ES2609845T3 - Métodos para la detección de modificación de nucleótidos - Google Patents

Métodos para la detección de modificación de nucleótidos Download PDF

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Abstract

Un método para la identificación de residuos de citosina modificada en una secuencia de nucleótidos de la muestra que comprende; i) proporcionar una población de polinucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de la muestra, ii) Oxidar o reducir una primera porción de dicha población, iii) Tratar la primera porción, oxidada o reducida, de dicha población y una segunda porción de dicha población con bisulfito, iv) secuenciar los polinucleótidos en la primera y segunda porciones de la población que siguieron las etapas ii) y iii) para producir una primera y segunda secuencias de nucleótidos respectivamente e; v) identificar el residuo en la primera y segunda secuencias de nucleótidos que corresponda a un residuo de citosina en la secuencia de nucleótidos de la muestra, en donde la citosina modificada es 5-metilcitosina (5mC), 5-hidroximetilcitosina (5hmC) o 5-formilcitosina (5fC).

Description

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En algunas modalidades, el ADN genómico completo y/o ARN que se aíslan de las células pueden usarse directamente como una población de polinucleótidos como se describe en la presente descripción, después del aislamiento. En otras modalidades, el ADN genómico y/o el ARN que se aíslan pueden someterse a etapas de preparación adicionales.
El ADN genómico y/o ARN pueden fragmentarse, por ejemplo mediante sonicación, cizallamiento o digestión por enzimas endonucleasas, para producir fragmentos de ADN. Una fracción del ADN genómico y/o ARN pueden usarse como se describe en la presente descripción. Las fracciones adecuadas de ADN genómico y/o ARN pueden basarse en la talla u otros criterios. En algunas modalidades, una fracción de ADN genómico y/o fragmentos de ARN los cuales son ricos en islas de CpG (CGI) pueden usarse como se describe en la presente descripción.
El ADN genómico y/o ARN pueden desnaturalizarse, por ejemplo mediante calentamiento o por tratamiento con un agente desnaturalizante. Los métodos adecuados para la desnaturalización del ADN genómico y el ARN se conocen bien en la técnica.
En algunas modalidades, el ADN genómico y/o ARN pueden adaptarse para la secuenciación antes de la oxidación o reducción y el tratamiento con bisulfito, o el tratamiento con bisulfito solo. La naturaleza de las adaptaciones depende del método de secuenciación que se va a usar. Por ejemplo, para algunos métodos de secuenciación, los cebadores pueden ligarse a los extremos libres del ADN genómico y/o fragmentos de ARN después de la fragmentación. Los cebadores adecuados pueden contener 5mC para evitar que las secuencias del cebador se modifiquen durante la oxidación o reducción y el tratamiento con bisulfito, o el tratamiento con bisulfito solo, como se describe en la presente descripción. En otras modalidades, el ADN genómico y/o ARN pueden adaptarse para la secuenciación después de la oxidación, reducción y/o tratamiento con bisulfito, como se describe en la presente descripción.
Después del fraccionamiento, desnaturalización, adaptación y/o otras etapas de la preparación, el ADN genómico y/o ARN pueden purificarse por cualquier técnica conveniente.
Después de la preparación, la población de polinucleótidos puede proporcionarse en una forma adecuada para tratamientos posteriores como se describe en la presente descripción. Por ejemplo, la población de polinucleótidos puede estar en una solución acuosa en ausencia de tampones antes del tratamiento como se describe en la presente descripción.
Los polinucleótidos para usar como se describe en la presente descripción pueden ser de simple o doble cadena.
La población de polinucleótidos puede dividirse en dos, tres, cuatro o más porciones separadas, cada una de las cuales contiene los polinucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de la muestra. Estas porciones pueden tratarse y secuenciarse independientemente como se describe en la presente descripción.
Preferentemente, las porciones de polinucleótidos no se tratan para adicionar marcas o grupos sustituyentes, tal como glucosa, a los residuos de 5-hidroximetilcitosina en la secuencia de nucleótidos de la muestra, antes de la oxidación y/o reducción.
La primera porción de la población de polinucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de la muestra puede oxidarse. La oxidación convierte cualquier 5-hidroximetilcitosina en la secuencia de nucleótidos de la muestra en 5formilcitosina. La oxidación puede ser oxidación no mediada por enzimas, por ejemplo mediante el uso de un agente químico oxidante orgánico o inorgánico, preferentemente bajo condiciones desnaturalizantes.
La primera porción puede oxidarse mediante el tratamiento con un agente oxidante. El agente oxidante es cualquier agente adecuado para generar un aldehído a partir de un alcohol. El agente oxidante o las condiciones que se usan en la etapa de oxidación pueden seleccionarse de modo que cualquier 5-hidroximetilcitosina se oxide selectivamente. De esta manera, sustancialmente ninguna otra función en el polinucleótido se oxida en la etapa de oxidación. La etapa de oxidación, por consiguiente, no resulta en la reacción de cualquier residuo de timina o de 5-metilcitosina, donde aquellas estén presentes. Los agentes o condiciones se seleccionan para minimizar o evitar cualquier degradación del polinucleótido.
El uso de un agente oxidante puede resultar en la formación de algún producto correspondiente a 5-carboxicitosina. La formación de este producto no influye negativamente en los métodos de identificación descritos en la presente descripción. Bajo las condiciones de la reacción de bisulfito que se usan para convertir 5-formilcitosina en uracilo, se percibe además, que 5-carboxicitosina se convierte igualmente en uracilo. Se comprende que una referencia a 5formilcitosina que se obtiene por oxidación de 5-hidroximetilcitosina puede ser una referencia a un producto que, además, comprende 5-carboxicitosina que se obtiene, además, mediante esa oxidación.
El agente oxidante puede ser un agente oxidante no enzimático, por ejemplo, un compuesto químico orgánico o inorgánico.
Los agentes oxidantes adecuados se conocen bien en la técnica e incluyen óxidos de metal, tales como KRuO4, MnO2 y
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KMnO4. Particularmente los agentes oxidantes útiles son aquellos que pueden usarse en condiciones acuosas, como tales son los más convenientes para la manipulación de los polinucleótidos. Sin embargo, los agentes oxidantes que son adecuados para usar en solventes orgánicos pueden usarse además donde sea factible.
En algunas modalidades, el agente oxidante puede comprender un anión perrutenato (RuO4-). Los agentes oxidantes perrutenatos adecuados incluyen sales de perrutenato orgánicas e inorgánicas, tales como el perrutenato de potasio (KRuO4) y otros perrutenatos metálicos, perrutenato de tetraalquilamonio, tales como el perrutenato de tetrapropilamonio (TPAP) y el perrutenato de tetrabutilamonio (TBAP); perrutenato en soportes de polímero (PSP) y el rutenato de tetrafenilfosfonio.
Favorablemente, el agente oxidante o las condiciones oxidantes pueden, además, preservar el polinucleótido en un estado desnaturalizado.
Después del tratamiento con el agente oxidante, los polinucleótidos en la primera porción pueden purificarse.
La purificación puede realizarse mediante el uso de cualquier técnica conveniente para la purificación de ácidos nucleicos. Las técnicas adecuadas para la purificación de ácidos nucleicos incluyen la cromatografía en columnas de centrifugación.
Los polinucleótidos pueden someterse a otras etapas de oxidación repetidas. Tales etapas se acometen para maximizar la conversión de 5-hidroximetilcitosina a 5-formilcitosina. Esto puede necesitarse donde un polinucleótido tiene suficiente estructura secundaria que es capaz de rehibridarse ("re-anneling"). Cualquier porción híbrida del polinucleótido puede limitar o impedir el acceso del agente oxidante a esa porción de la estructura, lo cual tiene el efecto de proteger la 5hidroxicitosina de la oxidación.
En algunas modalidades, la primera porción de la población de polinucleótidos puede, por ejemplo, someterse a múltiples ciclos de tratamiento con el agente oxidante seguido de la purificación. Por ejemplo, pueden realizarse uno, dos, tres, o más de tres ciclos.
En algunas modalidades, la primera porción de la población de polinucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de la muestra puede reducirse. En otras modalidades, la tercera porción de la población de polinucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de la muestra puede reducirse. La reducción de la primera o tercera porciones de los polinucleótidos convierte los residuos de 5-formilcitosina en la secuencia de nucleótidos de la muestra en 5-hidroximetilcitosina
La primera o tercera porciones de los polinucleótidos puede reducirse mediante tratamiento con un agente reductor. El agente reductor es un agente adecuado para la generación de un alcohol de un aldehído. El agente o condiciones reductoras que se usan en la etapa de reducción pueden seleccionarse de modo que cualquier 5-formilcitosina se reduce selectivamente (es decir, el agente reductor o las condiciones reductoras son selectivas para 5-formilcitosina). De esta manera, sustancialmente ninguna otra funcionalidad en el polinucleótido se reduce en la etapa de reducción. Los agentes o condiciones reductoras se seleccionan para minimizar o evitar cualquier degradación del polinucleótido.
Los agentes reductores adecuados se conocen bien en la técnica e incluyen NaBH4, NaCNBH4 y LiBH4. Los agentes reductores particularmente útiles son aquellos que pueden usarse en condiciones acuosas, como tales son más convenientes para la manipulación de los polinucleótidos. Sin embargo, los agentes reductores que son adecuados para usar en solventes orgánicos pueden usarse además donde sea factible.
Después de la oxidación y la reducción respectivamente, la primera porción de la población, y opcionalmente la tercera porción, se tratan con bisulfito. Una segunda porción de la población que no se oxida o reduce se trata, además, con bisulfito.
El tratamiento con bisulfito convierte en uracilo ambos residuos de citosina y 5-formilcitosina en un polinucleótido. Como se estableció anteriormente, donde esté presente cualquier 5-carboxicitosina (como un producto de la etapa de oxidación), esta 5-carboxicitosina se convierte en uracilo en el tratamiento con bisulfito. Sin desear estar atado a la teoría, se cree que la reacción de 5-formilcitosina ocurre a través de la pérdida del grupo formilo hasta producir citosina, seguido de una desaminación subsecuente para dar uracilo. Se cree que 5-carboxicitosina produce uracilo a través de una secuencia de etapas de descarboxilación y desaminación. El tratamiento con bisulfito puede realizarse bajo condiciones que conviertan tanto a la citosina como a los residuos de 5-formilcitosina o 5-carboxicitosina del polinucleótido, en uracilo, como se describe en la presente descripción.
Una porción de la población puede tratarse con bisulfito mediante la incubación con iones de bisulfito (HSO32-).
El uso de los iones de bisulfito (HSO32-), para convertir las citosinas no metiladas del ácido nucleico en uracilo, es común en la técnica y los reactivos y condiciones adecuadas se conocen bien por un experto en la técnica (39-42). Numerosos protocolos y reactivos están, además, disponibles comercialmente (por ejemplo, EpiTect™, Qiagen NL; EZ ADN Methylation™ Zymo Research Corp CA; CpGenome Turbo Bisulfite Modification Kit; Millipore).
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Una característica de los métodos descritos en la presente descripción es la conversión de citosina no metilada (la cual puede generarse in situ a partir de 5-formilcitosina o 5-carboxicitosina) en uracilo. Esta reacción se logra típicamente a través del uso de bisulfito. Sin embargo, en los aspectos generales de la invención, cualquier reactivo o condiciones de
5 reacción pueden usarse para efectuar la conversión de citosina en uracilo. Tales reactivos o condiciones se seleccionan de manera que poca o ninguna 5-metilcitosina reaccione, y más específicamente, de manera tal que poca o ninguna 5metilcitosina reaccione para formar uracilo El reactivo, u opcionalmente un reactivo adicional, pueden, además, efectuar la conversión de 5-formilcitosina o 5-carboxicitosina en citosina o uracilo.
10 Después de la incubación, las porciones de los polinucleótidos pueden inmovilizarse, lavarse, desulfonarse, eluirse y/o tratarse de otro modo según se requiera.
En algunas modalidades, la primera, segunda, y tercera porciones de polinucleótidos de la población pueden amplificarse después del tratamiento como se describe anteriormente. Esto puede facilitar la manipulación y/o la
15 secuenciación posterior. Las alteraciones de las secuencias en la primera, segunda y tercera porciones de polinucleótidos se conservan después de la amplificación. Las técnicas de amplificación de polinucleótidos adecuadas se conocen bien en la técnica e incluyen el PCR. La presencia de un residuo de uracilo (U) en una posición en la primera, segunda y/o tercera porciones del polinucleótido puede indicarse o identificarse por la presencia de un residuo de timina (T) en esa posición en el polinucleótido amplificado correspondiente.
20 Como se describió anteriormente, los polinucleótidos pueden adaptarse después de la oxidación, reducción, o tratamiento con bisulfito para ser compatibles con una técnica o plataforma de secuenciación. La naturaleza de la adaptación dependerá de la técnica o plataforma de secuenciación. Por ejemplo, para la secuenciación Solexa-Illumina, los polinucleótidos tratados pueden fragmentarse, por ejemplo mediante sonicación, o tratamiento restrictivo con
25 endonucleasas, los extremos libres de los polinucleótidos repararse según se requiera, y los cebadores ligarse en los extremos.
Los polinucleótidos pueden secuenciarse mediante cualquier técnica o plataforma de secuenciación de alto o bajo rendimiento conveniente, que incluyen la secuenciación de Sanger (43), la secuenciación Solexa-Illumina (44), la 30 secuenciación basada en ligación (SOLiD™) (45), la pirosecuenciación (46); secuenciación estroboscópica (SMRT™) (47, 48); y la secuenciación en chip semiconductores (Ion Torrent™) (49).
Los protocolos, reactivos y equipamientos adecuados para la secuenciación de polinucleótidos se conocen bien en la técnica y están disponibles comercialmente.
35 Los residuos en posición en la primera, segunda, y/o tercera secuencia de nucleótidos que se correspondan a citosina en la secuencia de nucleótidos de la muestra pueden identificarse.
La modificación de un residuo de citosina en una posición en la secuencia de nucleótidos de la muestra puede 40 determinarse a partir de la identidad de los residuos en las posiciones correspondientes en la primera, segunda, y opcionalmente, tercera secuencias de nucleótidos, como se describe anteriormente.
La extensión o la cantidad de la modificación de citosina en la secuencia de nucleótidos de la muestra pueden determinarse. Por ejemplo, puede determinarse la proporción o cantidad de 5-hidroximetilcitosina y/o 5-metilcitosina en 45 la secuencia de nucleótidos de la muestra en comparación con las citosinas no modificadas.
Los polinucleótidos como se describen en la presente descripción, por ejemplo la población de polinucleótidos o 1, 2, 3,
o los 4 de la primera, segunda, tercera y cuarta porciones de la población, pueden inmovilizarse sobre un soporte sólido.
50 Un soporte sólido es un cuerpo insoluble, no gelatinoso que presenta una superficie sobre la cual los polinucleótidos pueden inmovilizarse.
Los ejemplos de soportes adecuados incluyen láminas de cristal, pocillos, membranas o microperlas. Los soportes pueden ser en forma de partículas o sólidos, que incluyen por ejemplo una placa, un tubo de ensayo, perlas, bolilla,
55 filtro, tela, polímero o membrana. Los polinucleótidos pueden, por ejemplo, fijarse a un polímero inerte, una placa de 96 pocillos, otro dispositivo, aparato o material que se use en la secuenciación de ácidos nucleicos u otros contextos de investigación. La inmovilización de un polinucleótido a la superficie de un soporte sólido se conoce bien en la técnica. En algunas modalidades, el soporte sólido mismo puede inmovilizarse. Por ejemplo, las microperlas pueden inmovilizarse sobre una segunda superficie sólida.
60 En algunas modalidades, la primera, segunda, tercera y/o cuarta porciones de la población de polinucleótidos pueden amplificarse antes de la secuenciación. Preferentemente, las porciones de polinucleótidos se amplifican después del tratamiento con bisulfito.
65 Los métodos adecuados para la amplificación de polinucleótidos se conocen bien en la técnica.
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Estas condiciones se usaron, además, para la oxidación de ARN.
Oxidación de ADN de simple cadena
1 µg de ADNsc sintético de 15 mer se oxidó de acuerdo a la oxidación general.
Oxidación de ADN sintético de doble cadena
El ADNdc se precipitó con etanol y después se filtró a través de una mini columna de centrifugación rápida (después de cuatro lavados con 600ul de H2O). Para el ADNdc sintético se requirió una doble oxidación ya que la desnaturalización con NAOH no es 100 % efectiva con una solución de un solo fragmento de ADN homólogo (a diferencia del ADN genómico).
1 µg de ADN se desnaturalizó en NaOH 0.05 M (volumen total 19 µL) durante 30 min a 37°C. Después la reacción se enfrió rápidamente en hielo y se dejó durante 5 min. Posteriormente la reacción se oxidó de acuerdo a la oxidación general pero en un volumen total de 20 µL. Este ADN se redesnaturalizó en NaOH 0.05 M (volumen total 24 µL) durante 30 min a 37°C. Nuevamente la reacción se enfrió rápidamente en hielo, se dejó durante 5 min y se oxidó de acuerdo a la oxidación general.
Reacción general de oxidación para ADN genómico.
El ADN (1 µg o menos) se precipitó con etanol antes de la oxidación, después se filtró a través de una mini columna de oligo de centrifugación rápida (después de cuatro lavados con 600 µL de H2O). El ADN se desnaturalizó en NaOH 0.05 M (volumen total 24 µL o 40 µL) durante 30 min a 37°C. Después este se enfrió rápidamente en hielo, se dejó durante 5 min y se oxidó de acuerdo a la oxidación general.
1.7 Secuenciación de Sanger e Illumina de ADNdc tratado con bisulfito oxidativo
Para la secuenciación de Sanger, 1 μg de ADN de 122 mer que contiene C, 5mC y 5hmC se oxidó de acuerdo con la doble oxidación de ADNdc y se trató con bisulfito mediante el uso del juego de Qiagen Epitect, de conformidad con las instrucciones del fabricante para muestras FFPE, excepto que el ciclo térmico se realizó dos veces más. Después esas muestras se sometieron a la secuenciación de Sanger (fuente BioScience).
Para la secuenciación Illumina, 1 μg de ADN de 122 mer y de 135 mer que contienen 5hmC se digirieron durante la noche con DraI (2 μl, New England Biolabs) y SspI (1 μl, New England Biolabs). Las bandas digeridas se purificaron con el juego de extracción de gel Fermentas GeneJET y se ligaron los adaptadores metilados (Illumina) mediante el uso de la mezcla maestra de preparación de muestra NEBNext ADN. Después de la oxidación y del tratamiento con bisulfito como anteriormente, los fragmentos ligados se amplificaron (18 ciclos) mediante el uso de Pfu Turbo Cx (Agilent) y los cebadores específicos del adaptador (Illumina), seguido de purificación mediante perlas AMPure XP (Agencourt).
1.8 Espectrometría de masa
Los nucleósidos se derivaron del ADN mediante la digestión con la ADN Degradase Plus (Zymo Research) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se analizaron mediante LC-MS/MS en un espectrómetro de masas LTQ Orbitrap Velos (Thermo Scientific) equipado con una fuente de iones nanoelectrospray (Proxeon). Se adquirieron los datos del espectro de masas para 5hmC, 5fC y, donde fuera aplicable, 5mC y T, en modo de barrido de alta resolución (R >
40.000 para los iones pseudomoleculares protonados y > 50.000 para los fragmentos de iones de base protonados acompañantes), y además, en el modo de monitoreo de reacciones seleccionadas (SRM), se monitorearon las transiciones 258 -> 142.0611 (5hmC), 256 -> 140.0455 (5fC), 242 -> 126.0662 (5mC) y 243 -> 127.0502 (T). Los iones parentales se seleccionaron para SRM con una ventana de aislamiento de 4 unidades de masa y se fragmentaron mediante HCD con una energía de colisión relativa del 20 %, con R> 14.000 para los fragmentos de iones.
Las áreas de los pico de los cromatogramas iónicos que se extrajeron de los iones correspondientes a 5hmC y 5fC se normalizaron con aquellas de las de 5mC (donde fuera aplicable) o T, y se cuantificaron mediante calibración externa con respecto a los patrones que se obtienen por digestión de nucleótidos trifosfatos u oligonucleótidos.
1.9 Cultivo de células ES y extracción de ADN
Las células J1 ES (129S4/SvJae) se adquirieron de la ATCC (Cat. SCRC-1010) y se cultivaron sobre una capa alimentadora pMEF irradiada con rayos γ, a 37°C y 5% CO2 en medio ES completo (DMEM glucosa 4500 mg/l, Lglutamina 4 mM y piruvato de sodio 110 mg/l, suero fetal bovino 15%, penicilina 100 U / estreptomicina 100 µg en 100 ml de medio, amino ácidos no esenciales 0.1mM, β-mercaptoetanol 50 µM, 103U LIF ESGRO®). El ADN genómico se preparó de las células ES en el pase 14 o 20 mediante el uso del mini juego Qiagen Allprep ADN/ARN.
1.10 oxRRBS
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Claims (1)

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