CN104251826A - 一种用于检测抗氧化潜力的体外检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过检测血液将三价铁转化为二价铁的能力从而评价人体清除过氧化氢物的抗氧化能力的应用方法，该方法包括：氯化铁和硫氰化钾反应，生成血红色产物硫氰化铁，自动生化仪505nm波长测吸光度值；血清加入硫氰化铁混合物中，血液中抗氧化物把三价铁还原成二价铁，产物颜色变淡，自动生化仪505nm波长测吸光度值；两次吸光度之差与抗氧化物浓度呈正比。本发明BAP检测的方法为一步法，测定仪器为临床生化诊断最基本的和必备的检验设备生化分析仪，具有操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好等优点。针对体内抗氧化潜能的氧化应激分析可作为治疗方案制定或预后判断等的依据，具有相当重要的临床意义。

Description

一种用于检测抗氧化潜力的体外检测方法

技术领域

本发明涉及通过检测血液将三价铁转化为二价铁的能力从而评价人体清除过氧化氢物的抗氧化能力，称为BAP(biological antioxidant potential)测试。BAP测试反映了机体内总体的抗氧化能力，包括许多抗氧化物如胆红素、尿酸、维生素C、维生素E和蛋白质等的整体浓度水平。通常情况下，BAP数值下降发生于不均衡饮食或是体内自由基产生过多。

背景技术

氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统的动态平衡失衡。过多的自由基会攻击体内细胞，亦会导致病理改变，因此自由基跟衰老及很多疾病都有关联。

血液含有很多抗氧化物可以对抗过氧化氢物等自由基的侵害。抗氧化潜力测试(BAP test)可检测血液中抗氧化物的浓度，而这些抗氧化物可以减低铁质由亚铁转变成三价铁的机会，即评价抗氧化物减低氧化作用的指数并评估抗氧化的潜力。BAP测试不是用来测量单一种抗氧化物的浓度，而是表示机体内抗氧化物的整体浓度水平。

与全球体外诊断产品市场相对成熟不同，我国体外诊断市场仍处于发展的初级阶段。我国的诊断试剂市场规模仅为全球市场的1/14，人均消费量约为全球人均消费量的17％左右，即仍处于产品研发与生产的投入初期。因此，我国诊断试剂市场的生存、发展和壮大依然是一个漫长的过程。随着生物技术的快速发展，我国诊断试剂产业将面临更大的机遇和挑战。并且，我国人口众多，市场庞大，其中蕴含的经济利益和社会效益更是无法估量。研制价廉物美、操作简便的诊断试剂产品无疑是非常必要且具重要意义的。

目前国际上常用的BAP测试系统通常包括检测试剂、参考品(校准品、质控品)、分光光度仪整套系统，在检测重复性、准确性上有很大的优势，但相对操作过程复杂、经济花费较大。国内对于BAP的检测，生产厂家几乎都没有生产相应质控品的经验和实力，因此市场上缺乏认可的用于BAP检测的国产产品。本发明所用BAP检测的方法为一步法，测定仪器为临床生化诊断最基本的和必备的检验设备生化分析仪，具有操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好等优点。针对BAP的氧化应激分析可作为治疗方案制定或预后判断等的依据，可为人类及动物医学的氧化压力评估上开拓新方向。

发明内容

针对现有氧化应激分析评估系统存在的问题，本发明的目的在于提供一种操作简单、成本低廉、成功率高的BAP检测方法。

为实现上述目的，本发明一种BAP检测方法，该方法包括：

1)全血离心，分离血清和血细胞；

2)取适量氯化铁和硫氰化钾反应，生成血红色产物硫氰化铁，自动生化仪505nm波长测OD值；

3)取步骤1)中适量血清加入步骤2)反应复合物中，37℃静置5分钟；

4)产物再次用自动生化仪505nm波长读数，颜色变化强度与抗氧化能力呈比例；

5)在以上步骤进行的同时，步骤3)中血清以已知不同浓度的维生素E(分子式C₁₄H₁₈O₄)代替，余步骤不变，以不同浓度维生素E反应产物读取的OD值做标准曲线(Trolox标准曲线)，由此计算出血清的抗氧化能力(用Trolox等价抗氧化能力表示)。

其中，步骤2)、3)和步骤5)中化学反应的原理图如下所示：

A)FeCl₃+3KSCN→3KCl+Fe(SCN)₃

B)R-OH+Fe³⁺→R-O^-+Fe²⁺+H⁺

C)C₁₄H₁₈O₄+Fe³⁺→C₁₄H₁₇O₄+Fe²⁺+H⁺

本发明的有益效果在于：本发明BAP检测的方法操作非常简单，检测成本低，结果准确可靠，而且具有高重复性，可快速准确检测血液将三价铁转化为二价铁的能力从而评价人体抗氧化能力。为临床上评估疾病的危险因素，确定疾病的治疗方案和判断疾病的预后提供可靠的理论依据。

附图说明

图1示Trolox标准曲线的绘制方法。待测血清样本可根据OD值及标准曲线计算出待测血清的Trolox等价抗氧化能力。

图2为本测定系统的稳定性观察。在4天时间内，每天重复检测同一份血清样本，OD值读值稳定。

图3为本发明BAP检测方法与国际上认可度较高的FRAS4氧化应激分析评估系统的准确性比较。发现两组测定结果具有良好的两两相关性，相关系数大于0.97。

具体实施方式

下面参考附图，对本发明进行更全面的说明，附图中示出了本发明测定的详细方法，该测定系统的稳定性，以及与国际上认可度较高的FRAS4氧化应激分析评估系统的准确性比较。充分说明了本发明操作简单，检测成本低，结果准确可靠，并且具有高重复性的特点。

本发明的原理主要在于：氯化铁和硫氰化钾反应，生成血红色产物硫氰化铁，自动生化仪505nm波长测吸光度值；血清加入硫氰化铁混合物中，血液中抗氧化物把三价铁还原成二价铁，产物颜色变淡，自动生化仪505nm波长测吸光度值；两次吸光度之差与抗氧化物浓度呈正比。

该方法具体为：

1.全血1500g离心15min，吸取25μL上层血清。

2.50μL浓度为10mM的氯化铁与50μL浓度为30mM的硫氰化钾反应，生成血红色产物硫氰化铁。

3.产物用奥林巴斯AU5400生化仪的505nm波长读数。

4.分别配制浓度为0.25mM、0.5mM、1mM、2mM、4mM、8mM、16mM的维生素E甲醇溶液，各取25μL与步骤2)中硫氰化铁混合，37℃静置5分钟；待测血清同样取25μL与步骤2)中硫氰化铁混合，37℃静置5分钟。

5.步骤4)中产物用奥林巴斯AU5400生化仪的505nm波长读数。

6.绘制维生素E标准曲线(Trolox标准曲线)，并计算待测血清的Trolox等价抗氧化能力，单位以μm/L表示。

在图1中，示Trolox标准曲线的绘制方法。初始血红色产物硫氰化铁生化仪读数为OD₀，0.25mM、0.SmM、1mM、2mM、4mM、8mM、16mM的维生素E甲醇溶液与硫氰化铁反应后的读数为OD₁、OD₂、OD₃、OD₄、OD₅、OD₆、OD₇，以维生素E甲醇溶液浓度为横坐标，OD₁-OD₀、OD₂-OD₀、OD₃-OD₀、OD₄-OD₀、OD₅-OD₀、OD₆-OD₀、OD₇-OD₀为纵坐标，绘制标准曲线。

在图2中，示本测定系统的稳定性观察。用本测定方法在连续4天时间内，每天重复3次检测同一份血清样本，四组ΔOD值读数没有显著性差异(P＞0.05)。说明本测定系统稳定性良好。

在图3中，对本发明BAP检测的方法与国际上认可度较高的FRAS4氧化应激分析评估系统的准确性比较。分别以两种方法对不同待测血清测定后，做相关分析发现，两种测定体系间具良好的两两相关性，相关系数大于0.97。说明本检测系统准确性良好。

上述快速准确检测血液将三价铁转化为二价铁的能力从而评价人体抗氧化能力的体外检测法，可作为治疗方案制定或预后判断等的依据，不是以诊断为目的，不属于疾病的诊断方法。

除非特殊定义，本发明描述所用的术语是在有关技术领域中公知的术语。标准的化学符号及缩写符号可以与其全名互换使用。

除非特殊指明，本发明所用到但未明确阐述或简单阐述的技术和方法是指本技术领域通常使用的技术和方法，可按照本领域公知的技术和方法进行。试剂盒的使用是根据制造商或供应商提供的说明书进行。

Claims (6)

1.一种操作简单、成本低廉、成功率高的BAP检测方法，其特征在于，该方法包括：

1)全血离心，分离血清和血细胞；

2)取适量氯化铁和硫氰化钾反应，生成血红色产物硫氰化铁，自动生化仪505nm波长测吸光度值；

3)取步骤1)中适量血清加入步骤2)反应复合物中，37℃静置5分钟；

4)产物再次用自动生化仪505nm波长读数，颜色变化强度与抗氧化能力呈比例；

5)在以上步骤进行的同时，步骤3)中血清以已知浓度的维生素E(分子式C₁₄H₁₈O₄)代替，余步骤不变，以不同浓度维生素E反应产物读取的OD值做标准曲线(Trolox标准曲线)，由此计算出血清的抗氧化能力。

2.如权利要求1所述BAP检测的方法，其特征在于，步骤2)中所述反应为50μL浓度10mM的氯化铁与50μL浓度30mM的硫氰化钾反应，生成血红色产物硫氰化铁。

3.如权利要求1所述BAP检测的方法，其特征在于，步骤5)中所述维生素E化学反应为浓度0.25mM、0.5mM、1mM、2mM、4mM、8mM、16mM的维生素E甲醇溶液，各取25μL与步骤2)中硫氰化铁混合。

4.如权利要求1所述BAP检测的方法，其特征在于，步骤5)中所述血清的抗氧化能力用Trolox等价抗氧化能力表示。

5.一种如权利要求1所述通过检测血液将三价铁转化为二价铁的能力从而评价人体抗氧化能力的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，针对体内抗氧化潜能的氧化应激分析可作为治疗方案制定或预后判断等的依据，具有相当重要的临床意义。