CN102792165B

CN102792165B - 用于测定生物流体和植物流体的抗氧化力的方法

Info

Publication number: CN102792165B
Application number: CN201180011001.0A
Authority: CN
Inventors: 翁贝托·康纳利
Original assignee: COR CON INTERNATIONAL Srl
Current assignee: COR CON INTERNATIONAL Srl
Priority date: 2010-02-25
Filing date: 2011-02-23
Publication date: 2015-08-12
Anticipated expiration: 2031-02-23
Also published as: ES2597956T3; WO2011104267A1; EP2539716A1; JP5801325B2; CN102792165A; EP2362227A1; JP2013520665A; US9442124B2; US20120309102A1; EP2539716B1

Abstract

描述了用于测定生物流体例如唾液、血清、血浆、尿液、汗液、眼泪，和植物流体例如水果、蔬菜、来源于它们的饮料的抗氧化力的方法。所述方法被证明是在评价唾液的抗氧化力时特别地合适的，评价唾液的抗氧化力从分析观点呈现特别的复杂性。此外，本发明涉及具体的用于实施所述方法的试剂和试剂盒，试剂盒包括所述试剂。试剂含有无机锆盐和至少一种合适的溶剂，例如水-醇混合物，以对抗由磷酸盐的存在造成的干扰。

Description

用于测定生物流体和植物流体的抗氧化力的方法

发明领域

本发明涉及用于测定生物流体例如唾液、血清、血浆、尿液、汗液、眼泪，和来自植物例如水果和蔬菜的流体，和来源于其的饮料的抗氧化力的方法。所述方法已经被证明是在评价唾液的抗氧化力时特别地合适的，评价唾液的抗氧化力从分析观点呈现特别的复杂性。

本发明还涉及用于实施所述方法的试剂盒。

现有技术

当消耗食品、饮料或挥发性物质时，唾液是第一个与外部环境接触的生物流体。其外观是澄清的、略微地酸性的粘液浆液性类型的流体，其由主要的腺(腮腺、下颌下腺和舌下腺)的分泌物与龈沟液组合形成。

在24小时时期内产生的唾液的量从1至1.5升变化。在睡眠期间的唾液流量是实质上可忽略的，并且在醒着的时间在休息时其是平均0.3ml/min，而在刺激下其可以达到高至7ml/min。

唾液流量经受许多变化，并且实际上不仅观察到昼夜节律而且观察到季节性节律，其在夏季较低并且在冬季较高。流量还根据水合状态、年龄、性别(女性具有低于男性的基线分泌和被刺激的分泌二者[1])、光强度(在黑暗中具有30-40％的减少[2])和某些习惯例如吸烟(吸烟根据局部刺激增加分泌[2])和口香糖使用变化。

在休息时(因此不被食品和/或咀嚼刺激)各种唾液腺对总分泌的贡献是20％腮腺、65％下颌下腺和7-8％舌下腺。

然而在刺激期间，最主要的分泌清楚地是腮腺并且贡献分泌的约50％。

通常，唾液pH从6至7变化，然而，在减少的流量的条件下，pH被减少至5.3，而在增加的流量下其上升至7.8[1]。作为一般的规律，腮腺唾液具有淀粉酶、富含脯氨酸的蛋白质和凝集素的较高的含量，以及溶菌酶和糖蛋白的少的量。舌下腺和下颌下腺代替地特别地产生粘蛋白(MG1和MG2)和溶菌酶。

唾液主要地具有五个主要的功能，即：润滑和保护、缓冲和清除、牙齿完整性的保持、抗菌作用以及最终地香味的识别和消化。明显地，所有的这些功能不能够被分离地考虑而是形成一体的体系的一部分[3]，即唾液本身，其中这些功能中的一个是其抗氧化性作用。后者的功能取决于唾液流量和某些唾液组分的类型二者。

对于不同类型的分泌物，对水溶性的抗氧化剂的最大的贡献是来自腮腺，而其他的例如亲脂性的抗氧化剂大多数地来源于下颌下腺和舌下腺。总体地，大多数分泌的抗氧化剂是在本质上亲水的，而其他的类型贡献总抗氧化能力的小于10％[5]。

因此，在抗氧化剂的方面，唾液分泌物包含各种化合物和酶，其中最重要的是尿酸(UA)和过氧化物酶(POX)，二者都是水溶性的。

UA代表唾液抗氧化能力的约70％，而唾液中含有的另一水溶性的抗氧化剂，即抗坏血酸，表现为具有与UA相比的次要的或辅助性的重要性[5]。然而，抗坏血酸的在龈沟液中的浓度表现为达到血浆中的那些浓度的3倍[6]。在血浆和唾液UA之间具有相关性，预检(prevailing)血浆来源。

关于酶，最重要的是POX。然而，其他的酶也已经被分离，例如谷胱甘肽过氧化物酶(glu POx)和超氧化物歧化酶(SOD)[7]。这些后者是支持还原型谷胱甘肽(GSH)的产生、消耗和再生的酶，其是身体中最重要的抗氧化剂体系之一；其在实际上所有的流体中存在的所有的细胞中运行并且因此也在唾液中运行，虽然以有限的量。

在重量方面，POX代表总唾液蛋白质的仅0.01％，实质上具有两种过氧化物酶：实际的唾液过氧化物酶(POX)和髓过氧化物酶。该后者相似于在口腔的发炎区域中的淋巴细胞产生的乳过氧化物酶[8，9]。POX具有双重的作用：

a)被细菌和白细胞产生的H₂O₂水平的控制；

b)对于某些细菌特异性的抗菌作用。

H₂O₂是强有力的氧化剂(具有穿过任何细胞膜的能力)并且是在局部和在胃肠系统中都有毒的。实际上，其能够根据以下的反应氧化硫氰酸根离子(SCN^-，即被唾液腺分泌的氰化物[CN^-]的解毒产物)：

SCN^-+H₂O₂→HOSCN+H₂O

次硫氰酸

HOSCN和其共轭物OSCN^-具有很大的细胞毒性能力[9]，因为它们是具有抗菌作用的强有力的氧化剂[10]；它们通过氧化细菌的巯基基团抑制细菌的糖酵解。

总体上，POX、乳过氧化物酶和H₂O₂、和SCN^-的组合比单独的H₂O₂更强有力[9]，因为其可以在较宽的pH范围内起作用。

实际上，在酸性的环境中，被质子化的形式HOSCN是更活跃的(成为更亲脂性的)，而H₂O₂是在中性pH更活跃的[10]。不应被忽视的是以下事实，即在H₂O₂和OSCN^-之间的反应中，∑O₂(单线态氧)也被部分地产生，其也具有很大的氧化能力[11]。

另一个涉及H₂O₂的反应是与氯形成HClO(次氯酸)；该反应在中性粒细胞中在髓过氧化物酶的作用下发生并且是可以抵抗细菌群的杀菌机理中的一个。

然而，氧化过程可以是保护性的或有害的，并且因此必须被控制以最好地利用其保护性潜力。

从上文描述的，得出，唾液的抗氧化力来源于难以被评价的各种复杂的组分。但是，对它们的组合的活性的综合分析是在测定唾液防御能力上的重要的指标。

以下的表格1示出了在休息条件和刺激条件下的显著的唾液参数中的某些参数[7]，以与抗氧化剂保护相关。

表格1.休息时的和在刺激之后的唾液流量和与抗氧化力相关的某些唾液变量的值(平均值±SD)

变量	测量的单位	全唾液
			休息时的流量ml/min	ml/min	0.42±0.07
在刺激之后的流量		0.92^a±0.11
					[C] [T]*
休息时的POX mU/ml	mU/ml	284^a 120
			在刺激之后的POX		175 161

			休息时的SOD U/ml	U/ml	0.79 0.33
在刺激之后的SOD		0.82 0.74

休息时的尿酸(UA)	mg/dl	2.87^a 1.20
			在刺激之后的尿酸(UA)		1.15 1.06

			休息时的TAS	mM	0.68^a 0.28
在刺激之后的TAS		0.42 0.38

休息时的硫醇基团	μM	26.6^a 11
			在刺激之后的硫醇基团		19.1 18

*[C]浓度；[T]来源于唾液流量和浓度的乘积的总量；C的标准差未示出但是在[7]中可用；^aANOVA p＜0.05休息时的相对于在刺激之后的。TAS＝总抗氧化性状态。

值涉及年龄在18至54岁的19位表面上健康的受试者[7]。使用Carlson-Crittenden杯对于腮腺唾液收集唾液，而对于舌下腺和下颌下腺唾液使用温和的吸入。

使用被以30秒间隔逐滴地(1ml)施用于舌背部的2％柠檬酸溶液实现刺激。收集使用两个方法二者在几分钟内进行，但是未指定精确的时间段。

应注意，氧化平衡的条件被作为SOD(超氧化物歧化酶)、POX(过氧化物酶)、UA、TAS(总抗氧化性状态)表达，并且还最终被硫醇基团复合物(thiol group complex，即具有还原能力的硫氨基酸/肽/蛋白质组)表达。

还应注意在列的右侧的[T]值，即流量和浓度的乘积。该值不是作者给出的，而是通过合适地处理数据产生的，以从而允许正在发生的事的更完全的检验。

从T的该评价，得出，浓度在刺激时趋于减少(除了SOD)，但是所有的组分的总量趋于增加(POX增加34％，SOD增加124％，TAS增加36％，硫醇基团增加50％)，除了反而趋于减少的UA。

因此，似乎，唾液中的最主要的抗氧化剂不能够被作为浓度表达，而是应当被作为总量表达。此外，被作为TAS表达的总抗氧化力还应当被作为总能力而不作为浓度表达，以实现更精确的测量。

在另一个研究[5]中，对年龄在25和50岁之间的28位表面上健康的受试者(在表格2中示出)，唾液的抗氧化力通过评价TAS(总抗氧化性状态或总抗氧化性能力TAC或总抗氧化性活性TAA)被测定。在本实验中，以与之前的实验不同的方式在15分钟时期内收集唾液。对于休息时的收集，受试者简单地吐入容器中，而在被刺激的条件下，收集通过咀嚼1g的石蜡然后使受试者在15分钟内每2分钟吐入合适的容器中进行。

表格2.休息时的和在刺激之后的唾液流量和与抗氧化力相关的某些唾液变量的值(平均值±SD)

变量	测量的单位	值	总[T]*
				休息时的流量	ml/min	0.33±0.17
在刺激之后的流量		1.93±1.07

休息时的TAS	mM	0.25±0.06	0.08
				在刺激之后的TAS		0.14±0.04	0.28

				休息时的尿酸	mg/dl	3.68±0.64	1.21
在刺激之后的尿酸		1.75±0.36	3.40

休息时的白蛋白	μM	12±7	4.10
				在刺激之后的白蛋白		8±2	15.40

				休息时的抗坏血酸盐	μM	9±6	3.00
在刺激之后的抗坏血酸盐		9±4	17.00

*[T]浓度和流量的乘积

如在表格1的情况下，流量计算和浓度计算的乘积[T]以可与表格1中的值的那些单位相比较的单位给出。如同之前的研究，可以看到，刺激减少浓度但是增加总量。

所提出的另一个重要的要素被流量(休息的流量和被刺激的流量二者)的作为总量的负的或正的“放大器”起作用的差异代表。

在这方面，从0.42ml/min(表格1)至0.33ml/min(表格2)的流量减少[相应于约20％的减少]导致TAS的总量的从0.28mM(表格1)至0.08mM(表格2)的修改，相应于TAS的约70％的减少。差被与流量的刺激成比例地进一步放大；因为流量增加2倍，所以总TAS增加8倍。

从所示出的实施例得出，实际的TAS的估计应当对标准化的流量进行，这可能地被限制以避免过度的放大。

在同一个实验中，见以下的表格3，牙周病的某些案例被考虑，未概括其基本的疾病准则(具有温和的至中度的程度的牙周病的案例，具有差的口腔卫生)。

表格3.休息时的和在刺激之后的唾液流量和与抗氧化力相关的某些唾液变量的值(平均值±SD)

在7个案例(4位女性，3位男性，年龄在25至45岁之间)的具有牙周病(平均值±SD)的受试者

变量	测量的单位	值	总[T]
				休息时的流量	ml/min	0.34±0.17
在刺激之后的流量		1.33±0.58
				休息时的TAS	mM	0.30±0.01	0.10
在刺激之后的TAS		0.17±0.07	0.23
				休息时的尿酸	mg/dl	4.27±0.89	1.45
在刺激之后的尿酸		2.20±0.06	2.90
				休息时的白蛋白	μM	11.7±7.0	4.00
在刺激之后的白蛋白		9.3±2.8	12.40
				休息时的抗坏血酸盐	μM	6.4±3.6	2.10
在刺激之后的抗坏血酸盐		6.6±2.9	8.80

作者得到结论，即：

a)被牙周病影响的受试者的唾液具有与正常的受试者的抗氧化力相同的抗氧化力；

b)UA与唾液的抗氧化力良好地相关。

实际上，通过考虑T值并且将该值与表格1中的那些比较，可以看到：

i)在正常的受试者中的唾液刺激增加TAS 3.5倍，而在患有牙周病的受试者中增加是2.5倍(低70％)；

ii)在正常的受试者中的唾液刺激增加UA 2.8倍，而其在患有疾病的案例中增加仅2.0倍(低70％)；对于抗坏血酸盐可以是相同的(低70％)；对于白蛋白差异是低20％。

换句话说，在这些实验条件下，已经表明了精确地相反的事实，即被牙周病影响的受试者的抗氧化剂防御被减少，这是已经在最近被广泛地表明的事实[12]。

对唾液的抗氧化力的系统评价追溯到1990年代结束时，实际上借助于使用与用于血清或血浆的方法相同的方法[13，14，15]。

在很大程度上，这些方法集中于研究单一的组分，例如POX、UA、GSH、维生素，或研究氧化性加合物，例如异前列烷、TBARS(硫代巴比妥酸反应性物质)、MDA(丙二醛)和过氧化氢。

代替地评价抗氧化能力的整体的已知的方法具有三个不同的类型：分光光度法、化学发光和伏安法。

分光光度法与用于血液的测定的那些方法相同并且利用自由基型物质反应性的原理。

这些物质是极端地反应性的并且趋于立即地结合于捕获它们并且在它们的捕获之后改变颜色的受体。在待被评价的流体中含有的抗氧化剂(其具有还原力)将趋于将它们的电子给予至被故意地以已知的量加入样品中的自由基型物质；受体将因此不能够捕获它们。以这种方式，显色的程度将被减少。

通常的受体[5]是2，2′-次偶氮基双(3-乙基苯并二氢噻唑-6-磺酸)即ABTS，其在捕获自由基后被转化为自由基离子ABTS⁺，成为在颜色上青绿色的。读取在UV区域中进行，但是也在660nm、734nm和820nm处进行。一般地，高铁血红蛋白被用作可氧化的产物，并且H₂O₂被用作氧化产物。

两个产物在流体中的组合产生Fenton反应，并且形成的自由基(OH·)被ABTS捕获，ABTS被转化为ABTS⁺。

通常，在使用这种类型的反应时，参照具有已知的抗氧化力的标准溶液。最多地使用的体系是参照trolox，即参照维生素E的可溶的类似物，的体系。

因此，抗氧化潜力被作为TEAC表达(即Trolox当量抗氧化能力)；来源于本方法的值被称为，根据作者，TAC(总抗氧化能力)、或TAA(总抗氧化剂活性)或TAS(总抗氧化性状态)。反应性变量被部分地修改以改进方法，使得使用相同的方法获得的值经常是非常不同的，甚至在对照的情况下。

因此，比较仅对于在相同的实验条件下进行的实验是可靠的，即，来源于不同的实验室的数据是几乎不可比较的。

第二种方法是基于化学发光[13，15]。

HRP(辣根过氧化物酶)催化鲁米诺的使用H₂O₂的氧化。在加强光信号的对碘苯酚在反应中的存在下，反应产生的光被放大。

该信号可以被抗氧化剂的在流体中的存在减小，并且该减小保留，直到抗氧化剂被耗尽。抗氧化能力被使用已知的抗氧化剂的标准曲线参数化。

一个另外的方法，基于该同一个原理，利用在流体中存在的抗氧化剂抑制过氧化氢(其是氧化产物并且因此是氧化的间接指示物)与异鲁米诺/髓过氧化物酶之间的接触产生的发光的能力[14]。

取决于反应在其中被触发的流体，Fenton反应还可以触发化学发光刺激，这是由于在抗氧化剂存在时可以被还原的OH·自由基的形成[16]。然而，该方法被证明是几乎不可再现的，因为不同的实验室给出不同的结果，这些不同的结果是非常不可比较的，甚至在健康的个体上[13，15]。

第三类型是基于循环伏安法[17]，其对于低分子量抗氧化剂在唾液中的存在是灵敏的。待被评价的样品被置于含有三个电极的比色皿中；支持电极(碳)、参比电极(Ag/AgCl)和辅助电极(Pt)。恒定电势向参比电极的施加使电势(循环伏安图)能够被记录，其值是流体中含有的抗氧化剂供给电子的能力的函数。

然而，不是所有的抗氧化剂都能够以被参比电极可检测的量供给电子；因此，测量仅是部分的测量，使得必须有时依赖对于某些抗氧化剂(GSH型的)特异性的电极。

还已知的是FRAP(铁还原/抗氧化力)测试，其被Benzie和Strain(1999)第一次建立以用于测量血浆的还原力，然后适应于鉴定植物物种的抗氧化能力。该测试测量形成鲜蓝色产物的铁2，4，6-三吡啶基-s-三嗪(TPTZ)的还原(Guo等人，2003；Jimenez-Escrig等人，2001)。还原力与羟基化的程度和多酚中共轭的程度相关(Pulido等人，2000)。然而，FRAP测试不能够检测通过氢转移(自由基猝灭)起作用的化合物，例如硫醇和蛋白质。这导致结果的低估，特别是在血清中。此外，在FRAP测试中用于将铁保持在溶液中的强酸性的pH导致支配的反应机理的转移，因此暗示FRAP测试结果不可与抗氧化剂测试的其它的测量比较。FRAP在以下前提下建立，即氧化还原反应非常迅速地发生(在4至6分钟内)，但是实际上这不是在任何时间都发生的。这使该测试强烈地取决于为了分析所消耗的时间。

还已知的是BAP(生物抗氧化潜力)测试，其在血浆血清将铁离子还原至亚铁离子的能力的方面评价血浆血清的抗氧化力，并且借助于光度学检测合适的色原的颜色改变。

因此，在BAP测试中，待被分析的血清样品被溶解在通过将铁离子的源(FeCl₃，即三氯化铁)加入特定的色原(硫基化合物)中获得的被上色的溶液中。在简短的孵化(5分钟)之后，溶液脱色；被测试的血清的组分将还原初始地存在的并且导致在所考虑的时间间隔内形成被上色的络合物的铁离子的能力越强，该脱色将越明显。通过在光度学上评价该脱色的程度，可能的是，测量被还原的铁离子的量以及，简单地说，被测试的血清的相对于基准血清(被称为校准物)的还原力或抗氧化力。测试结果，即血清还原铁的“生理”抗氧化力，被以每升样品的抗氧化剂还原铁的毫当量表达，根据下式：

其中：

-[Abs]是在505nm测量的溶液的吸光度值；并且

-[校准物]是以毫当量/l表达的校准物浓度。

应记住，1ml的血清被认为是足以减少至少1.8μmol/l的维生素C，然后使用以下的换算表比较BAP测试的结果：

BAP测试具有被声明在1000至3000μmol/l之间是线性的。

然而，已经注意到，本测试，以及依赖于具有未知的起源和类型的所述校准物的使用，没有考虑待被分析的样品的组成复杂性，特别是在生物流体的情况下，其中存在干扰铁离子的还原，从而相对于其实际值改变和歪曲所得到的抗氧化力的测定，因此导致样品的实际的抗氧化性状态的不正确的评价的化合物。

根据上文关于对关于本内容的专门的文献的讨论所声明的，因此，本发明的目的是识别使生物流体和植物流体中的抗氧化力的水平能够被可靠地、可再现地、重复地和经济地评价的方法，以这种方式克服上文声明的关于已知的方法的缺点。

发明概述

上文提到的目的已经借助于包含至少一种无机锆盐和至少一种合适的溶剂的用于测定生物流体和植物流体的抗氧化力的试剂被实现，如在权利要求1中表示的。

本发明的另一个方面涉及用于测定生物流体和植物流体的抗氧化力的方法，如在权利要求6中表示的。

本发明的另一个方面涉及用于实施所述方法的试剂盒，如在权利要求17中表示的。

按照下文给出的详细描述以及为了例证和非限制性的目的提供的起作用的实施例，本发明的特征和优点将是明显的。

发明的详细描述

通过从支撑用于评价仅血浆的抗氧化力的BAP测试的原理开始，本发明的试剂和方法二者已经，如将在下文经常看到的，出乎意料地使不仅与所述BAP测试相关联的而且与上文提到的已知的技术的方法相关联的所有的已知的缺点能够被克服，同时实现绝对地非预期的另外的优点。

如已经提到的，从基于抑制硫氰酸根(SCN_-)和Fe³⁺之间的反应的能力的BAP测试开始，发明人已经首先研究所述测试的方法的有特色的特征，以收集关于后者能够提供的结果的信息。所述信息然后被用于与使用本发明的方法获得的结果比较，以证明其有效性和在所有的被考虑的方面的显著的改进。

如已知的，硫氰酸根(SCN^-)与Fe³⁺反应以生成硫氰酸铁络合物(Fe[(SCN)₆]^3-)；该络合物在颜色上是红棕色的并且被UV-Vis分光光度计在505nm的波长检测。在待被评价的流体样品内的还原性物质将Fe³⁺还原为Fe²⁺，从而将其从与硫氰酸根的反应除去并且因此修改了样品吸光度。

本发明的发明人已经出乎意料地发现，干扰铁离子还原，从而改变相对于其实际值的所得到的抗氧化力测定，并且因此实际上导致样品的实际抗氧化性状态的不正确测定的化合物是生物流体和植物流体样品中的磷酸盐。

具体地，发明人已经注意到，例如，唾液具有从1变化至超过50mg/100ml的磷酸盐含量，而在血清中量是2.6至4.5mg/100ml。因此，因为这些量的磷酸盐是绝对地不可忽略的，所以在使用BAP测试时的抗氧化力的完全地不精确的和不准确的测量从而产生实际的假阳性的潜在原因可以被理解。

为了尽可能可重复地和可再现地实现抗氧化力的测定，特别是如果待被分析的生物流体是唾液的话，产生的一个另外的问题是依照ml/min标准化唾液流量，因为，如上文描述的，抗氧化力以与流量本身不成正比地(indirectly proportional)变化。本发明的发明人已经出乎意料地发现，对于0.70ml/min至1.50ml/min的流量来说，用于评价抗氧化力的浓度不仅是可比较的而且是实际上匹配的，如将在下文的实施例2和实施例3中宽泛地解释和说明的。

本发明因此提供用于测定生物流体和植物流体的抗氧化力的试剂，包含至少一种无机锆盐和至少一种合适的溶剂。在这方面，所述试剂的使用使磷酸盐在生物流体和植物流体样品中的存在能够被掩蔽，从而有利地避免所述磷酸盐干扰抗氧化力测定同时将它们保持在溶液中，即避免将不利地导致专门的分离步骤的沉淀。该结果对于诊断目的来说是极端地重要的，特别是当待被分析的生物流体是唾液时，其中珐琅质的再矿化/去矿化的平衡可以生成(如所陈述的)甚至＞50mg/dl的磷酸盐量，与其相比BAP测试被证明是对于测定唾液的真实的抗氧化力来说完全地不可靠的，甚至将结果高估57％，如在实施例4中评价的。对于血清，平均磷酸盐量在正常的条件下不超出4.5mg/dl。尽管如此，通过BAP测定的总抗氧化力的值被高估33％，再次如在实施例4中评价的。

因此，如被本发明的发明人看到的和研究的，磷酸盐对Fe³⁺的掩蔽作用应当在每次关心流体的抗氧化力的测定时被考虑(也见FRAP测试[21])。从这一点，可以意识到，用于本发明的试剂的无机锆盐的选择是如何出人意料和有利的。

优选地，在所述试剂中，所述无机锆盐选自由氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、碳酸盐、硫酸盐、硝酸盐和其混合物组成的组。更优选地，所述无机锆盐选自由氟化物、氯化物、溴化物、碘化物和其混合物组成的组。

根据优选的实施方案，所述无机锆盐是ZrCl₄。

优选地，所述至少一种合适的溶剂是水-低级醇混合物，其中低级醇意指线型的或支链的(C₁-C₅)醇。更优选地，其是水-(C₁-C₃)醇混合物。根据优选的实施方案，所述溶剂是水-异丙醇混合物。

优选地，所述试剂还包含硫氰酸根，更优选地具有碱金属或碱土金属的硫氰酸根无机盐。

在另外的方面，本发明涉及所述试剂用于测定生物流体和植物流体的抗氧化力的用途，如也在给出的实施例中宽泛地说明的。

本发明的另一个方面涉及用于测定生物流体和植物流体的抗氧化力的方法，包括以下步骤：

a)提供硫氰酸根的醇溶液；

b)加入如上文描述的至少一种试剂；

c)加入铁盐水溶液；

d)测量由此获得的溶液的吸光度；

e)加入生物流体或植物流体样品；

f)测量含有样品的溶液的吸光度；

g)从在步骤f)的吸光度减去在步骤d)的吸光度；以及

h)将由此获得的吸光度值在维生素C的标准校准曲线上作图，并且根据朗伯-比尔定律获得作为维生素C当量的检测的流体的抗氧化力的值。

为了本发明的目的，术语“生物流体或植物流体”意指任何动物或植物源的流体，例如唾液、血清、血浆、尿液、眼泪、汗液、来源于水果、蔬菜、食品、白酒、啤酒、饮料、咖啡、茶的流体。优选地，所述生物流体是唾液、血清、血浆、尿液或眼泪。

已经出乎意料地和有利地观察到，通过使用上文描述的试剂，生物流体和植物流体的抗氧化力可以通过获取样品的吸光度以快速的、非常简单的、可重复的和可再现的方式被测定，因为磷酸盐导致的干扰被完全地和有效地排除。此外，本发明的方法有利地不需要另外的基准物，例如校准物，其在BAP测试中是基本的并且对于血清是必需的，尽管未知出处和类型。

优选地，所述校准曲线已经在UV-Vis分光光度计中预设置，所以自动地供应作为维生素C当量的所讨论的流体的抗氧化力的值(μmol/l)。实际上，如将在下文的实施例1A-1D中更宽泛地看到的，维生素C的校准曲线已经被证明是极端地稳定的，甚至在铁盐浓度的变化和/或锆盐浓度的变化之后。

优选地，所述铁盐选自由氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、碳酸盐、硫酸盐和硝酸盐组成的组。根据优选的实施方案，所述铁盐是硝酸盐。

优选地，试剂b)的所述无机锆盐和所述铁盐是以20∶1至5∶1的摩尔比率。更优选地，所述无机锆盐和所述铁盐是以15∶1至8∶1的摩尔比率。根据优选的实施方案，所述无机锆盐和所述铁盐以约10∶1的摩尔比率。

这些摩尔比率因此意味着锆相对于Fe³⁺离子过量，因为这显著地有助于使用锆盐有效地掩蔽磷酸盐的任务，以及将它们保持在溶液中和防止它们的沉淀，如也将在实施例6中看到的。

优选地，所述生物流体或植物流体的样品和在步骤c)之后获得的溶液是以1∶250至1∶50的体积比率。更优选地，所述生物流体或植物流体的样品和在步骤c)之后获得的溶液是以1∶180至1∶75的体积比率。甚至更优选地，所述生物流体或植物流体的样品和在步骤c)之后获得的溶液是以1∶120至1∶90的体积比率。

这些比率实际上被发现增加了体积强度测定直接地落入为维生素C的校准曲线设置的极限(500-6000μmol/l)内的概率，而不需要另外的稀释。

关于生物流体或植物流体样品的体积，因为分析在UV-Vis分光光度计中进行，所以适合于向比色皿中的引入的体积被考虑。在这点上，注意，对于唾液、眼泪和汗液来说，约5μl的体积是优选的，对于血液(血清或血浆)来说10μl，而对于尿液来说10μl，但是是在已经被去离子水1∶5稀释之后。

本发明的另一个方面涉及用于实施上文描述的方法的试剂盒，包括：

i)至少一种如上文描述的试剂；

ii)至少一种硫氰酸根醇溶液；

iii)至少一种铁盐的水溶液；以及

iv)图示性活页，包括用于实施抗氧化力测定的说明书。

有利的结果已经是显著地简化为了生物流体或植物流体的抗氧化力的测定所需要的组分，因为与BAP测试形成对比，本发明的试剂盒绝对地不包括校准物，即基准血清。实际上，因为本发明的方法直接地参照维生素C的校准曲线，所以对于血清或对于任何其他的流体都不需要基准样品，因此实现一系列的显著的优点，包括更好的可重复性、更好的可再现性、减少的成本和结果的优良的可靠性，如也将在下文的实施例中说明的，特别是实施例4和5。

优选地，所述i)至少一种试剂和所述ii)至少一种硫氰酸根醇溶液是单一的溶液(1)。

在优选的实施方案中，所述图示性活页还包括用于收集生物流体和植物流体样品的说明书。更优选地当所述生物流体是唾液时，用于样品收集的所述另外的说明书表示，所述收集在所述唾液流量是0.70至1.50ml/min的条件下进行。甚至更优选地，用于样品收集的所述另外的说明书表示，所述收集在所述唾液流量是1.00至1.30ml/min的条件下进行。在优选的实施方案中，所述唾液流量是约1.20ml/min。

应当理解，所有的被认为是对于本发明的方法优选的和有利的方面也被认为是相似地对于试剂盒和其用途优选的和有利的。

出于例证性的和非限制性的目的，在下文提供了本发明的起作用的实施例。

实施例

实施例1.根据本发明的用于测定唾液、血浆和尿液的抗氧化力的方法准备以下的组分：

通过合并氯化锆溶液和硫氰酸根醇溶液制备溶液(1)；然后将该溶液(1)引入用于分光光度法UV-Vis分析的比色皿中。然后加入溶液(2)，从而将颜色从透明转变为红褐色，其强度与存在的与硫氰酸根反应的Fe³⁺成比例。之后立即地，鉴定相应于被分光光度计测量的吸光度的最大峰值的波长，在这种情况下是505nm。

然后，将样品也加入比色皿中。在5分钟之后，重复吸光度读取。第一吸光度读数和第二吸光度读数之间的差使得能够借助于朗伯-比尔定律获得用维生素C的μmol/l表示的浓度，并且因此能够获得被测试的样品的抗氧化力。

在这方面，维生素C被用作用于校准方法的标准，因为其示出了在500至6000μmol/l之间的线性值，如在下文的实施例1A中说明的。对于浓度＞6000μmol/l来说，将样品使用去离子水合适地稀释，直到其值落入500至6000μmol/l的维生素C内。

实施例1A.本发明的方法的线性度

实施例1A的目标是说明本发明的方法的测定的在维生素C的值500至6000μmol/l之间的线性度，其被用作用于测定相关的流体的抗氧化力的基准。

首先，注意，如在实施例1中，溶液(1)和(2)在一起的最大吸光度值相应于7134±67.7μmol/l的浓度，具有CV＜1％(其中CV是变异系数)。该值通过从溶液(1)和(2)的共同的读数减去空白读数(即单独的溶液(1)的)被获得。

为了产生作为维生素C的标量量的函数的校准曲线，制备维生素C的不同的溶液，以从500μmol/l开始乘以乘数(2、4、8、10、12)的标量浓度，通过使用脱矿质水稀释维生素C在脱矿质水中的浓溶液(35.22mg/ml)获得。

对于每次稀释进行5次测定，测量使用不同的次序取得；对于一半的样品，使用逐渐增加的浓度(从500至6000μmol/l)，并且对于另一半，使用逐渐减小的浓度(从6000至500μmol/l)。所有的测量都在同一天期间在温度受控的条件(25℃)下进行。

通过在实际测定和期望值之间应用学生t检验在统计学上分析这些值；所有的数据都在表格4中给出。

表格4.对于不同的维生素C浓度的测定。5次测定的平均值±SD

*对于相互依存的实际数据相对于预期数据的t检验：p＞0.05

如可以从在表格4中给出的数据的分析看到的，校准曲线是完美地线性的，即在高至6000μmol/l的值时实际上是直线并且具有从3.0％至3.5％变化的CV。

实施例1B.铁盐量对维生素C校准曲线的影响的评价

本实施例被进行以说明，溶液(2)中的铁盐的不同的量不导致在测定维生素C的μmol/l值上的显著的改变。

为了该目的，对与实施例1A相同的样品进行测定，仅仅利用2000和4000μmol/l的标准维生素C浓度并且加入同一个Fe(NO₃)₃浓度的三个不同的体积，即25μl-30μl-35μl。

对数据计算方差分析(ANOVA)。

结果在表格5中示出。

表格5.对具有以不同的体积加入的Fe(NO₃)₃的两个维生素C浓度的测定。在5个样品上平均值±SD

Fe(NO₃)₃的体积	25μl	30μl	35μl	ANOVA
					2000μmol/l	2023±58.0	2020±65.7	2026±63.5	p＞0.05
4000μmol/l	4041±123.1	4036±129.0	4043±130.2	p＞0.05

本测试证实，当使用在25至35μl之间的体积的同一个浓度的Fe(NO₃)₃时，没有看到显著的偏差。

实施例1C.Zr盐对维生素C的校准曲线的可能的干扰的评价

本实施例被进行以说明无机Zr盐不干扰，即不改变，维生素C的校准曲线的线性度。

维生素C被用作具有两个不同的溶液(1)的比较样品：

-溶液(1)-AcZ，即含有以ZrCl₄的形式的Zr，以及

-溶液(1)-AsA，即没有Zr。

样品由在去离子水中的2000μmol/l维生素C溶液组成。将维生素C溶液连续地制备10次；对于每个维生素C样品，使用两个溶液(1)二者以紧接的次序进行测试。

将(1)-AcZ在溶液(1)AsZ之前评价五次并且在其之后评价5次。ZrCl₄浓度是47.2mmol/l并且被引入比色皿中的体积是5μl。

也对这些样品评价变异系数(％CV)。

对于相互依存的数据，使用的t检验比较数据，并且在表格6中示出。

表格6.在ZrCl₄的存在或不存在下对以2000μmol/l浓度的维生素C溶液的测定。平均值±SD.

Ns＝p＜0.05对于相互依存的数据的t检验

从以上的报告的数据得出，无机Zr盐的加入有利地不修改维生素C的校准曲线；此外，注意到无机Zr盐的存在便利地显著地减少％CV。

实施例1D.对人类生物流体的不同的样品的评价

通过使用不同量的不同生物流体样品评价本发明的方法。

为了该目的，检查来源于相同的10位受试者(他们全部是健康的志愿者)的尿液、唾液和眼泪的样品。

在咀嚼棉花之后将他们的唾液以＞1ml的量收集在塑料容器中；将尿液在外部以20ml的量收集在塑料容器中；在提取器机罩(extractor hood)下暴露于气体邻氯亚苄丙二腈短时间(3秒)之后将眼泪收集在微比色皿中。以100μl的最小的量收集眼泪。该最终的测定仅对5个案例进行(3位男性和2位女性)。

参与研究的志愿者的特征在下文给出(平均值±SD)：

变量	值
		年龄(岁)	23±1.7
性别	5位男性和5位女性

所有的样品在收集的当天被分析；案例的一半使用从5μl至10μl的次序评价，而另一半使用逆向的次序评价。

将尿液试样使用去离子水以1∶5的比率稀释。

结果在表格7中示出。

表格7.对生物流体的样品的测定。平均值±SD

*比较对于10μl的值与对于5μl的那些值乘以2的对于相互依存的数据的t检验；Ns＝p＞0.05

根据本发明的方法，样品的抗氧化力的测定因此通过读取吸光度并且在乘以6.500的因子之后借助于朗伯-比尔定律计算以μmol/l维生素C当量表示的相应的浓度来实现。

实施例2.标准化用作本发明的方法中的样品的唾液的量

当待分析的生物流体是唾液时，鉴于其分析的复杂性，考虑标准化其收集的合适性。首先，这种收集在使用牙膏和/或牙线和/或嗽口水的日常的口腔卫生措施之后进行。在所述卫生程序之后至少一小时收集唾液。

因此唾液通过在让受试者在舒适地就座下咀嚼以300±30mg的量的某些被合适地制备的亲水的棉花60秒时期时被收集。

受试者平均实现不多于60±2次咀嚼，没有在牙齿之间过度压缩棉花，而是在咀嚼期间使其在口腔内运动。

当咀嚼结束时，将棉花收集在合适的容器中，其重量被容器重量加上棉花的重量的总和(皮重)代表。在减去皮重之后，评价代表唾液流量/min的流体的程度。在本发明的方法的最优的条件下，所述流量是1.2±0.2ml/min。

如果所获得的量不在所述值的区域内，那么唾液收集必须在至少5分钟的间隔之后被重复，直到期望的量通过调整咀嚼被获得；即在低流量的情况下增加咀嚼或在高流量的情况下减少咀嚼。如果流量是非常低的(这是不经常的但是可能的事件)，那么相同的量的棉花可以被使用但是加入3％柠檬酸溶液的液滴(45μl)。以这种方式，几乎100％的具有唾液流量＜0.5ml/min的受试者能够将唾液流量增加至适合于评价的水平，即在0.70至1.5ml/min之间。

在唾液样品的离心之后的测定始终与未以800rpm离心的样品相同。因此，离心应该仅在唾液腐质在唾液中明显时是有用的。

鉴于以上的通过本发明的方法获得的结果，加之对于在唾液的特定的情况中的取样的方便，实现了方法的高可重复性和可再现性，如在下文的实施例3-6中说明的。

实施例3.唾液流量对根据本发明的方法的唾液抗氧化力的测定的影响

选择两个性别(5位男性和5位女性)的在形式上健康的10位受试者。在这方面，接纳准则要求他们是非吸烟者，不进行任何疗法，包括节育，也不正在摄入任何食品补充。

受试者必须从前一个晚上禁食并且被告知在测试之前的一整天避免过量的食品以及避免过度的体育锻炼。

测试在25℃的受控的温度进行。使受试者保持在休息条件下30分钟，然后评价唾液的流量和抗氧化力。

唾液流量的测量根据以下的方法进行。

就座的受试者必须咀嚼亲水的棉花的300±30mg的小方块。要求咀嚼棉花一分钟的时期，而不过度地将其在牙齿之间压缩，但是允许其在口内运动。要求约60次咀嚼/分钟的节奏被保持，允许唾液流入棉花中。

在一分钟结束时，将棉花从口腔移除并且收集在具有已知的重量的合适的塑料容器中。整体称重，并且减去容器皮重和棉花重量，提供唾液重量，并且因此测定其的流量。

在10分钟之后重复该评价，以获得对各个受试者产生唾液的能力的更精确的测定。

取决于唾液流量，受试者被要求修改咀嚼的数量和唾液的活化。如果流量低于0.70ml/min，那么受试者被要求增加咀嚼的数量和要求他们努力产生唾液。如果流量很大地高于1.50ml/min(例如高于3ml/min)，那么受试者被要求减少咀嚼。

如果唾液流量是过于低的，那么柠檬酸的溶液(45μl的3％水溶液)可以被加入以增加量，但是测试受试者中没有一个需要这样。

每个受试者经受三个空车(run-in)测试，其在实际测试开始之前的一天进行。

方案包括5个不同的唾液流量的评价，即：

-从0.3至0.60ml/min；

-从0.6至0.9ml/min；

-从0.91至1.3ml/min；

-从1.31至1.8ml/min；以及

-从1.81至2.5ml/min。

这种产生差别性的唾液流量的能力被认为是接纳准则：实际上，10位最终的受试者通过筛选15位受试者产生。被拒绝的案例是因为不足够的唾液生产(3位受试者)，或足够地刺激唾液流量的困难(2位受试者)，即流量不能够被修改至所需要的程度。

在空车之后，将测试对同一个受试者重复一天三次(1、3和5)，为了测定数据的可重复性的目的。

在评价的第一天的会话被命名为“流量1、2、3、4、5”，而在随后的天的那些被命名为流量6(在第三天)和流量7(在第五天)。

实际评价的第一天测试全部的五个唾液流量的抗氧化力，而在随后的天(第2天和第5天)的其他的两个测试仅评价被认为是对于测试理想的那些流量值(如将在下文看到的)，即在1至1.5ml/min之间。

总抗氧化力通过使用本发明的方法对唾液测定，从而在10μl的唾液的量上操作。

所有的数据通过计算平均值和离散参数(SD或标准差)被在统计学上分析，并且比较基于对于相互依存的数据的学生t检验以及对于正交对比的方差分析被进行。

结果

10位受试者的特征在下文给出：

变量	值
		性别	5位男性和5位女性
年龄(岁)	28±6.7
		体重(Kg)	67±10.5
身高(m)	1.68±0.083
		BMI*(kg/m²)	23.4±1.60

*BMI＝体重指数

所有的受试者成功地完成测试。在监测不同的流量的第一天期间的以μmol/ml的维生素C表示的唾液流量和相对浓度的测量在以下的表格8中给出。

还计算“流量×测试”的乘积，其是总氧化性能力(TC)的表达方式。所有的测量通过使用10μl进行并且值被作为μmol/l的维生素C表达。对数据的检验显示出，当平均流量范围在0.75ml/min至1.14ml/min的范围内时，测试值实际上匹配。低于0.70ml/min或高于1.50ml/min的流量在两种情形下以显著的方式(t检验p＜0.05)分别地显示出较高的或较低的浓度。因此，可以得到结论，即通过保持0.70ml/min至1.5ml/min的唾液流量，所得到的以μmol/l的维生素C表示的浓度的变化可忽略。

表格8.唾液的体积(ml/min)和以μmol/l的维生素C表示的浓度。平均值±SD.

^a对于相互依存的数据的t检验：p＜0.05，对于流量1相对于流量“n”

^b对于相互依存的数据的t检验：p＜0.05，测试3相对于测试4

^c对于相互依存的数据的t检验：p＜0.05，TC 1相对于TC“n”的比较

^dANOVA正交对比：p＜0.05，序列TC5＞TC4＞TC3

已经发现，在从1.10ml/min至1.44ml/min的中等流量(流量3、流量4)，总抗氧化能力的量增加。这进一步证实了以下的事实，即中度的流量是对于标准化唾液抗氧化力评价最优的。

在本实施例的内容中，唾液流量和相对的总抗氧化能力的评价被再测定两次，即在3天之后和5天之后(分别地，流量6和流量7)。

结果在表格9中示出，说明，在对于在第1、3和5天的被刺激的流量获取的值之间没有值得注意的显著的偏差(ANOVAp＞0.05)，从而证实本发明的方法的高可再现性。

表格9.在随后的天的在1ml/min至1.5ml/min之间的被刺激的唾液的值。平均值±SD.

实施例4.对唾液和血浆进行的本发明的方法和BAP测试之间的比较

在本实施例中，比较在本发明的方法和BAP测试之间进行，其如上文所述的仅仅为了评价血浆或血清的抗氧化力而设想和使用。

两个方法在来源于相同的受试者并且在相同的时间被收集的相同的样品上比较，从而使比较本身是尽可能一致的和有意义的。

选择12位受试者(6位男性和6位女性)，其中的十位与前一实施例的那些受试者相同。在被检查的案例中的一个中，取出足够的唾液和血液以能够在10次相继的测定之后测定变异系数(％CV)。

本比较在前一实施例的那些比较之后的时间时期内发生。

接纳准则与前一实施例的那些接纳准则相同。受试者的一般的特征在以下示出：

变量	值
		性别	6位男性和6位女性
年龄(岁)	29±6.2
		体重(Kg)	68±10.8
身高(m)	1.69±0.090
		BMI(kg/m²)	23.6±1.50

对于唾液收集，按照在实施例2中给出的方法。

两个测试，即BAP和本发明的方法，在相同的样品上相继地测定。再次使用相同的样品，还测定磷酸盐量，通过应用Dick和Tabatabai的方法[19]并且使用被减少至1ml的总样品体积[20]。对于所述测定，有时必需的(当量是1ml多一点点时)是，在两个刺激性的会话(被间隔开至少10分钟)上重复唾液收集。当这发生(仅2次机会)时，混合两次唾液收集。从肱静脉收集用于磷酸盐的评价的血液，将5ml的量采入管中，将管立即离心以进行血清的分离。对唾液和血清二者的测定，通过使用BAP和本发明的方法，在收集的上午期间进行。因为通过BAP和本发明的方法的测定在相同的样品上进行，所以直接比较具有最大的意义，其独立于所有的其他的变量。

处理所有的数据以计算平均值和SD值；为了评价两个类型的测试之间的差异，应用学生t检验。在各种值之间，还计算相关系数。

结果

所有的受试者都完成研究，BAP和本发明的方法的值与血液和唾液的磷酸盐含量共同地在表格10中示出。

应当注意，虽然两个方法都测量流体还原Fe³⁺的能力并且二者都以μmol/ml的维生素C表示，但是通过BAP测试，获得比本发明的方法高得多的值(平均地在唾液中57％并且在血清中30％)。

可以看到，在所有的案例中，BAP测定必须通过将样品体积从10μl减少至5μl被进行，因为在使用10μl时，获得值＞3000μmol/ml，其在所述BAP测试的所声明的线性度的上限。

表格10.健康的受试者中的唾液和血清的抗氧化力的通过BAP测试和本发明的方法的测定，与唾液和血清中的分别的初始的磷酸盐水平比较(平均值±SD)

在十个相继的测定中的％CV测量分别是对于唾液3.3％和对于血清2.9％[10次测定的平均值±SD是对于唾液3794±126.7和对于血清1513±44.0]。

关于相关性，这些表示血清磷酸盐和唾液磷酸盐之间的关系的存在。对于研究的目的最重要的值是在血清和唾液中的测定中的BAP和磷酸盐之间的直接的和显著的干扰的实验证据。

本发明的方法便利地未被观察到这种干扰，本发明的方法的结果是出人意料的并且有利的，独立于磷酸盐的存在，从而提供极端地可靠的抗氧化力值，这是因为对在所述方法中使用的组分的合适的选择。

该事实是对于诊断目的来说极端地重要的，特别是当待被分析的生物流体是唾液时，其中珐琅质的再矿化和去矿化之间的平衡可以生成甚至大于50mg/dl的磷酸盐水平，与其相比BAP已经被证明是在测定唾液的真实的抗氧化力上完全地不可靠的，实际上将结果高估57％。

对于血清，磷酸盐的平均量在正常的条件下不超出4.5mg/dl。但是，通过BAP测定的总抗氧化力的值被发现被高估甚至33％。

从上文明显的是，用于本发明的试剂的无机锆盐的选择是出人意料的和有利的。

实施例5.对尿液进行的本发明的方法和BAP测试之间的比较

与实施例4相似地，在本实施例中，对尿液进行在使用BAP测试可获得的结果和使用本发明的方法可获得的结果之间的比较。

为了该目标，采用与实施例4中相同的受试者。

尿液在13.30时收集；受试者被要求在上午7∶30排空膀胱。然后，在7.30时之后的所有的尿液必须被收集在合适的容器中并且被保持在冷冻器中。在12.30时，受试者将膀胱排空入收集容器中。以这种方式，获得在6小时时期内产生的尿液的量。

根据两个测试的对尿液的抗氧化力的测定通过将尿液样品以1∶5比率(1+4)稀释以及使用10μl的相对体积进行。

对尿液中的磷酸盐的评价通过应用与用于血浆和唾液的方法相同的方法被实现[19]。在一种情况下，10次相继的评价被对尿液样品进行，以根据本发明的方法测定尿液的抗氧化力的％CV。

对所有的数据计算平均值和离散参数，并且还测定来源于两个测试的尿磷酸盐浓度之间的相关性。

结果

所有的受试者都成功地完成在同一个分析实验室中的研究。

借助于两个测试的对尿液样品的分析被对被1∶5稀释的样品使用用于分析的10μl进行。在同一个下午，还进行磷酸盐分析。

结果在表格11中给出。

表格11.健康的受试者中的尿液的抗氧化力的通过BAP和本发明的方法的测定，相对于分别的初始的磷酸盐水平(平均值±SD)

	尿液	相关性	“r”	P
					体积(ml)	415±82.2
磷酸盐(mg/dl)	281±82.2
					本发明的方法(μmol/l)	1970±265.2	本发明的方法相对于磷酸盐	0.095	Ns
BAP(μmol/l)	4210±590.4	BAP相对于磷酸盐	0.706	＜0.05

通过研究数据，观察到，根据本发明的方法的值清楚地不同于BAP的值，并且BAP的平均值实际上超出本发明的方法的平均值110％，这是由于尿液中的高磷酸盐含量。实际上，再次在这种情况下，证实了磷酸盐对BAP测试的显著的干扰，如从BAP测试值和磷酸盐之间的相关性(r＝0.706，p＜0.05)推导出的。

然而，至于涉及本发明的方法时，出乎意料地和有利地证实的是，在对于抗氧化力发现的值和在样品中存在的磷酸盐的量之间不具有相关性。

本发明的方法对于尿液的％CV被证明是3.7％[从等于1820±66.7的平均值±SD推导出]。

实施例6.对根据本发明的方法的唾液的在其离心之前和之后的抗氧化力的评价

对于本实施例，评价常去某牙科诊所进行他们的例行检查的20位受试者(10位男性和10位女性)。

还包括具有假体的受试者，但是被牙周病影响的或患有牙齿脓肿的患者被排除。

唯一的要求是在观察期之前在吃早餐或午餐或任何食品或饮料之后预先使用牙膏和/或牙线清洁牙齿。

测试在同一天的10.00至19.00时之间的期间内进行。

被检查的受试者的一般的特征在以下给出：

变量	值
		性别	10位男性和10位女性
年龄(岁)	40±15.0
		体重(Kg)	70±8.1
身高(m)	1.68±0.091
		BMI(kg/m²)	24.9±2.61

唾液收集遵循在前述的实施例2中例证的方法。

将对于相互依存的数据的t检验应用于在离心之前和之后获得的值，以测定差异是否是统计学上显著的。对5μl的唾液进行测定并且将值乘以2。

结果在表格12中示出。

表格12.唾液的在离心之前和之后的抗氧化力的根据本发明的方法的测定(平均值±SD)

	值
		唾液的体积(ml)	1.1±0.20
在离心之前的测定(μmol/l)	2760±354.0
		在离心之后的测定(μmol/l)	2741±360.7

p＞0.05对于相互依存的数据的t检验

如从平均数据和统计分析得出的，在离心之前和之后获得的值之间不具有显著的差异，因为在本发明的方法中使用的组分，特别是锆盐，出乎意料地并且有利地不诱导磷酸盐的沉淀，而是有效地掩蔽它们的存在同时将它们保持在溶液中。

实施例7.在正常的受试者和被牙周病影响的那些受试者之间的比较中的TAS的评价

在本实施例中，通过比较表面上健康的受试者和被具有不同的临床程度的牙周病影响的那些受试者评价唾液抗氧化力的水平。

将100位受试者置于观察下，再分成每个具有50位受试者的两个组。

所有的受试者常去同一个牙齿诊疗所进行他们的牙齿卫生。

因此是可能的是，识别简单地进行每六个月一次(six monthly)的或每年的牙齿检查的那些受试者以及经受对于具有变化的程度的牙周病病理的治疗的那些受试者。

牙周病的水平使用1至4半定量尺度区分，由此1代表“轻微的”水平并且4代表“严重的”水平。严重性主要地从被疾病影响的牙弓象限(dental arch quadrant)的数量以及牙龈破环的程度(牙龈的收缩和牙龈的炎症)测定。

被牙周病影响的受试者还具有其他的相关联的病理，主要是高血压和/或脂代谢紊乱；患者只有在他们处于已经建立至少两个月的治疗的疗法控制下时才被准入。

对于表面上健康的受试者的接纳准则不允许任何其他的病理或目前的药理治疗或补充治疗。

所有的受试者从检验之前的晚上被禁食。受试者在正常的自主的卫生程序(使用牙膏刷牙)之后至少一小时以及在经受任何其他的牙齿检查之前被测试唾液抗氧化力。根据在实施例2中表示的方法在25℃的温度从舒适地就座的受试者收集唾液。

如果体积不是所要求的1至1.5ml的量，那么在至少10分钟的休息之后重复唾液收集。

对数据计算平均值和离散参数；此外，为了清楚地示出组之间的差异，应用学生t检验。此外，测定在本发明的方法的结果和牙周病的严重性之间的相关系数。

受试者的一般的特征在以下示出：

那些被牙周病影响的受试者被注意到比健康的受试者显著地年轻。

对唾液抗氧化力值、相对唾液流量和牙周病的程度的评价在表格13中给出。

表格13.健康的受试者和被牙周病影响的受试者之间的比较。平均值±SD。

变量	健康的受试者	具有牙周病的受试者	t检验
				牙周病指数	0	2.1±0.92
体积(ml/min)	1.21±0.17	1.17±0.15	Ns
				本发明的方法(μmol/l)	2032±332.1	1212±220.6	p＜0.05

已经发现，虽然唾液流量在被牙周病影响的受试者之间实际上没有显著的差异，但是对于这些被牙周病影响的受试者，唾液流量测试经常必须被重复，这是由于不足够的生产。

鉴于两个组之间的在年龄上的显著的差异，统计分析被对于年龄修正，但是唾液流量值的差异被发现是显著的，因为它们表明在被牙周病影响的受试者中唾液的抗氧化力被减少。

此外，注意到，在牙周病的严重性和相关的唾液的抗氧化力值之间的成反比例的相关性(“r”-0.544p＜0.05)。这证实了实验证据，如上文参照表格3示出和评论的。

实施例8.根据本发明的方法对某些食品和饮料的抗氧化力的评价

本发明的方法被用于测定可以含有不同的量的磷酸盐的一系列的食品和饮料的抗氧化力。

对于每个产品，检查不同来源的5个批次，并且在收集的同一天并且然后在随后的天同时间地进行对所有的样品的评价。

结果在表格14中给出。

表格14.饮料和食品的抗氧化力的测定

^aVerdello柠檬[类型：—原产地意大利Cat.II尺寸代码4/5]

^b红橙[类型：Mariarosa——原产地意大利Cat.I尺寸代码6]

^c用于制浆的番茄[原产地意大利]

^d蓝莓[类型：Vitalberry——原产地智利Cat.I]

^e树莓[类型：Natberry Maroc——原产地摩洛哥Cat.I]

^f古典基安蒂[生产商：Cecchi——原产地意大利]

^gSoave Cadis[生产商：Cantina di Soave——原产地意大利]

^hRose`Salento[生产商：Al Tralcio Antico——原产地意大利]

ⁱ茶色波特酒[生产商：Offley——原产地葡萄牙]

^lDreher[生产商：Dreher——原产地意大利]

^m黑比诺格拉巴酒[生产商：La Versa——原产地意大利]

ⁿFundador[生产商：Pedro Domecq——原产地西班牙]

^oNespresso[类型：Roma——原产地意大利]

[类型：Earl Grey——原产地英国]

咖啡使用Nespresso自动机器制备，具有Caffe`Roma类型品质。5种不同的咖啡以30ml的量制备。

对于茶，使用茶包[经典伯爵茶]；通过将一个茶包浸渍在150ml的在已经沸腾之后2分钟时被使用的水中3分钟制备样品。

将代表任何水果和蔬菜的水果和番茄均质化并且使用去离子水以1∶5比率稀释。然后将所有的样品以800rpm离心2分钟，并且进行对10μl的上清液的测定。

如果测定已经超出6000μmol/l(例如对于咖啡和柠檬)，那么使用5μl重复测量并且将值乘以2。

表格14还示出了食品部分的总抗氧化力的值。从这些数据出乎意料地得出的是，白酒(Soave)和玫瑰葡萄酒(Salento)的抗氧化值没有与红酒(Chianti)的抗氧化值显著地不同。在被分析的食品中，橙子、咖啡和柠檬是具有最高的抗氧化力的那些。

从详细描述和以上给出的实施例，证实了借助于本发明的试剂和方法实现的优点。特别地，所述试剂使磷酸盐在生物流体和植物流体的样品中的存在能够被掩蔽，从而有利地避免所述磷酸盐干扰抗氧化力测定同时将它们保持在溶液中，即避免它们将不利地导致专门的分离步骤的沉淀。所述优点在实施本方法的实践性和成本有效性的方面是特别地有价值的。所述本发明的方法，也借助于包括所述试剂的试剂盒，使生物流体和植物流体中的抗氧化力能够以可靠的、可再现的、可重复的和在经济上方便的方式被评价，从而克服已知的方法的上文注意到的缺点以及特别地对于BAP测试注意到的缺点。

书目参考文献

1)Percival RS，Challacombe SJ，Marsh PD.Flow rates of resting wholeand stimulated parotid saliva in relation to age and gender.J Dent Res.1994；73：1416-1420.

2)Del Vigna de Almeda P，Trindade Grècio A，Naval Machado A et al.Saliva composition and functions：a comprehensive review.J Cont Dent Pract.2008；9：1-11.

3)Humphrey SP，Williamson RT.A review of saliva：normalcomposition，flow，and function.J Prost Den 2001；85：162-169.

4)Battino M，Ferreiro MS，Gallardo I et al.The antioxidant capacity ofsaliva.J Clin Periodontol 2002；29：189-194.

5)Moore S，K AC Calder，Miller NJ，C A Rice-Evans.Antioxidantactivity of saliva and periodontal disease.Free Rad Res 1994；21：417-425.

6)Meyle J，Kapitza K.Assay of ascorbic acid in human crevicular fluidfrom clinically healthy gingival sites by high-performance liquidchromatography.Arch Oral Biol 1990；35：319-323.

7)Nagler RM，Klein I，Zarhevsky N et al.Characterization of thedifferentiated antioxidant profile in human saliva.Free Rad Biol Med2002；32：268-277.

8)Iwamoto Y，Nakamura R，Watanabe T，Tsunemitsu A.Heterogenity ofperoxidase related to antibacterial activity in human parotid saliva.J Dent Res1972；51：503-508.

9)Thomas EL，Milligan TW，Joyher RE，Jefferson MM.Antibacterialactivity of hydrogen peroxide and the lactoperoxidase-hydrogenperoxide-thiocyanate system against oral streptococci.Infect Immunl994；62：529-535.

10)Grisham MB，Ryan EM.Cytotoxic properties of salivary gland.Am JPhysiol 1990；258：C115-C121.

11)Kou F，Takahama U.Hydrogen peroxide-induced luminescence andevolution of molecular oxygen saliva.Arch Oral Biol 1995；40：15-21.

12)Borges I，Machado-Moreira EA，Filho DW et al.Proinflammatoryand oxidative stress markers in patients with periodontal disease.Med Inflamm2007；ID 45794：1-5

13)Huang D，Ou B，Prior RL.The chemistry behind antioxidant capacityassays.Agr Food Chem 2005；53：1841-1856.

14)LM，Segundo MA，Reis S，Lima JLFC.Methodologicalaspects about in vitro evaluation of antioxidant properties.Anal Acta2008；613：1-19.

15)Hirayama O，Tagaki M，Hukumoto K，Katoh S.Evaluation ofantioxidant activity by chemiluminescence.Anal Biochem 1997；247：237-241.

16)Hirayama O，Yida M.Evaluation of hydroxyl radical-scavengingability by chemiluminescence.Anal Biochem 1997；251：297-299.

17)Kohen R，Beit-Yannai E，Berry EM，Tirosh O.Overall low molecularweight antioxidant activity of biological fluids and tissues by cyclicvoltammetry.Method Enzymol 1999；300：285-296.

18)Celi P，Sullivan M，Evans D.The stability of the reactive oxygenmetabolites(d-ROMs)and biological antioxidant potential(BAP)tests onstored horse blood，Vet J 2010；183：217-218.

19)Dick WA，Tabatabai MA.Determination of Orthophosphates inaqueous solutions containing labile organic and inorganic phosphoruscompounds.J Environ Qual 1977；6：82-85.

20)He Z，Griffin T，Honeycutt CW.Phosphorus distribution in dairymanures.J Environ Qual 2004；33：1528-1534.

21)Benzie IFF，Strain JJ.The ferric reducing ability of plasma(FRAP)as a measure of“antioxidant power”：The FRAP assay.Anal Biochem1996；239：70-76.

22)Composizione degli alimenti-Aggiornamento 2000 Istituto Nazionaledi Ricerca per gli Alimenti e la Nutrizione Ed EDRA Medical Publishing&New Media.

Claims

1.试剂用于测定生物流体的抗氧化力的用途，所述试剂包含至少一种无机锆盐和至少一种溶剂，所述至少一种溶剂是水-低级醇混合物。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述无机锆盐选自由氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、碳酸盐、硫酸盐、硝酸盐和其混合物组成的组。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述无机锆盐选自由氟化物、氯化物、溴化物、碘化物和其混合物组成的组。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述无机锆盐是ZrCl₄。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述低级醇是直链的或支链的C₁-C₃醇。

6.用于测定生物流体的抗氧化力的方法，包括以下步骤：

a)提供硫氰酸根醇溶液；

b)加入至少在权利要求1中所用的所述试剂；

c)加入铁盐水溶液；

d)测量由此获得的溶液的吸光度；

e)加入生物流体的样品；

f)测量含有所述样品的溶液的吸光度；

g)从在步骤f)的吸光度减去在步骤d)的吸光度；以及

h)将由此获得的吸光度值在维生素C的标准校准曲线上作图，并且根据朗伯-比尔定律获得作为维生素C当量的检测的所述流体的抗氧化力的值。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述铁盐选自由氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、碳酸盐、硫酸盐和硝酸盐组成的组。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述铁盐是硝酸盐。

9.根据权利要求6所述的方法，其中步骤b)的权利要求1的试剂的无机锆盐和步骤c)的铁盐是以20:1至5:1的摩尔比率。

10.根据权利要求6所述的方法，其中所述生物流体样品和在步骤c)之后获得的溶液是以1:250至1:50的体积比率。

11.根据权利要求6所述的方法，其中所述生物流体是唾液、血清、血浆、尿液、眼泪、汗液、或来源于食品的流体。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述食品为水果、蔬菜或饮料。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述饮料为白酒、啤酒、咖啡或茶。

14.一种用于实施根据权利要求6所述的方法的试剂盒，包括

i)至少在权利要求1中所用的所述试剂；

ii)至少一种硫氰酸根醇溶液；

iii)至少一种铁盐水溶液；以及

iv)图示性活页，包括用于实施抗氧化力的测定的说明书。

15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述i)至少在权利要求1中所用的所述试剂和所述ii)至少一种硫氰酸根醇溶液被合并成一个单一的溶液。

16.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述图示性活页还包括用于收集所述生物流体样品的说明书。

17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中当所述生物流体是唾液时，用于样品收集的所述说明书陈述了所述收集在0.70至1.50ml/min的唾液流量的条件下进行。