ES2597956T3 - Método para determinar el poder antioxidante de fluidos biológicos y vegetales - Google Patents

Abstract

Un uso de un reactivo que comprende al menos una sal inorgánica de circonio y al menos un disolvente, dicho al menos un disolvente que es una mezcla de agua y un alcohol lineal o ramificado (C1-C5), para la determinación del poder antioxidante de fluidos biológicos y vegetales.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

[0053] Sin embargo, no todos los antioxidantes son capaces de donar electrones en una cantidad detectable por el electrodo de referencia; por tanto, la medición es solo una medida parcial tal que a veces se debe recurrir a electrodos específicos para ciertos antioxidantes (de tipo GSH).

5 [0054] También se conoce el ensayo de FRAP (Poder reductor/antioxidante férrico), establecido por primera vez por Benzie y Strain (1999) para medir el poder reductor del plasma, adaptado después para analizar la capacidad antioxidante de especies botánicas. El ensayo mide la reducción de 2,4,6-tripiridil-S-triazina férrica (TPTZ) para formar un producto azul intenso (Guo et al., 2003; Jiménez-Escrig et al, 2001). El poder reductor se relaciona con el grado de hidroxilación y el nivel de conjugación en los polifenoles (Pulido et al., 2000). Sin embargo, el ensayo de

10 FRAP es incapaz de detectar compuestos que actúan por transferencia de hidrógeno (extinción de radicales), tales como tioles y proteínas. Esto da lugar a una subestimación de los resultados, sobre todo en el suero.

[0055] Por otra parte, el pH fuertemente ácido, que se utiliza en el ensayo de FRAP para mantener el hierro en solución, da lugar a un cambio en el mecanismo de reacción dominante con la consiguiente implicación de que los

15 resultados del ensayo de FRAP no son comparables con otras mediciones de los ensayos de antioxidantes. El FRAP se basa en la premisa de que las reacciones redox tienen lugar con bastante rapidez (en 4 a 6 minutos), pero en realidad esto no sucede en cualquier momento. Esto hace que este ensayo dependa en gran medida del tiempo necesario para el análisis.

20 [0056] También es conocido el ensayo de BAP (potencial antioxidante biológico) que evalúa el poder antioxidante de suero plasmático en términos de la capacidad de este último para reducir los iones férricos a iones ferrosos, y detecta los cambios de color de un cromógeno adecuado por medio de fotometría.

[0057] En el ensayo de BAP, por tanto, la muestra de suero a analizar se disuelve en una solución de color

25 obtenida mediante la adición de una fuente de iones férricos (FeCl3, es decir, cloruro férrico) a un cromógeno específico (un compuesto a base de azufre). Después de una breve incubación (5 minutos), la solución se decolora; esta decoloración será más pronunciada cuantos más componentes del suero analizado hayan sido capaces de reducir los iones férricos presentes inicialmente y responsables de la formación del complejo de color en el intervalo de tiempo considerado. Mediante la evaluación fotométrica del grado de esta decoloración, es posible medir la

30 cantidad de iones férricos reducidos y, en resumen, la capacidad reductora o el poder antioxidante del suero analizado con respecto a un suero de referencia, conocido como calibrador. Los resultados del ensayo, es decir, el poder antioxidante "fisiológico" de reducción de hierro del suero, se expresan en miliequivalentes de antioxidantes que reducen el hierro férrico por litro de muestra, de acuerdo con la fórmula:

[Abs del reactivo blanco -Abs de la muestra] × calibrador

[Abs del reactivo blanco -Abs del calibrador]) 35 en la que:

− [Abs] son los valores de absorbancia de la solución medida a 505 nm; y

− [Calibrador] es la concentración del calibrador expresado en mEq/l.

40 [0058] Teniendo en cuenta que 1 ml de suero se considera suficiente para reducir al menos 1,8 mol/l de vitamina C, los resultados del ensayo de BAP se comparan entonces con la siguiente tabla de referencia:

Valores de referencia expresados como nmol/l de sustancias antioxidantes como la vitamina C

> 2200

Valor óptimo

2200-1800

Valor limítrofe

2000-1800

Estado de deficiencia moderada

1800-1600

Estado de deficiencia

1600-1400

Estado de deficiencia severa

<1400

Estado de deficiencia muy severo

45 [0059] El ensayo de BAP se ha declarado que es lineal entre 1000 y 3000 µmol/l.

[0060] Sin embargo, se ha observado que este ensayo, además de depender del uso de dicho calibrador de procedencia y tipo desconocidos, no tiene en cuenta la complejidad de la composición de las muestras a analizar, en particular en el caso de fluidos biológicos, en los que hay presentes compuestos, que interfieren con la reducción de

50 iones férricos, alterando y falsificando de este modo la determinación del poder antioxidante resultante con respecto a su valor real, y por tanto, da lugar a una evaluación incorrecta del estado antioxidante real de la muestra.

[0061] Métodos similares se describen en Shanmugasundaram P. et al. ("Hepatoprotective and antioxidant effects of Hygrophila auriculata (K. Schum) Heine Acanthaceae root extract", Journal of Ethnopharmacology, Elsevier

7

imagen6

imagen7

imagen8

i) al menos un reactivo como se ha descrito anteriormente; ii) al menos una solución alcohólica de tiocianato; iii) al menos un solución acuosa de una sal férrica; y iv) un folleto ilustrado que comprende las instrucciones para llevar a cabo la determinación del poder

5 antioxidante.

[0098] El resultado ventajoso ha sido simplificar significativamente los componentes necesarios para la determinación del poder antioxidante de fluidos biológicos o vegetales en el sentido de que, en contraste con el ensayo de BAP, el kit de la invención no comprende calibrador en absoluto, es decir, suero de referencia. De hecho, 10 puesto que el método de la presente invención se refiere directamente a la curva de calibración de la vitamina C, no hay necesidad de una muestra de referencia, ni para el suero ni por cualquier otro fluido, consiguiendo por tanto una serie de ventajas notables como una mejor repetibilidad, mejor reproducibilidad, coste reducido y una excelente fiabilidad de los resultados como se demuestra también en los siguientes ejemplos, en particular en los Ejemplos 4 y

5.

15 [0099] Preferentemente, dicho i) al menos un reactivo y dicha ii) al menos una solución alcohólica de tiocianato son una única solución (1).

[0100] En una realización preferida, dicho folleto ilustrativo comprende además instrucciones para la recogida de la

20 muestra de fluido biológico y vegetal. Más preferentemente, cuando dicho fluido biológico es saliva, dichas instrucciones adicionales para la recogida de muestras indican que dicha recogida se lleva a cabo en condiciones para que dicho flujo de saliva sea de 0,70 a 1,50 ml/min. Aún más preferentemente, dichas instrucciones adicionales para la recogida de muestras indican que dicha recogida se lleva a cabo en condiciones para que el flujo de saliva sea de 1,00 a 1,30 ml/ml dicho. En una realización preferida, dicho flujo de saliva es de aproximadamente 1,20

25 ml/min.

[0101] Debe entenderse que todos los aspectos identificados como preferidos y ventajosos para el método de la invención también se deben considerar preferidos y ventajosos de manera similar para el kit y el uso de los mismos.

30 [0102] A continuación se proporcionan Ejemplos de trabajo de la presente invención para fines ilustrativos y no limitantes.

Ejemplos

35 Ejemplo 1. Método para determinar el poder antioxidante de la saliva, el plasma y la orina, según la presente invención

[0103] Se prepararon los siguientes componentes:

Cantidad

Volumen

Muestra

10 µl

Alcohol isopropílico

600 µl

Solución (1)

H2O desmineralizada 355 µl

ZrCl4

47,20 mmol 5 µl

KSCN

0,11 mmol 10 µl

Solución (2)

Fe(NO3)3 5,01 mmol 30 µl

Total

1010 µl

40 [0104] La Solución (1) se preparó combinando la solución de cloruro de circonio y la solución alcohólica de tiocianato; a continuación, se introdujo esta solución (1) en una cubeta para el análisis espectrofotométrico UV-Vis. A continuación se añadió la solución (2), virando así el color de transparente a marrón rojizo, cuya intensidad es proporcional a la presencia de Fe3+ que ha reaccionado con el tiocianato. Inmediatamente después, se identificó la

45 longitud de onda correspondiente al pico máximo de absorbancia medido por espectrofotómetro que en este caso es de 505 nm.

[0105] Posteriormente, la muestra también se añadió a la cubeta. Después de 5 minutos, se repitió la lectura de absorbancia. La diferencia entre la primera y la segunda lectura de absorbancia permitió obtener la concentración en 50 términos de µmol/l de vitamina C, por medio de la ley de Lambert-Beer, y por tanto el poder antioxidante de la muestra analizada.

[0106] A este respecto, se utilizó la vitamina C como patrón para la calibración del método, ya que mostraba valores lineales entre 500 y 6000 µmol/l, como se demuestra en el Ejemplo 1A a continuación. Para concentraciones 55 > 6000 µmol/l, la muestra se diluyó adecuadamente con agua desionizada, hasta que sus valores cayeron dentro de

11

imagen9

imagen10

imagen11

imagen12

imagen13

[0157] Todos los sujetos completaron con éxito el ensayo. Las mediciones de flujo de saliva y las concentraciones relativas en términos de µmol/ml de vitamina C, durante los primeros días de seguimiento de los diferentes flujos, se dan en la Tabla 8 a continuación.

5 [0158] También se calcula el producto del "ensayo de flujo x", siendo ésta una expresión de la capacidad oxidativa total (CT). Todas las mediciones se llevaron a cabo usando 10 µl, y los valores se expresaron como µmol/l de vitamina C. El examen de los datos mostraba que cuando el flujo medio variaba de 0,75 ml/min a 1,14 ml/min los valores de ensayo prácticamente se igualan. Flujos inferiores a 0,70 ml/min o superiores a 1,50 ml/min mostraban

10 concentraciones más altas o más bajas, respectivamente, en ambos casos de manera significativa (prueba t, p <0,05). Por tanto, se puede concluir que, al mantener un flujo de saliva de 0,70 ml/min a 1,5 ml/min, las concentraciones resultantes en términos de µmol/l de vitamina C varían de forma despreciable.

Tabla 8. Volúmenes de saliva (ml/min) y concentraciones en términos de µmol/l de vitamina C. Valores medios ± DE.

Variables

Valores Capacidad total (CT) [Flujo x ensayo]

Flujo 1

0,43 ± 0,095

ensayo 1

4316 ± 381,5 1846 ± 383,8

Flujo 2

0,75 ± 0,085a

ensayo 2

3753 ± 301.4 2804 ± 299,1c

Flujo 3

1.10 ± 0.082a

ensayo 3

3492 ± 282,2b 3840 ± 397,0cd

Flujo 4

1,44 ± 0,070a

ensayo 4

3483 ± 265,1b 5006 ± 312,5cd

Flujo 5

2.31 ± 0.197a

ensayo 5

2075 ± 280,2 6053 ± 698,0cd

a prueba t para datos interdependientes: p <0,05 para Flujo 1 frente a Flujo "n" b prueba t para datos interdependientes: p <0,05 ensayo 3 frente a ensayo 4 c prueba t para datos interdependientes: p <0,05 comparación de CT 1 frente a CT "n" d contrastes ortogonales ANOVA: p <0,05 la secuencia CT 5 > CT 4 > CT 3

15 [0159] Se encontró que a flujos medios desde 1,10 ml/min a 1,44 ml/min (flujo 3, flujo 4), aumentó la cantidad de capacidad antioxidante total. Esto confirma además el hecho de que los flujos moderados eran óptimos para la normalización de la evaluación del poder antioxidante de la saliva.

20 [0160] En el contexto del ejemplo actual, se determinaron dos veces más las evaluaciones de flujo de saliva y la capacidad antioxidante total relativa, en concreto, después de 3 y 5 días (flujo 6 y flujo 7, respectivamente).

[0161] Los resultados, mostrados en la Tabla 9, demostraron que no había variaciones significativas notables (ANOVA p> 0,05) entre los valores adquiridos para los flujos estimulados los días 1, 3 y 5, lo que confirma la alta 25 reproducibilidad del método de la invención.

Tabla 9. Valores de la saliva estimulada entre 1 ml/min y 1,5 ml/min en los días posteriores. Valores medios ± DE.

Días

Variables Valores Capacidad total (CT) [producto de flujo x TAS]

1

Flujo 3 1,10 ± 0,082

ensayo 3

3492 ± 282,2 3840 ± 397,0

3

Flujo 6 1,13 ± 0,082

ensayo 6

3461 ± 254,6 3916 ± 452,5

5

Flujo 7 1,14 ± 0,084

16

imagen14

imagen15

imagen16

imagen17

[0210] Se observó que los sujetos afectados por paradontosis son significativamente más jóvenes que los sujetos sanos.

[0211] Las evaluaciones de los valores del poder antioxidantes salivales, el flujo de saliva relativa y el grado de paradontosis se dan en la Tabla 13.

Tabla 13. Comparación entre sujetos sanos y sujetos afectados por paradontosis. Valores medios ± DE.

Variables

Sujetos sanos Sujetos con paradontosis Prueba t

Índice de paradontosis

0 2,1 ± 0,92

Volumen (ml/min)

1,21 ± 0,17 1,17 ± 0,15 ns

Método de la invención (µmol/l)

2032 ± 332,1 1212 ± 220,6 p <0,05

[0212] Se encontró que, aunque los flujos de saliva en realidad no diferían significativamente entre los sujetos 10 afectados por paradontosis, el ensayo de flujo de saliva a menudo se debía repetir para estos últimos debido a la producción escasa.

[0213] En vista de la importante diferencia de edades entre los dos grupos, el análisis estadístico se corrigió para la edad, pero, sin embargo, se encontraron diferencias significativas en los valores de flujo de saliva, ya que 15 indicaban que en sujetos afectados por paradontosis se reducía el poder antioxidante de la saliva.

[0214] Por otra parte, se observó una correlación inversamente proporcional entre la gravedad de la paradontosis y los valores del poder antioxidante de la saliva relativa ("r" -0,544 p <0,05). Esto confirmó la evidencia experimental, como se muestra y se ha comentada anteriormente con referencia a la Tabla 3.

20

Ejemplo 8. Evaluación del poder antioxidante de ciertos alimentos y bebidas de acuerdo con el método de la invención

[0215] Se utilizó el método de la invención para determinar el poder antioxidante de una serie de alimentos y 25 bebidas que pueden contener diferentes cantidades de fosfatos.

[0216] Para cada producto, se examinaron 5 lotes de diferente origen y las evaluaciones se llevaron a cabo para todas las muestras en el mismo día de la recogida y después de manera simultánea en los días posteriores.

30 [0217] Los resultados se dan en la Tabla 14.

Tabla 14. Determinaciones del poder antioxidante de bebidas y alimentos

Producto

Método de la invención (µmol/l) Porción media (ml o g) Porción total (µmol equiv. de vitamina C)

Limones a

11373 ± 140,5 20 1137 ± 14,0

Naranjas b

2460 ± 273,4 120 1476 ± 164,1

Tomates c

1113 ± 11,9 150 835 ± 8,9

Arándanos d

1318 ± 66,1 40 264 ± 13,2

Frambuesas e

4556 ± 100,0 40 911 ± 20,0

Vino Chianti f

5426 ± 81,9 120 651 ± 81,9

Vino Soave g

4711 ± 93,4 120 565 ± 11.2

Vino rosado h

5645 ± 200,5 120 677 ± 24,1

Vino de Oporto i

4536 ± 56,0 40 181 ± 2,2

Cerveza l

1408 ± 47,3 330 465 ± 15,6

Grappa m

162 ± 18,5 40 6 ± 0,7

Brandy n

312 ± 38,1 40 12 ± 1,5

Café o

7945 ± 185,9 30 1192 ± 27,9

Té p

3840 ± 114,1 150 576 ± 17,1

a Limones Verdello [Tipo: Scelgobio® -Origen Italia, Cat. II Código de calibre 4/5] b Naranjas de sangre [Tipo: Mariarosa -Origen Italia, Cat. I Código de calibre 6] c Tomates para la fabricación de pasta [origen: Italia] d Arándanos [Tipo: Vitalberry-Origen Chile, Cat. I] e Frambuesas [Tipo: Natberry Maroc -Origen Marruecos, Cat. I] f Chianti Classico [Productor: Cecchi -Origen Italia]

21

g Soave Cadis [Productor: Cantina di Soave -Origen Italia] h Rosado de Salento [Productor: Al Tralcio Antico -Origen Italia] i Oporto Tawny [Productor: Offley -Origen Portugal] l Dreher [Productor: Dreher -Origen Italia] m Pinot Nero Grappa [Productor: La Versa -Origen Italia] n Fundador [Productor: Pedro Domecq -Origen España]

o Nespresso [Tipo: Roma -Origen Italia] p Twinings® [Tipo: Earl Grey -Origen Reino Unido]

[0218] El café, preparado con una máquina automática de Nespresso, era de una calidad tipo Caffe' Roma. Se prepararon 5 cafés diferentes en una cantidad de 30 ml. En relación con el té, se utilizaron bolsas de té Twinings® [Earl Grey clásico]; las muestras se prepararon mediante la

5 infusión de una bolsa de té durante 3 minutos en 150 ml de agua que se utilizó 2 minutos después de que hubiese bullido. La fruta y los tomates, representativas de cualquier frutas y hortalizas, se homogeneizaron y se diluyeron con agua desionizada en una proporción de 1:5. Todas las muestras se centrifugaron a 800 rpm durante 2 minutos y la determinación se llevó a cabo en 10 µl de sobrenadante.

10 En caso de que la determinación hubiese superado los 6000 µmol/l (por ejemplo, para el café y el limón), la medición se repitió usando 5 µl y el valor se multiplica por 2. La Tabla 14 también muestra los valores del poder antioxidante total de las porciones de alimentos. Sorprendentemente, de estos datos se deduce que los valores antioxidantes de un vino blanco (Soave) y un vino rosado (Salento) no son significativamente diferentes de las del vino tinto (Chianti). Entre los alimentos analizados,

15 las naranjas, los limones y el café son los que tienen el poder antioxidante más alto.

[0219] De la descripción detallada y los ejemplos proporcionados más arriba, son evidentes las ventajas conseguidas por medio del reactivo y el método de la presente invención. En particular, dicho reactivo permite enmascarar la presencia de fosfatos en muestras de fluidos biológicos y vegetales, evitando así ventajosamente que 20 dichos fosfatos interfieran con la determinación del poder antioxidante, mientras que al mismo tiempo los mantiene en solución, es decir, evitando su precipitación que desventajosamente incurriría en una etapa de separación dedicada. Dichas ventajas son particularmente apreciadas en términos de viabilidad y rentabilidad de la aplicación del método. Dicho método de la invención, también en virtud del kit que comprende dicho reactivo, permite evaluar el poder antioxidante en fluidos biológicos y vegetales de una manera fiable, reproducible y repetible y

25 económicamente conveniente, superando así las desventajas anteriormente mencionadas de los métodos conocidos, y, en particular, las desventajas observadas en relación con el ensayo de BAP.

Referencias bibliográficas

30 [0220]

1) Percival RS, Challacombe SJ, Marsh PD. Flow rates of resting whole and stimulated parotid saliva in relation to age and gender. J Dent Res. 1994; 73:1416-1420. 2) Del Vigna de Almeda P, Trindade Grècio A, Naval Machado A et al. Saliva composition and functions: a

35 comprehensive review. J Cont Dent Pract. 2008; 9:1-11. 3) Humphrey SP, Williamson RT. A review of saliva: normal composition, flow, and function. J Prost Den 2001; 85:162-169. 4) Battino M, Ferreiro MS, Gallardo I et al. The antioxidant capacity of saliva. J Clin Periodontol 2002; 29:189-194. 5) Moore S, K AC Calder, Miller NJ, C A Rice-Evans. Antioxidant activity of saliva and periodontal disease. Free

40 Rad Res 1994; 21:417-425. 6) Meyle J, Kapitza K. Assay of ascorbic acid in human crevicular fluid from clinically healthy gingival sites by high-performance liquid chromatography. Arch Oral Biol 1990; 35:319-323. 7) Nagler RM, Klein I, Zarhevsky N et al. Characterization of the differentiated antioxidant profile in human saliva. Free Rad Biol Med 2002; 32:268-277.

45 8) Iwamoto Y, Nakamura R, Watanabe T, Tsunemitsu A. Heterogenity of peroxidase related to antibacterial activity in human parotid saliva. J Dent Res 1972; 51:503-508. 9) Thomas EL, Milligan TW, Joyner RE, Jefferson MM. Antibacterial activity of hydrogen peroxide and the lactoperoxidase-hydrogen peroxide-thiocyanate system against oral streptococci. Infect Immun 1994; 62:529-535. 10) Grisham MB, Ryan EM. Cytotoxic properties of salivary gland. Am J Physiol 1990; 258:C115-C121.

50 11) Kou F, Takahama U. Hydrogen peroxide-induced luminescence and evolution of molecular oxygen saliva. Arch Oral Biol 1995; 40:15-21. 12) Borges I, Machado-Moreira EA, Filho DW et al. Proinflammatory and oxidative stress markers in patients with periodontal disease. Med Inflamm 2007; ID 45794:1-5 13) Huang D, Ou B, Prior RL. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Agr Food Chem 2005; 53:1841

55 1856.

22

imagen18

Claims (1)

1. imagen1