ES2329731T3 - Derivados de acido hialuronico de aril/alquil vinil sulfona. - Google Patents
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Abstract
Derivado de ácido hialurónico comprendiendo n unidades repetitivas y teniendo la fórmula general estructural (I):** ver fórmula** donde, en al menos una unidad repetitiva, uno o más de R1, R2, R3, R4 comprende una aril/alquil sulfona unida a un éter teniendo la fórmula general estructural (II), donde R comprende un grupo alquilo o arilo, y por el contrario R1, R2, R3, R4 son grupos hidróxilo, OH: ** ver fórmula**
Description
Derivados de ácido hialurónico de aril/alquil
vinil sulfona.
La presente invención se refiere a la
modificación de ácido hialurónico (HA) con aril o alquilvinil
sulfonas para producir derivados de HA con aril/alquil vinil
sulfonas (AVS-HA), a los derivados
AVS-HA como tales, a su producción, y a sus
aplicaciones y usos, particularmente en la industria cosmética y
biomédica.
Los heteropolisacáridos más abundantes del
cuerpo son los glicosaminoglicanos. Los glicosaminoglicanos son
polímeros de carbohidratos de cadena recta, que consisten en
unidades repetitivas de disacáridos (salvo el queratán sulfato que
es ramificado en la región del núcleo de los carbohidratos). Las
unidades de disacáridos generalmente comprenden, como una primera
unidad de sacárido, uno de dos azúcares modificados -
N-acetilgalactosamina (GalNAc) o
N-acetilglucosamina (GlcNAc). La segunda unidad es
normalmente un ácido urónico, tal como ácido glucurónico (GlcUA) o
iduronato.
Los glicosaminoglicanos son moléculas cargadas
negativamente, y tienen una conformación extendida que imparte alta
viscosidad cuando está en solución. Los glicosaminoglicanos se
encuentran principalmente en la superficie de las células o en la
matriz extracelular. Los glicosaminoglicanos también tienen baja
comprimibilidad en solución y, como resultado, son ideales como
fluido de lubrificación fisiológico, por ej., para las
articulaciones. La rigidez de los glicosaminoglicanos proporciona
integridad estructural a las células y proporciona vías de paso
entre las células, permitiendo la migración celular. Los
glicosaminoglicanos de mayor importancia fisiológica son
hialuronano, condroitina sulfato, heparina, glucosaminida sulfato
N-acetiltransferasa, dermatan sulfato, y queratan
sulfato. La mayoría de los glicosaminoglicanos están unidos de
manera covalente a una proteína central de proteoglicano a través de
estructuras de oligosacárido específico. El hialuronano forma
agregados grandes con determinados proteoglicanos, pero es una
excepción ya que las cadenas de carbohidratos libres forman
complejos no covalentes con proteoglicanos.
Se han identificados numerosas funciones del
hialuronano en el cuerpo (véase, Laurent T. C. y Fraser J. R. E.,
1992, FASEB J. 6: 2397-2404; y Toole B.P., 1991,
"Proteoglycans and hyaluronan in morphogenesis and
differentiation". En: Cell Biology of the Extracellular Matrix,
pp. 305-341, Hay E. D., ed., Plenum, New York). El
hialuronano está presente en el cartílago hialino, líquido sinovial,
y tejido de la piel, tanto en la dermis como en la epidermis.
También se cree que el hialuronano desarrolla un papel en numerosas
funciones fisiológicas, tales como adhesión, desarrollo, motilidad
celular, cáncer, angiogénesis, y cicatrización de heridas. Debido a
las propiedades físicas y biológicas únicas del hialuronano, se
emplea en cirugía ocular y de articulaciones y está siendo evaluado
en otros procedimientos médicos.
Los términos "hialuronano" o "ácido
hialurónico" son usados en la bibliografía para referirse a los
polisacáridos ácidos con diferentes pesos moleculares constituidos
por residuos de ácidos D-glucurónico y
N-acetil-d-glucosamina,
que ocurren naturalmente en las superficies de las células, en las
sustancias básicas extracelulares del tejido conjuntivo de
vertebrados, en el líquido sinovial de las articulaciones, en el
humor vítreo, en el tejido del cordón umbilical humano y en las
crestas de los gallos.
El término "ácido hialurónico" de hecho es
normalmente usado para referirse a toda una serie de polisacáridos
con residuos alternantes de ácidos D-glucurónico y
N-acetil-d-glucosamina
con pesos moleculares variables o incluso fracciones degradadas del
mismo, y por lo tanto sería más correcto usar el término plural de
"ácidos hialurónicos". El término singular, no obstante, será
usado a pesar de todo en esta descripción; además se usará
frecuentemente la abreviatura "HA" en lugar de este término
colectivo.
El HA juega un papel importante en el organismo
biológico como soporte mecánico para las células de muchos tejidos,
tales como la piel, tendones, músculos y cartílago, es un
componente principal de la matriz intercelular. el HA también forma
parte importante en los procesos biológicos, tales como la
hidratación de tejidos y lubricación.
El HA puede ser extraído de los tejidos
naturales arriba mencionados, aunque hoy se prefiere prepararlo por
métodos microbiológicos para minimizar el riesgo potencial de
transferencia de agentes infecciosos, y para aumentar la
uniformidad, calidad y disponibilidad del producto.
el HA y su varias fracciones de tamaño molecular
y las sales derivadas respectivas han sido usados como
medicamentos, especialmente en el tratamiento de artropatías, como
agente auxiliar y/o sustituto de órganos y tejidos naturales,
especialmente en oftalmología y cirugía cosmética, y como agentes en
preparaciones cosméticas. También se han desarrollado productos de
hialuronano para el uso en ortopedia, reumatología, y
dermatología.
El HA puede también ser usado como un aditivo
para varios materiales poliméricos usados para artículos sanitarios
y quirúrgicos, tales como poliuretanos, poliésteres, etc. con el
efecto de hacer estos materiales biocompatibles.
La invención se refiere a la preparación de una
generación nueva de ácido hialurónico derivado de reactivos
monofuncionales de vinil sulfona.
Los reactivos monofuncionales de vinil sulfona
tienen la fórmula general
(CH_{2}=CH-SO_{2}-R) donde R es
un grupo arilo o alquilo que es preferible pero no necesariamente
hidrofóbico. La reacción que produce la modificación se desarrolla
entre el grupo vinilo reactivo del reactivo de sulfona y las
fracciones de hidróxilo del ácido hialurónico.
La invención puede utilizarse para preparar una
gama amplia de derivados dependiendo de la naturaleza del grupo R
dependiente. Los compuestos comercialmente disponibles en el
mercado incluyen metil-, etil-, fenil-, p-tolil-,
octil- y otras alquil-/aril vinil sulfonas.
A diferencia de la divinil sulfona (DVS), los
reactivos de R-vinil sulfona son monofuncionales
evitando de ese modo cualquier reticulación del HA.
Los derivados resultantes, modificados con
grupos hidrofóbicos, pueden encontrar aplicación en la industria de
cosméticos como emulsionantes o en sistemas de administración
avanzados, tales como nanocápsulas. También pueden ser usados para
la hidratación de la piel a través de la formación de una película.
Las propiedades de los derivados permiten la producción de
biomaterias nuevas manteniendo al mismo tierno la biocompatibilidad
y biodegradabilidad del hialuronano original.
El método se basa en una química bien
establecida (DVS ha sido usado desde hace más de 20 años para
reticular HA) y tiene varias ventajas por ser un método muy
versátil, el HA se usa como su sal sódica, esto puede hacerse como
una "síntesis en una sola operación sintética", la reacción se
desarrolla a temperatura ambiente, es un proceso simple y corto, y
la purificación posterior puede hacerse muy eficazmente sin dejar
residuos de reactivos de vinil sulfona.
Hay una demanda, particularmente en la industria
cosmética y biomédica, de compuestos a base de o derivados de ácido
hialurónico que tengan determinadas características alteradas en
comparación con el HA no modificado. Las propiedades de interés son
la mejor capacidad de estabilizar espuma, y la capacidad para
mezclar con materiales no hidrofílicos, tal como se usa normalmente
en los productos cosméticos.
La invención proporciona productos amfifílicos
derivados de HA con propiedades beneficiosas en aplicaciones
cosméticas o biomédicas. Estos productos se unen más firmemente a
la piel de modo que éstos no son fácilmente lavados. Los derivados
AVS-HA son también adecuados para el uso en
formulaciones cosméticas o biomédicas más avanzadas, por ej., en la
formación de nano/macro cápsulas o nano/macro esferas para
administrar compuestos activos o fármacos. Los derivados
AVS-HA de peso molecular inferior (PM) penetran en
la piel más eficazmente que los HA no derivados de PM
comparable.
Por consiguiente, en un primer aspecto la
invención se refiere a un derivado de ácido hialurónico
comprendiendo n unidades repetitivas y teniendo la fórmula general
estructural (I):
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
donde, en al menos una unidad de
repetición, uno o más de R1, R2, R3, R4 comprende una aril/alquil
sulfona unida a un éter que tiene la fórmula general estructural
(II), donde R comprende un grupo alquilo o arilo, y por el contrario
R1, R2, R3, R4 son grupos hidróxilo,
OH:
En otras palabras, un aspecto de la invención se
refiere a un derivado de ácido hialurónico, donde uno o más grupos
hidróxilo del ácido hialurónico ha sido hecho reaccionar con uno o
más compuestos monofuncionales alquil/aril vinil sulfona, para
formar un enlace de éter entre el ácido hialurónico y el uno o más
compuestos de alquil/aril sulfona resultante.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a
un derivado de ácido hialurónico, donde se ha producido una
reacción de adición entre uno o más grupos hidróxilo del ácido
hialurónico y uno o más compuestos monofuncionales de
aril-/alquil-vinil sulfona, para formar un enlace de
éter entre el ácido hialurónico y el uno o más compuestos de
aril/alquil sulfona resultante.
En un tercer aspecto, la invención se refiere a
un proceso para producir un derivado de ácido hialurónico, el
proceso incluyendo las etapas de:
- (a)
- hacer reaccionar un ácido hialurónico con uno o más compuestos de alquil-/aril-vinil sulfona teniendo la fórmula general estructural (III) bajo condiciones alcalinas en una solución acuosa, por la cual se forma el derivado de ácido hialurónico; y
- (b)
- recuperar el derivado de ácido hialurónico.
\vskip1.000000\baselineskip
En un cuarto aspecto, la invención se refiere a
una composición que comprende un derivado de ácido hialurónico tal
y como se define en el primer o segundo aspecto, y una sustancia
activa, preferiblemente la sustancia activa es un agente
farmacológicamente activo.
Un quinto aspecto de la invención se refiere a
una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de
un derivado de ácido hialurónico tal y como se define en el primer
o segundo aspecto, junto con un soporte, excipiente o diluyente
farmacéuticamente aceptable.
Un sexto aspecto se refiere a una composición
farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un derivado de
ácido hialurónico tal y como se define en el primer o segundo
aspecto como un vehículo, junto con un agente farmacológicamente
activo.
Un séptimo aspecto se refiere a un artículo
cosmético comprendiendo como sustancia activa una cantidad eficaz
de un derivado de ácido hialurónico tal y como se define en el
primer o segundo aspecto, o una composición tal y como se define en
cualquiera del cuarto, quinto o sexto aspecto.
En un octavo aspecto, la invención se refiere a
un artículo sanitario, médico o quirúrgico que comprende un
derivado de ácido hialurónico tal y como se define en el primer o
segundo aspecto, o una composición tal y como se define en
cualquiera del cuarto, quinto, o sexto aspecto, preferiblemente el
artículo siendo un pañal, una compresa, una esponja quirúrgica, una
esponja para cicatrizar heridas, o una parte comprendida en una
tirita u otro material de apósito.
Un aspecto importante se refiere a una cápsula o
microcápsula de medicamento que comprende un derivado de ácido
hialurónico tal y como se define en el primer o segundo aspecto, o
una composición tal y como se define en cualquiera del cuarto,
quinto, o sexto aspecto.
Los últimos aspectos de la invención se refieren
a métodos para realizar procedimientos en oftalmología, en el
tratamiento de osteoartritis o cáncer, pérdida de pelo o calvicie,
de tratamiento de una herida, de realizar una administración dérmica
o transdérmica de un agente farmacológicamente activo, o
administración dérmica de un cosmético, la mejora que comprende el
uso de un derivado de ácido hialurónico tal y como se define en el
primer o segundo aspecto, o una composición tal y como se define en
cualquiera del cuarto, quinto, o sexto aspecto.
Varios aspectos se refieren a usos de un
derivado de ácido hialurónico tal y como se define en cualquiera
del primer o segundo aspecto, o una composición tal y como se
define en cualquiera del cuarto, quinto, o sexto aspecto, para la
producción de un medicamento para el tratamiento de osteoartritis,
cáncer, la producción de un medicamento para un tratamiento
oftalmológico, la producción de un medicamento para el tratamiento
de heridas, la producción de un medicamento para angiogénesis, la
producción de un medicamento para el tratamiento de pérdida de pelo
o calvicie, o la producción de una hidratante.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: espectro de RMN ^{1}H (HA, 300
kDa).
Figura 2: espectro de RMN ^{1}H,
(PVS-HA de HA 300 kDa) Proporción de PVS:HA
1.5:1.
Figura 3: espectro de RMN ^{1}H,
(PVS-HA de HA 300 kDa) Proporción de PVS:HA 1.5.
Figura 4: espectro de RMN ^{1}H
(PVS-HA de HA 300 kDa) Proporción de PVS:HA 10:1
Figura 5: espectro IR, (PVS-HA
de HA 300 kDa) Proporción de PVS:HA 10:1.
Figura 6: espectro de RMN ^{1}H,
(EVS-HA de HA 300 kDa) Proporción de EVS:HA
1.5:1.
\vskip1.000000\baselineskip
"Ácido hialurónico" es definido aquí como
un glicosaminoglicano no sulfatado compuesto por unidades
repetitivas de disacárido de N-acetilglucosamina
(GlcNAc) y ácido glucurónico (GlcUA) unidas por enlaces
beta-1,4 y beta-1,3 glicosídicos
alternantes. El ácido hialurónico es también conocido como
hialuronano, hialuronato, o HA. Los términos hialuronano y ácido
hialurónico son usados de forma intercambiable aquí.
Las crestas de gallo son una fuente comercial
significante de hialuronano. Los microorganismos son una fuente
alternativa. La patente U.S. n°. 4,801,539 expone un método de
fermentación para preparar ácido hialurónico que implica una cepa de
Streptococcus zooepidemicus con rendimientos proporcionados
de aproximadamente 3,6 g de ácido hialurónico por litro. La Patente
Europea no. EP0694616 expone procesos de fermentación usando una
cepa mejorada de Streptococcus zooepidemicus con
rendimientos proporcionados de aproximadamente 3,5 g de ácido
hialurónico por litro. Como se describe en WO 03/054163 (Novozymes),
que se incorpora aquí en su totalidad, el ácido hialurónico o sales
derivadas pueden ser producidas por recombinación, por ej., en un
huésped de Bacillus gram positivo.
Las hialuronano sintasas de vertebrados,
patógenos bacterianos y virus algales han sido descritas
(DeAngelis, P. L., 1999, Cell. Mol. Life Sci. 56:
670-682). WO 99/23227 expone un Grupo I de
hialuronato sintasa de Streptococcus equisimilis. WO
99/51265 y WO 00/27437 describen una hialuronato sintasa de Grupo II
de Pasturella multocida. Ferretti et al. describen el
operón de hialuronano sintasa de Streptococcus pyogenes, que
está compuesto de tres genes, hasA, hasB, y hasC, que codifican
hialuronato sintasa, UDP glucosa dehidrogenasa, y
UDP-glucosa pirofosforilasa, respectivamente (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 98, 4658-4663, 2001). WO
99/51265 describe un segmento de ácido nucleico que tiene una
región de codificación para una hialuronano sintasa de
Streptococcus equisimilis.
Como el hialuronano de una célula de
Bacillus recombinante es expresada directamente al medio de
cultivo, se puede usar un proceso simple para aislar el hialuronano
del medio de cultivo. Primero, las células de Bacillus y
detrito celular son físicamente eliminados del medio de cultivo. El
medio de cultivo puede ser diluido primero, si se desea, para
reducir la viscosidad del medio. Muchos métodos son conocidos por
los expertos en la técnica para la eliminación de células del medio
de cultivo, tal como centrifugado o microfiltración. Si se desea,
el sobrenadante restante puede luego ser filtrado, tal como por
ultrafiltración, para concentrar y eliminar contaminantes de
moléculas pequeñas del hialuronano. Tras la eliminación de las
células y detrito celular se realiza una precipitación simple del
hialuronano del medio por mecanismos conocidos. Se puede usar sal,
alcohol, o combinaciones de sal y alcohol para precipitar el
hialuronano del filtrado. Una vez reducido a un precipitado, el
hialuronano puede ser fácilmente aislado de la solución por medios
físicos. El hialuronano puede ser secado o concentrado de la
solución filtrada usando técnicas de evaporación conocidas en la
técnica, tal como secado por pulverización.
\newpage
El primer aspecto de la invención se refiere a
un derivado de ácido hialurónico comprendiendo n unidades
repetitivas y teniendo la fórmula general estructural (I):
donde, en al menos una unidad
repetitiva, uno o más de R1, R2, R3, R4 comprende una aril/alquil
sulfona unida a un éter teniendo la fórmula general estructural
(II), donde R comprende un grupo alquilo o arilo, y por el
contrario R1, R2, R3, R4 son grupos hidróxilo,
OH:
En otras palabras, un aspecto de la invención se
refiere a un derivado de ácido hialurónico, donde se produce una
reacción de adición entre uno o más grupos hidróxilo del ácido
hialurónico y uno o más compuestos monofuncionales de aril-/alquil
vinil sulfona, para formar un enlace de éter entre el ácido
hialurónico y el uno o más compuestos de aril/alquil sulfona
resultantes.
Una forma de realización preferida se refiere al
derivado de ácido hialurónico de la invención, donde el uno o más
compuestos monofuncionales de aril-/alquil-vinil
sulfona tienen la fórmula general estructural (III), donde R
comprende un grupo alquilo o arilo.
Aún otra forma de realización preferida se
refiere al derivado de ácido hialurónico de la invención, donde dos
o más de R1, R2, R3, R4 comprenden una o más aril/alquil sulfona
unida a un éter teniendo la fórmula general estructural (II); o
donde tres o más de R1, R2, R3, R4 comprenden uno o más aril/alquil
sulfonas unidas a un éter teniendo la fórmula general estructural
(II); o de hecho donde todos R1, R2, R3, R4 comprenden una o más
aril/alquil sulfonas unidas a un éter teniendo la fórmula general
estructural (II).
La reacción principal o sitio de adición en el
proceso de la invención es el hidróxilo primario de la unidad
repetitiva del ácido hialurónico, también mostrado como R4 en la
fórmula estructural (I).
Por consiguiente, una forma de realización
preferida se refiere al derivado de HA de la invención, donde al
menos R4 comprende una aril/alquil sulfona unida a un éter teniendo
la fórmula general estructural (II).
Se pueden concebir muchos grupos alquilo o arilo
diferentes adecuados en los componentes monofuncionales de
alquil-/aril-vinil sulfona para el uso en la
presente invención.
\newpage
Una forma de realización preferida se refiere al
derivado de HA de la invención, donde R comprende un grupo alquilo,
preferiblemente el grupo alquilo es hidrofóbico, preferiblemente el
grupo alquilo comprende un grupo alquilo
C_{1}-C_{20}, preferiblemente metilo, etilo,
propilo, 2-octenilo, 2-nonenilo,
2-dodecenilo, 2-hexadecenilo o
2-octadecenilo.
Otra forma de realización preferida se refiere
al derivado de HA de la invención, donde R comprende un grupo
arilo, preferiblemente el grupo arilo es hidrofóbico, y más
preferiblemente el grupo arilo es fenilo o
p-toluilo.
\vskip1.000000\baselineskip
El nivel de ácido hialurónico puede ser
determinado según el método de carbazol modificado (Bitter y Muir,
1962, Anal Biochem. 4: 330-334). Además, el peso
molecular promedio del ácido hialurónico puede ser determinado
usando métodos estándares en la técnica, tales como aquellos
descrito por Ueno et al., 1988, Chem. Pharm. Bull. 36,
4971-4975; Wyatt, 1993, Anal. Chim. Acta 272:
1-40; y Wyatt Technologies, 1999, "light
Scattering University DAWN Course Manual" y "DAWN EOS
Manual" Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara,
California.
En una forma de realización preferida, los
derivados de ácido hialurónico obtenidos por los métodos de la
presente invención tienen un peso molecular de aproximadamente
1,000 a aproximadamente 10,000,000 Da. En una forma de realización
más preferida, los derivados de ácido hialurónico obtenidos por los
métodos de la presente invención tienen un peso molecular de
aproximadamente 5,000 a aproximadamente 5,000,000 Da. En una forma
de realización aún más preferida, los derivados de ácido
hialurónico obtenidos por los métodos de la presente invención
tienen un peso molecular de aproximadamente 10,000 a aproximadamente
3,000,000 Da.
Otra forma de realización preferida se refiere
al producto del primer aspecto, donde el ácido hialurónico o sal
derivada tiene un peso molecular en el rango de entre 300,000 y
3,000,000; preferiblemente en el rango de entre 400,000 y 2,500,000;
más preferiblemente en el rango de entre 500,000 y 2,000,000; y de
la forma más preferible en el rango de entre 600,000 y 1,800,000
Da.
Cuando se usa ácido hialurónico o su sal
producido por recombinación en los métodos de la invención para
producir los productos o composiciones de la invención, puede ser
ventajoso para algunas aplicaciones reducir primero el peso
molecular promedio del ácido hialurónico o derivado o sal derivada.
Por ejemplo, varios fabricantes han informado de las denominadas
fracciones con bajo peso molecular del ácido hialurónico, que
pueden penetrar la barrera de la piel para restablecer el contenido
natural de ácido hialurónico en la piel, en consecuencia fracciones
de este tipo son particularmente adecuadas para composiciones
cosméticas vendidas como agentes antienvejecimiento de la piel y
antiarrugas. Para aplicaciones alimenticias, se ha demostrado que
el ácido hialurónico de bajo PM penetra la barrera gastrointestinal,
aumentando de ese modo su biodisponibilidad. Finalmente, el ácido
hialurónico de bajo PM exhibe un efecto antiinflamatorio y tiene
aplicaciones potenciales en el tratamiento de enfermedades
inflamatorias. Puede conseguirse una reducción del peso molecular
promedio de un ácido hialurónico o derivado o sal derivada mediante
métodos estándares en la técnica, tales como, tratamiento térmico
simple, degradación enzimática, sonicación con ultrasonidos, o
hidrólisis ácida. Véase, por ej., la patente estadounidense
6,020,484, que describe una técnica de tratamiento por ultrasonidos
del HA incluyendo NaOCl como aditivo, y T. Miiazaki et al.
(2001) Degradación y Estabilidad de los Polímeros, 74:
77-85.
Por consiguiente, una forma de realización
preferida se refiere al derivado de HA de la invención, donde el
ácido hialurónico o derivado o sal derivada tiene un peso molecular
promedio bajo en el rango de entre 10,000 y 3,000,000 Da;
preferiblemente en el rango de entre 10,000 y 50,000 Da; o
preferiblemente en el rango de entre 50,000 y 500,000 Da; incluso
más preferiblemente en el rango de entre 80,000 y 300,000 Da.
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El DS fue determinado por espectroscopia de RMN
^{1}H (10 mg/ml, D_{2}O, 80°C, 128 scans, 400MHz) según el
Ejemplo 6 abajo, donde los picos del Grupo OSA fueron asignados
usando una RMN 2D(gCOSY). El DS fue luego calculado
comparando la intensidad de los protones de vinilo de OSA (5.4 y
5.6 ppm) con aquello de los protones de acetilo (2.0 ppm).
En una forma de realización preferida el
derivado de HA del primer aspecto tiene un Grado de Sustitución
(DS) en el rango de 0.1-100%, preferiblemente
1-90%, más preferiblemente 2-80%,
aún más preferiblemente 4-70%, incluso más
preferiblemente 8-60%, o 10-50%,
14-40%, 16-30%, o de la forma más
preferible en el rango de 18-25%.
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En los métodos de la presente invención puede
usarse HA producido por recombinación. Este tipo de HA puede ser
producido por un proceso, donde las células huéspedes de producción
de HA son cultivadas en un medio nutritivo adecuado para la
producción del ácido hialurónico usando métodos conocidos en la
técnica. Por ejemplo, la célula puede ser cultivada por cultivo en
matraz vibrante, fermentación a pequeña escala o a gran escala
(incluyendo fermentaciones continuas, por lote, discontinuas o de
estado sólido) en laboratorio o fermentadores industriales
realizadas en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan que
las enzimas implicadas en la síntesis de ácido hialurónico sean
expresadas y aislar el ácido hialurónico. El cultivo se desarrolla
en un medio nutritivo adecuado comprendiendo fuentes de nitrógeno y
carbono y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la
técnica. Los medios adecuados están disponibles en los proveedores
comerciales o pueden ser preparados según composiciones publicadas
(por ej., en catálogos de la American Type Culture Collection). El
ácido hialurónico segregado puede ser recuperado directamente del
medio.
El ácido hialurónico resultante puede ser
aislado por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el ácido
hialurónico puede ser aislado del medio nutritivo por
procedimientos convencionales incluyendo, pero sin limitarse a
centrifugado, filtración, extracción, secado por pulverización,
evaporación, o precipitación. El ácido hialurónico aislado puede
luego ser adicionalmente purificado por una variedad de
procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero sin
limitarse a cromatografía (por ej., de intercambio iónico, de
afinidad, hidrofóbica, cromatoenfoque, y exclusión por tamaño),
procedimientos electroforéticos (por ej., isoelectroenfoque
preparatorio), solubilidad diferencial (por ej., precipitación de
sulfato amónico), o extracción (véase, por ej., purificación de
proteínas, J.-C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers,
Nueva York, 1989).
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Una forma de realización preferida se refiere a
cuando el ácido hialurónico o sal derivada es producido por
recombinación, preferiblemente por una bacteria gram positiva o
célula huésped, más preferiblemente por una bacteria del género
Bacillus.
La célula huésped puede ser cualquier célula de
Bacillus adecuada para la producción recombinante de ácido
hialurónico. La célula huésped de Bacillus puede ser una
célula de Bacillus tipo salvaje o un mutante de la misma.
Células de Bacillus útiles en la práctica de la presente
invención incluyen, pero no se limitan a, células de Bacillus
agaraderhens, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens,
Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus
coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus,
Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus,
Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, y Bacillus
thuringiensis. Las células de Bacillus subtilis mutante
particularmente adaptadas para la expresión recombinante están
descritas en WO 98/22598. Las células de Bacillus sin
encapsulación son particularmente útiles en la presente
invención.
En una forma de realización preferida, la célula
huésped de Bacillus es una célula de Bacillus
amyloliquefaciens, Bacillus clausii, Bacillus lentus, Bacillus
licheniformis, Bacillus stearothermophilus o Bacillus
subtilis. En una forma de realización más preferida, la célula
de Bacillus es una célula de Bacillus
amyloliquefaciens. En otra forma de realización más preferida,
la célula de Bacillus es una célula de Bacillus
clausii. En otra forma de realización más preferida, la célula
de Bacillus es una célula de Bacillus lentus. En otra
forma de realización más preferida, la célula de Bacillus es
una célula de Bacillus licheniformis. En otra forma de
realización más preferida, la célula de Bacillus es una
célula de Bacillus subtilis. En una forma de realización aún
más preferida, la célula huésped de Bacillus es Bacillus
subtilis A164\Delta5 (véase patente U.S. n°. 5,891,701) o
Bacillus subtilis 168\Delta4.
La transformación de la célula huésped de
Bacillus con un constructo de ácido nucléico de la presente
invención puede, por ejemplo, ser efectuada por transformación del
protoplasto (véase, por ej., Chang y Cohen, 1979, Genética
molecular general 168: 111-115), usando células
competentes (véase, por ej., Young y Spizizen, 1961, revista de
Bacteriología 81: 823-829, o Dubnau y
Davidoff-Abelson, 1971, Revista de Biología
Molecular 56: 209-221), por electroporación (véase,
por ej., Shigekawa y Dower, 1988, Biotécnicas 6:
742-751), o por conjugación (véase, por ej.,
Koenler y Thorne, 1987, Revista de Bacteriología 169:
5271-5278).
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En un tercer aspecto, la invención se refiere a
un proceso para producir un derivado de ácido hialurónico, el
proceso incluyendo las etapas de:
- (a)
- hacer reaccionar un ácido hialurónico con uno o más compuestos de alquil-/aril-vinil sulfona teniendo la fórmula general estructural (III) bajo condiciones alcalinas en una solución acuosa, por la cual el derivado de ácido hialurónico es formado; y
- (b)
- recuperar el derivado de ácido hialurónico.
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Una forma de realización preferida se refiere al
proceso del tercer aspecto, donde el grupo alquilo/arito, R en
(III), comprende un grupo alquilo, preferiblemente un grupo alquilo
hidrofóbico, más preferiblemente el grupo alquilo comprende un grupo
alquilo C_{1}-C_{20}, y de la forma más
preferible el grupo alquilo comprende un metilo, etilo, propilo,
2-octenilo, 2-nonenilo, 2
dodecenilo, 2-hexadecenilo o
2-octadecenilo; o donde el grupo alquilo/arilo
comprende un grupo arilo, preferiblemente un grupo arilo
hidrofóbico, y más preferiblemente el grupo arilo comprende fenilo o
p-toluilo.
También se prefiere que diferentes compuestos
monofuncionales de vinil sulfona puedan ser empleados al mismo
tiempo, conduciendo a la adición de varios compuestos de alquil o
aril sulfona diferentes a la molécula de HA.
Por consiguiente, una forma de realización
preferida se refiere al proceso del tercer aspecto, donde el
primero o más compuestos de alquil-/aril-vinil
sulfona comprenden dos o más grupos alquilo y/o arilo diferentes.
Preferiblemente, los dos o más grupos alquilo/arilo diferentes
comprenden un grupo alquilo, preferiblemente un grupo alquilo
hidrofóbico, más preferiblemente el grupo alquilo comprende un grupo
alquilo C_{1}-C_{20}, y de la forma más
preferible el grupo alquilo comprende un metilo, etilo, propilo,
2-octenilo, 2 nonenilo,
2-dodecenilo, 2-hexadecenilo o
2-octadecenilo; o los dos o más grupos
alquilo/arilo diferentes comprenden un grupo arilo, preferiblemente
un grupo arilo hidrofóbico, y más preferiblemente el grupo arilo
comprende fenilo o p-toluilo.
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En una forma de realización preferida, las
composiciones que comprenden un derivado de HA de la invención
puede también comprender otros ingredientes, preferiblemente una o
más sustancias activas, preferiblemente una o más sustancias
farmacológicamente activas, y también preferiblemente un excipiente
hidrosoluble, tal como lactosa.
Ejemplos no limitativos de una sustancia activa
o sustancia farmacológicamente activa que puede ser usada en la
presente invención incluyen fármacos a base de proteína y/o
péptidos, tales como, hormona de crecimiento humano, hormona de
crecimiento bovina, hormona de crecimiento porcina, hormona de
crecimiento de liberación de hormonas/péptidos, factor de
estimulación de colonias de granulocitos, factor de estimulación de
colonias-macrófagos de granulocitos, factor de
estimulación de colonias de macrófagos, eritropoyetina, proteína
morfogénica de huesos, interferón o su derivado, insulina o su
derivado, atriopeptina III, anticuerpo monoclonal, factor de
necrosis tumoral, factor macrófago activante, interleuquina, factor
de degeneración tumoral, factor de crecimiento de tipo insulina,
factor de crecimiento epidérmico, activador del
t-plasminógeno, factor IIV, factor IIIV y
uroquinasa.
Un excipiente hidrosoluble puede ser incluido
para estabilizar el (los) ingrediente(s) activo(s),
tal excipiente puede incluir una proteína, por ej., albúmina o
gelatina; un aminoácido, tal como glicina, alanina, ácido glutámico,
arginina, lisina y una sal derivada; carbohidratos tales como
glucosa, lactosa, xilosa, galactosa, fructosa, maltosa, sacarosa,
dextrano, manitol, sorbitol, trehalosa y sulfato de condroitina; una
sal inorgánica tal como fosfato; un tensioactivo tal como TWEEN®
(ICI), polietilenoglicol, y una mezcla del mismo. El excipiente o
estabilizador puede ser usado en una cantidad que varía de 0.001 a
99% en peso del producto.
Diferentes aspectos de la invención se refieren
a varias composiciones y fármacos comprendiendo, entre otros
ingredientes, una cantidad eficaz del producto tal y como se define
en el primer aspecto, y una sustancia activa, preferiblemente la
sustancia activa siendo un agente farmacológicamente activo; un
soporte, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable,
preferiblemente un excipiente hidrosoluble, y de la forma más
preferible lactosa.
Además, aspectos de la invención se refieren a
artículos que comprenden un derivado de HA tal y como se define en
el primer aspecto o una composición tal y como se define en los
aspectos y formas de realización sobre, por ej., un artículo
cosmético, un artículo sanitario, un artículo médico o quirúrgico.
En un último aspecto, la invención se refiere a una cápsula o
microcápsula de medicamento que comprende un producto tal y como se
define en el primer aspecto o una composición tal y como se define
en otros aspectos y formas de realización de la invención.
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Se disolvió HA en agua milliQ (10 ml) durante
toda la noche a temperatura ambiente. Se añadió NaOH a la solución
acuosa de HA bajo agitación. Se disolvió PVS en acetona (10 ml) y
la solución resultante fue añadida gota a gota después de
4-5 minutos usando un embudo de separación. La
mezcla fue agitada durante toda la noche a temperatura ambiente. La
mezcla cruda fue luego purificada en una bolsa de diálisis
(Spectra/Por®, corte 14 kDa) sumergida en agua milliQ (7.5 L). Se
cambió el agua milliQ 3 veces, después de 3 horas, luego después de
una noche y finalmente después de 3 horas. La diálisis fue vigilada
midiendo la conductividad del agua milliQ y se detuvo cuando la
conductividad fue menor de 5 \mu ES/cm. El producto purificado fue
finalmente diluido en agua milliQ (50 ml) y liofilizado.
La reacción dio un material blanco esponjoso de
94.5 mg, parcialmente soluble en agua milliQ. La composición del
producto purificado fue analizada por TLC. Los valores de tiempo de
retención mostraron que no quedó ningún residuo de PVS en el
producto purificado. La estructura del producto purificado fue
constatada por RMN ^{1}H y reveló un grado de sustitución (DS)
del 11% por unidad de disacárido de repetición (figura 2). También
se usó FT-IR para confirmar la formación de HA
derivado de fenil vinil sulfona.
Se realizó un estudio bajo la influencia de la
cantidad de PVS implicada en la reacción. Este estudio mostró que
cantidades más altas de PVS daban mayores grados de sustitución.
Estos fueron normalmente entre 11% y 55% para relaciones de PVS:HA
que variaban de 5:1 a 10:1 (Ejemplo 2).
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Los derivados arriba fueron preparados según el
método descrito en el Ejemplo 1. La relación NaOH:HA fue 1:1. El
grado de sustitución de los derivados es mostrado en la tabla
3.
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La figura 3 y la figura 4 representan los
espectros de RMN de los derivados. La figura 5 representa un
espectro de IR que confirma la inserción de PVS en cadenas de HA.
La atribución de las bandas es presentada en la tabla 4.
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El derivado EVS-HA fue preparado
según el método descrito en el Ejemplo 1. La reacción dio un
material blanco esponjoso, soluble en agua milliQ (12.5 g/l). La
estructura del producto purificado fue constatada por RMN ^{1}H y
reveló un grado de sustitución del 13.5% por unidad de disacárido
repetitiva (figura 6). Éste fue calculado comparando la señal de
protones de metilo en el sustituyente y aquella de protones de
metilo en HA.
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Esta lista de documentos citados por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector y no forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
- \bullet US 4801539 A [0033]
- \bullet WO 0027437 A [0034]
- \bullet EP 0694616 A [0033]
- \bullet US 6020484 A [0048]
- \bullet WO 03054163 A [0033]
- \bullet WO 9822598 A [0055]
- \bullet WO 9923227 A [0034]
- \bullet US 5891701 A [0056]
\bullet WO 9951265 A [0034] [0034]
\bulletLaurent T. C.; Fraser J.
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\bulletYoung; Spizizen. Journal of
Bacteriology, 1961, vol. 81, 823-829
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Davidoff-Abelson. Journal of Molecular
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\bulletKoenler; Thorne. Journal of
Bacteriology, 1987, vol. 169, 5271-5278
[0057]
Claims (27)
1. Derivado de ácido hialurónico comprendiendo n
unidades repetitivas y teniendo la fórmula general estructural
(I):
donde, en al menos una unidad
repetitiva, uno o más de R1, R2, R3, R4 comprende una aril/alquil
sulfona unida a un éter teniendo la fórmula general estructural
(II), donde R comprende un grupo alquilo o arilo, y por el
contrario R1, R2, R3, R4 son grupos hidróxilo,
OH:
2. Derivado de ácido hialurónico según la
reivindicación 1, donde dos o más de R1, R2, R3, R4 comprenden una
o más aril/alquil sulfona unida a un éter teniendo la fórmula
general estructural (II).
3. Derivado de ácido hialurónico según la
reivindicación 1 ó 2, donde tres o más de R1, R2, R3, R4 comprenden
una o más aril/alquil sulfonas unidas a un éter teniendo la fórmula
general estructural (II).
4. Derivado de ácido hialurónico de cualquiera
de las reivindicaciones 1-3, donde todos R1, R2,
R3, R4 comprenden una o más aril/alquil sulfonas unidas a un éter
teniendo la fórmula general estructural (II).
5. Derivado de ácido hialurónico de cualquiera
de las reivindicaciones 1-3, donde al menos R4
comprende una aril/alquil sulfona unida a un éter teniendo la
fórmula general estructural (II).
6. Derivado de ácido hialurónico de cualquiera
de las reivindicaciones 1-4, donde R comprende un
grupo alquilo, preferiblemente el grupo alquilo es hidrofóbico.
7. Derivado de ácido hialurónico según la
reivindicación 6, donde el grupo alquilo comprende un grupo alquilo
C_{1}-C_{20}, preferiblemente metilo, etilo,
propilo, 2-octenilo, 2-nonenilo,
2-dodecenilo, 2-hexadecenilo o
2-octadecenilo.
8. Derivado de ácido hialurónico de cualquiera
de las reivindicaciones 1-5, donde R comprende un
grupo arilo, preferiblemente el grupo arilo es hidrofóbico, y más
preferiblemente el grupo arilo es fenilo o
p-toluilo.
9. Derivado de ácido hialurónico de cualquiera
de las reivindicaciones 1-8, donde el Grado de
Sustitución (DS) está en el rango de 0.1-100%,
preferiblemente 1-90%, más preferiblemente
2-80%, aún más preferiblemente
4-70%, incluso más preferiblemente
8-60%, ó 10-50%,
14-40%, 16-30%, o de la forma más
preferible en el rango de 18-25%, determinado tal y
como se define aquí.
10. Derivado de ácido hialurónico, donde se
produce una reacción de adición entre uno o más grupos hidróxilo
del ácido hialurónico y uno o más compuestos monofuncionales de
aril-/alquil-vinil sulfona para formar un enlace de
éter entre el ácido hialurónico y el uno o más compuestos de
aril/alquil sulfona resultante.
\newpage
11. Derivado de ácido hialurónico según la
reivindicación 10, donde el uno o más compuestos monofuncionales de
aril/alquil-vinil sulfona tiene la fórmula general
estructural (III), donde R comprende un grupo alquilo o arilo.
12. Derivado de ácido hialurónico de cualquiera
de las reivindicaciones 10-11, donde el grupo
alquilo/arilo comprende un grupo alquilo, preferiblemente un grupo
alquilo hidrofóbico, más preferiblemente el grupo alquilo comprende
un grupo alquilo C_{1}-C_{20}, y de la forma
más preferible el grupo alquilo comprende un metilo, etilo, propilo,
2-octenilo, 2-nonenilo,
2-dodecenilo, 2-hexadecenilo o 2
octadecenilo.
13. Derivado de ácido hialurónico según la
reivindicación 11, donde el grupo alquilo/arilo comprende un grupo
arilo, preferiblemente un grupo arilo hidrofóbico.
14. Derivado de ácido hialurónico según la
reivindicación 13, donde el grupo arilo comprende fenilo o
p-toluilo.
15. Derivado de ácido hialurónico de cualquiera
de las reivindicaciones 10-14, donde el Grado de
Sustitución (DS) está en el rango de 0.1-100%,
preferiblemente 1-90%, más preferiblemente
2-80%, aún más preferiblemente
4-70%, incluso más preferiblemente
8-60%, ó 10-50%,
14-40%, 16-30%, o de la forma más
preferible en el rango de 18-25%, determinado tal y
como se define aquí.
16. Proceso para producir un derivado de ácido
hialurónico, el proceso incluyendo las etapas de:
- (a)
- hacer reaccionar un ácido hialurónico con uno o más compuestos de alquil-/aril-vinil sulfona teniendo la fórmula general estructural (III) bajo condiciones alcalinas en una solución acuosa, por la cual se forma el derivado de ácido hialurónico; y
- (b)
- recuperar el derivado de ácido hialurónico.
17. Proceso según la reivindicación 16, donde el
grupo alquilo/arilo, R en (III), comprende un grupo alquilo,
preferiblemente un grupo alquilo hidrofóbico, más preferiblemente
el grupo alquilo comprende un grupo alquilo
C_{1}-C_{20}, y de la forma más preferible el
grupo alquilo comprende un metilo, etilo, propilo,
2-octenilo, 2-nonenilo,
2-dodecenilo, 2-hexadecenilo o
2-octadecenilo.
18. Proceso según la reivindicación 16, donde el
grupo alquilo/arilo comprende un grupo arilo, preferiblemente un
grupo arilo hidrofóbico, y más preferiblemente el grupo arilo
comprende fenilo o p-toluilo.
19. Proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 16-18, donde el uno o más
compuestos de alquil-/aril-vinil sulfona comprenden
dos o más grupos alquilo y/o arilo diferentes.
20. Proceso según la reivindicación 19, donde
los dos o más grupos alquilo/arilo diferentes comprenden un grupo
alquilo, preferiblemente un grupo alquilo hidrofóbico, más
preferiblemente el grupo alquilo comprende un grupo alquilo
C_{1}-C_{20}, y de la forma más preferible el
grupo alquilo comprende un metilo, etilo, propilo,
2-octenilo, 2-nonenilo,
2-dodecenilo, 2-hexadecenilo, o
2-octadecenilo.
21. Proceso según la reivindicación 19, donde
los dos o más grupos alquilo/arilo diferentes comprenden un grupo
arilo, preferiblemente un grupo arilo hidrofóbico, y más
preferiblemente el grupo arilo comprende fenilo o
p-toluilo.
22. Proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 16-21, donde el derivado de ácido
hialurónico tiene un Grado de Sustitución (DS) en el rango de
0.1-100%, preferiblemente 1-90%,
más preferiblemente 2-80%, aún más preferiblemente
4-70%, incluso más preferiblemente
8-60%, o 10-50%,
14-40%, 16-30%, o de la forma más
preferible en el rango de 18-25%, determinado tal y
como se define aquí.
23. Composición que comprende un derivado de
ácido hialurónico tal y como se define en cualquiera de las
reivindicaciones 1-15 y una sustancia activa,
preferiblemente la sustancia activa es un agente farmacológicamente
activo.
24. Artículo cosmético que comprende un derivado
de ácido hialurónico tal y como se define en cualquiera de las
reivindicaciones 1-15 o una composición tal y como
se define en la reivindicación 23.
25. Artículo, sanitario, médico o quirúrgico que
comprende un derivado de ácido hialurónico tal y como se define en
cualquiera de las reivindicaciones 1-15 o una
composición tal y como se define en la reivindicación 23;
preferiblemente el artículo es un pañal, una compresa, una esponja
quirúrgica, una esponja para cicatrizar heridas, o una parte
comprendida en una tirita u otro material de apósito.
26. Uso de un derivado de ácido hialurónico tal
y como se define en cualquiera de las reivindicaciones
1-15 o una composición tal y como se define en la
reivindicación 23; para la producción de un medicamento para el
tratamiento de osteoartritis, cáncer, una herida, pérdida de pelo o
calvicie, para un tratamiento oftalmológico o para
angiogénesis.
27. Uso de un derivado de ácido hialurónico tal
y como se define en cualquiera de las reivindicaciones
1-15 o una composición tal y como se define en la
reivindicación 23; para la producción de una hidratante.
Applications Claiming Priority (4)
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|---|---|---|---|
| DKPA200600305 | 2006-03-02 | ||
| DK200600305 | 2006-03-02 | ||
| DKPA200600312 | 2006-03-03 | ||
| DK200600312 | 2006-03-03 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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