ES2616085T3 - Valenceno sintasa - Google Patents

Abstract

Valenceno sintasa que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o un homólogo funcional de cualquiera de estas secuencias, siendo dicho homólogo una valenceno sintasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 60 % con SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.

Description

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contener su propio promotor u otros elementos reguladores y en el caso de ADNc este puede estar bajo el control de un promotor apropiado u otros elementos reguladores para expresión en la célula hospedadora.

Pueden prepararse vectores que contienen un ácido polinucleico de acuerdo con la invención basándose en metodología conocida en la técnica en sí misma. Por ejemplo, se puede usar una secuencia de ADNc que codifica el polipéptido de acuerdo con la invención unida operativamente con elementos reguladores adecuados, tales como secuencias de ácido nucleico reguladores de la transcripción o la traducción.

El término “vector” como se usa en el presente documento, incluye referencia a un vector para trabajo de clonación convencional (“vector de clonación”) así como para un tipo de vectores más especializado, como un vector de expresión (autosómico) y un vector de clonación usado para integración en el cromosoma de la célula hospedadora (“vector de integración”).

Los “vectores de clonación” típicamente contienen uno o un número pequeño de sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción en los que pueden insertarse secuencias de ADN ajeno de una manera determinable sin pérdida de función biológica esencial del vector, así como un gen marcador que es adecuado para su uso en la identificación y selección de células transformadas con el vector de clonación.

La expresión “vector de expresión” se refiere a una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica un polipéptido de interés bajo el control de (es decir unido operativamente con) segmentos de ácido nucleico adicionales que posibilitan su transcripción. Dichos segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras, y pueden incluir opcionalmente uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un potenciador, una señal de poliadenilación y similares. Los vectores de expresión generalmente derivan de ADN plasmídico o viral, o pueden contener elementos de ambos. En particular un vector de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que comprende en la dirección 5’ a 3’ y unidos operativamente:

(a) una región de inicio de la transcripción y de la traducción que se reconoce por el organismo hospedador, (b) una secuencia codificante de un polipéptido de interés, y (c) una región de terminación de la transcripción y la traducción que se reconoce por el organismo hospedador. “Plásmido” se refiere a ADN extracromosómico de replicación autónoma que no está integrado en el genoma de un microorganismo y es habitualmente de naturaleza circular.

Un “vector de integración” se refiere a una molécula de ADN, lineal o circular, que puede incorporarse en el genoma de un microorganismo y posibilita una herencia estable de un gen que codifica un polipéptido de interés. El vector de integración comprende en general uno o más segmentos que comprenden una secuencia génica que codifica un polipéptido de interés bajo el control de (es decir, unido operativamente con) segmentos de ácido nucleico adicionales que posibilitan su transcripción. Dichos segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras, y uno o más segmentos que conducen la incorporación del gen de interés en el genoma de la célula diana, habitualmente por el proceso de recombinación homóloga. Típicamente, el vector de integración será uno que pueda transferirse a la célula diana, pero que tiene un replicón que no es funcional en ese organismo. La integración del segmento que comprende el gen de interés puede seleccionarse si se incluye un marcador apropiado dentro de ese segmento.

Como se usa en el presente documento, la expresión “unido operativamente” o “unido de forma operativa” se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos en este modo están en una relación que les permite actuar de su manera pretendida. Una secuencia de control “unida operativamente” con otra secuencia de control y/o con una secuencia codificante se liga de tal manera que se consiga transcripción y/o expresión de la secuencia codificante en condiciones compatibles con la secuencia de control. En general, unido operativamente significa que las secuencias de ácido nucleico que se unen son continuas y, cuando sea necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, contiguas y en la misma fase de lectura.

La expresión “valenceno sintasa” se usa en el presente documento para polipéptidos que tengan actividad catalítica en la formación de valenceno a partir de farnesil difosfato, y para otros restos que comprenden dicho polipéptidos. Los ejemplos de dichos otros restos incluyen complejos de dicho polipéptido con uno o más polipéptidos adicionales, otros complejos de dichos polipéptidos (por ejemplo complejos de metaloproteína), compuestos macromoleculares que comprenden dicho polipéptido y otro resto orgánico, dicho polipéptido unido a un material de soporte, etc. La valenceno sintasa puede proporcionarse en su ambiente natural, es decir, dentro de una célula en la que se ha producido, o en el medio al que se ha excretado por la célula que la produce. También puede proporcionarse separada de la fuente que ha producido el polipéptido y puede manipularse por unión con un vehículo, marcarse con un resto de marcaje y similares.

La expresión “homólogo funcional” de una secuencia, o abreviado “homólogo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que comprende dicha secuencia específica a condición de que uno o más aminoácidos se sustituyan, supriman, añadan y/o inserten, y cuyo polipéptido tiene (cualitativamente) la misma funcionalidad enzimática para conversión de sustrato en caso de que se use la expresión “homólogo funcional” para una enzima, es decir, un homólogo de la secuencia con SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 que tiene actividad catalítica en la formación de valenceno a partir de farnesil difosfato. En los ejemplos se describe un ensayo que es adecuado

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Se proporcionan métodos generales para cultivar tejidos vegetales por ejemplo en Maki, K.Y. et al., Plant Physiol. (1993) 15: 473-497; y en Phillips, R.I. et al. En: Sprague GF, Dudley JW, eds. Corn and corn improvement. 3ª edn. Madison (1988) 345-387.

Después de la transformación las células vegetales transgénicas se colocan en un medio selectivo apropiado para selección de células transgénicas que después se cultivan para generar callos. Se dejan crecer brotes a partir de callos y se generan plántulas a partir de los brotes dejando crecer en medio de enraizamiento. El marcador particular usado permitirá la selección de células transformadas en comparación con células que carecen del ADN que se ha introducido.

Para confirmar la presencia de los transgenes en células y plantas transgénicas, puede realizarse una diversidad de ensayos. Dichos ensayos incluyen, por ejemplo, ensayos “biológicos moleculares” bien conocidos por los expertos en la materia, tales como transferencia de Southern y Northern, hibridación in situ y métodos de amplificación basados en ácidos nucleicos tales como PCR o RT-PCR y ensayos “bioquímicos” tales como detectar la presencia de un producto proteico, por ejemplo, mediante medios inmunológicos (ELISA y transferencias de Western) o mediante función enzimática. La presencia de valenceno sintasa enzimáticamente activa puede establecerse por análisis químico de productos volátiles (valenceno) de la planta.

Puede usarse una valenceno sintasa de acuerdo con la invención para la producción industrial de valenceno, pudiéndose usarse dicho valenceno en sí mismo como un saporífero o aroma, por ejemplo, en un producto alimentario, o como una fragancia, por ejemplo, en un producto doméstico, o como un intermedio para la producción de otro isoprenoide, por ejemplo nootkatona.

Un método para producir valenceno de acuerdo con la invención comprende preparar valenceno en presencia de valenceno sintasa. En principio dicho método puede basarse en cualquier técnica para emplear una enzima en la preparación de un compuesto de interés.

El método puede ser un método en el que FPP o cualquiera de sus precursores (tales como farnesol, IPP, isopentenil fosfato, 3-metilbut-3-en-1-ol e incluso mevalonato) se proporciona como sustrato a células que comprenden la valenceno sintasa. Como alternativa el método puede ser también un método en el que se usa un organismo vivo que comprende un sistema enzimático capaz de formar FPP a partir de una fuente de carbono adecuada, estableciendo de este modo una vía fermentativa completa a valenceno. Debería observarse que el término “fermentativo” se usa en el presente documento en un sentido amplio para procesos en los que se usa un cultivo de un organismo para sintetizar un compuesto a partir de una materia prima adecuada (por ejemplo, un carbohidrato, una fuente de aminoácidos, una fuente de ácidos grasos). Por lo tanto, se entiende en el presente documento que los procesos fermentativos no están limitados a condiciones anaerobias, y se extienden a procesos en condiciones aerobias. Se conocen en general para especies de (micro)organismos materias primas adecuadas.

También se puede usar la valenceno sintasa aislada de la célula en la que se ha producido, por ejemplo, en un sistema de reacción en el que el sustrato (FPP) y la valenceno sintasa se ponen en contacto en condiciones adecuadas (pH, disolvente, temperatura), pudiendo basarse dichas condiciones en la técnica anterior a la que se hace referencia en el presente documento y la presente divulgación, opcionalmente en combinación con algunos ensayos rutinarios. La valenceno sintasa puede solubilizarse, por ejemplo, en un medio acuoso en el que también está presente el FPP o la valenceno sintasa puede inmovilizarse en un material de soporte de una manera conocida en la técnica y después ponerse en contacto con un líquido que comprende el FPP. Ya que la enzima tiene una actividad y/o selectividad alta para la catálisis de FPP a valenceno, la presente invención también es ventajosa para dicho método in vitro, no solamente en condiciones ácidas, sino también en el caso de que el pH sea aproximadamente neutro o alcalino. Las condiciones adecuadas pueden basarse en metodología conocida para valenceno sintasas conocidas, por ejemplo referidas en la bibliografía a la que se hace referencia en el presente documento, la información desvelada en el presente documento, el conocimiento general común y opcionalmente alguna experimentación rutinaria.

En un método particularmente ventajoso de la invención, el valenceno se prepara de forma fermentativa, es decir, cultivando células que expresen valenceno sintasa en un medio de cultivo. La reacción real catalizada por la valenceno sintasa puede tener lugar intracelularmente o, si la valenceno sintasa se excreta al medio de cultivo, extracelularmente en el medio del cultivo.

Las células usadas en un método para preparar valenceno de acuerdo con la invención pueden ser en particular células hospedadoras de acuerdo con la invención. Si se desea, estas células hospedadoras pueden modificarse técnicamente para proporcionar el FPP a la valenceno sintasa en cantidades mayores. Esto puede realizarse, por ejemplo, potenciando el flujo de carbono hacia FPP, que a su vez puede realizarse de diferentes maneras. En células hospedadoras con una ruta de DXP endógena (como E. coli y R. sphaeroides) la desregulación de la expresión de estas enzimas de la ruta puede tener un efecto positivo claro en la formación de isoprenoides. La sobreexpresión de dxs que codifica 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa (DXP sintasas), la primera enzima de la

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(escualeno sintasa), que cataliza la condensación de dos restos de farnesil difosfato para formar escualeno. Debido a que esta es la primera etapa después de FPP en la biosíntesis de esterol y por lo tanto regula el flujo de unidades de isopreno a la ruta de esterol, ERG9 es una diana frecuente en la modificación metabólica de levadura para aumentar la producción de sesquiterpeno y de carotenoides. La alteración de ERG9 en combinación con sobreexpresión de la tHMG-CoA reductasa en la levadura C. utilis condujo a aumento de la producción de licopeno (Shimada et al. Appl. Env. Microbiol. (1998) 64: 2676-2680). Una combinación similar de la sobreexpresión de tHMG-CoA reductasa y regulación negativa de ERG9 usando un promotor reprimible por metionina aumentó la producción de sesquiterpeno amorfadieno en levadura en aprox. 10 veces en comparación con la cepa de levadura que solamente expresa el gen de amorfadieno sintasa (Ro et al. Nature (2006) 440: 940-943; Lenihan et al. Biotechnol. Prog. (2008) 24: 1026-1032). Ya que el ergosterol es vital para crecimiento de levaduras y las células de levadura no pueden asimilar ergosterol alimentado de forma externa durante el crecimiento aeróbico, la regulación negativa/inactivación de ERG9 se combina frecuentemente con mutaciones que equipan la cepa de levadura con captación aeróbica eficaz de ergosterol del medio de cultivo. Son ejemplos el alelo sue (Takahishi et al. Biotechnol. Bioeng. (2007) 97: 170-181) y el alelo upc2-1 (Jackson et al. Org. Lett. (2003) 5: 1629-1632). Takahashi et al (Biotechnol. Bioeng. (2007) 97: 170-181) también investigaron el efecto de limitar la actividad fosfatasa endógena inactivando el gen de fosfatasa dpp1 en levadura. Aunque esta anulación claramente limitó la desfosforilación de FPP reflejada por acumulación de mucho menos farnesol, no mejoró la producción de sesquiterpeno más allá de la de las mutaciones erg9/sue combinadas en las condiciones de crecimiento aplicadas.

Pueden seleccionarse condiciones de reacción para preparar de forma fermentativa valenceno dependiendo de condiciones conocidas para la especie de la célula hospedadora usada (por ejemplo, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Paracoccus zeaxanthinifaciens, Escherichia coli, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Saccharomyces cerevisiae, Penicillium chrysogenum, Phaffia rhodozyma y Pichia pastoris), la información desvelada en el presente documento, el conocimiento general habitual y opcionalmente alguna experimentación rutinaria.

En principio, el pH del medio de reacción (medio de cultivo) usado en un método de acuerdo con la invención puede elegirse dentro de límites amplios, siempre que la valenceno sintasa (en la célula hospedadora) esté activa y presente una especificidad deseada en las condiciones de pH. En caso de que el método incluya el uso de células, para expresar la valenceno sintasa, el pH se selecciona de modo que las células sean capaces de realizar su función o sus funciones pretendidas. El pH puede elegirse en particular dentro del intervalo de cuatro unidades de pH por debajo del pH neutro y dos unidades de pH por encima del pH neutro, es decir entre pH 3 y pH 9 en el caso de un sistema esencialmente acuoso a 25 ºC. Se han conseguido buenos resultados, por ejemplo en un medio de reacción acuoso que tiene un pH en el intervalo de 6,8 a 7,5.

Un sistema se considera acuoso si el agua es el único disolvente o el disolvente predominante (> 50 % p, en particular, > 90 % p, basándose en líquidos totales), en el por ejemplo una cantidad menor de alcohol u otro disolvente (< 50 % p, en particular < 10 % p, basándose en líquidos totales) puede disolverse (por ejemplo como una fuente de carbono, en caso de un enfoque fermentativo completo) en una concentración tal que los microorganismos que están presentes permanezcan activos.

En particular en caso de que se usa una levadura y/o un hongo, pueden preferirse condiciones ácidas, en particular el pH puede estar en el intervalo de pH 3 a pH 8, basándose en un sistema esencialmente acuoso a 25 ºC. Si se desea, el pH puede ajustarse usando un ácido y/o una base o tamponarse con una combinación adecuada de un ácido y una base.

Las condiciones anaerobias se definen en el presente documento como condiciones sin ningún oxígeno o en las que no se consume sustancialmente ningún oxígeno por las células cultivadas, en particular un microorganismo, y habitualmente corresponde a un consumo de oxígeno de menos de 5 mmol/l.h, preferentemente a un consumo de oxígeno de menos de 2,5 mmol/l.h., o más preferentemente menos de 1 mmol/l.h. Las condiciones aerobias son condiciones en las que un nivel suficiente de oxígeno para crecimiento sin restricciones se disuelve en el medio, capaz de soportar una velocidad de consumo de oxígeno de al menos 10 mmol/l.h, más preferentemente más de 20 mmol/l.h., aún más preferentemente más de 50 mmol/l.h., y más preferentemente más de 100 mmol/l.h.

Las condiciones de oxígeno limitado se definen como condiciones en las que el consumo de oxígeno está limitado por la transferencia de oxígeno del gas al líquido. El límite inferior para condiciones de oxígeno limitado se determina por el límite superior para condiciones anaerobias, es decir, habitualmente al menos 1 mmol/l.h. y en particular al menos 2,5 mmol/l.h., o al menos 5 mmol/l.h. El límite superior para condiciones de oxígeno limitado se determina por el límite inferior para condiciones aerobias, es decir menos de 100 mmol/l.h., menos de 50 mmol/l.h., menos de 20 mmol/l.h. o menos de 10 mmol/l.h.

Si las condiciones son aerobias, anaerobias o de oxígeno limitado depende de las condiciones en las que se lleva a cabo el método, en particular por la cantidad y composición de flujo de gas entrante, las propiedades de transferencia de mezcla/masa reales del equipamiento usado, el tipo de microorganismo y la densidad de microorganismos.

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polipéptido) y 5 l de farnesil difosfato (FPP de Sigma 10 mM secado por evaporación y disuelto en carbamato de amonio 0,2 M y etanol 50 %). Cubrir cuidadosamente la mezcla con 500 l de pentano, e incubar a 30 ºC con agitación suave durante 2 horas. Posteriormente, recoger el pentano. Después, someter la fase acuosa restante a extracción con 1 ml de etilacetato. Combinar las fases de etilacetato y el pentano y centrifugar la combinación a

5 1.200 x g. Secar sobre una columna de sulfato sódico y analizar una muestra del producto secado por GC-MS. Convenientemente para el análisis de GC-MS, puede usarse un sistema Agilent Technologies, que comprende un sistema de GC de 7980 A, un detector de MSD inerte 597C (70 eV), un auto-muestreador 7683 e inyector y una columna Phenomenex Zebron ZB-5 ms de 30 mm de longitud x 0,25 mm de diámetro interno y 0,25 m de fase estacionaria, con una precolumna Guardian (5 m). En este sistema, inyectar 1 l de la muestra, en las siguientes

10 condiciones: orificio de inyección a 250 ºC, inyección sin fraccionamiento, la columna ZB5 mantenida a 45 ºC durante 2 minutos después de lo que se inicia un gradiente de 10 ºC por minuto, hasta 300 ºC. Se detectan picos de sesquiterpeno a 204 m/z. Los compuestos pueden identificarse por su índice de retención y por su espectro de masas en combinación con comparación del espectro de masas con bibliotecas (NIST o desarrolladas de forma interna). En este sistema, se detecta valenceno a (aproximadamente) 14,125 minutos. Si detecta valenceno, el

15 polipéptido es una valenceno sintasa.

Bacterias y condiciones de cultivo

Se obtuvo cepa de Rhodobacter sphaeroides Rs265-9c de la cepa de Rhodobacter sphaeroides ATCC 35053

20 [obtenida de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC - Manassas, VA, Estados Unidos - www.atcc.ora); número 35053; Rhodobacter sphaeroides (van Niel) Imhoff et al., aislada de una charca de captación de aguas residuales en Indiana y depositada como Rhodopseudomonas sphaeroides van Niel] después de dos ciclos de mutagénesis y se usó como el hospedador básico para construcción de cepas recombinantes que tienen producción mejorada de valenceno. Todas las cepas de R. sphaeroides se cultivaron a 30 ºC en medio RS102 a no ser que se

25 indique de otro modo. La composición y preparación de medio RS102 se resume en la Tabla 1.

Se cultivaron cepas de E. coli a 37 ºC en medio LB (Becton Dickinson, Sparks, MD, Estados Unidos). Para mantenimiento de plásmidos en cepas de E. coli y R. sphaeroides recombinantes, se añadieron ampicilina (100 mg/l), cloranfenicol (30 mg/l) y/o kanamicina (25-50 mg/l, dependiendo del plásmido) al medio de cultivo. Los cultivos

30 líquidos se dejaron crecer rutinariamente de forma aeróbica en un agitador rotatorio a 220 rpm (véase posteriormente). Cuando se requirió medio sólido, se añadió agar (concentración final de 1,5 %).

Tabla 1. Composición y preparación de medio RS102

Componente

Cantidad por litro de agua destilada

1. Extracto de levadura

20 g

2. NaCl

0,5 g

3. MgSO4 – 7H2O

0,5 g

4. D-glucosa monohidrato

33 g

5. Solución de microelementos

2 ml

6. Solución de café

2 ml

Los componentes 1-4 se mezclan entre sí, el volumen final se ajusta a 1 litro. El pH se ajusta a 7,4 con NaOH 0,5 M. El medio básico resultante se esteriliza después por filtración a través de una membrana de 0,22 micrómetros; se añaden 2 ml de cada uno de solución de microelementos estéril y solución de CaFe estéril (véase posteriormente) para proporcionar el medio final RS102. Para medio sólido, se mezclan entre sí en primer lugar 1 litro de medio básico mencionado anteriormente más 15 g de agar y se esteriliza por autoclave. Después el medio se enfría a aproximadamente 60 ºC, las soluciones estériles de microelementos y CaFe (2 ml de cada una) se añaden y el medio fundido se distribuye en placas de Petri estériles.

Solución de microelementos

Componente

Cantidad por litro de agua destilada

(NH4)2Fe(SO4)2 ·6H2O

80 g

ZnSO4 ·7H2O

6 g

MnSO4 ·H2O

2 g

NiSO4 ·6H2O

0,2 g

Vitamina C

2 g

- Esterilizar por filtración a través de una membrana de 0,22 micrómetros, almacenar a 4 ºC.

Solución de CaFe

Componente

Cantidad por litro de agua destilada

CaCl2 ·2H2O

75 g

FeCl3 ·6H2O

5 g

HCl (37 %)

3,75 ml

- Esterilizar por filtración a través de una membrana de 0,22 micrómetros, almacenar a 4 ºC.

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Tabla 3. Composición y preparación de medio RÄ

Medio RÄ

Componente

Cantidad por litro de agua destilada

1. Ácido málico

3 g

2. MgSO4·7H2O

0,2 g

3. (NH4)2SO4

1,2 g

4. CaCl2·2H2O

0,07 g

5. Solución de microelementos

1.5 ml

6. Solución de vitaminas

8 ml

7. Solución de tampón fosfato

20 ml

Los componentes 1-5 se mezclan entre sí, el volumen final se ajusta a 1 litro, y el pH se ajusta a 6,9 con NaOH 0,5 M. El medio básico resultante se esteriliza después por filtración a través de una membrana de 0,22 micrómetros; se añaden 8 ml de solución de vitaminas estéril y 20 ml de solución de tampón fosfato estéril (véase posteriormente) para proporcionar el medio RÄ final. Para medio sólido, el litro de medio básico mencionado anteriormente más 20 g de agar se mezclan en primer lugar entre sí y se esterilizan por autoclave. Después el medio se enfría hasta aproximadamente 60 ºC, las vitaminas estériles y las soluciones de tampón fosfato se añaden y el medio fundido se distribuye en placas de Petri estériles.

Solución de microelementos

Componente

Cantidad por litro de agua destilada

Citrato de Fe(II)

500 mg

MnCl2 · 4H2O

20 mg

ZnCl2

5 mg

LiCl

5 mg

KBr

2,5 mg

KI

2,5 mg

CuSO4·5H2O

0,23 mg

Na2MoO4

0,851 mg

CoCl2 · 6H2O

5 mg

SnCl2 · 2H2O

0,5 mg

BaCl2 · 2H2O

0,59 mg

AlCl3

1 mg

H3BO4

10 mg

EDTA

20 mg

- Esterilizar por filtración a través de una membrana de 0,22 micrómetros, almacenar a 4 ºC.

Solución de vitaminas

Componente

Cantidad por litro de agua destilada

Niacina

200 mg

Tiamina-HCl

400 mg

Nicotinamida

200 mg

Biotina

8 mg

- Esterilizar por filtración a través de una membrana de 0,22 micrómetros, almacenar a 4 ºC.

Solución de tampón de fosfato

Componente

Cantidad por litro de agua destilada

KH2PO4

600 mg

K2HPO4

900 mg

- Esterilizar por filtración a través de una membrana de 0,22 micrómetros, almacenar a 4 ºC.

Tabla 4. Composición y preparación de placas de medio PY

Medio PY

Componente

Cantidad por litro de agua destilada

1. Bacto peptona

10 g

2. Extracto de levadura

0,5 g

3. CaCl2 (0,4 M)

5 ml

4. MgCl2 (0,4 M)

5 ml

5. FeSO4 (0,5 %)

2,4 ml

6. Agar

20 g

7. H2O

990 ml

Los componentes 1-7 se mezclan entre sí, el pH se ajusta a 7,0 con NaOH 0,5 M, y la mezcla se esteriliza por autoclave. Después el medio se enfría hasta aproximadamente 60 ºC, el medio fundido se distribuye en placas de Petri estériles.

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