CN113402633B - 一种透明质酸-超氧化物歧化酶结合物及其在皮肤护理产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种透明质酸‑超氧化物歧化酶结合物及其在皮肤护理产品中的应用。超氧化物歧化酶是应用于化妆品中的一种重要的抗氧化活性成分,由于其不稳定性,本发明提供了一种透明质酸修饰的超氧化物歧化酶结合物,制备方法包括:取适量HA、SOD和NaBH3CN加入六氟异丙醇和NaHCO3的混合溶液中,充分反应。将所得的反应物用超滤膜浓缩,去除未反应的HA,冻干,检测HA‑(SOD)n结合物的生物活性。结果表明,该结合物具有较甘油更好的保湿性,较SOD更好的抗氧化活性、抗炎活性以及防辐射活性,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种透明质酸-超氧化物歧化酶结合物、其制备方法、包含所述结合物的药物组合物,及上述结合物、药物组合物在制备皮肤护理产品中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
根据衰老的自由基理论,在皮肤的衰老过程中,自由基对皮肤的损害是一个重要的因素。体内产生的自由基与脂肪酸作用而生成丙二醛等物质,他们与细胞膜上的蛋白质等作用形成脂褐素,沉积于皮肤上,成为各种色斑。自由基也能使表皮内的胶原纤维断裂,形成皱纹。因此自由基对皮肤的损坏作用是很大的,如能采取措施来减少皮肤自由基的生成,对已生成的自由基进行有效的清除,并能保持皮肤的水分,就可以有效地减缓皮肤的衰老。
超氧化物歧化酶(SOD)是超氧阴离子游离基的有效清除剂,目前它已经在化妆品中有所应用,但作用并不显著,原因是SOD容易失活,因此急需找到一种修饰剂去稳定超氧化物歧化酶。
发明内容
为实现现有技术不足,本发明提供一种透明质酸(HA)修饰的超氧化物歧化酶(SOD)结合物,SOD经透明质酸修饰后能够扩大SOD适应的pH范围,交联于SOD上的透明质酸能够产生空间障碍,阻挡蛋白水解酶接近SOD,能“遮盖”SOD分子敏感键,使SOD免遭蛋白水解酶的破坏。本发明通过控制不同的反应条件,得到缀和超氧化物歧化酶的结合物,这种结合物具有良好的保湿性、抗氧化活性、抗炎活性和防辐射活性。
基于上述技术效果,本发明提供以下技术方案:
本发明首先提供一种透明质酸-超氧化物歧化酶结合物,所述透明质酸与超氧化物歧化酶通过共价键连接,所述结合物结构式如下:
HA-(SOD)n;
其中,n为1-200中的自然数。
其次,本发明还提供所述透明质酸-超氧化物歧化酶结合物的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:将透明质酸(HA)、超氧化物歧化酶(SOD)与氰基硼氢化钠(NaBH3CN)投入反应体系中进行交联反应。
上述反应体系中,所述氰基硼氢化钠(NaBH3CN)作为反应体系中还原剂,在反应体系中起到活化透明质酸的作用。发明人的研究发现,对氰基硼氢化钠(NaBH3CN)采用重结晶操作可以去除痕量的NaBH4,NaBH4能极其迅速的还原醛基,进而阻止醛基参与速度较慢的还原胺化反应。因此重结晶操作可以有效的提高透明质酸的活化程度,提高透明质酸与超氧化物歧化酶的连接强度,从而提升结合物的保湿性能。
基于上述研究成果,本发明提供的透明质酸-超氧化物歧化酶结合物能够根据使用需求调整SOD的缀合度及分子量,结合物本身具有良好的保湿、抗氧化、抗炎和防辐射效果,应用于功效性的化妆品、皮肤外用药物领域可有效的发挥保湿、抗氧化等功效。
以上一个或多个技术方案的有益效果是:
1、本发明技术方案通过控制透明质酸的分子量和反应时间,共制备6种HA-SOD结合物;本发明经功效评价发现,HA与SOD的缀合效果并非呈简单的线性相关,当HA的分子量为5kDa,SOD的缀合数为6时,所述结合物具有更好的保湿效果及抗氧化效果。
2、针对制备方法的研究中,本发明提供了一种可针对超氧化物歧化酶缀合数进行调整的制备方法,基于本发明方法,本领域技术人员可依据应用目的和需求对所述结合物总分子量及其中SOD的占比进行调整,能够灵活满足工业上的多种应用目的。另外,本发明还发现,针对还原胺的重结晶处理,能够有效的改善透明质酸与超氧化物歧化酶的交联效果,提升保湿性能。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1:HA-SOD保湿性测试;
图2:HA-SOD对DPPH自由基清除活性测试。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的,超氧化物歧化酶是一种超氧阴离子游离基的有效清除剂,但是其自身稳定性较差在化妆品中的应用效果并不理想。为了解决如上的技术问题,本发明提出了一种透明质酸-超氧化物歧化酶结合物,透明质酸为超氧化物歧化酶提供了丰富的结合位点,并且有效提供了超氧化物歧化酶的稳定性。
本发明第一方面,提供一种透明质酸-超氧化物歧化酶结合物,所述透明质酸与超氧化物歧化酶通过共价键连接,所述结合物结构式如下:
HA-(SOD)n;
其中,n为1-200中的自然数。
第一方面优选的方案,所述结合物中透明质酸的分子量为2kDa~150kDa。本领域公知,透明质酸是D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的双糖单位糖胺聚糖,上述分子量的透明质酸均能够形成满足本申请技术效果的结合物,当透明质酸分子量升高,其表面可结合超氧化物歧化酶的位点也增多,即上述结构式中的n值也随之增大。
考虑到上述结合物在皮肤外用制剂或生物医药领域的应用,透明质酸的分子量在5kDa~120kDa范围内更为恰当,市售透明质酸产品的分子量通常为固定的数值,因此本发明一些具体的实施方式中,所述透明质酸的分子量为5kDa、50kDa或120kDa。
本发明第一方面效果较好的实施方式中,所述透明质酸的分子量为5kDa,所述超氧化物歧化酶(SOD)的数量为1或6个。
又一种具体的实施方式中,所述透明质酸的分子量为50kDa,所述超氧化物歧化酶的数量为13个或65个。
又一种具体的实施方式中,所述透明质酸的分子量为120kDa,所述超氧化物歧化酶的数量为31个或158个。
本发明第二方面,提供第一方面所述透明质酸-超氧化物歧化酶结合物的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:将透明质酸(HA)、超氧化物歧化酶(SOD)与氰基硼氢化钠(NaBH3CN)投入反应体系中进行交联反应。
因此,第二方面优选的技术方案中,所述氰基硼氢化钠为重结晶后的氰基硼氢化钠(NaBH3CN),所述重结晶方式如下:将NaBH3CN溶于四氢呋喃中获得NaBH3CN溶液,将所述溶液滴入1~3倍体积的二氧六环中,待其析出晶体。
进一步的,所述四氢呋喃的体积采用可溶解NaBH3CN的最小溶剂体积,技术人员可以采用逐滴加入的方式直至所有的NaBH3CN均能够溶解获得所述NaBH3CN溶液,二氧六环试剂的体积优选为NaBH3CN溶液体积的二倍。
进一步的,所述溶液滴入二氧六环后,在室温下静置过夜滤出晶体,获取滤出的晶体采用二氧六环清洗后干燥获得。
优选的,所述反应体系为六氟异丙醇及NaHCO3,其制备方法如下:将六氟异丙醇与0.1M NaHCO3以体积比2~3:1~2混合,pH=6.5~7.5。
优选的,所述交联反应的温度为35~39℃,通过磁力搅拌混合。
上述制备方法的一种具体的实施方式,步骤如下:所述HA的分子量为5kDa,反应时间为24h时,其制备方法为:以体积比3:2取六氟异丙醇和0.1M NaHCO3共5mL(pH 7.0)置于反应容器中,混匀;取80mg HA、80mg SOD,30mg S1所述NaBH3CN加入上述反应容器,磁力搅拌,37℃反应24h,得到HA-SOD1(SOD缀和数为1)。
又一种具体的实施方式中,所述制备方法步骤如下:所述HA的分子量为5kDa,反应时间为48h时,其制备方法为:以体积比3:2取六氟异丙醇和0.1M NaHCO3共5mL(pH 7.0)置于反应容器中,混匀;取80mg HA、80mg SOD,30mg S1所述NaBH3CN加入上述反应容器,磁力搅拌,37℃反应48h,得到HA-SOD2(SOD缀和数为6)。
又一种具体的实施方式中,所述制备方法步骤如下:所述HA的分子量为50kDa,反应时间为24h时,其制备方法为:以体积比3:2取六氟异丙醇和0.1M NaHCO3共5mL(pH 7.0)置于反应容器中,混匀;取80mg HA、80mg SOD,30mg S1所述NaBH3CN加入上述反应容器,磁力搅拌,37℃反应24h,得到HA-SOD3(SOD缀和数为13)。
又一种具体的实施方式中,所述制备方法步骤如下:所述HA的分子量为50kDa,反应时间为48h时,其制备方法为:以体积比3:2取六氟异丙醇和0.1M NaHCO3共5mL(pH 7.0)置于反应容器中,混匀;取80mg HA、80mg SOD,30mg S1所述NaBH3CN加入上述反应容器,磁力搅拌,37℃反应48h,得到HA-SOD4(SOD缀和数为65)。
又一种具体的实施方式中,所述制备方法步骤如下:所述HA的分子量为120kDa,反应时间为24h时,其制备方法为:
以体积比3:2取六氟异丙醇和0.1M NaHCO3共5mL(pH 7.0)置于反应容器中,混匀;取80mg HA、80mg SOD,30mg S1所述NaBH3CN加入上述反应容器,磁力搅拌,37℃反应24h,得到HA-SOD5(SOD缀和数为31)。
又一种具体的实施方式中,所述制备方法步骤如下:所述HA的分子量为120kDa,活化时间为48h时,其制备方法为:以体积比3:2取六氟异丙醇和0.1M NaHCO3共5mL(pH 7.0)置于反应容器中,混匀;取80mg HA、80mg SOD,30mg S1所述NaBH3CN加入上述反应容器,磁力搅拌,37℃反应48h,得到HA-SOD6(SOD缀和数为158)。
优选的,所述制备方法还包括对产物的纯化过程,所述纯化过程包括超滤、或超滤并检测HA-SOD纯度。
进一步的,所述超滤采用超滤管,2500-3000g转速,10-20min进行超滤离心。
上述超滤过程中,所述超滤管的截留分子量依据产物的分子量进行调整,调整依据为反应后未除去的SOD及HA分子量,本领域技术人员可以依据常规研究思路进行确定。
进一步的,所述HA-SOD纯度检测方法步骤如下:通过咔唑硫酸法检测超滤管被浓缩液体中HA的质量比,当HA质量比不再下降,表明产物中未交联的HA被完全清除,交联反应结束。
本发明第三方面,提供一种药物组合物,所述药物组合物中包括第一方面所述透明质酸-超氧化物歧化酶结合物。
所述药物组合物可以为以下制剂形式:溶液、悬浮液、乳液、霜剂、擦剂、硬膏、软膏、凝胶、泡沫、贴剂、膏药、粉剂、糊剂等。优选的,所述药物组合物中,还包括必需的载体。本申请中所述“必须的载体”主要表示皮肤外用产品中所必需的辅料,主要包括油相、水相、赋形剂等。
进一步的,所述油相包括例如烃、酯、动植物油和脂肪、蜡、虾虎油、高级脂肪酸、高级醇、硅酮类物质、固醇和树脂、以及通过酶(例如,水解和酯交换)或化学(例如,酯交换和氢化)处理的上述物质;具体的实例如杏仁油、坚果油、鳄梨油、猴面包树油、茶花油、胡萝卜油、蓖麻油、香茅油、椰子油、酸果蔓籽油、葡萄籽油、大麻籽油、霍霍巴油、澳洲坚果油、草甸泡沫种子油、燕麦润肤剂、红树莓种子油、玫瑰果油、大豆油、菜籽油、玉米油、芝麻籽油、棉籽油、红花油、葵花籽油、花生油、胚芽油、夏威夷果油、大蒜油、山茶油、棕榈油、橄榄油、亚麻籽油、桉树油、月见草油、乌龟油、貂油、猪油、牛脂、马油、蛇油、鱼油、蛋黄油;液体石蜡、异链烷烃、凡士林、角鲨烷、角鲨烯、松节油、聚乙二醇、肉豆蔻酸异丙酯、肉豆蔻酸异棕榈酰酯、2-肉豆蔻酸辛基十二烷基酯、2-乙基己酸十六烷基酯、三-2-乙基甘油酯己酸、甘油三辛酸酯、辛酸和癸酸的混合脂肪酸甘油三酸酯、新戊二醇二-2-乙基己酸酯、苹果酸二异硬脂基酯、异壬酸异壬酸酯(3,5,5-三甲基己基-3'、5'、5'-三甲基己酸)、胆固醇12-羟基硬脂酸酯、二季戊四醇和异硬脂酸和/或高级脂肪酸的单酯至六酯、对甲氧基肉桂酸和2-己酸的甘油酯、对甲氧基肉桂酸异辛酯、三硬脂酸甘油酯、松香、胆固醇、植物甾醇、羊毛脂、肉豆蔻酸、棕榈酸、异棕榈酸、硬脂酸、异硬脂酸、油酸、亚油酸、亚油酸、蓖麻油酸、12-羟基硬脂酸酸、10-羟基硬脂酸、山嵛酸、芥酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、肉豆蔻醇、鲸蜡醇、硬脂醇、异硬脂醇、山嵛醇、羊毛脂醇、石蜡、微晶蜡、蜜蜂蜡、乳木果油、凡士林、硬脂、巴西棕榈蜡、小烛树蜡、米糠蜡、向日葵蜡、浆果蜡、杨梅果蜡、月桂树蜡、日本蜡、虫胶、二甲基聚硅氧烷、甲基苯基聚硅氧烷。
上述载体中成分的具体选择根据药物组合物的制剂形式决定,固体形式如膏剂、乳剂中的油相成分可从上述原料中选择一种或多种植物性油、动物油脂、黄油、蜡进行组合。水溶性的软膏制剂中,至少包括一种聚乙二醇类成分。
进一步的,所述赋形剂为包括但不限于增稠剂、胶凝剂、中和剂、吸留性、抗氧化剂、缓冲剂、pH调节剂、填充剂、乳化剂、助乳化剂、润肤剂、溶剂、稳定剂、增溶剂、增硬剂、助悬剂、粘合剂、增粘剂、渗透促进剂、防腐剂、螯合剂、崩解剂、增塑剂、湿润剂、香料等。
所述抗氧化剂的实例如抗坏血酸(维生素C)、谷胱甘肽、硫辛酸、尿酸、生育酚(维生素E)、丁基化羟基甲苯(BHT)、丁基化羟基茴香醚(BHA)、胡萝卜素或泛醇(辅酶Q)。
所述胶凝剂的实例如西黄蓍胶、海藻酸钠、果胶、硅酸盐(例如气相二氧化硅)、明胶、纤维素衍生物(例如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素)、卡波姆、瓜尔豆胶、聚乙烯醇粘土等。
所述渗透促进剂的实例如油酸、卵磷脂、尿素、丁香油、肉豆蔻酸异丙酯、薄荷醇、香芹酚、芳樟醇、柠檬烯、香叶醇、橙花醇、丙二醇双戊四酸酯或环糊精。
所述抗菌防腐剂的实例如羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、氯甲酚、苯甲酸、硝酸苯汞、氯化苯扎氯铵、乙酸洗必太、苄醇或汞。
所述螯合剂的实例如柠檬酸或马来酸。
所述湿润剂的实例如聚乙二醇、甘油或山梨糖醇。
所述香料的实例如薰衣草油、玫瑰油、柠檬油、石灰油、佛手柑油、橙油、petgragrain油、橘油、洋甘菊油、肉桂油、鼠尾草精油、柏树油、天竺葵油、姜油、杜松油、马郁兰精油、桃金娘油、橙花油、松木油、紫檀木油、依兰油、雪松木油、茉莉花油、乳香油、没药油、广藿香油、檀香油或刺五加油。
所述乳化剂的实例如烷基硫酸盐、肥皂、十二烷基苯磺酸盐、乳酸酯、磺基琥珀酸酯、单酸甘油酯磺酸盐、磷酸酯、硅氧烷、牛磺酸盐等。
本发明第四方面,提供第一方面所述透明质酸-超氧化物歧化酶结合物、第三方面所述药物组合物在制备皮肤护理产品中的应用。
优选的,所述皮肤修复产品包括但不限于药物、洗护产品、化妆品或皮具护理剂。
上述技术方案中,所述药物优选为皮肤外用制剂,进一步的,所述皮肤外用制剂用于炎症、干燥、辐射相关的皮肤症状,如皮肤干燥综合症、皮炎、放射性皮肤病、晒伤等。
所述洗护产品包括但不限于面部或身体的清洁产品、护理产品;所述清洁产品的实例如洗发水、沐浴露、洗面奶、剃须膏、洗手液、香皂等;所述护理产品的实例包括但不限于面霜、护手霜、身体乳等。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案,以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
本实施例中,提供一种HA-SOD1(SOD缀和数为1)的制备方法:
S1、氰基硼氢化钠重结晶
将NaBH3CN用最小体积的四氢呋喃溶解,过滤,将四氢呋喃溶液滴入两倍体积的二氧六环,室温混合过夜,滤出晶体,用二氧六环清洗,真空干燥。
S2、制备HA-SOD结合物
所述HA的分子量为5kDa,以体积比3:2取六氟异丙醇和0.1M NaHCO3共5mL(pH7.0)置于反应容器中,混匀;取80mg HA、80mg SOD,30mg S1所述NaBH3CN加入上述反应容器,磁力搅拌,37℃反应24h,得到HA-SOD1(SOD缀和数为1)。
S3、透明质酸修饰-超氧化物歧化酶结合物纯化
(1)超滤:用截留分子量为30kDa的15mL超滤管,2500-3000g转速,10-20min进行超滤离心;每次离心过程均使v形管内液体从5mL减少约0.5ml。
(2)检测HA-SOD纯度:每次离心后采用咔唑硫酸法测超滤管中浓缩层HA质量比,直至HA质量比不再下降,确定产物中未交联的HA被完全清除。
实施例2
本实施例中,提供一种HA-SOD2(SOD缀和数为6)的制备方法,与实施例1不同之处如下:
所述HA的分子量为5kDa,反应时间为48h时,其制备方法为:以体积比3:2取六氟异丙醇和0.1M NaHCO3共5mL(pH 7.0)置于反应容器中,混匀;取80mg HA、80mg SOD,30mg S1所述NaBH3CN加入上述反应容器,磁力搅拌,37℃反应48h,得到HA-SOD2(SOD缀和数为6)。
实施例3
本实施例中,提供一种HA-SOD3(SOD缀和数为13)的制备方法,与实施例1不同之处如下:
所述HA的分子量为50kDa,反应时间为24h时,其制备方法为:以体积比3:2取六氟异丙醇和0.1M NaHCO3共5mL(pH 7.0)置于反应容器中,混匀;取80mg HA、80mg SOD,30mgS1所述NaBH3CN加入上述反应容器,磁力搅拌,37℃反应24h,得到HA-SOD3(SOD缀和数为13)。
实施例4
本实施例中,提供一种HA-SOD3(SOD缀和数为13)的制备方法,与实施例1不同之处如下:
所述HA的分子量为50kDa,反应时间为48h时,其制备方法为:以体积比3:2取六氟异丙醇和0.1M NaHCO3共5mL(pH 7.0)置于反应容器中,混匀;取80mg HA、80mg SOD,30mgS1所述NaBH3CN加入上述反应容器,磁力搅拌,37℃反应48h,得到HA-SOD4(SOD缀和数为65)。
实施例5
本实施例中,提供一种HA-SOD5(SOD缀和数为31)的制备方法,与实施例1不同之处如下:
所述HA的分子量为120kDa,反应时间为24h时,其制备方法为:以体积比3:2取六氟异丙醇和0.1M NaHCO3共5mL(pH 7.0)置于反应容器中,混匀;取80mg HA、80mg SOD,30mgS1所述NaBH3CN加入上述反应容器,磁力搅拌,37℃反应24h,得到HA-SOD5(SOD缀和数为31)。
实施例6
本实施例中,提供一种HA-SOD6(SOD缀和数为158)的制备方法,与实施例1不同之处如下:
所述HA的分子量为120kDa,活化时间为48h时,其制备方法为:以体积比3:2取六氟异丙醇和0.1M NaHCO3共5mL(pH 7.0)置于反应容器中,混匀;取80mg HA、80mg SOD,30mgS1所述NaBH3CN加入上述反应容器,磁力搅拌,37℃反应48h,得到HA-SOD6(SOD缀和数为158)。
本实施例中,还针对上述不同分子量透明质酸-超氧化物歧化酶的结合物的保湿、抗氧化、抗炎和防辐射效果进行了评价:
(1)HA-SOD保湿性评价:将六种HA-SOD样品及甘油配置成10mg/mL的样品,测试温度为20℃,在干燥器底部放入200g经干燥的变色硅胶,分别称取约3g溶液于直径3cm的称量皿中放置在硅胶干燥器中,进行保湿实验。每隔24h将称量皿取出称重,连续称重5次,由此测定前后试样的质量差。计算保湿率:保湿率(%)=Hn/H0×100%(式中,Hn为放置n天后的含水质量,H0为放置前的含水质量)。
(2)HA-SOD总还原力评价:称取一定浓度的HA-SOD样品0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL于试管中,加入PBS缓冲液(pH 6.60)定容至2.5mL,加入1%铁氰化钾溶液5mL,混匀后放入50℃水浴中保温20min,然后加入10%三氯乙酸5mL,混匀,5000r/min离心10min,移取上清液2.5mL于试管中,加入2.5mL蒸馏水,0.1%三氯化铁0.5mL,常温反应5min,700nm波长下测定吸光值,吸光值越大表示还原能力越强。
(3)HA-SOD对DPPH自由基清除活性评价:取一定浓度的HA-SOD样品0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL于试管中,加入双蒸水定容至2mL,每管分别加入2mL 0.02%的DPPH溶液,空白对照组用双蒸水代替样品,记录各组在517nm的吸光值Ai和A0。根据公式(清除率(%)=(A0-Ai)/A0×100%)(式中,Ai表示样品组、A0表示空白对照组),计算样品对DPPH自由基的抑制率。
(4)HA-SOD对羟自由基清除活性评价:在试管中依次加入6mmol/L的FeSO4溶液2mL,不同浓度的样品溶液2mL,6mmol/L的水杨酸溶液2mL,摇匀,37℃静置15min,再加入6mmol/L的H2O2溶液2mL启动反应,摇匀,37℃静置15min,以蒸馏水调零,于510nm处测其吸光值。根据公式(清除率(%)=(A0-Ai)/A0×100%)(式中,Ai表示样品组、A0表示空白对照组),计算样品对羟自由基的抑制率。
(5)HA-SOD的抗炎活性评价:将实验分为以下8组,每组包括4个平行孔:(Ⅰ)正常对照组(加PBS);(Ⅱ)HA-SOD(1-6);(Ⅲ)SOD组;(Ⅳ)混合物组(SOD+HA);(Ⅴ)HA组;(Ⅵ)模型对照组(加PBS)。除了正常对照组,其余实验组均同时加脂多糖(LPS)。按照分组要求,除了正常对照组,其他7组实验组中,各组对应药物和LPS共同孵育24h小鼠腹腔巨噬细胞,取上清液,离心。采用鼠TNF-α、IL-1β的ELISA试剂盒测定各炎症因子水平,操作过程严格按照试剂盒说明书进行。
(6)HA-SOD的辐射防护评价:取对数生长期细胞用于铺板,浓度为每孔2000个细胞。将细胞恒温培养以贴壁。第二天一早给药,分组如下:(Ⅰ)正常对照组;(Ⅱ)HA-SOD(1-6)组;(Ⅲ)SOD组;(Ⅳ)混合物组(SOD+HA);(Ⅴ)HA组。药物作用24h后,为每孔更换新鲜培养基。送去进行X射线照射,照射剂量为4Gy。照射后继续放置恒温培养箱培养48h,进行MTT检测。
对比例
该实施例下,针对氰基硼氢化钠NaBH3CN的预处理进行了研究,对是否需要提前对NaBH3CN进行重结晶进行了考察,该实施例中,直接使用未处理的NaBH3CN进行还原胺化反应:
以体积比3:2取六氟异丙醇和0.1M NaHCO3共5mL(pH 7.0)置于反应容器中,混匀;取80mg HA、80mg SOD,30mg S1所述NaBH3CN加入上述反应容器,磁力搅拌,37℃反应24h,得到HA-SOD7。
对比例结果表示,不对NaBH3CN进行重结晶处理的反应体系,HA不能与SOD产生反应,初步推断,NaBH3CN重结晶可以用于除去痕量的NaBH4,NaBH4能极其迅速的还原醛基,进而阻止醛基参与速度较慢的还原胺化反应。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (19)
1.一种透明质酸-超氧化物歧化酶结合物,其特征在于,所述透明质酸与超氧化物歧化酶通过共价键连接,所述结合物结构式如下:
HA-(SOD)n;
其中,n为1-200中的自然数;
制备方法包括以下步骤:将透明质酸、超氧化物歧化酶与氰基硼氢化钠投入反应体系中进行交联反应;所述透明质酸的分子量为5 kDa,超氧化物歧化酶的数量为1或6个。
2.权利要求1所述透明质酸-超氧化物歧化酶结合物的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:将透明质酸、超氧化物歧化酶与氰基硼氢化钠投入反应体系中进行交联反应。
3.如权利要求2所述透明质酸-超氧化物歧化酶结合物的制备方法,其特征在于,所述氰基硼氢化钠为重结晶后的氰基硼氢化钠,所述重结晶方式如下:将NaBH3CN溶于四氢呋喃中获得NaBH3CN溶液,将所述溶液滴入1~3倍体积的二氧六环中,待其析出晶体。
4.如权利要求3所述透明质酸-超氧化物歧化酶结合物的制备方法,其特征在于,所述四氢呋喃的体积采用可溶解NaBH3CN的最小溶剂体积,二氧六环试剂的体积为NaBH3CN溶液体积的二倍。
5.如权利要求3所述透明质酸-超氧化物歧化酶结合物的制备方法,其特征在于,所述溶液滴入二氧六环后,在室温下静置过夜滤出晶体,获取滤出的晶体采用二氧六环清洗后干燥获得。
6.如权利要求2所述透明质酸-超氧化物歧化酶结合物的制备方法,其特征在于,所述反应体系为六氟异丙醇及NaHCO3,其制备方法如下:将六氟异丙醇与0.1M NaHCO3以体积比2~3:1~2混合,pH=6.5~7.5。
7.如权利要求2所述透明质酸-超氧化物歧化酶结合物的制备方法,其特征在于,所述制备方法还包括对产物的纯化过程,所述纯化过程包括超滤、或超滤并检测HA-SOD纯度。
8.如权利要求7所述透明质酸-超氧化物歧化酶结合物的制备方法,其特征在于,所述超滤采用超滤管,2500-3000 g转速,10-20 min进行超滤离心。
9.如权利要求7所述透明质酸-超氧化物歧化酶结合物的制备方法,其特征在于,所述HA-SOD纯度检测方法步骤如下:通过咔唑硫酸法检测超滤管被浓缩液体中HA的质量比,当HA质量比不再下降,表明产物中未交联的HA被完全清除,交联反应结束。
10.一种药物组合物,其特征在于,所述药物组合物中包括权利要求1所述透明质酸-超氧化物歧化酶结合物。
11.如权利要求10所述药物组合物,其特征在于,所述药物组合物为以下制剂形式:溶液、悬浮液、乳液、霜剂、擦剂、硬膏、软膏、凝胶、泡沫、贴剂、膏药、粉剂或糊剂。
12.如权利要求11所述药物组合物,其特征在于,所述药物组合物中,还包括必需的载体,包括油相、水相或赋形剂。
13.如权利要求12所述药物组合物,其特征在于,所述油相包括烃、酯、动植物油和脂肪、蜡、虾虎油、高级脂肪酸、高级醇、硅酮类物质、固醇和树脂、以及通过酶或化学处理的上述物质。
14.如权利要求12所述药物组合物,其特征在于,所述赋形剂为包括增稠剂、胶凝剂、中和剂、吸留性、抗氧化剂、缓冲剂、pH调节剂、填充剂、乳化剂、助乳化剂、润肤剂、溶剂、稳定剂、增溶剂、增硬剂、助悬剂、粘合剂、增粘剂、渗透促进剂、防腐剂、螯合剂、崩解剂、增塑剂、湿润剂或香料。
15.权利要求1所述透明质酸-超氧化物歧化酶结合物或者权利要求10-14任一所述药物组合物在制备皮肤护理产品中的应用。
16.如权利要求15所述应用,其特征在于,所述皮肤修复产品包括药物、洗护产品、化妆品或皮具护理剂。
17.如权利要求16所述应用,其特征在于,所述药物为皮肤外用制剂。
18.如权利要求17所述应用,其特征在于,所述皮肤外用制剂用于炎症、干燥、辐射相关的皮肤症状,包括皮肤干燥综合症、皮炎、放射性皮肤病或晒伤。
19.如权利要求16所述应用,其特征在于,所述洗护产品包括面部或身体的清洁产品、护理产品;所述清洁产品包括洗发水、沐浴露、洗面奶、剃须膏、洗手液、香皂;所述护理产品包括面霜、护手霜、身体乳。
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