ES2606078T3

ES2606078T3 - Aislamiento de proteínas del plasma

Info

Publication number: ES2606078T3
Application number: ES10184552.7T
Authority: ES
Inventors: Allan Otto Fog Lihme
Original assignee: Therapure Biopharma Inc
Current assignee: Therapure Biopharma Inc
Priority date: 2004-06-07
Filing date: 2005-06-07
Publication date: 2017-03-17
Anticipated expiration: 2025-06-07
Also published as: CN102924565A; ES2454566T3; EP2277912A3; EP2277912B1; EP3127916A1; EP1765866B1; US20170282095A1; BRPI0511906A; PT1765866E; EP2277912A2; AU2009238344A1; EP1765866A2; WO2005121163A3; US9428545B2; WO2005121163A2; US9624260B2; CN1972961B; AU2009238344B2; US20070299251A1; US20160009757A1

Abstract

Un procedimiento para el aislamiento de una o más proteínas humanas a partir de una solución proteínica en donde la solución proteínica se obtiene a partir de plasma humano y contiene etanol, y una fracción de Cohn se selecciona del grupo que consiste en sobrenadante I, sobrenadante II + III, sobrenadante I + II + III, fracción resolubilizada II + III, fracción resolubilizada IV-1, y una combinación de los mismos, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: una fracción de Cohn a) ajustar el pH de la solución proteínica a un pH preestablecido; b) ajustar la fuerza iónica de la solución proteínica a una fuerza iónica preestablecida; c) aplicar dicha solución proteínica a una columna de adsorción de lecho expandido que comprende partículas adsorbentes de alta densidad que tienen una densidad de 1,5 g/ml a 15 g/ml, y en donde el 85% en volumen de las partículas adsorbentes de alta densidad tienen un diámetro de partícula en el intervalo de 10 a 150 μm; d) lavar la columna con un tampón de lavado para retirar por lavado el material no unido; e) lavar la columna con un tampón de elución para eluir una o más de las proteínas humanas desde el adsorbente; en donde el caudal lineal de líquido a través de la columna es de al menos 2 cm/min.

Description

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DESCRIPCION

Aislamiento de protemas del plasma Campo de la invencion

La presente invencion se refiere al fraccionamiento y aislamiento a gran escala de protema o protemas de plasma humano, a partir de una solucion protemica. En particular, la presente invencion se refiere a la fabricacion a gran escala de protema o protemas de plasma terapeutico a partir de plasma humano, utilizando un adsorbente acoplado con un ligando para la captacion de la protema o protemas, a partir de la solucion protemica.

Antecedentes de la tecnica y tecnica anterior

La sangre humana y animal comprende muchas protemas y enzimas, que poseen propiedades terapeuticas y que potencialmente salvan vidas. Algunas de estas protemas se pueden encontrar en los globulos rojos mientras que otras se encuentran en solucion en el plasma o en el suero. Desde mediados del siglo XX, tales protemas han sido objeto de aislamiento a gran escala y espedfico con el objetivo de purificar y estandarizar las protemas para uso como agentes terapeuticos humanos. Ejemplos de destacadas protemas sangumeas que estan actualmente disponibles como productos terapeuticos aislados son: albumina, inmunoglobulina G, Factor VIII e inhibidor de la proteinasa alfa 1. Algunas de estas protemas se producen a una escala de varios miles de kg por ano (albumina e IgG), mientras que otras se producen solo a una escala del gramo al kilogramo por ano. Sin embargo, a nivel mundial se procesan muchos millones de litros de sangre al ano con la finalidad de aislar estas protemas.

La sangre, el plasma sangumeo y el suero sangumeo son soluciones extremadamente complicadas que contienen protemas que comprenden otros muchos tipos de compuestos distintos de la protema o protemas o enzima o enzimas de interes, todos cuidadosamente equilibrados y regulados para trabajar en el torrente sangumeo en un intervalo muy amplio de funciones bioqmmicamente complicadas tales como el transporte de oxfgeno, la proteccion inmunologica y el sistema de coagulacion que impide el excesivo sangrado de las heridas. Especialmente cuando se extrae sangre de un animal y se expone a la atmosfera y a la superficie de diferentes tipos de recipientes se vuelve muy inestable. Aunque se pueden anadir agentes qrnmicos, como la heparina y el citrato de sodio, para aumentar la estabilidad y, en cierto grado, impedir la coagulacion del plasma sangumeo obtenido al separar las celulas sangumeas, el plasma seguira siendo una solucion protemica muy fragil, muy concentrada y viscosa, que comprende tambien cantidades significativas de lfpidos. A pesar de la adicion de estabilizantes, cualquier manipulacion o alteracion de la composicion de plasma implica el riesgo de desestabilizacion accidental, que puede causar la activacion de la cascada de coagulacion, precipitacion de, p. ej., los componentes lipfdicos, asf como la desnaturalizacion de la protema o protemas diana y, de ese modo, se hace muy diffcil trabajar con la sangre. Por ello, cualquier procedimiento empleado para aislar protemas a partir de la sangre o de soluciones derivadas de la sangre debe tener en cuenta la inestabilidad inherente de la solucion y de las propias protemas. Esto ha demostrado ser un reto muy importante para la produccion a gran escala de productos terapeuticos a partir de la sangre.

Ademas, desde un punto de vista tecnologico, la complejidad e inestabilidad de la sangre hace que la separacion y aislamiento de las protemas de la sangre sea mucho mas complicada y economicamente exigente que el aislamiento de protemas de otros tipos de soluciones protemicas tal como sobrenadantes de cultivos celulares de marnfferos y caldo de fermentacion de microorganismos modificados geneticamente como los que se usan tfpicamente en la industria de la biotecnologfa. Ademas, la industria de la biotecnologfa normalmente solo aislara un producto espedfico a partir de un sobrenadante de un cultivo celular mientras que, por razones economicas y eticas, la industria terapeutica de fraccionamiento de la sangre debe aislar generalmente tantos productos como sea posible de la cantidad limitada de sangre disponible.

El coste de la sangre, del suero y del plasma ha aumentado muy significativamente durante las ultimas decadas siendo la principal razon debido al aumento del coste de las medidas de seguridad necesarias para impedir la propagacion de enfermedades vmcas desde los donantes de sangre hasta los receptores de los productos sangumeos. Durante mas de 10-20 anos, el muy elevado coste del plasma sangumeo, asf como el aumento de los costes de implantacion de etapas de eliminacion vmca y otras medidas de seguridad durante el tratamiento han puesto a la industria de fraccionamiento de la sangre bajo una presion significativa para aumentar el rendimiento por litro de productos individuales tales como la inmunoglobulina G (IgG) y el inhibidor de la proteinasa alfa 1.

Existe, ademas, generalmente una fuerte necesidad de ampliar el numero de productos que pueden ser producidos a partir de la misma cantidad de plasma, es decir, producir un aumento del numero de las diferentes protemas del plasma, siendo al mismo tiempo capaz de producir los productos existentes con rendimientos aceptables. La industria del fraccionamiento de la sangre ha experimentado que estas necesidades de hace mucho tiempo son diffciles de satisfacer con la tecnologfa conocida y aunque se han hecho intentos durante mucho tiempo por emplear tecnicas de adsorcion modernas como una alternativa a los procedimientos de precipitacion establecidos todavfa hay problemas significativos en lo que respecta a la viabilidad economica y a la robustez del tratamiento de los procedimientos de adsorcion descritos hasta ahora.

Uno de los procedimientos usados convencionalmente para el fraccionamiento de la protema o protemas del plasma sangumeo o del suero sangumeo se ha descrito en el documento US 2.390.074 (Cohn et al.) que describe un

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procedimiento para el fraccionamiento de protemas de plasma o de suero a gran escala que utiliza precipitacion con etanol y regula la temperatura, el pH, la fuerza ionica y el tiempo para controlar la precipitacion de ciertas protemas del plasma humano. El procedimiento de fraccionamiento implica la adicion escalonada de etanol a la materia prima del plasma con el fin de obtener varios precipitados (fracciones) y los correspondientes sobrenadantes que comprenden diferentes soluciones protemicas enriquecidas.

Un inconveniente del procedimiento de precipitacion con etanol, descrito por Cohn et al., es que algunas protemas tienden a desnaturalizarse durante el procedimiento dando como resultado un menor rendimiento de la protema a aislar y la contaminacion con agregados que necesita que se eliminen antes de que se pueda obtener un producto terapeutico aceptable. Ademas, durante este procedimiento de fraccionamiento, las protemas precipitadas tienen que ser resolubilizadas para su posterior tratamiento. Dichas soluciones de protemas resolubilizadas pueden comprender niveles significativos de protema insoluble (desnaturalizada) y material lipfdico que hace que resulte diffcil y consuma tiempo trabajar el producto diana, lo que tambien contribuye significativamente a la perdida de valor del producto. Ademas, es caractenstico de este procedimiento que una protema espedfica pueda distribuirse en varias de las fracciones obtenidas durante la adicion escalonada de etanol, que de nuevo da como resultado un trabajo de bajos rendimientos y que conlleva mucho tiempo de las fracciones protemicas recombinadas.

En el fraccionamiento de, p. ej., inhibidor de la proteinasa alfa 1 o inmunoglobulinas, tal como la IgG, utilizando el procedimiento de fraccionamiento descrito por Cohn et al., el rendimiento del inhibidor de la proteinasa alfa 1 es tan bajo como 10-20% y el rendimiento de la IgG es tan bajo como 40-50%. Sin embargo, puesto que estos productos son muy necesarios y como existe un subabastecimiento del producto para satisfacer las necesidades de los pacientes, para aislar tales productos son muy necesarios nuevos procedimientos donde es menor la perdida de producto.

Durante la ultima decada se han hecho muchos intentos para desarrollar un procedimiento de fraccionamiento que puede proporcionar un aumento del rendimiento utilizando una gama de otras tecnicas, incluida la cromatograffa. Sin embargo, inconvenientes asociados con las tecnicas de adsorcion conocidas, tales como caudales bajos y bajas capacidades de union dan como resultado baja productividad, asf como falta de robustez y dificultades en la aplicacion de procedimientos de limpieza seguros han dificultado el equilibrio del rendimiento y de la econoirna implicados en el fraccionamiento de las protemas del plasma y del suero sangumeos. El nucleo de los procedimientos de fabricacion industriales existentes, se basa, por lo tanto, todavfa, en el trabajo de Cohn et al.

Los procedimientos de aislamiento y purificacion utilizados actualmente han mostrado que son inadecuados y las impurezas traza resultantes de procedimientos de purificacion ineficientes pueden estimular una respuesta inmune en los pacientes. Ademas, los procedimientos de purificacion que no separan la parte activa e inactiva del producto, como los procedimientos actualmente utilizados, pueden conducir a un producto con una eficacia impredecible y una actividad espedfica que vana entre lotes independientes.

Incluso los intentos de desarrollar tecnicas avanzadas de adsorcion, tal como la adsorcion en lecho expandido, que se introdujeron por primera vez a principios de los anos noventa, no han logrado mejorar el empleo de las tecnicas de adsorcion. Finette G. M. S. et al., Biotechnol. Prog., 1998, 14, pag. 286-293, describe asf la aplicacion de un adsorbente que tiene un diametro medio de partmula de 180 micrometros y una densidad de 1,79 g/ml para adsorcion en lecho empaquetado y en lecho expandido del inhibidor de proteinasa alfa 1 a partir de la fraccion II+IN de Cohn. Los autores concluyen que un caudal volumetrico de 0,2 ml/min (correspondiente a un caudal lineal de 0,1 cm/min o 60 cm/hora) dara como resultado un rendimiento del inhibidor de la proteinasa alfa 1 del 50%. Los autores afirman ademas que caudales mas altos disminuiran el rendimiento asf como perturbaran el flujo en piston en la columna. Tales bajos caudales no son economicamente interesantes y no es aconsejable, por lo tanto, el uso de, p. ej., adsorcion en lecho expandido para el fraccionamiento industrial de protemas sangumeas.

Otros intentos de aplicar adsorcion en lecho expandido para el aislamiento de protemas en plasma humano confirman los bajos caudales aplicados con tecnicas anteriores. El documento US 6.617.133 describe, por ello, el uso de un adsorbente Streamline SP (Amersham Biosciences) que, segun el proveedor, tiene un diametro de la partmula de volumen medio de 200 micras y una densidad de 1,20 g/ml para el aislamiento de seroalbumina humana utilizando un caudal de aplicacion de la materia prima de 100 cm/hora. Un bajo caudal de este tipo esta limitando la productividad del sistema de adsorcion y, por ello, requiere columnas muy grandes y da como resultado un alto coste de materiales por unidad de albumina humana producida.

El documento WO 02/096215 divulga un procedimiento a gran escala para el aislamiento de protemas, que incluye seroalbumina o inmunoglobulinas bovinas, a partir de una solucion protemica, cuyo procedimiento comprende las etapas de ajustar el pH de la mezcla, aplicar la mezcla a una columna de adsorcion de lecho expandido que comprende un adsorbente de alta densidad, lavar la columna y eluir la protema desde el adsorbente. Las soluciones protemicas a las que se aplica este procedimiento son soluciones derivadas de la leche y soluciones derivadas del pescado.

El documento WO 99/65586 divulga el uso de procedimientos de adsorcion de lecho expandido para el aislamiento de protemas a partir de una gama completa de extractos y materias primas.

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Burnouf (J. Chromatography. B, 664 (1995) 2-5) es un artmulo de revision interesado en las formas en que se ha utilizado el fraccionamiento cromatografico en el fraccionamiento del plasma.

En consecuencia, un procedimiento para el fraccionamiento de protemas del plasma que es rapido, robusto (es decir, que es fiable durante el funcionamiento diario con un tiempo de inactividad reducido), espedfico y seguro, y que al mismo tiempo proporciona un rendimiento y una pureza mejorados de los productos de interes durante el tratamiento y, de ese modo, facilita un equilibrio mejorado y aceptable entre rendimiento y economfa, en comparacion con los procedimientos utilizados convencionalmente, p. ej., el procedimiento descrito por Cohn et al., y que resuelve los problemas antes mencionados siendo, por lo tanto, deseado. Un procedimiento de este tipo se proporciona en el presente documento.

Sumario de la invencion

En consecuencia, la presente invencion se refiere a un procedimiento para el aislamiento de una o mas protemas humanas a partir de una solucion protemica. El procedimiento de la presente invencion es rapido, robusto, espedfico y seguro, y proporciona un rendimiento y una pureza mejorados del producto de interes durante el tratamiento y, de este modo, facilita un mejorado y aceptable equilibrio entre el rendimiento del producto y la economfa involucrada, en comparacion con los procedimientos utilizados convencionalmente. El procedimiento segun la invencion es particularmente adecuado para la produccion a gran escala.

Por ello, un aspecto de la presente invencion es proporcionar un procedimiento para el aislamiento de una o mas protemas humanas a partir de una solucion protemica en donde la solucion protemica se obtiene a partir de plasma humano y contiene etanol y se selecciona del grupo que consiste en sobrenadante I, sobrenadante II + III, sobrenadante I + II + III, fraccion resolubilizada II + III, fraccion resolubilizada IV-1, y cualquier combinacion de los mismos. El procedimiento comprende las etapas de:

a) ajustar el pH de la solucion protemica a un pH preestablecido;

b) ajustar la fuerza ionica de la solucion protemica a una fuerza ionica preestablecida;

c) aplicar dicha solucion protemica a una columna de adsorcion de lecho expandido que comprende partmulas adsorbentes de alta densidad que tienen una densidad de 1,5 g/ml a 15 g/ml, y en donde el 85% en volumen de las partmulas adsorbentes de alta densidad tienen un tamano de partmula en el intervalo de 10 a 150 |im;

d) lavar la columna con un tampon de lavado para lavar el material no unido;

e) lavar la columna con un tampon de elucion para eluir una o mas protemas humanas del adsorbente;

en donde el caudal lineal de lfquido a traves de la columna es de al menos 2 cm/min. Preferiblemente, el sobrenadante o la fraccion precipitada tienen una concentracion de alcohol de al menos 5% en volumen.

Preferiblemente, el adsorbente comprende un polfmero matriz funcionalizado que lleva una pluralidad de grupos funcionales unidos de forma covalente que comprenden un sistema de anillo aromatico o heteroaromatico y uno o mas grupos acidos.

Preferiblemente, dichas una o mas protemas de la sangre humana se seleccionan del grupo que consiste en albumina, IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, inhibidor de la proteinasa alfa 1, protema de procoagulacion de la sangre, protema de anticoagulacion de la sangre, agente trombolftico, protema anti-angiogenica, a-2-antiplasmina, inhibidor de la esterasa C-1, apolipoprotema, HDL, LDL, Fibronectina, beta-2-glicoprotema I, fibrinogeno 30, plasminogeno, plasmina, activador del plasminogeno, inhibidor del plasminogeno, estreptocinasa, inhibidor de interalfa-tripsina, a-2- macroglobulina, protema amiloide, ferritina, prealbumina, globulina GC, hemopexina, complemento C3, transferrina, urocinasa y glicoprotema a-1 acida.

Preferiblemente, una o mas protemas se retiran por lavado como una protema no unida con uno o mas tampones de lavado. Preferiblemente, la protema no unida comprende el inhibidor de la proteinasa a-1.

Preferiblemente, el pH preestablecido esta en el intervalo de pH 3,0 a pH 10,0 y/o la fuerza ionica presente esta en el intervalo de 0,0001 a 12,0.

Preferiblemente, el adsorbente tiene una capacidad de union dinamica a 10% de saturacion para al menos una protema espedfica de al menos 5 g por litro de adsorbente sedimentado.

Preferiblemente, la albumina y la IgG estan unidas al adsorbente y simultaneamente el inhibidor de la proteinasa a-1 se obtiene como material no unido desde el adsorbente.

Preferiblemente, albumina e IgG se obtienen del adsorbente por elucion escalonada.

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Descripcion detallada de la invencion

Durante la ultima decada el desarrollo de la adsorcion en lecho expandido ha ganado cada vez mas atencion debido a la gran aplicabilidad para la purificacion a gran escala. Las protemas se pueden purificar a partir de una solucion protemica en bruto sin la necesidad de clarificacion individual, concentracion y otros tipos de purificacion inicial para eliminar la materia en partmulas. Los adsorbentes, utilizados en la adsorcion en lecho expandido, captan las moleculas diana utilizando los mismos principios de la cromatograffa de afinidad, de intercambio ionico o de interaccion hidrofoba.

El concepto basico y la tecnica anterior en el campo de la adsorcion en lecho expandido se ha descrito en, p. ej., los documentos EP 0 722 771, WO 01/85329, WO 92/18237, WO 2000/25884, WO 02/05923, WO 99/65586 y WO 00/57982, que divulgan diferentes tipos de aparatos y equipos de adsorcion en lecho expandido, asf como diferentes tipos de partmulas de adsorcion que han encontrado los autores de la presente invencion para adaptarse adecuadamente o desarrollarse adicionalmente para el aislamiento de protemas del plasma como se describe en la presente invencion.

En una realizacion de la presente invencion, el procedimiento segun la presente invencion se puede realizar a gran escala. En el presente contexto, la expresion "a gran escala" se refiere al tratamiento de un volumen de materia prima de al menos 1 litro por ciclo de adsorcion, tal como al menos 5 litros por ciclo de adsorcion, tal como al menos 10 litros por ciclo de adsorcion, tal como al menos 25 litros por ciclo de adsorcion, tal como al menos 100 litros por ciclo de adsorcion, tal como al menos 1.000 litros por ciclo de adsorcion y, de ese modo, distinguir la invencion de cualquier experimento analftico y de pequena escala que no este relacionado con los exigentes requisitos de robustez y reproducibilidad de un entorno industrial de produccion a gran escala.

La solucion protemica

Segun la presente invencion, la protema o protemas de interes son aisladas de una solucion protemica. En el presente contexto, la expresion “solucion protemica” se refiere a cualquier tipo de solucion en forma lfquida que comprenda la protema o protemas de interes y a partir de las cuales se puedan separar y aislar la protema o protemas. En la presente invencion, la solucion protemica se obtiene a partir de plasma humano.

En la presente invencion, la solucion protemica utilizada se complementa con un alcohol que es etanol.

En el presente contexto, la expresion "complementado con un alcohol" se refiere a la adicion de un alcohol a la solucion protemica con el fin de lograr la separacion de al menos dos componentes presentes en la solucion protemica en la que un componente llegara a estar presente en un sobrenadante y el otro componente llegara a estar presente en una fraccion. En particular, dicha separacion de la solucion protemica implica aumentar gradualmente la cantidad de alcohol anadido a la solucion protemica y, de ese modo, separar al menos una protema del suero o plasma de la solucion protemica. En el transcurso del procedimiento de separacion, la protema o protemas de interes pueden estar presentes bien en el sobrenadante o bien en la fraccion. En una realizacion de la presente invencion, la solucion protemica se complementa con un alcohol para comprender al menos 0,1% en vol. de un alcohol, p. ej., al menos 0,5% en vol., tal como al menos 0,75% en vol., p. ej., al menos 1,0% en vol., tal como al menos 1,5% en vol., p. ej., al menos 2,0% en vol., tal como al menos 3,0% en vol., p. ej., al menos 5,0% en vol., tal como al menos 7,5% en vol., p. ej., al menos 10,0% en vol., tal como al menos 20% en vol., p. ej., al menos 25,0% en vol., tal como al menos 40% en vol., p. ej., al menos 50,0% en vol., tal como al menos 60% en vol., p. ej., al menos 75,0% en vol.

Aun en una realizacion de la presente invencion, la solucion protemica tiene un contenido total en alcohol de al menos 0,1% en vol., p. ej., al menos 0,5% en vol., tal como al menos 0,75% en vol., p. ej., al menos 1,0% en vol., tal como al menos 1,5% en vol., p. ej., al menos 2,0% en vol., tal como al menos 3,0% en vol., p. ej., al menos 5,0% en vol., tal como al menos 7,5% en vol., p. ej., al menos 10,0% en vol., tal como al menos 20% en vol., p. ej., al menos 25,0% en vol., tal como al menos 40% en vol., p. ej., al menos 50,0% en vol., tal como al menos 60% en vol., p. ej., al menos 75,0% en vol., tal como al menos 77% en vol.

En el presente contexto, el termino "sobrenadante" se refiere a una fase lfquida, que esta situada por encima de una fraccion lfquida, una fraccion de sedimento o una fraccion precipitada obtenida por la adicion de un alcohol a la solucion protemica, segun la presente invencion.

En el presente contexto, el termino “fraccion” se refiere a una parte de la solucion protemica que se puede separar del sobrenadante mediante un procedimiento de fraccionamiento, tal como filtracion, microfiltracion, centrifugacion, destilacion o cromatograffa y la fraccion puede ser una combinacion de compuestos o un compuesto puro. En una realizacion de la presente invencion, la fraccion puede estar en forma de un lfquido (una fraccion lfquida), un sedimento (una fraccion de sedimento) o un precipitado (una fraccion precipitada).

En la presente invencion, la solucion protemica se complementa con etanol.

En la presente invencion, la solucion protemica comprende fraccion o fracciones de plasma y/o sobrenadante o sobrenadantes en el plasma de un ser humano.

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Ademas, en una realizacion de la presente invencion, las fracciones obtenidas a partir de un precipitado resolubilizado pueden obtenerse por la adicion gradual de alcohol a la solucion protemica. En particular, se puede proporcionar una fraccion de plasma a partir de un precipitado resolubilizado obtenido mediante la adicion de alcohol al plasma.

Segun la presente invencion, una solucion protemica puede comprender la combinacion de uno o mas sobrenadante o sobrenadantes y/o una o mas fracciones resolubilizadas. En particular, una solucion protemica de plasma humano se puede obtener por recombinacion de uno o mas sobrenadantes y/o uno o mas precipitados resolubilizados obtenidos por la adicion de alcohol al plasma humano.

En una realizacion de la presente invencion, la temperatura de la solucion protemica puede estar en el intervalo desde -5 hasta 50 °C, mas preferiblemente en el intervalo de -5 a 40 °C, todavfa mas preferiblemente en el intervalo de -5 a 30 °C , todavfa mas preferiblemente en el intervalo de -5 a 20 °C, todavfa mas preferiblemente en el intervalo desde 0 a 10 °C o en el intervalo de 0 a 50 °C, mas preferiblemente en el intervalo de 10 a 50 °C, todavfa mas preferiblemente en el intervalo de 20 a 50 °C, todavfa mas preferiblemente en el intervalo de 30 a 50 °C, todavfa mas preferiblemente en el intervalo de 40 a 50 °C.

El procedimiento de fraccionamiento/separacion

Como se ha mencionado anteriormente, la forma convencional de fraccionar las soluciones protemicas implica el procedimiento descrito por Cohn et al., que implica la adicion escalonada de alcohol a la solucion protemica en el que la protema o protemas de interes son separadas gradualmente de la solucion protemica. Este procedimiento se ha descrito con mas detalle en: Cohn et al., "Separation into Fractions of Protein and Lipoprotein Components" J. Am. Chem. Soc, 68, 459-475, 1946; E. J. Cohn et al., Preparation and Properties of Serum and Plasma Proteins, IV, A System for Separation into Fractions of the Protein and Lipoproptein Components of Biological Tissues and Fluids, The Journal of the American Chemical Society, vol. LxVlII (Enero-Julio 1946), pag. 459-475; US 2.390.074 y US 2.469.193.

En el presente contexto, los terminos “fraccionamiento” y “separacion” se usan indistintamente y se relacionan con el procedimiento de preparacion de la solucion protemica antes de ponerse en contacto con el adsorbente para el aislamiento de la protema o protemas de interes.

En una realizacion de la presente invencion, un fraccionamiento escalonado de soluciones protemicas por la adicion de alcohol para obtener protema o protemas se puede ilustrar mediante una o mas de las siguientes operaciones:

(i) El plasma puede congelarse inicialmente y despues someterse a un procedimiento lento de descongelacion controlada, en el que se forma un crioprecipitado que comprende Factor VIII (complejado con el factor de von Willebrand, vWF) y fibrinogeno, y un sobrenadante que comprende la mayor parte de las protemas que permanecen en el plasma (denominado plasma cryo-poor).

(ii) La fraccion de crioprecipitado obtenida en (i) se puede resolubilizar para formar una solucion protemica y la

protema o protemas se pueden aislar poniendola en contacto con un adsorbente. En particular, la protema o

protemas, tal como el Factor VIII, el vWF y el fibrinogeno, se pueden aislar de la solucion protemica obtenida a partir de la fraccion resolubilizada.

(iii) El sobrenadante de (i), plasma cryo-poor, se complementa con alcohol y fraccion I (un precipitado) y se forma el sobrenadante I.

(iv) El sobrenadante I se puede complementar con mas alcohol, y se forman la fraccion II + III precipitada y el

sobrenadante II + III. La fraccion II + III se puede separar y resolubilizar para formar una solucion protemica y la

protema o protemas de interes se pueden aislar poniendolas en contacto con un adsorbente. En particular, protema o protemas como las inmunoglobulinas (tal como IgG) se pueden aislar de la solucion protemica obtenida de las fracciones II + III. El sobrenadante II + III comprendera principalmente albumina e inhibidor de la proteinasa alfa 1.

(v) El sobrenadante II + III se puede complementar adicionalmente con alcohol y formar el sobrenadante IV-1 y la fraccion IV-1 precipitada. La fraccion IV-1 se puede separar y resolubilizar y formar una solucion protemica y la protema o protemas se pueden aislar poniendolas en contacto con un adsorbente. En particular, la protema o protemas del plasma tales como el inhibidor de la proteinasa alfa 1, la antitrombina III y el complejo del Factor IX se pueden aislar de la solucion protemica obtenida de la fraccion IV-1.

(vi) El sobrenadante IV-1 se puede complementar con mas alcohol para formar la fraccion precipitada IV-4 y el sobrenadante IV-4. La fraccion IV-4 se puede separar y resolubilizar para formar una solucion protemica y la protema o protemas de interes se pueden aislar poniendolas en contacto con un adsorbente. En particular, la Butirilcolinesterasa se puede aislar de la solucion protemica obtenida de la fraccion IV-4.

(vii) El sobrenadante VI-4 se puede complementar adicionalmente con alcohol para proporcionar la fraccion V precipitada que se puede separar y resolubilizar para formar una solucion protemica y la protema o protemas de interes se pueden aislar poniendolas en contacto con un adsorbente. En particular, la albumina se puede aislar a

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partir de la solucion protemica obtenida de la fraccion V.

En la presente invencion, la solucion protemica se selecciona del grupo que consiste en sobrenadante I, sobrenadante II + III, sobrenadante I + II + III, fraccion resolubilizada II + III, fraccion resolubilizada IV-1, fraccion resolubilizada IV-4, fraccion resolubilizada V y cualquier combinacion de la misma.

En una realizacion particular de la presente invencion, la solucion protemica se puede seleccionar del grupo que consiste en sobrenadante I, sobrenadante II + III, fraccion resolubilizada IV-1, y cualquier combinacion de los mismos.

Aun en una realizacion particular de la presente invencion, la solucion protemica puede seleccionarse del grupo que consiste en sobrenadante I, sobrenadante II + III, sobrenadante I + II + III, y fraccion resolubilizada IV-1, y cualquier combinacion de los mismos.

En una realizacion particular adicional de la presente invencion, la solucion protemica se puede seleccionar del grupo del sobrenadante I y la fraccion resolubilizada II + III.

Las fracciones precipitadas se pueden resolubilizar en una amplia gama de soluciones acuosas que incluyen agua pura. En muchas realizaciones preferidas, el medio de resolubilizacion sera un tampon acuoso que tiene un pH y una fuerza ionica adecuados para la siguiente etapa de tratamiento aguas abajo, p. ej., una etapa de adsorcion segun la invencion.

En una realizacion de la presente invencion se pueden obtener fracciones precipitadas a partir de un sobrenadante por filtracion, centrifugacion, decantacion, ultrafiltracion y/o sedimentacion.

En una realizacion de la presente invencion, la solucion protemica se puede obtener mediante el procedimiento de fraccionamiento de Cohn et al., descrito por Cohn et al., "Separation into Fractions of Protein and Lipoprotein Components" J. Am. Chem. Soc, 68, 459-475, 1946; E. J. Cohn et al., Preparation and Properties of Serum and Plasma Proteins, IV, A System for the Separation into Fractions of the Protein and Lipoprotein Components of Biological Tissues and Fluids, The Journal of the American Chemical Society, vol. LXVIII (Enero-Julio 1946), pag. 459-475; US 2.390.074 y US 2.469.193.

En una realizacion de la presente invencion, la solucion protemica comprende al menos una protema del plasma humano obtenida a partir del fraccionamiento del plasma por adicion de etanol, p. ej., el procedimiento original de fraccionamiento de Cohn o variantes del mismo, tales como el procedimiento de Cohn-Oncley.

La protema

En la presente invencion, una o mas de las protemas a aislar es una o mas de las protemas del plasma humano. En el presente contexto, la expresion "protema o protemas de plasma" se refiere a una protema o protemas que son producidas o requeridas por el cuerpo humano.

El plasma es un componente de la sangre. Es el lfquido en el que las celulas sangumeas estan en suspension. El plasma sangumeo contiene protemas, lfpidos, nutrientes, productos finales metabolicos, hormonas y electrolitos inorganicos. El plasma sangumeo es estabilizado normalmente mediante la adicion de anticoagulantes tales como citrato de sodio, heparina y AEDT.

En una realizacion de la presente invencion, una o mas protema o protemas del plasma humanas que se aislaran se seleccionan del grupo que consiste en albumina, IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, inhibidor de la proteinasa alfa 1 (igual que a-1-antitripsina), protema procoagulante sangumea, protema anticoagulante sangumea, agente trombolftico, protema anti-angiogenica, a-2-antiplasmina, inhibidor de esterasa C-1, apolipoprotema, HDL, LDL, Fibronectina, beta-2-glicoprotema I, fibrinogeno, plasminogeno, plasmina, activador del plasminogeno, inhibidor del plasminogeno, inhibidor de la proteasa del plasma, anti-trombina III, estreptocinasa, inhibidor de la inter-alfa-tripsina, a-2- macroglobulina, protema amiloide, ferritina, pre-albumina, globulina GC, hemopexina, complemento C3, transferrina, urocinasa, glicoprotema a-1 acida y el factor o factores coagulantes o anti-coagulantes tal como Factor II, Factor V, Factor VII, Factor VIII, factor de von Willebrand, complejo de Factor VIII-factor de von Willebrand, Factor IX, Factor X, Factor XI, inhibidor C1, protema C y/o Protema S.

La columna

El adsorbente capaz de capturar una o mas protema o protemas se mantiene dentro de una columna. En el presente contexto, el termino "columna" se refiere a cualquier tipo de recipiente que pueda ser suministrado con al menos una entrada y al menos una salida para la aplicacion de la solucion protemica a la columna y despues eluir la protema. La entrada y la salida, para ciertas columnas, pueden ser la misma (por ejemplo, para los tanques de adsorcion por lotes). La columna esta en forma de una columna de adsorcion en lecho expandido (EBA). La columna de adsorbente se puede usar en un sistema por lotes o en un sistema continuo. Normalmente, las columnas de adsorcion de lecho expandido operan bajo condiciones de flujo en piston (es decir, no hay mezclado posterior ni turbulencia del lfquido en el lecho adsorbente).

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El hecho de que la tecnologfa EBA, en general, pueda trabajar eficientemente con una solucion protemica no clarificada la hace interesante para el aislamiento de protemas. En comparacion con los procedimientos basados en tecnicas de adsorcion en lecho empacado, el EBA puede ofrecer un procedimiento robusto que comprende menos etapas y, por ello, da como resultado un aumento de los rendimientos y una mayor economfa del procedimiento. Debido a la expansion del lecho adsorbente durante la ejecucion de un procedimiento de EBA, las columnas de EBA pueden ademas ser ampliadas hasta escala industrial sin ningun tipo de consideraciones significativas respecto al aumento de las contrapresiones o ruptura del procedimiento debido al atasco del sistema que a menudo es un problema cuando se utilizan columnas de lecho empaquetado.

Segun la presente invencion, la solucion protemica se aplica a una columna de lecho expandido que comprende un adsorbente.

En el presente contexto, la expresion "lecho expandido" se refiere a la situacion en donde las partmulas adsorbentes se emplean en columnas que permiten que el adsorbente se expanda con un flujo ascendente de lfquido a traves de la columna. La columna se disenara para evitar unas excesivas mezcla y turbulencia del lfquido en la columna al tiempo que las partmulas adsorbentes individuales se mantienen en un estado dinamico, no fijo, moviendose solo en estrecha una zona local en la columna. Aunque los mientras lechos expandidos preferidos tienen una pequena zona de mezclado en la parte inferior de la columna en la que se distribuye el lfquido entrante en toda la seccion transversal de la columna, los lechos expandidos generalmente operan bajo condiciones de flujo en piston en similitud con los lechos empaquetados.

En la presente invencion, el adsorbente se mantiene en una columna de adsorcion en lecho expandido y se usa preferiblemente para el aislamiento a gran escala de una o mas protemas a partir de una solucion protemica.

El adsorbente

Un objeto adicional de esta invencion es proporcionar un procedimiento para el aislamiento de protema o protemas a partir de una solucion protemica basada en la adsorcion a un material en fase solida por adsorcion en lecho expandido (EBA). Ademas, la adsorcion puede se puede caracterizar por el uso de caractensticas adsorbentes selectivas y/o qrnmica de ligandos que permite la union espedfica y la posterior elucion de sustancialmente una unica sustancia biomolecular, o que permite alternativamente una union espedfica de grupo de unas pocas sustancias biomoleculares seguida por una elucion selectiva y consecutiva de una o mas sustancias desde el adsorbente.

El adsorbente comprende un ligando adecuado para unirse a una o mas de las protemas de interes. En una realizacion de la presente invencion, el adsorbente se puede lavar y/o equilibrar opcionalmente con uno o mas tampones de lavado y/o tampones de equilibrado.

En la presente invencion es de importancia cntica que el adsorbente sea una partmula que tenga caractensticas combinadas en lo que respecta a tamano y densidad. Asf, se ha encontrado que para soluciones protefnicas muy concentradas, tales como plasma o suero, es muy deseable emplear partmulas que tengan un diametro de la partmula de volumen medio menor de 150 |im con el fin de obtener una rapida y eficaz union a la protema (que es importante para la productividad, y por ello la economfa, de una planta de produccion). Sin embargo, se ha encontrado ademas que es la combinacion del pequeno diametro de las partmulas adsorbentes (menores de 150 |im) con una cierta densidad minima (mayor de 1,5 g/ml) de las partmulas adsorbentes lo que permite mejoras significativas en la productividad de la planta de produccion. Por esto, se consigue una combinacion unica de union rapida y eficaz a protemas con altos caudales de lfquido a traves de las columnas empleadas para que pueda lograrse el procedimiento de adsorcion. Particularmente para columnas de lecho expandido, los altos caudales de lfquido que se pueden obtener con los adsorbentes segun la invencion pueden ser significativos. Generalmente se encuentra que un diametro mas pequeno del volumen medio de las partmulas puede desear una mayor densidad de las partmulas.

Ejemplos de partmulas adsorbentes comerciales que se pueden emplear para algunas de las realizaciones de la presente invencion son:

- FastLine UFC NNSDW, UpFront Chromatography A/S, Dinamarca, que tiene un diametro de partmulas de volumen medio de 70 |im y una densidad de 2,9 g/ml.

- STREAMLINE Direct CST-1, Amersham Biosciences, Suecia, que tiene un diametro de partmulas de volumen medio de 135 |im y una densidad de 1,8 g/ml.

- Adsorbentes de intercambio ionico Q y CM HyperZ, Biosepra SA, Francia, que tienen un diametro de partmulas de volumen medio de 75 |im y una densidad de 3,2 g/ml.

Espedficamente, en la adsorcion en lecho expandido, el caudal, el tamano de las partmulas y la densidad de las partmulas pueden tener influencia sobre la expansion del lecho expandido y es importante controlar el grado de expansion de tal manera que se mantengan las partmulas dentro de la columna cuando se trabaja con adsorcion de lecho expandido. Para aplicabilidad industrial puede ser de interes tener un caudal elevado y una baja expansion. El

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grado de expansion puede determinarse como H/Ho, donde Ho es la altura del lecho en modo de lecho empaquetado (sin flujo a traves de la columna) y H es la altura del lecho en modo expandido (con un flujo determinado a traves de la columna). En una realizacion de la presente invencion, el grado de expansion H/Ho esta en el intervalo de 1,1-6, tal como 1,1-5, p. ej., 1,1-4, tal como 1,2-5, p. ej., 1,5-4 tal como 2-4, tal como 2-3, tal como 3-4. En otra realizacion de la presente invencion, el grado de expansion H/Ho es a lo sumo 1,2, p. ej., a lo sumo 1,3, tal como a lo sumo 1,5, p. ej., a lo sumo 1,8 tal como a lo sumo 2, tal como a lo sumo 2,5, p. ej., a lo sumo 3, tal como a lo sumo 3,5, p. ej., de 4, tal como a lo sumo 4,5. En aun una realizacion de la presente invencion, el caudal es de 5 cm/min y el grado de expansion H/Ho es a lo sumo 1,2, p. ej., a lo sumo 1,3, tal como a lo sumo 1,5, p. ej., a lo sumo 1,8 tal como a lo sumo 2, tal como a lo sumo 2,5, p. ej., a lo sumo 3, tal como a lo sumo 3,5, p. ej., de 4, tal como a lo sumo 4,5. En una realizacion adicional de la presente invencion, el caudal es de 7 cm/min y el grado de expansion H/Ho es a lo sumo 1,2, p. ej., a lo sumo 1,3, tal como a lo sumo 1,5, p. ej., a lo sumo 1,8 tal como a lo sumo 2, tal como a lo sumo 2,5, p. ej., a lo sumo 3, tal como a lo sumo 3,5, p. ej., de 4, tal como a lo sumo 4,5. Todavfa en una realizacion de la presente invencion, el caudal es de 1o cm/min y el grado de expansion H/Ho es a lo sumo 1,2, p. ej., a lo sumo 1,3, tal como a lo sumo 1,5, p. ej., a lo sumo 1,8, tal como a lo sumo 2, tal como a lo sumo 2,5, p. ej., a lo sumo 3, tal como a lo sumo 3,5, p. ej., de 4, tal como a lo sumo 4,5. En aun una realizacion de la presente invencion, el caudal es de 15 cm/min y el grado de expansion H/Ho es a lo sumo 1,2, p. ej., a lo sumo 1,3, tal como a lo sumo 1,5, p. ej., a lo sumo 1,8, tal como a lo sumo 2, tal como a lo sumo 2,5, p. ej., a lo sumo 3, tal como a lo sumo 3,5, p. ej., de 4, tal como a lo sumo 4,5. Todavfa en una realizacion de la presente invencion, el caudal es de 2o cm/min y el grado de expansion H/Ho es a lo sumo 1,2, p. ej., a lo sumo 1,3, tal como a lo sumo 1,5, p. ej., a lo sumo 1,8, tal como a lo sumo 2, tal como a lo sumo 2,5, p. ej., a lo sumo 3, tal como a lo sumo 3,5, p. ej., de 4, tal como a lo sumo 4,5.

En la presente invencion, el caudal lineal de la columna de lecho expandido es de al menos 2 cm/min, preferiblemente al menos 3 cm/min, mas preferiblemente al menos 4 cm/min, todavfa mas preferiblemente al menos 5 cm/min, todavfa mas preferiblemente al menos 6 cm/min, todavfa mas preferiblemente al menos 7 cm/min, todavfa mas preferiblemente al menos 8 cm/min, todavfa mas preferiblemente al menos 1o cm/min, todavfa mas preferiblemente al menos 12 cm/min, todavfa mas preferiblemente al menos 15 cm/min, todavfa mas preferiblemente al menos 2o cm/min, todavfa mas preferiblemente al menos 25 cm/min, todavfa mas preferiblemente al menos 3o cm/min, todavfa mas preferiblemente al menos 4o cm/min, todavfa mas preferiblemente al menos 5o cm/min. Todavfa en una realizacion de la presente invencion, el caudal lineal esta en el intervalo de 2-75 cm/min, p. ej., 5-75 cm/min, tal como 7-75 cm/min, p. ej., 1o-75 cm/min, tal como 15-75 cm/min, p. ej., 2o-75 cm/min, tal como 3o-75 cm/min, p. ej., 4o-75 cm/min, tal como 5o-75 cm/min, tal como 2-5o cm/min, p. ej., 2-3o cm/min, tal como 3-3o cm/min, tal como 3-2o cm/min, tal como 3-15 cm/min, tal como 4-3o cm/min, tal como 4-25 cm/min, tal como 4-2o cm/min, tal como 4-15 cm/min, tal como 5-25 cm/min, p. ej., 5-15 cm/min, tal como 5-1o cm/min, p. ej., 5-7,5 cm/min, tal como 7,5 cm/min. Estos mayores caudales, en comparacion con los caudales convencionales utilizados, pueden ser en gran medida posibles debido al pequeno diametro de partfcula en combinacion con la alta densidad del adsorbente. En realizaciones particulares de la presente invencion, la aplicacion de la solucion protemica a la columna de adsorbente puede realizarse con un caudal lineal de al menos 2oo cm/hora, tal como al menos 3oo cm/hora, mas preferiblemente al menos 4oo cm/hora, tal como al menos 5oo o 6oo cm/hora, tal como al menos el 9oo cm/hora.

En la presente invencion, la columna comprende un adsorbente de alta densidad. En el presente contexto, la expresion "adsorbente de alta densidad" se refiere a parte del grupo de adsorbentes e implica todo el lecho de partfculas adsorbentes presentes en la columna de adsorbente. La expresion "partfcula adsorbente" se utiliza indistintamente con el termino "partfcula" y se refiere a las partfculas simples individuales que constituyen el adsorbente en la columna. La forma preferida de una sola partfcula adsorbente es sustancialmente esferica. La forma global de las partfculas no es, sin embargo, normalmente, extremadamente cntica, por ello, las partfculas pueden tener otros tipos de formas redondeadas, p. ej., forma de elipsoide, de gota y de grano. Sin embargo, para ciertas aplicaciones (por ejemplo, cuando las partfculas se usan en una disposicion de lecho fluidizado), puede preferirse que al menos el 95% de las partfculas sean sustancialmente esfericas. En el presente contexto, las expresiones "diametro de partfcula" y "tamano de partfcula" se usan indistintamente y se refieren al diametro de un cfrculo que puede hacerse alrededor de la partfcula y, por lo tanto, puede ser considerado como el diametro de la partfcula en la parte mas ancha de la partfcula.

La densidad de una partfcula adsorbente pretende describir la densidad de la partfcula adsorbente en su estado completamente solvatado (por ejemplo, hidratado) en oposicion a la densidad de un adsorbente seco. En la presente invencion, la densidad de la partfcula se puede medir realizando el siguiente procedimiento: 1) Drenar una muestra de las partfculas adsorbentes por succion suave sobre un filtro de vidrio de vacfo para eliminar el agua intersticial que ocupa el espacio entre los granulos individuales. 2) Pesar la muestra de las partfculas drenadas para determinar la masa total de las partfculas. 3) Anadir la cantidad total de muestra de las partfculas drenadas a una cantidad conocida de agua en un cilindro de medicion y leer el aumento de volumen total obtenido por la adicion de las partfculas drenadas. 4) Calcular la densidad dividiendo la masa total de las partfculas drenadas entre el aumento de volumen determinado en el punto 3.

En la presente invencion, la densidad de la partfcula adsorbente esta en el intervalo de 1,5 g/ml a 15 g/ml, adecuadamente en el intervalo de 4 g/ml a 15 g/ml, o en el intervalo de 4 g/ml a 1o g/ml.

La densidad de la partfcula adsorbente en la EBA es significativa para los caudales aplicables en relacion con el

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grado maximo de expansion posible del lecho adsorbente dentro de una tipica columna de EBA (por ejemplo, con H/Ho max. 3-5) y es al menos 1,5 g/ml, preferiblemente al menos 1,8 g/ml, mas preferiblemente al menos 1,9 g/ml, incluso mas preferiblemente al menos 2,0 g/ml, todavfa mas preferiblemente al menos 2,1 g/ml, lo mas preferiblemente al menos 2,3 g/ml, incluso mas preferiblemente al menos 2,5 g/ml, incluso mas preferiblemente al menos 2,8 g/ml, incluso mas preferiblemente al menos 2,9 g/ml, todavfa mas preferiblemente al menos 3,0 g/ml, todavfa mas preferiblemente al menos 3,5 g/ml con el fin de permitir una alta productividad del procedimiento.

En la presente invencion, el 85% en volumen de las partfculas individuales del adsorbente tienen un diametro dentro del intervalo de 10 a 150 micrometros, preferiblemente dentro del intervalo de 15 a 120 micrometros, todavfa mas preferiblemente dentro del intervalo de 20 a 100 micrometros, todavfa mas preferiblemente dentro del intervalo de 20 a 80 micrometros, todavfa mas preferiblemente dentro del intervalo de 80 a 150 micrometros, e incluso todavfa mas preferiblemente dentro del intervalo de 40 a 120 micrometros. Aun en una realizacion de la presente invencion, el diametro medio de partfcula adsorbente puede ser de 150 micrometros o menos, preferiblemente de 120 micrometros o menos, incluso mas preferiblemente de 100 micrometros o menos, todavfa mas preferiblemente de 80 micrometros o menos, todavfa mas preferiblemente de 70 micrometros o menos, todavfa mas preferiblemente de 60 micrometros o menos, todavfa mas preferiblemente de 50 micrometros o menos, todavfa mas preferiblemente de 40 micrometros o menos.

En un procedimiento de EBA se pueden aplicar varios parametros que influyen en el caudal. Las propiedades de fluidizacion de las partfculas adsorbentes (que se pueden describir con la ayuda de la Ley de Stokes) determinan que caudales se pueden aplicar para expandir el adsorbente y que se mantenga el adsorbente todavfa dentro de la columna. Los principales factores que influyen en ello son el diametro y la densidad de las partfculas adsorbentes en combinacion con la viscosidad del lfquido que fluye a traves de la columna. Sin embargo, las cineticas de union y de transferencia de masas de utilidad para una aplicacion espedfica son igualmente importantes para asegurar la eficiencia y productividad optimas del procedimiento de EBA. Por ejemplo, puede ser posible hacer funcionar una columna de EBA que contenga un determinado adsorbente de EBA a caudales muy altos en lo que respecta a las propiedades ffsicas de fluidizacion y expansion, mientras que el alto caudal aplicado da como resultado una adsorcion pobre e ineficaz (es decir, una baja capacidad dinamica) debido al hecho de que las moleculas diana que se uniran no pueden difundirse dentro y fuera de las partfculas adsorbentes que igualan este caudal (es decir, el factor limitante es la cinetica de transferencia de masas).

Por consiguiente, en una combinacion de realizaciones de la invencion particularmente preferidas, donde el caudal lineal aplicado durante la aplicacion de la solucion protemica es superior a 300 cm/hora, el diametro de la partfcula de volumen medio es de 150 |im o menos. Normalmente, en realizaciones en donde el procedimiento de fraccionamiento se realiza a un caudal lineal aplicado superior a 500 cm/min, el diametro de la partfcula de volumen medio es inferior a 120 |im, preferiblemente inferior a 90 |im. Tfpicamente, en realizaciones donde el procedimiento de fraccionamiento se realiza a un caudal lineal aplicado superior a 600 cm/hora, el diametro de la partfcula de volumen medio es preferiblemente inferior a 85 |im, mas preferiblemente inferior a 75 |im.

Fundamentalmente, la expresion de distribucion del tamano de partfcula en este contexto es volumen basado en la comprension general en el campo de la tecnica y descrito por Malvern Instruments Ltd (Worcestershire, Reino Unido) en su Grna de Usuarios (MAN 0320 Edicion 1.0, Marzo 2004) del Mastersizer 2000E, que describe la medicion de la distribucion del tamano de partfcula con la ayuda de la dispersion de la luz.

Esto significa que, cuando el resultado indica, por ejemplo, que el 11% de una distribucion esta en la categona de tamano 65-78 |im, esto significa que el volumen total de todas las partfculas con diametros en ese intervalo (dentro de la categona de tamano 65-78) representa el 11% del volumen total de todas las partfculas en la distribucion. El diametro del volumen medio (o diametro medio volumetrico) al que se hace referencia en el presente contexto se refiere al diametro del volumen medio etiquetado "D(4,3)" por Malvern para el Mastersizer 2000E. Siempre que se hace referencia a un intervalo de tamano de partfcula tal como en "las partfculas tienen un diametro de partfcula en el intervalo de X-Y |im", debe entenderse como que al menos el 90% del volumen total de las partfculas tiene un diametro en el intervalo de X-Y |im, tal como al menos el 95%, p. ej., al menos el 98%, tal como al menos el 99%.

Todavfa en una realizacion de la presente invencion, la densidad del adsorbente, el diametro de partfcula y el diametro de la partfcula de volumen medio como se ha descrito anteriormente se pueden combinar de cualquier manera posible para proporcionar el adsorbente mas adecuado para el aislamiento de una o mas protemas de interes. En una realizacion de la presente invencion, la densidad del adsorbente puede estar en el intervalo de 1,5 a 10,0, el 85% en volumen de las partfculas individuales del adsorbente pueden tener un diametro dentro del intervalo de 10 a 150 micrometros y el diametro de la partfcula de volumen medio puede estar en el intervalo de 15 a 100 micrometros. En otra realizacion de la presente invencion, la densidad del adsorbente puede estar en el intervalo de 2,0 a 5,0, el 85% en volumen de las partfculas individuales del adsorbente puede tener un diametro dentro del intervalo de 20 a 140 micrometros y el diametro de la partfcula de volumen medio puede estar en el intervalo de 55 a 85 micrometros. En aun una realizacion de la presente invencion, la densidad del adsorbente puede estar en el intervalo de 2,5 a 3,5, el 85% en volumen de las partfculas individuales del adsorbente puede tener un diametro dentro del intervalo de 40 a 120 micrometros, y el diametro de la partfcula de volumen medio puede estar en el intervalo de 60 a 80 micrometros.

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En una combinacion de realizaciones preferidas, en donde el diametro de la partfcula de volumen medio puede ser de 120 |im o menos, la densidad de las partfculas es de al menos 1,6 g/ml, mas preferiblemente de al menos 1,9 g/ml. Cuando el diametro de la partfcula de volumen medio es inferior a 90 |im, la densidad debe ser al menos 1,8 g/ml o mas preferiblemente al menos 2,0 g/ml. Cuando el diametro de la partfcula de volumen medio es inferior a 75 |im, la densidad debe ser al menos 2,0 g/ml, mas preferiblemente al menos 2,3 g/ml y lo mas preferiblemente al menos 2,5 g/ml.

En una realizacion de la presente invencion, la partfcula adsorbente comprende una partfcula que tiene un diametro de la partfcula de volumen medio de a lo sumo 150 |im y una densidad de las partfculas de al menos 1,5 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 1,6 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 1,9 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 2,0 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 2,3 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 2,5 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 2,8; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 3,0 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 3,5 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 4,0 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 4,5 g/ml. Preferiblemente, la partfcula adsorbente comprende una partfcula que tiene un diametro de la partfcula de volumen medio de a lo sumo 120 |im y una densidad de las partfculas de al menos 1,5 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 1,6 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 1,9 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 2,0 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 2,3 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 2,5 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 2,8; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 3,0 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 3,5 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 4,0 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 4,5 g/ml. Mas preferiblemente, la partfcula adsorbente comprende una partfcula que tiene un diametro de la partfcula de volumen medio de a lo sumo 100 |im y una densidad de las partfculas de al menos 1,5 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 1,6 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 1,9 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 2,0 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 2,3 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 2,5 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 2,8; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 3,0 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 3,5 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 4,0 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 4,5 g/ml. Incluso mas preferiblemente, la partfcula adsorbente comprende una partfcula que tiene un diametro de la partfcula de volumen medio de a lo sumo 90 |im y una densidad de las partfculas de al menos 1,5 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 1,6 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 1,9 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 2,0 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 2,3 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 2,5 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 2,8; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 3,0 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 3,5 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 4,0 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 4,5 g/ml. Incluso mas preferiblemente, la partfcula adsorbente comprende una partfcula que tiene un diametro de la partfcula de volumen medio de a lo sumo 75 |im y una densidad de las partfculas de al menos 1,5 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 1,6 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 1,9 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 2,0 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 2,3 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 2,5 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 2,8; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 3,0 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 3,5 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 4,0 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 4,5 g/ml. Incluso mas preferiblemente, la partfcula adsorbente comprende una partfcula que tiene un diametro de la partfcula de volumen medio de a lo sumo 50 |im y una densidad de las partfculas de al menos 1,5 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 1,6 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 1,9 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 2,0 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 2,3 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 2,5 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 2,8; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 3,0 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 3,5 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 4,0 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 4,5 g/ml. Incluso mas preferiblemente, la partfcula adsorbente comprende una partfcula que tiene un diametro de la partfcula de volumen medio de a lo sumo 40 |im y una densidad de las partfculas de al menos 1,5 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 1,6 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 1,9 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 2,0 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 2,3 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 2,5 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 2,8; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 3,0 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 3,5 g/ml; p. ej., una densidad de las partfculas de al menos 4,0 g/ml; tal como una densidad de las partfculas de al menos 4,5 g/ml.

La partfcula adsorbente utilizada segun la invencion debe ser al menos parcialmente permeable a la sustancia biomolecular que se va a aislar para asegurar una capacidad de union significativa en contraste con las partfculas impermeables que solo pueden unirse a la molecula diana en su superficie dando como resultado una capacidad de union relativamente baja. La partfcula adsorbente puede ser de una matriz de diferentes estructuras, composiciones y formas.

La alta densidad de la partfcula adsorbente se consigue, en gran medida, por inclusion en una fase polimerica porosa, de una cierta proporcion de un material del nucleo denso no poroso. El nucleo no poroso tiene,

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preferiblemente, una densidad de al menos 4,0 g/ml, tal como al menos 5,0 g/ml, p. ej., al menos 8,0 g/ml, tal como al menos 10 g/ml, p. ej., al menos 15 g/ml. Tfpicamente, el material del nucleo no poroso tiene una densidad en el intervalo de aproximadamente 4,0-25 g/ml, tal como aproximadamente 4,0-20 g/ml, p. ej., aproximadamente 4,0-15 g/ml, tal como 12-19 g/ml, p. ej., 14-18 g/ml, tal como aproximadamente 6,0-15,0 g/ml, p. ej., aproximadamente 6,010 g/ml.

Otros tipos de partmulas adsorbentes de alta densidad se basan en partmulas constituidas por un material poroso de alta densidad, tal como oxido de circonio, en el que los ligandos de poros para la adsorcion pueden inmovilizarse directamente en el material de alta densidad o en redes polimericas porosas introducidas en los poros del material de alta densidad, veanse, por ejemplo, los documentos US 6.036.861 y WO 99/51316. Aunque siendo una forma interesante de proporcionar una alta densidad y pequena partmula adsorbente, tales tipos de adsorbentes tendran generalmente algunos inconvenientes debido a la restriccion de la difusion en la estructura porosa y un alto contenido en volumen de la fase de alta densidad dando como resultado bajos volumenes accesibles de union a la protema.

Es de trascendental importancia para una amplia gama de realizaciones preferidas de la invencion que la partmula adsorbente empleada segun la invencion tenga un elevado volumen accesible de union a la protema. En el presente contexto, la expresion “volumen accesible, de union a la protema, de la partmula” se refiere al volumen relativo de poros de cualquier tipo espedfico de partmula y se expresa como tanto por ciento en volumen con respecto al volumen total del granulo (es decir, (volumen ocupado por los poros/volumen total del granulo) x 100%). Por ello, si el material de alta densidad ocupa demasiado volumen de la partmula, solo se pueden conseguir bajas productividades en la columna.

En una realizacion de la presente invencion, el volumen accesible, de union a la protema, de la partmula adsorbente puede ser al menos 20%, mas preferiblemente al menos 30%, todavfa mas preferiblemente al menos 40%, todavfa mas preferiblemente al menos 50%, todavfa mas preferiblemente al menos 55%, todavfa mas preferiblemente al menos 60%, todavfa mas preferiblemente al menos 65%, todavfa mas preferiblemente al menos 70%, todavfa mas preferiblemente al menos 75%, todavfa mas preferiblemente al menos 80%, todavfa mas preferiblemente al menos 85% y todavfa mas preferiblemente al menos 90%.

En una realizacion de la presente invencion, el adsorbente puede tener una capacidad de union dinamica al 10% de saturacion para dicha al menos una protema espedfica de al menos 5 g por litro de adsorbente sedimentado, mas preferiblemente al menos 10 g por litro, incluso mas preferiblemente al menos 15 g por litro, todavfa mas

preferiblemente al menos 20 g por litro, todavfa mas preferiblemente al menos 25 g por litro, todavfa mas

preferiblemente al menos 30 g por litro, todavfa mas preferiblemente al menos 35 g por litro, todavfa mas

preferiblemente al menos 40 g por litro, todavfa mas preferiblemente al menos 50 g/litro, todavfa mas

preferiblemente al menos 60 g/litro.

Cuando se anade la solucion protemica a la columna de adsorbente, la proporcion entre la partmula adsorbente presente en la columna y la solucion protemica puede optimizarse para retener una alta capacidad del adsorbente y obtener una alta pureza de la protema o protemas a aislar. En una realizacion preferida de la presente invencion, el adsorbente presente en la columna relativo a la solucion protemica que se cargara en la columna se proporciona en una proporcion de al menos 1:100, tal como al menos 1:50, p. ej., al menos 1:30, tal como al menos 1:15, p. ej., 1:10, tal como 1:5, tal como 1: 1, tal como 1:0,5, medido sobre una base de volumen/volumen.

Por ello, las partmulas adsorbentes pueden estar constituidas por una serie de materiales porosos qmmicamente derivados que tienen la densidad, diametro y/o capacidad de union necesarios para funcionar a los caudales dados per se. Las partmulas son de cualquier tipo de conglomerado, como se describe en el documento WO 92/00799, con al menos dos nucleos no porosos rodeados por un material poroso, o del tipo pelicular con un unico nucleo no poroso rodeado por un material poroso.

En el presente contexto, la expresion "tipo de conglomerado" se refiere a una partmula de un material en partmulas, que comprende granulos de material del nucleo de diferentes tipos y tamanos, mantenidos unidos por la matriz de base polimerica, p. ej., una partmula de nucleo que consiste en dos o mas partmulas de alta densidad mantenidas juntas por una matriz de base polimerica circundante (por ejemplo, agarosa).

En el presente contexto, la expresion "tipo pelicular" se refiere a un material compuesto de partmulas, en donde cada partmula consiste en solo un material del nucleo de alta densidad revestido con una capa de matriz de base polimerica porosa, p. ej., un granulo de acero inoxidable de alta densidad revestido con agarosa.

Por consiguiente, la expresion "al menos un nucleo no poroso de alta densidad" se refiere a cualquier nucleo pelicular, que comprende una unica partmula no porosa de alta densidad o se refiere a un nucleo de conglomerado que comprende mas de una partmula no porosa de alta densidad.

La partmula adsorbente, como se ha indicado, puede comprender un nucleo no poroso de alta densidad con un material poroso que rodea al nucleo y dicho material poroso comprende, opcionalmente, un ligando en su superficie exterior.

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En el presente contexto, el termino “nucleo” se refiere a la partfcula de nucleo o partfculas de nucleo no poroso que estan presentes dentro de la partfcula adsorbente. La partfcula de nucleo o las partfculas de nucleo pueden estar circunstancialmente distribuidas dentro del material poroso y no estan limitadas a estar localizadas en el centro de la partfcula adsorbente.

El nucleo no poroso constituye tipicamente a lo sumo el 70% del volumen total de la partfcula adsorbente, tal como a lo sumo el 60%, preferiblemente a lo sumo el 50%, preferiblemente a lo sumo el 40%, preferiblemente a lo sumo el 30%, preferiblemente a lo sumo el 20%, preferiblemente a lo sumo el 15%, preferiblemente a lo sumo el 10%, preferiblemente a lo sumo el 5%.

Ejemplos de materiales del nucleo no poroso adecuados son compuestos inorganicos, metales, metales pesados, elementos no metalicos, oxidos metalicos, oxidos de no metales, sales metalicas y aleaciones metalicas, etc., siempre que se cumplan los criterios de densidad anteriores. Ejemplos de tales materiales del nucleo son silicatos metalicos, borosilicatos metalicos; materiales ceramicos que incluyen diboruro de titanio, carburo de titanio, diboruro de circonio, carburo de circonio, carburo de wolframio, carburo de silicio, nitruro de aluminio, nitruro de silicio, nitruro de titanio, oxido de itrio, polvo de silicio metalico y disiliciuro de molibdeno; oxidos y sulfuros de metales, que incluyen oxido de magnesio, aluminio, titanio, vanadio, cromo, circonio, hafnio, manganeso, hierro, cobalto, mquel, cobre y plata; oxidos de no metales; sales metalicas, que incluyen sulfato de bario; elementos metalicos, que incluyen wolframio, circonio, titanio, hafnio, vanadio, cromo, manganeso, hierro, cobalto, mquel, indio, cobre, plata, oro, paladio, platino, rutenio, osmio, rodio e iridio, y aleaciones de elementos metalicos, tal como las aleaciones formadas entre dichos elementos metalicos, p. ej., acero inoxidable; formas cristalina y amorfa de carbono, que incluyen grafito, negro de carbon y carbon vegetal. Los materiales del nucleo no poroso preferidos son granulos de carburo de wolframio, wolframio, acero y titanio tales como los granulos de acero inoxidable.

El material poroso es una matriz de base polimerica utilizada como un medio para cubrir y mantener unidos multiples (o uno solo) nucleos y dentro de la partfcula adsorbente y como un medio para unir el ligando adsorbente.

La matriz de base polimerica se puede buscar entre ciertos tipos de polfmeros organicos naturales o sinteticos, tfpicamente seleccionados de i) polisacaridos naturales y sinteticos y otros polfmeros basados en carbohidratos, que incluyen agar, alginato, carragenano, goma guar, goma arabiga, goma ghatti, goma tragacanto, goma karaya, goma de algarrobo, goma de xantano, agarosas, celulosas, pectinas, mucinas, dextranos, almidones, heparinas, quitosanos, hidroxialmidones, hidroxipropilalmidones, carboximetilalmidones, hidroxietilcelulosas, hidroxipropilcelulosas y carboximetilcelulosas; ii) polfmeros y monomeros organicos sinteticos que dan como resultado polfmeros, que incluyen polfmeros acnlicos, poliamidas, poliimidas, poliesteres, polieteres, compuestos vimlicos polimericos, polialquenos, y derivados sustituidos de los mismos, asf como copolfmeros que comprenden mas de una funcionalidad del polfmero, y derivados sustituidos de los mismos; y iii) mezclas de los mismos.

Un grupo preferido de matrices de base polimerica son los polisacaridos como la agarosa.

Los investigadores de la presente invencion han encontrado que con el fin de asegurar una adsorcion eficaz a caudales elevados es necesario minimizar el diametro de la partfcula de volumen medio de la partfcula adsorbente. Por ello, en una realizacion preferida de la presente invencion, la partfcula adsorbente tiene un diametro de la partfcula de volumen medio a lo sumo de 150 |im, tfpicamente un diametro de la partfcula de volumen medio en el intervalo de aproximadamente 40 |im a 150 |im. La partfcula adsorbente tiene normalmente un diametro de la partfcula de volumen medio a lo sumo de 120 |im, particularmente a lo sumo de 100 |im, mas preferiblemente a lo sumo de 90 |im, de 80 |im o de 75 |im, mas preferiblemente de 70 |im y lo mas preferiblemente a lo sumo de 60 |im.

Desde el punto de vista de la productividad, es importante que el adsorbente pueda unirse a una gran cantidad de la sustancia biomolecular por unidad de volumen del adsorbente. Por ello, los autores de la invencion han encontrado que es preferible aplicar adsorbentes que tengan una fase polimerica (es decir, la red polimerica permeable donde esta situado un ligando y en donde tiene lugar la adsorcion real) que constituya al menos el 50% del volumen de la partfcula adsorbente, preferiblemente al menos el 70%, mas preferiblemente al menos el 80% y lo mas preferiblemente al menos el 90% del volumen de las partfculas adsorbentes.

El ligando

El procedimiento de aislamiento de una o mas protemas puede proporcionarse y facilitarse uniendo un ligando adecuado al adsorbente. En una realizacion de la presente invencion, el adsorbente comprende un polfmero matriz funcionalizado que lleva una pluralidad de ligandos que comprenden grupos funcionales unidos de forma covalente. En una realizacion preferida de la presente invencion, el ligando comprende un sistema de anillo aromatico o heteroaromatico y uno o mas grupos acidos.

En el presente contexto, la expresion "polfmero matriz funcionalizado" se refiere al sitio de anclaje del ligando que fomenta las caractensticas deseadas de adsorcion a la protema. Dependiendo de la estructura de la partfcula adsorbente, el polfmero matriz puede formar la cadena principal o esqueleto que define la forma ffsica de las partfculas adsorbentes o puede ser un polfmero que este ocupando los poros de otro material que sirva como cadena principal o esqueleto de las partfculas. En realizaciones preferidas, el polfmero matriz funcionalizado es un

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poKmero organico sintetico o natural, tal como un polisacarido (p. ej., poUmeros poliacnlicos, agarosa o celulosa), o puede ser un poUmero inorganico, tal como s^lice. En casos especiales, el propio polfmero matriz puede constituir el sitio de adsorcion de la protema, en cuyo caso no es necesario inmovilizar otros ligandos sobre el polfmero.

En una realizacion de la presente invencion, el adsorbente comprende un poUmero matriz funcionalizado que lleva una pluralidad de grupos funcionales unidos de forma covalente, teniendo dichos grupos la formula general:

M-SP1-X-Alk,

en donde que M designa el polfmero adsorbente; SP1 designa un espaciador opcional opcionalmente sustituido con -A-SP2-ACID, -A, o -ACID; X designa -O-, -S-, -H-, o -NAlk-; Alk puede estar ausente o ser -A-SP2-ACID, -A, -ACID o alquilo C1-4, donde alquilo C1-4 puede estar opcionalmente sustituido con -A-SP2-ACID, -A o -ACID; A designa un resto aromatico o heteroaromatico opcionalmente sustituido; SP2 designa un espaciador opcional; y ACID designa uno o mas grupos acidos; en donde al menos uno de SP1 o Alk esta sustituido con -A-SP2-ACID o -A, y al menos uno de SP1 o Alk comprende -ACID y en donde al menos uno de SP1 o Alk esta presente. Si Alk esta ausente, X tambien estara ausente.

En una realizacion de la presente invencion, el adsorbente puede acoplarse con un ligando que lleva una carga positiva a un valor de pH de pH 10 o inferior, tal como pH 9 o inferior, p. ej., pH 8 o inferior, tal como pH 7 o inferior, p. ej., pH 6 o inferior, tal como pH 5 o inferior, p. ej., pH 4 o inferior.

Ademas se ha encontrado que los grupos funcionales no deben ser demasiado grandes en tamano y complejidad con el fin de obtener una alta capacidad de union y una alta estabilidad qmmica del adsorbente. Por ello, se ha encontrado que un tamano mayor en lo que respecta a peso molecular y numero de sistemas de anillo presentes en el grupo funcional en muchos casos solo aumentan el coste del adsorbente sin dar el beneficio de una mayor capacidad de union en lo que respecta a la cantidad de protema que puede unirse por litro de adsorbente. Tambien, la concentracion molar del grupo funcional unido de forma covalente realizable en el adsorbente puede ser menor si se emplea un tamano molecular grande del grupo funcional (presumiblemente debido a impedimento esterico).

Por ello, en una realizacion de la invencion, los grupos funcionales unidos de forma covalente comprenden un maximo de tres sistemas de anillo mono- o bidclicos, aromaticos o heteroaromaticos, para cada grupo funcional unido al polfmero matriz, mas preferiblemente un maximo de dos sistemas de anillo monodclicos o bidclicos, aromaticos o heteroaromaticos, e incluso mas preferiblemente un maximo de un sistema de anillo mono- o bidclicos, aromaticos o heteroaromaticos, para cada grupo funcional unido al polfmero matriz. De manera similar, en una realizacion de la invencion, los grupos funcionales unidos de forma covalente comprenden un maximo de tres grupos acidos, preferiblemente un maximo de 2 grupos acidos y lo mas preferiblemente un maximo de un grupo acido unido a cada sistema de anillo aromatico o heteroaromatico presente en los grupos funcionales unidos de forma covalente.

En una realizacion preferida de la invencion, uno o mas grupos acidos se eligen del grupo de acidos carboxflicos, acidos sulfonicos, acidos fosfonicos, acidos boronicos y combinaciones de los mismos.

En una realizacion de la presente invencion, el ligando puede derivarse de un grupo dietilaminoetilo, una polialquilen- imina, una alquil-amina, una alquil-diamina o una polialilamina. Preferiblemente, pueden ser adecuadas alquil-amina o alquil-diamina que tienen una longitud de cadena de 3-14 atomos y 1-5 grupos funcionales amino. Los atomos que forman parte de la cadena pueden involucrar C (carbono), N (nitrogeno), O (oxfgeno) y/o S (azufre).

Aun en una realizacion de la presente invencion, el adsorbente puede comprender un ligando, que tiene tanto grupos aromaticos como grupos amino tales como una amina aromatica o una diamina aromatica. Preferiblemente, la diamina aromatica es 1,4-xilen-diamina o isomeros de 1,4-xilendiamina.

Aun en una realizacion de la presente invencion, el adsorbente puede acoplarse con un ligando que tiene un grupo acido, un resto aromatico o heteroaromatico, un grupo heteroaromatico bidclico sustituido o cualquier combinacion de los mismos, tal como un ligando que tiene un grupo acido y un resto aromatico o heteroaromatico, un ligando que tiene un grupo acido y un grupo heteroaromatico bidclico sustituido o un resto aromatico o heteroaromatico y un grupo heteroaromatico bidclico sustituido.

En otra realizacion de la presente invencion, el ligando comprende un grupo heteroaromatico bidclico sustituido que puede derivarse de compuestos seleccionados del grupo que consiste en bencimidazoles, benzotiazoles y benzoxazoles.

En una realizacion de la presente invencion, el ligando puede ser un acido aromatico o heteroaromatico seleccionado del grupo que consiste en acidos carboxflicos, acidos sulfonicos, acidos fosfonicos y acidos boronicos. Preferiblemente, el ligando puede seleccionarse del grupo que consiste en acido 2-mercaptobenzoico, acido 2- mercaptonicotmico, acido 2-aminobenzoico, acido 3-aminobenzoico y acido 4-aminobenzoico, acido 4-hidroxifenil- mercapto-acetico, acido 4-hidroxifenil-mercapto-propanoico, acido 4-hidroxifenil-mercapto-butanoico, acido 2,3- dihidroxi-benzoico, acido 2,4-dihidroxi-benzoico, acido 2,5-dihidroxi-benzoico, acido 2,6-dihidroxi-benzoico, acido 3,4-dihidroxi-benzoico, acido 3,5-dihidroxibenzoico, acido mercapto-bencimidazol-sulfonico, acido ortamlico, acido metamlico, acido sulfamlico, acido 4-metilanilina-2-sulfonico, acido 4-metoxianilina-2-sulfonico, acido anilina-2,5-

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disulfonico, acido N-metilmetamlico, acido 7-amino-1-naftol-3-sulfonico, acido 1-naftol-4-sulfonico, acido 2-naftol-6- sulfonico y acido 2-hidroxi-3-naftoico y acido 2-mercaptobenzimidazol-sulfonico.

En una realizacion de la presente invencion, el ligando puede ser un acido N-benzoil-amina, o un acido N-benzoil- amina que comprende grupos tiol o mercapto.

Aun en una realizacion de la presente invencion el ligando puede acoplarse al adsorbente a traves de un enlace tio- eter, un enlace amino, o un enlace oxfgeno-eter.

La concentracion optima de los grupos funcionales unidos de forma covalente (los ligandos) en la cadena principal del adsorbente polimerico (tambien referido frecuentemente como la densidad de grupos funcionales o la concentracion de ligando) dependera de la estructura detallada del grupo funcional y del tipo de material adsorbente utilizado para preparar el adsorbente.

Con el fin de asegurar una optimas resistencia de adsorcion y la productividad del adsorbente, se ha encontrado que puede ser importante la concentracion de ligando en el adsorbente. Por ello, en una realizacion adecuada, el adsorbente lleva ligandos para la adsorcion de las sustancias biomoleculares en una concentracion de al menos 20 mM, tal como al menos 30 mM o al menos 40 mM, preferiblemente al menos 50 mM y lo mas preferiblemente al menos 60 mM .

Sin embargo, generalmente sena preferible que el adsorbente tuviera una concentracion de grupos funcionales unidos de forma covalente en el intervalo de 5-500 milimoles por litro de adsorbente en su estado de lecho sedimentado (empaquetado), mas preferiblemente en el intervalo de 10-250 milimoles por litro, todavfa mas preferiblemente en el intervalo de 10-125 milimoles por litro, todavfa mas preferiblemente en el intervalo de 15 a 100 milimoles por litro, todavfa mas preferiblemente en el intervalo de 20-80 milimoles por litro, todavfa mas preferiblemente en el intervalo de 25-75 milimoles por litro, todavfa mas preferiblemente en el intervalo de 30-60 milimoles por litro.

En una realizacion de la presente invencion, los grupos funcionales unidos de forma covalente pueden estar unidos al adsorbente por cualquier tipo de enlace covalente conocido per se para ser aplicable con este fin, ya sea por una reaccion qmmica directa entre el ligando y el adsorbente o por una activacion precedente del adsorbente o del ligando con un reactivo adecuado conocido per se que permite enlazar la cadena principal de la matriz polimerica y el grupo funcional. Ejemplos de tales reactivos de activacion adecuados son epiclorhidrina, epibromhidrina, alilglicidil-eter; bis-epoxidos tal como butanodioldiglicidileter; compuestos alifaticos sustituidos con halogeno tales como di-cloro-propanol, carbonildiimidazol; aldehndos tal como dialdehndo glutarico; quinonas; peryodatos tales como meta-peryodato de sodio; carbodiimidas; cloruros de sulfonilo tales como cloruros de tosilo y cloruros de tresilo; N- hidroxi-succinimidas; tolueno-4-sulfonatos de 2-fluoro-1 -metilpiridinio; oxazolonas; maleimidas; disulfuros de piridilo; e hidrazidas. Entre estos, se prefieren los reactivos de activacion que dejan un grupo espaciador SP1 diferente de un enlace sencillo, p. ej., epiclorhidrina, epibromhidrina, alil-glicidileter; bis-epoxidos; compuestos alifaticos sustituidos con halogeno; aldehndos; quinonas; bromuro de cianogeno; cloro-triazinas; oxazolonas; maleimidas; disulfuros de piridilo; e hidrazidas.

Reactivos de activacion especialmente interesantes son los compuestos epoxfdicos tales como epiclorhidrina, alil- glicidileter y butanodioldiglicidileter y poliglicidileteres tal como glicerol poliglicidileter. En ciertos casos en los que se puede demostrar que la estabilidad de la union covalente del grupo funcional es estable al tratamiento con hidroxido de sodio, p. ej., hidroxido de sodio 0,1 M a 2 M, el reactivo de activacion puede basarse en reactivos derivados de triazina, p. ej., cloro-triazinas tal como cloruro cianurico.

Las posibilidades anteriormente mencionadas hacen importante definir la presencia de un espaciador opcional SP1 que reviste la cadena principal del adsorbente polimerico (tambien denominado polfmero matriz) y el grupo funcional. En el presente contexto, el espaciador SP1 puede considerarse que es parte del reactivo de activacion, que forma el enlace entre el polfmero matriz y el grupo funcional. Por ello, el separador SP1 corresponde a los reactivos de activacion y las reacciones de acoplamiento implicadas. En algunos casos, p. ej., cuando se utilizan carbodiimidas, el reactivo de activacion forma una forma activada del polfmero matriz o del reactivo del grupo funcional. Despues del acoplamiento no se deja ninguna parte del reactivo de activacion entre el grupo funcional y el polfmero matriz, y por ello el SP1 es simplemente un enlace sencillo.

En otros casos, el espaciador SP1 puede ser una parte integral del grupo funcional que logra las caractensticas de union, es decir, el grupo funcional, y esto sera especialmente significativo si el espaciador SP1 comprende sitios funcionalmente activos o sustituyentes tales como tioles, aminas, grupos acidos, grupos sulfona, grupos nitro, grupos hidroxi, grupos nitrilo u otros grupos que pueden interactuar a traves de enlaces de hidrogeno, union o repulsion electrostatica, transferencia de carga, o similares.

Todavfa en otros casos, el espaciador SP1 puede comprender un anillo aromatico o heteroaromatico, que desempene una funcion significativa de las caractensticas de union del adsorbente. Este sena, por ejemplo, el caso si se usaran quinonas o clorotriazinas como agentes de activacion del adsorbente o del grupo funcional.

En un caso adicional, el espaciador SP1 puede ser un enlace sencillo o un biradical derivado de un reactivo de

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activacion seleccionado de epiclorhidrina, alil-glicidileter, bromuro de alilo, bis-epoxidos tal como butanodioldiglicidileter, compuestos alifaticos sustituidos con halogeno tal como 1,3-dicloropropano-2-ol, aldelddos tales como dialdehido glutarico, quinonas, bromuro de cianogeno, cloro-triazinas tal como cloruro cianurico, tolueno- 4-sulfonatos de 2-fluoro-1 -metilpiridinio, maleimidas, oxa-zolonas e hidrazidas.

En una realizacion de la presente invencion, el espaciador SP1 puede ser un biradical alifatico de cadena corta, p. ej.,que tiene la formula -CH2-CH(OH)-CH2- (derivado de epiclorhidrina),-(CH2)3-O-CH2-CH(OH)-CH2- (derivado de alil-glicidileter) o -CH2-CH(OH)-CH2-O-(CH2)4-O-CH2-CH(OH)-CH2- (derivado de butano-dioldiglicidileter); o un enlace simple.

En una realizacion de la presente invencion, los adsorbentes comprenden tipicamente un ligando que comprende grupos aromaticos o heteroaromaticos (radicales) seleccionados entre los grupos que comprenden i) ligandos que comprenden los siguientes tipos como grupos funcionales: acidos benzoicos tales como acidos 2-aminobenzoicos, acidos 3-aminobenzoicos, acidos 4-aminobenzoicos, acidos 2-mercapto-benzoicos, acido 4-amino-2-clorobenzoico, acido 2-amino-5-clorobenzoico, acido 2-amino-4-clorobenzoico, acidos 4-aminosalidlicos, acidos 5-aminosalidlicos, acidos 3,4-diaminobenzoico, acido 3,5-diaminobenzoico, acido 5-aminoisoftalico, acido 4-aminoftalico; acidos cinamicos tal como acidos hidroxi-cinamicos; acidos nicotmicos tal como acidos 2-mercaptonicotfnicos; acidos naftoicos tal como acido 2-hidroxi-1-naftoico; quinolinas tal como 2-mercaptoquinolina; acidos tetrazolaceticos tal como acido 5-mercapto-1-tetrazolacetico; tiadiazoles tal como 2-mercapto-5-metil-1,3,4-tiadiazol; bencimidazoles tales como 2-amino-bencimidazol, 2-mercaptobencimidazol y 2-mercapto-5-nitrobencimidazol; benzotiazoles tales como 2-aminobenzotiazol, 2-amino-6-nitrobenzotiazol, 2-mercaptobenzotiazol y 2-mercapto-6-etoxibenzotiazol; benzoxazoles tal como 2-mercaptobenzoxazol; tiofenoles tales como tiofenol y 2-aminotiofenol; acido 2-(4- aminofeniltio)acetico; acidos sulfonicos aromaticos o heteroaromaticos y acidos fosfonicos, tales como acido 1- amino-2-naftol-4-sulfonico y fenoles tales como 2-amino-4-nitro-fenol. Debe senalarse que el caso donde M es agarosa, SP1 es un derivado de vinilsulfona y L es acido 4-aminobenzoico puede ser espedficamente no reivindicado en relacion con las matrices en fase solida segun la invencion, consultese el documento WO 92/16292, lo mas preferiblemente acidos aminobenzoicos como acido 2-amino-benzoico, acido 2-mercapto-benzoico, acido 3- aminobenzoico, acido 4-aminobenzoico, acido 4-amino-2-clorobenzoico, acido 2-amino-5-clorobenzoico, acido 2- amino-4-clorobenzoico, acidos 4-aminosalidlico, acidos 5-aminosalidlico, acidos 3,4-diaminobenzoico, acido 3,5- diaminobenzoico, acido 5-5-aminoisoftalico, acido 4-aminoftalico. En general, el acoplamiento que utiliza divinilsulfona puede no ser adecuado debido a que el acoplamiento de divinilsulfona es inestable cuando se pone en contacto con un alcalino y como los alcalinos son actualmente los agentes de limpieza mas adecuados y usados, los adsorbentes acoplados con divinilsulfona no se consideran importantes industrialmente; ii) ligandos que comprenden acidos 2-hidroxi-cinamicos, acido 3-hidroxi-cinamico y acido 4-hidroxi-cinamico; iii) ligandos que comprenden un acido carboxflico y un grupo amino como sustituyentes tales como acido 2-amino-nicotmico, acido 2-mercapto- nicotmico, acido 6-amino-nicotmico y acido 2-amino-4-hidroxipirimidin-carboxflico; iv) ligando que comprende radicales derivados de un anillo de benceno condensado con un sistema de anillo heteroaromatico, p. ej., un ligando seleccionado de bencimidazoles tales como 2-mercapto-bencimidazol y 2-mercapto-5-nitro-bencimidazol; benzotiazoles tales como 2-amino-6-nitrobenzotiazol, 2-mercaptobenzotiazol y 2-mercapto-6-etoxibenzotiazol; benzoxazoles tales como 2-mercaptobenzoxazol; y v) ligandos elegidos del grupo de tiofenoles tales como tiofenol y 2-aminotiofenol.

Dentro de la realizacion en la que el ligando se selecciona de entre los grupos i)-v) anteriormente mencionados, los adsorbentes tienen tfpicamente una capacidad de union dinamica de al menos 10 g de sustancia biomolecular por litro, mas preferiblemente al menos 20 g por litro, todavfa mas preferible al menos 30 g por litro cuando se ensayan segun las condiciones del procedimiento utilizadas en la aplicacion correspondiente. La capacidad de union del adsorbente puede determinarse en terminos de su capacidad de union a la albumina de suero bovino (BSA). La capacidad de union es tfpicamente tal que al menos 10 g/l de BSA se unen segun el Procedimiento A de ensayo.

Procedimiento A

El procedimiento A es un procedimiento utilizado para determinar la capacidad de union a albumina bovina de adsorbentes seleccionados que consiste en el siguiente procedimiento:

Solucion de albumina de suero bovino pH 4,0 (BSA, pH 4,0): Se disuelve albumina de suero bovino purificada (A 7906, Sigma, EE.UU.) hasta una concentracion final de 2 mg/ml en citrato de sodio 20 mM pH 4,0. Los adsorbentes se lavan con 50 volumenes de citrato de sodio 20 mM pH 4,0 y se drenan en un filtro de succion.

Se coloca una muestra de 1,0 ml de adsorbente drenado por succion en un tubo de ensayo de 50 ml seguido de la adicion de 30 ml de BSA, pH 4,0.

El tubo de ensayo se cierra despues con un tapon y la suspension se incuba en un mezclador de rodillos durante 2 horas a temperatura ambiente (20-25 °C). El tubo de ensayo se centrifuga despues durante 5 min a 2.000 rpm para sedimentar completamente el adsorbente. El sobrenadante se afsla despues desde el adsorbente pipeteando en un tubo de ensayo independiente, evitando el transporte de cualquier partfcula adsorbente y se filtra a traves de un pequeno filtro de 0,2 mm no adsorbente (Millipore, EE.UU.). Despues de esto, se realiza una determinacion de la concentracion de BSA no unida en el sobrenadante midiendo la densidad optica (DO) a 280 nm en un

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espectrofotometro.

La cantidad de BSA unida al adsorbente se calcula despues segun la siguiente formula:

mg de BSA unidos por ml de adsorbente drenado por succion = (1 - (DO del sobrenadante del ensayo/DO de la solucion de partida de BSA)) x 60 mg de BSA/ml de adsorbente.

Los parametros del procedimiento

Como se ha mencionado anteriormente, la solucion protemica que comprende una o mas protemas de interes se ajusta para que tenga un pH preestablecido y una fuerza ionica preestablecida.

En el presente contexto, el termino "preestablecido" se refiere al ajuste del pH o de la fuerza ionica, respectivamente, a un valor espedfico y predeterminado con el fin de seleccionar la capacidad del adsorbente para unir una o mas de las protemas de interes y aumentar de ese modo la eficacia del adsorbente para el aislamiento de la protema o de las protemas.

En una realizacion de la presente invencion, el pH preestablecido esta en el intervalo de pH 3,0 a pH 10,0, preferiblemente en el intervalo de pH 4 a pH 9, mas preferiblemente en el intervalo de pH 4 a pH 8, incluso mas preferiblemente en el intervalo de pH 4 a pH 7, todavfa mas preferiblemente en el intervalo de pH 4 a pH 6, todavfa mas preferiblemente en el intervalo de pH 4,5 a pH 5,5 o en el intervalo de pH 4 a pH 10, preferiblemente en el intervalo de pH 5 a pH 9, mas preferiblemente en el intervalo de pH 6 a pH 9, incluso mas preferiblemente en el intervalo de pH 6 a pH 8.

En aun una realizacion de la presente invencion, la fuerza ionica preestablecida esta en el intervalo de 0,0001 a 12,0, preferiblemente en el intervalo de 0,0001 a 5, mas preferiblemente en el intervalo de 0,0001 a 1, incluso mas preferiblemente en el intervalo de 0,0001 a 0,1, todavfa mas preferiblemente en el intervalo de 0,0001 a 0,075, todavfa mas preferiblemente en el intervalo de 0,01 a 0,05 o en el intervalo de 0,1 a 12,0, preferiblemente en el intervalo de 0,5 a 12, mas preferiblemente en el intervalo de 1 a 12, incluso mas preferiblemente en el intervalo de 1,5 a 12, todavfa mas preferiblemente en el intervalo de 2 a 12, todavfa mas preferiblemente en el intervalo de 4 a 12.

Para obtener una o mas protemas del adsorbente, se eluyen una o mas de las protemas con uno o mas tampones. En la presente invencion, el adsorbente se lava con un tampon de lavado para retirar por lavado el material no unido antes de eluir una o mas protemas del adsorbente.

Eliminacion de los virus

Para aumentar las medidas de seguridad necesarias para impedir la propagacion de enfermedades vmcas desde los donantes de sangre hasta los receptores de los productos sangumeos, puede ser necesario introducir una o mas etapas para la eliminacion de los virus.

En una realizacion de la presente invencion, la solucion protemica puede someterse al menos a un tratamiento de eliminacion de los virus. Preferiblemente, se puede realizar al menos un tratamiento de eliminacion de los virus antes de poner en contacto la solucion protemica con el adsorbente.

El tratamiento de eliminacion de los virus puede implicar la adicion a la solucion protemica de un detergente y/o un disolvente organico, tal como Tween, Triton, tri-n-butilfosfato.

En una realizacion de la presente invencion pueden realizarse varias etapas de eliminacion de los virus y preferiblemente se puede realizar un tratamiento de eliminacion de los virus antes de ponerse en contacto la solucion protemica con el adsorbente.

En una realizacion de la presente invencion pueden realizarse varias etapas de eliminacion de virus y preferiblemente se realiza un tratamiento de eliminacion de los virus antes de poner en contacto la solucion protemica con el adsorbente y, durante la etapa de adsorcion, cualquiera de las sustancias, tales como detergentes y/o disolventes organicos, anadidos a la solucion protemica permanecen no unidos al adsorbente y se retiran por lavado de la columna antes de la elucion de la protema a aislar.

Aun en una realizacion de la presente invencion, un procedimiento para eliminar los virus en fluidos biologicos puede realizarse mediante un tratamiento con disolventes organicos y/o detergentes; especialmente el tratamiento con fosfato de tri(n-butilo) (TNBP) y detergentes no ionicos como Tween 80 o Triton X-100. Este procedimiento puede dar como resultado una excelente recuperacion de protemas labiles, p. ej., factores VIII y IX de coagulacion, mientras se consigue un alto nivel de muerte vmca, p. ej., la muerte de >106 a >108 ID, de virus envueltos; sin embargo, poca eliminacion de virus no envueltos. El documento US 4.481.189 describe la eliminacion vmca mediante un tratamiento con detergente no anionico, alcoholes, eteres o mezclas de los mismos. El documento US 4.481.189 se incorpora aqrn por referencia.

Otros procedimientos de eliminacion de virus comunmente aplicados, y aplicables en la presente invencion, a fluidos

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biologicos que se usaran en un tratamiento de transfusion pueden tambien implicar un tratamiento con calor a temperaturas de 60 °C o mas, o el tratamiento con UVC unidos solos o unidos con B-propiolactona (B-PL).

Otras realizaciones

En la presente invencion, el procedimiento implica la etapa de someter el adsorbente a un tampon de elucion (un primer tampon de elucion) para eluir al menos una de dichas una o mas protemas.

El uso de un adsorbente acoplado con un grupo funcional (ligando) segun la presente invencion, para el aislamiento de una o mas protemas a partir de una solucion protemica tal como a partir de plasma o suero u otras fuentes derivadas de la sangre pueden comprender las etapas de: (i) Proporcionar una solucion protemica que comprende una o mas protemas de plasma o suero que tienen un pH preestablecido y una fuerza ionica preestablecida, (ii) poner en contacto dicha solucion con un adsorbente, opcionalmente lavado con uno o mas tampones de equilibrado, en el que una o mas protemas de plasma o suero puede unirse reversiblemente al adsorbente o permanece no unida, (iii) lavar el adsorbente con un tampon de lavado para obtener una fraccion protemica que comprende material no unido, (iv) lavar el adsorbente con al menos un tampon de elucion para obtener al menos un eluato que comprende protema o protemas que se unen reversiblemente mediante el adsorbente, (v) someter la protema o protemas obtenidas en el tampon de elucion o la protema o protemas obtenidas en el tampon de elucion hasta el tratamiento aguas abajo adicional que puede incluir al menos una etapa de eliminacion vffica. Ademas, el ligando acoplado al adsorbente puede comprender un poffmero matriz funcionalizado que lleva una pluralidad de grupos funcionales unidos de forma covalente que comprenden un sistema de anillos aromatico o heteroaromatico y uno o mas grupos acidos que se cargan negativamente por encima de pH 4,0.

Con el fin de eliminar el material no unido, incluyendo protema o protemas no unidas, el adsorbente se somete a un tampon de lavado. En la presente invencion, una o mas protemas a aislar de la solucion protemica pueden retirarse por lavado del adsorbente con el tampon de lavado. Este lavado se realiza antes de someter el adsorbente a un tampon de elucion como se ha descrito anteriormente. En una realizacion de la presente invencion, el inhibidor de la proteinasa alfa 1 puede retirarse por lavado con el tampon de lavado como una protema no unida. Las condiciones del procedimiento, el adsorbente y el ligando podnan ser facilmente modificados por el experto en la tecnica de tal manera que una o mas protemas de suero o plasma humano (distintas del inhibidor de la proteinasa alfa 1) puedan ser retiradas por lavado con el tampon de lavado y el inhibidor de la proteinasa alfa 1 puede estar unido.

En una realizacion, el lavado y/o la elucion se pueden realizar con un tampon de lavado y/o un tampon de elucion que tiene un pH mas alto y/o una mayor fuerza ionica que el pH preestablecido y la fuerza ionica preestablecida de la solucion protemica.

Todavfa en otra realizacion, el tampon de lavado y/o el tampon de elucion pueden comprender uno o mas compuestos que tienen un grupo hidrofobo asf como un grupo con carga negativa dentro de la misma molecula, p. ej., detergente con carga negativa tal como sulfato de octilo, azul de bromofenol, sulfonato de octano, laurilsarcosinato de sodio, sulfonato de hexano, dodecilsulfato de sodio y caprilato de sodio.

Con el fin de obtener una o mas protemas adicionales del adsorbente, el procedimiento segun la presente invencion puede comprender ademas la etapa de elucion con uno o mas tampones de elucion adicionales para eluir la protema o protemas que quedan.

En el presente contexto, la expresion "tampon o tampones de elucion adicionales” se refiere al tampon o tampones utilizados posteriormente para la elucion de una o mas protemas, que permanece unida al adsorbente despues de la elucion con el primer tampon de elucion.

En el presente contexto, la expresion “protema o protemas que quedan” se refiere a una o mas protemas que permanecen unidas al adsorbente despues de ser sometidas a un primer tampon de elucion y cuya protema o protemas pueden ser posteriormente eluidas por la adicion de un tampon de elucion adicional.

En una realizacion de la presente invencion, el adsorbente puede lavarse con un tampon de lavado adicional entre cada etapa de elucion.

En el presente contexto, la expresion "fraccion protemica" se refiere a las recolecciones obtenidas del adsorbente en las que pueden estar situadas una o mas de las protemas a aislar. Esta fraccion protemica puede someterse a un tratamiento adicional aguas abajo para el aislamiento adicional de una o mas protemas presentes. El tratamiento adicional aguas abajo puede involucrar operaciones como filtracion, centrifugacion, sedimentacion, microfiltracion, precipitacion y cromatograffa. En una realizacion de la presente invencion, la cromatograffa involucra la cromatograffa de intercambio ionico, filtracion en gel, cromatograffa de afinidad, cromatograffa de interaccion hidrofoba y cromatograffa de fase inversa, donde la protema o protemas pueden unirse a un segundo adsorbente en un posterior tratamiento aguas abajo.

En una realizacion de la presente invencion, el tratamiento aguas abajo adicional puede comprender la adsorcion de la protema en la fraccion o fracciones de protemas, tal como el inhibidor de la proteinasa alfa 1, a un intercambiador de iones con carga positiva.

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En una realizacion de la presente invencion, el tratamiento aguas abajo adicional puede comprender la adsorcion de la protema en la fraccion o fracciones de protema, tal como el inhibidor de la proteinasa alfa 1, a una alquil-amina tal como una alquil-diamina tal como diamino-hexano, diamino-heptano, diamino-octano, diamino-nonano, diamino- decano y sus isomeros o derivados.

En una realizacion de la presente invencion, el inhibidor de la proteinasa alfa 1 no esta unido en la primera etapa de adsorcion y el tratamiento aguas abajo adicional comprende la adsorcion de la proteinasa alfa 1 a una alquilamina tal como una alquil-diamina tal como diamino-hexano, diamino-heptano, diamino-octano, diamino-nonano, diamino- decano o isomeros o derivados de estos.

En una realizacion de la presente invencion, el tratamiento aguas abajo adicional puede comprender la adsorcion de la protema en la fraccion protemica, tal como el inhibidor de la proteinasa alfa 1, a un adsorbente en presencia de una sal liotropica tal como, pero sin limitarse a, sulfato de amonio, sulfato de potasio, sulfato de sodio, fosfato de amonio, fosfato de potasio y citrato de sodio. En una realizacion preferida, la concentracion de sal liotropica en la solucion que comprende el inhibidor de la proteinasa alfa 1 es al menos 0,1 M, al menos 0,25 M, tal como al menos 0,5 M, al menos 0,75 M, al menos 1 M, al menos 1,25 M, al menos 1,5 M, al menos 1,75 M o al menos 2 M.

Aun en una realizacion de la presente invencion, el tratamiento aguas abajo adicional puede comprender la adsorcion de la protema en la fraccion protemica, como el inhibidor de la proteinasa alfa 1, a un adsorbente en presencia o ausencia de una sal liotropica en donde el adsorbente comprende un ligando hidrofobo tal como un ligando no cargado que comprende cadenas alqmlicas largas opcionalmente sustituidas (p. ej., grupos derivados de butilo, hexilo, octilo, decilo y dodecilo) y/o estructuras aromaticas y heteroaromaticas (p. ej., grupos derivados de fenilo, naftilo y bencimidazol). Tambien se prefieren ligandos como los descritos en el documento US 6.610.630, en donde se describen adsorbentes cromatograficos que utilizan ligandos mercapto-heterodclicos, incorporados en la presente por referencia. Otros ligandos preferidos son ligandos en modo mixto que comprenden una carga positiva a, y por debajo, de aproximadamente pH 4, tales como ligandos con carga positiva que comprenden cadenas alqmlicas largas opcionalmente sustituidas (p. ej., grupos derivados de butilo, hexilo, octilo, decilo y dodecilo) y/o estructuras aromaticas y heteroaromaticas (p. ej., grupos derivados de fenilo, naftilo y bencimidazol). Ejemplos no limitantes de tales ligandos son butilamina-, hexilamina-, octilamina-, bencilamina-y fenilbutilamina-.

En una realizacion de la presente invencion, 2 o mas protemas de la solucion protemica son aisladas por medio de una cascada de 2 o mas adsorbentes, tal como 3 adsorbentes, p. ej., 4 adsorbentes, tal como 5 adsorbentes, p. ej., 6 adsorbentes, tal como 7 adsorbentes, p. ej., 8 adsorbentes, tal como 9 adsorbentes, p. ej., 10 adsorbentes.

En una cascada de 3 adsorbentes puede ocurrir el siguiente procedimiento:

a) el primer adsorbente puede capturar una o mas protema o protemas del plasma;

b) el segundo adsorbente puede capturar una o mas protema o protemas del plasma diferentes de las una o mas protema o protemas del plasma que pueden ser capturadas por el primer adsorbente; y

c) el tercer adsorbente puede capturar una o mas o protema o protemas del plasma diferentes de las una o mas protema o protemas de plasma que pueden ser capturadas por el primer adsorbente o por el segundo adsorbente;

En una realizacion de la presente invencion, uno o mas factores de coagulacion o factores de anti-coagulacion tal como Factor II, Factor V, Factor VII, Factor VIII, Factor de von Willebrand, complejo de Factor VIII- factor de von Willebrand, Factor IX, Factor X, Factor XI, inhibidor C1, protema C y Protema S, estan unidos a un primer adsorbente. En una realizacion de la presente invencion, al menos 2 de los factores de coagulacion o anti- coagulacion se unen al adsorbente, tal como al menos 3 de los factores de coagulacion o anti-coagulacion, p. ej., al menos 4 de los factores de coagulacion o anti-coagulacion, tal como al menos 5 de los factores de coagulacion o anti-coagulacion, p. ej., al menos 6 de los factores de coagulacion o anti-coagulacion, tal como al menos 7 de los factores de coagulacion o anti-coagulacion, p. ej., 8 de los factores de coagulacion o anti-coagulacion.

En otra realizacion de la presente invencion al menos una de las protemas seleccionadas de albumina, IgG, transferrina, fibrinogeno estan unidas a un segundo adsorbente. En una realizacion de la presente invencion al menos 2 de las protemas se unen al adsorbente, tal como al menos 3 de las protemas, p. ej., 4 de las protemas.

Aun en una realizacion de la presente invencion, al menos una de las protemas, el inhibidor de la a-1-proteinasa o la a-1-glicoprotema acida, se une a un tercer adsorbente. En una realizacion de la presente invencion 2 de las protemas se unen al adsorbente.

En una realizacion adicional de la presente invencion, las protemas seleccionadas del grupo que consiste en IgG, albumina, fibrinogeno, inhibidor de la proteinasa a-1, glicoprotema a-1 acida y uno o mas de los factores de coagulacion o de anti-coagulacion tales como Factor II, Factor V, Factor VII, Factor VIII, factor de von Willebrand, complejo Factor VIII-factor de von Willebrand, factor IX, factor X, factor XI, inhibidor C1, protema C y/o protema S, estan aislados en al menos 2 fracciones protemicas individuales, tal como 3 fracciones protemicas individuales, p. ej., 4 fracciones protemicas individuales, tal como 5 fracciones protemicas individuales, p. ej., 6 fracciones protemicas individuales. Ademas, se prefiere que el grado de contaminacion cruzada de la protema individual en la

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fraccion protemica sea a lo sumo del 20%, tal como a lo sumo del 15%, p. ej., a lo sumo del 10%, tal como a lo sumo del 5%, p. ej., a lo sumo del 3%, a lo sumo del 1%, p. ej., a lo sumo del 0,5%, a lo sumo del 0,1%, p. ej., a lo sumo del 0,01%. Preferiblemente, las fracciones protemicas individuales se obtienen dentro de un unico drculo de adsorcion.

Segun la presente invencion, una o mas de las protemas a aislar pueden aislarse mediante una de las siguientes:

(i) Una o mas de las protemas a aislar pueden lavarse a traves del adsorbente sin unirse espedficamente al adsorbente recogido en el tampon de lavado.

(ii) Una o mas de las protemas a aislar pueden unirse espedficamente al adsorbente y posteriormente ser eluidas utilizando uno o mas de los tampones de elucion y ser recogidas en uno o mas de los tampones de elucion.

(iii) Una o mas de las protemas a aislar pueden ser lavadas a traves de adsorbente y otra o mas de las protemas a aislar pueden estar espedficamente unidas al adsorbente y ser recogidas en el tampon de lavado, y una o mas de la protema o protemas de interes se pueden eluir posteriormente con uno o mas tampones de elucion y ser recogidas en uno o mas de los tampones de elucion.

En una realizacion de la presente invencion, el fibrinogeno puede unirse al adsorbente y simultaneamente uno o mas de los factores de coagulacion o anti-coagulacion tales como Factor II, Factor V, Factor VII, Factor VIII, factor de von Willebrand, complejo de Factor VIII-factor de von Willebrand, Factor IX, Factor X, Factor XI, inhibidor C1, protema C y/o Protema S pueden obtenerse como material no unido desde el adsorbente. Preferiblemente, al menos el 50% del fibrinogeno puede unirse al adsorbente, tal como al menos el 60%, p. ej., al menos el 70%, tal como al menos el 80%, p. ej., al menos el 90%, tal como al menos el 95%, p. ej., al menos el 98%.

En otra realizacion de la presente invencion, albumina e IgG pueden unirse al adsorbente y simultaneamente se puede obtener inhibidor de la proteinasa a-1 como material no unido desde el adsorbente. Posteriormente, se pueden obtener albumina e IgG desde el adsorbente por elucion escalonada. Preferiblemente, al menos el 50% de la albumina puede unirse al adsorbente, tal como al menos el 60%, p. ej., al menos el 70%, tal como al menos el 80%, p. ej., al menos el 90%, tal como al menos el 95%, p. ej., al menos el 98%. Preferiblemente, al menos el 50% de la IgG puede unirse al adsorbente, tal como al menos el 60%, p. ej., al menos el 70%, tal como al menos el 80%, p. ej., al menos el 90%, tal como al menos el 95%, p. ej., al menos el 98%.

En el presente contexto, la expresion "elucion escalonada" se refiere a un cambio gradual, pero discontinuo, de las propiedades de un tampon de elucion anadido al adsorbente en terminos de, pero sin limitarse a, cambios en la fuerza ionica o en la conductividad, el pH, la polaridad, la temperatura, la concentracion de sustancias competidoras y asf sucesivamente.

En otra realizacion de la presente invencion, el fibrinogeno y la IgG pueden unirse al adsorbente y simultaneamente se puede obtener albumina como material no unido desde el adsorbente. Posteriormente, se puede obtener fibrinogeno e IgG desde el adsorbente por elucion escalonada. Preferiblemente, al menos el 50% de la IgG puede unirse al adsorbente, tal como al menos el 60%, p. ej., al menos el 70%, tal como al menos el 80%, p. ej., al menos el 90%, tal como al menos el 95%, p. ej., al menos el 98%. Preferiblemente, al menos el 50% del fibrinogeno puede unirse al adsorbente, tal como al menos el 60%, p. ej., al menos el 70%, tal como al menos el 80%, p. ej., al menos el 90%, tal como al menos el 95%, p. ej., al menos el 98%.

En otra realizacion de la presente invencion, el fibrinogeno, la albumina y la IgG pueden unirse al adsorbente y simultaneamente se puede obtener inhibidor de la proteinasa a-1 como material no unido desde el adsorbente. Posteriormente, se puede obtener fibrinogeno, albumina e IgG desde el adsorbente por elucion escalonada. Preferiblemente, al menos el 50% de la IgG puede unirse al adsorbente, tal como al menos el 60%, p. ej., al menos el 70%, tal como al menos el 80%, p. ej., al menos el 90%, tal como al menos el 95%, p. ej., al menos el 98%. Preferiblemente, al menos el 50% del fibrinogeno puede unirse al adsorbente, tal como al menos el 60%, p. ej., al menos el 70%, tal como al menos el 80%, p. ej., al menos el 90%, tal como al menos el 95%, p. ej., al menos el 98%. Preferiblemente, al menos el 50% de la albumina puede unirse al adsorbente, tal como al menos el 60%, p. ej., al menos el 70%, tal como al menos el 80%, p. ej., al menos el 90%, tal como al menos el 95%, p. ej., al menos el 98%.

En otra realizacion de la presente invencion, al menos 1, tal como al menos 2, p. ej., 3 de entre fibrinogeno, albumina e IgG pueden unirse al adsorbente y simultaneamente se puede obtener glicoprotema a-1 acida como material no unido desde el adsorbente. Posteriormente, se pueden obtener fibrinogeno, albumina y/o IgG desde el adsorbente por elucion escalonada. Preferiblemente, al menos el 50% de la IgG puede unirse al adsorbente, tal como al menos el 60%, p. ej., al menos el 70%, tal como al menos el 80%, p. ej., al menos el 90%, tal como al menos el 95%, p. ej., al menos el 98%. Preferiblemente, al menos el 50% del fibrinogeno puede unirse al adsorbente, tal como al menos el 60%, p. ej., al menos el 70%, tal como al menos el 80%, p. ej., al menos el 90%, tal como al menos el 95%, p. ej., al menos el 98%. Preferiblemente, al menos el 50% de la albumina puede unirse al adsorbente, tal como al menos el 60%, p. ej., al menos el 70%, tal como al menos el 80%, p. ej., al menos el 90%, tal como al menos el 95%, p. ej., al menos el 98%.

En otra realizacion de la presente invencion, al menos 1, tal como al menos 2, p. ej., 3 de entre fibrinogeno, albumina

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e IgG pueden unirse al adsorbente y simultaneamente se puede obtener glicoprotema a-1 acida y/o inhibidor de la proteinasa a-1 como material no unido desde el adsorbente. Posteriormente, se puede obtener fibrinogeno, albumina y/o IgG desde el adsorbente por elucion escalonada. Preferiblemente, al menos el 50% de la IgG puede unirse al adsorbente, tal como al menos el 60%, p. ej., al menos el 70%, tal como al menos el 80%, p. ej., al menos el 90%, tal como al menos el 95%, p. ej., al menos el 98%. Preferiblemente, al menos el 50% del fibrinogeno puede unirse al adsorbente, tal como al menos el 60%, p. ej., al menos el 70%, tal como al menos el 80%, p. ej., al menos el 90%, tal como al menos el 95%, p. ej., al menos el 98%. Preferiblemente, al menos el 50% de la albumina puede unirse al adsorbente, tal como al menos el 60%, p. ej., al menos el 70%, tal como al menos el 80%, p. ej., al menos el 90%, tal como al menos el 95%, p. ej., al menos el 98%.

En una realizacion de la presente invencion, al menos el 50% de inhibidor de la proteinasa a-1, albumina, IgG, fibrinogeno o uno o mas de los factores de coagulacion o de anti-coagulacion tales como Factor II, Factor V, Factor VII, Factor VIII, factor de von Willebrand, complejo de Factor VIII-factor de von Willebrand, Factor IX, Factor X, Factor XI, inhibidor de C1, protema C y/o protema S pueden obtenerse desde el adsorbente, tal como al menos el 60%, p. ej., al menos el 70%, tal como al menos el 80%, p. ej., al menos el 90%, tal como al menos el 95%, p. ej., al menos el 98%.

En una realizacion de la presente invencion, la albumina puede unirse al adsorbente y simultaneamente se puede obtener inhibidor de la proteinasa a-1 como material no unido desde el adsorbente. Preferiblemente, al menos el 50% de la albumina puede unirse al adsorbente, tal como al menos el 60%, p. ej., al menos el 70%, tal como al menos el 80%, p. ej., al menos el 90%, tal como al menos el 95%, p. ej., al menos el 98%.

En una realizacion de la presente invencion, se puede aislar el inhibidor de la proteinasa a-1 de una solucion protemica, mediante un procedimiento que comprende las etapas de (i) poner en contacto una solucion acuosa de protemas del plasma que contienen IgG, albumina e inhibidor de la a-1-proteinasa con un adsorbente de intercambio anionico en condiciones tales que la albumina y el inhibidor de la alfa-1-proteinasa se unen al adsorbente y la IgG permanece no unida, en donde la solucion protemica se selecciona del grupo que consiste en sobrenadante I previamente tratado o sobrenadante II + III previamente tratado, sobrenadante I + II + III previamente tratado; (ii) recuperar, opcionalmente, la IgG no unida para obtener una fraccion protemica rica en IgG; (iii) eluir la albumina del medio de intercambio anionico para obtener una fraccion protemica rica en albumina; y (iv) eluir del medio de intercambio anionico para obtener una fraccion protemica rica en inhibidor de a-1-proteinasa.

En una realizacion adicional de la presente invencion, la fraccion protemica no unida puede comprender la protema o protemas lavadas a traves del adsorbente, tal como el inhibidor de la a-1-proteasa, la glicoprotema a-1 acida, la albumina, la IgG o el fibrinogeno con alto rendimiento. Preferiblemente, el rendimiento sera mayor que el 70%, mas preferiblemente mayor que el 80%, mas preferiblemente mayor que el 90% del inhibidor de la alfa-1-proteasa.

Otro objetivo de la invencion es proporcionar un procedimiento en donde dichas protemas sean lavadas a traves del adsorbente, tal como el inhibidor de la a-1-proteasa, glicoprotema a-1 acida, albumina, IgG o fibrinogeno presentes con alto rendimiento en la fraccion protemica no unida puede aislarse posteriormente de la fraccion protemica no unida mediante un tratamiento aguas abajo adicional, p, ej., empleando una segunda etapa de adsorcion cromatografica.

Una realizacion de la presente invencion es proporcionar un procedimiento en donde se proporcionan multiples fracciones protemicas por cada ciclo de adsorcion tal como al menos 2 fracciones protemicas, p. ej., al menos 3 fracciones protemicas, tal como al menos 4 fracciones protemicas, p. ej., al menos 5 fracciones protemicas, tal como al menos 6 fracciones protemicas. Preferiblemente, cada una de estas fracciones protemicas comprende un alto rendimiento de las protemas individuales sin una significativa contaminacion cruzada de la fraccion o fracciones protemicas entre las al menos 2 protemas, tal como al menos 3 protemas, p. ej., al menos 4 protemas, tales como al menos 5 protemas, p. ej., al menos 6 protemas dentro de la misma fraccion protemica. En una realizacion de la presente invencion, la cantidad de contaminacion cruzada en una fraccion protemica es menor que el 20%, tal como menor que el 15%, p. ej., menor que el 10%, tal como menor que el 5%, p. ej., menor que el 3%, tal como menor que el 1%, p. ej., menor que el 0,5%, tal como menor que el 0,1%, p. ej., menor que el 0,01%.

En el presente contexto, la expresion "contaminacion cruzada" se refiere a la cantidad o contenido de protema que no interesa que esta presente en la fraccion protemica. En algunos casos tiene interes eluir dos o mas protemas simultaneamente en un cfrculo de elucion y, en este caso, las protemas intencionadamente eluidas juntas no se consideran contaminantes. En una realizacion de la presente invencion, el grado de contaminacion cruzada de la protema individual en la fraccion protemica es a lo sumo del 20%, tal como a lo sumo del 15%, p. ej., a lo sumo del 10%, tal como a lo sumo del 5%, p. ej., a lo sumo del 3%, a lo sumo del 1%, p. ej., a lo sumo del 0,5%, tal como a lo sumo del 0,1%, p. ej., a lo sumo del 0,01%.

La invencion se ilustrara adicionalmente en las siguientes figuras, artmulos y ejemplos no limitantes.

La Figura 1 ilustra el fraccionamiento escalonado global de protemas de plasma humano por adicion gradual de etanol para obtener una serie de sobrenadantes y precipitados que comprenden varias protemas de plasma humano.

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La Fig. 2 ilustra la diferencia entre una columna de adsorcion de lecho empaquetado que comprende partmulas adsorbentes estrechamente empaquetadas y una columna de adsorcion de lecho expandido que comprende partmulas adsorbentes, que son fluidizadas por un flujo ascendente de lfquido. La columna de adsorcion de lecho expandido todavfa tiene flujo en piston con un mmimo de retro-mezcla.

La Fig. 3 ilustra una SDS-PAGE del eluato de un intercambiador de iones DEAE realizado en el Ejemplo 7 y muestra que el eluato-inhibidor de la proteinasa alfa 1 del intercambiador de iones DEAE tiene un alto grado de pureza segun se estimo mediante SDS-PAGE (estimado de >80%).

La Fig. 4 ilustra la actividad de union a la elastasa en la que el carril 1 comprende la solucion protemica sin incubacion de elastasa y el carril 2 comprende la incubacion de la solucion protemica + elastasa. El experimento mostro que sustancialmente todo el inhibidor de la proteinasa alfa 1 en la solucion protemica (fraccion no unida del ejemplo 5) es activo y se une a la elastasa.

La Fig. 5 ilustra el resultado en el Ejemplo 8 que muestra un grado muy alto de pureza del eluato-inhibidor de la proteinasa alfa 1 del Ejemplo 5 utilizando bencilamina como ligando y estimado por SDS-PAGE (pureza estimada de >95%).

Ejemplos

Ejemplo 1

Separacion de albumina humana e inhibidor de alfa-1-proteasa de la fraccion de Cohn (SUP I, II, III) por adsorcion en lecho expandido.

Adsorbente

FastLine® UFC NNSDW n.° de cat. CS48, UpFront Chromatography A/S. El adsorbente se baso en agarosa con partmulas de carburo de wolframio incorporadas, la densidad de las partmulas de conglomerado era de 2,9 g/ml y el diametro de partmula estaba en el intervalo de 40-120 |im con un diametro de la partmula de volumen medio (D (4,3)) de 70 |im (determinado en el Mastersizer 2000E, Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido). El adsorbente comprendfa acido 2-mercaptonicotmico como ligando y tema una concentracion de ligando de 40 micromoles por ml de adsorbente sedimentado.

Tratamiento previo de la solucion protemica

La solucion protemica comprendfa una fraccion de Cohn, Sobrenadantes I, II, III, Conductividad 5,74 mS, pH 7,2, comprendiendo aprox. 10% de etanol.

La solucion protemica se diluyo con agua desmineralizada en una proporcion de un volumen de sobrenadantes I, II, III de Cohn, frente a 2 volumenes de agua, y el pH se ajusto a pH 5,0 con acido hidroclorico 1 M. La conductividad despues de la dilucion era de 3,8 mS.

Parametros de procedimiento

El experimento se realizo en una columna de lecho expandido FastLine® 20 (^ = 2 cm) con numero de artmulo 70200000, UpFront Chromatography A/S.

La columna se empaqueto con 50 cm de adsorbente (157 ml) y se equilibro a temperatura ambiente (20-25 °C) con 160 ml de NaOH 1 M (primer tampon de equilibrio), 400 ml de tampon de pH 4,5 de citrato de sodio 40 mM (segundo tampon de equilibrio), y 400 ml de tampon de pH 5,0 de citrato de sodio 40 mM (tercer tampon de equilibrio).

Se realizaron dos experimentos con un caudal lineal de 450 cm/h:

(i) Experimento A). En la columna se cargaron 236 ml de solucion protemica diluida

(ii) Experimento B). En la columna se cargaron 353 ml de solucion protemica diluida tres veces

Fraccion 1: El material no unido se retiro por lavado de la columna con tampon de pH 5,0, de acido cftrico 10 mM. El inhibidor de alfa-1-proteasa se recogio en la fraccion de lavado. Las protemas unidas se eluyeron posteriormente en dos etapas.

- Fraccion 2, primera etapa de elucion: se eluyo la Albumina Humana con 5 mg/ml de octanoato de sodio (caprilato de sodio), pH 6,0.

- Fraccion 3, segunda etapa de elucion: se eluyeron otras protemas, incluidas IgG y transferrina, con citrato de sodio 0,3 M, pH 7,4.

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Resultados

La siguiente tabla muestra los volumenes de solucion protemica y tampones cargados en cada columna:

Fraccion: Serie A Serie B

Primer tampon de equilibrio: 160 ml 160 ml

Segundo tampon de equilibrio: 400 ml 400 ml

Tercer tampon de equilibrio: 400 ml 400 ml

Fraccion protemica 1 Volumen de lavado (inhibidor de proteasa alfa 1): 750 ml 815 ml

Fraccion protemica 2 Elucion de albumina humana: 500 ml 520 ml

Fraccion protemica 3 Elucion de IgG y transferrina: 350 ml 390 ml

Cuantificacion del inhibidor de la alfa-1-proteasa y de la albumina humana en las fracciones 1, 2 y 3. Se realizo la Inmunodifusion Radial Simple (SRI) con el fin de cuantificar el rendimiento relativo en tanto por ciento de inhibidor de alfa-1-proteasa y albumina humana en las fracciones a partir de la columna descrita en Scand. J. Immunol. Vol. 17, Supl. 10, 41-56, 1983.

El SRI se realizo con: Inhibidor de la alfa-1-proteasa antihumana de conejo de Dako Cytomation, Dinamarca, n.° de cat. A0012 (0,6 |il por cm2) y albumina antihumana de conejo de Dako Cytomation, Dinamarca, n.° de cat. A001 (0,3 |il por cm2).

Se realizo una curva patron con la solucion protemica cargada en la columna en la concentracion de 100%, 80%, 60%, 40% y 20%. Cada una de las tres fracciones se interpreto con respecto a la curva patron.

Resultados:

La siguiente tabla muestra el rendimiento relativo en tanto por ciento de la materia prima cargada en la columna:

Determinacion del inhibidor de la alfa-1-proteasa humana

Serie: Fraccion protemica 1 - Material no unido Fraccion protemica 2 - Primer eluato Fraccion protemica 3 - Segundo eluato

Serie A: 80% 0% 0%

Serie B: 80% 0% 0%

Determinacion de albumina humana

Serie: Fraccion 1- Material no unido Fraccion 2- Primer eluato Fraccion 3 - Segundo eluato

Serie A: 0% 95% 0%

Serie B: 0% 95% 0%

Cada fraccion del experimento se ensayo con SDS-PAGE para evaluar el contenido y la naturaleza de las protemas. SDS-PAGE

Para la SDS-PAGE, se utilizo gel 4-20% de Tris-Glicina Invitrogen SDS-Page (n.° de cat. EC6025). Preparacion de la muestra: 25 |il de muestra y 25 |il de tampon de muestra tris-glicina Invitrogen (n.° de cat. LC2676) se mezclaron y se sometieron a ebullicion durante 5 minutos en un bano de agua. Se anadio tampon de migracion tris 0,024 M (Sigma T1378), glicina 0,19 M (Merck 5001901000), SDS 0,1% (dodecilsulfato de sodio, JT Baker 2811) pH 8,6.

Se aplico una muestra de 20 |il en cada franja de analisis y la corriente se ajusto para dar una intensidad de 40 mA. Cuando la lmea azul del tampon muestra alcanzo un cm desde el fondo del gel, se corto la corriente y el gel se tino durante la noche en un kit de tincion azul coloidal Invitrogen (n.° de cat. LC 6025) en una mesa de agitacion. Al dfa siguiente, el gel se transfirio a agua y se destino en agua durante 2 horas.

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Resultados:

No se pudo detectar ninguna descomposicion ni desnaturalizacion del inhibidor de la alfa-1-proteasa humana (alfa-1- PI) o de las moleculas de albumina humana por electroforesis en gel con dodecil-sodio (SDS-PAGE). Se encontro que la pureza de la albumina humana eluida era mayor del 95% segun se determino mediante SDS-PAGE.

En la fraccion 1 se recupero el alfa-1-PI

En la fraccion 2 se recupero la albumina humana unida.

En la Fraccion 3 se recuperaron la inmunoglobulina G y la transferrina unidas.

Ejemplo 2

Separacion de la albumina humana e inhibidor de alfa-1-proteasa a partir de la fraccion de Cohn (SUP I, II y III) por adsorcion en lecho expandido a diferentes valores de pH.

Adsorbente

FastLine® UFC NNSDW, n.° de cat. CS48, UpFront Chromatography A/S. Vease el ejemplo 1.

Tratamiento previo de la solucion protemica

La solucion protemica comprendfa una fraccion de Cohn Sobrenadante I, II, III, conductividad 5,74 mS, pH 7,2, que comprendfa aproximadamente 10% de etanol.

La solucion protemica se diluyo con agua desmineralizada o acetato de sodio 20 mM pH 5 en una proporcion de un volumen de sobrenadante I, II, III de Cohn frente a 5 volumenes de agua o acetato de sodio 20 mM pH 5 y el pH se ajusto a diferentes valores de pH con acido hidroclorico 1 M.

Parametros de procedimiento:

El experimento se realizo en una columna de lecho expandido FastLine® 20 (^ = 2 cm), numero de artmulo 70200000, UpFront Chromatography A/S.

Se realizaron tres experimentos con un caudal lineal de 450 cm/h. La columna estaba empaquetada con 50 cm de adsorbente (157 ml) y equilibrada a temperatura ambiente (20-25 °C) con 160 ml de NaOH 1 M (primer tampon de equilibrio), 400 ml de tampon de pH 4,5 de citrato de sodio 40 mM (segundo tampon de equilibrio) seguido de equilibrado con un tercer tampon (tercero tampon de equilibrio) que comprende:

Experimento A: 400 ml de tampon de citrato de sodio 40 mM, pH 5,0

Experimento B: 400 ml de tampon de citrato de sodio 40 mM, pH 5,3

Experimento C: 400 ml de tampon de citrato de sodio 40 mM pH 5,5

Se ajustaron 240 ml de solucion protemica diluida con HCl 1 M para:

Experimento A: pH 5,0, conductividad = 2,16 mS

Experimento B: pH 5,3, conductividad = 2,27 mS

Experimento C: pH 5,5, conductividad = 2,29 mS

Despues de ajustar el pH, se cargo la solucion protemica en la columna.

Fraccion 1: El material no unido se retiro por lavado con tampon pH 5,0 de citrato de sodio 10 mM. El inhibidor alfa- 1-proteasa se recogio en la fraccion de lavado de la columna.

Las protemas unidas se eluyeron en dos etapas.

- Fraccion 2, primera etapa de elucion: la albumina humana se eluyo con caprilato de sodio 5 mg/ml, pH 6.

- Fraccion 3, segunda etapa de elucion: se eluyeron otras protemas, incluidas la IgG y la transferrina, con citrato de sodio 0,3 M, pH 7,4.

Resultados

La tabla siguiente muestra los volumenes de solucion protemica y tampones cargados en cada columna:

Cuantificacion del inhibidor de alfa-1-proteasa y albumina humana en las fracciones 1, 2 y 3

Fraccion: Serie A Serie B Serie C

Primer tampon de equilibrio: 160 ml 160 ml 160 ml

Segundo tampon de equilibrio(2: 400 ml 400 ml 400 ml

Tercer tampon de equilibrio: 400 ml 400 ml 400 ml

Volumen de solucion protemica: 240 ml 240 ml 240 ml

Fraccion: Serie A Serie B Serie C

Fraccion protemica 1: 640 ml 640 ml 685 ml

Volumen de fraccion de lavado (inhibidor alfa-1-proteasa)

Fraccion protemica 2 - Elucion de albumina humana: 490 ml 430 ml 360 ml

Fraccion protemica 3 - Elucion de trazas de IgG and transferrina humanas: 250 ml 210 ml 200 ml

Se realizo Inmunodifusion Radial Simple (SRI) con el fin de cuantificar el rendimiento relativo en tanto por ciento de inhibidor de la alfa-1-proteasa y albumina humana en las fracciones de la columna (vease el ejemplo 1)

Resultados:

5 La siguiente tabla muestra el rendimiento relativo en tanto por ciento de la solucion protemica cargada en la columna:

Determinacion del inhibidor de la alfa-1-proteasa

Serie A: 60% 0% 0%

Serie B: 80% 0% 0%

Serie C: Sin datos Sin datos Sin datos

Determinacion de albumina humana

Serie A: 0% 95% 0%

Serie B: 20% 80% 0%

Serie C: Sin datos Sin datos Sin datos

Cada fraccion del experimento se ensayo con SDS-PAGE para evaluar el contenido y la naturaleza de las protemas.

10 SDS-PAGE (Vease el experimento 1)

Resultados:

No se pudo detectar ninguna descomposicion ni desnaturalizacion de las moleculas del inhibidor de la alfa-1- proteasa o de la albumina por SDS-PAGE. Se encontro que la pureza de la albumina humana eluida era mayor del 95% segun se determino mediante SDS-PAGE.

15 Ejemplo 3

Aislamiento del inhibidor de la alfa-1-proteasa a partir de la fraccion no unida obtenida en el ejemplo 1.

Adsorbente

Intercambiador de iones FastLine® DEAE n.° de cat. CS62, UpFront Chromatography A/S. El adsorbente se baso en

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agarosa con partmulas de carburo de wolframio incorporadas, la densidad de las partmulas de conglomerado era de 2,9 g/ml y el diametro de partmula estaba en el intervalo de 40-120 |im con un diametro medio de partmula de 70 |im. El adsorbente comprend^a grupos dietilaminoetilo (DEAE) como ligando y una concentracion de ligando de 150 micromoles por ml de adsorbente sedimentado.

Solucion protemica

La fraccion protemica 1 (el material no unido) a partir de la separacion de albumina e inhibidor de la proteinasa alfa 1 como se describe en el ejemplo 1, experimento A. El pH en la fraccion protemica se ajusto a pH 8,2 con NaOH 1M. La conductividad en adelante era de 6,16 mS.

Parametros de procedimiento

El experimento se realizo en columnas Poly-Prep, numero de artmulo 731-1550, BioRad.

La columna se empaqueto con 1 ml de intercambiador de iones y se equilibro a temperatura ambiente (20-25 °C) durante 30 minutos con 5 ml de fosfato de potasio 1M, pH 8,2. Despues de la incubacion, el intercambiador de iones se lavo con 10 ml de fosfato de potasio 10 mM, pH 8,2.

Se ajustaron 30 ml de la fraccion protemica a pH 8,2 y se cargaron en la columna, y las fracciones ejecutadas se recogieron en fracciones de 5 ml. Despues de la carga de la fraccion protemica la columna se lavo con 10 ml de fosfato de potasio 10 mM, pH 8,2.

El inhibidor de la alfa-1-proteasa unida se eluyo con fosfato de potasio 10 mM + NaCl 1M hasta pH 8,2.

Resultados

La siguiente tabla muestra los volumenes de materia prima y tampones cargados en la columna:

Cuantificacion del inhibidor de la alfa-1-proteasa humana

Fraccion: 10

: 30 ml

Fraccion protemica

Volumen de fracciones ejecutadas: 6 x 5 ml

Fraccion de lavado: 10 ml

Inhibidor de alfa-1-proteasa, eluato: 10 ml

Se realizo Inmunodifusion Radial Simple (SRI) con el fin de cuantificar el rendimiento relativo en tanto por ciento de inhibidor de la alfa-1-proteasa en las fracciones de la columna segun se describe en Scand. J. Immunol. Vol. 17, Supl. 10, 41-56, 1983.

La RDI se realizo con: Inhibidor de la proteasa alfa-1 anti-humana de conejo de Dako Cytomation, Dinamarca, n.° de cat.: A0012 (0,6 |il por cm2).

Se realizo una lmea estandar con la fraccion protemica cargada en la columna en concentraciones de 100%, 80%, 60%, 40% y 20%. Cada una de las fracciones se interpreto con respecto a la curva patron.

Resultados:

La tabla siguiente muestra el rendimiento relativo del inhibidor de la alfa-1-proteasa en tanto por ciento de la fraccion protemica cargada en la columna:

Determinacion del inhibidor de la alfa-1-proteasa humana

Fraccion: Rendimiento relativo

Fraccion protemica 1 ejecutada: 0%

Fraccion protemica 2 ejecutada: 0%

Fraccion protemica 3 ejecutada: 0%

Fraccion protemica 4 ejecutada: 0%

Fraccion protemica 5 ejecutada: 0%

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Fraccion protemica 6 ejecutada: 0%

Lavado: 0%

Eluato: 80%

De este modo, no se encontro inhibidor de alfa-1-proteasa en las fracciones protemicas no unidas, mientras que se encontro en el eluato un 80% del inhibidor de alfa-1-proteasa cargado en la columna.

Ejemplo 4

Adsorcion en lecho expandido del inhibidor de la proteinasa alfa 1.

El ejemplo 3 se repitio esta vez utilizando, sin embargo, una columna de adsorcion en lecho expandido que utiliza el mismo adsorbente de intercambio ionico a una altura de lecho sedimentado de 5 cm y un caudal lineal de 5 cm/min.

De nuevo se encontro que no se hallaba en la fraccion no unida inhibidor de la alfa-1-proteasa, mientras que el 80% del inhibidor de la alfa-1-proteasa cargado en la columna se encontraba en el eluato.

Ejemplo comparativo 5

Aislamiento de protemas del plasma humano a partir de plasma humano utilizando adsorcion en lecho expandido con un caudal de 450 cm/h.

Adsorbente

FastLine® UFC NNSDW n.° de cat. CS48, UpFront Chromatography A/S. El adsorbente se baso en agarosa con partmulas de carburo de wolframio incorporadas, la densidad de las partmulas de conglomerado era de 2,9 g/ml y el diametro de partmula estaba en el intervalo de 40-120 |im con un diametro medio de partmula de 70 |im. El adsorbente comprendfa acido 2-mercaptonicotmico como ligando y una concentracion de ligando de 40 micromoles por ml de adsorbente sedimentado.

Tratamiento previo de la solucion protemica

La solucion protemica se diluyo con agua desmineralizada en una proporcion de un volumen de plasma humano frente a 2 volumenes de agua y el pH se ajusto a pH 5,0 con acido hidroclorico 1 M. La conductividad era a continuacion de 5,25 mS/cm2.

Parametros de procedimiento:

La columna se cargo con adsorbente para alcanzar una altura de lecho sedimentado (Ho) de 50 cm (correspondiente a 157 ml de adsorbente) y se lavo y se equilibro a 20-25 °C con los siguientes tampones en orden sucesivo 1) 160 ml de NaOH 1 M, 2) 400 ml de tampon de pH 4,53 de acido cftrico 40 mM y 3) 400 ml de tampon de pH 5,0 de acido cftrico 40 mM.

El experimento se realizo con un caudal lineal de 450 cm/h en todas las etapas y la salida de la columna se conecto a un monitor y registrador de UV.

Muestra:

En la columna se cargaron 120 ml de solucion protemica (correspondientes a 40 ml de plasma sin diluir).

Recogida de Fracciones:

Despues de la carga de la solucion protemica, el material no unido y el debilmente unido se retiraron por lavado de la columna con citrato de sodio 10 mM, pH 5,0.

La fraccion 1 (fraccion no unida) se recogio como una fraccion segun la monitorizacion UV del efluente de la columna.

Posteriormente, las protemas unidas se eluyeron en tres etapas secuenciales.

- Fraccion 2 - primera etapa de elucion, se realizo con caprilato de sodio 5 mg/ml, pH 6,0.

- Fraccion 3 - segunda etapa de elucion, se realizo con citrato de sodio 0,3 M, pH 7,4.

- Fraccion 4 -tercera etapa de elucion, se realizo con citrato de sodio 20 mM + NaCl 0,1 M, pH 7,4.

Entre la primera y la segunda etapa de elucion, la columna se lavo brevemente con 1 volumen de columna de citrato de sodio 1 M, pH 7,4.

Resultados

La siguiente tabla muestra los volumenes de cada fraccion:

Cuantificacion de las protemas de plasma humano, fracciones 1,2, 3 y 4 de la columna

Fraccion: Serie

Tampon de equilibrio(1: 160 ml

Tampon de equilibrio(2: 400 ml

Tampon de equilibrio(3: 400 ml

Fraccion protemica 1 - Protemas no unidas y lavado: 900 ml

Fraccion protemica 2: 550 ml

Fraccion protemica 3: 560 ml

Fraccion protemica 4: 370 ml

Se realizo Inmunodifusion Radial Simple (ISR) con el fin de mostrar los componentes en cada fraccion de la columna como se describe en Scand. J. Immunol. Vol. 17, Supl. 10, 41-56, 1983.

La SRI se realizo con los siguientes anticuerpos, todos de Dako Cytomation, Dinamarca:

Anticuerpo: Codigo n.° il de muestra/pocillo il por cm2

Albumina antihumana de conejo: A 0001 5 |il 0,30 il por cm2

IgG antihumana de conejo: A 0424 5 |il 0,30 il por cm2

Alfa-1-PI antihumano de conejo: A 0012 5 |il 0,60 il por cm2

Fibrinogeno antihumano de conejo: A 0080 5 il 0,40 il por cm2

Haptoglobina antihumana de conejo: A 0030 15 il 0,45 il por cm2

Globulina GC antihumana de conejo: A 0021 15 il 0,60 il por cm2

IgM antihumana de conejo: A 0426 15 il 0,40 il por cm2

IgA antihumana de conejo: A 0092 15 il 0,50 il por cm2

Macroglobulina alfa-2 antihumana de conejo: A 0033 15 il 0,40 il por cm2

Orosomucoide antihumana de conejo: A 0011 5 il 0,80 il por cm2

Transferrina antihumana de conejo: A 0061 5 il 0,30 il por cm2

Prealbumina antihumana de conejo: A 0002 15 il 0,75 il por cm2

Antitrombina III antihumana de conejo: A 0296 25 il 0,50 il por cm2

Se establecio una curva patron con la solucion protemica (el 100%, de referencia) cargada en la columna en la concentracion de 100%, 80%, 60%, 40% y 20%. Cada una de las cuatro fracciones se determino en relacion con esta curva patron.

Resultados

La siguiente tabla muestra el rendimiento relativo de cada protema humana en las 4 fracciones de la columna:

: Fraccion protemica 1 Material no unido Fraccion protemica 2 Fraccion protemica 3 Fraccion protemica 4

Albumina humana: - 100% - -

IgG humana: - - 95% 5%

Alfa-1-PI humana: 90% - - -

Fibrinogeno humano: - - 20% 60-80%

Haptoglobina humana: 40% 40% 20% -

Globulina GC humana: - 100% - -

IgM humana: - - 80% -

IgA humana: 10% 20% 70% -

Macroglobulina alfa-2 humana: - 40% 40% -

Orosomucoide humana: 100% - -

Transferrina humana: - - 100% -

Prealbumina humana: 40% - - -

Antitrombina III humana: - 80% - -

"-" = rendimiento relativo inferior al 5%

Ejemplo comparativo 6

Aislamiento de protemas de plasma humano a partir de plasma humano tratado con etanol utilizando adsorcion en lecho expandido con un caudal de 450 cm/h.

Adsorbente

5 FastLine® UFC NNSDW n.° de cat. CS48, UpFront Chromatography A/S. El adsorbente se baso en agarosa con

partmulas de carburo de wolframio incorporadas, la densidad de las partmulas de conglomerado era de 2,9 g/ml y el diametro de partmula estaba en el intervalo de 40-120 |im con un diametro medio de partmula de 70 |im. El adsorbente comprend^a acido 2-mercaptonicotmico como ligando y una concentracion de ligando de 40 micromoles por ml de adsorbente sedimentado.

10 Tratamiento previo de la solucion protemica

El plasma humano se ajusto a 8% de etanol en volumen con etanol del 99% a -3 °C y se incubo a -3 °C durante 1,5 horas. Despues de la incubacion, el plasma se centrifugo durante 10 minutos. El sobrenadante se diluyo en agua desmineralizada en una proporcion de 1 parte de plasma frente a dos partes de agua y el pH se ajusto a pH 5,0 con acido hidroclorico 1 M. La conductividad era a continuacion de 4,16 mS/cm2

15 Parametros del procedimiento, volumen de la muestra y fracciones

Todos los parametros y condiciones del procedimiento fueron identicos a los aplicados en el ejemplo comparativo 5.

Resultados

La siguiente tabla muestra los volumenes de cada fraccion:

Cuantificacion de las fracciones 1, 2, 3 y 4 de las protemas de plasma humano a partir de la columna.

20 El Analisis por SRI se realizo como en el ejemplo comparativo 5.

Fraccion: Serie

Tampon de equilibrio(1: 160 ml

Tampon de equilibrio(2: 400 ml

Tampon de equilibrio(3: 400 ml

Fraccion protemica 1 Protemas no unidas y lavadas: 900 ml

Fraccion protemica 2: 530 ml

Fraccion protemica 3: 570 ml

Fraccion: Serie

Fraccion protemica 4: 250 ml

Resultados

La siguiente tabla muestra el rendimiento de cada protema humana en las 4 fracciones de la columna con relacion a la cantidad total de la protema aplicada a la columna:

Albumina humana: - 100% - -

IgG humana: - - 95% 5%

Alfa-1-PI humana: 90% - - -

Fibrinogeno humano: - - 20% 60%

Haptoglobina humana: 40% 40% 20% -

Globulina GC humana: - 100% - -

IgM humana: - - 60% -

IgA humana: 10% 20% 60% -

Macroglobulina alfa-2 humana: - 50% 20% -

Orosomucoide humana: 100% - -

Transferrina humana: - - 100% -

Prealbumina humana: 40% 20%- - -

Antitrombina III humana: - 80% - -

"-" = rendimiento relativo inferior al 5%

Ejemplo comparativo 7

5 Aislamiento del inhibidor de la alfa-1-proteasa humana (API) a partir de la fraccion no unida del ejemplo comparativo 5.

Adsorbente

Intercambiador de iones FastLine® DEAE n.° de cat. CS62, UpFront Chromatography A/S.

El intercambiador de iones se baso en agarosa al 4% con partmulas de carburo de wolframio incorporadas. Los 10 granulos de conglomerado teman una densidad de aproximadamente 2,9 g/ml y un tamano de partmula en el

intervalo de 40-120 |im con un tamano medio de partmula (diametro) de 70 |im. El adsorbente comprendfa grupos

DEAE (dietilaminoetil-) y una concentracion de aprox. 150 milimoles por litro de adsorbente sedimentado

Solucion protemica

El material de partida para este experimento era la fraccion protemica 1 (el material no unido) obtenida del

15 aislamiento de protemas de plasma humano utilizando adsorcion en lecho expandido como se describe en el

ejemplo comparativo 5. El pH en la fraccion protemica se ajusto cuidadosamente a pH 8,2 con NaOH 1M. La conductividad era de aqrn en adelante 5,15 mS/cm2

Parametros del procedimiento:

El experimento se realizo como experimentos en lecho empaquetado en columnas Poly-Prep, numero de artmulo 20 731-1550, BioRad, EE.UU.

Todas las etapas se realizaron a un caudal de 1 ml/minuto.

La columna se empaqueto con 1 ml de intercambiador de iones DEAE y se equilibro, a 20-25 °C, con 5 ml de K2HPO41M ajustado a pH 8,2 con NaOH 1M. Despues del equilibrado, el intercambiador de iones se lavo con 10 ml de fosfato de potasio 10 mM pH 8,2.

5

10

15

20

25

30

Se cargaron 50 ml de la materia prima (material no unido) en fracciones de 10 de K2HPO410 mM, ajustado a pH 8,2

Despues de cargar y lavar, el inhibidor potasio 10 mM + NaCl 1 M, pH 8,2.

Resultados

Cuantificacion de la alfa-1-PI humano de la columna

ajustada a pH 8,2 en la columna y se recogieron las fracciones ejecutadas ml. Despues de la carga de la materia prima, la columna se lavo con 10 ml

de la proteinasa alfa 1 unida (alfa-1-PI) se libero y se eluyo con fosfato de

Fraccion: Volumen

Fraccion protemica: 50 ml

Fracciones ejecutadas: 5 x 10 ml

Fraccion de lavado: 10 ml

Alfa-1-PI humano, eluato: 10 ml

Se realizo Inmunodifusion Radial Simple (SRI) para cuantificar la concentracion relativa de alfa-1-PI en las fracciones de la columna como se describe en Scand. J. Immunol. Vol. 17, Supl. 10, 41-56, 1983.

La SRI se realizo con API anti-humana de conejo de Dako Cytomation, Dinamarca, n.° de cat. A0012 (0,6 |il por

cm2).

Se realizo una curva patron con la fraccion protemica (la de 100% de referencia) cargada en la columna en la concentracion de 100%, 80%, 60%, 40% y 20%. La concentracion de alfa-1-PI en cada una de las fracciones se determino frente a la curva patron y el rendimiento relativo en esa fraccion se calculo a partir del volumen de la fraccion con respecto al volumen y concentracion de alfa-1-PI en la fraccion protemica aplicada.

Resultados

La tabla siguiente muestra el rendimiento relativo en tanto por ciento de la alfa-1-PI total cargada en la columna: Determinacion del alfa-1-PI humano (inhibidor de la proteinasa alfa 1)

Fraccion

Fraccion protemica 1 ejecutada: 0%

Fraccion protemica 2 ejecutada: 0%

Fraccion protemica 3 ejecutada: 0%

Fraccion protemica 4 ejecutada: 5%

Fraccion protemica 5 ejecutada: 7%

Lavado: <5%

Eluato: 85%

Pureza del eluato y demostracion de la actividad de union a la elastasa.

SDS-PAGE

Para la SDS-PAGE, se utilizo gel de 4-20% de Tris-Glicina Invitrogen SDS-Page (n.° de cat. EC6025).

La demostracion de la actividad de union a la elastasa del alfa-1-PI en la fraccion protemica (fraccion 1, ejemplo comparativo 5) se realizo analizando la fraccion protemica con SDS-PAGE antes y despues de la incubacion con elastasa (codigo n.° E0127 de Sigma). La fraccion protemica se ajusto a pH 7 con NaOH 0,2 M y a 500 |il de la fraccion protemica se anadieron 6,5 |il de elastasa 2,5 mg/ml y se incubaron durante 30 min a 30 °C

Preparacion de la muestra: 25 |il de muestra y 25 |il de tampon muestra de Tris-glicina Invitrogen (n.° de cat. LC2676) se mezclaron y se sometieron a ebullicion durante 5 minutos en un bano de agua. Se anadio el tampon de migracion tris (Sigma T1378) 0,024 M, glicina 0,19 M (Merck 5001901000), SDS al 0,1% (dodecilsulfato de sodio, JT Baker 2811), pH 8,6.

5

10

15

20

25

30

35

Se aplico una muestra de 20 |il en cada franja de analisis y se ajusto la corriente para que diera una intensidad de 40 mA. Cuando la lmea azul del tampon muestra alcanzo un cm desde el fondo del gel, se corto la corriente y el gel se tino durante la noche en un kit de tincion de azul coloidal Invitrogen (n.° de cat. LC 6025) en una mesa de agitacion. Al dfa siguiente, el gel se transfirio al agua y se destino en agua durante 2 horas.

Resultados

El resultado mostro que el eluato de alfa-1-PI del intercambiador de iones DEAE tiene un alto grado de pureza segun se estimo mediante SDS-PAGE (estimado en >80%). Vease tambien la fig. 3.

Ademas, el resultado tambien mostro que sustancialmente todo el inhibidor de la proteinasa alfa 1 en la fraccion protemica (fraccion no unida del ejemplo comparativo 5) era activo y capaz de unirse a la elastasa. Vease tambien la fig. 4

Ejemplo comparativo 8

Aislamiento de la API humana y de la orosomucoide humana (alfa-1-glicoprotema acida) de la fraccion no unida en el ejemplo comparativo 5.

Adsorbente

Tamano de partmula (diametro) en el intervalo de 80-150 |im. Los adsorbentes basados en granulos de agarosa al 6% se entrecruzaron y se activaron con epiclorhidrina antes del acoplamiento de los siguientes ligandos:

Experimento n.° Ligando

1 2-hidroxi-piridina (45 micromoles/ml adsorbente)

2 4-bencil-oxifenol (40 micromoles/ml adsorbente)

3 2-amino-piridina (40 micromoles/ml adsorbente)

4 1,8-diamino-octano (50 micromoles/ml adsorbente)

5 Bencilamina (35 micromoles/ml adsorbente)

6 2,5-dimercapto-1,3,4-tiadiazol (65 micromoles/ml adsorbente)

7 N-octilamina (70 micromoles/ml adsorbente)

Solucion protemica

Fraccion protemica 1 (el material no unido) a partir del aislamiento de protemas del plasma humano utilizando la absorcion en lecho expandido del ejemplo comparativo 5. A la fraccion protemica se anadio sulfato de amonio hasta una concentracion final de sulfato de amonio 2 M seguido por un ajuste cuidadoso a pH 8,2 con NaOH 1 M.

Parametros del procedimiento

Los experimentos se realizaron como adsorcion en lecho empaquetado en columnas Poly-Prep, numero de artmulo 731-1550, BioRad, EE.UU. El caudal era de 1 ml/min en todas las etapas.

Cada una de las columnas estaba empaquetada con 1 ml de adsorbente y el adsorbente se lavo en la columna sucesivamente con 1) 5 ml de agua desmineralizada y 2) 4 ml de sulfato de amonio 2 M, pH 8,2.

Se cargaron 15 ml de fraccion protemica en cada columna y las fracciones ejecutadas (material no unido) se recogieron en dos fracciones. Despues de la carga de la fraccion protemica, las columnas se lavaron sucesivamente con 1 5 ml de sulfato de amonio 2 M, pH 8,2, 1 5 ml de sulfato de amonio 1 M, pH 8,2. Despues del lavado, el adsorbente se eluyo con 10 ml de tampon de fosfato de potasio 10 mM pH 8,2 + NaCl 0,1 M (excepto para el experimento 5, donde el pH del tampon era de pH 5,0). Las fracciones de lavado y elucion se recogieron como fracciones individuales para analisis.

Resultados

La tabla siguiente muestra el volumen de la fraccion protemica cargada en las columnas asf como el volumen de las fracciones recogidas durante el experimento 1-7:

5

10

15

20

25

Cuantificacion de la alfa-1-PI humana y la orosomucoide humana (alfa-1-glicoprotema acida) del experimento 1 al 7

Fraccion protemica aplicada: Fraccion protemica 1 ejecutada Fraccion protemica 1 ejecutada Lavado 1 Lavado 2 Eluato

15 ml: 5 ml 10 ml 5 ml 5 ml 10 ml

Se realizo Inmunodifusion Radial Simple (SRI) con el fin de cuantificar la concentracion relativa en tanto por ciento de protemas espedficas en las fracciones obtenidas como se describe en Scand. J. Immunol. Vol. 17, Supl. 10, 4156, 1983.

La SRI se realizo con los siguientes anticuerpos:

- Alfa-1-PI antihumano de conejo, Dako Cytomation, Dinamarca, n.° de cat. A0012 (0,6 |il por cm2),

- Orosomucoide antihumana de conejo, Dako Cytomation, Dinamarca, n.° de cat. A0011 (0,8 |il por cm2)

Se realizo una curva patron con la fraccion protemica cargada en la columna (no diluida = la referencia del 100%) en la concentracion de 100%, 80%, 60%, 40% y 20%. La concentracion relativa de las protemas espedficas en las fracciones recogidas se determino frente a la curva patron. El rendimiento relativo de las protemas espedficas en cada fraccion se calculo a partir del volumen de la fraccion con respecto a la cantidad total de la protema aplicada a la columna.

Determinacion de la pureza de alfa-1-PI eluida (inhibidor de la proteinasa alfa 1) con SDS-PAGE

Para la SDS-PAGE, se utilizo gel 4-20% de Tris-Glicina de Invitrogen SDS-Page (n.° de cat. EC6025).

Preparacion de la muestra: Se mezclaron 25 |il de muestra y 25 |il de tampon muestra Tris-glicina Invitrogen (n.° de cat. LC2676) y se sometieron a ebullicion durante 5 minutos en un bano de agua. Se anadio tampon de migracion 0,024 M tris (Sigma T1378), 0,19 M glicina (Merck 5001901000), SDS al 0,1% (dodecilsulfato de sodio, JT Baker 2811) pH 8,6.

Se aplico una muestra de 20 |il en cada franja de analisis y la corriente se ajusto para dar una intensidad de 40 mA. Cuando la lmea azul del tampon muestra alcanzo un cm desde el fondo del gel, se corto la corriente y el gel se tino durante la noche en un kit de tincion azul coloidal Invitrogen (n.° de cat. LC 6025) en una mesa de agitacion. Al dfa siguiente, el gel se transfirio al agua y se destino en agua durante 2 horas.

Resultados

La siguiente tabla muestra el rendimiento relativo de protema en cada fraccion en tanto por ciento de la cantidad total aplicada a la columna.

Determinacion de alfa-1-PI humana y de Orosomucoide humana (alfa-1-glicoprotema acida). Rendimiento respecto a

la cantidad total de protema aplicada

Experimento n.°: Fraccion 1 ejecutada Fraccion 2 ejecutada Lavado 1 Lavado 2 Eluato

Ligando: 2-hidroxi-piridina

1: alfa-1-PI - - - 60% 40%

Orosomucoide: 20% 80% - - -

Ligando: 4-bencil-oxifenol

2: alfa-1-PI - - - - 30%

Orosomucoide: - - - - 60%

Ligando: 2-amino-piridina

3: alfa-1-PI 40% 60% - - -

Orosomucoide: 40% 60% - - -


: Ligando: 1,8-diamino-octano

4: alfa-1-PI - 20% - 20% -

Orosomucoide: 40% 60% - - -

Ligando: bencilamina

5: alfa-1-PI - - - - 60%

Orosomucoide: 20% 25% - 60% -

Ligando: 2,5-dimercapto-1,3,4- tiadiazol

6: alfa-1-PI - - - - 90%

Orosomucoide: 15 40 - 40 -

Ligando: N-octilamina

7: alfa-1-PI - - - - -

Orosomucoide: - - - - -

"-" = rendimiento relativo inferior a 5%.

Tratamiento adicional aguas abajo

Concentracion del eluato del experimento 5 (bencilamina como ligando) por ultrafiltracion seguida de dos etapas de inactivacion vmca: 1) tratamiento con disolvente-detergente y 2) filtracion vmca (nanofiltracion) proporcionan un producto adecuado para uso terapeutico.

5 Ejemplo comparativo 9

Aislamiento del API humano y de la orosomucoide humana (alfa-1-glicoprotema acida).

Adsorbente

El tamano de partmula (diametro) estaba en el intervalo de 80-150 |im. Los adsorbentes se basaron en granulos de agarosa al 6% entrecruzados y activados con epiclorhidrina antes del acoplamiento de los siguientes ligandos:

Experimento n.°: Ligando

1: 2-hidroxi-piridina, (45 micromoles/ml adsorbente)

2: 4-bencil-oxifenol, (40 micromoles/ml adsorbente)

3: 2,5-dimercapto-1,3,4-tiadiazol, (65 micromoles/ml adsorbente)

10 Solucion protemica

Parametros del procedimiento

15 Los experimentos se realizaron como adsorcion en lecho empaquetado en columnas Poly-Prep, numero de artmulo 731-1550, BioRad, EE.UU. El caudal era de 1 ml/min en todas las etapas.

Cada una de las columnas estaba empaquetada con 1 ml de adsorbente y el adsorbente se lavo en la columna sucesivamente con 1) 5 ml de agua de intercambio ionico y 2) 4 ml de sulfato de amonio 2 M pH 8,2.

Se cargaron 75 ml de fraccion protemica en cada columna y se recogieron las fracciones ejecutadas en cinco

5

10

15

20

25

fracciones de 15 ml cada una.

Experimento 1 y 2: Despues de la carga de la fraccion protemica, las columnas se lavaron con 5 ml de sulfato de amonio 2 M pH 8,2 y se eluyeron con 10 ml de tampon fosfato de potasio 10 mM pH 8,2, NaCl 0,1 M.

Experimento 3: Despues de la carga de la fraccion protemica, la columna se lavo sucesivamente con 1) 5 ml de sulfato de amonio 2 M pH 8,2 2) 5 ml de sulfato de amonio 1 M pH 8,2. Despues del lavado, el adsorbente se eluyo con 10 ml de tampon de fosfato de potasio 10 mM, pH 8,2, NaCl 0,1 M.

Resultados

La siguiente tabla muestra los volumenes de la fraccion protemica y los tampones cargados en las columnas en el experimento 1-3

Experimento: Fraccion protemica Fracciones protemicas 1-5 ejecutadas Lavado 1 Lavado 2 Eluato

1: 75 ml 15 ml 5 ml No realizado 10 ml

2: 75 ml 15 ml 5 ml No realizado 10 ml

3: 75 ml 15 ml 5 ml 5 ml 10 ml

Se realizo Inmunodifusion Radial Simple (SRI) con el fin de cuantificar la concentracion en tanto por ciento de protemas espedficas en las fracciones obtenidas de las columnas con relacion a la fraccion protemica como se describe en Scand. J. Immunol. Vol. 17, Supl. 10, 41-56, 1983.

La SRI se realizo con los siguientes anticuerpos monoespedficos:

- Alfa-1-PI antihumana de conejo, DakoCytomation, Dinamarca, n.° de cat. A0012 (0,6 |il por cm2),

- Orosomucoide antihumana de conejo, DakoCytomation, Dinamarca, n.° de cat. A0011 (0,8 |il por cm2)

Se realizo una curva patron con la fraccion protemica cargada en la columna (no diluida = la referencia del 100%) en la concentracion de 100%, 80%, 60%, 40% y 20%. La concentracion relativa de las protemas espedficas en las fracciones recogidas se determino frente a la curva patron. El rendimiento relativo de las protemas espedficas en cada fraccion se calculo a partir del volumen de la fraccion en relacion con la cantidad total de la protema aplicada a la columna.

Resultados

La siguiente tabla muestra el rendimiento relativo de alfa-1-PI y orosomucoide (glicoprotema alfa 1 acida) en cada fraccion en tanto por ciento de la cantidad total aplicada a la columna.

Experimento-1: Ligando: 2-hidroxi-piridina

: alfa-1-PI Orosomucoide

Fraccion protemica 1 ejecutada: 2% 12%

Fraccion protemica 2 ejecutada: 4% 16%

Fraccion protemica 3 ejecutada: 6% 16%

Fraccion protemica 4 ejecutada: 8% 16%

Fraccion protemica 5 ejecutada: 10% 16%

Lavado 1: 0% 16%

Lavado 2: N.R. N.R.

Eluato: 80% 0%

Experimento-2: Ligando: 4-bencil-oxi-fenol

: alfa-1-PI Orosomucoide

Fraccion protemica 1 ejecutada: 0% 0%

Fraccion protemica 2 ejecutada: 0% 0%

Fraccion protemica 3 ejecutada: 1% 4%

Fraccion protemica 4 ejecutada: 2% 6%

Fraccion protemica 5 ejecutada: 4% 8%

Lavado 1: 0% 0%

Lavado 2: N.R. N.R.

Eluato: 80% 60%

Experimento-3: (Mimo CS) Ligando: 2,5-dimercapto-1,3,4- tiadiazol

: alfa-1-PI Orosomucoide

Fraccion protemica 1 ejecutada: 1% 8%

Fraccion protemica 2 ejecutada: 2% 12%

Fraccion protemica 3 ejecutada: 2% 12%

Fraccion protemica 4 ejecutada: 8% 16%

Fraccion protemica 5 ejecutada: 10% 16%

Lavado 1: 0% 0%

Lavado 2: 20% 0%.

Eluato: 50% 0%

"N.R." = No realizado

Ejemplo comparativo 10

Aislamiento de los factores de coagulacion y de anti-coagulacion del plasma humano en bruto por adsorcion en 5 lecho expandido.

Adsorbente

El adsorbente se baso en granulos de agarosa con partmulas de carburo de wolframio incorporadas, la densidad de las partmulas del conglomerado era de 2,9 g/ml y el diametro de partmula estaba en el intervalo de 40-120 |im con un diametro medio de partmulas de 70 |im. El adsorbente se activo y se entrecruzo con epiclorhidrina y se acoplo 10 con el ligando p-xililendiamina (la concentracion final del ligando era de 25 micromoles por ml de adsorbente sedimentado).

Tratamiento previo de la solucion protemica

El plasma humano en bruto (plasma patron citratado) se ajusto a pH 6,7 con acido acetico 1 M. La conductividad era de aqrn en adelante 11,5 mS/cm2

15 Parametros del procedimiento

El experimento se realizo en una columna de lecho expandido FastLine® 10 (^ = 1 cm), numero de artmulo 70100000, UpFront Chromatography A/S.

La columna se cargo con adsorbente hasta alcanzar una altura de lecho sedimentado (H0) de 25 cm (correspondiente a aprox. 20 ml de adsorbente sedimentado) y se lavo y equilibro a 20-25 °C con tampon de citrato 20 de sodio 20 mM, pH 6,7.

5

10

15

20

25

El experimento se realizo con un caudal lineal de 300 cm/h en todas las etapas y la salida de la columna se conecto a un monitor y registrador de UV.

En la columna se cargaron 100 ml de solucion protemica (correspondiente a 5 veces los volumenes de lecho sedimentados).

Despues de la carga de la solucion protemica, el material no unido se retiro por lavado de la columna con citrato de sodio 5 mM, pH 6,7 (etiquetado como Lavado 1). Despues del Lavado 1, las protemas debilmente unidas se retiraron por lavado de la columna con citrato de sodio 5 mM + cloruro de sodio 0,2 M pH 6,7 (etiquetado como Lavado 2). Posteriormente, las protemas fuertemente unidas se eluyeron con citrato de sodio 5 mM + cloruro de sodio 0,8 M, pH

6,7

La fraccion ejecutada y de Lavado 1 se recogieron de la columna como una sola fraccion, mientras que la de Lavado 2 y Eluato se recogieron en fracciones independientes.

A continuacion, el plasma en bruto, la fraccion combinada ejecutada y de lavado y el eluato se midieron para determinar la actividad de un intervalo de factores espedficos de coagulacion y de anti-coagulacion utilizando el analizador DiaMed CD-X (Cresser, Suiza). La actividad biologica del factor de Von Willebrand (vWF) se evaluo con el ensayo del cofactor de ristocetina (vWFRco). El antfgeno del factor de von Willebrand (vWFAg) se cuantifico utilizando un ensayo turbidimetrico. La protema S, la protema C y el inhibidor de C1 se midieron con un ensayo funcional.

Otras protemas tales como albumina, IgG, alfa-1-antitripsina, fibrinogeno, transferrina y glicoprotema alfa 1 acida se determinaron mediante inmunodifusion radial simple.

Ajustando la actividad o cantidad de cualquier protema espedfica aplicada a la columna en la solucion protemica al 100%, se puede determinar el rendimiento relativo en cada fraccion. La recuperacion total se define como la suma de los rendimientos encontrados en las fracciones ejecutadas, de lavado y de elucion.

El eluato se analizo adicionalmente por cromatograffa de exclusion por tamano en un Superdex G200 (Amersham Biosciences). Las fracciones del analisis se analizaron para determinar la actividad del Factor VIII.

Resultados

Rendimiento y recuperacion total de protemas seleccionadas con relacion al material de partida

: Plasma en bruto (%) Ejecutada/Lavado 1 (%) Lavado 2 (%) Eluato (%) Recuperacion (%)

Factor II: 100 <5 <5 40 40-50

Factor V: 100 <5 70 < 5 70-75

Factor VII: 100 <5 <5 100 ~ 100

Factor VIII: 100 10 10 45 65

Factor IX: 100 <5 10 50 60-65

Factor X: 100 <5 <5 100 ~ 100

Factor XI: 100 40 10 20 70

vWFAg: 100 <5 <5 60 60-65

vWFRco: 100 <5 <5 55 55-60

Protema S: 100 <5 <5 65 65-70

Protema C: 100 <5 <5 65 65-70

Inhibidor de C1: 100 10 60 40 ~ 100

Fibrinogeno: 100 95 <5 <5 95-100

Albumina: 100 97 1 <1 98

IgG: 100 98 1 <1 99

Alfa-1-antitripsina: 100 99 <1 <1 99

Glicoprotema alfa 1 acida: 100 99 <1 <1 99

5

10

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20

25

30

35

40

45

La cromatograffa de exclusion por tamano en un Superdex G200 indico que el Factor VIII en el eluato estaba complejado con el Factor de von Willebrand (la actividad del Factor VIII aparecio proxima al volumen vacm de la columna de exclusion por tamano, mientras que no se encontro ninguna actividad en la posicion correspondiente al Factor VIII no complejado).

La repeticion del experimento a un caudal aumentado de 500 cm/hora dio esencialmente los mismos resultados. Ejemplo comparativo 11

Aislamiento del complejo Factor VIII-vWF a partir del plasma mediante adsorcion en lecho expandido. Capacidad de union al adsorbente en funcion del tamano de partmula adsorbente.

Adsorbentes

Los cuatro adsorbentes empleados en este experimento se basaron todos en granulos de agarosa con partmulas de carburo de wolframio incorporadas, la densidad de las partmulas de conglomerado era de 2,9 g/ml mientras que el diametro de la partmula de volumen medio variaba entre 40 y 200 |im. Los adsorbentes se activaron y entrecruzaron con epiclorhidrina y se acoplaron con el ligando p-xililendiamina (la concentracion final del ligando era de 25 micromoles por ml de adsorbente sedimentado). Se ensayaron cuatro diferentes preparaciones adsorbentes con los siguientes diametros de partmulas de volumen medio:

- Diametro de la partmula de volumen medio: 40 |im

- Diametro de la partmula de volumen medio: 70 |im

- Diametro de la partmula de volumen medio: 150 |im

- Diametro de la partmula de volumen medio: 200 |im

Tratamiento previo de la solucion protemica

El plasma humano en bruto (plasma patron citratado) se ajusto a pH 6,7 con acido acetico 1 M. La conductividad era de aqu en adelante 11,5 mS/cm2.

Parametros del procedimiento

La columna se cargo con adsorbente hasta alcanzar una altura de lecho sedimentado (H0) de 25 cm (correspondiente a aprox. 20 ml de adsorbente sedimentado) y se lavo y equilibro a 20-25 °C con tampon de citrato de sodio 20 mM, pH 6,7.

El experimento se realizo con un caudal lineal de 350 cm/h en todas las etapas y la salida de la columna se conecto a un monitor y registrador de UV.

En la columna se cargaron 200 ml de solucion protemica (correspondiente a 10 veces los volumenes de lecho sedimentados).

6,7

El plasma en bruto, la fraccion combinada ejecutada y de lavado y el eluato se midieron despues para determinar la actividad del Factor VIII utilizando el analizador DiaMed CD-X (Cresser, Suiza).

Fijando la actividad del Factor VIII aplicado a la columna en la solucion protemica al 100%, se determino el rendimiento relativo en cada fraccion. La recuperacion total se define como la suma de los rendimientos encontrados en las fracciones ejecutadas, de lavado y de elucion.

5

10

15

20

25

30

35

Resultados

Rendimiento y recuperacion total del factor VIII en relacion con el material de partida.

Ej. A, 40 |im: 100 10 10 50 70

Ej. B, 70 |im: 100 20 15 35 70

Ej. C, 150 |im: 100 45 20 10 85

Ej. D, 200 |im: 100 70 20 5 95

La capacidad de union del adsorbente con el Factor VIII aumenta significativamente con una disminucion en el diametro de la partmula de volumen medio. El experimento ilustra el superior rendimiento de adsorbentes que tienen un diametro de la partmula de volumen medio inferior a 150 |im.

Ejemplo comparativo 12

Aislamiento de protemas del plasma humano a partir de plasma humano utilizando adsorbentes acoplados con diferentes ligandos aromaticos o heteroaromaticos que comprenden grupos acidos.

Adsorbentes

Todos los adsorbentes se basaron en agarosa con partmulas de carburo de wolframio incorporadas, la densidad de las partmulas del conglomerado era de 2,9 g/ml y el diametro de partmula estaba en el intervalo de 40-120 |im con un diametro de la partmula de volumen medio de 70 |im. Los adsorbentes se entrecruzaron y activaron con epiclorhidrina y se acoplaron con los siguientes diferentes ligandos: acido 2-mercaptonicotmico, acido 2-mercapto- benzoico, acido 3,4-diamino-benzoico, acido 2,4-dihidroxibenzoico, acido 3,5-dihidroxi-benzoico, acido 2-(4- aminofeniltio) acetico, acido 2-mercapto-bencimidazol sulfonico, N-benzoil-cistema.

La concentracion de ligando en todos los adsorbentes individuales se determino mediante valoracion acido-base que estaba en el intervalo de 25-40 micromoles por ml de adsorbente sedimentado.

Para cada adsorbente se realizo el siguiente experimento :

Tratamiento previo de la solucion protemica

La solucion protemica, plasma humano, se diluyo con agua desmineralizada en una proporcion de un volumen de plasma frente a 2 volumenes de agua y el pH se ajusto a pH 5,0 con acido hidroclorico 1 M. La conductividad era a continuacion 5,25 mS/cm2.

Parametros del procedimiento:

La columna se cargo con adsorbente hasta alcanzar una altura de lecho sedimentado (H0) de 50 cm (correspondiente a aprox. 40 ml de adsorbente sedimentado) y se lavo y equilibro a 20-25 °C con los siguientes tampones en orden sucesivo 1) NaOH 1 M, 2) tampon de acido cttrico 40 mM pH 4,5 3) tampon de acido dtrico 40 mM pH 5,0.

El experimento se realizo con un caudal lineal de 600 cm/h en todas las etapas y la salida de la columna se conecto a un monitor y registrador de UV.

Muestra:

En la columna se cargaron 30 ml de muestra (que corresponden a 10 ml de plasma sin diluir).

Recogida de Fracciones:

Despues de la carga de la solucion protemica, el material no unido y el debilmente unido se retiraron por lavado de la columna con citrato de sodio 10 mM de pH 5,0. La fraccion ejecutada y de lavado, RT (fraccion no unida), se recogio como una sola fraccion segun la monitorizacion UV del efluente de la columna.

Posteriormente, las protemas unidas se eluyeron en tres etapas secuenciales.

- Eluato 1 - la primera etapa de elucion se realizo con caprilato de sodio 5 mg/ml, pH 6,0

- Eluato 2 - la segunda etapa de elucion se realizo con citrato de sodio 0,3 M pH 7,4.

- Eluato 3 - la tercera etapa de elucion se realizo con citrato de sodio 20 mM + cloruro de sodio 0,1 M pH 7,4

Entre la primera y la segunda etapas de elucion la columna se lavo con 1 volumen de columna de citrato de sodio 1 M pH 7,4.

5 Cuantificacion de protemas del plasma humano en la fraccion Ejecutada/de lavado y en las eluciones 1, 2 y 3: se realizo Inmunodifusion Radial Simple (SRI) para mostrar los componentes en cada fraccion de la columna como se describe en Scand. J. Immunol. Vol. 17, Supl. 10, 41-56, 1983.

Anticuerpo: Codigo n.° il muestra/pocillo il por cm2

Albumina antihumana de conejo: A 0001 5 |il 0,30 il por cm2

IgG antihumana de conejo: A 0424 5 |il 0,30 il por cm2

Alfa-1-PI antihumana de conejo: A 0012 5 |il 0,60 il por cm2

Fibrinogeno antihumano de conejo: A 0080 5 il 0,40 il por cm2

Orosomucoide antihumana de conejo: A 0011 5 il 0,80 il por cm2

Transferrina antihumana de conejo: A 0061 5 il 0,30 il por cm2

10 Se establecio una curva patron con la solucion protemica (la de 100% de referencia) cargada en la columna en la concentracion de 100%, 80%, 60%, 40% y 20%. Cada una de las cuatro fracciones se determino en relacion con esta curva patron y se determino el rendimiento relativo de la protema espedfica en cada fraccion. Si el rendimiento de una protema espedfica en una fraccion espedfica en relacion con la cantidad de protema anadida a la columna es superior al 5%, se define que la protema se distribuye en dicha fraccion.

15 Resultados

Distribucion de protemas seleccionadas en funcion de la estructura del ligando

Ligando: Inhibidor de la proteinasa alfa 1 Glicoprotema alfa 1 acida Albumina IgG Transferrina Fibrinogeno

Acido 2-mercapto-nicotmico: RT RT E1 E2 E2 E3

Acido 2-mercapto-benzoico: RT RT E1 E2 E2 E3

Acido 3,4-diamino-benzoico: RT RT RT E1/E2 E1/E2 E2/E3

Acido 2,4-dihidroxi-benzoico: RT RT RT E2 RT E2/E3

Acido 3,5-dihidroxi-benzoico: RT RT RT E2 RT E2/E3

Acido 2-(4-amino-feniltio)-acetico: RT RT RT/E1 E2 E2 E2/E3

Acido 2-mercapto-benzimidazol sulfonico: RT RT RT/E1 E2 E2 E2/E3

N-benzoil-cistema: RT RT E1/E2 E2 E2 E2/E3

RT= ejecutada y primer lavado, E1= Eluato 1, E2= Eluato 2, E3= Eluato 3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Umbral: Al menos el 5% de la protema espedfica aplicada a la columna debe estar presente en la fraccion

La tabla ilustra que para el ligando acido 2-mercapto-nicotinico, el inhibidor de la proteinasa alfa 1 y la glicoprotema alfa 1 acida estan presentes solo en un grado de mas del 5% del total en la fraccion ejecutada y en la de lavado, mientras que la Albumina solo esta presente en el primer eluato, E1, es decir, no hay una cantidad significativa de albumina presente en ninguna de las otras fracciones, la IgG y la transferrina solo estan presentes en el segundo eluato y el fibrinogeno solo esta presente en el tercer eluato. Por ello, en general se puede senalar que hay muy poca contaminacion cruzada de las protemas individuales entre las fracciones protemicas individuales obtenidas en el experimento. El experimento ilustra ademas que puede utilizarse una amplia gama de ligandos aromaticos o heteroaromaticos que comprendan un grupo acido para el fraccionamiento segun la invencion de protemas de plasma o suero humano.

Ejemplo comparativo 13

Aislamiento del inhibidor de la proteinasa alfa 1 humana (alfa-1-PI) de la fraccion no unida del ejemplo comparativo 5 de baja fuerza ionica utilizando adsorbente con un ligando diamino-nonano.

Adsorbente

El adsorbente se baso en agarosa al 4% con partmulas de carburo de wolframio incorporadas. Los granulos de conglomerado teman una densidad de aproximadamente 3,8 g/ml y un tamano de partmula en el intervalo de 40100 |im con un tamano de la partmula de volumen medio de 60 |im. El adsorbente se entrecruzo y se activo con epiclorhidrina y se acoplo con diamino-nonano. La concentracion de ligando era de aprox. 25 mmoles por ml de adsorbente sedimentado.

Solucion protemica

El material de partida para este experimento fue la Fraccion protemica 1 (el material no unido) obtenida del aislamiento de protemas de plasma humano utilizando adsorcion en lecho expandido como se describe en el ejemplo comparativo 5. El pH en la fraccion protemica se ajusto cuidadosamente a pH 8,2 con hidroxido de sodio 1 M y la conductividad se ajusto a 3,0 mS/cm2 con la adicion de agua desmineralizada.

Parametros del procedimiento

El experimento se realizo como una adsorcion en lecho expandido.

La columna se cargo con adsorbente hasta alcanzar una altura de lecho sedimentado (H0) de 20 cm (correspondiente a aprox. 16 ml de adsorbente) y se lavo y equilibro a 20-25 °C con los siguientes tampones en orden sucesivo 1) NaOH 1 M, 2) HCl 0,2 M 3) etanol al 50% en agua 4) Tris/HCl 10 mM pH 8,2.

El experimento se realizo con un caudal lineal de 900 cm/h en todas las etapas y la salida de la columna se conecto a un monitor y registrador de UV.

Muestra

En la columna se cargaron 700 ml de la fraccion protemica ajustada a pH 8,2 y con una conductividad de 3,0 mS/cm y las fracciones ejecutadas (material no unido). Despues de la carga de la fraccion protemica, la columna se lavo con Tris 10 mM/HCl, pH 8,2. La fraccion ejecutada y la de lavado se recogieron como una fraccion combinada (utilizando el monitor UV para seguir la retirada por lavado del material no unido). Despues de la carga y el lavado, la alfa-1-PI unida se libero y eluyo con citrato sodopotasico 15 mM pH 6,0 y se recogio como Eluato 1. Cuando todo el alfa-1-PI se eluyo, segun se monitorizo en el monitor UV, un segundo tampon de elucion, citrato de sodio 15 mM + cloruro de sodio 500 mM de pH 5,2 se aplico entonces para liberar glicoprotema alfa 1 acida como Eluato 2. El Eluato 2 se recogio segun el pico obtenido en el registrador de UV.

Cuantificacion del alfa-1-PI humano de la columna

Se realizo una Inmunodifusion Radial Simple (SRI) para cuantificar la concentracion relativa de alfa-1-PI y de la glicoprotema alfa 1 acida (orosomucoide) en las fracciones de la columna como se describe en Scand. J. Immunol. Vol. 17, Supl. 10, 41-56, 1983.

La SRI se realizo con API anti-humana de conejo, n.° de cat.: A0012 (0,6 |il por cm2) y Orosomucoide anti humana de conejo, n.° de cat. A 00110 (0,8 |il por cm2) de DakoCytomation, Dinamarca.

Se realizo una curva patron para cada una de las dos protemas aplicadas con la fraccion protemica como la referencia 100% cargada en la columna en concentraciones del 100%, 80%, 60%, 40% y 20%. La concentracion de alfa-1-PI y de la glicoprotema alfa 1 acida se determino en cada una de las fracciones frente a la curva patron y se

5

10

15

20

25

30

35

40

calculo el rendimiento relativo en esa fraccion a partir del volumen de la fraccion en relacion con el volumen y la concentracion de alfa-1-PI en la fraccion protemica aplicada.

Pureza del eluato y demostracion de la actividad de union a la elastasa.

SDS-PAGE

Para la SDS-PAGE, se utilizo gel de Tris-Glicina 4-20% Invitrogen SDS-Page (n.° de cat. EC6025).

Union a la elastasa

La demostracion de la actividad de union a la elastasa del alfa-1-PI en la fraccion protemica se realizo analizando la materia prima con SDS-PAGE antes y despues de la incubacion con elastasa (codigo n.° E0127 de Sigma): La fraccion protemica se ajusto a pH 7 con NaOH 0,2 M y a 500 |il de la fraccion protemica se anadieron 6,5 |il de elastasa de 2,5 mg/ml y se incubaron durante 30 min a 30 °C. Preparacion de la muestra: 25 |il de muestra y 25 |il de tampon muestra de Tris-glicina Invitrogen (n.° de cat. LC2676) se mezclaron y se sometieron a ebullicion durante 5 minutos en un bano de agua. Se anadio el tampon de migracion 0,024 M tris (Sigma T1378), 0,19 M glicina (Merck 5001901000), SDS al 0,1% (dodecilsulfato de sodio, JT Baker 2811) pH 8,6. Se aplico una muestra de 20 |il en cada franja de analisis y se ajusto la corriente para dar una intensidad de 40 mA. Cuando la lmea azul del tampon muestra alcanzo un cm desde el fondo del gel, se corto la corriente y el gel se tino durante la noche en un kit de tincion de azul coloidal Invitrogen (n.° de cat. LC 6025) en una mesa de agitacion. Al dfa siguiente, el gel se transfirio al agua y se destino en agua durante 2 horas.

Resultados

La siguiente tabla muestra el rendimiento relativo del alfa-1-PI y de la glicoprotema alfa 1 acida en tanto por ciento de la cantidad total de las protemas individuales cargadas en la columna:

Fraccion: Alfa-1-PI (%) Glicoprotema alfa 1 acida (%)

Ejecutada/de Lavado: 0 0

Eluato 1: 85 < 5

Eluato 2: 15 85

Los resultados indican que el procedimiento de adsorcion habfa separado muy eficientemente el alfa-1-PI (inhibidor de la proteinasa alfa 1) y la glucoprotema alfa-1 acida.

El analisis por SDS-PAGE del alfa-1-PI en el Eluato 1 revelo una pureza de 80% y se encontro que la actividad de union a la elastasa era aproximadamente 100%. Se encontro que la glicoprotema alfa 1 acida era aproximadamente 45% pura como se determino por SDS-PAGE.

Estos resultados ilustran ademas un aislamiento eficaz del inhibidor de la proteinasa alfa 1 y de la glicoprotema alfa 1 acida utilizando un adsorbente que comprende un ligando amino-alquilo bajo condiciones de union de baja fuerza ionica.

Ejemplo comparativo 14

Aislamiento de protemas del plasma humano a partir de plasma humano a diferentes pH utilizando un adsorbente acoplado con acido 2-mercaptonicotmico.

Adsorbente

El adsorbente se baso en agarosa con partmulas de carburo de wolframio incorporadas, la densidad de las partmulas de conglomerado era de 3,6 g/ml y el diametro de partmula estaba en el intervalo de 40-100 |im con un diametro de la partmula de volumen medio de 50 |im. El adsorbente se entrecruzo y se activo con epiclorhidrina y se acoplo con acido 2-mercaptonicotmico para obtener una concentracion de ligando de 32 micromoles por ml de adsorbente sedimentado.

Tratamiento previo de la solucion protemica

La solucion protemica, plasma humano, se diluyo con agua desmineralizada en una proporcion de un volumen de plasma frente a 2 volumenes de agua. Se realizaron una serie de experimentos en los que el material de partida se ajusto a un intervalo de diferentes valores de pH (utilizando acido hidroclorico 1 M en la titulacion). Se realizaron los siguientes experimentos:

A. pH de la solucion protemica = 3,0

5

10

15

20

25

30

35

B. pH de la solucion protemica = 4,0

C. pH de la solucion protemica = 4,5

D. pH de la solucion protemica = 5,0

E. pH de la solucion protemica = 5,5

F. pH de la solucion protemica = 6,0

G. pH de la solucion protemica = 6.5 Parametros del procedimiento

Los experimented se realizaron en una columna de lecho expandido FastLine® 10 (^ = 1 cm), numero de artteulo 7010-0000, UpFront Chromatography A/S.

Para cada experimento, la columna se cargo con adsorbente hasta alcanzar una altura de lecho (H0) de 50 cm (que corresponden a aprox. 40 ml de adsorbente sedimentado) y se lavo y equilibro a 20-25 °C con los siguientes tampones en orden sucesivo 1) NaOH 1 M, 2) tampon de acido dtrico 40 mM pH 4,5 3) tampon de acido dtrico 40 mM que tiene el mismo pH que la solucion protemica para el experimento espedfico.

El experimento se realizo con un caudal lineal de 400 cm/h en todas las etapas y la salida de la columna se conecto a un monitor y registrador de UV.

Muestra

En la columna se cargaron 30 ml de solucion protemica (que corresponden a 10 ml de plasma sin diluir).

Recogida de Fracciones:

Despues de la carga de la solucion protemica, el material no unido y el debilmente unido se retiro por lavado de la columna con citrato de sodio 10 mM que tiene el mismo pH que la muestra para ese experimento particular. La fraccion ejecutada y de lavado, RT (fraccion no unida), se recogio como una sola fraccion segun la monitorizacion UV del efluente de la columna.

Posteriormente, las protemas unidas se eluyeron en tres etapas secuenciales.

Cuantificacion de protemas del plasma humano en la fraccion ejecutada/de lavado y en las eluciones 1, 2 y 3: se realizo Inmunodifusion Radial Simple (SRI) para mostrar los componentes en cada fraccion de la columna como se describe en Scand. J. Immunol. Vol. 17, Supl. 10, 41-56, 1983.

Anticuerpo: Codigo n.° il muestra/pocillo il por cm2

Albumina antihumana de conejo: A 0001 5 |il 0,30 il por cm2

IgG antihumana de conejo: A 0424 5 |il 0,30 il por cm2

Alfa-1-PI antihumano de conejo: A 0012 5 |il 0,60 il por cm2

Fibrinogeno antihumano de conejo: A 0080 5 il 0,40 il por cm2

Orosomucoide antihumana de conejo: A 0011 5 il 0,80 il por cm2

Transferrina antihumana de conejo: A 0061 5 il 0,30 il por cm2

Se establecio una curva patron con la solucion protemica (la 100% de referencia) cargada en la columna en la concentracion de 100%, 80%, 60%, 40% y 20%. Cada una de las cuatro fracciones se determino en relacion con esta curva patron y se determino el rendimiento relativo de la protema espedfica en cada fraccion. Si el rendimiento de una protema espedfica en una fraccion protemica espedfica en relacion con la cantidad de

5

10

15

20

25

30

protema anadida a la columna es superior al 5%, se define que la protema se distribuye en dicha fraccion. Resultados

Distribucion de protemas seleccionadas en funcion de la muestra y del pH de lavado

pH de la muestra y del tampon de lavado: Inhibidor de proteinasa alfa 1 Glicoprotema alfa 1 acida Albumina IgG Transferrina Fibrinogeno

A. pH = 3,0: RT/E2 ND RT/E1/E2 RT/E2 RT/E2 RT

B. pH = 4,0: RT/E2 ND E1/E2 RT/E1 E2/E3 E2 RT/E2/E3

C. pH = 4,5: RT/E2 RT E1/E2 E2 E2 E3

D. pH = 5,0: RT RT E1 E2 E2 E3

E. pH = 5,5: RT RT RT/E1 E2 E2 E3

F. pH = 6,9: RT RT RT RT/E2 RT/E2 E3

G. pH = 6,5: RT RT RT RT/E2 RT/E2 RT/E3

RT = ejecutada y de primer lavado, E1=Eluato 1, E2=Eluato 2, E3=Eluato 3, ND = no determinado. Umbral: al menos un 5% de protema espedfica aplicada a la columna debe estar presente en la fraccion

La tabla ilustra que para el ligando acido 2-mercaptonicotmico, un valor de pH de la solucion protemica y del tampon de lavado en el intervalo de pH 5,0 a pH 5,5 da como resultado la separacion mas eficaz de las protemas analizadas. Mas protemas aparecen en la fraccion no unida, RT, siempre que el pH sea inferior a pH 4,5 o superior a pH 5,5. Por debajo del pH 5,0, se encuentra que la alfa-1-antitripsina (inhibidor de la proteinasa alfa 1) se desnaturaliza (polimeriza), lo que se apoya en el hallazgo de que aparece tanto en RT como en E2 a pH 4,5 e inferior.

Ejemplo comparativo 15

Aislamiento de protemas de plasma humano a partir de plasma humano con diferentes tampones y diferentes fuerza ionica/conductividad utilizando un adsorbente acoplado con acido 2-mercaptonicotmico.

Adsorbente

El adsorbente se baso en agarosa con partmulas de carburo de wolframio incorporadas, la densidad de las partmulas del conglomerado era de 3,6 g/ml y el diametro de partmula estaba en el intervalo de 40-100 |im con un diametro de la partmula de volumen medio de 50 |im. El adsorbente se entrecruzo y se activo con epiclorhidrina y se acoplo con acido 2-mercaptonicotmico para obtener una concentracion de ligando de 32 micromoles por ml de adsorbente sedimentado.

Tratamiento previo de la solucion protemica

La solucion protemica, plasma humano, se diluyo con agua desmineralizada en una proporcion de un volumen de plasma frente a 2 volumenes de agua. Se realizaron una serie de experimentos en donde a la solucion protemica se anadio una gama de diferentes sustancias tampon dando como resultado una gama de diferentes fuerzas ionicas/conductividades. Todos los experimentos se realizaron a un pH de la muestra de 5,0.

Se realizaron los siguientes experimentos:

A. Citrato de sodio 10 mM, conductividad = 6,0 mS/cm

B. Citrato de sodio 20 mM, conductividad = 8,5 mS/cm

C. Acetato de sodio 20 mM, conductividad = 6,2 mS/cm

D. Histidina 20 mM, conductividad = 6,6 mS/cm

E. Glicina 20 mM, conductividad = 5,5 mS/cm

F. Octilamina 20 mM, conductividad = 8,0 mS/cm Parametros del procedimiento:

5

10

15

20

25

30

Para cada experimento, la columna se cargo con adsorbente hasta alcanzar una altura de lecho (H0) de 50 cm (que corresponden a aprox. 40 ml de adsorbente sedimentado) y se lavo y equilibro a 20-25 °C con los siguientes tampones en orden sucesivo 1) NaOH 1 M, 2) tampon de acido dtrico 40 mM pH 4,5 3) tampon de acido dtrico 40 mM pH 5,0.

Muestra

Recogida de fracciones protemicas:

Despues de la carga de la solucion protemica, el material no unido y el debilmente unido se retiraron por lavado de la columna con el mismo tipo de tampon y la misma concentracion de tampon que se anadio a la muestra para el experimento particular. Todos los tampones de lavado estaban a pH 5,0. La fraccion ejecutada y la de lavado, RT (fraccion no unida), se recogio como una sola fraccion segun la monitorizacion UV del efluente de la columna.

Posteriormente, las protemas unidas se eluyeron en tres etapas secuenciales.

Anticuerpo: Codigo n.° il muestra/pocillo il por cm2

Albumina antihumana de conejo: A 0001 5 |il 0,30 il por cm2

IgG antihumana de conejo: A 0424 5 |il 0,30 il por cm2

Alfa-1-PI antihumano de conejo: A 0012 5 |il 0,60 il por cm2

Fibrinogeno antihumano de conejo: A 0080 5 il 0,40 il por cm2

Orosomucoide antihumana de conejo: A 0011 5 il 0,80 il por cm2

Transferrina antihumana de conejo: A 0061 5 il 0,30 il por cm2

Se establecio una curva patron con la solucion protemica (la de 100% de referencia) cargada en la columna en la concentracion de 100%, 80%, 60%, 40% y 20%. Cada una de las cuatro fracciones se determino en relacion con esta curva patron y en cada fraccion se determino el rendimiento relativo de la protema espedfica. Si el rendimiento de una protema espedfica en una fraccion protemica espedfica en relacion con la cantidad de protema anadida a la columna es superior al 5%, se define que la protema se distribuye en dicha fraccion.

Resultados

Distribucion de protemas seleccionadas en funcion de la composicion/conductividad de la muestra y del tampon de lavado.

Tampon anadido a muestra y tampon de lavado: Inhibidor de la proteinasa alfa 1 Glicoprotema alfa 1 acida Albumina IgG Transferrina Fibrinogeno

A. Citrato de sodio 10 mM: RT RT E1 E2 E2 E3

5

10

15

20

25

30

B. Citrato de sodio 20 mM: RT RT RT/E1 E2 E2 E3

C. Acetato de sodio 20 mM: RT RT E1 E2 E2 E3

D. Histidina 20 mM: RT RT E1 E2 E2 E3

E. Glicina 20 mM: RT RT E1 E2 E2 E3

F. Octilamina 20 mM: RT RT RT RT RT RT/E3

RT= ejecutada y primer lavado, E1=Eluato 1, E2=Eluato 2, E3=Eluato 3. Umbral: al menos 5% de la protema espedfica aplicada a la columna debe estar presente en la fraccion.

Ejemplo comparativo 16

Aislamiento de protemas del plasma humano y animal a partir de diferentes plasmas humano y animal no diluidos utilizando un adsorbente acoplado con acido 2-mercaptonicotmico.

Adsorbente

El adsorbente se baso en agarosa con partmulas de carburo de wolframio incorporadas, la densidad de las partmulas de conglomerado era de 2,0 g/ml y el diametro de partmula estaba en el intervalo de 50-150 |im con un diametro de la partmula de volumen medio de 120 |im. El adsorbente se entrecruzo y se activo con epiclorhidrina y se acoplo con acido 2-mercaptonicotmico para obtener una concentracion de ligando de 36 micromoles por ml de adsorbente sedimentado.

Tratamiento previo de la solucion protemica

La solucion protemica, plasma humano y una gama de plasmas de diferentes animales, se ajusto a pH 5,0 con acido hidroclorico 1 M. Una serie de experimentos se realizaron utilizando diferentes plasmas.

Se realizaron los siguientes experimentos:

A. Plasma humano sin diluir

B. Plasma de caballo sin diluir

C. Plasma bovino sin diluir

D. Plasma de conejo sin diluir

E. Plasma de cabra sin diluir

F. Plasma de pollo sin diluir

G. Plasma de cerdo sin diluir

H. Plasma de raton sin diluir Parametros del procedimiento

Los experimentos se realizaron en una columna de lecho expandido FastLine® 10 (^ = 1 cm), numero de artmulo 7010-0000, UpFront Chromatography A/S.

Para cada experimento, la columna se cargo con adsorbente hasta alcanzar una altura de lecho (H0) de 50 cm (que corresponden a aprox. 40 ml de adsorbente sedimentado) y se lavo y equilibro a 20-25 °C con los siguientes tampones en orden sucesivo 1) NaOH 1 M, 2) tampon de acido cttrico 40 mM pH 4,5 3) tampon de acido dtrico 40 mM pH 5,0.

Muestra

En la columna se cargaron 20 ml de solucion protemica (que corresponden a 0,5 ml de plasma por ml de adsorbente

sedimentado).

Recogida de fracciones protemicas:

Despues de la carga de la solucion protemica, el material no unido y el ligeramente unido se retiraron por lavado de la columna de citrato de sodio 10 mM pH 5,0. La fraccion ejecutada y de lavado, RT (fraccion protemica no unida) se 5 recogio como una sola fraccion protemica segun la monitorizacion UV del efluente de la columna.

Posteriormente, las protemas unidas se eluyeron en dos etapas secuenciales.

- Eluato 2 - la segunda etapa de elucion se realizo con citrato de sodio 20 mM + cloruro de sodio 0,1 M pH 7,4

Todas las fracciones protemicas se analizaron mediante SDS-PAGE NO REDUCIDA utilizando gel de 4-20% Tris- 10 Glicina Invitrogen SDS-Page (n.° de cat. EC6025). Las bandas tenidas con Coomassie en la SDS PAGE se examinaron cualitativa y semicuantitativamente mediante inspeccion visual para registrar la distribucion de protemas de plasma seleccionadas en las fracciones de columnas individuales. Si se estima que una banda protemica, presente en una fraccion protemica espedfica, representa mas del 10% de la protema total anadida a la columna, se define que la protema se distribuye en esa fraccion protemica particular (el valor umbral).

15 Resultados

Distribucion de protemas seleccionadas en funcion del origen de la muestra.

Muestra: Albumina IgG

A. Plasma humano: RT/E1 E2

B. Plasma de caballo: RT/E1 E2

C. Plasma de vaca: RT/E1 E2

D. Plasma de conejo: RT/E1 E2

E. Plasma de cabra: RT/E1 E2

F. Plasma de pollo: RT/E1 E2

G. Plasma de cerdo: RT/E1 E2

H. Plasma de raton: RT/E1 E2

RT= ejecutada y primer lavado, E1=Eluato 1, E2=Eluato 2. Umbral: al menos 10% de la protema espedfica aplicada a la columna esta presente en la fraccion.

Los resultados ilustran que diferentes plasmas animal y humano sin diluir se comportan de forma muy similar cuando se fraccionan con un adsorbente acoplado con acido 2-mercapto-nicotmico en las condiciones de procedimiento especificadas. El adsorbente se une y se eluye practicamente con todas las IgG de todas las especies ensayadas. El 20 adsorbente se une a la mayor parte de la albumina presente en todas las muestras de plasma ensayadas y en todos los experimentos la albumina unida se eluye eficazmente mediante el tampon de pH 6,0 de caprilato de sodio de 5 mg/ml.

Ejemplo comparativo 17

Aislamiento de protemas del plasma humano a partir de plasma humano utilizando adsorbentes de diferentes 25 tamanos acoplados con acido 2-mercaptonicotmico.

Adsorbente

Todos los adsorbentes empleados se basaron en agarosa con partmulas de carburo de wolframio incorporadas, la densidad de las partmulas del conglomerado era de 2,5 g/ml y el diametro de partmula y el diametro de la partmula de volumen medio variaban de la forma siguiente:

30 Adsorbente A. Intervalo del diametro de partmula: 60-140 |im; Diametro de la partmula de volumen medio: 90 |im

Adsorbente B. Intervalo del diametro de partmula: 60-150 |im; Diametro de la partmula de volumen medio 120 |im

Adsorbente C. Intervalo del diametro de partmula: 80-240 |im; Diametro de la partmula de volumen medio 150 |im

Adsorbente D. Intervalo del diametro de partmula: 80-300 |im; Diametro de la partmula de volumen medio 200 |im

5

10

15

20

25

30

35

Adsorbente E. Intervalo del diametro de partmula: 100-400 |im; Diametro de la partmula de volumen medio: 250 |im

Los adsorbentes A-E se produjeron tamizando con redes de nailon de tamano de poro definido a partir de un lote de partmulas que tienen una amplia distribucion de tamanos, que primero se entrecruzaron y activaron con epiclorhidrina y se acoplaron con acido 2-mercaptonicotmico para obtener una concentracion de ligando de 28 micromoles por ml de adsorbente sedimentado. Con ello, todos los adsorbentes A-E se disenaron para desviarse entre sf solo con respecto al tamano de las partmulas.

Para cada uno de los adsorbentes A-E se realizo el siguiente experimento:

Tratamiento previo de la solucion protemica

La solucion protemica, plasma humano, se diluyo con agua desmineralizada en una proporcion de un volumen de plasma frente a 2 volumenes de agua y el pH se ajusto a pH 5,0 con acido hidroclorico 1 M. La conductividad era de aqrn en adelante 5,2 mS/cm2

Parametros del procedimiento

La columna se cargo con adsorbente hasta alcanzar una altura de lecho (H0) de 50 cm (que corresponden a aprox. 40 ml de adsorbente sedimentado) y se lavo y equilibro a 20-25 °C con los siguientes tampones en orden sucesivo 1) NaOH 1 M, 2) tampon de acido cftrico 40 mM pH 4,5 3) tampon de acido dtrico 40 mM pH 5,0.

Muestra

Recogida de fracciones protemicas:

Despues de la carga de la muestra de protema, el material no unido y el debilmente unido se retiraron por lavado de la columna con 10 mM de citrato de sodio pH 5,0. La fraccion ejecutada y de lavado, RT (fraccion no unida), se recogio como una sola fraccion protemica segun la monitorizacion UV del efluente de la columna.

Posteriormente, las protemas unidas se eluyeron en dos etapas secuenciales.

Cuantificacion de protemas de plasma humano en la fraccion ejecutada/de lavado y las eluciones 1 y 2, se realizo Inmunodifusion Radial Simple (SRI) para mostrar los componentes en cada fraccion protemica de la columna como se describe en Scand. J. Immunol. Vol. 17, Supl. 10, 41-56, 1983.

Anticuerpo: Codigo n.° |il muestra/pocillo |il por cm2

Albumina antihumana de conejo: A 0001 5 ml 0,30 |il por cm2

IgG antihumana de conejo: A 0424 5 ml 0,30 |il por cm2

Se establecio una curva patron con la solucion protemica (el 100% de referencia) cargada en la columna en la concentracion de 100%, 80%, 60%, 40% y 20%. Cada una de las tres fracciones de protema se determino en relacion con esta curva patron y se determino el rendimiento relativo de la protema espedfica en cada fraccion protemica.

5

10

15

20

25

Resultados:

Distribucion de las protemas seleccionadas en funcion del tamano de la partmula adsorbente

Intervalo del tamano de partmula adsorbente y tamano de la partmula de volumen medio: Albumina (%) IgG (%)

Adsorbente A.: RT: < 5 RT: < 5

Intervalo del diametro de partmula: 60-140 |im: m CD 0 m A cn

Diametro de la partmula de volumen medio: 90 |im: E2: < 5 E2: 90

Adsorbente B.: RT: < 5 RT: < 5

Intervalo del diametro de partmula: 60-150 |im: m CD 0 m A cn

Diametro de la partmula de volumen medio 120 |im: E2: < 5 E2: 90

Adsorbente C.: RT: 10 RT: 20

Intervalo del diametro de partmula: 80-240 |im: m 00 00 m A cn

Diametro de la partmula de volumen medio 150 |im: E2: < 5 E2: 70

Adsorbente D.: RT: 25 RT: 30

Intervalo del diametro de partfcula: 80-300 |im: m 0 m A cn

Diametro de la partfcula de volumen medio 200 |im: E2: < 5 E2: 50

Adsorbente E.: RT: 30 RT: 30

Intervalo del diametro de partfcula: 100-400 |im: E1: 65 m A cn

Diametro de la partfcula de volumen medio: 250 |im: E2: < 5 E2: 50

RT= ejecutada y primer lavado, E1 = Eluato 1, E2 = Eluato 2

Los resultados ilustran que a un caudal elevado (900 cm/hora) solo los adsorbentes que tienen un tamano de la partmula de volumen medio inferior a 150 |im consiguen unir practicamente toda la albumina e IgG presentes en la muestra aplicada. Cuanto mayor sea el tamano de partmula menor sera el rendimiento de las protemas en las fracciones protemicas de los eluatos respectivos.

Ejemplo comparativo 18

Aislamiento a gran escala de protemas del plasma humano a partir de plasma humano en una columna EBA de 30 cm de diametro.

Adsorbente

El adsorbente se baso en agarosa con partmulas de carburo de wolframio incorporadas, la densidad de las partmulas de conglomerado era de 2,8 g/ml y el diametro de partmula se encuentra en el intervalo de 40-120 |im con un diametro de partmula medio de 72 |im. El adsorbente comprendfa acido 2-mercaptonicotmico como ligando y tema una concentracion de ligando de 38 micromoles por ml de adsorbente sedimentado.

Tratamiento previo de la solucion protemica

La solucion protemica, plasma humano citratado, se diluyo con agua desmineralizada en una proporcion de un volumen de plasma frente a 2 volumenes de agua y el pH se ajusto a pH 5,0 con acido hidroclorico 1 M. La conductividad era de aqrn en adelante 5,3 mS/cm2

Parametros del procedimiento

El experimento se realizo en una columna de lecho expandido FastLine® 300 (^ = 30 cm), numero de artmulo 73000000, UpFront Chromatography A/S.

La columna se cargo con adsorbente hasta alcanzar una altura de lecho sedimentado (H0) de 50 cm (que corresponden a aprox. 35,3 l de adsorbente) y se lavo y equilibro a 20-25 °C con los siguientes tampones en orden sucesivo 1) 36 l de NaOH 1M, 2) 90 l de tampon de acido cttrico 40 mM pH 4,5 3) 90 l de tampon de acido cftrico 40 mM pH 5,0.

El experimento se realizo con un caudal lineal de 450 cm/h (que corresponde a un flujo volumetrico de 5,3 l/min) en todas las etapas y la salida de la columna se conecto a un monitor y registrador de UV.

Muestra

En la columna se cargo una solucion de 39 l de protema (que corresponde a 13 l de plasma sin diluir).

Recogida de fracciones protemicas:

Despues de la carga de la solucion protemica, el material no unido y el debilmente unido se retiraron por lavado de la 5 columna con citrato de sodio 10 mM de pH 5,0. La fraccion 1 (fraccion no unida) se recogio como una sola fraccion protemica segun la monitorizacion UV del efluente de la columna.

Posteriormente, las protemas unidas se eluyeron en tres etapas secuenciales.

- Fraccion protemica 2 - la primera etapa de elucion se realizo con caprilato de sodio 5 mg/ml, pH 6,0

- Fraccion protemica 3 - la segunda etapa de elucion se realizo con citrato de sodio 0,3 M, pH 7,4.

10 - Fraccion protemica 4 - la tercera etapa de elucion se realizo con citrato de sodio 20 mM + NaCl 0,1 M, pH 7,4

Entre la primera y la segunda etapas de elucion, la columna se lavo brevemente con 40 l de citrato de sodio 1 M, pH 7,4.

Resultados

La siguiente tabla muestra los volumenes de cada fraccion:

15 Cuantificacion de las protemas de plasma humano, fracciones 1, 2, 3 y 4 de la columna

Fraccion: Serie

Tampon de equilibrio (1: 36 l

Tampon de equilibrio (2: 90 l

Tampon de equilibrio (3: 90 l

Fraccion protemica 1 Protemas no unidas y lavado: 293 l

Fraccion protemica 2: 136 l

Fraccion protemica 3: 135 l

Fraccion protemica 4: 83 l

Se realizo Inmunodifusion Radial Simple (SRI) con el fin de mostrar los componentes en cada fraccion protemica de la columna como se describe en Scand. J. Immunol. Vol. 17, Supl. 10, 41-56, 1983.

Anticuerpo: Codigo n.° il muestra/pocillo il por cm2

Albumina antihumana de conejo: A 0001 5 |il 0,30 il por cm2

IgG antihumana de conejo: A 0424 5 |il 0,30 il por cm2

Alfa-1-PI antihumano de conejo: A 0012 5 |il 0,60 il por cm2

Fibrinogeno antihumano de conejo: A 0080 5 il 0,40 il por cm2

Haptoglobina antihumana de conejo: A 0030 15 il 0,45 il por cm2

Globulina GC antihumana de conejo: A 0021 15 il 0,60 il por cm2

IgM antihumana de conejo: A 0426 15 il 0,40 il por cm2

IgA antihumana de conejo: A 0092 15 il 0,50 il por cm2

Macroglobulina alfa-2 antihumana de conejo: A 0033 15 il 0,40 il por cm2

Orosomucoide antihumano de conejo: A 0011 5 il 0,80 il por cm2

Transferrina antihumana de conejo: A 0061 5 il 0,30 il por cm2

Prealbumina antihumana de conejo: A 0002 15 il 0,75 il por cm2

5

10

15

20

25

Anticuerpo: Codigo n.° |il muestra/pocillo |il por cm2

Antitrombina III antihumana de conejo: A 0296 25 |il 0,50 |il por cm2

Se establecio una curva patron con la solucion protemica (la de 100% de referencia) cargada en la columna en la concentracion de 100%, 80%, 60%, 40% y 20%. Cada una de las cuatro fracciones protemicas se determino en relacion con esta curva patron para cada protema ensayada y se determino el rendimiento relativo de la protema espedfica en cada fraccion protemica.

Resultados

Rendimiento de cada protema humana en relacion con la materia prima aplicada en cada una de las 4 fracciones de la columna EBA:

: Fraccion 1 Material no unido Fraccion 2 Fraccion 3 Fraccion 4

Albumina humana: - 98% - -

IgG humana: - - 95% 5%

Alfa-1-PI humana: 95% - - -

Fibrinogeno humano: - - 10% 60-80%

Haptoglobina humana: 40% 40% 20% -

Globulina GC humana: - 100% - -

IgM humana: - - 75% -

IgA humana: 15% 20% 70% -

Macroglobulina alfa-2 humana: - 45% 35% -

Orosomucoide humana: 100% - -

Transferrina humana: - - 95% -

Prealbumina humana: 55% - - -

Antitrombina III humana: - 75% - -

"-" = rendimiento relativo inferior al 5%

El procedimiento segun la invencion funcionaba eficazmente a gran escala y daba como resultado una separacion de las protemas del plasma muy similar a los experimentos realizados en columnas de 1 cm de diametro.

Ejemplo comparativo 19

Aislamiento de protemas del plasma humano a partir de plasma Cryo-poor utilizando adsorcion en lecho expandido con un caudal a 450 cm/h y condiciones como en el ejemplo comparativo 5.

Plasma Cryo-poor, tambien llamado criosobrenadante, producido por lenta descongelacion de plasma humano congelado, citratado, y separacion del crioprecipitado, se uso en lugar de solo plasma humano citratado en una repeticion del ejemplo comparativo 5. Todos los demas parametros se mantuvieron constantes.

Resultados

El experimento dio un resultado similar a los resultados obtenidos con solo plasma humano como se describe en el ejemplo comparativo 5 excepto por la ausencia sustancialmente completa de fibrinogeno en la fraccion protemica 4 (eluato 3).

Ejemplo comparativo 20

Aislamiento del fibrinogeno del Crioprecipitado resolubilizado. Adsorcion por lotes utilizando adsorbente de alta densidad que tiene un pequeno diametro del volumen medio.

Adsorbente

El adsorbente se baso en agarosa con partmulas de carburo de wolframio incorporadas, la densidad de las partmulas de conglomerado era de 3,8 g/ml y el diametro de partmula estaba en el intervalo de 20-60 |im con un diametro medio de partmula de 38 |im. El adsorbente comprendfa acido 2-mercaptonicotmico como ligando y una

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

concentracion de ligando de 31 micromoles por ml de adsorbente sedimentado.

Tratamiento previo de la solucion protemica

El crioprecipitado producido por descongelacion lenta de 2.000 ml de plasma humano citratado congelado y separado del criosobrenadante se volvio a solubilizar mezclando con citrato de sodio 10 mM, pH 6,7, dando como resultado aprox. 120 ml de solucion turbia.

Adsorcion por lotes seguida por elucion en columna

El crioprecipitado resolubilizado se transfirio a un vaso de precipitados de vidrio de 200 ml y se anadieron 20 ml de granulos adsorbentes lavados a fondo con citrato de sodio 10 mM de pH 6,7. La mezcla de adsorbente y solucion protemica se realizo con una agitacion mecanica moderada durante 30 minutos a temperatura ambiente. Despues de la adsorcion, el adsorbente se dejo sedimentar y el sobrenadante se decanto. A continuacion se anadio tampon de lavado (citrato de sodio 20 mM, pH 6,7) en 3 veces almuotas de 100 ml con mezcla, sedimentacion y decantacion entre cada adicion. La mezcla se realizo durante 2 minutos para cada adicion. Despues del lavado, el adsorbente se suspendio en una pequena cantidad de tampon de lavado y se vertio en una columna de lecho empaquetado de 2 cm de diametro, en la que se sedimento muy rapidamente. La elucion de la protema unida se realizo entonces anadiendo fosfato de potasio 20 mM + cloruro de sodio 0,8 M, pH 6,7, a un caudal de 2 ml por minuto. La elucion de la columna se controlo con un monitor de UV y el pico de elucion se recogio en una fraccion.

La fraccion protemica de eluato se analizo para determinar su pureza utilizando SDS-PAGE (gel de Tris-glicina de 420% no reducido Invitrogen SDS-APGE, n.° de cat.: EC6025). La actividad funcional del fibrinogeno se determino por el procedimiento de von Clauss (tiempo de coagulacion con trombina bovina).

Resultados

Al detener la mezcla del adsorbente y del crioprecipitado resolubilizado despues de los 30 minutos del penodo de adsorcion, las partmulas adsorbentes sedimentaron en el fondo del recipiente en menos de 30 segundos. La decantacion de los sobrenadantes del adsorbente sedimentado era extremadamente facil dado que los granulos adsorbentes permanecieron en el fondo del vaso de precipitados de vidrio sin ninguna tendencia significativa a mezclarse con la fase lfquida. La adicion y lavado con tampon de lavado 3 veces se realizo igualmente en pocos minutos debido a la rapida separacion del adsorbente. El adsorbente se empaqueto igualmente en la columna de elucion en menos de un minuto (estos procedimientos duran normalmente varias horas con granulos de baja densidad de un diametro tan pequeno). El fibrinogeno se eluyo de la columna en forma de una solucion transparente muy concentrada de fibrinogeno (volumen de elucion = 21 ml).

El analisis por SDS-PAGE del fibrinogeno eluido revelo que la protema era mas del 85% pura, siendo IgG el contaminante principal. No se pudo detectar albumina en el eluato. Se encontro que la actividad biologica del fibrinogeno eluido estaba completamente intacta.

El experimento ilustra la ventaja significativa de usar un adsorbente de alta densidad que tiene un diametro pequeno del volumen medio para la separacion de protemas del plasma del crioprecipitado resolubilizado.

Ejemplo comparativo 21

Aislamiento en cascada de factores de coagulacion/anti-coagulacion, Albumina, IgG, Fibrinogeno, inhibidor de la proteinasa alfa 1 y glicoprotema alfa 1 acida utilizando tres columnas consecutivas y plasma humano con los virus eliminados como solucion protemica.

Adsorbentes

En este experimento se utilizaron los adsorbentes utilizados en el ejemplo comparativo 10 (Ligando = 1,4-diamino- xilileno), en el ejemplo comparativo 5 (acido 2-mercapto-nicotmico) y en el ejemplo comparativo 13 (1,9-diamino- nonano).

Eliminacion de los virus

Una solucion protemica de plasma humano se trato con una solucion disolvente-detergente (conocida como tratamiento S/D) mediante la adicion de fosfato de tri-n-butilo (concentracion final de 0,3%) y Tween-80 (concentracion final del 1%) a 25 grados Celsius seguido de incubacion a la misma temperatura durante 6 horas.

Adsorcion sucesiva

El plasma tratado con S/D se fracciono a continuacion en tres etapas de adsorcion sucesivas:

Columna A: Como se describe en el ejemplo comparativo 10 Columna B: Como se describe en el ejemplo comparativo 5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Columna C: Como se describe en el ejemplo comparativo 13

La columna A se realizo como se describe en el ejemplo comparativo 10. La fraccion combinada ejecutada y lavada se ajusto a pH 5,0 con acido hidroclorico 1 M y despues se diluyo con agua para obtener una dilucion final en relacion con el volumen de material de partida correspondiente a 1+2 (como se describe en el ejemplo comparativo 5) y a continuacion se aplicaron 120 ml de la solucion protemica diluida a la columna B como se describe en el ejemplo comparativo 5. La fraccion combinada ejecutada y de lavado de la columna B se recogio, se pretrato y se proceso como se describe en el ejemplo comparativo 13. Para las tres columnas, todas las fracciones protemicas de elucion se recogieron y se analizaron como se describe en los respectivos ejemplos comparativos.

Resultados

El analisis de los eluatos de todas las columnas dio esencialmente los mismos resultados descritos en los ejemplos comparativos individuales. De ese modo, la etapa de eliminacion vmca por tratamiento con S/D no interfirio con el fraccionamiento de las protemas cuando se usaron los adsorbentes seleccionados. Al mismo tiempo, en ninguna de las fracciones protemicas aisladas se pudo detectar ni Tween-80 ni fosfato de tri-n-butilo que ilustrara sorprendentemente que ninguno de los adsorbentes elegidos se unen a estas sustancias. Por lo tanto, las fracciones protemicas aisladas se agotan eficientemente para las sustancias de eliminacion vmca simultaneamente con la separacion real de las protemas y, por lo tanto, no se requieren etapas adicionales para eliminarlas de las protemas aisladas.

El experimento ilustra ademas la eficaz separacion consecutiva de protemas del plasma humano en la siguientes, en total 6, diferentes fracciones protemicas que tienen muy poca contaminacion cruzada y muy alto rendimiento: A. Factores de coagulacion y de anti-coagulacion, B. Albumina, C. IgG y transferrina, D. Fibrinogeno, E. Inhibidor de la proteinasa alfa 1 y F.Glicoprotema alfa 1 acida.

La experimentacion adicional con el intercambio del orden de las etapas de adsorcion ha demostrado que:

• La columna A debe ser la primera a fin de evitar la inactivacion de los factores de coagulacion a pH 5,0 (utilizado para la columna B)

• La columna C debe estar despues de la columna B para evitar una union excesiva de albumina a la columna C y la consiguiente contaminacion grave del inhibidor de la proteinasa alfa 1.

Referencias

Cohn et al, "Separation into Fractions of Protein and Lipoprotein Components" J. Am. Chem. Soc, 68, 459-475, 1946

E. J. Cohn et al., Preparation and Properties of Serum and Plasma Proteins, IV, A System for the Separation into Fractions of the Protein and Lipoprotein Components of Biological Tissues and Fluids, The Journal of the American Chemical Society, vol. LXVIII (Jan.-Jul. 1946), pp. 459-475

Scand. J. Immunol. Vol. 17, Suppl. 10, 41-56, 1983

Finette G.M.S. et al, Biotechnol. Prog., 1998, 14, pp286-293

Malvern Instruments Ltd (Worcestershire, UK) in their Operators guide (MAN 0320 Issue 1.0 Mar. 2004) to the Mastersizer 2000E

US 2.390.074

US 2.469.193

US 6.617.133

US 6.036.861

US 4.481.189

EP 0 722 771

WO 01/85329

WO 92/18237

WO 2000/25884

WO 02/05923

WO 99/65586

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para el aislamiento de una o mas protemas humanas a partir de una solucion protemica en donde la solucion protemica se obtiene a partir de plasma humano y contiene etanol, y una fraccion de Cohn se selecciona del grupo que consiste en sobrenadante I, sobrenadante II + III, sobrenadante I + II + III, fraccion resolubilizada II + III, fraccion resolubilizada IV-1, y una combinacion de los mismos, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

una fraccion de Cohn

a) ajustar el pH de la solucion protemica a un pH preestablecido;

b) ajustar la fuerza ionica de la solucion protemica a una fuerza ionica preestablecida;

c) aplicar dicha solucion protemica a una columna de adsorcion de lecho expandido que comprende partmulas adsorbentes de alta densidad que tienen una densidad de 1,5 g/ml a 15 g/ml, y en donde el 85% en volumen de las partmulas adsorbentes de alta densidad tienen un diametro de partmula en el intervalo de 10 a 150 |im;

d) lavar la columna con un tampon de lavado para retirar por lavado el material no unido;

e) lavar la columna con un tampon de elucion para eluir una o mas de las protemas humanas desde el adsorbente; en donde el caudal lineal de lfquido a traves de la columna es de al menos 2 cm/min.
2. Un procedimiento segun la reivindicacion 1, en donde el sobrenadante o la fraccion precipitada tiene una concentracion de alcohol de al menos 5% en volumen.
3. Un procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el adsorbente comprende un polfmero matriz funcionalizado que lleva una pluralidad de grupos funcionales unidos de forma covalente que comprenden un sistema de anillo aromatico o heteroaromatico y uno o mas grupos acidos.
4. Un procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dichas una o mas de las protemas de la sangre humana se seleccionan del grupo que consiste en albumina, IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, inhibidor de la proteinasa alfa 1, protema pro-coagulacion de la sangre, protema anti-coagulacion de la sangre, agente trombolttico, protema antiangiogenica, a-2-antiplasmina, inhibidor de la esterasa C-1, apolipoprotema, HDL, LDL, Fibronectina, beta-2-glicoprotema I, fibrinogeno, plasminogeno, plasmina, activador del plasminogeno, inhibidor del plasminogeno, estreptocinasa, inhibidor de la inter-alfa-tripsina, a-2-macroglobulina, protema amiloide, ferritina, prealbumina, GC-globulina, hemopexina, complemento C3, transferrina, urocinasa y a-1-acido-glicoprotema.
5. Un procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde una o mas protemas son retiradas por lavado como una protema no unida con uno o mas tampones de lavado.
6. Un procedimiento segun la reivindicacion 5, en donde dicha protema no unida comprende inhibidor de la proteinasa alfa 1.
7. Un procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el pH preestablecido esta en el intervalo de pH de 3,0 a pH 10,0, y/o en donde la fuerza ionica preestablecida esta en el intervalo de 0,0001 a 12,0.
8. Un procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el adsorbente tiene una capacidad de union dinamica al 10% de saturacion para dicha, al menos una, protema espedfica de al menos 5 g por litro de adsorbente sedimentado.
9. Un procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la albumina y la IgG estan unidas al adsorbente y simultaneamente se obtiene el inhibidor de la proteinasa a-1 como material no unido desde el adsorbente
10. Un procedimiento segun la reivindicacion 9, en donde la albumina y la IgG se obtienen desde el adsorbente por elucion escalonada.

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Fig. 3

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Fig. 4

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rig. 5