ES2599032T3

ES2599032T3 - Método de tratamiento y bioensayo que implica el factor de inhibición de la migración de macrófagos (MIF) como factor depresor del miocardio de origen cardiaco

Info

Publication number: ES2599032T3
Application number: ES04782427.1T
Authority: ES
Inventors: Brett Giroir; Monte Willis; Vidal De La Cruz; Thais Sielecki
Original assignee: Baxter Healthcare SA; Baxter International Inc; University of Texas System
Current assignee: Baxter Healthcare SA; Baxter International Inc; University of Texas System
Priority date: 2003-08-29
Filing date: 2004-08-30
Publication date: 2017-01-31
Anticipated expiration: 2024-08-30
Also published as: CN102499984B; HUE029888T2; US20150017179A1; EP3078386A3; AU2004268017A2; CN102499984A; WO2005020919A3; BRPI0413404A; EP1658037B1; US8747843B2; MXPA06001828A; US20080260723A1; JP2007504158A; US20050202010A1; PT1658037T; EP1658037A2; EP3078386A2; CN1972713A; CY1117925T1; JP5905659B2

Abstract

Una composición farmacéutica eficaz para su uso en el tratamiento o la prevención de la disfunción cardiaca asociada con lesión por quemadura en un sujeto que lo necesita, que comprende: una cantidad eficaz de al menos un anticuerpo anti-MIF; y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Description

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FIGURA 3: La presencia de MIF en el corazón, el hígado y el bazo antes y después de la exposición a LPS. El MIF preformado en el corazón, el hígado y el bazo (A, D, G) disminuye 12 h después de la exposición a LPS (B, E y H) y se repone tras 24 h (C, F e I) tal como se demuestra mediante inmunohistoquímica. Ampliación: 100X (riñón, bazo), 400X (corazón).

FIGURA 4: La función cardiaca determinada mediante preparación de Langendorff tras exposición a MIFr en ratones C57BL/6J y ratones C3H/HeJ resistentes a endotoxina demuestra que MIFr media en la disfunción cardiaca en un mecanismo independiente de LPS. Los datos representan el promedio de 7 (C3H/HeJ) a 10 (C57BL/6J) experimentos de Langendorff independientes por grupo. *p<0,05.

FIGURA 5: Evaluación ecocardiográfica de los efectos de la administración de LPS y LPS más anticuerpos anti-MIF sobre la función cardiaca. Ecocardiogramas en modo M representativos en ratones de tipo silvestre en el nivel inicial y 8 h tras la administración de LPS, A y B, respectivamente. C y D muestran, respectivamente, ecocardiogramas representativos en Ratones tratados con LPS más anticuerpos anti-MIF a las 8 y 48 h. Se observa una protección significativa en la función cardiaca (% FS) en ratones expuestos a LPS cuando se administran anticuerpos anti-MIF antes del tratamiento (E). Los datos representan el promedio de 9 ciclos cardiacos de 3 ratones monitorizados en múltiples puntos de tiempo. *p<0,05. FIGURA 6: Modelo de quemadura que demuestra inhibición de MIF con anticuerpo anti-MIF tras la exposición a LPS. Los datos de quemadura demuestran que la inhibición de MIF con el anticuerpo anti-MIF y restablece la función cardiaca tras la quemadura.

FIGURA 7: Una representación gráfica que demuestra la velocidad de liberación de MIF del corazón tras traumatismo térmico. El factor de inhibición de la migración de macrófagos (MIF) se expresa de manera constitutiva en tejido cardiaco y se libera de manera máxima 8 horas tras la lesión por quemadura. Cada punto de datos representa la densidad media en unidades arbitrarias (U.A.)/mm2  EE de 3 experimentos de inmunotransferencia de tipo Western independientes. Debajo del gráfico se muestra una inmunotransferencia de tipo Western representativa. Se emplearon un ANOVA de una vía y un procedimiento de comparación múltiple usando el método de Tukey para determinar la significación estadística en comparación con el grupo control (*p<0,05).

FIGURA 8: Portaobjetos con tinción inmunoquímica que demuestran presencia de MIF en varias muestras de tejido. La parte insertada G-MIF, presente de manera constitutiva en el corazón, el hígado, el bazo, el pulmón y el riñón, se disminuye tras la lesión por quemadura. El MIF preformado en el corazón, el rizón y el bazo (A, E, I) disminuye 8 horas tras la lesión por quemadura (B, F, J), a excepción del hígado (M,N) y aumenta a las 24 horas en el corazón y el riñón (C, G), pero no en el corazón ni en el hígado (K,O) tal como se demuestra mediante inmunohistoquímica. Un control negativo (anticuerpo secundario sin el anticuerpo primario anti-MIF) demuestra de manera sistemática que no está presente tinción de fondo en cada punto de tiempo en cada órgano investigado tal como se representa en la columna más a la derecha (D, H, L, P). Ampliación: 100X (riñón, bazo, hígado), 400X (corazón).

FIGURA 9: Representaciones gráficas del cambio de concentración de tres citocinas diferentes a lo largo del tiempo tras traumatismo térmico. Figura 9 -Concentraciones séricas de MIF (ng/ml), IL-12 (pg/ml) e IL-6 (pg/ml) tras lesión por quemadura (A-C, respectivamente). Los datos se expresan como la media  EE de seis ratones C57BL/6J tal como se determina mediante ELISA y se analizaron estadísticamente usando un ANOVA de una vía con un procedimiento de comparación múltiple empleando el método de Bonferroni para determinar la significación entre grupos (*p<0,05 en comparación con el nivel inicial).

FIGURA 10: Representación gráfica y transferencia de tipo Northern representativa que muestra regulación por incremento de ARNm de MIF tras traumatismo térmico. La lesión por quemadura regula por incremento la expresión de ARNm de MIF en tejido cardiaco significativamente hacia las 8 horas. Se detectaron los ARNm de MIF y -actina usando sondas radiomarcadas con 32P complementarias a los ARNm de MIF y -actina. Cada punto de datos representa la densidad media en unidades arbitrarias (U.A.)/mm2  EE de 3 experimentos de transferencia de tipo Northern independientes. Debajo del gráfico se muestra una transferencia de tipo Northern representativa. Se determinó el MIF normalizado multiplicando la densidad de MIF por la densidad de -actina presente. Se emplearon un ANOVA de una vía y un procedimiento de comparación múltiple usando el método de Tukey para determinar la significación estadística en comparación con el nivel inicial (*p<0,05).

FIGURA 11: Representaciones gráficas de velocidades de flujo coronario calculadas de tres formas diferentes que comparan la medida de control de la velocidad de flujo con traumatismo térmico no tratado frente a traumatismo térmico tratado con anticuerpos anti-MIF. Determinación de la función cardiaca mediante preparación de Langendorff 18 horas tras la lesión por quemadura en función del flujo coronario (A) y Ca2+. La función cardiaca se expresa como la media  EE de 25 experimentos de Langendorff independientes (11 simulados, 9 de lesión por quemadura, 5 de lesión por quemadura tras tratamiento con anticuerpos anti-MIF). Se realizaron análisis independientes para cada LVP, +dP/dtmáx, y -dP/dtmáx en función del grupo de tratamiento y la velocidad de flujo coronario usando un ANOVA de mediciones repetidas y un procedimiento de comparación múltiple empleando el método de Bonferroni para determinar diferencias significativas entre grupos (*p<0,05).

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FIGURA 12: Representación gráfica y ecocardiográfica de los efectos de terapia con anticuerpos anti-MIF tras la lesión por quemadura que demuestra los efectos cardioprotectores del bloqueo de MIF. La evaluación ecocardiográfica de los efectos de terapia con anticuerpos anti-MIF tras la lesión por quemadura demuestra los efectos cardioprotectores del bloqueo de MIF. Ecocardiogramas en modo M representativos en ratones de tipo silvestre en el nivel inicial y 8 horas tras la lesión por quemadura, A y B, respectivamente. C y D representan ecocardiogramas representativos en lesión por quemadura más ratones tratados con anticuerpos anti-MIF a las 4 y las 48 horas, respectivamente. Se observa una recuperación significativa de la función cardiaca (% FS) en ratones con lesión por quemadura a los que se habían administrado anticuerpos anti-MIF antes de la lesión por quemadura (E). Los datos de cada grupo representan la media  EE de 9 ciclos cardiacos de 3 ratones monitorizados en múltiples puntos de tiempo. La función cardiaca determinada mediante ecocardiografía se expresa como % de acortamiento fraccional (LVEDLVES/ LVED x 100)  EE y se analizó usando un ANOVA de mediciones repetidas de una vía y un procedimiento de comparación múltiple empleando la prueba de Tukey para determinar diferencias significativas entre grupos específicos.

FIGURA 13: Concentración sérica de MIF (veces de aumento desde el nivel inicial) tras una exposición a 4 mg/kg de endotoxinas en: (A) ratones de tipo silvestre, (B) ratones TNFR-/-y (C) ratones de tipo silvestre tratados previamente (60 minutos) con Enbrel®. Los datos se expresan como fracción de los niveles iniciales de MIF (media +/-error estándar) de: (A) 6 ratones C57BL/6J, (B) 6 ratones TNFR-/-y (C) 3 ratones C57BL/6J (C) tratados previamente con Enbrel®. Se determinaron los niveles séricos mediante ELISA y se analizaron estadísticamente usando un ANOVA de una vía con un procedimiento de comparación múltiple empleando el método de Bonferroni para determinar la significación entre grupos (*p<0,05 en comparación con el nivel inicial).

FIGURA 14: No se detecta liberación de proteína MIF tras la exposición a LPS en tejido cardiaco. Cada punto de datos es la media (+/-error estándar) de 3 experimentos de inmunotransferencia de tipo Western independientes. Debajo del gráfico se muestra una inmunotransferencia de tipo Western representativa. *p<0,05.

FIGURA 15: La presencia de MIF en el corazón, el hígado y el bazo antes y después de la exposición a LPS en ratones TNFR-/-. El MIF preformado en el corazón, el hígado y el bazo (A, D, G) no disminuye 12 horas después de la exposición a LPS (B, F, J) lo que se observa en ratones de tipo silvestre tal como se demuestra mediante inmunohistoquímica. Ampliación: 100X (riñón, bazo), 400X (corazón).

FIGURA 16: La exposición a LPS no regula por incremento el ARNm de MIF en tejido cardiaco en ratones TNFR-/-. Cada punto de datos en el gráfico es la media (+/-error estándar) de 3 experimentos de transferencia de tipo Northern independientes. Debajo del gráfico se muestra una transferencia de tipo Northern representativa. No se identificaron diferencias significativas entre los puntos de tiempo (p>0,05).

FIGURA 17: La función cardiaca determinada mediante preparación de Langendorff tras exposición a MIFr en ratones C57BL/6J, B6/129S y TNFR-/-demuestra que MIFr media en la disfunción cardiaca independiente de la señalización de TNF- ex vivo. Los datos representan el promedio de 6 (C57BL/6J), 4 (B6/129S) y 4 (TNFR-/-) experimentos de Langendorff independientes por grupo. *p<0,05.

FIGURA 18: Evaluación ecocardiográfica de los efectos de la administración de LPS y LPS más anticuerpos anti-MIF sobre la función cardiaca en ratones TNFR-/-. Ecocardiogramas en modo M representativos en ratones de tipo silvestre en el nivel inicial y 4 h tras la administración de LPS, A y B, respectivamente. C y D muestran, respectivamente, ecocardiogramas representativos en ratones tratados con LPS más anticuerpos anti-MIF a las 4 y las 48 horas. Se observa una protección significativa en la función cardiaca (% FS) en ratones expuestos a LPS cuando se administran anticuerpos anti-MIF antes del tratamiento (E). Los datos representan el promedio de 9 ciclos cardiacos de 3 ratones monitorizados en múltiples puntos de tiempo. *p<0,05.

FIGURA 19: Determinación de citocinas séricas en ratones de tipo silvestre y TNFR-/-después de la exposición a LPS. Se sometió a ensayo un panel de citocinas inflamatorias en la plataforma Luminex para: (A) TNF-, (B) IL-1,

(C) IFN-, (D) IL-12, (E) IL-10, (F) IL-6, (G) GM-CSF, e IL-2, IL-4, IL-5 (datos no mostrados). Los datos se expresan como la media +/-error estándar de concentraciones séricas de citocina de 3 ratones experimentales independientes en cada punto de tiempo.

FIGURA 20: Determinación de citocinas séricas en tipo natural tras la exposición a LPS con o sin pretratamiento con anticuerpos anti-MIF (90 minutos). Se muestran las citocinas moduladas: (A) IFN- y (B) IL-10 tal como se someten a ensayo en la plataforma Luminex. Los datos se expresan como la media +/-error estándar de concentraciones séricas de citocina de 3 ratones experimentales independientes en cada punto de tiempo.

FIGURA 21: Compara la función cardiaca (acortamiento fraccional) tras ligadura de LAD con LAD solo y anticuerpos anti-MIF + LAD.

FIGURA 22: Muestra el efecto de la terapia con anticuerpos anti-MIF antes de LAD con LAD solo y anticuerpos anti-MIF + LAD.

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Una realización preferida de la divulgación se refiere al descubrimiento del TNF- como mediador anterior de MIF.

Una realización preferida de la divulgación se refiere a la observación de que CD74 (un receptor de MIF) se expresa en cardiomiocitos y es un mediador “crítico” de la disfunción cardiaca.

Una realización preferida de la divulgación se refiere a la inhibición de MIF y a la mejora de la cardioprotección mediante la inhibición del receptor de CD74 con uno o más anticuerpos neutralizantes monoclonales anti-CD74.

Un objeto preferido de la divulgación se refiere a un método para tratar y/o prevenir la disfunción cardiaca, tal como una irregularidad o depresión en la actividad miocárdica. El método incluye preferiblemente administrar una cantidad eficaz de una composición que comprende un inhibidor del factor de inhibición de la migración de macrófagos (MIF). El inhibidor puede ser un anticuerpo. El inhibidor puede afectar a una actividad de MIF particular incluyendo una actividad enzimática, tal como actividad tautomerasa o actividad oxidorreductasa.

Una realización preferida de la divulgación se refiere a un ensayo para identificar agentes que inhiben la actividad de MIF. El ensayo preferiblemente implica tanto un miocito, ya sea in vitro o in vivo, como MIF en presencia y en ausencia de un agente que puede inhibir la actividad de MIF. El ensayo analiza la actividad del miocito, por ejemplo, usando herramientas tales como inmunoquímica o ecocardiografía, basándose en la presencia de MIF y un inhibidor potencial.

Una realización preferida de la divulgación se refiere a un método de uso de este ensayo para identificar un agente que inhibe la actividad de MIF que comprende colocar un miocito y MIF en presencia de un agente que puede inhibir la actividad de MIF y determinar el efecto sobre la actividad del miocito. El miocito puede estar in vitro o in vivo y el efecto puede medirse utilizando inmunoquímica o ecocardiografía.

Los presentes inventores han encontrado que MIF es un agente inductor de la disfunción miocárdica, que se sabe que contribuye significativamente a la morbimortalidad de la septicemia en seres humanos. Tanto en pacientes humanos como en modelos animales, la disfunción cardiaca asociada con septicemia se caracteriza por dilatación biventricular, contractilidad sistólica disminuida y relajación diastólica disminuida. Aunque no se desea restringirse a la teoría, se cree que su patogénesis es multifactorial, con citocinas de origen miocárdico tales como factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-) implicadas en la inducción de su comienzo.

Una realización de la presente solicitud se refiere a identificar si el MIF u otras proteínas de origen cardiaco median, mediante mecanismos paracrinos o autocrinos, la disfunción miocárdica en la septicemia y otras enfermedades cardiacas. El análisis de microalineamiento de detección de la expresión de genes cardiacos en ratones sugiere que el MIF se expresa en el corazón, y se regula de manera diferencial tras la exposición a lipopolisacáridos (LPS). Dados los datos de que la inhibición de MIF mejora el desenlace en animales con septicemia experimental, se idearon los ejemplos siguientes para verificar si los cardiomiocitos expresaban el MIF in vivo, si su expresión resultaba alterada por la exposición a endotoxinas y que el MIF tenía un efecto fisiológicamente importante sobre la función cardiaca. Varios de los ejemplos en el presente documento demuestran la expresión cardiaca de MIF in vivo, y determinan que MIF reduce la función cardiaca en una exposición a endotoxinas subletal in vivo.

El MIF se expresa de manera constitutiva en el miocardio normal, y se libera por los cardiomiocitos tras la exposición a endotoxinas, alcanzando los niveles de tejido cardiaco un nadir 12 horas tras la exposición. Se observan pruebas que respaldan una liberación retardada en la presente solicitud mediante inmunotransferencia de tipo Western e inmunohistoquímica que demuestran liberación significativa a las 12 h de tejido cardiaco y de bazo, y están respaldadas indirectamente por el comienzo retardado de la protección cardiaca que comienza a las ocho horas, y que continúa después. El tratamiento de ratones expuestos a LPS con anticuerpos monoclonales anti-MIF mejora significativamente la función cardiaca in vivo tal como se pone de manifiesto por la mejora en la fracción de acortamiento del ventrículo izquierdo.

Para demostrar adicionalmente los efectos depresores del miocardio de MIF, se perfundieron corazones con latido de ratón (perfusión de Langendorff) con una disolución que contenía una concentración de MIF recombinante (MIFr). La perfusión con MIFr da como resultado reducción significativa del rendimiento tanto sistólico como diastólico. Los presentes inventores han demostrado que el MIF se sintetiza por los cardiomiocitos in vivo, y se libera tras la exposición a LPS. Por tanto el MIF media directamente en la disfunción cardiaca y se demuestra que el MIF es una diana farmacológica para la mejora de la función cardiaca en septicemia y otras enfermedades cardiacas.

Los datos de microalineamiento sobre la expresión de genes cardiacos subrayan que el MIF también se expresa en tejido cardiaco. Varios ejemplos en el presente documento indican que la perfusión de MIF reduce directamente la función cardiaca in vitro; y además, el tratamiento con cualquiera de dos anticuerpos monoclonales independientes dirigidos contra el MIF mitiga la depresión miocárdica tardía.

La invención se refiere a una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento y/o la prevención de la disfunción cardiaca asociada con quemadura, tal como una irregularidad o depresión en la actividad miocárdica. La composición comprende un inhibidor del factor de inhibición de la migración de macrófagos (MIF). El inhibidor puede

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inhibir la actividad de MIF y/o la producción de MIF. El inhibidor es un anticuerpo. El inhibidor puede afectar a una actividad particular de MIF incluyendo una actividad enzimática, tal como actividad tautomerasa o actividad oxidorreductasa. El inhibidor puede inhibir o bloquear la actividad de MIF o la producción de MIF en tejido miocárdico. El inhibidor también puede inhibir o impedir la liberación de MIF, tal como inhibidores del transportador ABC.

Otra realización preferida de la divulgación se refiere a un ensayo para identificar agentes que inhiben la actividad o la producción de MIF. El ensayo implicaría un miocito, ya sea in vitro o in vivo, y posiblemente MIF en presencia y en ausencia de un agente que inhibe la actividad de MIF o la producción de MIF. El ensayo analizaría la actividad del miocito, usando herramientas tales como inmunoquímica o ecocardiografía, basándose en la presencia de MIF y un inhibidor potencial.

Una realización de la invención utiliza el papel de MIF en la disfunción cardiaca asociada con quemadura para su uso en métodos de prevención/tratamiento. Usando un modelo murino de lesión por quemadura (TBSA del 40 %), los presentes inventores identificaron que el MIF cardiaco constitutivo disminuía significativamente (2,1 veces) 8 horas tras la lesión por quemadura tal como se determina mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western. El MIF sérico fue máximo a las 4 horas tras la lesión por quemadura (aumento de 2,2 veces). Estos patrones concuerdan con la liberación de MIF de reservas citoplasmáticas de origen cardiaco y sistémico tras la lesión por quemadura. Tal como se observa en los ejemplos en el presente documento, para determinar el efecto de MIF en la disfunción cardiaca observada tras la lesión por quemadura, se trataron ratones tratados previamente con anticuerpos monoclonales neutralizantes anti-MIF. Comenzando a las 4 horas tras la lesión por quemadura (y continuando hasta las 48 horas) únicamente los ratones con lesión por quemadura demostraron un porcentaje de acortamiento fraccional (% FS) del ventrículo izquierdo deprimido del 38,6+/-1,8 % (% FS simulado 56,0 +/-2,6 %). Los ratones tratados con anticuerpo anti-MIF demostraron una función cardiaca mejorada retardada tras la lesión por quemadura, con recuperación completa de la función hacia las 24 horas. Esto demuestra que la citocina MIF media en la disfunción cardiaca asociada tardía con lesión por quemadura, y también demuestra que MIF es una diana farmacológica para el tratamiento de la disfunción cardiaca asociada con quemadura así como otras complicaciones mediadas por MIF tales como SDRA asociada con lesión por quemadura.

Tras la lesión por quemadura, se libera MIF de manera máxima en el suero hacia las 4 horas (figura 9); la liberación del tejido se produce al máximo hacia las 8 horas (corazón y bazo) (figuras 7 y 8). Cuando MIF se neutraliza por anticuerpos, la función cardiaca mejora significativamente hacia las 12 horas y completamente hacia las 24 horas, lo que demuestra la modulación de MIF como mediador de la disfunción cardiaca in vivo tras la lesión por quemadura (figura 12).

En un modelo de ratón de lesión por quemadura, se ha demostrado que los LPS median en la disfunción cardiaca asociada a través de su interacción con Tlr-4 (receptor 4 de tipo toll) y su interacción con IRAK-1. Se cree que la fuente de LPS se deriva del intestino debido a varios ataques potenciales asociados con la lesión por quemadura. Estos incluyen isquemia intestinal, translocación bacteriana y permeabilidad intestinal aumentada. Aunque no se desea restringirse a la teoría, se cree que la producción y la liberación de factores inflamatorios se vuelven sistémicas a través de tejidos linfoides asociados con el intestino.

En un modelo de endotoxicosis subletal en ratones (4 mg/kg de LPS), se observa que MIF medió en efectos depresores cardiacos tardíos in vivo. También se determina que MIF recombinante induce una depresión cardiaca inmediata ex vivo mediante en ensayo de Langendorff de una manera independiente de LPS. Con respecto a la lesión por quemadura, una realización de la presente invención tiene de manera adecuada varias ventajas en comparación con las observaciones realizadas en un modelo de endotoxicosis. En primer lugar, se libera MIF en un punto de tiempo anterior en el modelo de quemadura (4 horas, figura 7) en comparación con la exposición a LPS (8 horas) y este aumento en las concentraciones sistémicas de MIF es significativamente superior (aumento de 2,2 veces (figura 9) frente a 1,5 veces). En segundo lugar, el grado de la disfunción cardiaca no es tan grande en el modelo de lesión por quemadura en comparación con el modelo de endotoxicosis tal como se mide mediante ecocardiografía. Con respecto a la lesión por quemadura, los presentes inventores permiten de manera deseable que disminuya el porcentaje de acortamiento fraccional (una estimación del gasto cardiaco) en el 38 % con respecto al nivel inicial hacia las cuatro horas (% FS del 56,2 -(% FS del 34,8/(% FS del 56,2) en comparación con 53,7 % en el modelo de endotoxicosis (% FS del 67,2 -FS % del 31,1/(% FS del 67,2) a las cuatro horas. La inhibición de MIF según una realización de la presente invención da como resultado la protección cardiaca completa hacia las 24 horas (figura 12), lo que no se producía hasta las 48 horas en el modelo de endotoxicosis, aunque se observó primero protección significativa hacia las 8 horas en el modelo de endotoxicosis, y no hasta las 12 horas en el modelo de lesión por quemadura. Esto demuestra que MIF desempeña un papel superior en la disfunción cardiaca asociada con lesión por quemadura. Finalmente, se determinó que el aumento en los niveles cardiacos de ARNm de MIF estaba aumentado significativamente hacia las 8 horas en la lesión por quemadura (figura 10) y que no aumentaba hasta las 48 horas en el modelo de endotoxicosis. Aunque se ha demostrado que los efectos cardiacos de la lesión por quemadura están relacionados con los LPS derivados del intestino, el ataque efectivo es más complejo que el modelo de endotoxicosis porque implica la piel así como el intestino y es un proceso de enfermedad más relevante fisiológicamente.

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MIF una diana potencial para enfermedades tales como lesión por quemadura asociada morbimortalidad en relación con sus efectos cardiopulmonares.

Los presentes inventores han encontrado que la liberación MIF del corazón, el hígado y el bazo depende de la señalización del receptor de TNF I/II tras la exposición a LPS. Adicionalmente, los presentes inventores identifican la liberación al suero de MIF independiente de la señalización del receptor de TNF I/II. Sin la señalización de receptor de TNF, los niveles de MIF parecen ligeramente retardados (12-24 horas en comparación con 8 horas en el tipo natural) y ligeramente aumentados (1,7-2,3 veces con respecto al nivel inicial en comparación con un aumento de 1,5 en ratones de tipo silvestre). Además, la liberación de MIF independiente del receptor de TNF en ratones deficientes en el receptor de TNF I/II (TNFR-/-) es suficiente para mediar en la disfunción cardiaca hacia al menos 24 horas después de la exposición a LPS pese a la falta de liberación de MIF de tejidos que se han identificado previamente en ratones de tipo silvestre. La disfunción cardiaca temprana se identificó en los ratones TNFR-/-y, sin desear restringirse a la teoría, se cree que se debe probablemente a mediadores conocidos que los presentes inventores han identificado que se expresan de manera elevada en este modelo (IL-1, IL-6) además de otros mediadores potenciales (por ejemplo, IL-18 así como otros mediadores). En corazones aislados (preparación de Langendorff), se determinó que MIF inducía una disfunción cardiaca (sistólica y diastólica) inmediata (en el plazo de 20 minutos) directamente en ratones tanto TNFR-/-como de tipo silvestre en el mismo grado. Sin embargo, la disfunción cardiaca inducida por LPS en los ratones TNFR-/-, desapareció completamente hacia las 48 horas con neutralización de MIF con anticuerpos, lo que indica que la liberación de MIF independiente mediada por el receptor de TNF podría inducir una profunda disfunción cardiaca tardía (24 y 48 horas) en un modelo de endotoxicosis.

La citocina MIF se expresa de manera constitutiva en numerosos tipos celulares incluyendo linfocitos, macrófagos y la hipófisis anterior. Muchos tejidos también contienen MIF incluyendo el corazón, pulmón, hígado, glándula suprarrenal, bazo, riñón, piel, músculo, timo, piel y testículos. Recientemente se ha descrito el mecanismo de secreción en monocitos estimulados con LPS. Los inhibidores de la secreción clásica de proteínas tales como la monensina o la brefeldina A no inhiben la secreción de MIF, lo que sugiere una vía de exportación de proteínas no clásica. Cuando se administraron inhibidores de los transportadores ABCA1 (casete de unión a ATP Al) (gliburida y probenicida), no se produjo la secreción de MIF. MIF se ubica predominantemente en el núcleo y el citosol en vesículas pequeñas que se pinchan y se liberan al exterior de las células. Se ha demostrado que esta ruta de secreción no clásica, mediada por vesículas, es un mecanismo de secreción de otros mediadores inflamatorios importantes, tales como HMGB1, que se ha demostrado que desempeña un papel significativo en enfermedades inflamatorias y específicamente en septicemia. En la presente invención se describe por primera vez la dependencia de la secreción de MIF sobre la señalización de TNF- en varios tejidos.

MIF tiene numerosas actividades biológicas incluyendo propiedades antagonistas de glucocorticoides, propiedades catalíticas que se regulan a través del coactivador JAB1/CSN5 y la proteína de la superficie celular CD74/cadena Ii. La secreción específica de MIF resulta tras estímulos inflamatorios tales como endotoxina (LPS) y factor de necrosis tumoral, así como hormonas tales como ACTH y angiotensina II. Además de las células inmunitarias, las células endocrinas y algunas células epiteliales secretan MIF. La secreción se debe a una potenciación de la expresión de MIF y a la síntesis de novo así como a una inducción de la liberación a partir de reservas preexistentes; habiéndose demostrado ambas previamente en el corazón.

Se ha notificado que MIF cardiaca se libera de manera máxima a las 12 horas tras la exposición a LPS en ratones de tipo silvestre. Los niveles séricos de MIF en ratones de tipo silvestre tras la exposición a LPS se liberan de manera máxima a las 8 horas, lo que corresponde a una protección temprana de la disfunción cardiaca. Cuando se inhibe la señalización de TNF- tras la exposición a LPS o bien mediante el pretratamiento con Enbrel® o bien en ratones TNFR-/-, los niveles de MIF llegan a un máximo más tarde y es ligeramente superior, lo que indica que el TNF- tiene cierto control sobre los niveles séricos de MIF, pero no inhibe la liberación de MIF. Cuando se pretrataron ratones de tipo silvestre con anticuerpos neutralizantes anti-MIF y se sometieron a una exposición a LPS (4 mg/kg), se observó una disfunción cardiaca grave inicial a las cuatro horas que fue idéntica a la de ratones a los que se administraron LPS solo. Sin embargo, se observó protección significativa inicial a las 8 horas y mejorada hasta las 48 horas donde la función cardiaca no fue significativamente diferente de la los animales control. Puesto que MIF tenía un efecto cardiaco casi inmediato y directo en corazones de tipo silvestre aislados, se creyó que MIF desempeñaba un papel en la función cardiaca que estaba emparejada con su liberación retardada. Sin embargo, en la presente invención se demuestra que la liberación no cardiaca de MIF también puede tener efectos significativos sobre la función in vivo (24 y 48 horas). Estos efectos se producen posteriormente a los descritos antes (protección inicial a las 8 horas) y de manera paralela hay un retardo en la liberación de MIF sistemáticamente cuando se bloquea la señalización de TNF- (12-24 horas) en comparación con ratones de tipo silvestre (liberación máxima de MIF a las 8 horas).

Se cree que la disfunción cardiaca temprana puede atribuirse a varias citocinas que se ha demostrado que median en la disfunción cardiaca asociada con septicemia (y LPS) tales como TNF-, IL-1 e IL-18. Se ha notificado una discordancia temporal entre los niveles de TNF- en el miocardio y la disfunción contráctil en endotoxemia. Estos hallazgos de la disfunción miocárdica asociada con LPS no se produjeron hasta que los niveles de TNF- volvieron al nivel inicial, lo que contradice otros hallazgos que han notificado protección de la disfunción cardiaca inducida por

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mejora en la función cardiaca es notable y sustancialmente supera al menos las 10 veces en comparación con otras dianas inmunitarias tales como TNF-alfa.

Antes de la presente invención no había tratamientos para el infarto de miocardio que se dirigieran a mediadores químicos/de citocina de la disfunción cardiaca y la lesión aguda de tejido miocárdico. La tecnología actual se dirige a minimizar el infarto mediante terapias tales como TPA. Una vez que se administra TPA o una terapia similar, no hay ninguna terapia farmacológica para prevenir la insuficiencia/choque cardiogénico aparte de los inotropos convencionales (dobutamina) o dispositivos mecánicos (bomba de balón intraaórtica). Las terapias para bloquear MIF están administrándose simultáneamente con TPA o angioplastia de balón para mejorar adicionalmente la función cardiaca tanto a corto plazo como a largo plazo y minimizar potencialmente el tamaño del infarto tal como se contempla en el presente documento.

Una realización de la presente invención resuelve los problemas de la disfunción cardiaca aguda y crónica tras un infarto de miocardio agudo. La presente invención posibilita proporcionar una clase única de terapias porque modula un mediador inmunitario, es decir, MIF. Sin desear restringirse a la teoría, se cree que la presente invención puede disminuir directamente el tamaño del infarto. No existe ninguna terapia equivalente para preservar la función cardiaca a largo plazo. Para la función a corto plazo, la modulación de la actividad de MIF según la presente invención minimizaría la necesidad de bombas de balón intraaórticas y otros dispositivos mecánicos. Se obtienen anticuerpos monoclonales anti-MIF adecuados de Cytokine PharmaScience, Inc., King of Prussia, PA.

Otra realización de la presente divulgación se refiere a la inhibición de CD74 para proteger la disfunción cardiovascular asociada con enfermedades graves tales como septicemia, traumatismo, IM agudo e insuficiencia cardiaca congestiva. Aunque CD74 se ha descrito en células inmunitarias circulantes y células presentadoras de antígeno (en asociación con la clase II del MHC) hasta la presente invención, no se había notificado la presencia de CD74 en el corazón (así como en otros órganos). Y lo que es más importante, no se había demostrado previamente el papel de la función de CD74 sobre la función cardiaca en procesos fisiológicos o de enfermedad. Aunque se ha mostrado que CD74 media la actividad de MIF in vitro, esto no se ha confirmado independientemente y se limita a fibroblastos y leucocitos.

Se dispone de anticuerpos anti-CD74 humano adecuados, por ejemplo, de BD Biosciences (números de catálogo de producto 555538 (clon M-B741; formato purificado; isotipo de ratón IgG2a, ; W.S. n.º V CD74.4; reactividad humana) y 555612 (clon LN2; formato purificado; isotipo de ratón IgG1; ; W.S. n.º V CD74.3; reactividad humana).

La presente invención posibilita usar terapia con anticuerpos anti-citocina (incluyendo anticuerpos anti-MIF) en enfermedades cardiacas. Los experimentos preliminares usando terapia con anticuerpos anti-TNF en modelos de septicemia no funcionaron. Adicionalmente, MIF, la supuesta citocina bloqueada por la inhibición de CD74, es una citocina que se produce posteriormente, y en el modelo de IM agudo está aumentada durante varias semanas tras el ataque, lo que permite la intervención durante cualquier punto de ese tiempo.

La disfunción cardiaca temprana en el IM agudo y en la septicemia explica la alta morbimortalidad asociada con cada una de estas enfermedades. Los presentes inventores contemplan la terapia con citocinas que puede mejorar el rendimiento y disminuir potencialmente la morbididad asociada con cada una.

La mayoría de las intervenciones terapéuticas en la enfermedad cardiaca se han centrado en la reperfusión (IM) o en los inotropos (IM y septicemia). Mediante una realización de la presente invención, la intervención con el receptor de CD74, el supuesto receptor para MIF, puede atenuarse la afectación cardiogénica tanto aguda como crónica y puede mejorar la supervivencia/desenlaces.

Se secreta MIF de los cardiomiocitos tras la exposición a LPS, y media directamente una disfunción cardiaca de comienzo tardío (>6 horas). En células inmunitarias, se determinó que CD74 era el receptor de MIF, que ejerce efectos a través de rutas de señalización intracelulares de ERK1/2. Para determinar si CD74 media en la disfunción cardiaca en septicemia inducida por MIF, los presentes inventores expusieron: 1) ratones de tipo silvestre (C57BL/6) a LPS; 2) ratones de tipo silvestre tratados previamente con anticuerpos monoclonales neutralizantes anti-CD74; y expuestos a LPS y 3) ratones deficientes en CD74 con LPS (4 mg/kg). Se realizó ecocardiografía en serie y se determinó el acortamiento fraccional ((% FS). A las 24 horas, se observó disfunción significativa en ratones WT a los que se había administrado LPS ((% FS=31,6 %±3,3 %) en comparación con los controles ((% FS=58±1 %). Tanto en los ratones tratados con anticuerpos anti-CD74 como en los deficientes para CD74 expuestos a LPS, la función cardiaca mejoró significativamente en comparación con los ratones de tipo silvestre a los que se habían administrado LPS solo ((% FS=49±3,6 % y 53,3±2,4 %, respectivamente, p<0,05). Puesto que nunca se ha documentado la expresión de CD74 en el corazón, los presentes inventores realizaron inmunotransferencias e histoquímica que confirmaron que CD74 está presente de manera constitutiva en las membranas de células cardiacas y en el citosol; y que se regulaba sustancialmente tras la exposición a LPS (casi ausente a las 12 horas >disminución de 4 veces). Los presentes inventores demuestran que CD74 se expresa en cardiomiocitos y es un mediador crítico de la disfunción cardiaca.

Otra realización de la presente divulgación se refiere a la inhibición de actividad de MIF mediante el uso de uno o

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más de receptor de MIF soluble o antagonista del receptor de MIF. Como ejemplo, con las terapias con anticuerpos anti-TNF, son adecuados REMICADE™ o INFLIXIMAB ™ (anticuerpo anti-TNF) y ENBREL™ o ETANERCEPT™ (receptor de TNF soluble). Este método incluye administrar uno o más del receptor de MIF soluble y/o el antagonista del receptor de MIF en una cantidad eficaz para tratar y/o prevenir la disfunción cardiaca en un sujeto que lo 5 necesita, tratar y/o prevenir la irregularidad en la actividad miocárdica en un sujeto que lo necesita, tratar y/o prevenir la depresión en la actividad miocárdica en un sujeto que lo necesita, tratar y/o prevenir la disfunción cardiaca asociada con lesión por quemadura en un sujeto que lo necesita, tratar y/o prevenir la disfunción cardiaca tras infarto de miocardio agudo en un sujeto que lo necesita, tratar y/o prevenir la cardiodepresión en un sujeto que lo necesita,

o una combinación de los mismos a un sujeto que lo necesita.

10 Otra realización de la presente divulgación se refiere al uso de inhibidores de MIF de molécula pequeña (en ocasiones denominados “antagonistas de MIF” o “compuestos de isoxazolina”) en el tratamiento y/o la prevención de la disfunción cardiaca en un sujeto que lo necesita, el tratamiento y/o la prevención de la irregularidad en la actividad miocárdica en un sujeto que lo necesita, el tratamiento y/o la prevención de la depresión en la actividad miocárdica

15 en un sujeto que lo necesita, el tratamiento y/o la prevención de la disfunción cardiaca asociada con lesión por quemadura en un sujeto que lo necesita, el tratamiento y/o la prevención de la disfunción cardiaca tras infarto de miocardio agudo en un sujeto que lo necesita, el tratamiento y/o la prevención de la cardiodepresión en un sujeto que lo necesita, o una combinación de los mismos.

20 En la siguientes fórmulas químicas, el uso del superíndice en un sustituyente es para identificar un nombre de sustituyente (por ejemplo, “R2” se usa para indicar un sustituyente denominado R2), mientras que el uso de un subíndice se usa para enumerar el número de veces que aparece un sustituyente en ese sitio molecular (por ejemplo, “R2” o “(R)2” se usan ambos para indicar dos sustituyentes denominados simplemente “R”).

25 Un inhibidor de MIF de molécula pequeña adecuado para su uso en los métodos en el presente documento tiene la siguiente fórmula I:

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30 en la que:

R1-4 son, independientemente, R, halo, N3, CN, OH, NRR’ o SH;

R y R’ son, independientemente, H o alquilo C1-6; 35 X es R, halo, N3, CN, OR, NRR’, SH, =O, =CH2, o A;

A es un anillo aromático sustituido o no sustituido;

40 Y es R, NRR’, NRR”o (CH2)n-A;

Z es R, OR, OR”, NRR’, NRR”, o A;

R” es una cadena C2-C18 saturada o insaturada, lineal o ramificada; 45 y n es 0 ó 1.

Preferiblemente, el compuesto de fórmula I es un compuesto que contiene p-hidroxifenil-isoxazolina, en el que cada uno de R, R1-4, X e Y es H o -CH2-A y Z es OR. Más preferiblemente, el compuesto de fórmula I es un éster del ácido

50 (R)-3-(4-hidroxifenil)-4,5-dihidro-5-isoxazolinacético, particularmente el éster metílico del ácido del mismo (en ocasiones identificado como “ISO-1” o “CPSI” o “CPSI-26” en el presente documento) que también se conoce como éster metílico de p-hidroxifenol-isoxazolina. Todavía más preferiblemente, el compuesto es un éster del ácido 2-{3(4-hidroxi-fenil)-4,5-dihidro-isoxazol-5-il}-3-fenil-propiónico, particularmente el éster metílico del mismo (identificado como “ISO-2”).

55 Otros inhibidores de MIF de molécula pequeña adecuados para su uso en el método en el presente documento tienen las siguientes formulas II o III:

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impregnadas con los componentes activos y conformadas en forma de comprimido o capsules que contienen tales matrices poliméricas porosas impregnadas o encapsuladas.

Las preparaciones en forma líquida incluyen disoluciones, suspensiones y emulsiones. Como ejemplo pueden mencionarse disoluciones acuosas, etanólicas, acuosas-etanólicas o acuosas-en propilenglicol para inyecciones parenterales o adición de edulcorantes y opacificantes para disoluciones, suspensiones y emulsiones orales. Las preparaciones en forma líquida también pueden incluir disoluciones para administración intranasal.

Las preparaciones en aerosol adecuadas para inhalación pueden incluir disoluciones y sólidos en forma de polvo, que pueden estar en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como gas comprimido inerte, por ejemplo, nitrógeno.

Para preparar supositorios, en primer lugar se funde una cera de bajo punto de fusión tal como una mezcla de glicéridos de ácidos grasos tal como manteca de cacao, y se dispersa homogéneamente el principio activo en ella mediante agitación o mezclado similar. Entonces se vierte la mezcla homogénea fundida en moldes dimensionados convenientemente, se deja enfriar y de ese modo se solidifica.

También se incluyen preparaciones en forma sólida que se desea que se conviertan, poco antes de su uso, en preparaciones en forma líquida para administración o bien oral o bien parenteral. Tales formas líquidas incluyen disoluciones, suspensiones y emulsiones.

Los compuestos para su uso de la presente invención también pueden administrarse por vía transdérmica. Las composiciones transdérmicas pueden adoptar la forma de cremas, lociones, aerosoles y/o emulsiones y pueden incluirse en un parche transdérmico de tipo matriz o depósito tal como es convencional en la técnica para este fin.

El término cápsula se refiere a un recipiente o recinto especial compuesto por metilcelulosa, alcoholes polivinílicos o almidón o gelatinas desnaturalizadas para retener o contener composiciones que comprenden los principios activos. Las cápsulas de cubierta dura normalmente están compuestas por combinaciones de gelatinas de piel de cerdo y hueso de resistencia de gel relativamente alta. La propia cápsula puede contener pequeñas cantidades de colorantes, agentes opacificantes, plastificantes y conservantes.

Comprimido significa una forma de dosificación sólida comprimida o moldeada que contiene los principios activos con diluyentes adecuados. El comprimido puede prepararse mediante compresión de mezclas o granulaciones obtenidas mediante granulación en húmedo, granulación en seco o mediante compactación bien conocidas por un experto en la técnica.

Geles orales se refieren a los principios activos dispersos o solubilizados en una matriz semisólida hidrófila.

Polvos para constitución se refieren a combinaciones de polvos que contienen los principios activos y diluyentes adecuados que pueden suspenderse en agua o zumos.

Los diluyentes adecuados son sustancias que habitualmente constituyen la principal parte de la composición o forma de dosificación.

Los diluyentes adecuados incluyen azúcares tales como lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol, almidones derivados de trigo, maíz, arroz y patata, y celulosas tales como celulosa microcristalina. La cantidad de diluyente en la composición puede oscilar entre aproximadamente el 5 y aproximadamente el 95 % en peso de la composición total, preferiblemente entre aproximadamente el 25 y aproximadamente el 75 %, más preferiblemente entre aproximadamente el 30 y aproximadamente el 60 % en peso.

El término disgregantes se refiere a materiales añadidos a la composición para ayudarla a romperse (disgregarse) y liberar los medicamentos. Los disgregantes adecuados incluyen almidones, almidones modificados “solubles en agua fría” tales como carboximetilalmidón de sodio, gomas naturales y sintéticas tales como goma garrofín, goma karaya, goma guar, tragacanto y agar, derivados de celulosa tales como metilcelulosa y carboximetilcelulosa de sodio, celulosas microcristalinas y celulosas microcristalinas reticuladas tales como croscarmelosa de sodio, alginatos tales como ácido algínico y alginato de sodio, arcillas tales como bentonitas y mezclas efervescentes. La cantidad de disgregante en la composición puede oscilar entre aproximadamente el 2 y aproximadamente el 20 % en peso de la composición, más preferiblemente entre aproximadamente el 5 y aproximadamente el 10 % en peso.

Los aglutinantes se caracterizan por ser sustancias que unen o “adhieren” polvos entre sí y los hacen cohesivos formando gránulos, sirviendo por tanto como “adhesivo” en la formulación. Los aglutinantes añaden fuerza cohesiva a la ya disponible en el diluyente o agente de carga. Los aglutinantes adecuados incluyen azúcares tales como sacarosa, almidones derivados de trigo, maíz, arroz y patata; gomas naturales tales como goma arábiga, gelatina y tragacanto; derivados de algas tales como ácido algínico, alginato de sodio y alginato de amonio y calcio; materiales celulósicos tales como metilcelulosa y carboximetilcelulosa de sodio y hidroxipropilmetilcelulosa; polivinilpirrolidona; y compuestos inorgánicos tales como silicato de aluminio y magnesio. La cantidad de aglutinante en la composición

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Ejemplo 15

Animales: Se mantuvieron ratones C57BL/6 de Charles River (12-15 semanas de edad) con alimentos comerciales y agua corriente a voluntad. Se revisaron y aprobaron todos los protocolos de animales por el University of Texas Southwestern IACAC de conformidad con las normas que regulan el uso de animales publicadas por el NIH.

Ligadura de arteria coronaria: Se anestesiaron ratones con isoflurano al 1-1,5 % tras lo que se realizó la ligadura de arteria coronaria. Se administraron preoperatoriamente atropina (0,75 mg/kg administrados por vía intramuscular), lidocaína (1 mg/ml por vía intramuscular) y solución salina (1 ml por vía intraperitoneal). Se logró ventilación usando una máscara adaptada ajustada al hocico del ratón y un pequeño ventilador para animales (Harvard Apparatus, Inc., Holliston, MA). Se practicó una incisión (5 mm) en la parte izquierda del tórax en el cuarto espacio intercostal y se realizó pericardiotomía para exponer el ventrículo izquierdo. Se ocluyó la arteria coronaria izquierda usando Prolene 8-0 aproximadamente 2 mm bajo la aurícula izquierda. Posteriormente, se cerró el tórax en capas y volvió la presión negativa del tórax mediante evacuación por jeringa. Se administró buprenorfina (0,10 mg/kg) una vez de manera posoperatoria para el dolor. Se realizaron procedimientos simulados de manera idéntica sin la ligadura coronaria.

Anticuerpo anti-MIF: Se usaron un anticuerpo monoclonal IgG1 anti-MIF de ratón (III.D.9, cortesía de Cytokine PharmaScience, Inc.) y un anticuerpo monoclonal de control de isotipo IgG1 (HB-49, cortesía de Cytokine PharmaScience, Inc.) en los estudios de ecocardiografía. Estudios anteriores han demostrado la neutralización in vivo de la actividad de MIF. Las figuras 21-25 muestran los resultados obtenidos en este ejemplo. La figura 21 compara la función cardiaca (acortamiento fraccional) tras ligadura de LAD con LAD solo y anticuerpo anti-MIF + LAD. La figura 22 muestra el efecto de la terapia con anticuerpos anti-MIF antes de LAD, con LAD solo y con anticuerpo anti-MIF + LAD. La figura 23 presenta datos de función cardiaca 48 horas tras LAD para varios grupos de tratamiento. La figura 24 muestra la concentración sérica de troponina 48 h tras LAD con tratamiento con anticuerpos anti-MIF previo y retardado. La figura 25 las concentraciones séricas de troponina I y MIF durante dos semanas tras la ligadura.

Ejemplo 16

El MIF se secreta de los cardiomiocitos tras la exposición a LPS, y media directamente una disfunción cardiaca de comienzo tardío (>6 horas). En células inmunitarias, se determinó recientemente que CD74 era el receptor de MIF, que ejerce efectos a través de rutas de señalización intracelulares de ERK1/2. Para determinar si CD74 media en la disfunción cardiaca inducida por MIF en septicemia, se expusieron: 1) ratones de tipo silvestre (C57BL/6) a LPS; 2) ratones de tipo silvestre tratados previamente con anticuerpos monoclonales neutralizantes anti-CD74; y expuestos a LPS, y 3) ratones deficientes en CD74 a LPS (4 mg/kg). Se realizó ecocardiografía en serie y se determinó el acortamiento fraccional (% FS). A las 24 horas, se observó disfunción significativa en ratones WT a los que se había administrado LPS (% FS=31,6 %3,3 %) en comparación con los controles ((% FS=581 %). Tanto en los ratones tratados con anticuerpos anti-CD74 como en los deficientes para CD74 expuestos a LPS, la función cardiaca mejoró significativamente en comparación con los ratones de tipo silvestre a los que se había administrado LPS solo ((% FS=49:3,6 % y 53,32,4 %, respectivamente, p<0,05). Puesto que nunca se ha documentado la expresión de CD74 en el corazón, se realizaron inmunotransferencias e histoquímica que confirmaron que CD74 está presente de manera constitutiva en las membranas de células cardiacas y en el citosol; y que se regulaba sustancialmente tras la exposición a LPS (casi ausente a las 12 horas ->disminución de 4 veces). Figuras 26-30 y tablas 5-7. Los datos son los primeros en demostrar que CD74 se expresa en cardiomiocitos y es un mediador crítico de la disfunción cardiaca.

Tabla 5

Nombre de gel: Serie 1 de CD74 (Imagen 1-D sin procesar)

Índice: Área Valor medio Desviación estándar Densidad

mm2: INT INT/mm2

1: 60,752571 0,194609751 0,189491850143 27,14811295

2: 60,752571 0,287409566 0,248436881024 40,09371219

3: 60,752571 0,233961015 0,202269192827 32,63762488

4: 60,752571 0,193959627 0,180271350955 27,05742043

5: 60,752571 0,395414888 0,260615830635 55,16048369

6: 60,752571 0,324963155 0,260421026338 45,33244800

7: 60,752571 0,383720515 0,267718631786 53,52911561

8: 60,752571 0,445625310 0,256556738182 62,16485123

9: 60,752571 0,424732026 0,248033724362 59,25023237

10: 60,752571 0,391370235 0243462155963 54,59625355

11: 60,752571 0,607251315 0,202530867340 84,71172258

12: 60,752571 0,620208919 0,184951399717 86,51931171

Método de sustracción de fondo: local Unidades de datos: intensidad (INT)

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Claims

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