CN103977447A - 负载SOD的γ-聚谷氨酸水凝胶制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种负载SOD的γ-聚谷氨酸水凝胶制备方法，该方法采用EDC/NHS活化体系，利用SOD的赖氨酸残基及聚谷氨酸侧链羧基，形成SOD-γ-PGA固定化产物；再利用二胺类交联剂胱胺二盐酸交联上述反应所得的SOD-γ-PGA，形成SOD-γ-PGA凝胶体系；该凝胶体系可应用于创伤敷料或面膜中，发挥其抗氧化损伤作用，有利于皮肤创伤得到快速修复。
Description
技术领域
本发明涉及生物酶在高分子材料上的负载方法，具体说是超氧化物歧化酶（SOD）在γ-聚谷氨酸（γ-PGA）水凝胶上的负载方法。
背景技术
超氧化物歧化酶（SOD）是生物体内清除超氧自由基的主要抗氧化酶，其在生物医药、美容保健等方向都有广泛应用。但直接使用超氧化物歧化酶溶液存在着易失活，作用时间短，脉冲式给药剂量等等问题。其中最急需解决的问题是防止超氧化物歧化酶失活，特别是应用于创伤修复中。正常皮肤pH值中性偏酸，一般为5~6，炎症反应时创面pH值甚至可达4。如果超氧化物歧化酶长期暴露于这种酸性环境中会导致其失活，无法清除自由基。
通过物理包埋方式或其他非化学方式负载超氧化物歧化酶，可以在一定程度上防止其失活。但此类方法一般为非化学键合方式，依靠分子间作用力同SOD结合，稳定性差，难以保证超氧化物歧化酶长期不失活。超氧化物歧化酶通过化学修饰，有可能得到性质更为稳定的产物。但酶的化学修饰，需要考虑反应专一性，试剂毒性及反应条件等；如果处理不当，都会造成反应过程中SOD失活。因此，应选取反应条件温和，反应专一性高，无毒害试剂的反应体系进行SOD化学修饰。
N-（3-二甲基氨丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化体系可以活化羧基形成活化酯，同伯胺类化合物快速生成酰胺。反应条件温和，无需加热，水溶液体系反应即可。作为活化剂的EDC及NHS反应结束后脱去，残留量低。
另一方面，水凝胶或凝胶敷料因其可大量吸收创面分泌物及渗出液，保持创面清洁，减少疤痕形成，阻隔致病菌侵入创面防止感染等优势，在现代创伤外科中有着广泛应用。
发明内容
本发明采用EDC/NHS活化体系，利用SOD的赖氨酸残基及聚谷氨酸侧链羧基，形成SOD-γ-PGA固定化产物；再利用二胺类交联剂胱胺二盐酸交联上述反应所得的SOD-γ-PGA，形成SOD-γ-PGA凝胶体系；将该凝胶体系应用于创伤敷料或面膜中，发挥其抗氧化损伤作用。
负载SOD的γ-聚谷氨酸水凝胶制备方法为：以γ-PGA为投料比例基准，γ-PGA: EDC: NHS: SOD:胱胺二盐酸盐的投料摩尔比例范围为1: 0.25-2: 0.25-2: 0.00005-0.001: 0.05-0.5；将γ-PGA溶于去离子水中，超声溶解；加入EDC冰浴4 ℃反应15 min，之后加入NHS继续冰浴4 ℃反应15 min；向以上活化体系内加入SOD，室温反应2-5 小时，之后4 ℃条件下静置24 小时；然后加入交联剂胱胺二盐酸盐，室温反应1-4 小时，形成凝胶；反应结束后，将反应溶液放入透析袋中，4 ℃在去离子水中透析3-7 天，每12 小时换水一次；所得透析液冷冻干燥后得到负载SOD的γ-聚谷氨酸水凝胶。
本发明的突出优点在于：
选用EDC/NHS活化体系及胱胺交联剂制备SOD-γ-PGA水凝胶，反应条件温和，反应后的SOD活性较好，酶比活力保持率高，分散均匀，生物相容性好，所制得的SOD-γ-PGA水凝胶具有显著的抗氧化活性。另一方面，炎症皮肤创面pH值偏酸，pH下降，这会导致SOD失活。利用胱胺为交联剂得到键合有SOD的γ-PGA水凝胶可提高SOD在酸性环境中的活性保持性能。因为在酸性环境下，凝胶体积收缩，凝胶内聚谷氨酸分子链发生塌缩，包绕SOD，避免其暴露于pH值偏低的酸性环境下失去活性；而且，γ-PGA水凝胶还可以使SOD得到缓慢释放。因此，由该方法制备的SOD-γ-PGA水凝胶在加快皮肤修复方面具有显著的效果。
具体实施例：
实施例1. 负载SOD的γ-聚谷氨酸水凝胶，即SOD-γ-PGA水凝胶的制备
以γ-PGA为投料比例基准，γ-PGA: EDC: NHS: SOD:胱胺二盐酸盐的投料摩尔比为1: 0.5: 0.5: 0.0001: 0.1；将γ-PGA溶于去离子水中，超声溶解；加入EDC冰浴4 ℃反应15 min，之后加入NHS继续冰浴4 ℃反应15 min；向以上活化体系内加入SOD，室温反应3 小时，之后4 ℃条件下静置24 小时；然后加入一定量胱胺二盐酸盐，室温反应3 小时，形成凝胶；反应结束后，将反应溶液放入透析袋中，4 ℃在去离子水中透析6 天，每12 小时换水一次。所得透析液冷冻干燥后得到负载SOD的γ-聚谷氨酸水凝胶。
实施例2. 负载SOD的γ-聚谷氨酸水凝胶，即SOD-γ-PGA水凝胶的制备
以γ-PGA为投料比例基准，γ-PGA: EDC: NHS: SOD:胱胺二盐酸盐的投料摩尔比为1: 0.75: 0.75: 0.0005: 0.075；将γ-PGA溶于去离子水中，超声溶解；加入EDC冰浴4 ℃反应15 min，之后加入NHS继续冰浴4 ℃反应15 min；向以上活化体系内加入SOD，室温反应3 小时，之后4 ℃条件下静置24 小时；然后加入一定量胱胺二盐酸盐，室温反应34小时，形成凝胶；反应结束后，将反应溶液放入透析袋中，4 ℃在去离子水中透析6 天，每12 小时换水一次。所得透析液冷冻干燥后得到负载SOD的γ-聚谷氨酸水凝胶。
Claims (1)
1.负载SOD的γ-聚谷氨酸水凝胶制备方法，其特征在于：以γ-PGA为投料比例基准，γ-PGA: EDC: NHS: SOD:胱胺二盐酸盐的投料摩尔比例范围为1: 0.25-2: 0.25-2: 0.00005-0.001: 0.05-0.5；将γ-PGA溶于去离子水中，超声溶解；加入EDC冰浴4 ℃反应15 min，之后加入NHS继续冰浴4 ℃反应15 min；向以上活化体系内加入SOD，室温反应2-5 小时，之后4 ℃条件下静置24 小时；然后加入交联剂胱胺二盐酸盐，室温反应1-4 小时，形成凝胶；反应结束后，将反应溶液放入透析袋中，4 ℃在去离子水中透析3-7 天，每12 小时换水一次；所得透析液冷冻干燥后得到负载SOD的γ-聚谷氨酸水凝胶。
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2014
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