ensayos de RNAi en las células infectadas con baculovirus, primero intentamos silenciar el gen egfp indicador con diferentes cantidades de dsRNA. Estos ensayos piloto demostraron que el efecto de RNAi más potente se consigue con 100 pg de dsRNA por célula (datos sin mostrar). Al mismo tiempo, también se demostró que el tratamiento de RNAi no tiene efectos negativos sobre la producción de la progenie de viriones de gemación infecciosos. También intentamos transfectar el dsRNA en las células en dos momentos de tiempo diferentes, 24 h antes de la infección o 1 h p.i. Los resultados demostraron que la transfección realizada 1 h p.i. es más eficaz para el silenciamiento de los genes expresados en las fases tardía/muy tardía de la infección baculovírica, a diferencia de la transfección realizada 24 h antes de la infección (datos sin mostrar). Además, para asegurar que el silenciamiento era genoespecífico, el dsRNA que corresponde al gen cat se transfectó como control negativo de RNAi. En este caso pudimos observar una inhibición moderada de la propagación de la infección del baculovirus en comparación con las células de insecto sin transfectar. Sin embargo, también se observó el mismo fenómeno cuando las células de insecto se trataron solo con reactivos de transfección. Por lo tanto, podemos concluir que el efecto se puede explicar por un impacto negativo (citotoxicidad) de la presencia de reactivos de transfección sobre la viabilidad celular.

El cribado del silenciamiento de los genes de baculovirus reveló que la represión de vp1054, vp39, dbp y odv/ec-27 también está asociada a una reducción o inhibición de la expresión génica muy tardía medida mediante la detección de la EGFP (figuras 1A y 1B). La mayor inhibición se observó en las células en las que se actuó selectivamente sobre dbp y sobre odv/ec-27. La causa de este efecto se puede explicar por la presencia de transcritos de ARNm solapantes y bicistrónicos que se producen durante un ciclo de replicación del baculovirus. Finalmente, en el proceso también podía intervenir una reacción cruzada con dianas que tienen poca similitud de secuencia. Sólo las células tratadas con el dsRNA de vp80 mostraron un nivel de la expresión de EGFP similar al de las células sin transfectar o en particular al de células tratadas con el dsRNA de cat. Es importante que se observaran muy pocas células productoras de EGFP en las células de insecto donde se introdujo el dsRNA específico de egfp (control de RNAi positivo), lo que demuestra que la eficacia de la transfección era alta. Según nuestros logros sobre el cribado por RNAi, el gen (locus) vp80 parece ser un candidato adecuado para la acción selectiva por RNAi en el contexto de la interferencia con la expresión génica muy tardía del baculovirus.

La anulación de vp80 impide totalmente la producción de los BV y de los ODV de aspecto normal

Para determinar la importancia de los genes candidatos seleccionados (vp1054, vp39, vp80, dbp y odv/ec-27) en la producción de la progenie de viriones por gemación, al medio de cultivo celular (36 h p.i.) de las células tratadas con el dsRNA se le examinó la presencia de los BV. Las titulaciones por dilución hasta el límite confirmaron que todos los genes analizados son esenciales para la producción de la progenie infecciosa del virus por gemación (figura 1C). No fuimos capaces de detectar ningún BV infeccioso en las células en las que se actuó selectivamente sobre vp80 y dbp. Además, el ensayo por PCR indicó que tampoco se producían las partículas víricas no infecciosas o defectuosas en las células en las que se actuó selectivamente sobre vp80. Es importante destacar que los resultados también mostraron una disminución significativa de la producción de BV infecciosos en los controles de RNAi (células tratadas con el dsRNA específico de egfp y cat) en comparación con las células sin transfectar. La citotoxicidad de los reactivos de la transfección es de nuevo la causa supuesta de este efecto negativo. El análisis por microscopia electrónica de los lisados celulares mostró que la formación de los ODV y de las estructuras en forma de bastoncillo se inhibió totalmente en las células tratadas con el dsRNA de vp39, tal y como se esperaba (figura 1D). La producción de los ODV y de las estructuras en forma de bastoncillo también se redujo significativamente en las células de insecto tratadas con el dsRNA de vp80 (figura 1D). Sin embargo, en las células en las que se actuó selectivamente sobre vp80 pudimos encontrar principalmente nucleocápsidas de fenotipos aberrantes (de forma puntiagudas). Por otra parte, la introducción del dsRNA de cat en las células de insecto no ocasionó ningún cambio en la producción de los ODV.

El gen vp80 de AcMNPV es esencial para la replicación vírica

Se construyó un virus de AcMNPV con deleción tal y como se detalla en la figura 2. Se diseñaron construcciones de reparación de tal forma que el ORF del vp80 de tipo silvestre o los genes vp80 etiquetados con FLAG en el extremo amino o carboxilo junto con sus regiones del promotor de la polihedrina o nativas se insertaron en el locus de la polihedrina junto al gen egfp bajo el promotor de p10 (figura 3A). Para investigar la función del gen vp80, las células Sf9 se transfectaron con las construcciones de bácmidos con anulación o de reparación y se les monitorizó la expresión de EGFP por microscopia de fluorescencia. Cuando el Ac-vp80null se introdujo en las células Sf9 no se observó ninguna propagación vírica en el cultivo celular desde las 72 h y las 120 h p.t. Pudimos observar tan sólo un fenotipo de «infección de una sola célula» similar al fenotipo del bácmido Ac-gp64null (figura 3B). Los resultados indican que Ac-vp80null es capaz de alcanzar la fase muy tardía de infección como se confirmó mediante la expresión de EGFP impulsada por el promotor de p10. Desde las 72 h a las 120 h p.t. se pudo observar la expresión generalizada de EGFP en monocapas de células de insecto que se transfectaron con las tres construcciones de reparación (vp80 impulsado desde su promotor nativo, vp80 impulsado desde el promotor de la polihedrina y vp80 etiquetado con FLAG en el extremo amino impulsado por su promotor nativo), lo que indica que estos bácmidos eran capaces de producir una cantidad viriones de gemación infecciosos que era suficiente para iniciar la infección secundaria a un nivel similar al del bácmido de tipo silvestre (figura 3B). En cambio, en las células de insecto transfectadas con las construcciones de reparación de vp80 etiquetado con FLAG en el extremo carboxilo, la expresión de EGFP al cabo de 72 h p.t. sólo se observó en células aisladas que ya estaban transfectadas inicialmente, lo que indica que esta construcción de bácmido es incapaz de replicar el virus (figura 3B). Sin embargo, al cabo de las 96 h p.t. se observó la formación de calvas diminutas y a las 120 h p.t. se desarrollaron muy pocas calvas de tamaño normal. Los resultados muestran que el mutante etiquetado con FLAG en el extremo carboxilo retrasa mucho la producción de virus de gemación y mostró que para la función de VP80 era muy importante que el extremo carboxilo estuviera sin modificar. A los 5 días p.t. se retiraron los sobrenadantes de los cultivos celulares y se añadieron a las células Sf9 recién sembradas en placas y a continuación se incubaron durante 3 días para detectar la infección por el virus generado desde la células transfectadas con estos bácmidos. Tal y como se esperaba, las células Sf9 incubadas con los sobrenadantes de las transfecciones con construcciones de reparación contenían muchas células que expresaban la EGFP (figura 3C). No obstante, las células incubadas con el sobrenadante de las construcciones etiquetadas con FLAG en el extremo carboxilo presentaban una reducción significativa del número de células positivas para EGFP. Por otra parte, en las células de insecto incubadas con el sobrenadante de la transfección con el vp80 anulado no se detectó ninguna expresión de EGFP en ningún momento del tiempo analizado hasta las 72 h (figura 3C).

Además, para caracterizar el efecto exacto de la deleción del gen vp80 sobre la infección de AcMNPV, la propagación vírica en las células Sf9 transfectadas se comparó entre Ac-wt, Ac-Avp80, Ac-Avp80-vp80Rep, Ac-Avp80-polh-vp80Rep, Ac-Avp80-FLAG-vp80Rep y Ac-Avp80-vp80-FLAGRep. Los sobrenadantes del cultivo celular de las construcciones de los bácmidos anteriores se analizaron en los momentos de tiempo indicados en busca de la producción de BV (figura 4). Tal y como se esperaba, los virus reparados de Ac-Avp80-vp80Rep, Ac-Avp80-polhvp80Rep, Ac-Avp80-FLAG-vp80Rep mostraban una cinética de replicación vírica que concordaba con la propagación del virus de tipo silvestre (Ac-wt). La producción de viriones de gemación mediante el virus Ac-Avp80-vp80-FLAGRep, con la etiqueta en el extremo carboxilo, se redujo a aproximadamente el 0,06% en comparación con el virus Ac-wt o los otros virus reparados.

Estos resultados indican que el gen vp80 es esencial para la producción de BV infecciosos. Se ha demostrado con claridad que se puede eliminar toda la secuencia del ORF de vp80 del esqueleto del bácmido y se puede rescatar adecuadamente mediante la introducción del ORF de vp80 en un sitio heterólogo (locus de la polihedrina) del genoma. También se ha demostrado que la expresión del gen vp80 se puede impulsar desde la secuencia del promotor heterólogo de la polihedrina sin ningún efecto negativo sobre la replicación vírica en el cultivo celular. Adicionalmente, observamos que el extremo amino, a diferencia del extremo carboxilo, del VP80 acepta que se le hagan modificaciones génicas (marcación con etiquetas epitópicas). Señalamos que la cinética del virus con VP80 etiquetada con FLAG en el extremo carboxilo presentaba un retraso significativo cuando se comparó con otros virus de tipo silvestre o rescatados, lo que indica la importancia funcional del extremo carboxilo de VP80.

Se necesita VP80 para la producción de BV y de ODV

Los resultados descritos más arriba indicaban que el mutante Ac-vp80null no es capaz de producir ningún virus de gemación infeccioso. Sin embargo, también había una posibilidad de que el mutante pudiera aún producir partículas de gemación no infecciosas. Para investigar esta capacidad, las células Sf9 se transfectaron con las construcciones de los bácmidos con anulación, de reparación o de tipo silvestre y los medios de cultivo celular se ultracentrifugaron para sedimentar los virus de gemación 7 días p.t. Los sedimentos formados se analizaron por microscopia electrónica de tinción negativa o bien mediante detección por PCR y transferencia Western para confirmar la presencia de los virus de gemación. Ningún virus de gemación intacto, ni partícula similivírica, ni sus estructuras (tal como la proteína principal de la cápsida VP39 y la secuencia del genoma vírico) aparecieron en el sedimento de las células transfectadas con el mutante Ac-vp80null (figuras 5A y 5B). Por otra parte, todas las construcciones de reparación analizadas produjeron virus de gemación de aspecto normal cuando se comparaban con el virus de gemación procedente del virus de tipo silvestre (figura 5A). No obstante, era muy difícil hallar viriones de gemación representativos en el sedimento de las células transfectadas con la construcción de reparación del gen vp80 etiquetado con FLAG en el extremo carboxilo.

Para caracterizar adicionalmente el efecto de la deleción del gen vp80 sobre el ciclo de vida del baculovirus, se realizó microscopia electrónica con cortes ultrafinos generados a partir de células transfectadas con el bácmido. Las células transfectadas con Ac-vp80null desarrollaron típicamente el fenotipo de célula infectada con el baculovirus, con un núcleo alargado, una cromatina hospedadora fragmentada, un estroma virógeno electrodenso, etc. (figura 6A). La ausencia de VP80 no impidió la formación de nucleocápsidas de aspecto normal dentro del estroma virógeno (figura 6C). Las nucleocápsidas formadas eran fenotípicamente indistinguibles de las producidas por los bácmidos Ac-wt o Ac-vp80null reparado. Sin embargo, las nucleocápsidas ensambladas eran quizá menos abundantes que con las células transfectadas con los bácmidos Ac-wt o Ac-vp80null reparado (figuras 6E y 6G). Además, no se pudo observar ningún virión derivado por oclusión ni haces de nucleocápsidas antes de que apareciera una envoltura en el compartimento periestromal de un nucleoplasma (también llamado la zona anular) de las células transfectadas con el bácmido Ac-vp80null (figuras 6B y 6D). Parece ser que VP80 desempeña su función durante la maduración de las nucleocápsidas y/o su liberación o transporte desde el estroma virógeno. Finalmente, VP80 puede, de algún modo, contribuir a un ensamblaje de nucleocápsidas eficaz, lo que se podría explicar por que el número de nucleocápsidas presentes en el estroma virógeno de las células transfectadas con Ac-vp80null es pequeño. Cuando el gen vp80 se introdujo de nuevo en el bácmido mutante, se pudieron observar muchas nucleocápsidas y viriones derivados por oclusión en las zonas del anillo de las células transfectadas (figura 6F). La abundancia y el aspecto de los viriones derivados por oclusión producidos en las células transfectadas con el bácmido con reparación Ac-Avp80-vp80 eran similares a los de los producidos con el bácmido de tipo silvestre (figuras 6F y 6H).

La función de VP80 se puede complementar mediante el gen vp80 por acción en trans

Para demostrar que la función de VP80 se puede complementar mediante el ORF de vp80 de acción en trans, se realizó un ensayo de complementación con una línea de células transgénica, Sf9-vp80, que estaba transformada de forma estable con el gen vp80 expresado bajo el control de un promotor temprano de ie-2 del baculovirus de Orgyia pseudotsugata. En el ensayo, las células Sf9 y Sf9-vp80 se transfectaron con el bácmido mutante Ac-vp80null (figura 7). La diseminación de la infección del virus se monitorizó mediante fluorescencia específica de EGFP a las 72 h y a las 96 h p.t. En las células Sf9-vp80 se pudieron observar calvas víricas, lo que demuestra la diseminación del virus. Por otra parte, en las células Sf9 sólo se pudo observar el fenotipo «infección de una sola célula» tal y como ya se describió más arriba. Al cabo de seis días, los sobrenadantes de cultivo de las células se recogieron y se utilizaron como un inóculo para infectar grupos nuevos de células Sf9. Al cabo de 5 días, las células positivas de EGFP se monitorizaron con microscopia de fluorescencia. Sólo se observó el fenotipo de «infección de una sola célula» en las células Sf9 que recibían el sobrenadante de las células Sf9-vp80. Como se suponía, no se detectó ninguna señal de EGFP en las células Sf9 que recibieron el sobrenadante de las células Sf9. Estos resultados demuestran que el Acvp80null se puede rescatar con las células que expresan VP80 (Sf9-vp80) y demuestran que la complementación observada se debe a la proteína VP80 expresada desde la línea celular hospedadora y no por la adquisición del gen vp80 desde la línea celular. En otras palabras, los resultados satisfacen los requisitos que se le piden para producir productos biofarmacéuticos (proteína EGFP en nuestro modelo de ensayo) sin viriones baculovíricos contaminantes.

Generación y caracterización del bácmido vp39-null

Para estudiar la funcionalidad del gen vp39 de AcMNPV durante la infección del virus, se construyó un bácmido de AcMNPV vp39-null mediante la deleción parcial del gen vp39. La construcción con la deleción se seleccionó por su resistencia al cloranfenicol, lo que indicaba que se había producido la deleción específica de sitio del gen vp39. En el bácmido de AcMNPV vp39-null resultante, la parte interna del gen vp39 estaba reemplazada correctamente por el gen cat. Posteriormente, el cat se eliminó por la recombinación Cre/LoxP (figura 8A). La secuencia de vp39 se retiró desde los nucleótidos 75894 a 76391 de acuerdo con la secuencia del genoma del clon C6 de AcMNPV (SEQ ID n.° 1). La estructura de las construcciones con la deleción de vp39 se confirmó por PCR con los cebadores 75834 y 76420 (figura 8B). Se amplificó un fragmento de ADN de 647 pb cuando se utilizó como molde el bácmido de AcMNPV de tipo silvestre, mientras que se pudo amplificar un fragmento de ADN de 1.113 pb con el molde de AcMNPV vp39-null(+cat) (figura 8B). Cuando la construcción final de AcMNPV vp80null(-cat) con eliminación del casete de cat se utilizó en el análisis por PCR, sólo se pudo detectar un pequeño fragmento de ADN de 183 pb (figura 8B). Los resultados se confirmaron por secuenciación del ADN.

El mapeo funcional del ORF de vp39 indica una probable relación funcional entre los ORF de vp39 y cg-30

Las construcciones de reparación se diseñaron de tal modo que el ORF de vp39 de tipo silvestre bajo control de la secuencia del promotor de la polihedrina se insertó en el locus de la polihedrina junto con el gen egfp controlado por el promotor de p10 (figura 9A). Para estudiar la función del gen vp39, las células Sf9 se transfectaron con las construcciones de bácmidos con anulación o de reparación y se les monitorizó la expresión de EGFP mediante microscopia de fluorescencia. Cuando el Ac-vp39null se introdujo en las células Sf9, no se observó ninguna propagación vírica desde las 72 h a las 168 h p.t. Pudimos observar sólo un fenotipo de «infección de una sola célula» similar al fenotipo del bácmido Ac-gp64null (figura 9B).

Estos resultados indican que la construcción Ac-vp39null es capaz de alcanzar la fase muy tardía de la infección, tal y como se demuestra por la expresión de EGFP impulsada por el promotor de p10. Inesperadamente, no se pudo observar ninguna propagación vírica en las monocapas de células de insecto que se transfectaron con la construcción de reparación de vp39 (vp39 impulsado por la polihedrina, Ac-Avp39-polh-vp39Rep) (figura 3B). Por este motivo, decidimos preparar tres bácmidos más de reparación que llevaban los ORF de vp39 y lef-4 bajo el control de sus promotores nativos. Cuando las células de insecto se transfectaron con estas construcciones de reparación, de nuevo no se produjo la replicación vírica (figura 9B) y se observó un fenotipo de «infección de una sola célula» desde las 72 h a las 168 h p.t. Resulta interesante que en las monocapas de células de insecto que se transfectaron con las construcciones de reparación que llevan vp39 (o vp39 etiquetado con FLAG) y cg-30 pudiéramos observar agrupaciones diminutas de células que expresaban la EGFP (3-5 células) (figura 9B). Sin embargo, no vimos una replicación vírica que se pudiera considerar completa, como la del vector de tipo silvestre (Ac-wt).

Al cabo de 7 días p.t. se recogieron los sobrenadantes de los cultivos de células y se añadieron a las células Sf9 recién sembradas en placas, que a continuación se incubaron durante 3 días para detectar la infección mediante los virus generados por las células transfectadas con todos los bácmidos mencionados aquí (figura 9C). Como se esperaba, las células Sf9 incubadas con el sobrenadante de las transfecciones de Ac-wt mostraron numerosas células que expresan la EGFP. Por otra parte, las células incubadas con los sobrenadantes de las construcciones Ac-Avp39-polh-vp39Rep y Ac-Avp39-vp39-lef-4Rep no mostraron ninguna célula positiva para la EGFP. Sin embargo, en las células de insecto incubadas con los sobrenadantes de Ac-Avp39-vp39-cg30Rep y Ac-Avp39-FLAG-vp39-Rep se detectaron muchas células que expresaban la EGFP (figura 9C). Estos resultados indicaron que se requiere una posible relación funcional entre los ORF de vp39 y cg-30 para la replicación del baculovirus.

Ya que la secuencia del ORF de vp39 se solapa con las secuencias promotoras de los dos ORF flanqueantes (lef-4 y cg-30), no pudimos eliminar el ORF de vp39 completo en nuestra construcción de bácmido vp39null. Por lo tanto, también puede ser que se pudieran expresar el mutante o los mutantes truncados en el extremo carboxilo o amino de vp39, lo que podría interferir como un inhibidor competitivo con la proteína VP39 normal.

Construcción y análisis del bácmido vp1054-null

Para estudiar la funcionalidad del gen vp1054 de AcMNPV durante la infección del virus, se construyó un bácmido de AcMNPV vp1054-null mediante la deleción parcial del gen vp1054 del bácmido de AcMNPV (bMON14272) por recombinación homóloga en E. coli. La construcción de deleción se seleccionó por su resistencia al cloranfenicol, lo que indicaba que se había producido la deleción específica de sitio del gen vp1054. En el bácmido de AcMNPV vp1054-null resultante, la parte de 955 pb del extremo 3' del gen vp1054 se reemplazó correctamente por el gen cat. Posteriormente se eliminó el casete de resistencia antibiótica (cat) del esqueleto del bácmido mediante el sistema de recombinación Cre/LoxP (figura 10A). La secuencia eliminada se retiró de las coordenadas nucleotídicas 45365 a 46319 de acuerdo con la secuencia del genoma del clon C6 de AcMNPV (SEQ ID n.° 1). La estructura de todas las construcciones de deleción se confirmó por PCR (figura 10B). Cuando el gen vp1054 está presente, como en el bácmido parental de AcMNPV de tipo silvestre, se puede amplificar un producto de PCR de 775 pb con los cebadores 45510 y 46235, mientras que se produce un fragmento de PCR de 596 pb con los cebadores cat-F y cat-R sólo cuando el gen cat se introduce en la secuencia del bácmido en el caso de la construcción vp1054null(+cat) de AcMNPV (figura 10B). El procedimiento de recombinación correcta también se confirmó mediante el mapeo por PCR del locus de vp1054 con los cebadores 45122 y 46441. Se amplificó un fragmento de ADN de 1.320 pb cuando se utilizó como molde el bácmido de AcMNPV de tipo silvestre, mientras que se pudo amplificar un fragmento de ADN de 1.353 pb en el molde de AcMNPV vp1054-null(+cat) (figura 10B). Cuando la construcción final AcMNPV-vp1054null(-cat) con eliminación del casete de cat se utilizó en el análisis por PCR, sólo se pudo detectar un fragmento de ADN de 423 pb (figura 10B). Los clones positivos se verificaron con éxito por secuenciación del ADN.

El gen vp1054 de AcMNPV es esencial para la replicación del virus

La construcción de reparación se diseño de tal manera que el ORF de vp1054 de AcMNPV con su región promotora nativa se insertara en el locus de la polihedrina junto con el gen egfp bajo el control del promotor de p10 (figura 11A). Ya que el promotor de vp1054 y la secuencia del ORF se solapa con el ORF de lef-10, la construcción de reparación también es capaz de expresar la LEF-10. Para estudiar la función del gen vp1054, las células Sf9 se transfectaron con la construcción del bácmido con anulación de vp1054 o bien con la de de reparación y se monitorizaron por la expresión de EGFP por microscopia de fluorescencia. Cuando la construcción Ac-vp1054null se introdujo en las células Sf9, no se observó ninguna propagación vírica en el cultivo celular desde las 72 h a las 120 h p.t. Pudimos observar sólo un fenotipo de «infección de una sola célula» similar al fenotipo del bácmido Ac-gp64null (figura 11B). Los resultados indican que Ac-vp1054null es capaz de alcanzar la fase muy tardía de la infección, tal y como se confirmó mediante la expresión de EGFP impulsada por el promotor de p10. Es decir, los resultados sugieren que la expresión del factor de expresión tardío 10, LEF-10, no estaba afectado en el mutante del bácmido vp1054-null. Desde las 72 h a las 120 h p.t., la expresión generalizada de la EGFP se pudo observar en las monocapas de células de insecto que se transfectaron con las construcciones de reparación (Ac-Avp1054-vp1054). Los resultados indican que el bácmido de reparación es capaz de producir una cantidad suficiente de viriones de gemación infecciosos para que se inicie la infección secundaria a un nivel similar a la del bácmido de tipo silvestre (figura 11B). Al cabo de 6 días p.t. se retiraron los sobrenadantes de los cultivos celulares y se añadieron a las células Sf9 recién sembradas en placas, y a continuación se incubaron 3 días para detectar la infección por el virus generado desde las células transfectadas con estos bácmidos. Tal y como se esperaba, las células Sf9 incubadas con los sobrenadantes de las transfecciones con las construcciones de reparación mostraron numerosas células que expresan la EGFP (figura 11C). Por otra parte, en las células de insecto incubadas con el sobrenadante de la transfección con el Ac-vp1054null anulado no se detectó ninguna expresión de EGFP en ningún punto del tiempo analizado hasta las 72 h (figura 11C).

Estos resultados indican que el gen vp1054 es esencial para la producción de BV infecciosos. Se ha demostrado con claridad que la parte de la secuencia de 955 pb del extremo 3' del ORF de vp1054 se puede eliminar completamente del esqueleto del bácmido y se puede rescatar adecuadamente por la introducción del ORF de vp1054 de AcMNPV en un sitio heterólogo (locus de la polihedrina) del genoma. Además, los resultados demostraron que la deleción del gen vp1054 no altera la expresión génica muy tardía, como se demuestra mediante las células que expresan la EGFP entre las células transfectadas con el bácmido mutante Ac-vp1054null (figura 11B).

Generación y caracterización del bácmido p6.9null

Para estudiar la funcionalidad del gen p6.9 de AcMNPV durante la infección del virus, se construyó un bácmido de AcMNPV vp80-null mediante la deleción del gen p6.9 del bácmido de AcMNPV (bMON14272) por recombinación homóloga en E. coli. La construcción con la deleción se seleccionó por su resistencia al cloranfenicol, lo que indicaba que se había producido la deleción específica de sitio del gen p6.9. En el bácmido de AcMNPV p6.9-null resultante, el gen p6.9 estaba reemplazado correctamente por el gen cat. Posteriormente se eliminó el casete de resistencia antibiótica (cat) del esqueleto del bácmido con el sistema de recombinación Cre/LoxP (figura 12A). La secuencia eliminada se retiró desde el codón de inicio de la traducción (ATG ^ Met) hasta el codón de parada (TAT ^ Tyr), coordenadas nucleotídicas 86716 a 86879 de acuerdo con la secuencia del genoma del clon C6 de AcMNPV (SEQ ID n.° 1). No se eliminó el codón de parada del ORF de p6.9 ya que su secuencia se solapa con el codón de parada del ORF flanqueante de lef-5. La estructura de todas las construcciones de deleción se confirmó por PCR (figura 12B). Cuando el gen p6.9 está presente, como en el bácmido de AcMNPV de tipo silvestre parental, solo se pudo amplificar un fragmento de PCR de 596 pb con los cebadores cat-F y cat-R cuando el gen cat se introdujo en la secuencia del bácmido en el caso de la construcción p6.9null(+cat) de AcMNPV (figura 12B). Todos los procesos de recombinación correcta se pudieron confirmar también por PCR al mapear el locus de p6.9 con los cebadores 86596 y 86995. Se amplificó un fragmento de ADN de 400 pb cuando se usó como molde un bácmido de AcMNPV de tipo silvestre, mientras que se conseguía amplificar un fragmento de ADN de 1.220 pb con el AcMNPV vp80null(+cat) de molde (figura 12B). Cuando la construcción final AcMNPV-vp80null(-cat) sin el casete de cat se utilizó en el análisis por PCR, sólo se pudo detectar un fragmento pequeño de ADN de 290 pb (figura 12B). Los clones positivos se verificaron satisfactoriamente mediante secuenciación del ADN.

El gen p6.9 de AcMNPV es esencial para la replicación vírica

Las construcciones de reparación se diseñaron de tal manera que los ORF de p6.9 de tipo silvestre de AcMNPV o de SeMNPV con la región promotora de p6.9 de AcMNPV se insertaron en el locus de la polihedrina con el gen egfp bajo el promotor de p10 (figura 13A). Para estudiar la función del gen p6.9, las células Sf9 se transfectaron con las construcciones de bácmido con anulación o de reparación de p6.9 y se les monitorizó la expresión de la EGFP mediante microscopia de fluorescencia. Cuando el Ac-p6.9null se introdujo en las células Sf9, no se observó ninguna propagación vírica en el cultivo celular desde las 72 h a las 120 h p.t. Pudimos observar sólo un fenotipo de «infección de una sola célula» similar al fenotipo del bácmido Ac-gp64null (figura 13B). Los resultados indican que el Ac-p6.9null es capaz de alcanzar la fase muy tardía de infección como se confirmó por la expresión de la EGFP impulsada por el promotor de p10. Desde las 72 h a las 120 h p.t. se pudo observar la expresión generalizada de EGFP en las monocapas de células de insecto que se transfectaron con las dos construcciones de reparación (Ac-Ap6.9-Acp6.9 y Ac-Ap6.9-Sep6.9). Los resultados indican que estos dos bácmidos de reparación son capaces de producir una cantidad de viriones de gemación infecciosos suficientes para iniciar la infección secundaria a un nivel similar al del bácmido de tipo silvestre (figura 13B). A los 6 días p.t. se retiraron los sobrenadantes del cultivo celular y se añadieron a las células Sf9 recién sembradas en placas y a continuación se incubaron durante 3 días para detectar la infección por el virus generado por las células transfectadas con estos bácmidos. Tal y como se esperaba, las células Sf9 incubadas con los sobrenadantes de las transfecciones con las construcciones de reparación mostraban numerosas células que expresaban la EGFP (figura 13C). Por otra parte, en las células de insecto incubadas con el sobrenadante de la transfección con el Ac-p6.9null anulado, no se detectó ninguna expresión de EGFP en ningún momento del tiempo analizado hasta las 72 h (figura 3C). Además, para caracterizar el efecto exacto de la eliminación del gen p6.9 en la infección de AcMNPV, la propagación vírica en las células Sf9 transfectadas se comparó entre Ac-wt, Ac-Ap6.9, Ac-Ap6.9-Acp6.9Rep, Ac-Ap6.9-Sep6.9Rep. A los sobrenadantes del cultivo celular de todas las construcciones de bácmidos anteriores se les analizaron en los momentos de tiempo indicados la producción de BV (figura 13D). Tal y como se esperaba, los virus Ac-Ap6.9-Acp6.9Rep y Ac-Ap6.9-Sep6.9Rep mostraron una cinética de replicación vírica acorde con la propagación del virus de tipo silvestre (Ac-wt).

Estos resultados indican que el gen p6.9 es esencial para la producción de BV infecciosos. Se ha demostrado con claridad que la secuencia completa del ORF de p6.9 se puede eliminar totalmente del esqueleto del bácmido y que se puede rescatar adecuadamente mediante la introducción del ORF de vp80 de AcMNPV en un sitio heterólogo (locus de la polihedrina) del genoma. También demostramos que el gen p6.9 se pude complementar con eficacia mediante el ORF de p6.9 procedente de SeMNPV (M. Westenberg). Además, los resultados demostraron que la deleción del gen p6.9 no altera la expresión génica muy tardía, tal y como se demuestra mediante las células que expresan la EGFP entre las células transfectadas con el bácmido mutante Ac-p6.9null (figura 15B).

Ejemplo II. Los inventores han corregido el mejor modo de la presente invención en el siguiente ejemplo.

Materiales y Métodos

Generación de un bácmido vp80-null de AcMNPV sin el gen de resistencia a antibióticos

Para determinar si la proteína VP80 desempeña una función importante en el contexto de la producción de la progenie vírica, construimos un bácmido de AcMNPV (derivado de bMON14272 (de Invitrogen)) con una deleción del ORF de vp80 por recombinación homóloga en E. coli. Para conseguirlo, un gen cat flanqueado por los sitios LoxP mutantes (Suzuki et al., 2005) se amplificó con los cebadores para PCR vp80-KO-F y vp80-KO-R (véase la tabla 1) a partir de un plásmido que comprende un gen cat flanqueado por los sitios LoxP mutantes. El fragmento de PCR resultante, que contenía el gen cat flanqueado por los sitios LoxP mutantes y las aproximadamente 50 pb con homología de secuencia con AcMNPV con la región proximal en 5' o 3' del ORF de vp80 se trataron con DpnI y se purificaron en gel para eliminar el plásmido molde. A continuación, el producto de la PCR se transformó en células de E. coli DH10p que contenían el bMON14272 (Invitrogen) y el plásmido pKD46 productor de la recombinasa Lambda RED (Datsenko y Wanner, 2000), que se habían preparado de la siguiente manera. Las células de E. coli transformadas DH10p-bMON14272/pKD46 se hicieron crecer en cultivos de LB de 50 ml (peptona al 2,0%, extracto de levadura al 0,5%, NaCl a 85,5 mM, [pH 7,0]) con kanamicina (50 gg/ml), ampicilina (100 gg/ml) y L-arabinosa (1,5 mg/ml) a 30 °C para una DO⁶⁰⁰de = 0,6 y a continuación se hicieron electrocompetentes mediante un procedimiento estándar. Las células electroporadas se incubaron a 37 °C durante 3 h en 3 ml de medio LB y se sembraron en placas en LB-agar que contenían cloranfenicol a una concentración de 6,5 gg/ml. Después de una incubación de 48 h a 37 °C, las colonias resistentes al cloranfenicol se extendieron para aislar colonias en el medio LB-agar recién preparado con cloranfenicol a 34 gg/ml. Las placas se incubaron a 37 °C durante una noche y las colonias resistentes al cloranfenicol se seleccionaron para otra confirmación del genotipo pertinente por PCR. Los cebadores 90292 y 90889 se utilizaron para confirmar la ausencia del ORF de vp80 y los cebadores cat-F y cat-R se emplearon para verificar la presencia del casete de cat en el bácmido (las secuencias se detallan en la tabla 1).

Para eliminar el gen de resistencia antibiótica introducido (cat) del esqueleto del bácmido, se empleó un sistema de la recombinasa Cre/LoxP. Un plásmido pCRE que lleva la recombinasa Cre, que se obtuvo de Jeanine Louwerse (LUMC Leiden, Países Bajos), se introdujo en las células de E. coli DH10p-bMON14272-vp80null y la expresión de CRE se indujo posteriormente mediante la adición del isopropiltiogalactósido (IPTG). Brevemente, las células electroporadas se incubaron a 37 °C durante 3 h en 3 ml de medio LB (peptona al 2,0%, extracto de levadura al 0,5%, NaCl a 85,5 mM, [pH 7,0]) y se sembraron en placas de medio LB-agar con kanamicina a 50 gg/ml, ampicilina a 100 gg/ml e IPTG a 2 mM. Después de la incubación de 24 h, las colonias resistentes a la kanamicina y a la ampicilina se seleccionaron para otra verificación del genotipo deseado por PCR. En los análisis por PCR, los cebadores 89507 y 91713 (tabla 1) se utilizaron para verificar la eliminación del gen cat del esqueleto del bácmido. Los clones positivos también se confirmaron mediante secuenciación del ADN.

Para recuperar la competencia de la transposición, el plásmido pMON7124 que codifica la transposasa cooperadora (Invitrogen) se volvió a introducir en las células de E. coli DH10p-bMON14272-vp80null. Finalmente, el gen indicador egfp se introdujo en el bácmido de vp80-null para facilitar la observación de su comportamiento en las células de insecto. Brevemente, el gen indicador egfp se amplificó con los oligonucleótidos para PCR gfp-NheI-F y gfp-SphI-R (tabla 1) a partir del plásmido pEGFP-N3 (Clontech). El producto de la PCR se clonó en el plásmido pJet1.2/Blunt con el kit de clonación de PCR CloneJET™ (Fermentas) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Posteriormente se escindió el ORF de egfp de pJet1.2-egfp sin errores con NheI y SphI, y se subclonó en el pFastBacDUAL (Invitrogen) digerido con NheI y SphI para generar el plásmido pFB-egfp. Un casete de expresión que contiene el gen indicador egfp bajo el control transcripcional del promotor muy tardío de p10 se transpuso desde pFB-egfp al locus de la polihedrina del bácmido vp80-null tal y como se describe en el manual de Bac-to-Bac (Invitrogen). En el genoma resultante, se ha eliminado el ORF de vp80 completo (véase la figura 2). Esto corresponde a la deleción del 2.074 pb desde las posiciones nucleotídicas 89564 a 91637 en el genoma del clon C6 de AcMNPV dado a conocer en la SeQ ID n.° 1.

Construcción de los bácmidos vp80-null reparados

Para preparar los vectores del donante de reparación de vp80, modificamos el plásmido pFB-egfp (descrito más arriba) retirándole el promotor de la polihedrina y reemplazándolo por un fragmento que contiene la región del promotor de vp80 y el ORF de vp80. Primero, un fragmento de 2.300 pb que contiene el promotor de vp80 y la secuencia del ORF se amplificó con los cebadores pvp80-StuI-F y vp80-XbaI-R (tabla 1) a partir del bácmido molde bMON14272 y se clonó en el vector pJet1.2/Blunt (Fermentas) para formar el pJet1.2-pvp80-vp80. Después de la verificación de la secuencia del ADN, se escindió el casete de vp80 del pJet1.2-pvp80-vp80 mediante la doble digestión con StuI y XbaI, y a continuación se subclonó en el pFB-egfp digerido con físt1107I y XbaI, y purificado en gel, para generar el plásmido donante pFB-egfp-pvp80-vp80. En paralelo se construyó un plásmido donante pFB-egfp-polh-vp80, en donde el ORF de vp80 está impulsado por el promotor muy tardío de la polihedrina (polh). Con este objetivo, un fragmento de 2.105 pb que lleva el ORF de vp80 se amplificó con los cebadores vp80-SacI-F y vp80-XbaI-R (tabla 1) y se clonó en el pJet1.2/Blunt para generar el pJet1.2-vp80. En la última etapa se escindió el ORF de vp80 (SacI/XbaI) de pJet1.2-vp80 y se subclonó en el pFB-egfp digerido con SacI y XbaI para crear el pFB-egfp-polH-vp80.

Para superar el problema de la falta de anticuerpos anti-VP80, se realizó la marcación de VP80 con la etiqueta FLAG (fusión en el extremo amino y en el carboxilo) para facilitar la inmunodetección. La secuencia de FLAG-vp80 con la fusión en el extremo amino se generó mediante una estrategia de PCR en dos etapas, la llamada PCR de fusión. Primero, un fragmento de 259 pb que contenía el promotor de vp80 y la etiqueta FLAG se amplificó por PCR con los cebadores pvp80-StuI-F y vp80-FLAG-R1 a partir del bácmido molde bMON14272. Después de la purificación en gel y de la cuantificación del ADN, el fragmento de 259 pb se utilizó como cebador directo en una segunda etapa de amplificación por PCR con el cebador inverso vp80-XbaI-R sobre el bácmido molde bMON14272. El producto de PCR final (2.324 pb) se clonó en el vector pJet1.2/Blunt (Fermentas) para formar el pJet1.2-pvp80-FLAG-vp80. Después de la verificación de la secuencia de ADN, el casete FLAG-vp80 se escindió de pJet1.2-pvp80-FLAG-vp80 mediante la digestión doble con StuI y XbaI, y a continuación se subclonó en el pFB-egfp digerido con físt1107I y XbaI, y purificado en el gel, para generar el plásmido donante pFB-egfp-pvp80-FLAG-vp80. El casete vp80-FLAG con la fusión en el extremo carboxilo se amplificó con pvp80-StuI-F y vp80-FLAG-R a partir del bácmido molde bMON14272. El fragmento de 2.324 pb se clonó en el pJet1.2/Blunt y posteriormente se transfirió al pFB-egfp de un modo similar a como se realizó para las construcciones anteriores.

Los insertos de todos los plásmidos donantes construidos se transpusieron en el bácmido vp80-null según el protocolo de Bac-to-Bac (Invitrogen). La detección selectiva de las construcciones positivas para la transposición en el locus de polh se realizó mediante el ensayo por PCR triple con el empleo de los cebadores directo e inverso de M13 y un cebador GenR específico del gen de resistencia a la gentamicina (tabla 1).

Ensayo de transfección-infección

Se prepararon los ADN de bácmido a partir de cultivos bacterianos de 1,5 ml de una noche a partir de 2 o 3 colonias independientes que llevan el bácmido con el gen heterólogo insertado de acuerdo con el manual de Bac-to-Bac (Invitrogen) y se analizaron en paralelo. Para las transfecciones, 1 gg de cada preparación de ADN de bácmido se utilizó para transfectar 1 x 106 células Sf9 en una placa de 6 pocillos mediante el protocolo de transfección con Cellfectin™ tal y como se describe en el manual de Bac-to-Bac (Invitrogen). Desde las 72 h a las 120 h después de la transfección (p.t.), se comprobó la propagación vírica mediante microscopia de fluorescencia. A las 120 h p.t., el medio de cultivo celular se centrifugó durante 5 min a 2000xg para retirar los residuos celulares y este sobrenadante aclarado se utilizó para infectar 1,5 x 106 células Sf9 en placas de 6 pocillos. Después de 72 h p.i., se monitorizó de nuevo la diseminación de la infección del virus mediante microscopia de fluorescencia. En todos los experimentos se utilizó como control positivo un bácmido bMON14272 de tipo silvestre que lleva el gen indicador egfp bajo el control del promotor de p10. Un bácmido bMON14272-gp64null que también lleva el gen indicador egfp bajo el control del promotor de p10 sirvió como control negativo, ya que había perdido la capacidad de movimiento de una célula a otra para la infección (Lung et al., 2002).

Caracterización de la propagación vírica en el cultivo celular a lo largo del tiempo

Se realizaron análisis a lo largo del tiempo para comparar la producción de virus de gemación a partir del virus AcMNPV vp80null y las diferentes construcciones de reparación en comparación con el bácmido de AcMNPV de tipo silvestre (Ac-wt), todos ellos con egfp. Brevemente, las células Sf9 se inocularon en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos (1 x 106 células/pocillo) en un medio de cultivo de 1 ml de Sf900-II sin suero a 28 °C. Al cabo de dos horas se retiró el medio de cultivo y las células se transfectaron con 5 gg de ADN de bácmido en las condiciones estándares que se recomiendan en el manual de Bac-to-Bac (Invitrogen). Los sobrenadantes de los cultivos celulares se recogieron a las 24, 48, 72, 96 y 120 h p.t. y se les analizó la producción de virus de gemación infecciosos mediante un ensayo de dilución hasta el límite para determinar la dosis infecciosa 50 para el cultivo del tejido (TCID⁵⁰). La infección se determinó mediante la monitorizac ión de la expresión de egfp (a partir del promotor de p10). Se calcularon los valores promedio de los títulos infecciosos procedentes de tres transfecciones independientes y se representaron gráficamente.

Microscopia electrónica de transmisión

Las células Sf9 de insecto se inocularon en un matraz 25T (3,5 x 106 células/matraz) y se transfectaron con 20 gg de la construcción del bácmido Ac-Avp80, Ac-Avp80-vp80 de rescate o Ac-wt. Al cabo de 48 h p.t., las células se recogieron y prepararon para la microscopia electrónica de transmisión tal y como se describió anteriormente (van Lent et al., 1990). Se examinaron las muestras y se fotografiaron con un microscopio electrónico Philips CM12. Ensayo de producción del virus de gemación

Se inocularon las células de insecto Sf9 en dos matraces 25T (3,5 x 106 células/matraz) y se transfectaron con 20 gg de la construcción de bácmido Ac-Avp80, Ac-Avp80-vp80, Ac-Avp80-pH-vp80, Ac-Avp80-FLAG-vp80, Ac-Avp80-vp80-FLAG o Ac-wt. Al cabo de 5 días p.t. se recogieron los sobrenadantes del cultivo celular enriquecidos en BV y se ultracentrifugaron a través de un colchón de una solución de sacarosa al 10% (25.000 rpm durante 1,5 horas, Beckman SW32). Los viriones de gemación sedimentados se resuspendieron en agua desmineralizada estéril y se prepararon para la microscopia electrónica de tinción negativa, electroforesis de SDS-poliacrilamida o la detección por PCR (como se mencionó más arriba).

Purificación de los ODV y de las estructuras con forma de bastoncillo a partir de las células infectadas

La presencia de los ODV y de las estructuras de tipo bastoncillo en las células de insecto infectadas/transfectadas se analizó por microscopia electrónica (EM). Con este propósito, las células de insecto se recogieron 48 h p.i., se lisaron y los lisados celulares se ultracentrifugaron a través de un colchón de sacarosa al 40% en tampón TE (Tris-HCl a 1 mM, pH 7,4, EDTA a 0,1 mM) (45.000 rpm durante 1 hora, Beckman SW55). Los sedimentos se resuspendieron en agua desmineralizada estéril y se analizaron mediante EM de tinción negativa tal y como se describió previamente (van Lent et al., 1990).

Purificación y fraccionamiento de los viriones de BV y ODV

Para producir los BV, 3,0 x 107 células Sf9 se infectaron con Ac-Avp80-Flag.vp80 o el virus Ac-wt de control a una MDI = 1. Al cabo de 6 días p.i. se recogieron 72 ml del medio enriquecido con BV y se centrifugaron a 1500xg durante 10 min. A continuación se ultracentrifugó el sobrenadante a 80.000xg (rotor Beckman SW28) durante 60 min a 4 °C. El sedimento de BV se resuspendió en 350 pl de tampón TE a 0,1X y se cargó en un gradiente lineal de sacarosa (del 25% al 56% (p/v)) y se ultracentrifugó a 80.000xg (rotor Beckman SW55) durante 90 min a 4 °C. Se recogió la banda de BV formada y se diluyó en 12 ml de TE a 0,1X. La preparación de BV se concentró a 80.000xg durante 60 min a 4 °C. El sedimento de virus final se resuspendió en 150 pl de TE a 0,1X.

Para producir los ODV, 6,0 x 107 células Sf9 se coinfectaron con los virus Ac-Avp80-Flag.vp80 (MDI = 25) y AcMNPV (MDI = 5) (cepa E2, Smith y Summers, 1979). Cinco días p.i. se recogieron las células infectadas y los ODV se purificaron de los cuerpos de oclusión víricos tal y como se describió previamente (Braunagel et al., 1994). El sedimento de ODV final se resuspendió en 0,5 ml de TE a 0,1X (Tris a 10 mM, EDTA a 1 mM, pH = 7,5).

Los viriones de BV y ODV purificados se fraccionaron en las fracciones de la envoltura y de la nucleocápsida tal y como se describió previamente (Braunagel et al., 1994). Las fracciones finales se procesaron para SDS-PAGE y se inmunotransfirieron contra el anticuerpo monoclonal anti-Flag de ratón (Stratagene), antisuero policlonal anti-VP39 de conejo (amablemente proporcionado por Lorena Passarelli, Kansas State University, EE. UU.), antisuero policlonal anti-GP64 de conejo (amablemente proporcionado por Hualin Wang y Feifei Yin, Instituto de Virología Wuhan, China (Yin et al., 2008), o antisuero policlonal de conejo contra el factor 1 de infectividad por vía oral (PIF-1) (amablemente proporcionado por Ke Peng, Universidad de Wageningen, Países Bajos (Peng et al., 2010)).

Desarrollo de la línea celular transgénica derivada de Sf9 que expresa vp80

Para desarrollar una línea celular, que produce la proteína VP80, un fragmento de 2.105 pb que lleva el ORF de vp80 se amplificó con los cebadores vp80-SacI-F y vp80-XbaI-R (tabla 1) y se clonó en el pJet1.2/Blunt para generar el pJet1.2-vp80. En la siguiente etapa se escindió (con SacI y XbaI) el ^oR^fde vp80 de pJet1.2-vp80 y se subclonó en el plZ digerido con SacI y XbaI (Invitrogen) para crear el plZ-vp80. El vector plasmídico resultante plZ-vp80 se linealizó con £co57I y se purificó en gel. Las células Sf9 se inocularon en una placa de seis pocillos (1 x 106 células/pocillo) y se transfectaron con 10 pg del vector linealizado. Al cabo de 24 horas de la transfección, las células se seleccionaron mediante el medio de cultivo celular que contiene Zeocin™ (300 pg/ml) durante 2 o 3 semanas, hasta que ninguna célula Sf9 de control sobrevivió en las mismas condiciones. A continuación, las células se propagaron como una línea celular sin clonar.

Expresión de la proteína recombinante con el virus vp80null

Para medir la capacidad de expresar la proteína recombinante con el inóculo del virus Ac-Avp80 (complementado en trans), 3,0 x 107 células Sf9 sin transformar se infectaron (ensayo por triplicado independiente) con los virus Ac-wt, Ac-Avp80-Flag.vp80 (ambos producidos en la línea celular sin transformar) o Ac-Avp80 (producido en la línea celular Sf9-vp80) con una MDI = 10. Todos estos inóculos de virus expresan egfp como un gen heterólogo modelo a partir del promotor muy tardío de p10 de baculovirus. A las 48 h y a las 72 h p.i., se recogieron las células y el medio de cultivo, y se utilizaron para transferencia Western, ensayo inmunoenzimático (ELISA) o titulación de BV (véase más arriba). Para la transferencia Western se utilizaron los mismos anticuerpos que se mencionaron más arriba para detectar la etiqueta Flag, EGFP y GP64, así como un anticuerpo monoclonal antiactina de ratón (ImmunO).

Para la cuantificación relativa, las placas de 96 pocillos Maxisorp (Nunc) se revistieron durante una noche a 4 °C con 100 ng de anticuerpo anti-GFP policlonal de conejo (Molecular Probes) en un volumen de 100 pl por pocillo, a lo que siguieron procedimientos estándares de ELISA como los descritos previamente (Fric et al., 2008). Se calculó el porcentaje de la producción de EGFP (ensayo por triplicado independiente) de acuerdo con la fórmula: % de expresión de EGFP = (absorbancia problemanh - absorbancia de fondo)/(EGFP de Ac-wt72h - absorbancia de fondo) x 100%, en donde nh representa el momento temporal p.i. La significación estadística de las diferencias observadas entre el Ac-wt de control y los genotipos experimentales de Ac-Avp80-Flag.vp80 y Ac-Avp80 se analizaron con la prueba t de Student.

Resultados

El gen de vp80 de AcMNPV es esencial para la replicación vírica

Se construyó un virus de AcMNPV con deleción como se detalla en la figura 2. Se diseñaron construcciones de reparación de tal modo que el ORF de vp80 de tipo silvestre o los genes vp80 etiquetados con FLAG en el extremo carboxilo o amino junto con las regiones promotoras de la polihedrina o la nativa se insertaron en el locus de la polihedrina junto con el gen egfp bajo el promotor de p10 (figura 3A). Para investigar la función del gen de vp80, las células Sf9 se transfectaron con las construcciones de bácmidos con anulación o de reparación y se monitorizaron por la expresión de EGFP mediante microscopia de fluorescencia. Cuando el Ac-vp80null se introdujo en las células Sf9 no se observó ninguna propagación vírica en el cultivo de células a las 72 h ni a las 120 h p.t. Solo pudimos observar un fenotipo de «infección de una sola célula» similar al fenotipo del bácmido Ac-gp64null (figura 3B). Los resultados indican que el Ac-vp80null es capaz de llegar a la fase muy tardía de la infección, como se confirma por la expresión de EGFP impulsada por el promotor de p10. Desde las 72 h a las 120 h p.t. se pudo observar una expresión de EGFP generalizada en las monocapas de células de insecto que se transfectaron con las tres construcciones de reparación (vp80 impulsado desde su promotor nativo, vp80 impulsado desde el promotor de la polihedrina y vp80 etiquetado con FLAG en el extremo amino impulsado desde su promotor nativo), lo que indica que estos bácmidos eran capaces de producir una cantidad suficiente de viriones de gemación infecciosos para iniciar la infección secundaria a un nivel similar al del bácmido de tipo silvestre (figura 3B). Por el contrario, en las células de insecto transfectadas con las construcciones de reparación de vp80 etiquetado con FLAG en el extremo carboxilo, hacia las 72 h p.t., solo se observó la expresión de EGFP en células aisladas que inicialmente se había transfectado, lo que indica que esta construcción de bácmido no es capaz de replicarse (figura 3B). Sin embargo, hacia las 96 h p.t. se observó la formación de calvas diminutas y a las 120 h p.t., se desarrollaron muy pocas calvas de tamaño normal. Los resultados muestran que el mutante etiquetado con FLAG en el extremo carboxilo tiene muy retrasada la producción de virus de gemación y demostraron que un extremo carboxilo sin modificar es muy importante para el funcionamiento de VP80. A los 5 días p.t. se retiraron los sobrenadantes del cultivo celular y se añadieron a las células Sf9 recién sembradas en placas y a continuación se incubaron durante 3 días para detectar la infección por el virus generado de las células transfectadas con estos bácmidos. Tal y como se esperaba, las células Sf9 incubadas con los sobrenadantes de las transfecciones con las construcciones de reparación mostraron numerosas células que expresaban la EGFP (figura 3C). No obstante, las células incubadas con el sobrenadante de las construcciones etiquetadas con FLAG en el extremo carboxilo mostraron una reducción significativa del número de células positivas para EGFP. Por otra parte, en las células de insecto incubadas con el sobrenadante de la transfección con el vp80 anulado no se detectó ninguna expresión de EGFP en ningún momento del tiempo analizado hasta las 72 h (figura 3C).

Además, para caracterizar el efecto exacto que tiene la deleción del gen de vp80 sobre la infección de AcMNPV, la propagación vírica en las células Sf9 transfectadas se comparó entre Ac-wt, Ac-Avp80, Ac-Avp80-vp80Rep, Ac-Avp80-polh-vp80Rep, Ac-Avp80-FLAG-vp80Rep y Ac-Avp80-vp80-FLAGRep. Los sobrenadantes del cultivo celular de todas las construcciones de bácmidos anteriores se analizaron en los momentos de tiempo indicados para la producción de BV (figura 4). Tal y como se esperaba, los virus de reparación Ac-Avp80-vp80Rep, Ac-Avp80-polhvp80Rep, Ac-Avp80-FLAG-vp80Rep mostraron una cinética de replicación vírica que concordaba con la propagación del virus del tipo silvestre (Ac-wt). La producción de viriones de gemación mediante el virus Ac-Avp80-vp80-FLAGRep etiquetado con FLAG en el extremo carboxilo se redujo a aproximadamente el 0,06% en comparación con el virus Ac-wt o los otros virus reparados.

Estos resultados indican que el gen vp80 es esencial para la producción de BV infecciosos. Se ha demostrado con claridad que se puede eliminar completamente toda la secuencia del ORF de vp80 del esqueleto del bácmido y rescatarla adecuadamente mediante la introducción del ORF de vp80 en un sitio heterólogo (locus de la polihedrina) del genoma. También demostramos que la expresión del gen vp80 puede ser impulsada por la secuencia del promotor de la polihedrina heterólogo sin ningún efecto negativo sobre la replicación vírica en el cultivo celular. Adicionalmente, observamos que el extremo amino de VP80, a diferencia de su extremo carboxilo, permite que se le hagan modificaciones génicas (marcación con la etiqueta de epítopo). Observamos que la cinética del virus con VP80 etiquetado con FLAG en el extremo carboxilo estaba significativamente retrasada en comparación con otros virus de tipo silvestre o de rescate, lo que indica la importancia funcional del extremo carboxilo de VP80.

Se necesita VP80 para la producción de BV y de ODV

Los resultados descritos más arriba indicaban que el mutante Ac-vp80null no produce absolutamente ningún virus de gemación infeccioso. Sin embargo, también estaba la posibilidad de que el mutante todavía pudiera producir partículas de gemación no infecciosas. Para investigar esta posibilidad, las células Sf9 se transfectaron con las construcciones de bácmidos con anulación, de reparación o de tipo silvestre, y se ultracentrifugaron a los 7 días p.t. los medios de cultivo celular para sedimentar los virus de gemación. Los sedimentos formados se analizaron por microscopia electrónica de tinción negativa o mediante detección por PCR y por transferencia Western para confirmar la presencia de los virus de gemación. No se revelaron ningún virus de gemación intacto, ni partículas similivíricas, ni sus estructuras (tal como VP39, la proteína principal de la cápsida, y la secuencia del genoma vírico) en el sedimento de las células transfectadas con el mutante Ac-vp80null (figuras 5A y 5B). Por otra parte, todas las construcciones de reparación analizadas produjeron virus de gemación que parecen normales en comparación con los virus de gemación derivados del virus de tipo silvestre (figura 5A). No obstante, era muy difícil encontrar viriones de gemación representativos en el sedimento procedente de las células transfectadas con la construcción de reparación del gen vp80 etiquetado con FLAG en el extremo carboxilo.

Para caracterizar aún más la deleción del gen vp80 en el ciclo de vida de los baculovirus, se realizó la microscopia electrónica con cortes ultrafinos generados de las células transfectadas con el bácmido. Las células transfectadas con Ac-vp80null desarrollaron típicamente el fenotipo de célula infectada con baculovirus, con un núcleo agrandado, una cromatina hospedadora fragmentada, un estroma virógeno electrodenso, etc. (figura 6A). La ausencia de VP80 no impidió la formación de nucleocápsidas que parecen normales dentro del estroma virógeno (figura 6C). Las nucleocápsidas formadas eran fenotípicamente indiferenciables de las producidas por los bácmidos Ac-wt o Acvp80null de reparación. Sin embargo, las nucleocápsidas ensambladas era más bien poco abundante en comparación con las células transfectadas con los bácmidos Ac-wt o Ac-vp80null de reparación (figuras 6E y 6G). Además, en el compartimento periestromático de un nucleoplasma (también llamado la zona anular) de las células transfectadas con el bácmido Ac-vp80null no se pudo observar ningún virión derivado por oclusión ni haces de nucleocápsidas antes de una envoltura (figuras 6B y 6D). Parece ser que la VP80 desempeña una función importante durante la maduración de las nucleocápsidas y/o su liberación o transporte desde el estroma virógeno. Finalmente, la VP80 puede contribuir, de algún modo, a un ensamblaje eficaz de nucleocápsidas que se podría explicar por un número pequeño de nucleocápsidas presentes en el estroma virógeno de las células transfectadas con Ac-vp80null. Cuando el gen vp80 se reintrodujo en el bácmido mutante, se pudieron observar muchas nucleocápsidas y viriones derivados por oclusión en las zonas anulares de las células transfectadas (figura 6F). La abundancia y la forma de los viriones derivados por oclusión producidos en las células transfectadas con el bácmido de reparación Ac-Avp80-vp80 eran similares a las de los producidos por el bácmido de tipo silvestre (figuras 6F y 6H).

VP80 está asociado a las nucleocápsidas de BV y de ODV

Para estudiar la asociación de VP80 con las preparaciones de BV, se recogieron los BV a las 48 p.i. y se separaron las fracciones de la nucleocápsida y de la envoltura. La proteína Flag.VP80 sólo se detectó en la fracción de la nucleocápsida como una doble banda con masas moleculares que oscilan entre 80 kDa y 95 kDa que se observaban en las células Sf9 infectadas (figura 14A, panel superior). La separación correcta en las fracciones de nucleocápsida y envoltura se confirmó con los anticuerpos contra VP39 (nucleocápsida solo) y GP64 (envoltura solo) (figura 14A, paneles inferiores).

Para examinar si la VP80 también estaba asociada a los ODV, las células Sf9 se coinfectaron con los virus AcMNPV de tipo silvestre productores de cuerpos de oclusión (OB) y los virus Ac-Avp80-Flag.vp80 para proporcionar la proteína POLH. El análisis por transferencia Western demostró que la VP80 estaba asociada a la fracción de la nucleocápsida de los ODV, y que en este caso migra como una sola banda de aproximadamente 80 kDa, que corresponde a la forma de 80 kDa producida en la fase muy tardía de la infección (figura 14B, panel superior). El fraccionamiento adecuado en las fracciones de nucleocápsida y envoltura se controló con el antisuero contra PIF-1, una proteína de la envoltura de los ODV (figura 14B, panel inferior).

La función de VP80 se puede rescatar mediante la complementación genética en trans

Para verificar si una deleción de vp80 en el genoma vírico se puede complementar mediante un ORF de vp80 ofrecido en trans bajo el control de un promotor constitutivo, se construyó una línea celular transgénica que expresaba el vp80 etiquetado con FLAG. En estas células, la VP80 se producía principalmente como una proteína de aproximadamente 95 kDa, tal y como se mostró con el análisis por transferencia Western con el anticuerpo anti-Flag (figura 15A). También se observaron dos bandas menores, una de aproximadamente 80 kDa y una segunda de aproximadamente 65 kDa.

En los ensayos de complementación en trans, las células Sf9-vp80 se transfectaron con el bácmido Ac-Avp80 y la diseminación de la infección del virus se monitorizó mediante la fluorescencia específica de EGFP a las 96 h y 120 h p.t. (figura 15Ba-c). Se observaron calvas víricas en las células Sf9-vp80 transfectadas, lo que demuestra que el virus se transmitió de una célula a otra. No obstante, observamos que el número y el tamaño de calvas desarrolladas era significativamente más pequeño que el observado en las células Sf9 transfectadas con el bácmido Ac-wt (figura 15D). Como control, las células Sf9 no transgénicas mostraron solo infecciones de una sola célula cuando se transfectaron con el bácmido Ac-Avp80 (figura 15Bc).

Cuando el medio de cultivo de las células Sf9-vp80 transfectadas con Ac-Avp80 se utilizó para infectar las células Sf9 no transgénicas inoculadas recientemente, se observó un fenotipo de «una sola infección» (figura 15Bb, panel derecho). Por tanto, las partículas de BV que resultan de la complementación en trans fueron capaces de entrar en las células, pero eran incapaces de producir nuevos BV. Esto también demuestra que el Ac-Avp80 no se revirtió a Ac-wt en las células Sf9-vp80 mediante la recuperación del transgén de las células hospedadoras. Tal y como estaba previsto, no se detectó ninguna señal de EGFP en las células Sf9 que recibieron el sobrenadante de células Sf9 no transgénicas transfectadas con Ac-Avp80 (figura 15Bc, panel derecho). El número de BV infecciosos de las células Sf9-vp80 transfectadas con el bácmido Ac-Avp80 era comparable al producido en las células Sf9 transfectadas con Ac-wt al cabo de 6 días p.i. Este experimento demostró que, para la producción de BV, el sistema actual de complementación en trans es aproximadamente 25 veces menos eficaz que el sistema de producción clásico basado en Sf9 (Fig. 15C).

El virus Ac-vp80null incapaz de replicarse, complementado en trans, es competente para expresar una gran cantidad de la proteína recombinante

Para valorar el efecto de la deleción del gen vp80 sobre la expresión de la proteína recombinante, se realizó un ensayo comparativo de producción a pequeña escala. En él, las células Sf9 se infectaron en paralelo con tres tipos de inóculos de baculovirus a una MDI = 10, a saber (i) Ac-wt, (ii) Ac-Avp80-Flag.vp80 (ambos producidos en las células Sf9) y (iii) Ac-Avp80 (producido en las células Sf9-vp80) que codifican todos ellos la EGFP. Los perfiles por transferencia Western demostraron que la proteína EGFP se expresaba en la misma cantidad en los tres genotipos de baculovirus analizados, al igual que la glucoproteína GP64 que sirvió aquí para propósitos de control (figura 16A, panel superior). La cantidad relativa de EGFP se cuantificó por ELISA a las 48 y 72 h p.i. en los lisados de las células infectadas (figura 16B) y no se puso de manifiesto entre los tres genotipos de baculovirus analizados ninguna diferencia estadísticamente significativa respecto a la cantidad de EGFP. Así pues, los resultados demuestran que el inóculo del virus Ac-Avp80 complementado en trans, aunque incapaz de replicar el virus, es capaz de producir una proteína recombinante al igual que los vectores de expresión de baculovirus convencionales, siempre y cuando la multiplicidad de infección inicial sea suficientemente elevada para infectar todas las células.

De igual forma, durante el cultivo de producción no se detectaron genotipos del virus revertiente que lleven el gen vp80, ya que no se detectó la proteína Flag.VP80 expresada de novo (figura 16A) en las inmunotransferencias. Teóricamente, una cierta cantidad de la proteína Flag.VP80 asociada al inóculo del virus complementado en trans está entrando en las células de insecto, pero esto ya no se detectaba en tiempos muy tardíos después de la infección y probablemente se degradaba por la actividad mediada por el proteasoma o bien por el lisosoma. En el mismo experimento no se registró ninguna liberación de BV a los sobrenadantes de los cultivos celulares procedentes de las células Sf9 inoculadas con el inóculo del virus Ac-Avp80 (figura 16C), lo que demuestra que no se había producido ni la generación de virus revertientes ni la contaminación del virus de tipo silvestre.

Resumen

En este estudio nos centramos en mejorar las herramientas convencionales de expresión en baculovirus con el objetivo de eliminar la progenie de baculovirus que contaminan la fabricación de proteínas recombinantes. Este iniciativa está muy apoyada por las expectativas farmacéuticas, ya que los fármacos expresados en baculovirus recombinantes se usan cada vez más en la medicina humana y veterinaria. Por lo tanto, perseguimos identificar el gen o genes de baculovirus cuya acción selectiva da lugar a un baculovirus incapaces de producir viriones, pero que no afectan, o sólo afectan levemente, a la expresión génica muy tardía. De este modo, el alto nivel de expresión de los genes heterólogos quedará salvaguardado.

Una visión general resumida de la nueva tecnología con el gen vp80 como ejemplo se presenta en la figura 16. Con el uso de la manipulación genética mediante bácmidos, los inventores construyeron un genoma de AcMNPV que carecía del gen vp80 (figura 16B). La genómica funcional y los análisis por microscopia electrónica revelaron que la falta de vp80 impide la producción de los BV y de los ODV. En paralelo se construyeron células Sf9 para producir la VP80 que complementa en trans el bácmido Ac-Avp80null (figura 14A,C). Finalmente, demostramos que el inóculo de baculovirus incapaz de replicarse y complementado en trans es capaz de producir una cantidad de proteína recombinante similar a la producida mediante los vectores baculovíricos convencionales (figura 14D).

Tabla 1. Lista de cebadores para PCR en orden de aparición en el texto

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para la producción un producto biofarmacéutico, que comprende:

en donde el genoma de dicho al menos un baculovirus es deficiente para el gen de p6.9, o en donde dicha célula de insecto productora de sustancia biofarmacéutica comprende un sistema de control de expresión que permite la inactivación del gen de p6.9.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde:

- el gen de p6.9 se hace deficiente en dicho genoma por medio de la sustitución, inserción o deleción de nucleótidos;

- la célula de insecto productora de sustancia biofarmacéutica es una célula de insecto recombinante que comprende una construcción que expresa un dsRNA específico del gen de p6.9, en donde el dsRNA se expresa opcionalmente bajo un promotor inducible;

- el al menos un baculovirus se produce antes de la etapa (a) en una célula productora de baculovirus que expresa una copia complementaria del gen de p6.9;

- el al menos un baculovirus procede de AcMNPV o BmNPV;

- el producto biofarmacéutico es una proteína recombinante, un virus recombinante (en concreto un AAV recombinante) o una partícula similivírica; y/o

- el producto biofarmacéutico está codificado por al menos un gen introducido en el genoma del baculovirus recombinante bajo el control del promotor de la polihedrina o de p10.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la deficiencia o inactivación del gen de p6.9 no afecta a la expresión muy tardía de dicho baculovirus en comparación con la expresión muy tardía del baculovirus de tipo silvestre.

4. Utilización de un sistema de células de insecto y baculovirus para la producción de un producto biofarmacéutico, en donde el sistema de células de insecto y baculovirus comprende una célula de insecto productora de baculovirus infectada con al menos un baculovirus recombinante, en donde:

- el baculovirus recombinante, o cada uno de ellos, comprende un genoma baculovírico que codifica el producto biofarmacéutico, o al menos un componente del producto biofarmacéutico, y

- el genoma baculovírico recombinante, o cada uno de ellos, es deficiente para el gen de p6.9, o la célula de insecto productora de baculovirus comprende un sistema de control de expresión que permite la inactivación del gen de p6.9.

5. Un bácmido que comprende un genoma baculovírico, en donde dicho genoma es deficiente para el gen de p6.9.

6. Un vector baculovírico recombinante, preferiblemente un vector baculovírico de AcMNPV, en donde el genoma de dicho baculovirus es deficiente para el gen de p6.9.

7. Una célula de insecto infectada con el vector baculovírico de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Una célula de insecto, que comprende una construcción que expresa un dsRNA específico del gen de p6.9, en donde dicha construcción está integrada preferiblemente en el genoma de la célula de insecto.

9. Una célula de insecto que comprende un casete de expresión que codifica el gen de p6.9.

10. Un método para la producción de un baculovirus deficiente para el gen de p6.9, que comprende la etapa de transfección de una célula de insecto de acuerdo con la reivindicación 9 con un bácmido de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el gen de p6.9 para el cual dicho bácmido es deficiente está codificado por el casete de expresión comprendido en dicha célula de insecto.