ES2576302T3 - Un dispositivo para medir ópticamente la fluorescencia de ácidos nucleicos en muestras de ensayo y uso del dispositivo - Google Patents

Un dispositivo para medir ópticamente la fluorescencia de ácidos nucleicos en muestras de ensayo y uso del dispositivo Download PDF

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Abstract

Dispositivo para medir ópticamente la fluorescencia de muestras de ensayo (14) que comprende: - una pluralidad de tubos de muestra (16) verticales fabricados de material transparente, que tienen una pared lateral (20), un extremo inferior (22) y que contienen una de las muestras de ensayo (14), - una pluralidad de pocillos de muestra (32) verticales, cada uno de los cuales es para recibir uno de los tubos de muestra (16) verticales, - al menos una fuente de luz de excitación (24; 74, 76, 78, 80) para dirigir un haz de luz de excitación a través de la pared lateral (20) de un tubo de muestra (16) al interior de la muestra de ensayo (14), y - un detector de fluorescencia óptico (28) para capturar la fluorescencia emitida por la muestra de ensayo (14) al excitarla, en el que - las muestras de ensayo (14) contienen ácidos nucleicos y una pluralidad de colorantes fluorescentes, - el dispositivo comprende una pluralidad de fuentes de luz de excitación (74, 76, 78, 80), dispuestas alrededor de cada pocillo de muestra (32), estando cada fuente de luz de excitación (74, 76, 78, 80) dispuesta cerca del pocillo de muestra (32) asociado para excitar un colorante en la muestra de ensayo (14) del pocillo de muestra (32); - el haz de luz de excitación de cada una de la pluralidad de fuentes de luz de excitación (74, 76, 78, 80) tiene un espectro de longitudes de onda diferentes para excitar uno de la pluralidad de colorantes fluorescentes; - el dispositivo comprende una pluralidad de detectores de fluorescencia ópticos (28), - debajo del extremo inferior (22) de cada tubo de muestra (16) está situado uno de los detectores de fluorescencia (28) para capturar la fluorescencia emitida por el colorante de la muestra de ensayo (14) al excitarla , - el eje del tubo de muestra (16) alojado en el pocillo de muestra (32) está alineado con el detector de fluorescencia (28), caracterizado por que - cada pocillo de muestra (32) está provisto de un único bloque termoconductor (86), - cada bloque termoconductor (86) está insertado en un orificio pasante de un bloque óptico (84), - el bloque óptico (84) está provisto de orificios pasantes (88) horizontales, - cada orificio pasante (88) aloja una de la pluralidad de fuentes de luz de excitación (74, 76, 78, 80) que están situadas alrededor de cada pocillo de muestra (32) y - cada orificio pasante (88) está alineado con el correspondiente orificio del bloque termoconductor (86) que se abre hacia el pocillo de muestra (32).

Description

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DESCRIPCION
Un dispositivo para medir opticamente la fluorescencia de acidos nucleicos en muestras de ensayo y uso del dispositivo
La presente invencion se refiere a la medicion de la fluorescencia de muestras de ensayo. Espedficamente, la presente invencion se dirige a un dispositivo para medir opticamente la fluorescencia de muestras de ensayo de acuerdo con la reivindicacion 1. Mas espedficamente, la invencion se refiere a la medicion de la fluorescencia de acidos nucleicos en muestras de ensayo.
Estado de la tecnica
La PCR (reaccion en cadena de la polimerasa) convencional es muy conocida en la tecnica, y se utiliza para amplificar una secuencia de ADN diana, sin embargo, tambien se puede utilizar para amplificar el ARN. Con la PCR convencional, la secuencia amplificada de ADN se detecta al final de la reaccion en cadena usando geles de agarosa. Como alternativa, se pueden utilizar diferentes metodos basados en colorantes fluorescentes, donde la deteccion y/o cuantificacion de la secuencia de ADN amplificada en una muestra de ensayo se puede realizar por medicion optica de la fluorescencia durante la reaccion en tiempo real. En otras palabras, la secuencia de ADN amplificada en la muestra de ensayo se mide en cada ciclo de la PCR. Esta forma de la PCR se conoce como PCR cuantitativa PCR (QPCR) o PCR en tiempo real. Los ejemplos de colorantes fluorescentes que se usan en estos metodos son Sybr Green, EvaGreen o sondas de ADN que contienen fluoroforos de tipo FRET, tales como TaqMan. Estos colorantes se suelen intercalar o enlazar exclusivamente con el ADN bicatenario (ADNbc), es decir, el producto del ciclo de la PCR, que produce la fluorescencia del colorante. Durante la reaccion, un aumento en el producto de ADN conduce, por tanto, a un aumento en la intensidad de la fluorescencia en cada ciclo. Este aumento se puede medir con un detector de fluorescencia, permitiendo de esta forma cuantificar las concentraciones de ADN por comparacion con una dilucion de muestra patron. Los datos de la medicion obtenidos se pueden representar graficamente frente al numero de ciclos en una escala logaritmica y se pueden analizar con un programa informatico para determinar la cuantificacion absoluta o relativa del ADN amplificado. La PCR en tiempo real tambien se puede aplicar a la deteccion y cuantificacion de ADN en muestras para determinar la presencia y abundancia de una secuencia de ADN particular en dichas muestras.
Metodos similares basados en colorantes fluorescentes se pueden aplicar al analisis de la curva de fusion (MCA, por las siglas en ingles Melting Curve Analysis), que es una evaluacion de las caracteristicas de disociacion del ADN bicatenario durante el calentamiento, es decir, una medicion de la disociacion del ADN amplificado frente a la temperatura.
Los dispositivos para realizar la PCR se conocen como termocicladores, y los dispositivos para llevar a cabo la medicion optica de la fluorescencia del ADN en muestras de ensayo durante la PCR cualitativa en tiempo real o en el analisis de la curva de fusion se denominan cicladores termicos "de tipo optico".
Estos cicladores termicos "de tipo optico" comprenden medios para calentar y enfriar alternativamente las muestras de ensayo durante los ciclos de PCR cualitativa/en tiempo real o para calentar las muestras de ensayo durante el analisis de la curva de fusion, respectivamente, junto con al menos una fuente de luz de excitacion para excitar el colorante fluorescente de las muestras de ensayo, y al menos un detector de fluorescencia optico para medir la fluorescencia emitida por el colorante tras la excitacion. Los medios para calentar y enfriar las muestras de ensayo pueden comprender dispositivos Peltier para facilitar los cambios rapidos de temperatura de las muestras de ensayo. Como en el caso de los cicladores termicos convencionales, se utilizan tapas calentadas para minimizar la evaporation de las muestras durante el proceso de ciclado termico.
En los cicladores termicos de tipo optico actuales para su uso con los tubos de muestra de plastico convencionales, por ejemplo, los tubos de muestra para microcentrifuga de plastico convencionales utilizados normalmente para el analisis de ADN, tanto las fuentes de luz de excitacion como los detectores de fluorescencia opticos se disponen por encima de los pocillos para tubos de muestra en una tapa articulada del dispositivo. En estos cicladores, la excitacion del colorante y la deteccion de la fluorescencia se llevan a cabo a traves de la parte superior abierta de los tubos de muestra. Sin embargo, cuando se utiliza una tapa calentada, la tapa debe estar perforada o ser parcialmente transparente para permitir el paso de la luz de excitacion y de la fluorescencia, lo que anade complejidad al dispositivo. Adicionalmente, esta configuration adolece de lo que se denomina variation en el alineamiento optico, es decir, desviaciones en la position de las fuentes de luz de excitacion y los detectores de fluorescencia opticos con respecto a los pocillos de muestra o tubos de muestra, que se pueden ocasionar, por ejemplo, por tolerancias de la tapa movil.
Las variaciones en el alineamiento optico son habituales en los termocicladores que tienen componentes moviles para colocar la fuente de luz de excitacion o el sistema detector optico o ambos por encima de los pocillos de muestra que contienen los tubos de muestra abiertos. Se divulga un ciclador termico de ese tipo, por ejemplo, en el documento WO 2010/118541 A1, donde las unidades opticas que comprenden una fuente de luz de excitacion y un detector giran con respecto a las camaras de muestra, conteniendo cada una de ellas una muestra. Las variaciones
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en el alineamiento optico tambien son habituales en los cicladores termicos que tienen una bandeja movil motorizada para desplazar los tubos de muestra dentro y fuera de una posicion de tratamiento y medida.
Algunos de los cicladores termicos de tipo optico de la tecnica anterior requieren la colocacion de las muestras de ensayo en camaras para muestras especificas personalizadas y no permiten la medicion de las muestras de ensayo en los tubos de ensayo habituales, por ejemplo, los tubos de muestra convencionales de plastico para microcentrifuga utilizados en el analisis de ADN.
El documento US 6 515 743 81 divulga un dispositivo de tipo escaner de acuerdo con el preambulo de la reivindicacion 1 para la medicion del producto de una reaccion fluorescente producido mediante reaccion enzimatica. El dispositivo comprende una pluralidad de pocillos de muestra, para recibir un tubo de muestra vertical hecho de un material transparente y que contiene una muestra de ensayo. Los pocillos de muestra estan dispuestos en un arco circular que tiene una unidad de transmision para hacer girar el arco y desplazar sucesivamente los pocillos de muestra en las proximidades de una unica fuente de luz de excitacion. La fuente de luz de excitacion dirige un haz de luz de excitacion a traves de la pared lateral de uno de los tubos de muestra. El dispositivo comprende ademas al menos un detector de fluorescencia optico para capturar la fluorescencia emitida desde uno de los tubos de muestra a traves del fondo del tubo de muestra. Una ruta optica entre la parte inferior del tubo de muestra y el detector de fluorescencia comprende una guia de luz que tiene un extremo emisor situado en el centro del eje de rotacion del arco circular.
El documento WO 2008/116186 A1 divulga un dispositivo para realizar un seguimiento de reacciones bioquimicas isotermicas, por ejemplo, la amplificacion de acidos nucleicos o el crecimiento de celulas, tales como en una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) usando ciclado termico. El dispositivo comprende un subsistema de excitacion que incluye una primera y una segunda pluralidad de, por ejemplo, fuentes de excitacion LED. Cada una de la primera/segunda pluralidad de fuentes de excitacion esta colocada para dirigir la energia electromagnetica hacia al menos una porcion del respectivo soporte de muestra 16, que esta alojado en el respectivo receptaculo del receptor. El subsistema detector comprende detectores, cada uno de ellos colocado para detectar la energia electromagnetica emitida por la muestra de un soporte de muestra que esta alojado en el respectivo receptaculo del receptor. Los detectores estan colocados en la cara inferior del receptor para recibir la fluorescencia ya que el receptor es un bloque de elevada masa termica.
Descripcion detallada de la invencion
Un objetivo de la invencion es proporcionar un dispositivo y un uso del dispositivo para medir opticamente la fluorescencia de acidos nucleicos en muestras de ensayo que pueden evitar las variaciones en el alineamiento optico. Otro objetivo de la invencion es proporcionar un dispositivo y un uso del dispositivo para medir opticamente la fluorescencia de acidos nucleicos en muestras de ensayo que permiten el uso de tubos de muestra convencionales, en particular tubos de microcentrifuga convencionales. Es un objetivo adicional de la invencion proporcionar un dispositivo para medir opticamente la fluorescencia de acidos nucleicos en muestras de ensayo de tal forma que ni la excitacion ni la deteccion de la fluorescencia se realice por encima de la muestra de ensayo, facilitando de esta forma el acceso a los pocillos de muestra, eliminando el requisito de perforaciones o ventanas transparentes en la tapa para permitir la transmision optica, y el potencial de utilizar otros medios que no sean una tapa calentada para evitar la evaporacion de las muestras.
Para conseguir estos objetivos, la presente invencion proporciona un dispositivo para medir opticamente la fluorescencia de los acidos nucleicos, preferentemente ADN, en muestras de ensayo de acuerdo con la reivindicacion 1. Adicionalmente, tambien se divulga el uso del dispositivo para PCR cualitativa/tiempo real y/o para el analisis de la curva de fusion.
Con el dispositivo de acuerdo con la invencion es posible localizar la fuente de luz de excitacion, el pocillo de muestra y el detector de fluorescencia en una pieza unitaria del dispositivo de forma que se puede evitar cualquier posible movimiento relativo entre si y, por tanto, cualquier variacion en el alineamiento optico. Por tanto, se puede garantizar completamente el alineamiento optico.
Sorprendentemente, se posible utilizar tubos de muestra convencionales o personalizados con el dispositivo de acuerdo con la invencion, en particular tubos de microcentrifuga convencionales, no suelen estar fabricados de polietileno transparente o translucido. El polietileno transparente tiene una transmitancia de luz, o claridad, inferior al 90 %, principalmente aproximadamente un 80 % y, por tanto, no se considera un material de "calidad optica" como se considera necesario para las mediciones opticas de fluorescencia.
Ademas, el dispositivo de acuerdo con la invencion puede facilitar el acceso a los tubos de muestra en los pocillos de muestra mediante una tapa, articulada o de otra forma, que debe estar en la forma de una placa metalica convencional ya que no se requieren perforaciones ni ventanas transparentes en la tapa. Ventajosamente, la tapa aplica una presion a los tapones de los tubos de muestra para mantener los tapones cerrados y los tubos de muestra en buen contacto termico con las paredes de los pocillos de muestra durante el ciclado termico. Preferentemente, la tapa puede estar provista de un calentador por resistencia, sencillo y asequible que se puede
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utilizar para calentar el aire que esta por encima de los tubos de muestra, minimizando de esta forma la condensation de la muestra en la parte superior o en el tapon del tubo. Cuando se prefiere dejar los tubos de muestra abiertos durante el ciclado termico, se puede anadir un aceite o una cera en la parte superior de las muestras para evitar la evaporation. Puesto que no existe necesidad de transmision de luz a traves de la capa superior de aceite o grasa, esta puede ser opaca o temporalmente opaca, por ejemplo, cuando solidifica durante los ciclos de enfriado.
Cuando se compara con los termocicladores de piezas moviles, como el del documento WO 2010/118541 A1, no existe retraso en el tiempo de medida asociado con el desplazamiento mecanico de las piezas entre si.
En el contexto de la presente invention, se entiende que el termino "tubo de muestra" se refiere a un recipiente alargado generalmente tubular o vial utilizado para someter a ensayo muestras de ADN o de ARN. No es necesario que los tubos de muestra sean cilindricos, sino que pueden ser algo conicos en su longitud completa o a lo largo de una parte del mismo.
Como ya se ha mencionado anteriormente, sorprendentemente, la configuration optica del dispositivo de acuerdo con la invencion permite el uso de tubos de muestra convencionales, en particular tubos de microcentrifuga convencionales. Sin embargo, incluso cuando no se requiere fabricar los tubos de muestra a partir de un material de calidad optica, puede ser ventajoso utilizar un material claro transparente con una transmitancia de luz de mas de un 90 % en la fabrication de los tubos de muestra para mejorar la cantidad de luz fluorescente que incide sobre el detector fluorescente en un momento dado, es decir, el rendimiento del detector. Dado que los tubos de muestra son meros consumibles, estan fabricados de material plastico. Preferentemente, se fabrican mediante moldeo por inyeccion a partir de un material termoplastico. Un material termoplastico preferido con una elevada transmitancia de claridad para la fabricacion de tubos de muestra para el dispositivo de acuerdo con la invencion puede ser el poli(tereftalato de etileno) (PET) debido a su excelente transmitancia de luz y su coste relativamente asequible.
De manera mas preferida, pero no necesariamente, los tubos de muestra son tubos de microcentrifuga con una forma normalizada que es adecuada para el dispositivo de acuerdo con la presente invencion. Sin embargo, para potenciar la transmitancia de la pared inferior en los extremos inferiores cerrados de los tubos de muestra que estan frente a los detectores de fluorescencia, los tubos de muestra pueden estar provistos de un fondo plano en lugar del fondo redondeado convexo de los tubos de microcentrifuga convencionales. Los tubos de muestra tienen un volumen que es, preferentemente, inferior a 1 ml y puede ser de 0,2 o 0,5 ml.
De acuerdo con una realization adicionalmente preferida de la invencion, la forma de la section transversal de los pocillos de muestra para recibir los tubos de muestra verticales esta adaptada a la forma de la seccion transversal de los tubos de muestra. Debido a ello, es posible por una parte evitar variaciones en la medida de un ensayo a otro, o de muestra a muestra, porque los tubos de ensayo estan firmemente sujetos en una position definitiva con respecto a la fuente de excitation y el detector de fluorescencia, preferentemente en una posicion donde los tubos de muestra estan centrados en el interior de los pocillos de muestra de tal forma que cada eje de los tubos de muestra esta alineado con los detectores de fluorescencia situados bajo sus extremos inferiores. El centrado de los tubos de muestra en el interior de los pocillos de muestra contribuye a un rendimiento maximo de los detectores de fluorescencia. Por otra parte, la transferencia termica desde las paredes de los pocillos de muestra a los tubos de muestra se puede potenciar para poder calentar mas rapidamente las muestras de ensayo en los tubos de muestra.
Ventajosamente, cada fuente de luz de excitacion es un LED que emite luz de un espectro de longitud de onda especifica incluyendo una longitud de onda adaptada para excitar un colorante fluorescente especifico anadido al aDn en el tubo de muestra. Los LED adecuados estan disponibles a un precio relativamente bajo, no comprenden ninguna pieza movil y tienen una larga vida util. Ademas, ocuparan solamente un espacio limitado en el termociclador.
Con uno o mas LED por pocillo de muestra, cada tubo de muestra se puede calibrar facil y sencillamente con respecto a la fluorescencia, es decir, cada pocillo se puede calibrar individualmente. Ademas, uno o mas LED por pocillo de muestra garantizara continuamente una elevada intensidad de luz por pocillo y evitara las variaciones de iluminacion de un pocillo a otro.
Preferentemente, cada detector de fluorescencia optico comprende un unico fotodiodo. Los fotodiodos mediran la fluorescencia emitida por el colorante con alta precision, tiene un lapso de vida prolongado, con elevada fiabilidad y disponible a costes relativamente bajos. Sin embargo, en lugar de un fotodiodo, cada detector de fluorescencia tambien podria comprender un dispositivo de carga acoplada (CCD) para medir la cantidad de luz fluorescente que incide sobre una superficie de detection del detector. Con un fotodiodo especifico por pocillo de muestra, el analisis sera completamente consistente y no susceptible a la interferencia por diafonia.
Para evitar las variaciones en la medicion de un pocillo a otro, las longitudes en los caminos opticos de cada fuente de luz de excitacion para el detector de fluorescencia asociado es el mismo para todos los pocillos de muestra, es decir, la longitud radial de un primer camino optico desde cada fuente de luz de excitacion hasta el eje del pocillo de muestra o tubo de muestra y la longitud axial de un segundo camino optico desde la intersection del primer camino
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optico con el eje del pocillo de muestra o el tubo de muestra hasta la superficie del detector de fluorescencia son identicos para todos los pocillos de muestra.
Para bloquear cualquier luz en el espectro de longitud de onda de la fuente de luz de excitacion que no contribuya a la excitacion del colorante o colorantes fluorescentes especificos anadidos a la muestra en el tubo de ensayo, de acuerdo con una realizacion preferida de la invencion se considera disponer de un filtro de excitacion optica en el camino del haz de luz de excitacion entre la fuente de luz de excitacion y la pared lateral del tubo de muestra asociado, estando adaptado el filtro de excitacion para transmitir solamente luz de la longitud o longitudes de onda especifica adecuadas para el colorante o colorantes fluorescentes especifico anadidos a la muestra. Adicionalmente, preferentemente, un filtro optico de emision de luz se dispone entre el extremo inferior del tubo de muestras y el detector de fluorescencia optico, estando adaptado el filtro de emision para transmitir solamente la luz fluorescente emitida desde el colorante o colorantes. Ambos filtros ayudaran a evitar que cualquier luz parasita incida sobre el detector.
El dispositivo de la presente invencion se puede utilizar ventajosamente tanto para el analisis de la curva de fusion como en la PCR cualitativa/en tiempo real.
Si el dispositivo de acuerdo con la divulgacion se utiliza para el analisis de la curva de fusion, entonces, cada pocillo de muestra esta preferentemente provisto de una fuente de luz de excitacion unica. Preferentemente, la fuente de luz de excitacion es un unico LED dispuesto en un orificio radial en una pared de cada pocillo de muestra de tal forma que la boca del orificio este frente a la pared lateral del tubo de muestra insertado en el pocillo de muestra para dirigir el haz de luz de excitacion a lo largo del orificio y a traves de la pared lateral del tubo de muestras hacia el interior de la muestra de ensayo para excitar el colorante fluorescente incluido en el mismo. El filtro de la luz de excitacion, en su caso, esta situado preferiblemente en la boca del orificio cerca de la pared lateral del tubo de muestra.
En el dispositivo para realizar el analisis de la curva de fusion, cualquier fluorescencia emitida por el colorante fluorescente de la muestra se detecta mediante un unico fotodiodo del detector de fluorescencia que esta situado directamente debajo del tubo de muestra, convenientemente a una distancia suficiente para montar un filtro de emision optica entre en extremo inferior del tubo de muestra y la superficie de deteccion del detector. Preferentemente, el filtro de emision optica es un filtro de paso de banda estrecho que esta disenado para transmitir las longitudes de onda concretas del espectro de emision fluorescente del colorante en los tubos de muestra y para bloquear el resto de las longitudes de onda.
Por otra parte, si el dispositivo de acuerdo con la invencion se utiliza en la PCR cualitativa/en tiempo real donde el tubo de muestra contiene la muestra de ensayo y una pluralidad de diferentes colorantes fluorescentes, es una ventaja utilizar correspondientemente una pluralidad de fuentes de luz de excitacion que estan dispuestas alrededor de cada pocillo muestra y que alternativamente se pueden encender, es decir, solamente una de cada vez. En este caso, el haz de luz de excitacion procedente de cada pluralidad de fuentes de luz de excitacion tiene una longitud de onda o espectro de longitud de onda especifico adaptado para excitar solamente uno de la pluralidad de los diferentes colorantes fluorescentes. Es preferible utilizar una pluralidad de diferentes LED coloreados que se correspondan con los diferentes colorantes de excitacion. El haz de luz de excitacion procedente de cada una de las fuentes de luz de excitacion se puede hacer pasar a traves de un filtro de excitacion optica que se corresponde o es especifico de la fuente de luz de excitacion particular con el fin de transmitir una unica longitud de onda que contribuya a la excitacion de uno de los diferentes colorantes y para bloquear cualquier otra longitud de onda no deseada emitida, en su caso, por las fuentes de luz de excitacion.
En el dispositivo para realizar la PCR cualitativa/en tiempo real, cualquier fluorescencia emitida por el colorante fluorescente de la muestra se detecta preferentemente mediante un unico fotodiodo que esta situado directamente debajo del tubo de muestra. Adicionalmente, un filtro optico de emision optico se dispone entre el extremo inferior del tubo de muestra y la superficie de deteccion del detector de fluorescencia. Para realizar la PCR cualitativa/en tiempo real multiplexada, permitiendo la deteccion y/o la cuantificacion de multiples genes diana de ADN en una unica reaccion multiplexada, el filtro de emision es, preferentemente, en un filtro de paso de banda estrecho que esta disenado para transmitir solamente las longitudes de onda concretas del espectro de emision de fluorescencia asociado con todos los colorantes de los tubos de muestra, mientras que bloquea el resto de las longitudes de onda.
En este caso, los filtros de excitacion de las fuentes de luz de excitacion y la pared lateral del tubo de muestra asociado se pueden dispensar si las fuentes de luz de excitacion son LED con un haz de luz de salida espectral de banda estrecha y si un filtro de emision de paso de banda estrecho multiple se coloca entre el extremo inferior de cada tubo de muestra y el fotodiodo asociado.
El dispositivo de acuerdo con la invencion comprende una pluralidad de pocillos de muestra para acelerar la medicion de la fluorescencia de un numero dado de muestras. Por ejemplo, el numero de pocillos de muestras puede ser 2, 6, 10 o 12 o cualquier otro numero adecuado. Para eliminar la diafonia entre pocillos vecinos, es preferible activar las fuentes de luz de excitacion de pocillos vecinos, de forma alternativa o ciclica, cambiando en primer lugar las fuentes de luz de excitacion de los pocillos impares y, a continuacion, las fuentes de luz de
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excitacion de los pocillos pares, una vez que las fuentes de luz de excitacion de los pocillos impares se han vuelto a apagar, etc.
Para poder aumentar y disminuir rapidamente la temperatura de las muestras de ensayo en el interior de los tubos de muestra, los pocillos de muestra para recibir los tubos de muestra son preferentemente aberturas o cavidades de un bloque termoconductor que, a su vez, esta en contacto intimo con un dispositivo Peltier para calentar y enfriar a la vez la muestra de ensayo. Los tipos de materiales alternativos para el bloque termicamente conductor incluye metales como aluminio y plata y plasticos o resinas termoconductoras, por ejemplo, CoolPoly D-Series, es decir, polimeros moldeables termoconductores que estan disponibles de Cool Polymers, Inc., North Kingstown, RI, EE.UU., todos ellos seleccionados para potenciar la transferencia de calor.
En el dispositivo para realizar el analisis de la curva de fusion que solamente necesita una unica fuente de luz de excitacion para cada muestra, cuando el dispositivo Peltier tiene preferentemente una orientacion vertical y esta montado ventajosamente en el bloque termoconductor en el lado opuesto de la fuente de luz de excitacion. En el dispositivo para realizar la PCR cualitativa/en tiempo real, el bloque termoconductor con las aberturas o cavidades para recibir los tubos de muestra, comprende preferentemente en su extremo inferior una extension de placa unitaria en contacto intimo con el dispositivo Peltier.
La presente invencion se ilustra por referencia a las figuras ilustrativas, que abarcan diferentes vistas de dos realizaciones preferidas de la invencion, en las que:
La Fig. 1 es una vista esquematica de una configuracion de un termociclador de tipo optico de acuerdo con la divulgacion para realizar el analisis de la curva de fusion;
La Fig. 2 es una vista parcialmente en seccion del termociclador que incorpora la configuracion optica de acuerdo con la Fig. 1;
La Fig. 3 es una vista en perspectiva de un conjunto de piezas que incorpora el termociclador de acuerdo con la Fig. 2;
La Fig. 4 es una vista en perspectiva parcialmente seccionada de otro conjunto de piezas incorporadas en el termociclador de acuerdo con la Fig. 2;
La Fig. 5 es una vista esquematica de la configuracion optica de otro tipo termociclador de tipo optico de acuerdo con la invencion para llevar a cabo la PCR cualitativa/en tiempo real;
La Fig. 6 es una vista parcialmente en seccion del termociclador que incorpora la configuracion optica de acuerdo con la Fig. 5;
La Fig. 7 es una vista en seccion tomada a lo largo de la linea VII-VII de la Fig. 6.
La configuracion optica 10 y el termociclador de tipo optico 12 como se representa graficamente en las Figuras 1 a 4 del dibujo son para su uso en el analisis de la curva de fusion, es decir, una medicion de las caracteristicas de disociacion de las muestras de ensayo 14 del ADN bicatenario frente a la temperatura durante el calentamiento.
Cada muestra de ensayo 14 esta incluida en un tubo de microcentrifuga 16 convencional, como se muestra mejor en las Figuras 1 y 2. Los tubos de microcentrifuga 16 son consumibles fabricados de polietileno transparente que tiene una transmitancia de luz inferior al 85 %, es decir, los tubos de microcentrifuga 16 no estan fabricados de un material plastico de calidad optica. La parte superior de cada tubo de microcentrifuga 16 esta provisto de una tapa articulada 18 que se mantiene cerrada durante la medicion para evitar la contaminacion. Los tubos de microcentrifuga 16 tienen una pared lateral 20 que comprende una parte superior ligeramente conica y una parte inferior conica ligeramente mas pronunciada para contener la muestra de ensayo 14 y tiene adicionalmente una pared del extremo redondeada o extremo 22.
A las muestras de ensayo de ADN 14 de los tubos de microcentrifuga 16 se anade un unico colorante fluorescente, como Sybr Green, que se intercala, o se une, solamente al ADN bicatenario (ADNbc) de forma que una disminucion en la cantidad de ADN bicatenario durante la disociacion del ADN da como resultado la correspondiente disminucion en la intensidad de la fluorescencia durante la excitacion del colorante con una longitud de onda de excitacion adecuada.
Para medir la intensidad de fluorescencia del colorante en una de las muestras de ensayo 14, el haz de luz de excitacion procedente de un unico LED 24 se dirige a traves de un filtro de excitacion optica 26 y a traves de la pared lateral 20 transparente del tubo de microcentrifuga 16 que contiene la muestra de ensayo 14. El LED 24 esta adaptado para emitir un espectro de longitudes de onda que comprende una longitud de onda para excitar el colorante fluorescente anadido a la muestra de ensayo 14. El filtro de excitacion 26 esta adaptado para bloquear cualquier longitud de onda del espectro de longitudes de onda del LED 24 que no contribuya a la excitacion del
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colorante fluorescente. Para la deteccion de la fluorescencia del colorante, que resulta de la excitacion y sale a traves del extremo inferior 22 transparente del tubo de microcentrifuga 16, un unico fotodiodo 28 se coloca debajo del extremo inferior 22 del tubo de microcentrifuga 16. Un unico filtro de emision 30 de paso de banda estrecho en el camino optico entre el extremo inferior 22 del tubo de microcentrifuga 16 y el fotodiodo 28 esta adaptado para transmitir solamente el espectro de emision de fluorescencia asociado con el colorante, es decir, la fluorescencia resultante tras la excitacion derivada del LED 24, y para bloquear cualquier otra longitud de onda.
Para llevar a cabo el analisis de la curva de fusion simultaneamente en una serie de muestras de ensayo 14, el termociclador 12 de las Figuras 2 a 4 comprende un numero de pocillos de muestra 32 y el correspondiente numero de LED 24 y fotodiodos 28, cada uno asociado a uno de los pocillos de muestra 32.
Como se puede observar mejor en las Figuras 2 y 3 los pocillos de muestra verticales 32 son orificios pasantes paralelos en un bloque termoconductor 34 rectangularmente alargado. Como puede observarse en la Fig. 2, cada uno de los orificios pasantes comprenderan una parte inferior cilindrica y una parte superior verticalmente alargada. Las dimensiones de la parte superior estan adaptadas a las dimensiones de los tubos de microcentrifuga 16 de forma que estos ultimos encajen perfectamente en los pocillos de muestra 32 con su extremo superior proyectandose desde los pocillos de muestra 32. El bloque termoconductor 34 puede estar hecho de metal, como aluminio o plata, o de un material polimerico termoconductor y comprende el numero correspondiente de perforaciones horizontales 36, que son perpendiculares a los orificios pasantes. Como puede observarse en la Fig. 2, cada perforacion se extiende desde una cara lateral 38 del bloque termoconductor 34 en uno de los pocillos de muestra 32.
El bloque termoconductor 34 forma parte del conjunto termico 40 representado graficamente en la Fig. 3 que comprende ademas un dispositivo Peltier 42, un circuito impreso 44 y un pozo termico de aluminio 46 con una pluralidad de aletas de refrigeracion 50. Los dispositivos Peltier 42 se utilizan para calentar o enfriar rapidamente las muestras de ensayo 14 en los tubos de microcentrifuga 16 insertados en los pocillos de muestra 32, dependiendo del modo de funcionamiento del termociclador 12. Como puede verse mejor en la Fig. 2 los dispositivos Peltier 42 estan montados en contacto estrecho con una cara lateral 48 del bloque termoconductor 34 que esta en el lado opuesto de la cara lateral 38. El termociclador 12 comprende ademas un ventilador (no mostrado en los dibujos) para soplar aire a traves de las aletas 50 del pozo termico 46.
Los LED 24 y los fotodiodos 32 forma parte del conjunto optico 52 representado graficamente en la Fig. 4, que comprende ademas un bloque optico 54 que aloja los LED 24 y los fotodiodos 32, el filtro de excitacion 26, el filtro de emision 30, y dos circuitos impresos 56, 58. El bloque optico 54 tiene numeroso orificios 60 horizontales paralelos para cada uno de los LED 24. En un lado, el bloque optico 54 esta provisto de una repisa saliente 62 que tiene numerosos orificios 64 verticales paralelos. Cada orificio 64 aloja uno de los fotodiodos 28, con su superficie de deteccion orientada hacia arriba. Los orificios 60 y 64 tienen la misma separacion, y estan asociados entre si. El lateral del bloque optico 54 que esta situado por encima de la repisa saliente 62 y la parte superior de la repisa saliente 62 esta provista, cada una, con una cavidad rectangular alargada poco profunda para contener el filtro de excitacion 26 y el filtro de emision 30, respectivamente, que tienen cada uno la forma de un bloque rectangular alargado encajado en la correspondiente cavidad.
Tras montar los conjuntos 40 y 52 del termociclador 12 como se muestra en la Fig. 2, la repisa 62 se proyecta debajo del bloque de metal 34 de tal forma que la cara lateral 38 del bloque de metal 34 sobresale hacia el lado del bloque optico 54 y la superficie inferior del bloque de metal 34 sobresale hacia el lado superior del estante 62 y los orificios verticales 64 de la repisa 62 estan alineados con los orificios pasantes de los pocillos de muestra 32 y los orificios 36 del bloque termoconductor 34 estan alineados con los orificios 60 del boque optico 54.
Ademas, el termociclador 12 esta provisto de una tapa (que no se muestra en los dibujos) que se puede desplazar entre una posicion abierta para introducir los tubos de microcentrifuga 16 dentro de los pocillos de muestra 32 y una posicion cerrada para cubrir los extremos superiores de los tubos de microcentrifuga 16 que sobresalen de los pocillos de muestra 32. En la posicion cerrada, la tapa aplica una presion a los tapones 18 de los tubos 16 para mantener los tapones 18 cerrados y los tubos 16 en buen contacto termico con el bloque termoconductor 34 durante el ciclado termico. La tapa esta provista con un calentador por resistencia que calienta el aire que esta por encima de los tubos 16 cerrados para minimizar la evaporacion de la muestra y evitar que las muestras 14 se condensen en la parte superior de los tubos 16.
En numerosos ensayos que se realizaron con la configuracion optica 10 de acuerdo con la Fig. 1 en el termociclador 12 de acuerdo con las Figuras 2 a 5, se descubrio sorprendentemente que a pesar de la utilizacion de tubos de microcentrifuga 16 convencionales fabricados de polietileno transparente, se podia conseguir una correlacion muy buena entre la temperatura de las muestras de ensayo 14 y la intensidad de fluorescencia medida con los fotodiodos 28, de forma que no era necesario fabricar los tubos de microcentrifuga 16 a partir de un material plastico de calidad optica mas caro que tenga una transmitancia de luz de mas del 90 %.
La configuracion optica 70 y el termociclador de tipo optico 72 como se representa graficamente en las Figuras 5 a 7 del dibujo con para uso en la PCE cualitativa/en tiempo real, es decir, la deteccion y cuantificacion simultaneas de
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multiples genes diana en una secuencia de ADN amplificada en las muestras de ensayo 14 por medicion optica de la fluorescencia en una unica reaccion multiplexada. Cada muestra de ensayo 14 esta incluida, de nuevo, en un tubo de microcentrifuga 16 convencional, como se muestra mejor en la Fig. 5, junto con cuatro colorantes fluorescentes diferentes, que se intercalan o enlazan exclusivamente con el ADN bicatenario (ADNbc). Un aumento en la secuencia de ADN amplificada durante la PCR ocasiona un aumento en la intensidad de la fluorescencia emitida por los colorantes tras su excitacion con un espectro de longitudes de onda adecuado. Por medida de la intensidad de la fluorescencia, se pueden cuantificar las concentraciones de ADN por comparacion con una dilucion de muestra patron.
Para llevar a cabo la PCR cualitativa/en tiempo real simultaneamente en varias muestras de ensayo 14, el termociclador 72 de acuerdo con las Figuras 6 y 7 tambien incluye un numero de pocillos de muestra 32 con un fotodiodo 28 debajo del extremo inferior de cada pocillo de muestra 32. Sin embargo, a diferencia del termociclador optico 12 que se ha descrito anteriormente, en el termociclador optico 72, en lugar de un LED, se han instalado cuatro LED de diferentes colores 74, 76, 78, 80, asociados con cada pocillo de muestra 32 y un filtro de emision de paso de banda estrecho 82 multiple en lugar del filtro de monoemision 64.
Para medir la fluorescencia de los cuatro colorantes de cada una de las muestras de ensayo 14, los haces de luz de excitacion de los cuatro LED 74, 76, 78, 80 de cada pocillo de muestra 32 se dirigen simultaneamente a traves de la pared lateral 20 transparente del tubo de microcentrifuga 16 que contiene la muestra de ensayo 14. Los cuatro LED estan adaptados para emitir un espectro de longitudes de onda diferentes, comprendiendo cada una de ellas una longitud de onda para excitar uno de los colorantes fluorescentes anadidos a la muestra de ensayo 14. Cada uno de los LED 74, 76, 78, 80 puede estar provisto de su correspondiente filtro de excitacion 94, como se muestra en la Fig. 5. Sin embargo, tambien se puede prescindir del filtro de excitacion 94, como se muestra en la Fig. 7. La intensidad de la fluorescencia resultante de los colorantes fluorescentes que sale a traves del extremo inferior 22 transparente del tubo de microcentrifuga 16 se detecta de nuevo mediante el unico fotodiodo 28 debajo del pocillo de muestra 32 y el filtro de emision de paso de banda estrecho 82 cuadruple. Este ultimo filtro 82 en el camino optico entre el extremo inferior 22 del tubo de microcentrifuga 16 y el fotodiodo 28 esta adaptado para transmitir solamente el espectro de emision de fluorescencia asociado con los cuatro colorantes y para bloquear cualquier otra longitud de onda.
Como puede observarse en la Fig. 7, los pocillos de muestra 32 verticales son cavidades que tienen el perfil de un tubo de microcentrifuga 16. Cada pocillo 32 esta provisto de un unico bloque termoconductor 86. Cada bloque 86 esta insertado en el correspondiente agujero pasante conformado de un bloque optico 84, teniendo el bloque optico 84 una seccion transversal generalmente hexagonal.
El bloque optico 84 esta provisto de cuatro orificios pasantes 88 horizontales alineados con los correspondientes orificios (no visibles) de bloque termoconductor 86 y se abren hacia los pocillos de muestra 32, cada uno de ellos para recibir uno de los LED 74, 76, 78, 80. Los orificios pasantes 88 y los LED 74, 76, 78, 80 estan igualmente separados en la direction perimetral del tubo de microcentrifuga 16 en el pocillo de muestra 32.
Para calentar y enfriar la muestra de ensayo 14 introducida en el tubo de microcentrifuga 16 en el pocillo de muestra 32, cada bloque termoconductor 86 presenta una extension 90 horizontal de tipo placa que se extiende en paralelo a un dispositivo Peltier 42 montado bajo la extension 90 de tipo placa. La superficie superior del dispositivo Peltier 42 esta en contacto estrecho con la extension 90 de tipo placa del bloque termoconductor 86. Un pozo termico 46 hecho de aluminio con una pluralidad de aletas 50 esta montado por debajo del dispositivo Peltier 42.
A diferencia del termociclador 12 de las Figuras 1 a 4, el termociclador 72 de acuerdo con las Figuras 5 a 7 no tiene una tapa calentada. En su lugar, se anade un aceite o una cera en la parte superior de las muestras 14 en los tubos de muestra 16 para evitar la evaporation. De esta forma, los tapones 18 de los tubos de muestra 16 se pueden dejar abiertos durante el ciclado termico para evitar cualquier problema asociado con el cierre automatico de los tapones 18.
Cuando se utiliza el termociclador 72, los LED 74, 76, 78, 80 de cada bloque optico 84 se encienden de forma alternativa, es decir, uno de cada vez. Para eliminar la diafonia entre los pocillos de muestra 32 vecinos en el termociclador optico 72, los LED 74, 76, 78, 80 de los pocillos de muestra 32 vecinos se encienden y apagan alternativa o ciclicamente. En otras palabras, los LED 74, 76, 78, 80 de todos los pocillos de muestra 32 de numero impar de la fila de pocillos de muestra 32 que se ilustran parcialmente en la Fig. 7, se encienden sucesivamente mientras que los LED 74, 76, 78, 80 de todos los pocillos de muestra 32 de numero par estan apagados y, a continuation, los LED 74, 76, 78, 80 de todos los pocillos de muestra 32 con numero par se encienden sucesivamente mientras que los LED 74, 76, 78, 80 de todos los pocillos de muestra 32 de numero impar estan apagados.
Cuando se lleva a cabo la PCR cualitativa/en tiempo real con sondas de ADN que contienen fluoroforos de tipo FRET, tales como TaqMan, en el termociclador 72 de las Figuras 5 a 7, es posible utilizar solamente uno de los lEd 74, 76, 78, 80 junto con el filtro de emision de paso de banda estrecho 82 cuadruple.
En numerosos ensayos que se realizaron con la configuracion optica 70 de acuerdo con la Fig. 5, en el termociclador 72 de acuerdo con las Figuras 6 y 7, tambien se descubrio que, a pesar de la utilizacion de tubos de microcentrifuga 16 convencionales fabricados de polietileno transparente, se podia conseguir una correlacion muy buena entre la cantidad de los genes diana multiples en las muestras de ensayo 14 y la intensidad de fluorescencia medida con los 5 fotodiodos 28, de forma que no era necesario fabricar los tubos de microcentrifuga 16 a partir de un material plastico de calidad optica mas caro que tenga una transmitancia de luz de mas del 90 %.

Claims (11)

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    REIVINDICACIONES
    1. Dispositivo para medir opticamente la fluorescencia de muestras de ensayo (14) que comprende:
    - una pluralidad de tubos de muestra (16) verticales fabricados de material transparente, que tienen una pared lateral (20), un extremo inferior (22) y que contienen una de las muestras de ensayo (14),
    - una pluralidad de pocillos de muestra (32) verticales, cada uno de los cuales es para recibir uno de los tubos de muestra (16) verticales,
    - al menos una fuente de luz de excitacion (24; 74, 76, 78, 80) para dirigir un haz de luz de excitacion a traves de la pared lateral (20) de un tubo de muestra (16) al interior de la muestra de ensayo (14), y
    - un detector de fluorescencia optico (28) para capturar la fluorescencia emitida por la muestra de ensayo (14) al excitarla,
    en el que
    - las muestras de ensayo (14) contienen acidos nucleicos y una pluralidad de colorantes fluorescentes,
    - el dispositivo comprende una pluralidad de fuentes de luz de excitacion (74, 76, 78, 80), dispuestas alrededor de cada pocillo de muestra (32), estando cada fuente de luz de excitacion (74, 76, 78, 80) dispuesta cerca del pocillo de muestra (32) asociado para excitar un colorante en la muestra de ensayo (14) del pocillo de muestra (32);
    - el haz de luz de excitacion de cada una de la pluralidad de fuentes de luz de excitacion (74, 76, 78, 80) tiene un espectro de longitudes de onda diferentes para excitar uno de la pluralidad de colorantes fluorescentes;
    - el dispositivo comprende una pluralidad de detectores de fluorescencia opticos (28),
    - debajo del extremo inferior (22) de cada tubo de muestra (16) esta situado uno de los detectores de fluorescencia (28) para capturar la fluorescencia emitida por el colorante de la muestra de ensayo (14) al excitarla ,
    - el eje del tubo de muestra (16) alojado en el pocillo de muestra (32) esta alineado con el detector de fluorescencia (28),
    caracterizado por que
    - cada pocillo de muestra (32) esta provisto de un unico bloque termoconductor (86),
    - cada bloque termoconductor (86) esta insertado en un orificio pasante de un bloque optico (84),
    - el bloque optico (84) esta provisto de orificios pasantes (88) horizontales,
    - cada orificio pasante (88) aloja una de la pluralidad de fuentes de luz de excitacion (74, 76, 78, 80) que estan situadas alrededor de cada pocillo de muestra (32) y
    - cada orificio pasante (88) esta alineado con el correspondiente orificio del bloque termoconductor (86) que se abre hacia el pocillo de muestra (32).
  2. 2. Dispositivo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que los tubos de muestra son tubos de microcentrifuga (16) fabricados de un material plastico con una transmitancia de luz inferior al 90 %.
  3. 3. Dispositivo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que las fuentes de luz de excitacion son LED (24; 74, 76, 78, 80).
  4. 4. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cada detector de fluorescencia optico comprende un unico fotodiodo (28).
  5. 5. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que un filtro de excitacion (26; 94) esta situado en un camino del haz de luz de excitacion entre las fuentes de luz de excitacion (24; 74, 76, 78, 80) y las paredes laterales (20) de los tubos de muestra (16), estando adaptado el filtro de excitacion (26; 94) para transmitir solamente luz de una longitud de onda especifica.
  6. 6. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que un filtro de emision de paso de banda estrecho (30; 82) esta situado entre los extremos inferiores (22) de los tubos de muestra (16) y los detectores de fluorescencia opticos (28), estando adaptado el filtro de emision (30; 82) para transmitir solamente la luz fluorescente emitida por al menos un colorante.
  7. 7. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende ademas una tapa, que se puede desplazar entre una posicion abierta para introducir los tubos de muestra (16) en los pocillos de muestra (32) y una posicion cerrada para cubrir la pluralidad de pocillos de muestra (32), y un calentador por resistencia en la tapa.
  8. 8. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas una superposition en cada tubo de muestra (16) para cubrir la muestra de ensayo (14) en el tubo de muestra (16).
  9. 9. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que un filtro de emision de paso de banda estrecho (82) multiple esta situado entre los extremos inferiores (22) de los tubos de muestra (16) y los detectores de fluorescencia opticos (28) y en donde el filtro de emision (82) esta adaptado para transmitir solamente
    5 la luz fluorescente emitida desde la pluralidad de colorantes fluorescentes.
  10. 10. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas medios para activar alternativamente las fuentes de luz de excitacion (24; 74, 76, 78, 80) de los pocillos de muestra (32) vecinos.
    10 11. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas al menos un
    dispositivo Peltier (42) para calentar y enfriar las muestras de ensayo (14) en los pocillos de muestra (32), estando el dispositivo Peltier (42) en contacto estrecho con un bloque termoconductor (34; 84) que rodea los pocillos de muestra.
    15 12. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la forma de la seccion
    transversal de los pocillos de muestra (32) para recibir los tubos de muestra (16) verticales esta adaptada a la forma de la seccion transversal de los tubos de muestra (16).
  11. 13. Uso del dispositivo (12; 72) de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores para la PCR cualitativa/en 20 tiempo real.
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