ES2607635T3

ES2607635T3 - Derivados tiazol como inhibidores de tirosina quinasa de Bruton

Info

Publication number: ES2607635T3
Application number: ES13805327.7T
Authority: ES
Inventors: Nicholas John Silvester Huby; Francisco Javier Lopez-Tapia; Sung-Sau So
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2012-12-13
Filing date: 2013-12-09
Publication date: 2017-04-03
Anticipated expiration: 2033-12-09
Also published as: EP2931721A1; BR112015013762A2; EP2931721B1; JP6154482B2; CN104837837B; HK1212975A1; CN104837837A; JP2016502988A; US20150353534A1; WO2014090715A1; MX2015007291A; KR20150093238A; CA2893637A1; KR101707761B1; US9359345B2; RU2015126293A

Abstract

Compuesto de fórmula I:**Fórmula** en la que: A es alquilo C1-6, fenilo, CH2R1, OR4,**Fórmula** R1 es H,**Fórmula** R2 es H o halo, R3 es halo, R4 es alquilo C1-6, R5 es alquilo C1-6, R6 es H o halo, X es C(>=O) o S(>=O)2, y Y es CH o N, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

DESCRIPCION

Derivados tiazol como inhibidores de tirosina quinasa de Bruton CAMPO DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere a la utilizacion de nuevos compuestos que inhiben la Btk y que resultan utiles para el tratamiento de enfermedades autoinmunologicas e inflamatorias causadas por la activacion aberrante de las celulas B.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Las protema quinasas constituyen una de las familias mas grandes de enzimas humanos y regulan muchos procesos de senalizacion diferentes mediante la adicion de grupos fosfato a protemas (T. Hunter, Cell 50:823-829, 1987). Espedficamente, las tirosina quinasas fosforilan protemas en la fraccion fenolica de los residuos tirosina. La familia de tirosina quinasa incluye elementos que controlan el crecimiento, migracion y diferenciacion celulares. Se ha implicado la actividad anormal de quinasa en una diversidad de enfermedades humanas, incluyendo canceres, y enfermedades autoinmunologicas e inflamatorias. Debido a que las protema quinasas son reguladores clave de la senalizacion celular, proporcionan una diana para modular la funcion celular con inhibidores moleculares pequenos de quinasa y, de esta manera, constituyen buenas dianas de farmacos de diseno. Ademas del tratamiento de procesos de enfermedad mediados por quinasa, los inhibidores selectivos y eficaces de la actividad de quinasa tambien resultan utiles para la investigacion de los procesos de senalizacion celular y para la identificacion de otras dianas celulares de interes terapeutico.

Existe buena evidencia de que las celulas B desempenan un papel clave en la patogenesis de las enfermedades autoinmunologicas y/o inflamatorias. Los terapeuticos basados en protemas que reducen el numero de celulas B, tales como el Rituxan, resultan eficaces contra enfermedades inflamatorias reguladas por autoanticuerpos, tales como la artritis reumatoide (Rastetter et al., Annu. Rev. Med. 55:477, 2004). Por lo tanto, los inhibidores de las protema quinasas que desempenan una funcion en la activacion de las celulas B seguramente resultaran ser terapeuticos utiles para las patologfas mediadas por las celulas B, tales como la produccion de autoanticuerpos.

La senalizacion a traves del receptor de celulas B (RCB) controla un abanico de respuestas de las celulas B, entre ellas la proliferacion y diferenciacion en celulas productoras de anticuerpos maduras. El RCB es un punto regulador clave para la actividad de las celulas B y la senalizacion aberrante puede provocar la proliferacion de celulas B desregulada y la formacion de autoanticuerpos patogenicos que conducen a multiples enfermedades autoinmunologicas y/o inflamatorias. La tirosina quinasa de Bruton (Btk) es una quinasa no asociada a RCB situada proxima a la membrana e inmediatamente despues del RCB. Se ha demostrado que la falta de Btk bloquea la senalizacion del RCB y, por lo tanto, la inhibicion de la Btk podna ser un enfoque terapeutico util para bloquear los procesos de enfermedad mediados por celulas B.

La Btk es un miembro de la familia Tec de tirosina quinasas y se ha demostrado que es un regulador crucial del desarrollo temprano de las celulas B y de la activacion y supervivencia de las celulas B maduras (Khan et al., Immunity 3:283, 1995; Ellmeier et al., J. Exp. Med. 192:1611, 2000). La mutacion de Btk en el ser humano conduce a la condicion de la agammaglobulinemia ligada al X (ALX) (revisada en Rosen et al., New Eng. J. Med. 333:431, 1995, y Lindvall et al., Immunol. Rev. 203:200, 2005). Estos pacientes se encuentran inmunocomprometidos y muestran una maduracion alterada de las celulas B, niveles reducidos de inmunoglobulinas y celulas B perifericas, respuestas inmunologicas independientes de las celulas T disminuidas, asf como una movilizacion atenuada del calcio tras la estimulacion de RCB.

Tambien se ha obtenido evidencia del papel de la Btk en las enfermedades autoinmunologicas e inflamatorias en modelos de raton deficiente en Btk. En modelos murinos preclmicos de lupus eritematoso sistemico (LES), los ratones deficientes en Btk muestran un alivio marcado de la progresion de la enfermedad. Ademas, los ratones deficientes en Btk son resistentes a la artritis inducida por colageno (Jansson y Holmdahl, Clin. Exp. Immunol. 94:459, 1993). Se ha demostrado que un inhibidor selectivo de Btk presenta eficacia dependiente de la dosis en un modelo de artritis de raton (Z. Pan et al., Chem. Med. Chem. 2:58-61,2007). Med. Chem. 2:58-61,2007).

Btk tambien se expresa en otras celulas aparte de las celulas B que podnan participar en procesos patologicos. Por ejemplo, la Btk se expresa en mastocitos y los mastocitos derivados de medula osea deficientes en Btk muestran una desgranulacion inducida por antfgeno alterada (Iwaki et al., J. Biol. Chem. 280:40261, 2005). Lo anterior demuestra que la Btk podna resultar util para tratar respuestas patologicas de mastocitos, tales como alergias y asma. Tambien los monocitos de los pacientes de XLA, en los que se encuentra ausente la actividad de Btk, muestran una produccion de TNF-alfa reducida tras la estimulacion (Horwood et al., J. Exp. Med. 197:1603, 2003). Por lo tanto, la inflamacion mediada por TNF-alfa podna estar modulada por inhibidores de Btk de molecula pequena. Ademas, se ha informado de que Btk desempena un papel en la apoptosis (Islam y Smith, Immunol. Rev.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

178:49, 2000) y, de esta manera, los inhibidores de Btk podrian resultar utiles en el tratamiento de determinados linfomas de celulas B y leucemias (Feldhahn et al., J. Exp. Med. 201:1837, 2005).

El documento n° WO 2010/068788 da a conocer amidas heterodclicas como inhibidores de Btk.

DESCRIPCION RESUMIDA DE LA INVENCION

La presente solicitud proporciona compuestos inhibidores de Btk de formula I, los compuestos para la utilizacion en metodos de tratamiento y composiciones de los mismos, tal como se indica posteriormente en la presente memoria.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I:

imagen1

en la que:

A es alquilo inferior, fenilo, CH2R1, OR4,

R1 es H,

R2 es H o halo,

R3 es halo,

R4 es alquilo inferior,

R5 es alquilo inferior,

R6 es H o halo,

X es C(=O) o S(=O)2, y Y es CH o N,

imagen2

imagen3

o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I para la utilizacion en un metodo de tratamiento de una condicion inflamatoria y/o autoinmunologica que comprende administrar en el paciente que lo requiera, una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto de formula I.

La solicitud proporciona una composicion farmaceutica que comprende el compuesto de formula I, mezclado con por lo menos un portador, excipiente o diluyente farmaceuticamente aceptable.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Definiciones

El termino "un" o "una" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una o mas de dicha entidad, por ejemplo un compuesto se refiere a uno o mas compuestos o a por lo menos un compuesto. De esta manera, los terminos "un" (o "una"), "uno o mas" y "por lo menos uno" pueden utilizarse intercambiablemente en la presente memoria.

La expresion "tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria" se refiere a la definicion mas amplia para cada grupo tal como se proporciona en la descripcion resumida de la invencion o en la reivindicacion mas amplia. En todas las demas realizaciones proporcionadas posteriormente, los sustituyentes que pueden encontrarse presentes en cada realizacion y que no se definen explfcitamente conservan la definicion mas amplia proporcionada en la descripcion resumida de la invencion.

Tal como se utiliza en la presente memoria, en una expresion de transicion o en el cuerpo de una reivindicacion, las expresiones "que comprende(n)" y "comprendiendo" debe interpretarse que presentan un significado abierto.

Es decir, los terminos deben interpretarse como sinonimos de las expresiones "que presenta por lo menos" o "que incluye por lo menos". En el caso de que se utilice en el contexto de un procedimiento, la expresion "que comprende" se refiere a que el procedimiento incluye por lo menos las etapas indicadas, aunque puede incluir etapas adicionales. En el caso de que se utilice en el contexto de un compuesto o composicion, la expresion "que comprende" se refiere a que el compuesto o composicion incluye por lo menos los elementos o componentes indicados, aunque puede incluir ademas elementos o componentes adicionales.

Tal como se utiliza en la presente memoria, a menos que se indique espedficamente lo contrario, el termino "o" se utiliza en el sentido "inclusivo" de "y/o" y no el sentido "exclusivo" de "cualquiera de/o".

El termino "independientemente" se utiliza en la presente memoria para indica que una variable se aplica en un caso cualquiera con independencia de la presencia o ausencia de una variable que presenta la misma definicion o una definicion diferente dentro del mismo compuesto. De esta manera, en un compuesto en el que R'' aparece dos veces y se define como "independientemente carbono o nitrogeno" ambos R'' pueden ser carbonos, ambos R'' pueden ser nitrogeno o un R'' puede ser carbono y el otro, nitrogeno.

En el caso de que cualquier variable aparezca mas de una vez en cualquier fraccion o formula que ilustre y describe compuestos utilizados o reivindicados en la presente invencion, su definicion en cada aparicion sera independiente de su definicion en todas las demas apariciones. Ademas, las combinaciones de sustituyentes y/o variables son permisibles unicamente en el caso de que dichos compuestos resulten en compuestos estables.

Los sfmbolos "*" al final de un enlace o de "------" a traves de un enlace se refieren, cada uno, al punto de union de

un grupo funcional u otra fraccion qmmica al resto de la molecula de la que forma parte. De esta manera, por ejemplo:

MeC(=O)OR4

en la que

R4 = —<d o -j-<] => MeC(=0)0—<|

Un enlace dibujado en un sistema de anillos (no conectado en un vertice determinado) indica que el enlace puede unirse a cualquiera de los atomos anulares adecuados.

El termino “opcional” u “opcionalmente” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a que el suceso o circunstancia seguidamente indicado puede producirse o no producirse y que la descripcion incluye casos en los que el suceso o circunstancia se produce y casos en los que no se produce. Por ejemplo, "opcionalmente sustituido" se refiere a que la fraccion opcionalmente sustituida puede incorporar un hidrogeno o un sustituyente.

La expresion "enlace opcional" se refiere a que el enlace puede encontrarse presente o no y que la descripcion incluye enlaces sencillos, dobles o triples. En el caso de que se designe que un sustituyente sea un "enlace" o este "ausente", los atomos unidos a los sustituyentes se encuentran conectados directamente.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

El termino "aproximadamente" se utiliza en la presente memoria para referirse a en la region de, mas o menos o en el entorno de. En el caso de que el termino "aproximadamente" se utilice conjuntamente con un intervalo numerico, modifica ese intervalo extendiendo los lfmites por encima y por debajo de los valores numericos indicados. En general, el termino "aproximadamente" se utiliza en la presente memoria para modificar un valor numerico por encima y por debajo del valor indicado en una varianza de 20%.

Determinados compuestos de formulas I pueden mostrar tautomerismo. Los compuestos tautomericos pueden existir en forma de dos o mas especies interconvertibles. Los tautomeros prototropicos resultan de la migracion de un atomo de hidrogeno unido covalentemente entre dos atomos. Los tautomeros generalmente existen en equilibrio y los intentos para aislar un tautomero individual habitualmente producen una mezcla cuyas propiedades qmmicas y ffsicas son consistentes con una mezcla de compuestos. La posicion del equilibrio depende de las caractensticas qmmicas de la molecula. Por ejemplo, en muchos aldehfdos y cetonas alifaticas, tales como el acetaldelddo, la forma ceto es predominante, mientras que, en los fenols, predomina la forma enol. Entre los tautomeros prototropicos comunes se incluyen los tautomeros ceto/enol (-C(=O)-CH- u -C(-OH)=CH-), amida/acido airndico (- C(=O)-NH- u -C(-OH)=N-) y amidina (-C(=NR)-NH- u - C(-NHR)=N-). Los ultimos dos son particularmente comunes en los anillos heteroarilo y heterodclico y la presente invencion comprende todas las formas tautomericas de los compuestos.

A menos que se indique lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en la presente memoria presentan los mismos significados entendidos comunmente por el experto en la materia a la que se refiere la presente invencion, a menos que se indique lo contrario. En la presente memoria se hace referencia a diversas metodologfas y materiales conocidos por el experto en la materia. Entre las obras de referencia estandares que proporcionan principios generales de farmacologfa se incluyen The Pharmacological Basis of Therapeutics, de Goodman y Gilman, 10a ed., McGraw Hill Companies Inc., New York, 2001. Puede utilizarse cualesquiera materiales y/o metodos adecuados que conozca el experto en la materia durante la puesta en practica de la presente invencion. Sin embargo, se describen materiales y metodos preferentes. Los materiales, reactivos y similares a los que se hace referencia en la descripcion y ejemplos a continuacion pueden obtenerse de fuentes comerciales, a menos que se indique lo contrario.

Las definiciones proporcionadas en la presente memoria pueden enlazarse para formar combinaciones qmmicamente relevantes, tales como "heteroalquilarilo", "haloalquilheteroarilo", "arilalquilheterociclilo", "alquilcarbonilo", "alcoxialquilo" y similares. En el caso de que el termino "alquilo" se utilice como sufijo tras otro termino, tal como en "fenilalquilo" o "hidroxialquilo", pretende referirse a un grupo alquilo, tal como se ha definido anteriormente, que se sustituye con uno a dos sustituyentes seleccionados del otro grupo nombrado espedficamente. De esta manera, por ejemplo, "fenilalquilo" se refiere a un grupo alquilo que presenta uno a dos sustituyentes fenilo, y de esta manera incluye bencilo, feniletilo y bifenilo. Un "alquilaminoalquilo" es un grupo alquilo que presenta uno a dos sustituyentes alquilamino. El termino "hidroxialquilo" incluye 2-hidroxietilo, 2-hidroxipropilo, 1-(hidroximetil)-2-metilpropilo, 2-hidroxibutilo, 2,3-dihdiroxibutilo, 2-(hidroximetilo), 3-hidroxipropilo, etc. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "hidroxialquilo" se utiliza para definir un subgrupo de grupos heteroarilo definido posteriormente. El termino -(ar)alquilo se refiere a un grupo alquilo o aralquilo no sustituido. El termino (hetero)arilo o (het)arilo se refiere a un grupo arilo o heteroarilo.

El termino "espirocicloalquilo", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un grupo cicloalquilo espirodclico, tal como, por ejemplo, espiro[3.3]heptano. El termino "espiroheterocicloalquilo", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a heterocicloalquilo espirodclico, tal como, por ejemplo, 2,6-diaza-spiro[3.3]heptano.

El termino "acilo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un grupo de formula -C(=O)R, en la que R es hidrogeno o alquilo inferior tal como se define en la presente memoria. El termino "alquilcarbonilo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un grupo de formula -C(=O)R, en la que R es alquilo tal como se define en la presente memoria. El termino acilo C1-6 se refiere a un grupo -C(=O)R que contiene 6 atomos de carbono. El termino "arilcarbonilo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un grupo de formula C(=O)R, en la que R es un grupo arilo; el termino "benzoilo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un grupo "arilcarbonilo" en el que R es fenilo.

El termino "ester" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un grupo de formula -C(=O)R, en la que R es alquilo inferior tal como se define en la presente memoria.

El termino "alquilo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un residuo hidrocarburo monovalente saturado de cadena no ramificada o ramificada que contiene 1 a 10 atomos de carbono. La expresion "alquilo inferior" se refiere a un residuo hidrocarburo de cadena lineal o ramificada que contiene 1 a 6 atomos de carbono, El termino "alquilo C1-10" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un alquilo compuesto de 1 a 10 carbonos. Entre los ejemplos de grupos alquilo se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, grupos de alquilo inferior, entre ellos metilo, etilo, propilo, i-propilo, n-butilo, i-butilo, t-butilo o pentilo, isopentilo, neopentilo, hexilo, heptilo y octilo.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

En el caso de que el termino "alquilo" se utilice como sufijo tras otro termino, tal como en "femlalquilo" o "hidroxialquilo", pretende referirse a un grupo alquilo, tal como se ha definido anteriormente, que se sustituye con uno a dos sustituyentes seleccionados del otro grupo nombrado espedficamente. De esta manera, por ejemplo "fenilalquilo" se refiere al radical R'R''-, en el que R' es un radical fenilo y R'' es un radical alquileno tal como se define en la presente memoria, en el entendimiento de que el punto de union de la fraccion fenilalquilo se encontrara en el radical alquileno. Entre los ejemplos de radical arilalquilo se incluyen, aunque sin limitacion, bencilo, feniletilo y 3-fenilpropilo. Los terminos "arilalquilo" y "aralquilo" se interpretan de manera similar, excepto en que R' es un radical arilo. Los terminos "(het)arilalquilo" y "(het)aralquilo" se interpretan de manera similar, excepto en que R' es opcionalmente un radical arilo o heteroarilo.

Las expresiones "haloalquilo" o "halo-alquilo inferior" o "haloalquilo inferior" se refieren a un residuo hiddrocarburo de cadena lineal o ramificada que contiene 1 a 6 atomos de carbono en el que se sustituye uno o mas atomos de carbono con uno o mas atomos de halogeno.

El termino "alquileno" o "alquilenilo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un radical hidrocarburo lineal saturado divalente de 1 a 10 atomos de carbono (por ejemplo (CH2)n) o un radical hidrocarburo divalente saturado ramificado de 2 a 10 atomos de carbono (por ejemplo -CHMe- o -CH2CH(/'-Pr)CH2-), a menos que se indique lo contrario. Excepto en el caso del metileno, las valencias abiertas de un grupo alquileno no se unen al mismo atomo. Entre los ejemplos de radical alquileno se incluyen, aunque sin limitacion, metileno, etileno, propileno, 2-metil-propileno, 1,1 -dimetil-etileno, butileno y 2-etilbutileno.

El termino "alcoxi" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un grupo -O-alquilo, en el que alquilo es tal como se ha definido anteriormente, tal como metoxi, etoxi, n-propiloxi, i-propiloxi, n-butiloxi, i-butiloxi, t-butiloxi, pentiloxi, hexiloxi, incluyendo los isomeros de los mismos. La expresion "alcoxi inferior" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un grupo alcoxi con un grupo "alquilo inferior" tal como se ha definido anteriormente. El termino "alcoxi C1-10" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un -O-alquilo en el que el alquilo es C1-10.

El termino "PCy3" se refiere a una fosfina trisustituida con tres fracciones dclicas.

Las expresiones "haloalcoxi" o "halo-alcoxi inferior" o "haloalcoxi inferior" se refieren a un grupo alcoxi inferior en el que se sustituye uno o mas atomos de carbono por uno o mas atomos de halogeno.

El termino "hidroxialquilo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un radical alquilo definidos en la presente memoria en los que uno a tres atomos de hidrogeno en diferentes atomos de carbono se sustituyen por grupos hidroxilo.

Los terminos "alquilsulfonilo" y "arilsulfonilo" tal como se utilizan en la presente memoria se refieren a un grupo de formula -S(=O)2R, en la que R es alquilo o arilo, respectivamente, y alquilo y arilo son tal como se define en la presente memoria. El termino "heteroalquilsulfonilo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un grupo de formula -S(=O)2R, en la que R es "heteroalquilo" tal como se define en la presente memoria.

Los terminos "alquilsulfonilamino" y "arilsulfonilamino" tal como se utilizan en la presente memoria se refieren a un grupo de formula -NR'S(=O)2R, en la que R es alquilo o arilo, respectivamente, R' es hidrogeno o alquilo C1-3 y alquilo y arilo son tal como se define en la presente memoria.

El termino “cicloalquilo” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anillo carbodclico saturado que contiene entre 3 y 8 atomos de carbono, es decir ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo o ciclooctilo. El termino "cicloalquilo C3-7" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un cicloalquilo compuesto de 3 a 7 carbonos en el anillo carbodclico.

El termino "carboxi-alquilo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una fraccion alquilo en la que un atomo de hidrogeno ha sido sustituido por un carboxilo, bajo la condicion de que el punto de union del radical heteroalquilo sea a traves de un atomo de carbono. El termino "carboxi" o "carboxilo" se refiere a una fraccion - CO2H.

El termino “heteroarilo” o "heteroaromatico" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un radical monodclico o bidclico de 5 a 12 atomos anulares que presenta por lo menos un anillo aromatico o parcialmente insaturado que contiene cuatro a ocho atomos en cada anillo, que incorpora uno o mas heteroatomos N, O o S, siendo de carbono los atomos anulares restantes, bajo la condicion de que el punto de union del radical heteroarilo se encuentre en un anillo aromatico o parcialmente insaturado. Tal como es bien conocido por el experto en la materia, los anillos heteroarilo presentan un menor caracter aromatico que sus contrapartidas de solo carbonos. De esta manera, para los fines de la invencion, un grupo heteroarilo solo necesita presentar cierto grado de caracter aromatico. Entre los ejemplos de fracciones heteroarilo se incluyen heterociclos aromaticos monodclicos que

5

10

15

20

25

30

35

40

45

presentan entre 5 y 6 atomos anulares y 1 a 3 heteroatomos, incluyendo piridinilo, pirimidinilo, pirazinilo, oxazinilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, oxazolilo, 4,5-dihidro-oxazolilo, 5,6-dihidro-4H-[1,3]oxazolilo, isoxazol, tiazol, isotiazol, triazolina, tiadiazol y oxadiaxolina, que pueden encontrarse opcionalmente sustituidos con uno o mas, preferentemente uno o dos sustituyentes seleccionados de entre hidroxi, ciano, alquilo, alcoxi, tio, haloalcoxi inferior, alquiltio, halogeno, haloalquilo inferior, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, halogeno, amino, alquilamino, dialquilamino, aminoalquilo, alquilaminoalquilo y dialquilaminoalquilo, nitro, alcoxicarbonilo y carbamoilo, alquilcarbamoilo, dialquilcarbamoilo, arilcarbamoilo, alquilcarbonilamino y arilcarbonilamino. Entre los ejemplos de fracciones bidclicas se incluyen, aunque sin limitacion, quinolinilo, isoquinolinilo, benzofurilo, benzotiofenilo, benzoxazol, bencisoxazol, benzotiazol, naftiridinilo, 5,6,7,8-tetrahidro-[1,6]naftiridinilo y bencisotiazol. Las fracciones bidclicas pueden sustituirse opcionalmente en cualquiera de los anillos; sin embargo, el punto de union se encuentra en un anillo que contiene un heteroatomo.

El termino "heterociclilo", "heterocicloalquilo" o "heterociclo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un radical dclico saturado monovalente que consiste de uno o mas anillos, preferentemente uno a dos anillos, que incluyen sistemas de anillos espirodclicos, de tres a ocho atomos en cada anillo, que incorporan uno o mas heteroatomos anulares (seleccionados de entre N, O o S(O)o-2) y que pueden opcionalmente sustituirse independientemente con uno o mas, preferentemente uno o dos, sustituyentes seleccionados de entre hidroxi, oxo, ciano, alquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alquiltio, halogeno, haloalquilo inferior, hidroxialquilo, nitro, alcoxicarbonilo, amino, alquilamino, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, alquilaminosulfonilo, arilaminosulfonilo, alquilsulfonilamino, arilsulfonilamino, alquilaminocarbonilo, arilaminocarbonilo, alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, y formas ionicas de los mismos, a menos que se indique lo contrario. Entre los radicales heterodclicos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, morfolinilo, piperazinilo, piperidinilo, azetidinilo, pirrolidinilo, hexahidroazepinilo, oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotiofenilo, oxazolidinilo, tiazolidinilo, isoxazolidinilo, tetrahidropiranilo, tiomorfolinilo, quinuclidinilo e imidazolinilo, y formas ionicas de los mismos. Los ejemplos tambien pueden ser bidclicos, tales como, por ejemplo, 3,8-diaza-biciclo[3.2.1]octano, 2,5-diaza-biciclo[2.2.2]octano u octahidro- pirazino[2,1-c][1,4]oxazina.

Inhibidores de Btk

La solicitud proporciona un compuesto de formula I:

imagen4

en la que:

A es alquilo inferior, fenilo, CH2R1, OR4,

o

R1 es H,

R2 es H o halo,

3

R es halo,

R4 es alquilo inferior,

R5 es alquilo inferior,

R6 es H o halo,

X es C(=O) o S(=O)2, y Y es CH o N,

imagen5

imagen6

imagen7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.

Ademas, debe entenderse que cada realization referente a un residuo espetifico A, R1, R2, R3, R4, R5, R6, Y y Xtal como se da a conocer en la presente memoria puede combinarse con cualquier otra realizacion referente a otro residuo A, R1, R2, R3, R4, R5, R6, Y y X tal como se da a conocer en la presente memoria.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que X es C(=O).

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que A es:

imagen8

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que X es C(=O) y A es:

imagen9

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que R6 es H.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que R6 es Cl.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que R6 es H, X es C(=O) y A es:

imagen10

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que R6 es Cl, X es C(=O) y A es:

imagen11

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que A es metilo o OR4 y R4 es f-butilo.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que A es metilo.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que A es metilo u OR y R4 es f-butilo.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que X es C(=O) y A es metilo.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que X es C(=O), A es metilo o OR4 y R4 es f-butilo.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que A es:

imagen12

y R5 es f-butilo.

5

10

15

20

25

30

35

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que X es C(=O), A es:

y R5 es f-butilo.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que Y es N. La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que Y es CH.

imagen13

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que Y es N, X es C(=O), A es:

imagen14

y R5 es f-butilo.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que Y es CH, X es C(=O), A es:

imagen15

y R5 es f-butilo.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que A es:

imagen16

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que R2 es H.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que R2 es t-butilo.

imagen17

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que X es C(=O), R2 es H, y A es:

imagen18

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que X es C(=O), R2 es f-butilo y A es:

imagen19

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que X es S(=O)2 y A es metilo, isopropilo o fenilo.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que X es S(=O)2 y A es metilo.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que X es S(=O)2 y A es isopropilo.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que X es S(=O)2 y A es fenilo.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que A es:

imagen20

y R3 es Cl.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, en la que X es C(=O), A es:

imagen21

y R3 es Cl.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I, seleccionado de entre el grupo que consiste de:

{(R)-1-[4-carbamoil-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-2-il]-piperidm-3-il}-amida de acido 1,3-dihidro-isoindol-2-carboxflico, {(R)-1-[4-carbamoil-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-2-il]-piperidm-3-il -amida de acido 5-cloro-1,3-dihidro-isoindol-2- carboxflico,

terc-butil-ester de acido {(R)-1-[4-carbamoil-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-2-il]-piperidm-3-il}-carbamico, 6-terc-butil-N-{(R)-1-[4-carbamoil-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-2-il]-piperidm-3-il}-nicotinamida, amida de acido 2-((R)-3-fenilacetilamino-piperidm-1-il)-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-4-carboxflico, amida de acido 5-(piridm-2-ilamino)-2-[(R)-3-(2-m-tolil-acetilamino)-piperidm-1-il]-tiazol-4-carboxflico, amida de acido 2-[(R)-3-(4-terc-butil-benzoilamino)-piperidm-1 -il]-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-4-carboxflico, amida de acido 2-((R)-3-metanosulfonilamino-piperidm-1-il)-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-4-carboxflico, amida de acido 2-((R)-3-bencenosulfonilamino-piperidm-1-il)-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-4-carboxflico, amida de acido 2-[(R)-3-(propano-2-sulfonilamino)-piperidm-1-il]-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-4-carboxflico, amida de acido 2-{(R)-3-[2-(3-cloro-fenilamino)-acetilamino]-piperidm-l-il}-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-4-carboxflico y

amida de acido 2-((R)-3-acetilamino-piperidm-1-il)-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-4-carboxflico.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I para la utilization en un metodo de tratamiento de una condition inflamatoria y/o autoinmunologica que comprende administrar en el paciente que lo requiera, una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto de formula I.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I para la utilizacion en un metodo de tratamiento de la artritis reumatoide que comprende administrar en el paciente que lo requiera, una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto de formula I.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I para la utilizacion en un metodo de tratamiento del asma que comprende administrar en el paciente que lo requiera, una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto de formula I.

La solicitud proporciona una composition farmaceutica que comprende el compuesto de formula I.

La solicitud proporciona el compuesto indicado anteriormente como sustancia terapeuticamente activa.

La solicitud proporciona una utilizacion del compuesto de formula I en la preparation de un medicamento destinado al tratamiento de un trastorno inflamatorio.

5

10

15

20

25

30

35

40

La solicitud proporciona una utilizacion del compuesto de formula I en la preparacion de un medicamento destinado al tratamiento de un trastorno autoinmunologico.

La solicitud proporciona una utilizacion del compuesto de formula I en la preparacion de un medicamento destinado al tratamiento de la artritis reumatoide.

La solicitud proporciona una utilizacion del compuesto de formula I en la preparacion de un medicamento destinado al tratamiento del asma.

La solicitud proporciona el compuesto indicado anteriormente para el tratamiento de una condicion inflamatoria y/o autoinmunologica.

La solicitud proporciona el compuesto indicado anteriormente para el tratamiento de la artritis reumatoide.

La solicitud proporciona el compuesto indicado anteriormente para el tratamiento del asma.

La solicitud proporciona el compuesto indicado anteriormente para la utilizacion en el tratamiento de una condicion inflamatoria y/o autoinmunologica.

La solicitud proporciona un compuesto indicado anteriormente para la utilizacion en el tratamiento de la artritis reumatoide o del asma.

La solicitud proporciona un compuesto o composicion tal como se indica en la presente memoria.

Compuestos y preparacion

Se proporcionan en la Tabla, posteriormente, ejemplos de compuestos representativos comprendidos en la presente invencion y dentro del alcance de la misma. Estos ejemplos y preparaciones, proporcionados posteriormente, se proporcionan para permitir que el experto en la materia entienda mas claramente y ponga en practica la presente invencion. No deben considerarse limitativos del alcance de la invencion, sino meramente ilustrativos y representativos de la misma.

En general, la nomenclatura utilizada en la presente solicitud se basa en AutoNom™ v.4.0, un sistema computerizado del Beilstein Institute para la generation de nomenclatura sistematica de la IUPAC. En caso de una discrepancia entre una estructura ilustrada y un nombre dado a dicha estructura, la estructura ilustrada debe recibir mas peso. Ademas, en el caso de que la estereoqulmica de una estructura o de una parte de una estructura no se encuentre indicada mediante, por ejemplo, negrita o llneas discontinuas, la estructura o la parte de la estructura debe interpretarse que comprende la totalidad de los estereoisomeros de la misma.

La TABLA I ilustra ejemplos de compuestos segun la formula generica I:

TABLA I

Compuesto: Nomenclatura Estructura

1: {(R)-1-[4-carbamoil-5-(piridln-2- ilamino)-tiazol-2-il]-piperidln-3-il}- amida de acido 1,3-dihidro- isoindol-2-carboxllico >o a 6 ^

2: {(R)-1-[4-carbamoil-5-(piridm-2- ilamino)-tiazol-2-il]-piperidm-3-il}- amida de acido 5-cloro-1,3- dihidroisoindol-2-carboxflico ,NH= H °Y\ HN s \___y 6

3: terc-butil-ester de acido {(R)-1-[4- carbamoil-5-(piridm-2-ilamino)- tiazol-2-il]-piperidm-3-il}-carbamico h3i °y° ctVh

4: 6-terc-butil-N- {(R)-1 -[4-carbamoil- 5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-2-il]- piperidm-3-il -nicotinamida 0 /H2 . ibuvx o ^y

5: amida de acido 2-((R)-3- fenilacetilamino-piperidm-1-il)-5- (piridm-2-ilamino)-tiazol-4- carboxflico nh2 «-^x - ^ sAcrro

6: amida de acido 5-(piridm-2- ilamino)-2-[(R)-3-(2-m-tolil- acetilamino)-piperidm-1-il]-tiazol-4- carboxflico nh2 B^X "

7: amida de acido 2-[(R)-3-(4-terc- butil-benzoilamino)-piperidm-1-il]- 5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-4- carboxflico nh2

8: amida de acido 2-((R)-3- metanosulfonilamino-piperidm-1- il)-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-4- carboxflico nh2 H Os

9: amida de acido 2-((R)-3- bencenosulfonilaminopiperidm-1- il)-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-4- carboxflico nh2

10: amida de acido 2-[(R)-3-(propano- 2-sulfonilamino)-piperidm-1-il]-5- (piridm-2-ilamino)-tiazol-4- carboxflico

11: amida de acido 2-{(R)-3-[2-(3- clorofenilamino)-acetilamino]- piperidm-1-il}-5-(piridm-2-ilamino)- tiazol-4-carboxflico .NH, HljT^S V__/ 6

12: amida de acido 2-((R)-3- acetilaminopiperidm-1-il)-5- (piridm-2-ilamino)-tiazol-4- carboxflico nh2 B^X » CpVr

Esquemas sinteticos generales

Los compuestos de la presente invencion pueden prepararse mediante cualesquiera medios convencionales. Se 5 proporcionan procedimientos adecuados para sintetizar dichos compuestos en los Ejemplos. Generalmente, los compuestos de la invencion pueden prepararse segun los Esquemas, posteriormente.

Los compuestos reivindicados en la presente invencion pueden prepararse mediante la ruta mostrada en el Esquema 1.

5

10

15

20

25

30

35

imagen22

En la primera etapa de la secuencia sintetica se combino 2-bromotiazol-4-carbonitrilo 2 disponible comercialmente con un derivado piperidina sustituido apropiadamente, tal como terc-butil-ester de acido piperidm-3-ilcarbamico 3, formando los derivados tiazol 2-piperidinil-sustituidos de formula 4. El acoplamiento de la amina secundaria dclica de piperidina con un 2-bromotiazol puede llevarse a cabo bajo catalisis con paladio (0) en presencia de un ligando basado en fosfina adecuado que estimula el acoplamiento cruzado eficiente entre los 2 sustratos organicos. Muchas variaciones de las condiciones para el acoplamiento eficiente de haluros y aminas heteroaromaticos son conocidas de la literatura qmmica (Chem. Sci. 2:27, 2011) e incluyen la variacion en el precursor de catalizador de paladio (0), ligando de fosfina, base, temperatura de reaccion, solvente, estequiometria y concentracion de los reactivos. Las condiciones preferentes para llevar a cabo el acoplamiento de 2-bromotiazol 2 y piperidina sustituida 3 son la utilizacion de tris-(dibenciliden-acetona)dipaladio (0) (CAS numero 51364-51-3) como fuente de paladio (0), 2- (diciclohexilfosfino)-3,6-dimetoxi-2',4',6'-triisopropil-1,1'-bifenilo (BrettPhos, CAS numero 1070663-78-3) como ligando de fosfina, carbonato de cesio como base y llevando a cabo la reaccion en terc-butanol bajo calentamiento a 95°C.

En la segunda etapa de la secuencia sintetica se introdujo un atomo de bromo en la posicion 5 del anillo tiazol en el compuesto 4. Las condiciones preferentes para llevar a cabo dicha transformacion son la utilizacion de un ligero exceso estequiometrico de N-bromosuccinimida en DMF. Bajo dichas condiciones, el bromuro de tiazol 5 puede obtenerse limpiamente con un buen rendimiento con tiempos de reaccion cortos. Las condiciones alternativas de bromuracion que utilizan diferentes reactivos de transferencia de atomo de bromo y/o condiciones de reaccion puede ser igualmente eficientes.

En la tercera etapa de la secuencia sintetica, el bromuro de tiazol 5 se hace reaccionar con una amina para sustituir el atomo de bromo por un atomo de nitrogeno sustituido y formar un tiazol amino-sustituido. En el caso en que la reaccion de la amina es 2-aminopiridina, el producto es el tiazol sustituido con 2-aminopiridina 6. Esta transformacion se lleva a cabo mejor catalfticamente utilizando la catalisis con paladio (0) en presencia de un ligando basado en fosfina adecuado que estimula el acoplamiento cruzado eficiente entre los 2 sustratos organicos. Muchas variaciones de las condiciones para el acoplamiento eficiente de haluros y aminas heteroaromaticos son conocidas de la literatura qmmica (Chem. Sci. 2:27, 2011) e incluyen la variacion en el precursor de catalizador de paladio (0), ligando de fosfina, base, temperatura de reaccion, solvente, estequiometria y concentracion de los reactivos. Las condiciones preferentes para llevar a cabo el acoplamiento de 5-bromotiazol 5 con 2-aminopiridina son la utilizacion de tris-dibenciliden-acetona de dipaladio como la fuente de paladio (0), 4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilxanteno (Xantfos, CAS numero 161265-03-8) como ligando de fosfina, fosfato potasico tribasico como base y la realizacion de la reaccion en p-dioxano bajo calentamiento a 110°C.

En la cuarta etapa de la secuencia sintetica, el nitrilo en la posicion 4 del anillo tiazol en el compuesto 6 se convierte en una carboxamida primaria. Se ha informado de numerosas condiciones para la hidrolisis de los nitrilos con el fin

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

de formar carboxamidas primarias, incluyendo la utilizacion de base o acido acuoso. Las condiciones preferentes para llevar a cabo dicha reaccion, las cuales son compatibles con otra funcionalidad presente en el material de partida 6 y el producto 7, son la utilizacion de hidruro(acido dimetilfosfinoso-kP) [hidrogeno bis(dimetilfosfino- kP)]platino (II) (catalizador de Parkins, CAS numero 173416-05-2, J. Mol. Catal. A: chem. 160:249, 2000; Organic Letters 9:227, 2007) en una mezcla bajo calentamiento de tetrahidrofurano y agua.

Con el fin de funcionalizar el nitrogeno exodclico en el anillo piperidina, el grupo terc-butiloxicarbonilo se elimina en la quinta etapa de la secuencia sintetica. El grupo terc-butiloxicarbonilo tipicamente se elimina bajo condiciones acidas. Las condiciones preferentes para la eliminacion del grupo terc-butiloxicarbonilo del nitrogeno exodclico en el compuesto 7 son el tratamiento con una mezcla 1:1 de acido trifluoroacetico en diclorometano a temperatura ambiente. Bajo estas condiciones, la amina primaria 8 se forma inicialmente como la sal trifluoroacetato correspondiente, que puede convertirse en la base libre en una etapa separada, tal como la separacion entre un solvente organico y una solucion acuosa de una base apropiada, tal como hidrogenocarbonato sodico. Alternativamente, la neutralizacion de 8 puede llevarse a cabo in situ conjuntamente con la funcionalizacion de la amina primaria mediante la adicion de una base amina terciaria organica, tal como trietilamina o diisopropiletilamina.

Los compuestos reivindicados en la presente memoria, los compuestos de formula general 1, se preparan mediante derivatizacion de la amina primaria presente en el compuesto 8. En el caso de que la amina primaria deba convertirse en una amida, la amina puede hacerse reaccionar con un agente acilante, tal como un cloruro de acilo, en presencia de una base amina terciaria, para secuestrar el acido liberado, o condensarse con un acido carboxflico en presencia de un reactivo de acoplamiento de peptido, tal como hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)- N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU, CAS numero 94790-37-1). Alternativamente, la amina primaria tambien puede convertirse en una sulfonamida mediante la reaccion con un cloruro de sulfonilo. Alternativamente, la amina primaria puede convertirse en una urea mediante reaccion con un isocianato preformado, mediante conversion de la amina en un isocianato, seguido de la reaccion con un reactivo que contiene una segunda amina primaria o secundaria, o mediante reaccion con un carbonato que contiene 2 grupos labiles unidos al carbonilo, de manera que la amina 8 reacciona con el carbonato formando inicialmente un carbamato reactivo que puede reaccionar con un segundo equivalente de una amina primaria o segundaria, formando una urea. En el caso de que se sustituya un alcohol por el segundo equivalente de amina, el producto resultante es un carbamato. Alternativamente, la amina primaria puede convertirse en un carbamato directamente mediante reaccion de la amina primaria con un cloroformato sustituido o reactivo equivalente.

Resultara evidente para el experto en la materia de la qmmica organica que la secuencia sintetica mostrada en el Esquema 1 es unicamente una manera de preparar los compuestos reivindicados en la presente solicitud y que los reactivos y condiciones sugeridos para las transformaciones implicadas en cada etapa pueden no ser optimas para derivados particulares. Se esperana que el experto en la materia de la qmmica organica pueda derivar condiciones o encontrar un reactivo adecuado para llevar a cabo las transformaciones indicadas en el Esquema 1 haciendo referencia a los ejemplos proporcionados en la presente solicitud y mediante la referencia a ejemplos adecuados en otras publicaciones de la literatura qmmica.

Composiciones farmaceuticas y administracion

Los compuestos de la presente invencion pueden formularse en una amplia diversidad de formas y portadores de administracion oral. La administracion oral puede llevarse a cabo en forma de tabletas, tabletas recubiertas, grageas, capsulas de gelatina dura y blanda, soluciones, emulsiones, jarabes o suspensiones. Los compuestos de la presente invencion resultan eficaces al administrarse por otras vfas de administracion, incluyendo la administracion continua (goteo intravenoso), topica, parenteral, intramuscular, intravenosa, subcutanea, transdermica (que puede incluir un agente de potenciacion de la penetracion), bucal, nasal, mediante inhalacion y mediante supositorios, entre otras vfas de administracion. El modo de administracion preferente generalmente es oral al utilizar un regimen de administracion diaria conveniente que puede ajustarse segun el grado de la afliccion y la respuesta del paciente al ingrediente activo.

Puede introducirse uno o mas compuestos de la presente invencion, asf como sus sales farmaceuticamente aceptables, conjuntamente con uno o mas excipientes, portadores o diluyentes convencionales, en la forma de composiciones farmaceuticas y dosis unitarias. Las composiciones farmaceuticas y formas de dosificacion unitaria pueden comprender ingredientes convencionales en proporciones convencionales, con o sin compuestos o principios activos adicionales y las formas de dosificacion unitaria pueden contener cualquier cantidad eficaz adecuada del ingrediente activo proporcionales al intervalo de dosis diaria que se pretende utilizar. Las composiciones farmaceuticas pueden utilizarse como solidos, tales como tabletas o capsulas rellenas, semisolidos, polvos, formulaciones de liberacion sostenida, o lfquidos tales como soluciones, suspensiones, emulsiones, elixires o capsulas rellenas para la utilizacion oral, o en forma de supositorios para la administracion rectal o vaginal o en forma de soluciones inyectables esteriles para la utilizacion parenteral. Una preparacion tfpica contiene entre aproximadamente 5% y aproximadamente 95% de compuesto o compuestos activos (p/p). El termino "preparacion" o "forma de dosificacion" pretende incluir formulaciones tanto solidas como lfquidas del compuesto activo, y el

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

experto en la materia apreciara que puede existir un ingrediente activo en preparaciones diferentes dependiendo del organo o tejido diana y de la dosis deseada y parametros farmacocineticos.

El termino "excipiente" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un compuesto que resulta util para preparar una composicion farmaceutica que es generalmente segura, no toxica y que no resulta no deseable biologicamente o de otro modo, e incluye excipientes que resultan aceptables para el uso veterinario asf como el uso farmaceutico humano. Los compuestos de la presente invencion pueden administrarse solos, aunque generalmente se administran mezclados con uno o mas excipientes, diluyentes o portadores farmaceuticos adecuados seleccionados segun la via de administracion deseada y la practica farmaceutica estandar.

La expresion “farmaceuticamente aceptable” se refiere a que resulta util para preparar una composicion farmaceutica que es generalmente segura, no toxica y que no resulta indeseable biologicamente o de otro modo y que resulta aceptable para el uso veterinario asf como farmaceutico humano.

Una forma de "sal farmaceuticamente aceptable" de un ingrediente activo tambien puede proporcionar inicialmente una propiedad farmacocinetica deseada al ingrediente activo que se encuentra ausente en la forma no salina, y puede incluso afectar positivamente a la farmacodinamica del ingrediente activo con respecto a su actividad terapeutica en el cuerpo. La expresion “sal farmaceuticamente aceptable" de un compuesto se refiere a una sal que es farmaceuticamente aceptables y que presenta la actividad farmacologica deseada del compuesto parental. Entre dichas sales se incluyen: (1) sales de adicion de acido, formadas con acidos inorganicos, tales como acido clorhudrico, acido bromhHdrico, acido sulfurico, acido mtrico y acido fosforico, y similares, o formadas con acidos organicos, tales como acido acetico, acido propionico, acido hexanoico, acido ciclopentanopropionico, acido glicolico, acido piruvico, acido lactico, acido malonico, acido succmico, acido malico, acido maleico, acido fumarico, acido tartarico, acido cftrico, acido benzoico, acido 3-(4-hidroxibenzoil)benzoico, acido cinamico, acido mandelico, acido metanosulfonico, acido etanosulfonico, acido 1,2-etano-disulfonico, acido 2-hidroxietanosulfonico, acido bencenosulfonico, acido 4-clorobencenosulfonico, acido 2-naftalenosulfonico, acido 4-toluenosulfonico, acido canforsulfonico, acido 4-metilbiciclo[2.2.2]-oct-2-en-1-carboxflico, acido glucoheptonico, acido 3-fenilpropionico, acido trimetilacetico, acido butilacetico terciario, acido laurilsulfurico, acido gluconico, acido glutamico, acido hidroxinaftoico, acido salidlico, acido estearico, acido muconico, y similares o (2) sales formadas en el caso de que un proton acido presente en el compuesto parental sea sustituido por un ion metalico, por ejemplo un ion de metal alcalino, un ion de alcalino-terreo, o un ion de aluminio, o coordinados con una base organica, tal como etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N-metilglucamina y similares.

Entre las preparaciones en forma solida se incluyen polvos, tabletas, pfldoras, capsulas, sellos, supositorios y granulos dispersables. Un portador solido puede ser una o mas sustancias que tambien pueden actuar como diluyentes, agentes saborizantes, solubilizadores, lubricantes, agentes de suspension, ligantes, conservantes, agentes desintegrantes de tableta o un material de encapsulado. En forma de polvos, el portador generalmente es un solido finamente dividido que es una mezcla con el componente activo finamente dividido. En tabletas, el componente activo generalmente se mezcla con el portador que presenta la capacidad ligante necesaria en proporciones adecuadas y se compacta en la forma y tamano deseados. Entre los portadores adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azucar, lactosa, pectina, dextrina, almidon, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sodica, una cera de bajo punto de fusion, manteca de cacao y similares. Las preparaciones en forma solida pueden contener, ademas del componente activo, colorantes, saborizantes, estabilizadores, tampones, edulcorantes artificiales y naturales, dispersantes, espesantes, agentes solubilizadores y similares.

Entre las formulaciones lfquidas que tambien resultan adecuadas para la administracion oral se incluyen formulaciones lfquidas, incluyendo emulsiones, jarabes, elixires, soluciones acuosas y suspensiones acuosas. Entre ellas se incluyen preparaciones en forma solida destinadas a ser convertidas en preparaciones en forma lfquida poco antes de ser utilizadas. Pueden prepararse emulsiones en soluciones, por ejemplo en soluciones acuosas de propilenglicol o pueden contener agentes emulsionantes, tales como la lecitina, el monooleato de sorbitan o la acacia. Pueden prepararse soluciones acuosas mediante la disolucion del componente activo en agua y la adicion de colorantes adecuados, saborizantes, estabilizantes y agentes espesantes. Pueden prepararse suspensiones acuosas mediante la dispersion del componente activo finamente dividido en agua con material viscoso, tal como gomas naturales o sinteticas, resinas, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sodica y otros agentes de suspension bien conocidos.

Los compuestos de la presente invencion pueden formularse para la administracion parenteral (por ejemplo mediante inyeccion, por ejemplo la inyeccion de bolo o la infusion continua) y pueden presentarse en forma de dosis unitaria en ampollas, jeringas prerrellenas, infusiones de volumen reducido o recipientes multidosis con un conservante anadido. Las composiciones pueden presentar dichas formas, tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehfculos aceitosos o acuosos, por ejemplo soluciones en polietilenglicol acuoso. Entre los ejemplos de portadores, diluyentes, solventes o vehfculos aceitosos o no acuosos se incluyen propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales (por ejemplo aceite de oliva) y esteres organicos inyectables (por ejemplo oleato de etilo) y pueden contener agentes de formulacion, tales como agentes conservantes, humectantes, emulsionantes o de suspension,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

estabilizadores y/o dispersantes. Alternativamente, el ingrediente activo puede encontrarse en forma de polvos, obtenidos mediante aislamiento aseptico de un solido esteril o mediante liofilizacion a partir de solucion para la constitucion antes de la utilizacion con un vehnculo adecuado, por ejemplo agua esteril sin pirogenos.

Los compuestos de la presente invencion pueden formularse para la administracion topica en la epidermis como pomadas, cremas o lociones, o como parche transdermico. Las pomadas y cremas pueden, por ejemplo, formularse con una base acuosa o aceitosa con la adicion de agentes espesantes y/o gelificantes adecuados. Las lociones pueden formularse con una base acuosa o aceitosa y en general contendran ademas uno o mas agentes emulsionantes, agentes estabilizadores, agentes dispersantes, agentes de suspension, agentes espesantes o agentes colorantes. Entre las formulaciones adecuadas para la administracion topica en la boca se incluyen pastillas que comprenden agentes activos en una base saborizada, habitualmente sacarosa y acacia o tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte, tal como gelatina y glicerina o sacarosa y acacia, y lavados bucales que comprenden el ingrediente activo en un portador lfquido adecuado.

Los compuestos de la presente invencion pueden formularse para la administracion como supositorios. Una cera de bajo punto de fusion, tal como una mezcla de gliceridos de acido graso o manteca de cacao en primer lugar se funde y el componente activo se dispersa homogeneamente, por ejemplo mediante agitacion. La mezcla homogenea fundida seguidamente se vierte en moldes de tamano conveniente, se dejan enfriar y solidificar.

Los compuestos de la presente invencion pueden formularse para la administracion vaginal. Los pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o sprays que contienen ademas del ingrediente activo, son portadores que es conocido de la tecnica que resultan apropiados.

Los compuestos de la presente invencion pueden formularse para la administracion nasal. Las soluciones o suspensiones se aplican directamente en la cavidad nasal por medios convencionales, por ejemplo con un cuentagotas, pipeta o spray. Las formulaciones pueden proporcionarse en forma de dosis individual o multidosis. En este ultimo caso, de un cuentagotas o pipeta, lo anterior puede ser llevado a cabo por el paciente administrando un volumen predeterminado apropiado de la solucion o suspension. En el caso de un pulverizador, lo anterior puede llevarse a cabo, por ejemplo mediante una bomba de pulverizacion-atomizacion dosificadora.

Los compuestos de la presente invencion pueden formularse para la administracion de aerosol, particularmente en el tracto respiratorio e incluyendo la administracion intranasal. El compuesto generalmente presenta un tamano de partfcula reducido, por ejemplo del orden de cinco (5) micrometres o inferior. Dicho tamano de partfcula puede obtenerse por medios conocidos de la tecnica, por ejemplo mediante micronizacion. El ingrediente activo se proporciona en un paquete presurizado con un propelente adecuado, tal como clorofluorocarbono (CFC), por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano o diclorotetrafluoroetano o dioxido de carbono u otro gas adecuado. El aerosol puede contener tambien convenientemente un surfactante tal como lecitina. La dosis de farmaco puede controlarse con una valvula dosificadora. Alternativamente, los ingredientes activos pueden proporcionarse en una forma de polvos secos, por ejemplo una mezcla de polvos del compuesto en una base de polvos adecuada, tal como lactosa, almidon, derivados de almidon, tal como hidroxipropilmetilcelulosa y polivinilpirrolidona (PVP). El portador de polvos formara un gel en la cavidad nasal. La composicion de polvos puede presentarse en forma de dosis unitaria, por ejemplo en capsulas o cartuchos de, por ejemplo, gelatina, o paquetes blister a partir de los que pueden administrarse los polvos mediante un inhalador.

En caso de que se desee, las formulaciones pueden prepararse con recubrimientos entericos adaptados para la administracion de liberacion sostenida o controlada del ingrediente activo. Por ejemplo, los compuestos de la presente invencion pueden formularse en dispositivos de administracion transdermica o subcutanea de farmaco. Estos sistemas de administracion resultan ventajosos en el caso de que resulte necesaria la liberacion sostenida del compuesto y en el caso de que el cumplimiento del paciente de un regimen de tratamiento resulte crucial. Los compuestos en los sistemas de administracion transdermica frecuentemente se unen a un soporte solido adhesivo en la piel. El compuesto de interes tambien puede combinarse con un intensificador de la penetracion, por ejemplo azona (1-dodecil-azacicloheptan-2-ona). Los sistemas de administracion de liberacion sostenida se insertan subcutaneamente en la capa subdermica mediante cirugfa o inyeccion. Los implantes subdermicos encapsulan el compuesto en una membrana soluble en lfpidos, por ejemplo goma de silicona, o un polfmero biodegradable, por ejemplo acido polilactico.

Se describen formulaciones adecuadas conjuntamente con portadores, diluyentes y excipientes farmaceuticos, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 1995, editado por E. W. Martin, Mack Publishing Company, 19a edicion, Easton, Pennsylvania. Un tecnico de formulacion experto podna modificar las formulaciones dentro de las ensenanzas de la memoria con el fin de proporcionar numerosas formulaciones para una via particular de administracion sin que las composiciones de la presente invencion se conviertan en inestables y sin comprometer su actividad terapeutica.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La modificacion de los presentes compuestos para convertirlos en mas solubles en agua o en otro vehuculo, por ejemplo, puede conseguirse facilmente mediante modificaciones menores (formulacion de sal, esterificacion, etc.), que se encuentran perfectamente comprendidas dentro de los conocimientos del experto ordinario en la materia. Tambien se encuentra perfectamente comprendido dentro de los conocimientos del experto ordinario en la materia modificar la via de administracion y el regimen de administracion de un compuesto particular con el fin de controlar la farmacocinetica de los presentes compuestos para el maximo efecto beneficioso en el paciente.

La expresion "cantidad terapeuticamente eficaz" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una cantidad requerida para reducir los smtomas de la enfermedad en un individuo. La dosis se ajustara a los requisitos individuales en cada caso particular. La dosis puede variar dentro de amplios lfmites dependiendo de numerosos factores, tales como la gravedad de la enfermedad que debe tratarse, la edad y el estado general de salud del paciente, otros medicamentos con los que esta siendo tratado el paciente, la via y forma de administracion y las preferencias y experiencia del medico implicado. Para la administracion oral debena resultar apropiada una dosis diaria de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 1.000 mg/kg de peso corporal al dfa en monoterapia y/o en terapia de combinacion. Una dosis diaria preferente es de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal, mas preferentemente de entre 0,1 y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, y mas preferentemente de entre 1,0 y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal al dfa. De esta manera, para la administracion en una persona de 70 kg, un intervalo de dosis sena de entre aproximadamente 7 mg y 0,7 g al dfa. La dosis diaria puede administrarse en forma de una dosis individual o en dosis divididas, tfpicamente entre 1 y 5 dosis al dfa. Generalmente el tratamiento se inicia con dosis mas pequenas que son inferiores a la dosis optima del compuesto. A continuacion, se incrementa la dosis en incrementos pequenos hasta alcanzar el efecto optimo para el paciente individual. El experto ordinario en la materia del tratamiento de las enfermedades indicadas en la presente memoria podra, sin necesidad de experimentacion indebida y basandose en los propios conocimientos personales, la experiencia y la exposicion de la presente solicitud, determinar una cantidad terapeuticamente eficaz de los compuestos de la presente invencion para una enfermedad y paciente dados.

Las preparaciones farmaceuticas preferentemente se presentan en formas de administracion unitaria. En dicha forma, la preparacion se subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas del componente activo. La forma de dosificacion unitaria puede ser una preparacion empaquetada, conteniendo el paquete cantidades discretas de preparacion, tales como tabletas empaquetadas, capsulas y polvos en viales o ampollas. Ademas, la forma de dosificacion unitaria puede ser una capsula, tableta, oblea o pastilla, o puede ser el numero apropiado de cualquiera de ellas en forma empaquetada.

Indicaciones y metodos de tratamiento

Los compuestos de formula generica I inhiben la tirosina quinasa de Bruton (Btk). La activacion de la Btk por quinasas anteriores resulta en la activacion de la fosfolipasa Cy, que, a su vez, estimula la liberacion de mediadores proinflamatorios. Los compuestos de formulas I resultan utiles en el tratamiento de la artritis y de otras enfermedades antiinflamatorias y autoinmunologicas. Los compuestos segun las formulas I resultan, de acuerdo con lo anteriormente expuesto, utiles en el tratamiento de la artritis. Los compuestos de formula I resultan utiles para inhibir la Btk en las celulas y para modular el desarrollo de las celulas B. La presente invencion comprende ademas composiciones farmaceuticas que contienen compuestos de formulas I mezclados con portadores, excipientes o diluyentes farmaceuticamente aceptables.

Los compuestos indicados en la presente memoria son inhibidores de quinasa, en particular inhibidores de Btk. Estos inhibidores pueden resultar utiles para tratar una o mas enfermedades sensibles a la inhibicion de quinasa, incluyendo enfermedades sensibles a la inhibicion de Btk y/o a la inhibicion de la proliferacion de las celulas B, en mairnferos. Sin deseo de restringirse a ninguna teona en particular, se cree que la interaccion de los compuestos de la invencion con Btk resulta en la inhibicion de la actividad de Btk y, de esta manera, en la utilidad farmaceutica de estos compuestos. De acuerdo con lo anterior, la invencion incluye un metodo de tratamiento de un mamffero, por ejemplo un ser humano, que presenta una enfermedad sensible a la inhibicion de la actividad de Btk y/o que inhibe la proliferacion de las celulas B, que comprende administrar en el mamffero que presenta dicha enfermedad, una cantidad eficaz de por lo menos una entidad qmmica proporcionada en la presente memoria. Puede determinarse experimentalmente una concentracion eficaz, por ejemplo mediante el ensayo de la concentracion sangumea del compuesto, o teoricamente, mediante el calculo de la biodisponibilidad. Entre otras quinasas que pueden resultar afectadas ademas de Btk se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, otras tirosina quinasas y serina/treonina quinasas.

Las quinasas desempenan funciones notables en rutas de senalizacion que controlan procesos celulares fundamentales tales como la proliferacion, la diferenciacion y la muerte (apoptosis). La actividad de quinasa anormal se ha implicado en un amplio abanico de enfermedades, incluyendo multiples canceres, enfermedades autoinmunologicas y/o inflamatorias, y reacciones inflamatorias agudas. La funcion polifacetica de las quinasas en rutas de senalizacion celular clave proporciona una oportunidad significativa para identificar nuevos farmacos con diana en quinasas y rutas de senalizacion.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Una realizacion incluye un compuesto para la utilizacion en un metodo de tratamiento de un paciente que presenta una enfermedad autoinmunologica y/o inflamatoria, o una reaccion inflamatoria aguda sensible a la inhibicion de la actividad de Btk y/o de la proliferacion de las celulas B.

Entre las enfermedades autoinmunologicas y/o inflamatorias que pueden resultar afectadas utilizando compuestos y composiciones segun la invencion se incluyen, aunque sin limitarse a ellas: soriasis, alergia, enfermedad de Crohn, smdrome del intestino irritable, enfermedad de Sjogren, rechazo tisular del injerto y rechazo hiperagudo de organos trasplantados, asma, lupus eritematoso sistemico (y glomerulonefritis asociada), dermatomiositis, esclerosis multiple, escleroderma, vasculitis (asociada a ANCA y otras vasculitis), estados hemoltticos y trombocitopenicos autoinmunologicos, smdrome de Goodpasture (y glomerulonefritis y hemorragias pulmonares asociadas), ateroesclerosis, artritis reumatoide, purpura trombocitopenica idiopatica (PTI) cronica, enfermedad de Addison, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, diabetes, choque septico y miastenia grave.

Se indican en la presente memoria metodos de tratamiento en los que por lo menos una entidad qmmica proporcionada en la presente memoria se administra en combinacion con un agente antiinflamatorio. Entre los agentes antiinflamatorios se incluyen los AINE, inhibidores de enzima ciclooxigenasa no espedficos y espedficos de COX-2, compuestos de oro, corticoesteroides, metotrexato, antagonistas de receptores del factor de necrosis tumoral (FNT), inmunosupresores y metotrexato.

Entre los ejemplos de AINE se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, ibuprofeno, flurbiprofeno, naproxeno y naproxeno sodico, diclofenac, combinaciones de diclofenac sodico y misoprostol, sulindac, oxaprozina, diflunisal, piroxicam, indometacina, etodolac, fenoprofeno calcico, quetoprofeno, nabumetona sodica, sulfasalazina, tolmetina sodica e hidroxicloroquina. Entre los ejemplos de NSAID se incluyen ademas inhibidores espedficos de COX-2, tales como celecoxib, valdecoxib, lumiracoxib y/o etoricoxib.

En algunas realizaciones, el agente antiinflamatorio es un salicilato. Entre los salicilatos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el acido acetilsalidlico o aspirina, el salicilato sodico y la colina y los salicilatos de magnesio.

El agente antiinflamatorio tambien puede ser un corticoesteroide. Por ejemplo, el corticoesteroide puede ser cortisona, dexametasona, metilprednisolona, prednisolona, fosfato de prednisolona sodica, o prednisona.

En realizaciones adicionales, el agente antiinflamatorio es un compuesto de oro, tal como tiomalato sodico de oro o auranofina.

La solicitud incluye ademas realizaciones en las que el agente antiinflamatorio es un inhibidor metabolico, tal como un inhibidor de dihidrofolato reductasa, tal como metotrexato o un inhibidor de dihidroorotato deshidrogenasa, tal como leflunomida.

Otras realizaciones de la invencion se refieren a combinaciones en las que por lo menos un compuesto antiinflamatorio es un anticuerpo monoclonal anti-C5 (tal como eculizumab o pexelizumab), un antagonista de FNT, tal como entanercept, o infliximab, que es un anticuerpo monoclonal anti-FNT-alfa.

Todavfa otras realizaciones de la invencion se refieren a combinaciones en las que por lo menos un agente activo es un compuesto inmunosupresor, tal como un compuesto inmunosupresor seleccionado de entre metotrexato, leflunomida, ciclosporina, tacrolimus, azatioprina y micofenolato mofetilo.

Las celulas B y los precursores de las celulas B que expresan Btk han sido implicados en la patologfa de las neoplasias de celulas B, incluyendo el linfoma de celulas B, el linfoma (incluyendo el linfoma de Hodgkin y no de Hodgkin), el linfoma de celulas pilosas, el mieloma multiple, la leucemia mielogena cronica y aguda, y la leucemia linfodtica cronica y aguda.

Se ha demostrado que Btk es un inhibidor del complejo de senalizacion Fas/APO-1 inductor de muerte (CD-95) (DISC) en las celulas linfoides del linaje B. El destino de las celulas leucemicas/linfomicas puede residir en el equilibrio entre los efectos opuestos proapoptotico de las caspasas activadas por el DISC y un mecanismo regulador antiapoptotico anterior que implica Btk y/o sustratos de la misma (Vassilev et al., J. Biol. Chem. 274:1646-1656, 1998).

Tambien se ha descubierto que los inhibidores de Btk resultan utiles como agentes quimiosensibilizadores y, de esta manera, que resultan utiles en combinacion con otros farmacos quimioterapeuticos, en particular farmacos que inducen apoptosis. Entre los ejemplos de otros farmacos quimioterapeuticos que pueden utilizarse en combinacion con inhibidores de Btk quimiosensibilizadores se incluyen inhibidores de topoisomerasa (camptotecina o topotecan), inhibidores de topoisomerasa II (por ejemplo daunomicina y etoposido), agentes alquilantes (por ejemplo ciclofosfamida, melfalan y BCNU), agentes dirigidos a la tubulina (por ejemplo taxol y vinblastina) y agentes biologicos (por ejemplo anticuerpos tales como anticuerpo anti-CD20, IDEC 8, inmunotoxinas y citoquinas).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

La actividad de Btk tambien se ha asociado a algunas leucemias que expresan el gen de fusion bcr-abl resultante de la traslocacion de partes de los cromosomas 9 y 22. Esta anormalidad se observa comunmente en la leucemia mielogena cronica. Btk se fosforilada constitutivamente por la quinasa bcr-abl, que inicia senales de supervivencia posteriores que evitan la apoptosis en celulas bcr-abl (N. Feldhahn et al. J. Exp. Med. 201(11):1837-1852, 2005).

Metodos de tratamiento

La solicitud proporciona un compuesto de formula I para la utilizacion en un metodo de tratamiento de una condicion inflamatoria, que comprende administrar en el paciente que lo requiera, una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto de formula I.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I para la utilizacion en un metodo de tratamiento de una condicion inflamatoria y/o autoinmunologica que comprende administrar en el paciente que lo requiera, una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto inhibidor de Btk de formula I.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I para la utilizacion en un metodo de tratamiento de la artritis que comprende administrar en el paciente que lo requiera, una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto inhibidor de Btk de formula I.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I para la utilizacion en un metodo de tratamiento del asma que comprende administrar en el paciente que lo requiera, una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto inhibidor de Btk de formula I.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I para la utilizacion en un metodo de tratamiento de la proliferacion de celulas B, que comprende administrar en el paciente que lo requiera, una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto inhibidor de Btk de formula I.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I para la utilizacion en un metodo para la inhibicion de la actividad de Btk, que comprende administrar el compuesto inhibidor de Btk de formula I, en el que el compuesto inhibidor de Btk muestra una IC50 de 50 micromolar o inferior en un ensayo bioqmmico in vitro de la actividad de Btk.

En una variacion del metodo anteriormente indicado, el compuesto inhibidor de Btk muestra una IC50 de 100 nanomolar o inferior en un ensayo bioqmmico in vitro de actividad de Btk.

En otra variacion del metodo anteriormente indicado, el compuesto muestra una IC50 de 10 nanomolar o inferior en un ensayo bioqmmico in vitro de actividad de Btk.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I para la utilizacion en un metodo de tratamiento de la artritis, que comprende administrar en el paciente que lo requiera, una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto antiinflamatorio en combinacion con el compuesto inhibidor de Btk de formula I.

La solicitud proporciona un compuesto de formula I para la utilizacion en un metodo de tratamiento de un linfoma o de una leucemia BCR-ABL1 + mediante la administracion en el paciente que lo requiera de una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto inhibidor de Btk de formula I.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Ejemplos

Abreviaturas generales

Entre las abreviaturas utilizadas comunmente se incluyen: acetilo (Ac), azo-6/s-isobutirilnitrilo (AIBN), atmosferas (Atm), 9-borabiciclo[3.3.1]nonano (9-BBN o BBN), 2,2'-bis(difenilfosfino)-1,1'-binaftilo (BINAP), ferc-butoxicarbonilo (Boc), pirocarbonato de di-ferc-butilo o anlffdrido de boc (BOC2O), bencilo (Bn), butilo (Bu), numero de registro de Chemical Abstracts (CASRN), benciloxicarbonilo (CBZ o Z), carbonil-diimidazol (CDI), 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano (DABCO), trifluoruro de dietilamino-azufre (DAST), dibencyliden-acetona (dba), 1,5-diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno (DBN), 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DbU), N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC), 1,2-dicloroetano (DCE), diclorometano (DCM), 2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona (DDQ), azodicarboxilato de dietilo (DEAD), di-/so- propilazodicarboxilato (DIAD), hidruro de di-/so-butilaluminio (DIBAL o DIBAL-H), di-iso-propiletilamina (DIPEA), N,N- dimetil acetamida (DMA), 4-N,N-dimetilaminopiridina (DMAP), N,N-dimetilformamida (DMF), dimetilsulfoxido (DMSO), 1,1'-6/s-(difenilfosfino)etano (dppe), 1,1'-6/s-(difenilfosfino)ferroceno (dppf), hidrocloruro de 1-(3- dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDCI), 2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-dihidroquinolina (EEDQ), etilo (Et), acetato de etilo (EtOAc), etanol (EtOH), etil-ester de acido 2-etoxi-2H-quinolm-1-carbox^lico (EEDQ), eter diefflico (Et2O), eter etil-isoprc^lico (EtOiPr), hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N'N'-tetrametiluronio acido acetico (HATU), acido acetico (HOAc), 1-N-hidroxibenzotriazol (HOBt), cromatograffa Kquida de alto rendimiento (HPLC), /so-propanol (IPA), cloruro de isopropilmagnesio (iPrMgCl), hexametildisilazano (HMDS), cromatograffa Kquida- espectrometffa de masas (CL-EM), hexametildisilazano de litio (LiHMDS), acido metacloroperoxibenzoico (m-CpBA), metanol (MeOH), punto de fusion (pf), MeSO2- (mesilo o Ms), metilo (Me), acetonitrilo (MeCN), acido m- cloroperbenzoico (MCPBA), espectro de masas (em), eter metil f-bufflico (MTBE), metiltetrahidrofurano (MeTHF), N- bromosuccinimida (NBS), n-butil-litio (nBuLi), N-carboxianlffdrido (NCA), N-clorosuccinimida (NCS), N-metilmorfolina (NMM), N-metilpirrolidona (NMP), clorocromato de piridinio (PCC), dicloro-((bis-difenilfosfino)ferrocenil) paladio(II) (Pd(dppf)Ch), acetato de paladio(II) (Pd(OAc)2), tris(dibenciliden-acetona)dipaladio (0) (Pd2(dba)3), dicromato de piridinio (PDC), fenilo (Ph), propilo (Pr), /so-propilo (/-Pr), libras por pulgada cuadrada (psi), piridina (pyr), 1,2,3,4,5- pentafenil-1'-(di-terc-butilfosfino)ferroceno (Q-Phos), temperatura de laboratorio (temperatura ambiente, ta o TA), sec-butil-litio (sBuLi), ferc-butildimetilsililo o f-BuMe2Si (TBDMS), fluoruro de tetra-n-butilamonio (TBAF), trietilamina (TEA o Et3N), 2,2,6,6-tetrametilpiperidm-1-oxilo (TEMPO), trimetilsililetoximetilo (SEM), triflato o CF3sO2-(Tf), acido trifluoroacetico (TFA), 1,1'-6/s-2,2,6,6-tetrametilheptano-2,6-diona (TMHD), tetrafluoroborato de O-benzotriazol-1-il- N,N,N',N'-tetrametiluronio (TBTU), cromatograffa de capa fina (CCF), tetrahidrofurano (THF), trimetilsililo o Me3Si (TMS), monohidrato de acido p-toluenosulfonico (TsOH o pTsOH), 4-Me-C6H4SO2- o tosilo (Ts), y N-uretano-N- carboxianlffdrido (UNCA). La nomenclatura convencional, incluyendo los prefijos normal (n), /so (/-), secundaria (sec), ferc/ar/a (ferc-) y neo presenta sus significados habituales al utilizarlos con una fraccion alquilo (J. Rigaudy y D. P. Klesney, Nomenclature in Organic Chemistry, IUPAC 1979, Pergamon Press, Oxford).

Condiciones generales

Los compuestos de la presente invencion pueden prepararse partiendo de materias primas disponibles comercialmente, mediante la utilizacion de tecnicas y procedimientos sinteticos generales conocidos por el experto en la materia. Posteriormente se proporcionan esquemas de reaccion adecuados para preparar dichos compuestos. Se proporcionan ejemplos adicionales en los ejemplos espedficos.

Abreviaturas especificas

boc ferc-butoxicarbonilo

CH2Cl2 diclorometano

Cs2CO3 carbonato de cesio

DCM diclorometano

DMF N,N-dimetilformamida

DMSO dimetilsulfoxido

EtOAc acetato de etilo

HATU hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio

base de Hunig N,N-diisopropiletilamina HCl acido clorhfdrico

CL-EM cromatograffa ffquida-espectrometffa de masas

HPLC cromatograffa ffquida de alto rendimiento

MeOH alcohol mefflico

MgSO4 Sulfato de magnesio

nBuLi n-butil-litio

NaCl cloruro sodico

Na2CO3 carbonato sodico

NaOMe metoxido sodico

Na2SO4 sulfato sodico

NH4OH hidroxido amonico

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

NMP

RMN

Pd(OAc)2

TFA

THF

CCF

TMSCI

1 -metil-2-pirrolidinona resonancia magnetica nuclear acetato de paladio (II) acido trifluoroacetico tetrahidrofurano cromatografia de capa fina cloruro de trimetilsililo

Datos experimentales generales

Los reactivos se obtuvieron de Aldrich, Oakwood, Matrix, o de otros proveedores, y se utilizaron sin purificacion adicional. Las reacciones utilizando la irradiation de microondas para el calentamiento se llevaron a cabo utilizando un Personal Chemistry Emrys Optimizer System o un CEM Discovery System. La purificacion a escala de multi- miligramo a multi-gramo se llevo a cabo mediante metodos conocidos por el experto en la materia, tales como la elucion de una columna flash de gel de sflice; las preparaciones en columna flash preparativa tambien se llevaron a cabo en algunos casos mediante la utilization de columnas de gel de sflice multigramo preempaquetadas desechables (RediSep) eluidas con un sistema CombiFlash. Biotage™ e ISCO™ tambien son instrumentos de columna flash que pueden utilizarse en la presente invention para la purificacion de intermediarios.

Para el proposito de evaluar la identidad y pureza de compuestos, se registraron los espectros de CL/EM (cromatografia flquida/espectroscopia de masas) utilizando el sistema siguiente. Para la medicion de los espectros de masas, el sistema consisfia de un espectrometro Micromass Platform II: ionization por EP en modo positivo (intervalo de masas: 150 -1200). La separation cromatografica simultanea se llevo a cabo con el sistema de HPLC siguiente: ES Industries Chromegabond WR C-18 3u 120 A (3,2 x 30mm) cartucho de columna, fase movil A: agua (TFA al 0,02%) y fase B: acetonitrilo (TFA al 0,02%); gradiente de 10% de B a 90% de B en 3 minutos; tiempo de equilibrado: 1 minuto; caudal: 2 ml/minuto.

Muchos compuestos de formula 1 se purificaron tambien mediante HPLC de fase inversa utilizando metodos bien conocidos por el experto en la materia. En algunos casos, se llevo a cabo la purificacion en HPLC preparativa utilizando un espec. de masas PE Sciex 150 EX controlando un colector Gilson 215 incorporado a un sistema HPLC preparativo Shimadzu y un autoinyector Leap. Los compuestos se recolectaron del flujo de elucion mediante detection de CL/EM en el modo de detection de iones positivos. La elucion de los compuestos de las columnas C- 18 (2,0 x 10 cm eluyendo a 20 ml/min.) se llevo a cabo utilizando un modo apropiado de gradation lineal durante 10 minutos de solvente (A) TFA al 0,05%/H2O y solvente (B) TFA al 0,035%/acetonitrilo. Para la inyeccion en sistemas de HPLC, las muestras en bruto se disolvieron en mezclas de metanol, acetonitrilo y DMSO.

Los compuestos se caracterizaron mediante RMN-1H utilizando un espectrometro de RMN de 400 MHz Bruker.

Los compuestos de la presente invencion pueden sintetizarse segun tecnicas conocidas. Los ejemplos y referencias siguientes se proporcionan para ayudar a la comprension de la presente invencion. Sin embargo, los ejemplos no pretender limitar la invencion, el alcance de la cual es proporcionado en las reivindicaciones adjuntas. Los nombres de los productos finales en los ejemplos se generaron utilizando Isis AutoNom 2000.

Ejemplos preparativos

Eiemplo 1

terc-butil-ester de acido {(R)-1-[4-carbamoil-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-2-il1-piperidm-3-il)-carbamico

imagen23

5

10

15

20

25

30

35

40

45

imagen24

A un matraz de fondo redondo de 500 ml se anadio terc-butil-ester de acido (R)-piperidm-3-il-carbamico (10,3 g, 51,6 mmoles), carbonato de cesio (33,6 g, 103 mmoles), 2-(diciclohexilfosfino)-3,6-dimetoxi-2',4',6'-triisopropil-1,1'-bifenilo (BrettPhos, CAS numero 1070663-78-3) (369 mg, 688 ^moles) y 2-bromotiazol-4-carbonitrilo (6,5 g, 34,4 mmoles) seguido de terc-butanol (225 ml). La mezcla se desgasifico bajo vado (~50 mmHg) sonicando simultaneamente y despues el matraz se cargo con argon. Se repitio la desgasificacion dos veces. Se anadio tris-(dibenciliden- acetona)dipaladio (0) (CAS numero 51364-51-3) (315 mg, 344 ^moles) y el matraz se evacuo y se recargo con argon. Se repitio la operation anterior dos veces. El matraz de reaction se transfirio a un sistema de calefaccion de bloque de aluminio y se calento bajo reflujo de argon durante 5 horas. La mezcla de reaccion se enfrio hasta la temperatura ambiente y se vertio en agua (1 l), se extrajo con acetato de etilo (3x200 ml), los extractos organicos agrupados se lavaron con solution hipersalina (2x200 ml), se secaron sobre sulfato sodico, se filtraron y se concentraron al vado. El residuo se purifico mediante cromatograffa utilizando un gradiente de columna de sflice de 330 g, eluyendo de 10% hasta 40% de acetato de etilo en hexanos a un caudal de 100 ml/min. Se agruparon las fracciones que conteman el producto y se concentraron al vado, proporcionando terc-butil-ester de acido [(R)-1-(4- ciano-tiazol-2-il)-piperidm-3-il]-carbamico en forma de un solido blanquecino (8,75 g, 78%).

CL/EM: m/z calculado para C14H20N4O2S ([M+H-Boc]+): 209,3. Observado: 209,1 (ionization mediante electropulverizacion en modo positivo).

Etapa 2: preparacion de terc-butil-ester de acido [(R)-1-(5-bromo-4-ciano-tiazol-2-il)-piperidin-3-il1-carbamico

imagen25

A una solucion de terc-butil-ester de acido [(R)-1-(4-ciano-tiazol-2-il)-piperidm-3-il]-carbamico (13,0 g, 42,2 mmoles) en N,N-dimetilformamida (250 ml) se anadio N-bromosuccinimida (8,25 g, 46 mmoles) y la mezcla se agito bajo argon a temperatura ambiente durante 30 minutos. El analisis mediante cromatograffa de capa fina (fase estacionaria de sflice eluida con acetato de etilo al 25% v/v en hexanos) indico la conversion limpia de terc-butil-ester de acido [(R)-1-(4-ciano-tiazol-2-il)-piperidm-3-il]-carbamico en un compuesto ligeramente menos polar. La mezcla de reaccion se vertio en agua (1 l) y se extrajo con acetato de etilo (3x250 ml), los extractos organicos agrupados se lavaron con solucion hipersalina (2x200 ml), se secaron sobre sulfato sodico, se filtraron y se concentraron al vado, proporcionando un solido blanquecino. El producto en bruto se trituro con eter dietflico/eter de petroleo 1:1 v/v (volumen total: 300 ml). Se obtuvo terc-butil-ester de acido [(R)-1-(5-bromo-4-ciano-tiazol-2-il)-piperidm-3-il]- carbamico en forma de un solido incoloro mediante filtration, lavando con eter dietflico/eter de petroleo 1:2 v7v y secando mediante el paso de aire (14,33 g, 88%). Se obtuvo una cantidad adicional de terc-butil-ester de acido [(R)- 1-(5-bromo-4-ciano-tiazol-2-il)-piperidm-3-il]-carbamico mediante purification del residuo obtenido a partir de la concentration de los licores madre mediante cromatograffa utilizando un gradiente de columna de gel de sflice de 5% hasta 40% v/v de acetato de etilo en hexanos. Las fracciones que conteman producto se agruparon y se concentraron al vado, obteniendo terc-butil-ester de acido [(R)-1-(5-bromo-4-ciano-tiazol-2-il)-piperidm-3-il]- carbamico adicional en forma de un solido incoloro (1,18 g, 7%).

CL/EM: m/z calculado para C14H1gBrN4O2S ([M+H-Boc]+): 288,2. Observado: 287 y 289 (proportion 1:1, consistente con la presencia de 1 atomo de bromo) (ionizacion mediante electropulverizacion en modo positivo).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

imagen26

Un recipiente de presion de tapa enroscable se evacuo y se cargo con argon. Al recipiente de reaccion se anadio terc-butil-ester de acido [(R)-1-(5-bromo-4-ciano-tiazol-2-il)-piperidm-3-il]-carbamico (1,00 g, 2,58 mmoles), 2- aminopiridina (384 mg, 3,87 mmoles), 4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilxanteno (Xantfos, CAS numero 161265-03-8) (462 mmoles, 775 mmoles) y fosfato potasico tribasico (1,64 g, 7,75 mmoles) seguido de p-dioxano (20 ml). El recipiente de reaccion se desgasifico mediante sonicacion bajo vado (~50 mmHg) y el recipiente seguidamente se recargo con argon. Se repitio la desgasificacion dos veces mas. Se anadio tris-(dibenciliden-acetona)dipaladio (0) (CAS numero 51364-51-3) (241 mg, 258 ^moles) y el matraz se evacuo y se recargo con argon. Se repitio la operacion anterior dos veces. Se sello el recipiente y se introdujo en un bano de aceite precalentado a 110°C durante 16 horas. La mezcla de reaccion se enfrio hasta la temperatura ambiente y se vertio en agua (200 ml), se extrajo con acetato de etilo/tetrahidrofurano 1:1 v/v (3x100 ml), los extractos organicos agrupados se lavaron con solucion hipersalina (2x75 ml), se secaron sobre sulfato sodico, se filtraron y se concentraron al vado. El residuo se purifico mediante cromatografia utilizando un gradiente de silice eluido con 0% a 10% v/v de metanol en diclorometano. Las fracciones que conteman producto se agruparon y se concentraron al vado, proporcionando el producto parcialmente purificado en forma de un solido rojo/marron (429 mg). El material parcialmente purificado se introdujo en isopropanol/acetato de etilo 2:1 v/v (volumen total: 150 ml) y se anadio carbono activado. Tras dejar en reposo a temperatura ambiente durante 10 minutos, la mezcla se filtro a traves de medio filtrante de tierra diatomacea y el filtrado se concentro al vado, proporcionando terc-butil-ester de acido {(R)-1-[4-ciano-5-(piridm-2- ilamino)-tiazol-2-il]-piperidm-3-il}-carbamico en forma de un solido marron palido/amarillo (0,38 g, 35%).

CL/EM: m/z calculado para C19H24N6O2S ([M+H]+): 401,5. Observado: 401,2 (ionizacion mediante

electropulverizacion en modo positivo).

Etapa 4: preparacion de terc-butil-ester de acido {(R)-1-[4-carbamoil-5-(piridin-2-ilamino)-tiazol-2-il1-piperidin-3-il}- carbamico

Una solucion de terc-butil-ester de acido {(R)-1-[4-ciano-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-2-il]-piperidm-3-il}-carbamico (455 mg, 1,14 mmoles) en tetrahidrofurano/agua 10:1 v/v (volumen total: 16,5 ml) se desgasifico mediante burbujeo en argon durante 10 minutos bajo agitacion. Se anadio hidruro(acido dimetilfosfinoso-kP)[hidrogeno bis(dimetilfosfino- kP]platino (II) (CAS numero 173416-05-2) (78 mg, 183 ^moles) y la mezcla se calento a 150°C con microondas durante 45 minutos. La mezcla de reaccion se enfrio hasta la temperatura ambiente y se vertio en agua (150 ml) y se extrajo con tetrahidrofurano/acetato de etilo 1:1 v/v (4x50 ml), los extractos organicos agrupados se lavaron con solucion hipersalina (2x40 ml), se secaron sobre sulfato sodico, se filtraron y se concentraron al vado hasta producir un solido amarillo. El producto en bruto se purifico mediante cromatografia utilizando un gradiente de sflice eluido con 30% a 70% v/v de acetato de etilo en hexanos. Las fracciones que conteman producto se agruparon y se concentraron al vado, obteniendo terc-butil-ester de acido {(R)-1-[4-carbamoil-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-2-il]- piperidm-3-il}-carbamico en forma de un solido blanquecino (362 mg, 76%). CL/EM: m/z calculado para C19H26N6O3S ([M+H]-): 417,5. Observado: 417,4 (ionizacion mediante electropulverizacion en modo negativo).

Ejemplo 2

{(R)-1-[4-carbamoil-5-(piridin-2-ilamino)-tiazol-2-in-piperidin-3-il}-amida de acido 1,3-dihidro-isoindol-2-carboxilico

imagen27

5

10

15

20

25

30

imagen28

A una solution de terc-butil-ester de acido {(R)-1-[4-ciano-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-2-il]-piperidm-3-il}-carbamico (preparada tal como se indica en el Ejemplo 1, etapa 3) (20,2 mg, 50,4 pmoles) en diclorometano (0,5 ml) se anadio acido trifluoroacetico (1 ml, 13 mmoles) y la mezcla se agito bajo argon a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla de reaction se concentro al vado y el 2-((R)-3-amino-piperidm-1-il)-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-4- carbonitrilo en bruto se llevo a la etapa siguiente en la smtesis sin purification adicional. CL/EM: m/z calculado para C14H16N6S ([M+H]+): 301,4. Observado: 301,2 (ionization mediante electropulverizacion en modo positivo).

Etapa 2: preparacion de pentafluorofenil-ester de acido {(R)-1-[4-ciano-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-2-il]-piperidm-3-il}- carbamico

imagen29

A una solucion de 2-((R)-3-amino-piperidm-1-il)-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-4-carbonitrilo en bruto (-15 mg, -50 pmoles) en tetrahidrofurano (1 ml) a 0°C bajo argon se anadio diisopropiletilamina (18 pl, 100 pmoles) seguido de dipentafluorofenil-ester de acido carbonico (22 mg, 55 pmoles). Se dejo que la mezcla de reaccion se calentase lentamente hasta la temperatura ambiente y despues se agito durante 1 hora adicional. Se analizo una alicuota mediante CL-EM para garantizar que se completaba la reaccion antes de someter la mezcla de reaccion a la etapa siguiente en la secuencia sintetica. CL/EM: m/z calculado para C21H15F5N6O2S ([M+H]+): 511,5. Observado: 511,2 (ionizacion mediante electropulverizacion en modo positivo).

Etapa 3: preparacion de {(R)-1-r4-ciano-5-(piridin-2-ilamino)-tiazol-2-il1-piperidin-3-il)-amida de acido 1,3-dihidro- isoindol-2-carboxilico

imagen30

Una solucion de pentafluorofenil-ester de acido {(R)-1-[4-ciano-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-2-il]-piperidm-3-il}- carbamico en bruto (-50 pmoles) en tetrahidrofurano (1 ml) se enfrio a 0°C bajo una atmosfera de argon e

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

isoindolina (12,6 mg, 106 ^moles) y diisopropiletilamina (20 ^l, 115 ^moles). Se agito la mezcla de reaccion a 0°C durante 1 hora y despues se calento hasta la temperatura ambiente y se agito durante 1 hora adicional. La reaccion se desactivo mediante la adicion de solucion acuosa saturada de cloruro amonico (2 ml), se vertio en agua (10 ml) y se extrajo con acetato de etilo (4x5 ml). Los extractos organicos agrupados se lavaron con solucion hipersalina (2x5 ml), se secaron sobre sulfato sodico, se filtraron y se concentraron al vado. El residuo se purifico mediante cromatografia de fase inversa utilizando un gradiente de columna C-18 de 12 g eluyendo desde 10% de acetonitrilo en agua hasta 100% de acetonitrilo. Las fracciones que conternan producto se agruparon y se concentraron al vado, produciendo un solido amarillo. El solido amarillo se introdujo en diclorometano, se seco sobre sulfato sodico, se filtro y se concentro al vado, proporcionando {(R)-1-[4-ciano-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-2-il]-piperidm-3-il}-amida de acido 1,3-dihidro-isoindol-2-carboxflico en forma de un aceite viscoso amarillo (11,3 mg, 50%).

CL/EM: m/z calculado para C23H23N7OS ([M+H]+): 446,6. Observado: 446,3 (ionizacion mediante electropulverizacion en modo positivo).

Etapa 4: preparacion de {(R)-1-[4-carbamoil-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-2-il]-piperidm-3-il}-amida de acido 1,3-dihidro- isoindol-2-carboxilico

A una solucion de {(R)-1-[4-ciano-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-2-il]-piperidm-3-il}-amida de acido 1,3-dihidro-isoindol-2- carboxflico (11,3 mg, 25,4 ^moles) en tetrahidrofurano/agua 10:1 v/v (volumen total: 2,75 ml) se anadio hidruro(acido dimetilfosfinoso-kP)[hidrogeno bis(dimetilfosfino-kP]platino (II) (CAS numero 173416-05-2) (1,1 mg, 2,5 ^moles) y la mezcla se calento bajo reflujo de argon. Tras 8 horas, la CL/EM indico una conversion de aproximadamente -30% en un unico producto principal que mostraba el ion molecular del producto esperado. La mezcla de reaccion se transfirio a un tubo resellable, se anadio una alicuota adicional de hidruro(acido dimetilfosfinoso-kP)[hidrogeno bis- (dimetilfosfino-kP)]platino (II) (1 mg, 2,3 ^moles) y el tubo se calento a 80°C durante la noche. La Cl-EM indico el producto esperado como componente principal presente en la mezcla de reaccion, aunque todavia se encontraba presente algo de material de partida. Se anadio una alicuota adicional de hidruro(acido dimetilfosfinoso-

kP)[hidrogeno bis-(dimetilfosfino-kP)]platino (II) (1 mg, 2,3 ^moles) y el recipiente de reaccion se calento a 100°C durante 3,5 horas. La mezcla de reaccion se enfrio hasta la temperatura ambiente y se concentro al vado. El residuo se purifico mediante cromatografia de fase inversa utilizando un gradiente de columna C-18 desde 10% de acetonitrilo en agua hasta 100% de acetonitrilo. Las fracciones que conternan producto se agruparon y se concentraron al vado, obteniendo {(R)-1-[4-carbamoil-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-2-il]-piperidm-3-il}-amida de acido 1,3-dihidroisoindol-2-carboxflico en forma de un solido amarillo. Se purifico adicionalmente mediante HPLC de fase inversa utilizando un gradiente en columna C-18 de 30% a 100% de acetonitrilo en agua para eliminar una impureza que migraba en un nivel proximo. Las fracciones que conternan producto se agruparon y se concentraron al vado y el residuo se liofilizo a partir de acetonitrilo/agua, obteniendo {(R)-1-[4-carbamoil-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-2-il]- piperidm-3-il}-amida de acido 1,3-dihidroisoindol-2-carboxflico en forma de un solido amarillo palido (2,1 mg, 18%).

CL/EM: m/z calculado para C23H25N7O2S ([M+H]+): 464,6. Observado: 464,3 (ionizacion mediante

electropulverizacion en modo positivo).

Ejemplo 3

(R)-2-(3-(5-cloroisoindolin-2-carboxamido)piperidin-1-il)-5-(piridin-2-ilamino)tiazol-4-carboxamida

imagen31

Se preparo mediante la misma ruta sintetica indicada en el Ejemplo 2, excepto en que (i) en la etapa 3, se utilizo hidrobromuro de 5-cloroisoindolina y 3 equivalentes de diisopropiletilamina en lugar de isoindolina y 1,1 equivalentes de diisopropiletilamina, e (ii) en la etapa 4, se llevo a cabo la reaccion con 0,2 equivalentes de hidruro(acido dimetilfosfinoso-kP)[hidrogeno bis(dimetilfosfino-kP)]platino (II) bajo calentamiento a 150°C con microondas en un tubo sellado. Tras la purificacion mediante HPLC de fase inversa y la liofilizacion de las fracciones que conternan el producto, este se obtuvo en forma de un solido amarillo palido.

CL/EM: m/z calculado para C23H24ClN7O2S ([M+H]+): 499,0. Observado: 498,3 y 500,3 (proporcion de intensidades 3:1, consistente con la presencia de 1 atomo de cloro) (ionizacion mediante electropulverizacion en modo positivo).

5

10

15

20

25

30

35

40

Ejemplo 4

(R)-2-(3-(6-terc-butilnicotinamido)piperidm-1-il)-5-(piridm-2-ilamino)tiazol-4-carboxamida

imagen32

Etapa 1: preparacion de acido 6-terc-butilnicotinico

imagen33

A una suspension de acido nicotmico (2,00 g, 16,2 mmoles) en agua (250 ml) se anadio acido sulfurico concentrado (1 ml, 18,8 mmoles) y la mezcla se agito bajo nitrogeno para formar una solucion transparente. Se anadio acido pivalico (1,83 g, 17,9 mmoles) y se continuo la agitacion bajo nitrogeno a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se anadio nitrato de plata (125 mg, 0,74 mmoles) seguido de persulfato amonico (295 mg, 1,3 mmoles); el matraz se envolvio en hoja de aluminio para excluir la luz y la mezcla se calento a 90°C bajo nitrogeno. Tras 2 horas, la mezcla de reaccion se enfrio hasta la temperatura ambiente y la mezcla acuosa se concentro al vado formando un solido incoloro. Se trituro el solido con tetrahidrofurano y se filtro. Se retrituro el residuo solido con metanol y se filtro. Se agruparon ambos filtrados y se concentraron al vado. El producto en bruto se purifico mediante cromatografia de fase inversa utilizando un gradiente de columna C-18 de 85 g eluyendo desde 10% de acetonitrilo en agua hasta 100% de acetonitrilo. Las fracciones que conteman producto se agruparon y se concentraron al vado. El residuo se liofilizo a partir de agua, proporcionando acido 6-terc-butilnicotmico en forma de un solido incoloro (139 mg, 4%).

CL/EM: m/z calculado para C10H13NO2 ([M+H]+): 180,2. Observado: 180,1 (ionizacion mediante electropulverizacion en modo positivo).

Etapa 2: preparacion de amida de acido 2-((R)-3-amino-piperidin-1-il)-5-(piridin-2-ilamino)-tiazol-4-carboxilico

imagen34

A una suspension de terc-butil-ester de acido {1-[4-carbamoil-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-2-il]-piperidm-3-il}-carbamico (preparada tal como se indica en el Ejemplo 1) (359 mg, 0,86 mmoles) en diclorometano (10 ml) se anadio acido trifluoroacetico (10 ml, 130 mmoles), formando una solucion amarilla. La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 30 minutos y despues se evaporo a sequedad al vado. El residuo se introdujo en diclorometano (25 ml) y se lavo con solucion acuosa saturada de hidrogenocarbonato sodico (100 ml). Se separo la capa organica y la capa acuosa se extrajo con diclorometano (5x20 ml) hasta que ya no pudo extraerse mas color amarillo en la capa organica. Los extractos organicos agrupados se secaron sobre sulfato sodico, se filtraron y se concentraron al vado, proporcionando amida de acido 2-((R)-3-amino-piperidm-1-il)-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-4-carboxflico en forma de un solido amarillo (280 mg).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

CL/EM: m/z calculado para C14H18N6OS ([M+H]+): 319,4. Observado: 319,1 (ionizacion mediante electropulverizacion en modo positivo).

Etapa 3: preparacion de (R)-2-(3-(6-terc-butilnicotinamido)piperidm-1-il)-5-(piridm-2-ilamino)tiazol-4-carboxamida

A una solucion de acido 6-terc-butilnicotmico (23,5 mg, 131 pmoles) y amida de acido 2-((R)-3-amino-piperidm-1-il)- 5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-4-carboxflico (38 mg, 119 pmoles) en N,N-dimetilformamida (1 ml) se anadio diisopropiletilamina (35 pl, 200 pmoles) seguido de hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'- tetrametiluronio (61 mg, 161 pmoles). Tras agitar a temperatura ambiente durante la noche bajo una atmosfera de argon, la reaccion se desactivo mediante la adicion de solucion acuosa saturada de cloruro amonico (2 ml), la mezcla se vertio en agua (5 ml) y se extrajo con acetato de etilo (3x3 ml). Los extractos organicos agrupados se lavaron con solucion hipersalina (2x2 ml), se secaron sobre sulfato sodico, se filtraron y se concentraron al vado, formando un solido amarillo. El producto en bruto se purifico mediante cromatograffa utilizando un gradiente de columna C-18 de 13 g eluyendo desde 10% de acetonitrilo en agua hasta 100% de acetonitrilo. Las fracciones que conteman producto se agruparon y se concentraron al vado y el residuo se liofilizo a partir de acetonitrilo/agua, obteniendo (R)-2-(3-(6-terc-butilnicotinamido)piperidm-1-il)-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-4-carboxamida en forma de un solido amarillo palido (37,8 mg, 66%).

CL/EM: m/z calculado para C24H29N7O2S ([M+H]+): 480,6. Observado: 480,3 (ionizacion mediante electropulverizacion en modo positivo).

Ejemplo 5

(R)-2-(3-(2-fenilacetamido)piperidm-1-il)-5-(piridm-2-ilamino)tiazol-4-carboxamida

imagen35

Se preparo mediante la ruta sintetica indicada en el Ejemplo 4, excepto en que se utilizo acido 2-fenilacetico (17,9 mg, 131 pmoles) en lugar de acido 6-terc-butilnicotmico. Se obtuvo (R)-2-(3-(2-fenilacetamido)piperidm-1-il)-5- (piridm-2-ilamino)tiazol-4-carboxamida en forma de un solido amarillo palido (59%).

CL/EM: m/z calculado para C22H24N6O2S ([M+H]+): 437,5. Observado: 437,3 (ionizacion mediante

electropulverizacion en modo positivo).

Ejemplo 6

(R)-5-(piridin-2-ilamino)-2-(3-(2-m-tolilacetamido)piperidin-1-il)tiazol-4-carboxamida

imagen36

Se preparo mediante la ruta sintetica indicada en el Ejemplo 4, excepto en que se utilizo acido 2-m-tolil-acetico (19,7 mg, 131 pmoles) en lugar de acido 6-terc-butilnicotmico. Se obtuvo (R)-5-(piridm-2-ilamino)-2-(3-(2-m- tolilacetamido)piperidm-1-il)tiazol-4-carboxamida en forma de un solido amarillo palido (49%).

CL/EM: m/z calculado para C23H26N6O2S ([M+H]+): 451.6. Observado: 451,3 (ionizacion mediante

electropulverizacion en modo positivo).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Ejemplo 7

(R)-2-(3-(4-terc-butilbenzamido)piperidm-1-il)-5-(piridm-2-ilamino)tiazol-4-carboxamida

imagen37

Se preparo mediante la ruta sintetica indicada en el Ejemplo 4, excepto en que se utilizo acido 4-terc-butilbenzoico (23,4 mg, 131 ^moles) en lugar de acido 6-terc-butilnicotmico. Se obtuvo (R)-2-(3-(4-terc-butilbenzamido)piperidm-1- il)-5-(piridm-2-ilamino)tiazol-4-carboxamida en forma de un solido amarillo palido (68%).

CL/EM: m/z calculado para C25H30N6O2S ([M+H]+): 479.6. Observado: 479,3 (ionizacion mediante electropulverizacion en modo positivo).

Ejemplo 8

(R)-2-(3-(2-metilsulfonamido)piperidm-1-il)-5-(piridm-2-ilamino)tiazol-4-carboxamida

imagen38

A una suspension de amida de acido 2-((R)-3-amino-piperidm-1-il)-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-4-carboxflico (preparada tal como se indica en el Ejemplo 4) (5,6 mg, 171 ^moles) en tetrahidrofurano (1 ml) se anadio N,N- dimetilformamida (0,5 ml), formando una solucion transparente. Se anadio diisopropiletilamina (59,9 ^l, 343 ^moles) seguido de cloruro de metanosulfonilo (20 ^l, 257 ^moles) y la mezcla se dejo bajo agitacion durante la noche a temperatura ambiente bajo argon. La mezcla de reaccion se desactivo mediante la adicion de solucion acuosa saturada de cloruro amonico (2 ml), se vertio en agua (5 ml) y se extrajo con acetato de etilo (5x2 ml), los extractos organicos agrupados se lavaron con solucion hipersalina (2x2 ml), se secaron sobre sulfato sodico, se filtraron y se concentraron al vado. El residuo se purifico mediante cromatografia de fase inversa utilizando un gradiente de columna C-18 eluyendo desde 10% de acetonitrilo en agua hasta 100% de acetonitrilo. Las fracciones que conteman producto se agruparon y se concentraron al vado. El residuo se liofilizo a partir de agua/etanol, proporcionando (R)- 2-(3-(metilsulfonamido)piperidm-1-il)-5-(piridm-2-ilamino)tiazol-4-carboxamida en forma de unos polvos liofilizados blanquecinos (41 mg, 60%).

CL/EM: m/z calculado para C15H20NO3S2 ([M+H]+): 397.5. Observado: 397,2 (ionizacion mediante

electropulverizacion en modo positivo).

Ejemplo 9

(R)-2-(3-(fenilsulfonamido)piperidin-1-il)-5-(piridin-2-ilamino)tiazol-4-carboxamida

imagen39

Se preparo mediante la ruta sintetica indicada en el Ejemplo 8, excepto en que se utilizo cloruro de bencenosulfonilo (33 ^l, 257 ^moles) en lugar de cloruro de metanosulfonilo. Se obtuvo (R)-2-(3-(fenilsulfonamido)piperidm-1-il)-5- (piridm-2-ilamino)tiazol-4-carboxamida en forma de un solido amarillo palido (23%).

5

10

15

20

25

30

35

40

CL/EM: m/z calculado para C20H22N6O3S2 ([M+H]+): 459.6. Observado: 459,3 (ionizacion mediante electropulverizacion en modo positivo).

Ejemplo 10

(R)-2-(3-(1-metilsulfonamido)piperidm-1-il)-5-(piridm-2-ilamino)tiazol-4-carboxamida

imagen40

Se preparo mediante la ruta sintetica indicada en el Ejemplo 8, excepto en que se utilizo cloruro de propano-2- sulfonilo (30 ^l, 257 ^moles) en lugar de cloruro de metanosulfonilo. Se obtuvo (R)-2-(3-(1-

metiletilsulfonamido)piperidm-1-il)-5-(piridh-2-ilamino)tiazol-4-carboxamida en forma de un solido amarillo palido (4%).

CL/EM: m/z calculado para C17H24N6O3S2 ([M+H]+): 425.6. Observado: 425,3 (ionizacion mediante

electropulverizacion en modo positivo).

Ejemplo 11

(R)-2-(3-(2-(3-clorofenilamido)acetamido)piperidin-1-il)-5-(piridin-2-ilamino)tiazol-4-carboxamida

imagen41

Etapa 1: preparation de metil-ester de acido (3-cloro-fenilamino)-acetico

imagen42

Se disolvio bromoacetato de metilo (8,3 g, 54,3 mmoles), 3-cloroanilina (8,31 g, 65,1 mmoles) y diisopropiletilamina (7,01 g, 54,3 mmoles) en N,N-dimetilformamida (20 ml), proporcionando una solution amarillo palido, y la mezcla de reaction se calento a 60°C durante la noche. La mezcla de reaccion se enfrio hasta la temperatura ambiente, se diluyo con acetato de etilo y se lavo con solucion hipersalina. La capa organica se seco sobre sulfato sodico, se filtro y se concentro al vado, proporcionando metil-ester de acido (3-cloro-fenilamino)-acetico en forma de un solido que se lavo con hexanos, se filtro y se seco (10,2 g, 96%).

CL/EM: m/z calculado para CgH10ClNO2 ([M+H]+): 200.6. Observado: 200,0 (ionizacion mediante electropulverizacion en modo positivo).

Etapa 2: preparacion de acido (3-cloro-fenilamino)-acetico

imagen43

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Se agrupo metil-ester de acido (3-cloro-fenilamino)-acetico (4 g, 20,0 mmoles) e hidroxido sodico (4,00 g, 100 mmoles) en etanol (60,0 ml) y agua (10 ml), proporcionando una solution amarillo palido que se calento a 60°C durante 4 horas. La mezcla de reaction se enfrio hasta la temperatura ambiente, se diluyo con acetato de etilo y se lavo con acido hidroclorico acuoso 1 M. Se separo la capa organica, se seco sobre sulfato sodico anhidro, se filtro y se concentro al vatio, proporcionando acido (3-cloro-fenilamino)-acetico en forma de un solido marron (3,20 g, 86%).

CL/EM: m/z calculado para CsH8ClNO2 ([M+H]+): 186.0. Observado: 186,0 (ionization mediante electropulverizacion en modo positivo).

Etapa 3: preparation de (R)-2-(3-(2-(3-clorofenilamido)acetamido)piperidm-1-il)-5-(piridm-2-ilamino)tiazol-4-

carboxamida

Se preparo mediante la ruta sintetica indicada en el Ejemplo 4, excepto en que se utilizo acido (3-cloro-fenilamino)- acetico en lugar de acido 6-terc-butilnicotmico. Se obtuvo (R)-2-(3-(2-(3-clorofenilamido)acetamido)piperidm-1-il)-5- (piridm-2-ilamino)tiazol-4-carboxamida en forma de un solido amarillo palido (63%).

CL/EM: m/z calculado para C22H24ClNyO2S ([M+H]+): 487.0. Observado: 486,3 y 488,3 (proportion de intensidades 3:1, consistente con la presencia de 1 atomo de cloro) (ionizacion mediante electropulverizacion en modo positivo).

Ejemplo 12

(R)-2-(3-acetamidopiperidm-1-il)-5-(piridm-2-ilamino)tiazol-4-carboxamida

imagen44

Se preparo mediante la ruta sintetica indicada en el Ejemplo 4, excepto en que se utilizo acido acetico en lugar de acido 6-terc-butilnicotmico. Se obtuvo (R)-2-(3-acetamidopiperidm-1-il)-5-(piridm-2-ilamino)tiazol-4-carboxamida en forma de un solido amarillo palido (75%).

CL/EM: m/z calculado para C16H20N6O2S ([M+H]+): 361.4. Observado: 361,3 (ionizacion mediante electropulverizacion en modo positivo).

Ejemplo biologicos

Ensayo de inhibition de tirosina quinasa de Bruton (Btk)

El ensayo es una captura de producto fosforilado con 33P radioactivo mediante filtration. Las interacciones de Btk, sustrato de peptido SH2 biotinilado (homologia de Src) y ATP condujeron a la fosforilacion del sustrato peptidico. El producto biotinilado es ligado por las perlas de sefarosa con estreptavidina. Los productos marcados radioactivamente ligados son detectados con un contador de centelleo.

Las placas sometidas a ensayo de 96 pocillos de polipropileno (Greiner) y de 96 pocillos de filtracion de 1,2 ^m de PVDF hidrofflico (Millipore). Las concentraciones que se indican en la presente memoria son concentraciones de ensayo finales: compuestos 10 a 100 ^M en DMSO (Burdick y Jackson), enzima Btk 5 a 10 nM (etiquetada con His, de longitud completa), sustrato peptidico 30 ^M (Biotina-Aca-AAAEEIYGEI-NH2), ATP 100 ^M (Sigma), imidazol 8 mM (Sigma, pH 7,2), glicerol-2-fosfato 8 mM (Sigma), EGTA 200 ^M (Roche Diagnostics), MnCh 1 mM (Sigma), MgCl2 20 mM (Sigma), BSA 0,1 mg/ml (Sigma), DTT 2 mM (Sigma), 33P-ATP 1 ^Ci (Amersham), perlas de sefarosa- estreptavidina al 20% (Amersham), EDTA 50 mM (Gibco), NaCl 2 M (Gibco), NaCl 2 M con acido fosforico al 1% (Gibco), microscint-20 (Perkin Elmer).

Las determinaciones de IC50 se realizaron a partir de 10 puntos de datos de cada compuesto, utilizando datos producidos en un molde de ensayo de placa estandar de 96 pocillos. Se sometieron a ensayo un compuesto de control y siete inhibidores desconocidos en cada placa y se utilizo cada placa dos veces. Tipicamente los compuestos se diluyeron semilogaritmicamente partiendo de 100 ^M y finalizando en 3 nM. El compuesto de control era estaurosporina. Se obtuvo un conteo del nivel de fondo en ausencia de sustrato peptidico. Se determino la actividad total en presencia de sustrato peptidico. Se utilizo el protocolo siguiente para determinar la inhibicion de Btk.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

1) Preparacion de muestras: los compuestos de ensayo se diluyeron en incrementos semilogantmicos en tampon de ensayo (imidazol, glicerol-2-fosfato, EGTA, MnCl2, MgCl2, BSA).

2) Preparacion de perlas:

a. ) enjuagar las perlas mediante centrifugacion a 500 g

b. ) reconstituir las perlas con PBS y EDTA para producir una suspension de perlas al 20%

3) Preincubacion de la mezcla de reaccion sin sustrato (tampon de ensayo, DTT, aTp, ATP-33P) y mezcla con sustrato (tampon de ensayo, DTT, ATP, ATP-33P, sustrato peptfdico) a 30°C durante 15 min.

4) Para iniciar el ensayo, preincubar 10 ml de Btk en tampon enzimatico (imidazol, glicerol-2-fosfato, BSA) y 10 jl de compuestos de ensayo durante 10 min. a TA.

5) Adicion de 30 pl de mezcla de reaccion sin o con sustrato a Btk y compuestos.

6) Incubacion de 50 pl de mezcla de ensayo total durante 30 min. a 30°C.

7) Transferencia de 40 pl de ensayo a 150 pl de suspension de perlas en la placa de filtracion para detener la reaccion.

8) Lavado de placa de filtracion tras 30 min., con las etapas siguientes:

a. 3 x 250 jl de NaCl

b. 3 x 250 jl de NaCl que contema acido fosforico al 1%

c. 1 x 250 jl de H2O

9) Secado de la placa durante 1 h a 65°C o durante la noche a TA

10) Adicion de 50 pl de microscint-20 y recuento de cpm de 33P en el contador de centelleo.

Calculo del porcentaje de actividad a partir de los datos en bruto, en cpm:

porcentaje de actividad = (muestra-fondo) / (actividad total-fondo) x 100

Calculo de la IC50 a partir del porcentaje de actividad, utilizando un modelo sigmoidal de dosis-respuesta de un sitio

imagen45

x = conc. de comp., y = % de actividad, A = min, B = max, C = IC50, D = 1 (pendiente de Hill)

Ensayo de TR-FRET (FRET con resolucion temporal) de inhibicion de tirosina quinasa de Bruton (Btk)

Este ensayo de competicion de Btk mide la potencia del compuesto (IC50) con el estado inactivado de la tirosina quinasa de Bruton utilizando tecnologfa de FRET (transferencia de energfa por resonancia fluorescente/de Forster). Se incubo el complejo Btk-Eu sobre hielo durante una hora antes de utilizarlo a una concentracion inicial de 50 nM de Btk-BioeaseTm: Eu-estreptavidina 10 nM (Perkin-Elmer n° de catalogo AD0062). El tampon de ensayo consistfa de HEPES 20 mM (pH 7,15), DtT 0,1 mM, MgCh 10 mM, BSA 0,5 mg/ml con estabilizador de quinasa al 3% (Fremont Biosolutions, n° de catalogo STB-K02). Tras 1 h, la mezcla de reaccion anterior se diluyo 10 veces en tampon de ensayo, preparando Btk 5 nM: complejo de Eu-estreptavidina 1 nM (fluoroforo donante). A continuacion, se dispensaron 18 pl de una mezcla de Btk-Eu 0,11 nM y trazador quinasa 178 0,11 nM (Invitrogen, n° de catalogo PV5593) con Btk-Eu solo como control negativo, en placas de fondo plano de 384 pocillos (Greiner, 784076). Se prepararon los compuestos que debfan someterse a ensayo, como concentraciones 10x y se llevo a cabo la dilucion en serie en incrementos semilogantmicos en DMSO para generar curvas de 10 puntos. Para iniciar la reaccion de FRET, los compuestos preparados como solucion madre 10x en DMSO se anadieron a las placas y estas se incubaron durante 18 a 24 h a 14°C.

Tras la incubacion, se leyeron las placas en un lector de placas fluorescentes BMG Pherastar (o equivalente) y se utilizo para medir la energfa de emision a partir del fluoroforo donante europio (emision a 620 nm) y la FRET (emision a 665 nm). Los valores de los pocillos de control negativo se promediaron para obtener el mmimo medio. Los valores de los pocillos de control positivo "no inhibidor" se promediaron para obtener el maximo medio. Se calculo el porcentaje de FRET maxima utilizando la ecuacion siguiente:

% de FRETmax. = 100 x [(FSRcomp. - FSR min. media) / (FSRmax. media + FSRmin. media)]

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

en la que FSR = proporcion de senales de FRET. Se representaron en una graficas las curvas de FRET de % del max. en Activity Base (Excel) y se determinaron la IC50 (%), la pendiente de Hill, z' y CV(%). La IC50 media y la desviacion estandar se obtuvieron a partir de curvas por duplicado (curvas de inhibicion de singulete de dos diluciones independientes) utilizando Microsoft Excel.

Los datos de compuestos representativos para dicho ensayo se listan a continuacion, en la Tabla II.

TABLA II

Compuesto: IC50 de FRET (pmoles)

1: 0,2543

2: 7,7352

3: 1,2146

4: 1,7288

5: 6,2360

6: 7,5064

7: 0,4699

8: 5,0651

9: 1,6148

10: 5,8038

11: 5,3686

12: 6,0271

Inhibicion de la activacion de las celulas B en sangre completa medida a partir de la expresion de CD69

Un procedimiento para someter a ensayo la capacidad de los inhibidores de Btk de suprimir la activacion mediada por receptores de celulas B en la sangre humana es el siguiente:

Se obtuvo sangre humana completa (SHC) de voluntarios sanos, con las restricciones siguientes: no fumadores libres de farmacos durante 24 h. Se recolecto sangre mediante venipuncion en tubos Vacutainer anticoagulados con heparina sodica. Se diluyeron los compuestos de ensayo a diez veces la concentracion inicial deseada de farmaco en PBS (20x), seguido de diluciones en serie de tres veces en DMSO al 10% en PBS, produciendo una curva de dosis-respuesta de nueve puntos. Se anadieron 5,5 pl de cada dilucion de compuesto por duplicado a una placa de fondo V de 96 pocillos de 2 ml (Analytical Sales and Services, n° 59623-23); se anadieron 5,5 pl de DMSO al 10% en PBS a los pocillos de control y sin estimulo. Se anadio SHC (100 pl) a cada pocillo y tras mezclas las placas, se incubaron a 37°C, con 5% de CO2, 100% de humedad durante 30 minutos. Se anadio F(ab')2 de cabra anti-IgM humana (Southern Biotech, n° 2022-14) (10 pl de una solucion 500 pg/ml, concentracion final: 50 pg/ml) a cada pocillo (excepto los pocillos sin estfmulo) bajo agitacion y las placas se incubaron durante 20 horas adicionales.

Al final de la incubacion de 20 horas, las muestras de incubaron con anticuerpos marcados con sonda fluorescente (15 pl de anticuerpo de raton anti-CD20 humano PE, BD Pharmingen, n° 555623 y/o 20 pl de anticuerpo de raton anti-CD69 humano APC, BD Pharmingen, n° 555533) durante 30 minutos, a 37°C, con 5% de CO2 y 100% de humedad. Se incluyeron control inducido, no tenidos y tinciones unicas para los ajustes compensatorios y configuracion de voltaje inicial. A continuacion, se lisaron las muestras con 1 ml de tampon de lisis 1X Pharmingen (BD Pharmingen, n° 555899) y las placas se centrifugaron a 1.800 rpm durante 5 minutos. Se eliminaron los sobrenadantes mediante succion y los pellets restantes se lisaron nuevamente con otro 1 ml de tampon de lisis 1x Pharmingen y se peletizaron las placas tal como anteriormente. Se aspiraron los sobrenadantes y los pellets remanentes se lavaron en tampon FACS (PBS + FBS al 1%). Tras una centrifugacion final, se eliminaron los sobrenadantes y los pellets se resuspendieron en 180 pl de tampon FACS. Se transfirieron las muestras a una placa de 96 pocillos adecuada para analizarla en el sistema de 96 pocillos HTS en el citometro de flujo BD LSR II.

Utilizando longitudes de onda de excitacion y emision apropiadas para los fluoroforos utilizados, se adquirieron los datos y se obtuvieron los valores de porcentaje de celdas positivas se obtuvieron utilizando el software Cell Quest. Los resultados se analizaron inicialmente con el software de analisis de FACS (Flow Jo). La IC50 de los compuestos de ensayo se define como la concentracion que reduce en 50% el porcentaje de celulas positivas para cD69 que tambien son positivas para CD20 tras la estimulacion con anti-IgM (media de 8 pocillos de control, tras restar la media de 8 pocillos de fondo sin estfmulo). Los valores de IC50 se calcularon utilizando el software XLfit, version 3, ecuacion 201.

Inhibicion de la activacion de las celulas B: ensayo FLIPR de celulas B en celulas Ramos

Se demostro la inhibicion de la activacion de las celulas B por parte de compuestos de la presente invencion mediante la determinacion del efecto de los compuestos de ensayo sobre respuestas de celulas B estimuladas por anti-IgM.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

El ensayo FLIPR de celulas B es un metodo funcional celular para determinar el efecto de potenciales inhibidores del incremento del calcio intracelular a partir de la estimulacion por un anticuerpo anti-IgM. Se cultivaron celulas Ramos (lmea celular humana de linfoma de Burkitt, ATCC n° CRL-1596) en medio de crecimiento (descrito posteriormente). Un dfa antes del ensayo, las celulas Ramos se resuspendieron en medio de crecimiento fresco (el mismo que anteriormente) y se fijo una densidad de 0,5x106/ml en matraces de cultivo de tejidos. El dfa del ensayo se realizo un recuento de las celulas y se fijo una densidad de 1x106/ml en medio de crecimiento complementado con FLUO-3AM

I |jM (TefLabs, n° de cat. 0116, preparado en DMSO anhidro y acido pluronico al 10%) en un matraz de cultivo de tejidos, y se incubaron a 37°C (con 4% de CO2) durante una h. Para eliminar el pigmento extracelular, se recolectaron las celulas mediante centrifugacion (5 min., 1.000 rpm), se resuspendieron en tampon FLIPR (descrito posteriormente) a una densidad de 1x106 celulas/ml y despues se dispensaron en placas negras/transparentes de 96 pocillos recubiertos con poli-D-lisina (BD, n° de cat. 356692) a una densidad de 1x105 celulas en cada pocillo. Se anadieron los compuestos de ensayo a diversas concentraciones comprendidas entre 100 jM y 0,03 jM (7 concentraciones, mas informacion posteriormente) y se dejaron bajo incubacion con celulas durante 30 min. a TA. Se estimulo la senalizacion de Ca2+ de las celulas Ramos mediante la adicion de 10 jg/ml de anti-IgM (Southern Biotech, n° de cat. 2020-01) y se midio en un FLIPR (Molecular Devices, imagenes de captura de placas de 96 pocillos utilizando una camara CCD con un laser de argon a una longitud de onda de excitacion de 480 nm).

Medios/tampones:

Medio de crecimiento: medio RPMI 1640 con L-glutamina (Invitrogen, n° de cat. 61870-010), suero de feto bovino al 10% (FBS, Summit Biotechnology, n° de cat. FP-100-05), piruvato sodico 1 mM (Invitrogen, n° de cat. 11360-070).

Tampon de FLIPR: HBSS (Invitrogen, n° de cat. 141175-079), CaCh 2 mM (Sigma, n° de cat. C-4901), HEPES (Invitrogen, n° de cat. 15630-080), probenecid 2,5 mM (Sigma, n° de cat. P-8761), BSA al 0,1% (Sigma, n° de cat. A- 7906), glucose 11mM (Sigma, n° de cat. G-7528).

Datos de dilucion de compuestos:

Con el fin de conseguir la concentracion de ensayo final mas alta de 100 jM, se anadieron 24 jl de solucion madre de compuesto 10 mM (preparada en DMSO) directamente en 576 jl de tampon de FLIPR. Los compuestos de ensayo se diluyeron en tampon de FLIPR (utilizando un pipeteador robotizado Biomek 2000), resultando en el esquema de dilucion siguiente: vehmulo, 1,00x10-4 M, 1,00x10-5, 3,16x10-6, 1,00x10-6, 3,16x10, 1,00x10-7 y 3,16x 10'8.

Ensayo y analisis:

Los incrementos intracelulares de calcio se informaron utilizando un estadfstico max-min (restando la lmea base del pico causado por la adicion del anticuerpo estimulador utilizando software de exportacion de estadfsticas y de control de FLIPR de Molecular Devices). Se determino la IC50 utilizando un ajuste de curvas no lineal (software GraphPad Prism).

Artritis inducida por colageno en raton (AICm)

El dfa 0 se inyecto en la base de la cola o en varios puntos del lomo de los ratones una emulsion de colageno de tipo

II (i.d.) en adyuvante completo de Freund (ACF). Tras la inmunizacion de colageno, los animales desarrollan artritis tras aproximadamente 21 a 35 dfas. La aparicion de la artritis esta sincronizada (reforzada) por la administracion sistemica de colageno en adyuvante incompleto de Freund (AIF, i.d.) el dfa 21. Se examinaron los animales diariamente despues del dfa 20 para cualquier inicio de artritis leve (puntuacion de 1 o 2; ver la descripcion de la puntuacion posteriormente) que era la senal para realizar el refuerzo. Tras el refuerzo, se puntuaron los ratones y recibieron una dosis de agente terapeutico candidato durante el tiempo prescrito (tfpicamente 2 a 3 semanas) y la frecuencia de dosificacion, diaria (QD) o dos veces al dfa (BID).

Artritis inducida por colageno en rata (AICr)

El dfa 0 las ratas recibieron una inyeccion de una emulsion de colageno de tipo II bovino en adyuvante incompleto de Freund (AIF), inyectado intradermicamente (i.d.) en varios sitios del lomo. Se proporciono una inyeccion de refuerzo de emulsion de colageno aproximadamente el dfa 7 (i.d.) en la base de la cola o en sitios alternativos en el lomo. Se observo artritis generalmente 12 a 14 dfas despues de la inyeccion inicial de colageno. Los animales pueden evaluarse para el desarrollo de artritis tal como se indica posteriormente (evaluacion de artritis) desde el dfa 14 y posteriormente. Los animales recibieron dosis de agentes terapeuticos candidatos de manera preventiva desde el momento del reto secundario y durante el tiempo prescrito (tfpicamente 2 a 3 semanas) y frecuencia de dosificacion, diariamente (QD) o dos veces al dfa (BID).

5

10

15

20

25

30

35

40

Evaluacion de la artritis:

En ambos modelos, se cuantifico el desarrollo de inflamacion de las patas y articulaciones de las extremidades utilizando un sistema de puntuacion que inclma la evaluacion de las 4 patas siguiendo los criterios indicados a continuacion:

puntuacion: 1=hinchazon y/o enrojecimiento de pata o un dedo.

2=hinchazon en dos o mas articulaciones.

3=hinchazon gruesa de la pata con afectacion de mas de dos articulaciones.

4=artritis severa de la pata entera y dedos.

Las evaluaciones se realizaron el dfa 0 para la medicion de la lmea base y nuevamente empezando con los primeros signos de hinchazon durante hasta tres veces a la semana hasta el final del experimento. Se obtuvo el mdice artntico de cada raton mediante la adicion de las cuatro puntuacion de las patas individuales, proporcionando una puntuacion maxima de 16 a cada animal.

Modelo de asma in vivo en rata

Se sensibilizaron ratas Brown-Norway macho mediante inyeccion i.p. de 100 |jg de OA (ovoalbumina) en 0,2 ml de alumina una vez cada semana durante tres semanas (dfas 0, 7 y 14). El dfa 21 (una semana despues de la ultima sensibilizacion), las ratas recibieron una dosis q.d. de vetuculo o de formulacion de compuesto por via subcutanea 0,5 horas antes del reto de aerosol de OA (OA al 1% durante 45 minutos) y fueron sacrificadas 4 o 24 horas despues del reto. En el momento del sacrificio se recolectaron suero y plasma de todos los animales para analisis serologico y FC, respectivamente. Se inserto una canula traqueal y se lavaron los pulmones 3X con PBS. Se analizo el lfquido BAL para el numero total de leucocitos y recuento diferencial de leucocitos. Se determino el numero total de leucocitos en una alfcuota de las celulas (20 a 100 jl) con un contador Coulter. Para los recuentos diferenciales de leucocitos, se centrifugaron 50 a 200 jl de muestra en un Cytospin y el portaobjetos de tino con Diff-Quik. Se realizo un recuento de las proporciones de monocitos, eosinofilos, neutrofilos y linfocitos bajo microscopfa optica utilizando criterios morfologicos estandares y se expresaron como porcentajes. Los inhibidores representativos de Btk mostraban un recuento reducido del numero total de leucocitos en el BAL de ratas sensibilizadas y retadas con OA comparado con los niveles de control.

La invencion se ha descrito en cierto detalle a tftulo ilustrativo y ejemplar, con fines de claridad y comprension. Resultara evidente para el experto en la materia que los cambios y modificaciones que pueden llevarse a cabo dentro del alcance segun las reivindicaciones adjuntas. Por lo tanto, debe entenderse que la descripcion anteriormente proporcionada pretende ser ilustrativa y no limitativa. Por lo tanto, el alcance de la invencion debe determinarse no en referencia a la descripcion anteriormente proporcionada sino, por el contrario, debe determinarse en referencia a las reivindicaciones adjuntas a continuacion.

Claims

1.

Compuesto de formula I:

REIVINDICACIONES

imagen1

en la que:

A es alquilo Ci-6, fenilo, CH2R1, OR4

10

15

20

25

30

35

R1 es H,

imagen2

R2: es H o halo,

R3: es halo,

R4: CD (/) alquilo C1-6,

R5: es alquilo C1-6,

R6: es H o halo,

X es C(=O) o S(=O)2, y Y es CH o N,

o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo. Compuesto segun la reivindicacion 1, en el que X es C(=O). Compuesto segun la reivindicacion 1 o 2, en el que A es:

-ay'

Compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que R6 es H. Compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que R6 es Cl. Compuesto segun la reivindicacion 2, en el que A es metilo o OR4 y R4 es f-butilo. Compuesto segun la reivindicacion 2, en el que A es:

y R5 es f-butilo.

imagen3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

8. Compuesto segun la reivindicacion 7, en el que Y es N.

9. Compuesto segun la reivindicacion 7, en el que Y es CH.

10. Compuesto segun la reivindicacion 2, en el que A es:

imagen4

o

11. Compuesto segun la reivindicacion 10, en el que R es H.

12. Compuesto segun la reivindicacion 10, en el que R2 es t-butilo.

13. Compuesto segun la reivindicacion 1, en el que S(=O)2 y A es metilo, isopropilo o fenilo.

14. Compuesto segun la reivindicacion 2, en el que A es:

imagen5

15. Compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, seleccionado de entre el grupo que consiste de:

{(R)-1-[4-carbamoil-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-2-il]-piperidm-3-il}-amida de acido 1,3-dihidro-isoindol-2- carboxflico,

{(R)-1-[4-carbamoil-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-2-il]-piperidm-3-il}-amida de acido 5-cloro-1,3-dihidro- isoindol-2-carboxflico,

terc-butil-ester de acido {(R)-1-[4-carbamoil-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-2-il]-piperidm-3-il}-carbamico, 6-terc-butil-N-{(R)-1-[4-carbamoil-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-2-il]-piperidm-3-il}-nicotinamida, amida de acido 2-((R)-3-fenilacetilamino-piperidm-1-il)-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-4-carboxflico, amida de acido 5-(piridm-2-ilamino)-2-[(R)-3-(2-m-tolil-acetilamino)-piperidm-1-il]-tiazol-4-carboxflico, amida de acido 2-[(R)-3-(4-terc-butil-benzoilamino)-piperidm-1-il]-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-4-

carboxflico,

amida de acido 2-((R)-3-metanosulfonilamino-piperidm-1-il)-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-4-carboxflico, amida de acido 2-((R)-3-bencenosulfonilamino-piperidm-1-il)-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-4-carboxflico, amida de acido 2-[(R)-3-(propano-2-sulfonilamino)-piperidm-1-il]-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-4-carboxflico, amida de acido 2-{(R)-3-[2-(3-cloro-fenilamino)-acetilamino]-piperidm-1-il}-5-(piridm-2-ilamino)-tiazol-4- carboxflico y

16. Composicion farmaceutica que comprende el compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, mezclada con por lo menos un portador, excipiente o diluyente farmaceuticamente aceptable.

17. Utilizacion de un compuesto de formula I segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para la preparacion de un medicamento destinado al tratamiento de una condition inflamatoria y/o autoinmunologica.

18. Compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para la utilizacion en el tratamiento de una condicion inflamatoria y/o autoinmunologica.

19. Compuesto para la utilizacion segun la reivindicacion 18 para el tratamiento de la artritis reumatoide.

20. Compuesto para la utilizacion segun la reivindicacion 18 para el tratamiento del asma.