CN104357433A - 一种6-o-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物及其制备 - Google Patents

一种6-o-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物及其制备 Download PDF

Info

Publication number
CN104357433A
CN104357433A CN201410610157.6A CN201410610157A CN104357433A CN 104357433 A CN104357433 A CN 104357433A CN 201410610157 A CN201410610157 A CN 201410610157A CN 104357433 A CN104357433 A CN 104357433A
Authority
CN
China
Prior art keywords
superoxide
dismutase
trimethyl chitosan
chitosan chloride
sod
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410610157.6A
Other languages
English (en)
Inventor
刘纯慧
许玲华
王凤山
宋春霞
曹吉超
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong University
Original Assignee
Shandong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong University filed Critical Shandong University
Priority to CN201410610157.6A priority Critical patent/CN104357433A/zh
Publication of CN104357433A publication Critical patent/CN104357433A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y115/00—Oxidoreductases acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • C12Y115/01—Oxidoreductases acting on superoxide as acceptor (1.15) with NAD or NADP as acceptor (1.15.1)
    • C12Y115/01001—Superoxide dismutase (1.15.1.1)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及一种6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物及其制备，所述修饰物由SOD分子上的羧基与O-HTCC分子的氨基通过酰胺键结合；一分子O-HTCC分子与1～10分子SOD结合。本发明还涉及该6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法。本发明所述的O-HTCC-SOD修饰物与天然SOD相比，保留了SOD分解超氧阴离子的活性，整合了O-HTCC的良好特性，使其具有稳定性高、半衰期长、免原性低的特性；与TMC相比，O-HTCC修饰SOD的效率更高，因此具有更好的使用效果和应用范围。

Description

一种6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物及其制备
技术领域
本发明涉及一种6-O季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物及其制备，属于生物医药技术领域。
背景技术
超氧化物歧化酶(SOD)是一类重要的超氧阴离子自由基清除剂，可用于防治过量超氧阴离子自由基引起的疾病和机体损伤，如辐射损伤、缺血再关注损伤、自身免疫性疾病等。目前超氧化物歧化酶的主要来源为从动植物中提取，存在抗原性、体内半衰期短和稳定性差等缺点，限制了其应用。对其分子进行化学修饰是克服超氧化物歧化酶上述缺点的有效方法，常采用的修饰剂有聚乙二醇(PEG)、右旋糖苷、低分子肝素、壳聚糖等，修饰后的SOD免疫原性降低、体内半衰期延长、稳定性增加。
壳聚糖是目前发现的自然界存在的唯一一种阳离子多糖，具有清除自由基，抗炎等作用，季铵化能改善其水溶性并进一步提高其带正电荷的能力。Liu JF等(参见Journal of drug targeting,2009.17(3):216-224.)采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)缩合法使N,N,N-三甲基季铵化壳聚糖(TMC)的自由氨基与SOD分子的羧基形成酰胺键得修饰产物，研究表明TMC修饰的SOD衍生物具有稳定性高、体内半衰期长和显著的细胞靶向性等优点，是一种有研究和开发价值的SOD衍生物。
TMC制备过程中，壳聚糖的2-NH2被甲基化后首先生成2-NH(CH3)甚至2-N(CH3)2，然后才能进一步形成2-N(CH3)3 +季铵基团，因此，水溶性良好的TMC中的自由氨基数量极少(一般<10％)，导致其对SOD的效率较低、结合物活性保持率差，制约了季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物的进一步研究和应用。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶(O-HTCC-SOD)修饰物，并提供该修饰物的制备方法。
术语说明
自由氨基：伯胺基团(即—NH2)，亦称一级胺基。
6-O-季铵化壳聚糖：壳聚糖的C6-OH上接枝一个含有季铵盐的基团而得到的衍生物。本申请中采用2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)接枝到壳聚糖C6-OH上得到O-(羟基)丙基-3-三甲基氯化铵壳聚糖(O-HTCC)衍生物，水溶性良好，自由氨基率在70％以上。
本发明的技术方案如下：
一种6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物，由超氧化物歧化酶(SOD)分子上的羧基与季铵化壳聚糖(O-HTCC)分子的氨基通过酰胺键结合，结构式如下：
(SOD)n-CO-NH-O-HTCC；
式中，n＝1～10；SOD的分子量为32000Da；O-HTCC的分子量为2000Da以上，自由氨基摩尔含量为不小于20％。
优选的，所述n＝1～6，即一分子O-HTCC与1～6分子SOD共价结合形成修饰物；O-HTCC的分子量为5000Da～100000Da，自由氨基摩尔含量为不小于50％。
一种6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将超氧化物歧化酶溶于10mM pH 6.0的PBS缓冲液，制得超氧化物歧化酶溶液，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，使超氧化物歧化酶与碳二亚胺的摩尔比为1∶(1～200)，超氧化物歧化酶与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(1～100)，反应20～40min，制得反应液A；
(2)取6-O-季铵化壳聚糖(O-HTCC)溶于10mM pH 6.0的PBS缓冲液，制得季铵化壳聚糖溶液，然后加入步骤(1)制得的反应液A，使超氧化物歧化酶与6-O-季铵化壳聚糖的质量比为1：(0.1～50)，反应5～7h，经分离纯化，制得6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的超氧化物歧化酶溶液中超氧化物歧化酶的浓度为0.5～5mg/ml；超氧化物歧化酶与碳二亚胺的摩尔比为1∶(50～150)，超氧化物歧化酶与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(10～50)。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，反应条件为室温条件下100～600r/min搅拌反应25～35min；所述步骤(2)中，反应条件为室温条件下100～600r/min搅拌反应5～7h。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的6-O-季铵化壳聚糖可按照现有技术制备，如参见“Journal of applied polymer science,2007,105(2):552-561”；也可以按照如下方法制备：
①取3g壳聚糖溶于100ml质量浓度为10％的醋酸水溶液中，40℃搅拌30min，充分溶胀，加入苯甲醛15.8g，继续搅拌反应1h，制得乳白色反应液，于60℃真空干燥12h，调节pH至中性，过滤，收集沉淀，用甲醇洗涤，烘干，制得反应物A；
②将步骤①制得的反应物A研磨后，置于圆底烧瓶中，加入50ml异丙醇，搅拌30min后，逐滴加入9g 2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)，70℃水浴回流搅拌16h，反应液过滤，得到的固体用甲醇洗涤，真空干燥，制得反应物B；
③将步骤②制得的反应物B研磨后，置于圆底烧瓶中，加50ml 0.25mol/L的盐酸乙醇溶液，室温下搅拌反应24h，蒸发去除大部分溶剂，再加入15ml水，溶解后，加入过量丙酮，沉淀过夜，经离心，收集沉淀，干燥，制得O-HTCC粗品，然后溶于水中，采用滤膜截留分子量为10kD超滤仪超滤去除小分子杂质，超滤截留液经冷冻干燥，制得O-HTCC。
根据本发明进一步优选的，所述步骤①中，pH调节剂为质量浓度为10％的NaOH溶液，所述步骤③中，超滤仪为Millipore Labscale超滤仪。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的6-O季铵化壳聚糖溶液中季铵化壳聚糖的浓度为1～5mg/ml。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的超氧化物歧化酶与6-O季铵化壳聚糖质量比为1：(0.5～10)。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的分离纯化为采用DEAE弱阴离子交换柱层析纯化。
一种6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法，步骤如下：
(1)将超氧化物歧化酶(SOD)50mg溶于50ml浓度为10mM、pH 6.0的PBS缓冲液中，制得超氧化物歧化酶溶液，超氧化物歧化酶的浓度为1.0mg/ml(0.03125μmol/ml)；再加入50mgEDC和10mg NHS，温室下震荡反应30min，制得反应液A；
(2)称取6-O-季铵化壳聚糖(O-HTCC)50mg溶于25ml浓度为10mM、pH 6.0的PBS缓冲液中，制得6-O-季铵化壳聚糖溶液，O-HTCC的浓度为2.0mg/ml，然后加入步骤(1)制得的反应液A，震荡反应6h，经2.6×40cm的DEAE Sepharose Fast Flow树脂进行分离纯化，用pH 8.0、浓度10mmol/L～100mmol/L磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，流速1.5ml/min，检测波长254nm，收集各洗脱组分，制得6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物。
以上制备方法中没有特别说明的均按照现有技术。
有益效果
1、本发明所述的6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物(O-HTCC-SOD)与天然SOD相比，保留了SOD分解超氧阴离子的活性，整合了O-HTCC的良好特性，使其具有稳定性高、半衰期长、免原性低的特性，具有更好的使用效果和应用范围。与TMC相比，O-HTCC对SOD的修饰率更高，修饰产物活性保持率更高。
2、本发明所述的制备方法较传统修饰方法，可以提高O-HTCC对SOD的修饰率，制得的产物活性保持率更高，且工艺简单，便于工业化生产应用。
附图说明
图1是实施例2制得的6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物的SDS-PAGE电泳鉴定结果；
其中，泳道1、蛋白质Marker；泳道2、天然SOD；泳道3、O-HTCC；泳道4、DEAE洗脱峰1；5、DEAE洗脱峰2。
图2是O-HTCC-SOD修饰物与天然SOD的园二色谱对比图；
横坐标为波长，单位nm；纵坐标为圆二色谱，单位mdeg。
具体实施方式
为了更好地说明本发明的内容，下面将描述本发明的几个实施例，但这些实施例绝不是对本发明的任何限制。
原料来源
壳聚糖，普通市售产品，粘均分子量10k～100kDa；
超氧化物歧化酶，普通市售产品。
实施例1
6-O-季铵化壳聚糖(O-HTCC)的制备，步骤如下：
①取3g壳聚糖溶于100ml质量浓度为10％的醋酸水溶液中，40℃搅拌30min，充分溶胀，加入苯甲醛15.8g，继续搅拌反应1h，制得乳白色反应液，于60℃真空干燥12h，用质量浓度为10％的NaOH溶液调节pH至中性，过滤，收集沉淀，用甲醇洗涤3次，烘干，制得反应物A；
②将步骤①制得的反应物A研磨后，置于圆底烧瓶中，加入50ml异丙醇，搅拌30min后，逐滴加入9g 2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)，70℃水浴回流搅拌16h，反应液过滤，得到的固体用甲醇洗涤，真空干燥，制得反应物B；
③将步骤②制得的反应物B研磨后，置于圆底烧瓶中，加50ml 0.25mol/L的盐酸乙醇溶液，室温下搅拌反应24h，蒸发去除大部分溶剂，再加入15ml水，溶解后，加入过量丙酮，沉淀过夜，经离心，收集沉淀，干燥，制得O-HTCC粗品，然后溶于水中，采用滤膜截留分子量为10kD的Millipore Labscale超滤仪超滤去除小分子杂质，超滤截留液经冷冻干燥，制得O-HTCC。
经检测，自由氨基含量为73.4％
实施例2
一种6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法，制备步骤如下：
(1)将超氧化物歧化酶(SOD)溶于50ml浓度10mM、pH 6.0的PBS缓冲液中，制得超氧化物歧化酶溶液，超氧化物歧化酶的浓度为1.0mg/ml(0.03125μmol/ml)；再加入50mg EDC和10mg NHS，温室下震荡反应30min，制得反应液A；
(2)称取实施例1制得的季铵化壳聚糖(O-HTCC)100mg溶于50ml浓度为10mM、pH6.0的PBS缓冲液中，制得壳聚糖溶液，O-HTCC的浓度为2.0mg/ml，然后加入步骤(1)制得的反应液A，震荡反应6h，经2.6×40cm的DEAE Sepharose Fast Flow树脂进行分离纯化，用pH 8.0、浓度10mmol/L～100mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 8.0)进行梯度洗脱，流速1.5ml/min，检测波长254nm，收集各洗脱组分，制得6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物。
采用SDS-PAGE电泳鉴定，结果如图1所示，结果表明绝大部分SOD均通过-CO-NH-被O-HTCC修饰，SOD分子的修饰率约90％，结构式如下：
(SOD)n-CO-NH-O-HTCC；
式中，n＝1～10；SOD的分子量为32000Da；O-HTCC的分子量为2000Da以上。
实施例3
一种6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法，制备步骤如下：
(1)将超氧化物歧化酶(SOD)溶于50ml浓度10mM、pH 6.0的PBS缓冲液中，制得超氧化物歧化酶溶液，超氧化物歧化酶的浓度为1.0mg/ml(0.03125μmol/ml)；再加入30mg EDC和10mg NHS，温室下震荡反应30min，制得反应液A；
(2)称取实施例1制得的季铵化壳聚糖(O-HTCC)50mg溶于25ml浓度为10mM、pH 6.0的PBS缓冲液中，制得壳聚糖溶液，O-HTCC的浓度为2.0mg/ml，然后加入步骤(1)制得的反应液A，震荡反应6h，经2.6×40cm的DEAE Sepharose Fast Flow树脂进行分离纯化，用pH8.0、浓度10mmol/L～100mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 8.0)进行梯度洗脱，流速1.5ml/min，检测波长254nm，收集各洗脱组分，制得6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物。
采用SDS-PAGE电泳鉴定，表明绝大部分SOD均通过酰胺键被O-HTCC修饰，SOD分子的修饰率大于90％。
实施例4
一种6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法，制备步骤如下：
(1)将超氧化物歧化酶(SOD)溶于50ml浓度10mM、pH 6.0的PBS缓冲液中，制得超氧化物歧化酶溶液，超氧化物歧化酶的浓度为1.0mg/ml(0.03125μmol/ml)；再加入10mg EDC和10mg NHS，温室下震荡反应30min，制得反应液A；
(2)称取实施例1制得的季铵化壳聚糖(O-HTCC)30mg溶于15ml浓度为10mM、pH 6.0的PBS缓冲液中，制得壳聚糖溶液，O-HTCC的浓度为2.0mg/ml，然后加入步骤(1)制得的反应液A，震荡反应6h，经2.6×40cm的DEAE Sepharose Fast Flow树脂进行分离纯化，用pH8.0、浓度10mmol/L～100mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 8.0)进行梯度洗脱，流速1.5ml/min，检测波长254nm，收集各洗脱组分，制得6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物。
采用SDS-PAGE电泳鉴定，表明绝大部分SOD均通过酰胺键被O-HTCC修饰，SOD分子的修饰率大于70％。
对比例
采用现有的EDC缩合法制备N，N，N-三甲基季铵化壳聚糖(TMC)-超氧化物歧化酶修饰物。
称取自由氨基率为32.2％的TMC 200mg、SOD 40mg，分别溶于pH7.4的0.1mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液10ml中，将TMC溶液缓慢加入到SOD溶液中，在25℃缓慢搅拌，于30min分别加入EDC·HCl 48mg，4℃暗处反应过夜，4℃透析，DEAE Sepharose FF纯化。
电泳鉴定表明SOD分子的修饰率仅为30％。
试验例
O-HTCC-SOD修饰物与天然SOD性能比较
活性测定采用国际通用的″连苯三酚自氧化法，实验过程如下：
向多个试管中加入pH8.2、50mmol/L Tris-HCl缓冲液，并在25℃水浴20min，然后分别向各试管中加入25℃的50mmol/L的连苯三酚，在对照管加入等量10mmol/L的HCl。混匀后，迅速进行紫外分光光度检测，在反应前4min，每隔30s读一次A325nm数值，调整连苯三酚加入量将其自氧化速度控制为0.07A/min左右。
样品酶活测定时，先在各盛有缓冲液的试管内加入预热至25℃的样品溶液，然后按上述方法操作。通过调整样品加入量将连苯三酚自氧化速度控制在30％～70％之间，将最终测得的数据代入下列公式计算酶活性：
酶活单位定义：在25℃1ml反应液中每1min抑制连苯三酚自氧化速率为50％时的酶量为一个酶活性单位。
取适量SOD、实施例2制得的O-HTCC-SOD样品溶于磷酸盐缓冲液，配成0.1mg/ml溶液。于圆二色谱仪扫描采集190～250nm范围内样品谱，所用石英样品池的光程为0.1cm，灵敏度为2mdeg/cm，扫描时间0.5s，扫描速度3.3nm/s，分辨率为0.1nm。测定在室温下进行，所有圆二色谱数据经4次扫描取平均值。所得CD谱用DP-500N数据处理软件计算二级结构含量。
合成的O-HTCC-SOD修饰物与天然SOD的园二色谱图对比如图2，用软件处理得到的二级结构对比数据如表1。
表1是SOD与O-HTCC-SOD的二级结构数据
经对比发现，与天然的SOD相比，SOD经O-HTCC通过酰胺键修饰后，其中的β-折叠(主要是反平行式)、β转角变化较小，而由于β构象(β-折叠和β转角)为SOD表现酶活的优势构象，提示O-HTCC修饰对SOD的活性影响较小，这与对酶活测定结果相一致。另一方面，SOD被O-HTCC修饰后，α-螺旋显著增加，由14.71％增加到35.10％，无规则卷曲明显减少，由31.81％减少到12.50％，提示O-HTCC-SOD结合物的氨基酸在空间上的排布更加有序。

Claims (10)

1.一种6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物，由超氧化物歧化酶分子上的羧基与季铵化壳聚糖分子的氨基通过酰胺键结合，结构式如下：
(SOD)n-CO-NH-O-HTCC；
式中，n＝1～10；SOD的分子量为32000Da；O-HTCC的分子量为2000Da以上，自由氨基摩尔含量为不小于20％。
2.如权利要求1所述的6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物，其特征在于，所述n＝1～6；O-HTCC的分子量为5000Da～100000Da，自由氨基摩尔含量为不小于50％。
3.一种6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将超氧化物歧化酶溶于10mM pH 6.0的PBS缓冲液，制得超氧化物歧化酶溶液，加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，使超氧化物歧化酶与碳二亚胺的摩尔比为1∶(1～200)，超氧化物歧化酶与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(1～100)，反应20～40min，制得反应液A；
(2)取6-O-季铵化壳聚糖溶于10mM pH 6.0的PBS缓冲液，制得季铵化壳聚糖溶液，然后加入步骤(1)制得的反应液A，使超氧化物歧化酶与6-O-季铵化壳聚糖的质量比为1：(0.1～50)，反应5～7h，经分离纯化，制得6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的超氧化物歧化酶溶液中超氧化物歧化酶的浓度为0.5～5mg/ml；超氧化物歧化酶与碳二亚胺的摩尔比为1∶(50～150)，超氧化物歧化酶与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(10～50)。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，反应条件为室温条件下100～600r/min搅拌反应25～35min；所述步骤(2)中，反应条件为室温条件下100～600r/min搅拌反应5～7h。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的6-O-季铵化壳聚糖的制备方法如下：
①取3g壳聚糖溶于100ml质量浓度为10％的醋酸水溶液中，40℃搅拌30min，充分溶胀，加入苯甲醛15.8g，继续搅拌反应1h，制得乳白色反应液，于60℃真空干燥12h，调节pH至中性，过滤，收集沉淀，用甲醇洗涤，烘干，制得反应物A；
②将步骤①制得的反应物A研磨后，置于圆底烧瓶中，加入50ml异丙醇，搅拌30min后，逐滴加入9g 2,3-环氧丙基三甲基氯化铵，70℃水浴回流搅拌16h，反应液过滤，得到的固体用甲醇洗涤，真空干燥，制得反应物B；
③将步骤②制得的反应物B研磨后，置于圆底烧瓶中，加50ml 0.25mol/L的盐酸乙醇溶液，室温下搅拌反应24h，蒸发去除大部分溶剂，再加入15ml水，溶解后，加入过量丙酮，沉淀过夜，经离心，收集沉淀，干燥，制得O-HTCC粗品，然后溶于水中，采用滤膜截留分子量为10kD超滤仪超滤去除小分子杂质，超滤截留液经冷冻干燥，制得O-HTCC。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤①中，pH调节剂为质量浓度为10％的NaOH溶液；所述步骤③中，超滤仪为Millipore Labscale超滤仪。
8.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的6-O季铵化壳聚糖溶液中季铵化壳聚糖的浓度为1～5mg/ml；优选的，所述步骤(2)中的超氧化物歧化酶与6-O季铵化壳聚糖质量比为1：(0.5～10)。
9.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的分离纯化为采用DEAE弱阴离子交换柱层析纯化。
10.一种6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将超氧化物歧化酶50mg溶于50ml浓度为10mM、pH 6.0的PBS缓冲液中，制得超氧化物歧化酶溶液；再加入50mg EDC和10mg NHS，温室下震荡反应30min，制得反应液A；
(2)称取6-O-季铵化壳聚糖50mg溶于25ml浓度为10mM、pH 6.0的PBS缓冲液中，制得6-O-季铵化壳聚糖溶液，然后加入步骤(1)制得的反应液A，震荡反应6h，经2.6×40cm的DEAE Sepharose Fast Flow树脂进行分离纯化，用pH 8.0、浓度10mmol/L～100mmol/L磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，流速1.5ml/min，检测波长254nm，收集各洗脱组分，制得6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物。
CN201410610157.6A 2014-11-03 2014-11-03 一种6-o-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物及其制备 Pending CN104357433A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410610157.6A CN104357433A (zh) 2014-11-03 2014-11-03 一种6-o-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物及其制备

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410610157.6A CN104357433A (zh) 2014-11-03 2014-11-03 一种6-o-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物及其制备

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104357433A true CN104357433A (zh) 2015-02-18

Family

ID=52524744

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410610157.6A Pending CN104357433A (zh) 2014-11-03 2014-11-03 一种6-o-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物及其制备

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104357433A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105669857A (zh) * 2016-03-14 2016-06-15 山东大学 一种es-2肽的季铵化壳寡糖修饰物及其制备方法与应用
CN118389459A (zh) * 2024-04-23 2024-07-26 四平华科生物技术有限责任公司 一种二次修饰的sod及其制备方法和在治疗骨关节炎、类风湿关节炎产品中的应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101837149A (zh) * 2010-06-18 2010-09-22 华中科技大学 一种抗凝血抗菌生物医用材料及其制备方法
CN102168077A (zh) * 2011-01-01 2011-08-31 刘金锋 半乳糖化季铵化壳聚糖的超氧化物歧化酶结合物及其制备
CN102803297A (zh) * 2009-06-16 2012-11-28 菲迪雅制药股份公司 糖胺聚糖类(gag)与生物活性分子的缀合物的合成方法、聚合缀合物及其相关用途
CN103169957A (zh) * 2011-12-22 2013-06-26 国家纳米科学中心 一种纳米凝血酶及其制备方法
CN103555703A (zh) * 2013-11-04 2014-02-05 山东大学 一种季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物及其制备
CN103977447A (zh) * 2014-05-30 2014-08-13 天津爱若莉生物科技有限公司 负载SOD的γ-聚谷氨酸水凝胶制备方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102803297A (zh) * 2009-06-16 2012-11-28 菲迪雅制药股份公司 糖胺聚糖类(gag)与生物活性分子的缀合物的合成方法、聚合缀合物及其相关用途
CN101837149A (zh) * 2010-06-18 2010-09-22 华中科技大学 一种抗凝血抗菌生物医用材料及其制备方法
CN102168077A (zh) * 2011-01-01 2011-08-31 刘金锋 半乳糖化季铵化壳聚糖的超氧化物歧化酶结合物及其制备
CN103169957A (zh) * 2011-12-22 2013-06-26 国家纳米科学中心 一种纳米凝血酶及其制备方法
CN103555703A (zh) * 2013-11-04 2014-02-05 山东大学 一种季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物及其制备
CN103977447A (zh) * 2014-05-30 2014-08-13 天津爱若莉生物科技有限公司 负载SOD的γ-聚谷氨酸水凝胶制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李玮: "杂环改性 O-季铵化壳聚糖的制备及其抗菌性能研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105669857A (zh) * 2016-03-14 2016-06-15 山东大学 一种es-2肽的季铵化壳寡糖修饰物及其制备方法与应用
CN105669857B (zh) * 2016-03-14 2019-01-18 山东大学 一种es-2肽的季铵化壳寡糖修饰物及其制备方法与应用
CN118389459A (zh) * 2024-04-23 2024-07-26 四平华科生物技术有限责任公司 一种二次修饰的sod及其制备方法和在治疗骨关节炎、类风湿关节炎产品中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103920160B (zh) 环糊精为媒介的石墨烯/透明质酸组装体及其制备方法
Cui et al. Templated assembly of pH‐labile polymer‐drug particles for intracellular drug delivery
Zhang et al. Orthogonal, convergent syntheses of dendrimers based on melamine with one or two unique surface sites for manipulation
Kovacs et al. Dual-surface-modified bacteriophage MS2 as an ideal scaffold for a viral capsid-based drug delivery system
Witus et al. Using synthetically modified proteins to make new materials
Wen et al. Utilizing viral nanoparticle/dendron hybrid conjugates in photodynamic therapy for dual delivery to macrophages and cancer cells
Sandri et al. Insulin-loaded nanoparticles based on N-trimethyl chitosan: in vitro (Caco-2 model) and ex vivo (excised rat jejunum, duodenum, and ileum) evaluation of penetration enhancement properties
US20120283427A1 (en) Cationic dextran polymer derivatives
Kannaiyan et al. pH-dependent encapsulation of pyrene in PPI-core: PAMAM-shell dendrimers
CN107661504B (zh) 一种树枝状大分子修饰的金纳米粒子及其制备方法和应用
CA2484840C (en) Polysaccharide containing phosphorylcholine group and process for producing the same
Anaya‐Plaza et al. Photoantimicrobial biohybrids by supramolecular immobilization of cationic phthalocyanines onto cellulose nanocrystals
Saha et al. Mechanistic Investigation of Inclusion Complexes of a Sulfa Drug with α-and β-Cyclodextrins
CA2869056C (en) Anthocyanidin complex
CN103030813A (zh) 一种壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒转基因载体的制备方法
CN104357433A (zh) 一种6-o-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物及其制备
Zhou et al. Thiolactone-based conjugation assisted magnetic imprinted microspheres for specific capturing target proteins
CN105669857A (zh) 一种es-2肽的季铵化壳寡糖修饰物及其制备方法与应用
CN105905912A (zh) 一种高产量介孔二氧化硅纳米颗粒及叶酸靶向修饰的方法
Cui et al. Synthesis and 188Re radiolabelling of dendrimer polyamide amine (PAMAM) folic acid conjugate
Sonin et al. Silicon-containing nanocarriers for targeted drug delivery: Synthesis, physicochemical properties and acute toxicity
CN102153678B (zh) 一种含叠氮基团的超支化聚(β-环糊精)的制备方法
Battogtokh et al. GRP78‐Targeted HPMA Copolymer‐Photosensitizer Conjugate for Hyperthermia‐Induced Enhanced Uptake and Cytotoxicity in MCF‐7 Breast Cancer Cells
US20080119431A1 (en) Per-6-Guanidino-, Alkylamino-Cyclodextrins, Methods Of Their Synthesis And Their Use For The Compaction Of Dna And Interacellular Delivery
Kador et al. Selective Modification of Chitosan to Enable the Formation of Chitosan‐DNA Condensates by Electron Donator Stabilization

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150218

RJ01 Rejection of invention patent application after publication