ES2600358T3 - Procedimiento para la síntesis de conjugados de glicosaminoglicanos (GAG) con moléculas biológicamente activas, conjugados poliméricos y sus usos relativos - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la síntesis de conjugados de glicosaminoglicanos (GAG) con moléculas biológicamente activas, que comprende las siguientes fases: a) la formación de derivados del GAG con al menos un grupo aldehído (CHO), por la reacción del GAG con una molécula espaciadora (SP), en donde dicha molécula espaciadora comprende, como primer grupo funcional, uno o más grupos aldehído (SP-CHO), estando dichos grupos aldehído (SP-(CHO)) opcionalmente protegidos y, como segundo grupo funcional, un grupo nucleofílico apto para conjugación con el GAG; a1) hidrólisis del compuesto intermedio activado con ácidos acuosos cuando dichos uno o más grupos aldehído están protegidos; b) reacción del aducto obtenido en la fase a) o a1) con al menos una molécula biológicamente activa (TA), caracterizado porque dicha molécula biológicamente activa (TA) comprende un grupo funcional capaz de reaccionar con el grupo aldehído y se selecciona del grupo que consiste de polipéptidos y proteínas, ácidos nucleicos y agentes terapéuticos que contienen al menos un grupo amina no fundamental para el funcionamiento biológico, siendo dicho agente terapéutico seleccionado de grupo que consiste de fármacos antitumorales; agentes antivirales y antibióticos; inhibidores de proteasa y polimerasa; fármacos antiinflamatorios, analgésicos, anestésicos, contra el dolor; narcóticos; esteroideos; minoxidil.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento para la smtesis de conjugados de glicosaminoglicanos (GAG) con moleculas biologicamente activas, conjugados polimericos y sus usos relativos

La presente invencion se refiere a un procedimiento para la smtesis de conjugados de glicosaminoglicanos (GAG) con moleculas biologicamente activas de diferente naturaleza, que comprende pequenas moleculas y macromoleculas. En particular, la presente invencion se refiere a la conjugacion de acido hialuronico (HA) y sus derivados con polipeptidos y protemas con una accion biologica, tales como interferones, eritropoyetinas, factores de crecimiento, insulina, citoquinas, anticuerpos y hormonas.

El uso de polfmeros en el campo biomedico cubre diversos ambitos y esta ampliamente extendido. Los hidrogeles con una base polimerica, por ejemplo, se utilizan comunmente para reducir adherencias quirurgicas en cirug^a abdominal, en cirugfa cosmetica y reconstructiva, en sistemas de liberacion controlada que constan de matrices gelatinosas o como biomateriales.

Otro ejemplo importante es la obtencion de moleculas derivadas con accion farmacologica con cadenas polimericas, que mejoran la solubilidad y ocultan las moleculas con respecto a los procedimientos de degradacion, prolongando su accion.

El ejemplo mas tfpico en este contexto, es el polietilenglicol (PEG) que, aunque no esta presente en los organismos vivos, es totalmente biocompatible y no inmunogenico. PEG se utiliza comunmente para la implementacion del desempeno de los farmacos biologicos (protemas terapeuticas). Cabe resaltar al alfa-interferon pegilado, o peginterferon, por ejemplo, que ha reemplazado la simple version recombinante de la protema, convirtiendose en la terapia elegida para la hepatitis viral asf como en una verdadera bomba (patente europea EP0809996). El lfmite de la adicion de grupos funcionales a las protemas con PEG esta enlazado con la consecucion de conjugados con adicion irregular de grupos funcionales, o, en cualquier caso, con patrones polidispersos. Ademas, los diversos isomeros obtenidos se pueden caracterizar por una actividad biologica diferente, biodisponibilidad, vida media, poder inmunogenico.

Por esta razon, en los anos noventa, se introdujeron los metodos de pegilacion para obtener protemas modificadas solo en sitios espedficos; entre ellos, el extremo N-terminal es el mas accesible como resultado de su pKa considerablemente diferente con respecto a todos los demas grupos amina presentes en las protemas.

En este sentido, Pepinsky y colaboradores (Pepinsky RB, Le Page DJ, Gill A, y colaboradores. J Pharmac Exp Ther, 2001, 297 (3): 1059-1066), han estudiado espedficamente la introduccion de una cadena de PEG al extremo N- terminal del interferon beta 1 (que se utiliza en el tratamiento de la esclerosis multiple) mediante la alquilacion reductiva obtenida de un derivado del aldetudo de PEG. El aducto obtenido mostro una mejor eficacia in vivo debido a una mayor vida media.

Otra protema que ha sido modificada con PEG gracias a este enfoque, es G-CSF, un factor de crecimiento y activacion de granulocitos neutrofilos que Kinstler y colaboradores modificaron con la adicion de grupos funcionales en el extremo N-terminal (patente estadounidense No. 6.153.655). El producto correspondiente (Pegfilgrastim) ya esta en el mercado desde 2002.

En el grupo de los polfmeros en el campo biomedico, los biopolfmeros son de particular interes. Algunos de estos estan naturalmente presentes en los tejidos humanos y tienen propiedades de biocompatibilidad y no inmunogenicidad, lo que representa un valor anadido importante en este contexto. Entre estos biopolfmeros, los glicosaminoglicanos (GAG) son de particular interes, es decir polisacaridos no ramificados que tienen un alto peso molecular, que consisten de unidades de repeticion de disacaridos. Los GAG, por ejemplo, tienen una funcion estructural en el tejido conectivo, tendones y cartflago o pueden actuar como anticoagulantes.

El acido hialuronico (HA) es un GAG que se puede encontrar en la matriz extracelular con una funcion estructural implicada en el proceso de motilidad celular pero tambien tiene una funcion viscoelastica, ademas de ser un agente hidratante y de proliferacion. Gracias a estas caractensticas particulares, se usan el HA y sus derivados como matriz para biomateriales (documento EP 216453) y sistemas de liberacion controlada (solicitudes de patente estadounidenses No. 4.582.865 y 4.636.524; K. Motokawa y colaboradores, Journal of Biomedical Materials Research, Parte A, (2006), pag. 459).

El HA participa tambien en el reconocimiento molecular y en mecanismos de regulacion, ya que es reconocido por receptores celulares tales como RHAMM (CD168), CD44, LYVE1, Layilina. La especificidad de la interaccion de HA con CD44 es de particular importancia. De hecho, este receptor es sobreexpresado en la mayona de los canceres solidos de origen epitelial; al unir los farmacos con actividad anticancengena al HA, se puede explotar el direccionamiento activo del biopolfmero, lo que permite la endocitosis y la liberacion del agente anticancengeno dentro de la celula neoplasica (solicitud internacional de patente W02009001209).

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La formacion de derivados de agentes terapeuticos con poKmeros hidrosolubles (como, por ejemplo, GAG) es particularmente util en el caso de polipeptidos, hormonas polipeptidicas y protemas. Esta clase de moleculas, de hecho, tiene una estructura que es muy susceptible incluso a pequenas modificaciones, causadas por el entorno en el que estan presentes. Ademas, los polipeptidos y las protemas normalmente tienen un lapso de tiempo de eficacia muy limitado por su corta vida media. Esto es porque su formacion de grupos funcionales con polfmeros hidrosolubles es extremadamente importante, lo que mejora tambien la solubilidad, biodisponibilidad y la reduccion de la inmunogenicidad.

Los metodos de conjugacion de GAG con protemas a traves de divinil sulfona (patente estadounidense No. 7.034.127 que se refiere particularmente a IFN), puentes disulfuro (patente estadounidense No. 7.417.021), son conocidos en la tecnica. El unico metodo que permite el control del sitio de formacion de derivados es la reaccion a traves de la formacion de puentes disulfuro; en este caso el polfmero solo puede unirse por sf mismo en correspondencia con residuos de cistema en una forma reducida.

Si la cadena de polipeptido tiene solo un residuo de cistema disponible, y en forma reducida, el metodo de formacion de derivados es en realidad espedfico, pero este es un caso bastante raro. Las protemas, de hecho, a menudo tienen numerosos residuos de cistema, pero, sobre todo, a menudo ocurre que estos residuos ya estan acoplados en puentes disulfuro cuya reduccion implica reordenamientos significativos que pueden conducir a la perdida de funcionalidad de la protema.

Ninguno de los metodos del estado de la tecnica permite obtener un patron de adicion de grupos funcionales umvoco, manteniendo incluso la actividad biologica de la protema, por lo tanto un producto efectivamente monodisperso y eficiente.

Con base en lo anterior, se hace evidente la necesidad de hacer uso de un proceso de conjugacion de moleculas bioactivas, tales como protemas y polipeptidos, a GAG (es decir, HA) sin comprometer la funcionalidad de la protema.

Los autores de la presente invencion ahora han establecido un procedimiento de conjugacion de glicosaminoglicanos que tienen moleculas biologicamente activas (es decir, protemas y polipeptidos) capaces de superar los lfmites del estado de la tecnica, ya que permite que los GAG (tal como HA) se unan sin modificacion de la estructura basica de la protema y sin poner en peligro su funcionalidad. Otra caractenstica que distingue los conjugados entre GAG y un agente terapeutico (TA) de la presente invencion con respecto a los conjugados conocidos en el estado de la tecnica, consiste en el hecho de que el presente metodo de conjugacion conduce a la formacion de un aducto casi monodisperso y no a una mezcla isomerica de productos con diferentes caractensticas qrnmicas, ffsicas, biologicas, cuyo comportamiento, eficacia terapeutica y perfil toxicologico son variables.

Ademas, variando adecuadamente algunos de los parametros de procedimiento (es decir, el pH), tambien es posible seleccionar los grupos amina de la molecula biologicamente activa a la que esta enlazado el glicosaminoglicano; es posible, por ejemplo, enlazar espedficamente el polfmero hidrosoluble hA al extremo N-terminal.

En el caso de farmacos tales como protemas y polipeptidos, el acoplamiento al grupo amina a menudo tiene lugar a traves de acilacion, que conduce a la formacion de amidas, cuyo nitrogeno ya no es capaz de participar en equilibrios acido-base.

El metodo de la conjugacion de la presente invencion se caracteriza porque no implica ninguna alteracion de la carga neta presente en la especie activa, lo que conduce a la transformacion de una amina primaria en una amina secundaria que mantiene la capacidad de intercambio de protones. Esto es una clara ventaja en terminos del mantenimiento de la actividad biologica del TA.

Incluso mas sorprendentemente, los autores de la invencion han descubierto que los bioconjugados de la presente invencion son capaces de aumentar la eficacia del farmaco conjugado y mantenerlo con el tiempo (vease el ejemplo 10 insulina conjugada con HA).

La conjugacion del agente terapeutico con el polfmero hidrosoluble, mejora sus caractensticas, haciendolo mas soluble, biodisponible y mas activo. A diferencia de los polfmeros hidrosolubles que se describen en el estado de la tecnica (tales como, por ejemplo, polietilenglicol, PEG), el uso de glicosaminoglicanos permite obtener sistemas excelentes de suministro de farmacos, que son capaces de dirigir el agente terapeutico con una especificidad inaccesible con otros tipos de polfmeros. Esta especificidad es determinada por el sistema complejo de interacciones del receptor que implican gAg. Ademas, el uso de biopolfmeros que, aunque interactuan con los receptores celulares, no promueve una respuesta inmunologica, lo que resulta en una accion sinergica con una eficacia superior.

La presente invencion describe un procedimiento para la smtesis de conjugados de glicosaminoglicanos (GAG) con moleculas biologicamente activas, que comprende las siguientes fases:

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a) la formacion de derivados del GAG con al menos un grupo aldehndo (CHO), por la reaccion del GAG con una molecula espaciadora (SP), en donde dicha molecula espaciadora comprende, como primer grupo funcional, uno o mas grupos aldehfdo (SP-CHO), estando dichos grupos aldehfdo (SP-(CHO)) opcionalmente protegidos y, como segundo grupo funcional, un grupo nucleofflico apto para conjugacion con el GAG;

a1) hidrolisis del compuesto intermedio activado con acidos acuosos cuando dichos uno o mas grupos aldehfdo estan protegidos;

b) reaccion del aducto obtenido en la fase a) o a1) con al menos una molecula biologicamente activa (TA), caracterizado porque comprende un grupo funcional capaz de reaccionar con el grupo aldehfdo;

siendo dicho agente terapeutico seleccionado del grupo que consiste de farmacos antitumorales; agentes antivirales y antibioticos; inhibidores de proteasa y polimerasa; farmacos antiinflamatorios, analgesicos, anestesicos, contra el dolor; narcoticos; esteroideos; minoxidil.

Los hidrogeles compuestos por acido hialuronico con adicion de grupos funcionales amina o aldehfdo (protegidos o no protegidos) son conocidos en el estado de la tecnica, sin embargo, estos derivados se entrelazan posteriormente con otras moleculas del mismo polisacarido posiblemente formando derivados con diferentes grupos funcionales de tal forma que reaccionan con el grupo amina o aldehfdo del acido hialuronico de partida con adicion de grupos funcionales (EP1757314; Bulpitt P, y colaboradores. J of Biomedical Materials Research, 1999 47 (2) 152-169).

Como ya se menciono, los glicosaminoglicanos (GAG), son polisacaridos no ramificados que tienen un alto peso molecular, formados por unidades de repeticion de disacarido. Una caractenstica comun de los GAG es la presencia de un grupo funcional carboxflico por unidad de disacarido, que puede aparecer en la naturaleza en forma de acido o de sal, generando asf polianiones. En la presente invencion, el acronimo GAG indistintamente indica la forma de acido o la forma de sal de los polisacaridos y en este caso los contraiones mas tfpicos son los metales alcalinos y alcalinoterreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio. Los polfmeros clasificados como GAG, comprenden: acido hialuronico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, sulfato de queratano, heparina, sulfato de heparano. Los GAG que se utilizan dentro de la presente invencion pueden estar en forma nativa o en forma de derivados semisinteticos incluyendo sales de amonio cuaternario, esteres carboxflicos, O-esteres, amidas, derivados percarboxilados, derivados O-sulfatados, derivados N-desacetilados, derivados N-sulfatados o derivados mixtos caracterizados por la presencia simultanea de estas modificaciones. El acronimo GAG se utiliza en lo sucesivo para indicar tanto los polfmeros mencionados en forma nativa como los derivados semisinteticos correspondientes.

Incluso si los GAG, en representaciones normales como formulas estructurales, no portan ningun grupo aldehfdo, cabe recordar que el equilibrio natural que se establece en la solucion entre la forma abierta y la forma cerrada del extremo reductor, pasa a traves de la formacion de un grupo funcional aldehfdo. Sin embargo, esta presencia es cuantitativamente muy limitada, ya que la longitud de las cadenas polimericas crea una baja cantidad de extremos de reductores. Cuando disminuye el peso molecular del GAG, por otro lado, aumenta progresivamente la cantidad relevante de extremos reductores disponibles en forma de aldehfdo, hasta que resulte cuantitativamente util para los oligomeros de los GAG; este es el unico caso en que los extremos reductores pueden utilizarse eficazmente para efectuar el procedimiento de conjugacion descrito en este documento.

En todos los demas casos, teniendo en cuenta que el grupo aldehfdo es bastante inestable incluso bajo condiciones moderadas, es conveniente introducirlo sinteticamente en el polfmero hidrosoluble en la forma de aldehfdo protegido. De esta manera, es posible aislar un compuesto intermedio activado que posteriormente reacciona con el TA, sin tener que poner todos los componentes en contacto en una mezcla de reaccion unica.

Los conjugados de acuerdo con la presente invencion estan relacionados ya que el agente terapeutico TA esta enlazado al polfmero hidrosoluble como una amina secundaria o terciaria. La presencia del grupo aldehfdo (posiblemente protegido como se describe en la fase a)), como un medio para permitir el enlace entre el agente terapeutico y GAG y el metodo de smtesis preparado por el solicitante e ilustrado en el presente documento debe considerarse como el rasgo caractenstico de la presente invencion.

El aducto asf obtenido en la fase a) es lo suficientemente estable para permitir su aislamiento, pero una vez que han sido liberados los grupos aldehfdo, esta disponible con respecto a la reaccion de formacion de un derivado con el agente terapeutico de interes.

El conjugado obtenido puede describirse mediante la siguiente formula general:

GAG - SP - TA

en donde GAG indica el glicosaminoglicano, SP un brazo espaciador y TA el agente terapeutico.

Traduciendo la simbologfa de este metodo de formacion de derivados, se obtiene lo siguiente:

Fase a. GAG + SP-(CHO) ^ GAG-SP-(CHO)

Fase a1. GAG-SP-(CHO) ^ GAG-SP-CHO

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Fase b. GAG-SP-CHO + TA ^ GAG-SP-TA

donde CHO indica el grupo funcional aldehfdo, protegido si esta entre parentesis.

Esta proteccion puede obtenerse facilmente con las tecnicas de smtesis organica conocidas por los expertos en la materia. Una forma conveniente de proteccion, por ejemplo, consiste en el uso de hemiacetales o acetales, obtenidos a traves de la reaccion de aldehfdos con alcoholes o dioles alifaticos o aril alifaticos, que comprenden, por ejemplo, metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, sec-butanol, terc-butanol, iso-butanol, etilen glicol, propilen glicol, 1,3-propandiol, 1,4-butandiol y moleculas estructuralmente similares y es capaz de reaccionar con los aldehfdos para formar acetales que pueden ser aislados. El producto de la fase (a) representa lo que se define como un "compuesto intermedio activado" o un "compuesto intermedio semisintetico activado pero que puede ser aislado".

La qufmica que se utiliza para la adicion de grupos funcionales a GAG con el brazo espaciador para obtener el compuesto intermedio activado puede seleccionarse cada vez utilizando los grupos funcionales presentes en el polfmero o en el correspondiente derivado semisintetico, es decir, el grupo carboxflico, grupos hidroxilo (4 para cada unidad que se repite), a veces presentes en la forma de alquilo o esteres O-sulfatados, el grupo N-acetilo, el grupo N-sulfatado. Ademas, las condiciones de acoplamiento entre el GAG y el brazo espaciador deben ser tales como para no alterar al grupo aldehfdo o eliminar su proteccion cuando esta presente.

El brazo espaciador debe contener un grupo funcional adecuado para la union covalente con el GAG, preferiblemente uno nucleofilico tal como, por ejemplo, un grupo amina o alcohol. Se prefiere el grupo amina, en forma libre o de sal con sales adecuadas por su mayor nucleofilicidad. La molecula espaciadora SP-(CHO) es preferiblemente un amino-aldehfdo, incluso mas preferiblemente protegido como acetal.

Los ejemplos de moleculas que pueden utilizarse como brazo espaciador del tipo GAG-SP-(CHO) comprenden acetales de aminoaldehfdo compuestos de la siguiente forma:

• Grupo amina, libre o en forma de una sal

• Una cadena hidrocarbonada, preferentemente alifatica con un numero de atomos de carbono en el intervalo de 1 a 20

• Un grupo aldehfdo, preferiblemente en la forma de un acetal de acuerdo con el siguiente esquema, en el que n oscila entre 1 a 20, mientras que R y R' pueden ser residuos alifaticos o aril-alifaticos, iguales o diferentes, o la misma cadena que porta diferentes grupos hidroxilo.

imagen1

La cadena alifatica, ademas de ser lineal como la esquematizada, puede ser ramificada o contener grupos arilo.

El solicitante ha verificado que un metodo de acoplamiento conveniente consiste en la formacion de amidas, en la que GAG participa como acido carboxflico, y el brazo espaciador como amina. Este tipo de reaccion se efectua de acuerdo con tecnicas de smtesis organica conocidas por los expertos en la materia y puede llevarse a cabo por ejemplo con la ayuda de agentes de condensacion que promueven el ataque nucleofflico hacia los acidos carboxflicos. Estos reactivos incluyen aquellos que pueden utilizarse en la smtesis de peptidos en fase homogenea o heterogenea. Ejemplos de estos agentes son carbonil diimidazol, carbonato de disuccinimidilo, carbodiimidas, tales como, por ejemplo, 1-etiI-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC); N,N'-diciclohexilcarbodiimida; N-alil-N'-(P- hidroxietil)carbodiimida; N-(a-dimetil-aminopropiI-N'-terc-butilcarbodiimida; N-(a-dimetilaminopropiI)-N'-(P- bromoalil)carbodiimida; 1-(3-dimetilaminopropiI)-3-(6-benzoilaminohexil)carbodiimida; ciclohexil-p-(N-

metilmorfolina)etil carbodiimida p-toluenosulfonato (CMC) y productos similares.

La reaccion puede llevarse a cabo en un medio acuoso o en un disolvente organico a una temperatura de -10 a 70°C dependiendo del tipo de activacion utilizada. Cuando la preparation se lleva a cabo en un medio no acuoso, es conveniente utilizar sales de GAG que son mas solubles bajo estas condiciones, por ejemplo sales de tetraalquilamonio. En cualquier caso, estos contraiones deben eliminarse por medio del procedimiento de intercambio ionico, que debe efectuarse en el polfmero derivado antes de su aislamiento.

Las sales de tetra-alquilamonio de GAG (en particular de HA) son normalmente solubles en disolventes polares aproticos, tales como N-metil-pirrolidona (NMP), dimetilsulfoxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), que son adecuados como medio de reaccion. El uso de estos disolventes esta convenientemente acoplado con el uso de carbonil diimidazol como agente de condensacion, cuya action se ve favorecida por un ambiente ligeramente acido para pequenas cantidades de acidos fuertes, por ejemplo acido clorhfdrico gaseoso burbujeado en solution o acido

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metanosulfonico. Otros disolventes organicos adecuados para efectuar este tipo de smtesis del compuesto intermedio activado son carbonatos organicos, que comprenden carbonato de propileno, carbonato de dietilo, y en general carbonatos organicos sustituidos por cadenas alifaticas, aromaticas o arilalifaticas.

La reaccion es interrumpida por la adicion de una solucion saturada de un haluro alcalino, por ejemplo NaCl, NaBr, KCI, KBr. La hidratacion de la mezcla de reaccion desactiva los promotores de la formacion de enlaces amida, mientras que la sal, agregada en tal cantidad para que este en gran exceso con respecto a las moles de la unidad repetitiva de GAG, provoca un intercambio efectivo de iones. El requerimiento estequiometrico del gran exceso se obtiene mediante la adicion de una cantidad de solucion saturada de haluro alcalino que va desde 0,5% a 30% en volumen y preferiblemente de 5 a 15% en volumen.

La correspondiente sal alcalina del compuesto intermedio activado es purificada posteriormente por dialisis y despues liofilizada. Aunque este producto puede ser aislado y es estable, es activo con respecto a la posterior reaccion de adicion de grupos funcionales con agentes terapeuticos que contienen grupos funcionales sensibles a la reaccion hacia los aldehndos.

Un metodo alternativo de purificacion/aislamiento del compuesto intermedio activado consiste en la aplicacion de ciclos de precipitacion-lavado con mezclas de disolventes que tienen una polaridad adecuada. La precipitacion- lavado puede realizarse, por ejemplo, con alcoholes tales como metanol, etanol, n-propanol, isopropanol y homologos superiores, posiblemente mezclados con agua; otros disolventes adecuados son acetona, acetato de etilo, tetrahidrofurano, dioxano, acetonitrilo, disolventes polares aproticos (por ejemplo dimetilformamida o dimetilsulfoxido, n-metil pirrolidona, n-metilacetamida), carbonatos organicos. Cada uno de los disolventes mencionados puede utilizarse solos o en combinacion con cualquier otro disolvente o con agua a fin de obtener la polaridad y otras caractensticas fisicoqmmicas con mayor precision. Las mezclas que comprenden los alcoholes anteriores, acetona y agua son los preferidos.

La fase (b) que describe el acoplamiento entre el GAG-SP-(CHO) y TA tiene lugar a traves de una primera fase a1) para liberar el grupo aldehndo (cuando esta protegido), que consiste en la hidrolisis del acetal que se efectua por tratamiento con acidos acuosos de acuerdo con las tecnicas estandar conocidas por los expertos en la materia.

Dicha fase de hidrolisis a1) con acidos acuosos de los compuestos intermedios activados para liberar el grupo aldehndo preferentemente tiene lugar en un pH que vana de 1,5 a 3,0, preferiblemente con un pH que vana de 2,0 a 2,5, a una temperatura que va desde 25 a 65°C, preferiblemente de 40 a 60°C, durante al menos 30 minutos.

El aldehndo libre ahora es susceptible al ataque nucleofflico en la parte del agente terapeutico, activado a traves del grupo amina presente en la molecula de TA, que conduce a la formacion de una imina, reducida a amina a traves de los hidruros inorganicos tfpicamente utilizados en reacciones de aminacion reductiva, por ejemplo cianoborohidruro, hidruro de aluminio y litio, hidruro de boro y sodio y similares.

Los principios activos con una accion farmaceutica de interes dentro del ambito de la presente invencion comprenden, por ejemplo, "pequenas moleculas" con accion farmacologica, y/o polipeptidos, hormonas, protemas, glicoprotemas, enzimas, citoquinas, factores de crecimiento o factores de diferenciacion celular, anticuerpos, polfmeros terapeuticos, acidos nucleicos o una combinacion de los mismos. De acuerdo con modalidades preferidas de la presente invencion, la "especie activa" que puede ser conjugada con HA con la tecnica descrita en la presente invencion comprende:

Polipeptidos y/o protemas, en particular:

- inmunomoduladores, en particular protemas pertenecientes a la familia de interferones, tales como, por ejemplo, interferones de tipo I, es decir, aquellos que se unen por sf mismos al mismo receptor de IFNa, que ademas de FNa comprende IFNp e IFNui; interferones de tipo II y tipo III, es decir, interferones que se unen por sf mismos al receptor de IFNy e IFNA, respectivamente.

- Factores de crecimiento, en particular:

1. Eritropoyetinas y en general moleculas identificadas como ESA (agente estimulador de eritropoyesis), que comprende epoetina a y epoetina p, epoetina u>, epoetina 8, darbepoetina, CERA y sustancias generadas o derivadas de las mismas, tal como las protemas de fusion mediante la estimulacion de la eritropoyesis,

2. Factores que estimulan la hematopoyesis, tales como los factores GM-CSF G-CSF, que tambien pueden utilizarse en el campo de la oncologfa;

3. Factores de crecimiento de huesos y cartflagos que comprenden las protemas pertenecientes a la familia de la protema morfogenica osea (BMP) tal como, por ejemplo, BMp1, BMP2, bMp3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7 (tambien denominada en la literatura como OP1), BMP8a, BMP8b, BMP10, BMP15, BMP9 tambien conocido como GDF2 (Factor 2 de diferenciacion del crecimiento), protemas pertenecientes a la superfamilia de TGF-beta, VEGF, PDGF, protemas pertenecientes a la familia FGF;

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- Citoquinas y sus antagonistas receptores, tales como, por ejemplo, IL2, TNF con sus receptores solubles o anticuerpos monoclonales correlacionados; IL1-ra (antagonista del receptor de IL1, para el tratamiento de la artritis y la artritis reumatoide) y, en general, receptores solubles de citoquinas proinflamatorias;

- Glicoprotemas, en particular Lubricina;

- Enzimas: en particular superoxido dismutasa (SOD); Ribonucleasa y Glucocerebrosidasa;

- Anticuerpos: en particular anticuerpos monoclonales o sus conjugados o protemas de fusion; anticuerpos monoclonales que ejercen una accion antitumoral; anticuerpos monoclonales que ejercen una accion antiinflamatoria;

- Hormonas: hormonas proteicas o que contienen al menos parcialmente una cadena polipeptidica, en particular calcitonina, insulina y sus analogos y la hormona de crecimiento (GH o hGH).

Agentes terapeuticos que contienen grupos amina no fundamentales para el funcionamiento biologico:

- Farmacos antitumorales, en particular:

1. Taxanos, alcaloides de la Vinca; camptotecinas;

2. Ureas sustituidas;

3. Complejos de platino, oro, plata y otros metales utilizados por ejemplo en la terapia de tumores, osteoartritis y/o artritis reumatoide o agentes bacteriostaticos/antibacterianos;

4. Metotrexato, trimetrexato, pemetrexed, tetrahidrofolato,

5. Analogos de pirimidina; citidina, purina;

6. Anticuerpos oncologicos y analogos; antracenodionas;

- Agentes antivirales y antibioticos;

- Inhibidores de proteasa y polimerasa;

- Farmacos antiinflamatorios, analgesicos, anestesicos, contra el dolor con una accion central o periferica;

- Narcoticos opiaceos o no opiaceos;

- Esteroides;

- Minoxidil (normalmente utilizado en dermatologfa).

Acidos nucleicos, en particular

1. ARN pequeno de interferencia (o ARN corto de interferencia, comunmente conocido como ARNpi, esto es, una molecula de ARN entre 20 y 25 nucleotidos de longitud. Mas espedficamente, los ARNpi estan involucrados en la inhibicion de la expresion de genes individuales, su uso para el tratamiento de la degeneracion macular esta actualmente en fase experimental).

2. Los microARN (microARN, ARNmi, son pequenas moleculas de ARN no codificadoras que modulan la expresion de genes objetivo espedficos. Pueden, por tanto, funcionar como supresores tumorales de formas hematopoyeticas malignas espedficas).

3. ARN antisentido

Las sustancias enumeradas anteriormente se indican en lo sucesivo como "agentes terapeuticos" (TA en forma abreviada) o "especies activas".

La estructura molecular del TA debe portar un grupo funcional capaz de reaccionar con aldelddos, por ejemplo un grupo amina. Si este grupo no esta presente en el TA, puede introducirse mediante tecnicas de qmmica organica sintetica conocidas por los expertos en la materia. De esta manera, es posible enlazar practicamente cualquier molecula a GAG.

Dentro del alcance de la presente invencion, el uso de acido hialuronico (HA) y sus sales indicadas anteriormente, es de particular interes. El HA utilizado en la presente invencion puede derivarse de cualquier fuente; puede ser producido, por ejemplo, por extraccion de la planta cresta de gallo, en forma fermentativa, o biotecnologicamente y tiene un peso molecular de 400 a 3 x 106 Da, preferiblemente de 1 x 103 Da a 1 x 106 Da, incluso mas preferentemente de 10.000 a 750.000 Da.

La reaccion de formacion de derivados de la invencion puede aplicarse tanto al polisacarido como tal como al mismo previamente modificado. Las redes moleculares se obtienen por lo tanto a partir de acido hialuronico modificado de diferentes maneras conforme a metodos conocidos y en particular:

- HA convertido en sal con bases organicas y/o inorganicas (EP 138572 B1);

- HYAFF®: esteres de HA con alcoholes de la serie alifatica, aril-alifatica, cicloalifatica, aromatica, dclica y heterodclica, con un porcentaje de esterificacion, que puede variar de acuerdo con el tipo y la longitud del alcohol utilizado, preferentemente de 20 a 80%, mientras que el porcentaje restante de HA no esterificado se puede convertir en sal con bases organicas y/o inorganicas (EP 216453);

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- HYADD®: amidas de HA con aminas de la serie alifatica, aril-alifatica, cicloalifatica, aromatica, dclica y heterodclica, con un porcentaje de amidacion de 0,1 a 50%, mientras que el porcentaje restante de HA no sometido a amidacion puede ser convertido en sal con bases organicas y/o inorganicas (EP 1095064);

- Derivados O-sulfatados de HA hasta el cuarto grado de sulfatacion (EP 702699);

- ACP©: esteres internos de HA con un porcentaje de esterificacion no superior al 20%, preferiblemente de 0,05 a 10% de esterificacion, mientras que el porcentaje restante de HA no esterificado puede formar sales con bases organicas y/o inorganicas (EP 341745);

- desacetilados de HA: estos se derivan de la desacetilacion de los residuos de N-acetil-glucosamina presentes en HA, con un porcentaje de desacetilacion preferentemente en el intervalo de 0,1 a 30%, mientras que todos los grupos carboxflicos de HA pueden formar sales con bases organicas y/o inorganicas (EP 1313772);

- HYOXXMR: derivados de percarboxilato de HA obtenidos de la oxidacion del hidroxilo primario de la fraccion de N-acetil-glucosamina con un grado de percarboxilacion de 0,1 a 100% y preferiblemente de 25 a 75%. Todos los grupos carboxflicos de HA pueden formar sales con bases organicas y/o inorganicas (EP 1339753).

De acuerdo a una modalidad preferida de la invencion, el proceso de conjugacion entre HA y agentes terapeuticos comprende las siguientes fases:

a) reaccion de formacion de derivados de HA con amino aldehffdos protegidos SP-(CHO) en donde HA participa en la reaccion con el grupo carboxflico que forma una amida con la amina del amino-aldehffdo. Este pasaje se realiza preferentemente a partir de HATBA (sal tetrabutilamonio de HA) u otra sal soluble en un disolvente organico aprotico polar (DMSO, NMP, DMF, carbonatos organicos). El compuesto intermedio activado pero que puede ser aislado se obtiene de este pasaje.

a1) hidrolisis del compuesto intermedio activado, es decir, HA-SP-(CHO) ^ HA-SP-CHO para liberar el grupo aldehffdo: reaccion con acido fosforico dentro de un intervalo de pH de 1,5-3, preferiblemente con un pH que varia entre 2,0 y 2,5, a una temperatura que va desde 25 a 65°C, preferiblemente de 40°C a 60°C, durante al menos 30 minutos;

b) reaccion de conjugacion del compuesto intermedio activado con la molecula de TA, preferentemente una protema. Mediante la adicion de la protema bajo condiciones reductoras con cianoborohidruro de sodio, ocurre la formacion de imina y por lo tanto una amina. Si el agente terapeutico seleccionado es un compuesto polifuncional, existe la posibilidad de crear diferentes isomeros posicionales con diferentes caractensticas qmmicas, ffsicas y biologicas. Esta condicion ffpicamente se verifica en el caso de protemas, de las cuales el interferon, que cuenta con 12 sitios potenciales de union, representa un ejemplo. Cambiando el pH en el que se efectua esta reaccion, se genera preferiblemente una adicion de grupos funcionales en el N-terminal (pH 6,0) con todas las ventajas que esto implica o una adicion de grupos funcionales con HA unido a la protema en diferentes puntos, con un esquema no reproducible (pH > 7,5).

La qrnmica utilizada para preparar los conjugados de acuerdo con la presente invencion permite seleccionar en forma efectiva el patron de adicion de grupos funcionales.

Este importante resultado se logro gracias a la utilizacion del grupo aldehffdo, cuya reactividad particular con respecto a ataques nucleofflicos permite una selectividad suficiente con respecto al poder nucleofflico del grupo entrante. Las condiciones espedficas para ejercer convenientemente esta selectividad se determinan en caso a caso a traves de optimizaciones progresivas. Volviendo al ejemplo de la especie activa polifuncional mas importante, es decir, las protemas, pueden encontrarse los grupos amina nucleofflicos en posiciones que tienen accesibilidades diferentes, pero sobre todo pueden distinguirse con respecto a su fuerza como bases, expresada como pKa. Los grupos amina en la posicion £ presente en los residuos de lisina normalmente muestran un pKa en el intervalo de 9,3 a 9,5, mientras que los grupos amina en a en el carboxilo tienen un pKa normalmente de 7,6 a 8. Con el fin de favorecer la reaccion de las aminas en £ debe realizarse el procedimiento de acoplamiento a un pH superior a 8,0, preferiblemente en el intervalo de 8,5 a 9,0; con el fin de favorecer la reactividad de las aminas en el N-terminal, por otra parte, el pH debe estar dentro del intervalo de 5,0 y 6,5 y preferiblemente entre 5,5 y 6,2. Este segundo caso es el mas importante ya que las protemas ffpicamente tienen solo un grupo a-amina libre, situado en el extremo N- terminal. Estableciendo las condiciones de reaccion para reaccionar predominantemente, este grupo amina conduce a la formacion de un conjugado casi monodisperso entre GAG y las protemas.

Aunque los valores de pH indicados en su mayona representan las protemas de interes para la presente invencion, son indicativos ya que pueden cambiar ligeramente para moleculas diferentes.

Este procedimiento de smtesis permite obtener conjugados bioactivos, que tienen desempenos sustancialmente mas elevados con respecto a los conjugados conocidos en el estado de la tecnica. Mediante el estudio de las propiedades biologicas de estos nuevos conjugados, el solicitante ha encontrado de hecho caractensticas sustancialmente mas elevadas con respecto a los conjugados polimericos conocidos en el estado de la tecnica.

En particular, los conjugados de la invencion obtenidos despues de la formacion de derivados con acido hialuronico mantienen las propiedades biologicas tanto del principio activo como del polisacarido de partida, pero se

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caracterizan por diferentes propiedades mecanicas y reologicas. Las condiciones bajo las cuales se efectua el procedimiento de acoplamiento son tales que no modifican la funcionalidad biologica del TA.

El solicitante ha aplicado en realidad el procedimiento de smtesis de acuerdo con la presente invencion para sintetizar nuevos bioconjugados:

- entre acido hialuronico (HA) e interferon (IFNa)

- entre acido hialuronico y la hormona del crecimiento (hGH)

- entre acido hialuronico (HA) y RNasa A

- entre acido hialuronico e insulina,

- entre acido hialuronico y calcitonina de salmon

(HA-sCT)

- entre acido hialuronico e lL1-ra

- entre acido hialuronico y Lubricina,

que son por lo tanto, un objetivo de la presente invencion.

La preparacion del conjugado HA-IFNa se describe en el Ejemplo 3. IFN alfa 2a humano recombinante es una protema que tiene un peso molecular de alrededor de 20 kDa cuya estructura se caracteriza por 4 cistemas que forman 2 puentes disulfuro y 12 grupos amina, de los cuales 11 en la cadena lateral de los residuos de lisina, ademas del extremo N-terminal. Cabe senalar que los dos puentes disulfuro presentes en la protema nativa, que estan incluidos entre los residuos 29 y 138, son fundamentales para la actividad biologica, por lo tanto las condiciones reductoras necesarias para aplicar el metodo de acuerdo con la patente estadounidense No. 7.417.021, senan destructivas.

Las condiciones de smtesis utilizadas son tales que permiten obtener un conjugado casi monodisperso, con el HA predominantemente enlazado al extremo N-terminal de la citoquina. Esta especificidad se refleja en el mantenimiento y/o aumento de la actividad biologica del IFN y/o otros bioconjugados, para los cuales se ha desarrollado el metodo de medicion de acuerdo con el Ejemplo 4.

Se han efectuado experimentos de tomograffa de fluorescencia sobre el mismo conjugado HA-IFN, para observar la biodistribucion in vivo tras la administracion endovenosa. A fin de permitir que se revele con esta tecnica, se preparo el bioconjugado de acuerdo con el Ejemplo 6, para incluir una sonda fluorescente covalentemente enlazada. El perfil de biodistribucion encontrado (Ejemplo 7) muestra que en una escala de tiempo bastante rapida, la fluorescencia se acumula predominantemente a nivel hepatico y en menor medida en el area del pecho, debido al atrapamiento no especifico en la microcirculacion pulmonar. En penodos de tiempo mas largos, tambien se observa una acumulacion en la region pelvica, en particular en la region vesical, justificada no tanto por el mecanismo normal de excrecion- absorcion del bioconjugado, sino por la hidrolisis lenta y liberacion de la sonda fluorescente. La evidencia de esta acumulacion sustancial hepatica y pulmonar revela una propiedad mas interesante, que no se presenta por los conjugados conocidos en el estado de la tecnica, es decir, la posibilidad de dirigir la especie terapeutica espedficamente a ciertos tipos de tejido.

Un objetivo adicional de la invencion, se refiere por lo tanto al uso en el campo medico de los conjugados de acuerdo con la invencion, en particular en terapia antiviral y antitumoral. De acuerdo a una realizacion preferida, un objetivo de la invencion se refiere a la utilizacion del conjugado HA-IFN como un sistema para estimular el sistema inmune con respecto a las infecciones de tipo viral, tales como hepatitis (preferiblemente por administracion endovenosa) o patologfas causadas por agentes virales, tales como, por ejemplo, herpes labial, genital y en infecciones causadas por el VPH (virus del papiloma humano) capaz de causar verrugas (preferiblemente por aplicacion topica) o cancer de cuello uterino. El conjugado HA-IFN puede por lo tanto utilizarse tambien ventajosamente como agente antitumoral.

Como se muestra en el Ejemplo 10, el conjugado insulina-HA no solo aumenta al doble la eficacia farmacologica del agente terapeutico, sino que tambien mantiene la capacidad de la insulina para controlar el nivel de glucosa basal con el tiempo. En este caso, se revela una propiedad adicional del bioconjugado, que consiste en la creacion de sistemas de liberacion controlada de agentes terapeuticos.

En el Ejemplo 9 que ilustra la preparacion del bioconjugado HA-RNasa A, el mantenimiento de la actividad biologica de la enzima unida es aun mas evidente, ya que la medicion de la actividad enzimatica se efectua, directamente despues de la concentracion del sustrato con tecnicas espectroscopicas.

El solicitante tambien verifico que, una vez conjugado con HA y administrado en forma endovenosa, el agente terapeutico muestra una rapida acumulacion hepatica y pulmonar cuantitativa. Este aspecto de la invencion hace que su uso sea particularmente ventajoso en terapias relacionadas con patologfas que interesan el Idgado, como por

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ejemplo, hepatopatias correlacionadas con virus, fibrosis hepatica, cirrosis hepatica, enfermedad de Gaucher, tumores de tugado y pulmon. La cinetica y efectividad del atrapamiento hepatico y pulmonar del conjugado dependen en HA, modificando su peso molecular, el perfil de acumulacion puede modificarse hasta que se vuelva insignificante.

Por otro lado, la administracion endovenosa, no es la unica forma posible. El solicitante de hecho ha verificado que la administracion subcutanea del conjugado es efectiva en la liberacion lenta del TA (Ejemplo 10).

El Ejemplo 11 ilustra el procedimiento de preparacion del bioconjugado HA-calcitonina: la calcitonina es una hormona polipeptfdica lineal de 32 amino acidos que se produce en los seres humanos principalmente por parte de las celulas parafoliculares de la tiroides, esta hormona participa en el metabolismo del calcio (Ca2+) y el fosforo. Para ser espedficos, la calcitonina afecta los niveles de Ca2+ en sangre de cuatro formas:

• lnhibe la absorcion de Ca2+ por los intestinos

• Inhibe la actividad de los osteoclastos en huesos

• lnhibe la reabsorcion de fosfato por el los tubulos del rinon

• Aumenta la reabsorcion absoluta de Ca2+ y Mg2+ por los tubulos del rinon, calcitonina es una hormona renal de conservacion de Ca.

Por lo tanto, se utiliza la calcitonina para el tratamiento de:

• Osteoporosis postmenopausica

• Hipocalcemia

• Enfermedad de Paget

• Metastasis osea

La calcitonina tiene vidas medias cortas de absorcion y eliminacion de 10-15 minutos y 50-80 minutos, respectivamente. La calcitonina de salmon se degrada principalmente y casi exclusivamente en los rinones, formando fragmentos farmacologicamente inactivos de la molecula.

El nuevo bioconjugado HA-calcitonina, es por lo tanto, extremadamente importante, debido al hecho de que, como se describe en el Ejemplo 11, revela una accion mas prolongada de hipocalcemizacion con respecto a la hormona libre, permitiendo un efecto mas marcado que nos permite estudiar nuevos usos clmicos tales como la administracion intraarticular para la proteccion de los cartflagos y huesos en patologfas degenerativas tales como la artritis reumatoide y la artrosis.

El Ejemplo 13 ilustra el procedimiento de smtesis del bioconjugado HA-lubricina: la lubricina esta presente en el fluido sinovial y en la superficie del cartilago articular y por lo tanto desempena un papel importante en la lubricacion de las articulaciones y la homeostasis sinovial. Los fibroblastos sinoviales humanos han mostrado que producen lubricina.

El funcionamiento optimo de las articulaciones sinoviales depende de los coeficientes extremadamente bajos de friccion entre los tejidos que se articulan. Normalmente, se mantiene una superficie contigua, bien lubricada, en el cartflago articular. Durante la osteoartritis (OA), sin embargo, una lubricacion reducida contribuye a la degradacion de la matriz del cartflago y de la fibrilacion; esto a su vez contribuye al dolor y la disfuncion de la articulacion. Una lubricacion reducida tambien conduce al dolor y la disfuncion de la articulacion en otras formas de artritis, incluyendo la artritis reumatoide (RA). Tambien se ha detectado la expresion de lubricina y la protema localizada en el tendon, menisco, pulmon, higado. corazon, hueso, ligamento, musculo y piel.

Para estos tejidos, una superficie lubricada tambien contribuye a un funcionamiento optimo. Ademas de requerir una superficie lubricada, la funcion normal del tendon requiere de la prevencion de la adhesion celular a las superficies de los tendones.

Por lo tanto, el solicitante esta describiendo el nuevo uso para el bioconjugado novedoso de HA-lubricina, como lubricantes, agentes antiadhesivos y/o suplementos intraarticulares, por ejemplo, para articulaciones sinoviales, meniscos, tendones, peritoneo, pericardio y pleura, permitiendo un tiempo de residencia in situ y una mayor efectividad que la descrita para los TA no conjugados.

En este contexto, los conjugados de acuerdo con la presente invencion pueden utilizarse ventajosamente como sistemas para la liberacion controlada de los TA. Estos sistemas son extremadamente utiles para los TA, que tiene una ventana de efectividad terapeutica limitada a un penodo de tiempo restringido. Los ejemplos tfpicos de los TA con estas caractensticas son protemas terapeuticas, que comprenden citoquinas, factores de crecimiento, enzimas, hormonas, tales como por ejemplo GH, glucocerebrosidasa, sOd, IL1-ra, insulina y analogos, GM-CSF, GCSF, EPO y en general los ESA descritos anteriormente, interferones de tipo I, II, Ill, anticuerpos monoclonales, protemas de fusion y otros. Por ejemplo, la insulina, fue el primer farmaco biotecnologico y continua teniendo importancia

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primordial ya que es fundamental para el creciente numero de personas que padecen diabetes. Actualmente se encuentran disponibles formas de retardo de la insulina, pero no existen en el mercado sistemas de administracion de farmacos (conjugacion con poKmeros, micro-nanopartfculas).

Como se muestra en el Ejemplo 10, el metodo de conjugacion de acuerdo con la presente invencion es adecuado para la creacion de sistemas de liberacion controlada que son eficaces en la liberacion lenta del TA en forma activa y la prolongacion de la accion, multiplicando por dos su eficacia terapeutica. Tambien debe tenerse en cuenta el aspecto adicional relacionado con el cumplimiento por parte de los pacientes que en el presente regimen terapeutico deben someterse a varias administraciones subcutaneas diarias con evidentes molestias en su vida social y en el agotamiento progresivo de los sitios adecuados para la inyeccion. Consideraciones analogas tambien son validas para las otras sustancias terapeuticas enumeradas en el presente documento.

Los conjugados entre el acido hialuronico (preferiblemente sus derivados) y agentes terapeuticos de acuerdo con la presente invencion pueden por lo tanto ser ventajosamente utilizados para la preparacion de biomateriales con mejores caractensticas de efectividad, biocompatibilidad, biodisponibilidad, la posibilidad de direccionar el TA a tipos espedficos de celulas o tejidos de organos y la posibilidad de mejorar el perfil farmacocinetico por la liberacion controlada y mayor duracion del TA.

Pueden utilizarse ventajosamente los conjugados entre el acido hialuronico y agentes terapeuticos de acuerdo con la presente invencion para la preparacion de composiciones farmaceuticas adecuadas para administracion parenteral o no parenteral, que comprenden formulaciones para uso oral, soluciones inyectables mediante inyeccion intradermica, endovenosa, intramuscular, subcutanea, intraarterial, intratecal, intracardiaca, intrasinovial, intraperitoneal, intravesical o geles, cremas, unguentos, espumas, polvo seco, aerosoles, emplastos cutaneos o transdermicos para uso topico, pero tambien preparaciones farmaceuticas para uso rectal, intravaginal, sublingual, intraocular.

De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, las composiciones farmaceuticas son adecuadas para administracion endovenosa para una localizacion hepatica y/o pulmonar. De acuerdo con una realizacion mas preferida, las composiciones farmaceuticas son adecuadas para administracion subcutanea por medio de sistemas de liberacion controlada.

Los conjugados de acuerdo con la invencion mantienen la funcion biologica de los principios activos contenidos en ellos, pero con respecto a la forma aislada de estos, pueden utilizarse como sistemas para su direccionamiento y liberacion controlada. El direccionamiento hacia tejidos espedficos o tipos de celulas se obtiene seleccionando adecuadamente el tipo de GAG o derivado semisintetico, mientras que la cinetica de liberacion es modulada por la naturaleza del enlace entre el GAG o el derivado semisintetico y especies activas.

Por ultimo, la invencion se refiere a un biomaterial caracterizado por una matriz que comprende los conjugados que se definieron anteriormente.

A continuacion se describe la presente invencion para fines ilustrativos pero no limitantes, de acuerdo con sus realizaciones preferidas con especial referencia a las figuras de los dibujos adjuntos, en donde:

La Figura 1 muestra el esquema de smtesis del GAG con la funcion aldehndo, representado para propositos ilustrativos por el acido hialuronico (HA), mientras que el prototipo del brazo espaciador que porta el grupo aldehndo protegido representado es 4-amino-butiraldehndo-diacetal.

La Figura 2 muestra el espectro de RMN H del acido hialuronico con la funcion aldetndo. Este es un espectro de RMN de protones registrado en agua deuterada. La senal del proton de metilo del grupo acetilo presente en HA (1,88 ppm) esta flanqueada por una senal adicional que es atribuida al proton del metilo del acetal (1,05 ppm).

La Figura 3 muestra imagenes tomograficas de fluorescencia despues de administracion endovenosa del conjugado HA-IFN marcado con una sonda fluorescente en ratones.

La Figura 4 muestra los resultados de la prueba de citotoxicidad (ATPlite) en HA-IFN llevada a cabo en una lmea celular primaria humana de carcinoma de ovario (pdOVCA1), sensible a la accion antiproliferativa de IFN.

La Figura 5 muestra el cromatograma del conjugado HA-IFN que muestra respectivamente IFN libre y conjugado.

La Figura 6 muestra el cromatograma del conjugado HA-hGH que muestra respectivamente hGH libre y conjugado. La Figura 7 muestra el cromatograma del conjugado HA-RNasa que muestra respectivamente enzima ARNpi libre y conjugada.

La Figura 8 muestra el cromatograma del conjugado HA-insulina que muestra respectivamente insulina libre y conjugada.

La Figura 9 muestra la actividad biologica in vivo del conjugado insulina-HA administrado subcutaneamente en una dosis de 5 |jg o 20 |jg de insulina mediante la determinacion de los niveles de glucosa en la sangre de los animales tratados con respecto a los animales de control y no tratados.

La Figura 10 muestra la eficacia in vivo del HA-IFN bioconjugado contra IFN contra el producto no tratado.

La Figura 11 muestra el analisis de exclusion dimensional de HA-sCT utilizando una columna GF-250 (Agilent, 4,6 x 25 cm) con un flujo de 0,3 mL/min. Eluyente: regulador Na2HPO4 0,1 M, NaCl 0,2 M, pH 7,2, que contiene 20% de acetonitrilo. Se controlo el efluente de la columna mediante la medicion de la absorbancia a 280 nm. Se removio

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completamente la calcitonina que eluye en 9,2 minutes. Se inyecto el regulador de la corrida para demostrar que el pico a los 11 minutes corresponde al final del volumen de separacion de la columna utilizada.

La Figura 12 representa el perfil del nivel de calcio en la sangre despues de la administracion por via endovenosa de sCT, HA-sCT, Ha y solucion salina. Los datos representan el promedio de tres ratas y estan representados con los promedios relativos de las desviaciones estandar.

La Figura 13 muestra el analisis de exclusion dimensional de HA-IL1-ra utilizando una columna GF-250 (Agilent, 4,6 x 25 cm) con un flujo de 0,3 mL/min. Eluyente: regulador de Na2HPO4 0,1 M, NaCl 0,2 M, pH 7,2 que contiene 20% de acetonitrilo. Se controlo el efluente de la columna mediante la medicion de la absorbancia a 280 nm. El lL-1-ra que eluye en 9,75 minutos fue completamente removido.

La invencion sera descrita a continuacion con mayor detalle en los siguientes ejemplos, con el proposito, sin limitar sus posibles aplicaciones, de proporcionar una mejor comprension e ilustrar sus posibles realizaciones, que en cualquier caso pueden ser variadas por los expertos en el campo sin comprometer su espmtu basico.

Ejemplos

El esquema en la Figura 1 ilustra la sucesion de las reacciones del procedimiento de smtesis de conjugados GAG- TA descrito anteriormente, que describe la estructura molecular de las especies involucradas. El acido hialuronico (HA) esta representado para fines ilustrativos como GAG, mientras que el prototipo del brazo espaciador que porta el grupo aldetffdo protegido representado es 4-amino-butanal-diacetal.

Ejemplo 1: Smtesis de un derivado aldetffdo de HA que tiene un peso molecular promedio de 200 kDa

Se disuelven 5,00 g de acido hialuronico de una fraccion de hialastina de origen fermentativo de una sal de sodio (PM 200 kDa) en 250 ml de agua y la solucion resultante es percolada a traves de una columna de vidrio cargada previamente con 100 cm3 de resina Dowex en forma de tetrabutilamonio. Se recoge y liofiliza una solucion de una sal de HA eluida de TBA. Se obtienen 7,50 g de producto, que se disuelven en 400 ml de N-metil-pirrolidona (NMP).

Despues de la disolucion completa de la sal de HA, se anaden 300 mg de carbonil-diimidazol (CDI), 450 pl de acido metanosulfonico y 387 mg de dietilacetal 4-aminobutiraldehido y se deja reaccionar la mezcla a 40°C durante la noche bajo agitacion suave. Se detiene la reaccion mediante la adicion de 0,1 volumenes de una solucion acuosa saturada de NaCl y, despues de 30 minutos, se agrega la solucion a 3 volumenes de etanol absoluto para separar el derivado de HA de acuerdo con la Figura 1 de la mezcla de reaccion.

Se lava nuevamente el precipitado en etanol y finalmente se seca con alto vacte a 40°C. Se obtienen 4,49 g del derivado, que contiene 13% en moles de grupos aldetffdo protegidos con respecto a las unidades repetitivas de HA. El espectro de RMN de este producto, cuya smtesis se ha efectuado como se indica en el presente documento, se muestra en la Figura 2.

Ejemplo 2: Smtesis de un derivado de aldetffdo de HA que tiene un peso molecular promedio de 100 kDa

Se disuelven 4,00 g de la sal sodica del acido hialuronico que tiene un peso molecular promedio de 100 kDa, de origen extractivo, en 500 ml de agua para preparaciones inyectables. La solucion obtenida es llevada a una temperatura de 4°C y se anaden luego 290 mg (15% en moles) de EDC, 175 mg de NHS y 245 mg de 4- aminobutiraldehido dietilacetal. Despues de 18 horas de reaccion, se precipita el producto mediante la adicion de 4 volumenes de etanol absoluto y se lava con mezclas hidroalcoholicas con un contenido creciente de etanol hasta llegar a etanol absoluto. El producto demuestra estar sustituido con 11,9% moles/mol.

Ejemplo 3: Smtesis de un conjugado de HA-interferon

Se disuelven 3,00 g de un derivado aldetffdo de HA (compuesto intermedio activado) de acuerdo con el Ejemplo 1 hasta una concentracion de 10 mg/ml en medio acido por la presencia de acido fosforico a una temperatura de 60°C durante 2 horas. Se anaden 4 x 10'5 moles de interferon alfa 2a humano recombinante, 4 x 10'4 moles de cianoborohidruro al producto hidrolizado previamente enfriado y se regula el pH en 6,0. Despues de 24 horas de reaccion, se purifica el aducto por dialisis contra agua y luego se liofiliza. Se verifica la pureza por cromatograffa de exclusion dimensional (GPC), con el correspondiente cromatograma ilustrado en la Figura 5.

El bioconjugado HA-IFN fue sometido a SDS-PAGE + transferencia tipo Western, con anticuerpos anti-IFN alfa humanos. Se revelo la presencia de protema libre inferior al 5% por medio de tecnicas densitometricas. Este resultado es coherente con lo que surgio de la cromatograffa de exclusion dimensional (Figura 5).

Ejemplo 4: Determinacion in vitro de la actividad biologica del conjugado HA-IFN

La determinacion de la actividad biologica del conjugado HA-IFN se efectuo por medio de un metodo preparado con este fin.

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Los experimentos se llevaron a cabo en una lmea celular primaria humana de carcinoma de ovario (pdOVCAl), sensible a la accion antiproliferativa de IFN. Las celulas se sembraron en una concentracion de 10.000 celulas/pozo y se incubaron solas y en presencia de:

- bioconjugado de HA-IFN preparado como en el Ejemplo 3 en una concentracion de 1.000, 500, 250 U/ml como unidades equivalentes de IFN;

- interferon alfa 2a humano recombinante en una concentracion de 1.000, 500, 250 U/ml;

- HA que tiene un peso molecular de 200 kDa, es decir, el mismo utilizado para preparar el conjugado, en una concentracion de 323,5, 162,75, 81,375 |jg/ml.

Despues de 5 dfas de incubacion, se midio la vitalidad celular mediante el ensayo de citotoxicidad de ATPlite. Los resultados obtenidos se resumen en la Figura 4, donde se expresa la vitalidad de las celulas en porcentaje con respecto al nivel obtenido para las celulas incubadas solas.

Como puede verse, el interferon alfa 2a humano recombinante ejerce una accion citotoxica marcada con respecto a esta lmea celular. Esta propiedad se mantiene casi cuantitativamente en el conjugado, mientras que el HA no conjugado no es capaz de ejercer esta accion.

Ejemplo 5: Determinacion in vivo de la actividad biologica del conjugado HA-IFN

Los experimentos se llevaron a cabo utilizando la lmea celular de carcinoma de ovario (pdOVCA1) (sensible a la accion antiproliferativa del IFN) inoculada en forma intraperitoneal en ratones pertenecientes al grupo SCID F, 3 x 106 celulas/raton. El experimento se realizo utilizando 3 diferentes grupos de animales, 6 ratones por grupo:

1er grupo: tratamiento en el dfa 7, 14 y 21 con interferones alfa 2a humanos recombinantes (IFN) en una concentracion de 1.000 U/ml, como control positivo;

2do grupo: tratamiento en el dfa 7, 14 y 21 con el objetivo bioconjugado de la presente invencion (HA-IFN) preparado como se indica en el Ejemplo 3, en una concentracion de 1.000 U/ml como unidades equivalentes de IFN; 3er grupo: representa el control farmacologicamente no tratado sino unicamente inoculado con pdOVCA1.

Los resultados se resumen en la Figura 10: la experimentacion anterior muestra claramente la mayor eficacia in vivo del bioconjugado HA-IFN contra el farmaco IFN de referencia. Como una confirmacion adicional del resultado, las evaluaciones estadfsticas indican la considerable importancia del bioconjugado contra el control no tratado, mientras que no se revela ninguna importancia estadfstica del resultado obtenido a partir del control positivo contra el producto no tratado.

Ejemplo 6: Smtesis de un conjugado de HA-interferon marcado con una sonda fluorescente

Se debe tener cuidado para efectuar cada paso bajo condiciones de esterilidad, se marcan 12,5 mg de interferon alfa 2a humano recombinante con 0,5 mg de Cy5 de acuerdo con las instrucciones recibidas del proveedor (GE Healthcare). Se efectua una reaccion de acoplamiento con la protema marcada, purificada por dialisis exhaustiva contra agua, de acuerdo con las instrucciones proporcionadas en el Ejemplo 3. Se obtienen 90,4 mg de producto.

Ejemplo 7: Biodistribucion in vivo por tomograffa de fluorescencia del conjugado HA-interferon marcado con una sonda fluorescente

Se determino la biodistribucion del conjugado despues de administracion endovenosa in vivo mediante un sistema de formacion de imagenes opticas preclmicas Explore Optix (GE Healthcare). El sistema consiste en un aparato para medir la bioluminiscencia que se adapta para reconstruir tomograficamente todas las imagenes de cuerpo entero de pequenos roedores. La tecnologfa utilizada es "conteo de fotones individuales correlacionado con el tiempo", para medir la absorcion y fluorescencia (con su tiempo de vida) de sondas fluorescentes, permitiendo su localizacion tridimensional. Las imagenes mostradas en la Figura 3 representan el resultado del experimento de inoculacion en el raton anestesiado del conjugado marcado de acuerdo con el Ejemplo 6. Antes de la inoculacion, no se puede encontrar ninguna senal. Inmediatamente despues de la inoculacion, se observa una acumulacion hepatica, asociada con una fluorescencia menos intensa en la zona pulmonar adyacente, que es predominantemente causada por un atrapamiento no espedfico en la microcirculacion pulmonar. Una acumulacion en la region pelvica esta asociada con estas senales, que en una escala de tiempo mayor conduce a una acumulacion vesical.

Ejemplo 8: Smtesis de un conjugado HA-hGH

Se disuelve 1,00 g del derivado aldefndo de HA de acuerdo con el Ejemplo 1 en una concentracion de 10 mg/ml en medio acido por la presencia de acido fosforico a una temperatura de 60°C durante 2 horas. Se anaden 2 x 10'5 moles de hormona de crecimiento humana recom-binante, 2x 10'4 moles de cianoborohidruro al producto hidrolizado previamente enfriado y se regula el pH a 6,0. Despues de 24 horas de reaccion, se purifica el aducto por dialisis contra agua y luego se liofiliza.

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Ejemplo 9: Smtesis de un conjugado HA-ARNpi A

Se disuelve 1,00 g del derivada aldehndo de HA de acuerdo con el Ejemplo 1 en una concentracion de 8 mg/ml en medio acido por la presencia de acido fosforico a una temperatura de 50°C durante 2 horas. Se regula el pH a 6,0 y se anaden 2 x 10'5 moles de RNasa A y 2 x 10-4 moles de cianoborohidruro al producto hidrolizado previamente enfriado. A este pH tiene lugar la reaccion espedficamente en el extremo N-terminal de la protema. Despues de 24 horas de reaccion, se purifica el aducto por dialisis contra agua y luego se liofiliza. El correspondiente cromatograma de GPC registrado bajo las condiciones descritas en el Ejemplo 14 puede encontrarse en la Figura 7. Este tipo de conjugado es optimamente adecuado para medir in vitro la actividad residual de la enzima, usando un kit espedfico basado en la evaluacion del aumento de la absorcion a 287 nm con el tiempo, determinado por la hidrolisis del sustrato sintetico espedfico de monofosfato de 2',3'-citidina dclica (2',3'-CMC).

Una comparacion de la actividad residual de la enzima, libre o unida a HA, produce los siguientes resultados:

PRODUCTO

% de Actividad enzimatica relativa

ARNpi A

100

HA-Ac-ARNpi A

95,23

El mantenimiento cuantitativo de la actividad enzimatica muestra que la reaccion de conjugacion de ninguna manera degrada la protema.

Ejemplo 10: Smtesis y actividad in vivo del conjugado HA-insulina

Se disuelven 3,00 g del derivado aldehndo de HA (compuesto intermedio activado) de acuerdo con el Ejemplo 1 a una concentracion de 10 mg/ml en medio acido por la presencia de acido fosforico a una temperatura de 60°C durante 2 horas. Se anaden 4 x 10'5 moles de insulina, 4 x 10'4 moles de cianoborohidruro al producto hidrolizado previamente enfriado y se regula el pH a 6,0. Despues de 24 horas de reaccion, se purifica el aducto y se analiza mediante cromatograffa de exclusion dimensional; el cromatograma relativo es visible en la Figura 8. La actividad in vivo del conjugado se evalua en un modelo de diabetes inducida tipo l en una rata tras la administracion de estreptozocina a una dosis de 70 mg/Kg.

El conjugado HA-insulina se administra de manera subcutanea a una dosis de 5 o 20 |jg de insulina equivalente. La actividad biologica del conjugado se prueba a traves de la determinacion de los niveles de glucosa en la sangre de animales, medida por medio de kits comerciales (OneTouch® Il, LifeScan, Johnson & Johnson). El control consiste de ratas sanas (grupo 1) y ratas con diabetes inducida tratadas con insulina (grupo 2). Los resultados se ilustran en la Figura 9.

Las ratas tratadas con insulina pertenecientes al grupo 2 muestran una disminucion repentina en el nivel de glucosa en sangre, que sin embargo vuelve a valores altos en u lapso de tiempo relativamente corto. El conjugado HA- insulina tiene un efecto que se ejerce mas lentamente, pero tiene una duracion considerablemente prolongada en el tiempo, llevando la concentracion de glucosa, en un lapso de tiempo de 5 horas, a un nivel menor que el grupo tratado solo con insulina y se mantiene este efecto durante las 24 horas de duracion del experimento.

Estos resultados demuestran que el bioconjugado de acuerdo con la invencion es capaz de duplicar la efectividad del farmaco conjugado (en este caso espedfico insulina) manteniendola con el tiempo.

Por lo tanto, el ensayo muestra que los bioconjugados de acuerdo con la presente invencion o biomateriales preparados a partir de estos, son adecuados para producir sistemas para la liberacion prolongada de agentes terapeuticos, incluyendo protemas terapeuticas, debido a su capacidad para aumentar la efectividad terapeutica, manteniendola con el tiempo.

Ejemplo 11: Smtesis y determinacion de la actividad biologica del conjugado HA-calcitonina (HA-sCT)

Se disuelven 10 mg de HA-acetal en una concentracion de 10 mg/ml en acido fosforico 10 mM, pH 2,1 a una temperatura de 60°C durante 1 hora. Despues de regular el pH a 6,0 con NaOH 0,1 N y dejar enfriar la solucion a temperatura ambiente, se anaden 1,25 x 10'3 mmoles de calcitonina de salmon (sCT) al producto hidrolizado y despues de 30 minutos, 5,8 x 10'2 mmoles de cianoborohidruro de sodio. Despues de 48 horas de reaccion, se purifica el aducto y se analiza por dialisis contra agua (2 L) durante 24 horas utilizando una membrana con un corte de 50 kDa. Despues de la dialisis, se liofiliza el producto, se determina la concentracion de protema mediante el ensayo de acido bicinconmico (BCA; Sigma Aldrich) y absorcion a 280 nm.

La pureza del conjugado se verifica por medio de cromatograffa de filtracion de gel (GPC), el cromatograma correspondiente se muestra en la Figura 11.

La carga de calcitonina en el conjugado es de 9,1% (p/p).

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50

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65

La actividad in vivo de la calcitonina conjugada (HA-sCT) fue evaluada despues del efecto hipocalcemico medido despues de la administracion endovenosa en ratas.

Se llevaron a cabo los experimentos en ratas Sprague-Dawley con un peso de 180-250 g. Las ratas fueron divididas en 4 grupos de 3 animales en cada grupo y se administraron diferentes preparaciones a cada grupo: sCT, HA-sCT, HA y solucion salina. Se disolvieron sCT y HA-sCT y HA en una solucion fisiologica y se filtro con un filtro de 0,22 pm. Se administraron calcitonina y conjugado en una dosis de 40 pg/kg (equivalente de calcitonina). Se administro HA como control en las mismas cantidades presentes en el conjugado. Despues de la administracion a traves de la vena caudal, se tomaron muestras de sangre en tiempos preestablecidos (0, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 24 horas) y se conservaron en el refrigerador hasta el momento de usarlas. Despues de centrifugacion durante 20 minutos a 1.000 x g, se recolecto el plasma y se evaluo la presencia de calcio en el plasma por medio de un ensayo colorimetrico (kit de ensayo colorimetrico de calcio, Vinci-Biochem).

Los resultados obtenidos se resumen en la Figura 12, donde se expresa el porcentaje de variacion del calcio en el plasma con el tiempo. El sCT tiene su efecto maximo una hora despues de la administracion y, despues de 6 horas, los niveles de calcio se elevan de nuevo hacia los valores basicos. El conjugado, por el contrario, muestra una accion mas prolongada de hipocalcemizacion y un efecto mas marcado. El HA y la solucion salina no causan ninguna variacion en el calcio en la sangre.

Ejemplo 12: Smtesis de un conjugado HA-IL1-ra

Se disuelven 10 mg de HA-acetal en una concentracion de 10 mg/ml en acido fosforico 10 mM, pH 2,1 a una temperatura de 60°C durante 1 hora. Despues de regular el pH a 6,0 con NaOH 0,1 N y dejar que la solucion se enfne a temperatura ambiente, se anaden 2,46 x 10'4 mmoles de lL-1-ra al producto hidrolizado y despues de 30 minutos, 1,16 x 10'2 mmoles de cianoborohidruro de sodio. Despues de 48 horas de reaccion, se purifica el aducto por dialisis contra un regulador de fosfato 0,1 M, pH 6,5 (2 L) durante 24 horas utilizando una membrana con un corte de 50 kDa. Despues de la dialisis, se determina la concentracion de protema mediante un ensayo colorimetrico (ensayo BCA; Sigma Aldrich). El conjugado es mantenido en solucion a 4°C. La pureza se verifica por medio de cromatograffa de filtracion en gel (GPC), el cromatograma correspondiente se muestra en la Figura 13.

Ejemplo 13: Smtesis de un conjugado HA-Lubricina

Se disuelven 10 mg de HA-acetal en una concentracion de 10 mg/ml en acido fosforico 10 mM, pH 2,1 a una temperatura de 60°C durante 1 hora. Despues de regular el pH a 6,0 con NaOH 0,1 N y dejar que la solucion se enfne a temperatura ambiente, se anaden 2,50 x 10'4 mmoles de Lubricina al producto hidrolizado y despues de 30 minutos, 1,16 x 10'2 mmoles de cianoborohidruro de sodio. Despues de 48 horas de reaccion, se purifica el aducto por dialisis contra un regulador de fosfato 0,1 M, pH 6,5 (2 L) durante 24 horas utilizando una membrana con un corte de 50 kDa. Despues de la dialisis, se determina la concentracion de protema mediante un ensayo colorimetrico (ensayo BCA; Sigma Aldrich). El conjugado es mantenido en solucion a 4°C. La pureza se verifica por medio de cromatograffa de filtracion en gel (GPC).

Ejemplo 14: Caracterizacion mediante GPC de los conjugados sintetizados

Para determinar la presencia de la protema libre en los conjugados sintetizados, se someten las preparaciones de acuerdo con los Ejemplos 3, 8, 9 y 10 a cromatograffa de exclusion dimensional de alta presion. Para el conjugado HA-IFN de acuerdo con el Ejemplo 3 y HA-insulina de acuerdo con el Ejemplo 9, se registro el cromatograma (Figura 5 y Figura 8) en una columna GF-250 Agilent con un eluyente formado por un regulador de fosfato 0,2 M a pH 7,0 + NaCl 10'1 M al 80% + acetonitrilo al 20%, con un flujo de 0,3 ml/min.

Los cromatogramas relativos a los otros conjugados (Figura 6, Figura 7) se registraron con una columna Superose 12, deteccion UV a 280 nm, con un eluyente consistente en un regulador de fosfato 10'1 M a pH 7,2 + NaCl 0,2 M al 80% + acetonitrilo al 20%, con un flujo de 0,8 ml/min.

Ejemplo 15: Smtesis del derivado aldetffdo de sulfato de condroitina como el compuesto intermedio activado

Se disuelven 5,00 g de sulfato de condroitina de origen extractivo (con el grupo sulfato predominantemente en la posicion 4 de la unidad de N-acetil galactosamina) en 250 ml de agua y la solucion resultante es percolada a traves de una columna de vidrio cargada previamente con 100 cm3 de resina Dowex en forma de tetrabutilamonio. La solucion de sal de TBA eluida de sulfato de condroitina es recolectada y liofilizada. Se obtienen 7,75 g de producto, que se disuelven en 400 ml de N-metil-pirrolidona (NMP).

Despues de la disolucion completa, se anaden 345 mg de carbonil-diimidazol (CDI), 460 pl de acido metanosulfonico y 396 mg de dietilacetal 4-aminobutiraldetffdo y se deja reaccionar la mezcla a 45°C durante la noche bajo agitacion suave.

El procedimiento de formacion del derivado se detiene anadiendo 0,1 volumenes de una solucion acuosa saturada de NaCl. La mezcla de reaccion se dializa contra una solucion salina por NaCl al 0,9%, luego contra agua pura y se liofiliza. Se obtienen 4,13 g de un solido granulado de color marron claro.

Claims (25)

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   Reivindicaciones

   1. Un procedimiento para la smtesis de conjugados de glicosaminoglicanos (GAG) con moleculas biologicamente activas, que comprende las siguientes fases:

   a) la formacion de derivados del GAG con al menos un grupo aldehffdo (CHO), por la reaccion del GAG con una molecula espaciadora (SP), en donde dicha molecula espaciadora comprende, como primer grupo funcional, uno o mas grupos aldehffdo (SP-CHO), estando dichos grupos aldehffdo (SP-(CHO)) opcionalmente protegidos y, como segundo grupo funcional, un grupo nucleofflico apto para conjugacion con el GAG;

   a1) hidrolisis del compuesto intermedio activado con acidos acuosos cuando dichos uno o mas grupos aldehffdo estan protegidos;

   b) reaccion del aducto obtenido en la fase a) o a1) con al menos una molecula biologicamente activa (TA), caracterizado porque dicha molecula biologicamente activa (TA) comprende un grupo funcional capaz de reaccionar con el grupo aldehffdo y se selecciona del grupo que consiste de polipeptidos y protemas, acidos nucleicos y agentes terapeuticos que contienen al menos un grupo amina no fundamental para el funcionamiento biologico, siendo dicho agente terapeutico seleccionado de grupo que consiste de farmacos antitumorales; agentes antivirales y antibioticos; inhibidores de proteasa y polimerasa; farmacos antiinflamatorios, analgesicos, anestesicos, contra el dolor; narcoticos; esteroideos; minoxidil.
2. 2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, donde dicha proteccion del grupo aldehffdo tiene lugar con el uso de hemiacetales o acetales a traves de la reaccion de los aldehfdos con alcoholes alifaticos o aril alifaticos o dioles seleccionados de metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, sec-butanol, terc-butanol, iso-butanol, etilenglicol, propilenglicol, 1,3-propanodiol, 1,4-butanodiol para formar acetales que pueden ser aislados.
3. 3. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde dicha molecula espaciadora SP-(CHO) es un aminoaldehido, preferiblemente protegido como acetal.
4. 4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha fase a1) para la hidrolisis del compuesto intermedio activado con acidos acuosos para liberar el grupo aldehfdo, tiene lugar a un pH en el intervalo de 1,5 a 3,0, preferiblemente con un pH en el intervalo de 2,0 a 2,5, a una temperatura en el intervalo de 25 a 65°C, preferiblemente de 40 a 60°C, durante al menos 30 minutos.
5. 5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicho grupo nucleofflico de la fase a) es un grupo amina, en forma libre o de sal, o un grupo alcohol.
6. 6. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicho grupo funcional de la molecula biologicamente activa capaz de reaccionar con aldehfdos, es un grupo amina que puede estar naturalmente presente o introducido por smtesis.
7. 7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicho GAG se selecciona del grupo que consta de acido hialuronico (HA), sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, sulfato de queratano, heparina, sulfato de heparano, o sus derivados, seleccionados de sales con metales alcalinos y alcalinoterreos seleccionados de sodio, potasio, magnesio, calcio; sales de amonio cuaternario, esteres carboxflicos, O-esteres, amidas, derivados percarboxilados, derivados O-sulfatados, derivados N-desacetilados; derivados N-sulfatados.
8. 8. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde cuando dicha molecula biologicamente activa es un polipeptido o una protema, se selecciona del grupo que consiste de:

   - Inmunomoduladores, preferiblemente seleccionados del grupo que consiste de interferones de tipo I, interferones de tipo II, interferones de tipo III;

   - Factores de crecimiento, preferiblemente seleccionados del grupo que consiste de eritropoyetinas y en general moleculas identificadas como ESA, factores de estimulacion de eritropoyesis tal como factores GM-CSf y G-CSF, factores de crecimiento para los huesos y carfflagos;

   - Citoquinas, preferiblemente seleccionadas del grupo que consiste de IL2, TNF y sus antagonistas del receptor con sus receptores solubles, IL1-ra, y los receptores solubles de citoquinas proinflamatorias;

   - Glicoprotemas;

   - Enzimas, preferiblemente seleccionadas del grupo que consiste de superoxido dismutasas, RNasa y glucocerebrosidasa;

   - Anticuerpos;

   - Hormonas, preferiblemente seleccionadas del grupo que consiste de calcitonina, insulina y sus analogos, y la hormona de crecimiento.
9. 9. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde cuando dicha molecula biologicamente activa es un farmaco antitumoral, se selecciona del grupo que consiste de taxanos, alcaloides de la Vinca, camptotecinas, ureas sustituidas; complejos de platino, oro, plata u otros metales, metotrexato, trimetrexato, pemetrexed, tetrahidrofolato; analogos de pirimidina, citidina, purina; antibioticos oncologicos y antracenodionas.

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10. 10. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde cuando dicha molecula biologicamente activa es un acido nucleico, se selecciona del grupo que consiste de: ARN pequeno de interferencia, microARN, ARN antisentido.
11. 11. El procedimiento de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para la smtesis de conjugados de acido hialuronico o derivados de los mismos con moleculas biologicamente activas, que comprende las siguientes fases:

    a) formacion de derivados de HA, o de una sal soluble de HA en un disolvente polar organico aprotico, con al menos un grupo aldehfdo (CHO), a traves de la reaccion de HA con amino-aldehfdos protegidos efectuada en un medio acuoso en EDC + NHS para formar una amida o en un disolvente aprotico;

    a1) hidrolisis del compuesto intermedio de la fase a) con el fin de liberar el grupo aldehfdo, efectuado en acido fosforico a un pH en el intervalo de 1,5 a 3,0, preferiblemente con un pH en el intervalo de 2,0 a 2,5, a una temperatura en el intervalo de 25 a 65°C, preferiblemente de 40 a 60°C, durante al menos 30 minutos;

    b) reaccion del compuesto intermedio obtenido en la fase a) o a1) con una molecula biologicamente activa (TA) caracterizado porque comprende un grupo funcional capaz de reaccionar con el grupo aldelmdo.
12. 12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 11, en donde dicho acido hialuronico o derivados del mismo se seleccionan de acido hialuronico que forma una sal con bases organicas y/o inorganicas; esteres de acido hialuronico con alcoholes de la serie alifatica, arilalifatica, cicloalifatica, aromatica, cfclica y heterodclica con un porcentaje de esterificacion en el intervalo de 20 a 80%; amidas de HA con aminas de la serie alifatica, arilalifatica, cicloalifatica, aromatica, dclica y heterodclica, con un porcentaje de amidacion en el intervalo de 0,1 a 50%; derivados O-sulfatados del acido hialuronico hasta el cuarto grado de sulfatacion; esteres internos de acido hialuronico con un porcentaje de esterificacion inferior al 20%; compuestos desacetilados de acido hialuronico con un porcentaje de desacetilacion de 0,1 a 30%; derivados percarboxilados de acido hialuronico con un grado de percarboxilacion de 0,1 a 100% y, preferiblemente, entre 25 y 75%.
13. 13. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-12, en donde dicha molecula biologicamente activa es una protema o polipeptido y dicho grupo funcional es un grupo amina.
14. 14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 13, en donde dicha protema o polipeptido se anade al producto intermedio obtenido en la fase a) o a1) bajo condiciones reductoras con cianoborohidruro de sodio o hidruro de litio y aluminio o borohidruro de sodio.
15. 15. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-14, en donde dicho polipeptido o protema se selecciona del grupo que consiste de interferones, eritropoyetinas, factores estimuladores de hematopoyesis, factores de crecimiento oseo/cartflago, hormona del crecimiento, lubricina, insulina, calcitonina, IL1-ra.
16. 16. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-15 en donde dicha sal de HA es HATBA.
17. 17. Conjugados de glicosaminoglicanos (GAG) con moleculas biologicamente activas, que se pueden obtener por medio del proceso de smtesis de acuerdo con las reivindicaciones 1-16.
18. 18. Conjugados de acido hialuronico (HA) con moleculas biologicamente activas, que se pueden obtener por medio de procesos de smtesis de acuerdo con las reivindicaciones 11-16.
19. 19. Los conjugados de acuerdo con la reivindicacion 18, seleccionados de el grupo que consiste de HA-IFN, HA- EPO, HA-gCsF, factores de crecimiento HA-oseo/carfflago, HA-hGH, HA-lubricina HA-insulina, HA-sCT, HA-IL1-ra.
20. 20. Los conjugados de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17-19, para el uso en el campo medico.
21. 21. Uso de los conjugados de acuerdo con la reivindicacion 20, para la preparacion de un medicamento que tiene una accion antiviral o antitumoral.
22. 22. Uso de acuerdo con la reivindicacion 21, en donde dicho conjugado es HA-IFN.
23. 23. Composiciones farmaceuticas que comprenden, como principio activo, conjugados como los definidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17-20, junto con uno o mas excipientes farmacologicamente aceptables.
24. 24. Las composiciones farmaceuticas de acuerdo con la reivindicacion 23, para uso oral, rectal, intravaginal, sublingual, intraocular; o como soluciones inyectables mediante inyecciones intradermicas, intravenosas, intramusculares, subcutaneas, intraarteriales, intratecales, intracardiacas, intrasinoviales, intraarticulares, intraperitoneales, intravesicales, o formuladas para uso topico, tales como geles, cremas, unguentos, espumas, polvo seco, aerosoles, emplastos de piel o transdermicos.
25. 25. Las composiciones farmaceuticas de acuerdo con la reivindicacion 24, formuladas como soluciones intravenosas inyectables para localizacion hepatica y/o pulmonar, o como sistemas con liberacion controlada para administracion subcutanea y/o intradermica y/o intraarticular.

    5 26. Biomaterial caracterizado por una matriz que comprende los conjugados tal como se define de acuerdo con

    cualquiera de las reivindicaciones 17-19.