ES2969554T3

ES2969554T3 - Dispositivo para ciclado térmico simultáneo y uniforme de muestras y usos del mismo

Info

Publication number: ES2969554T3
Application number: ES19207382T
Authority: ES
Inventors: Krzysztof Mellem; Daniel Krzysztof Gorzkowski; Seweryn Bajer-Borstyn; Pawel Zawadzki; Piotr Garstecki; Kamil Robert Gewartowski
Original assignee: Curiosity Diagnostics Sp zoo
Current assignee: Curiosity Diagnostics Sp zoo
Priority date: 2014-03-28
Filing date: 2015-03-25
Publication date: 2024-05-21
Anticipated expiration: 2035-03-25
Also published as: CN106457252A; ES2770734T3; CN106457252B; EP3656474A1; US9737892B2; EP3122461A1; PL3656474T3; US20160167054A1; DK3122461T3; WO2015144783A1; EP3656474B1; EP3122461B1; PL3122461T3

Abstract

La invención se refiere a un dispositivo de ciclado térmico que comprende: una ubicación de muestra (4); un primer medio de calentamiento (3), en el que dicho primer medio de calentamiento está configurado para llevar una muestra en dicha ubicación de muestra a al menos aproximadamente una primera temperatura; preferiblemente dicho primer medio de calentamiento es un medio de calentamiento por contacto; un segundo medio de calentamiento (2), en el que dicho segundo medio de calentamiento está configurado para llevar dicha muestra a una segunda temperatura dirigiendo radiación electromagnética al extremo de la primera sección de tubo de luz y la sección de tubo de luz está configurada para dirigir dicha radiación electromagnética a través de su segundo extremo al lugar de la muestra (4), sus usos y métodos basados en el mismo. La invención también se refiere a un dispositivo de ciclado térmico que comprende: a) una ubicación de muestra (4); b) una primera sección de tubo de luz que puede funcionar al menos para recoger radiación electromagnética; c) una segunda sección de tubo de luz al menos operable para recoger excitación fluorescente y transmitir luz de emisión fluorescente; d) una tercera sección de tubo de luz al menos operable para iluminar la ubicación de la muestra (4) con radiación electromagnética y excitación fluorescente y para transmitir luz de emisión fluorescente a la segunda sección de tubo de luz; e) un filtro óptico configurado para reflejar la luz visible y transmitir radiación electromagnética; en el que cada sección de tubo de luz está configurada para homogeneizar la distribución de intensidad espacial de la luz y la radiación electromagnética mediante reflexión. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Dispositivo para ciclado térmico simultáneo y uniforme de muestras y usos del mismo

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo de los dispositivos de ciclado térmico, sus usos y procedimientos basados en los mismos. La presente invención en particular se refiere a un dispositivo de ciclado térmico que comprende: una ubicación de muestra, que está configurada para recibir múltiples muestras; una tubería de luz hueca (1), que comprende una sección de tubería de luz que comprende un primer y un segundo extremo, en el que dicha sección de tubería de luz está configurada para homogeneizar la distribución de intensidad espacial de la radiación electromagnética mediante reflexión; siendo un primer medio de calentamiento una fuente de calor de contacto, en el que dicho primer medio de calentamiento está configurado para llevar una muestra en dicha ubicación de muestra a al menos aproximadamente una primera temperatura; siendo un segundo medio de calentamiento una fuente de radiación electromagnética, en el que dicho segundo medio de calentamiento está configurado para llevar simultáneamente dichas múltiples muestras a una segunda temperatura dirigiendo radiación electromagnética al extremo de la primera sección de la tubería de luz y la sección de la tubería de luz está configurada para dirigir dicha radiación electromagnética que tiene una distribución de intensidad espacial homogeneizada a través de su segundo extremo simultáneamente a las múltiples muestras recibidas en la ubicación de la muestra. Según la presente invención, se utiliza una tubería de luz (o una sección de tubería de luz) para homogeneizar la distribución de intensidad espacial de la radiación electromagnética de calentamiento y para iluminar dicha muestra en dicha ubicación de muestra con luz durante el ciclo térmico. La presente invención también se refiere a los usos del ciclador térmico y la tubería de luz de la presente invención y a un procedimiento de amplificación por PCR ultrarrápido basado en los mismos. La solicitud también describe un dispositivo de ciclado térmico que comprende: a) una ubicación de muestra (4); b) una primera sección de tubería de luz que puede funcionar al menos para recoger radiación electromagnética; c) una segunda sección de tubería de luz al menos operable para recoger excitación fluorescente y transmitir luz de emisión fluorescente; d) una tercera sección de tubería de luz al menos operable para iluminar la ubicación de la muestra (4) con radiación electromagnética y excitación fluorescente y para transmitir luz de emisión fluorescente a la segunda sección de tubería de luz; e) un filtro óptico configurado para reflejar la luz visible y transmitir radiación electromagnética; en el que cada sección de tubería de luz está configurada para homogeneizar la distribución de intensidad espacial de la luz y la radiación electromagnética mediante reflexión; sus usos y procedimientos basados en los mismos.

Antecedentes de invención

La presente invención se refiere a dispositivos complejos de ciclado térmico que comprenden medios de calentamiento basados en radiación electromagnética combinados con otros medios de calentamiento (por ejemplo, medios de calentamiento por contacto) y una sección de tubería de luz (o una tubería de luz) para ciclos de temperatura uniformes y simultáneos de muestras (o múltiples muestras), por ejemplo, múltiples muestras de PCR) que permiten (por ejemplo, al menos 90 %, preferentemente al menos 95 %, más preferentemente al menos 98 %), simultánea y ultrarrápida (por ejemplo, hasta 3,7 segundos, por ejemplo, hasta 7 segundos, por ejemplo en el rango entre 3 y 7 segundos) ciclado térmico uniforme entre muestras (o entre múltiples muestras, por ejemplo, múltiples muestras de PCR) en la ubicación de la muestra. La PCR (o reacción en cadena de la polimerasa) es un procedimiento para la amplificación de ácidos nucleicos o fragmentos de estos. La PCR es una técnica de diagnóstico que se utiliza de forma rutinaria para detectar ADN objetivo, por ejemplo, en el diagnóstico de una enfermedad infecciosa, oncología o medicina forense. En muchos casos es beneficioso obtener el resultado de la prueba lo más rápido posible, por ejemplo, recetar el medicamento adecuado durante la visita al consultorio médico. Para amplificar el ADN objetivo, una reacción de PCR requiere cambios cíclicos en la temperatura de la muestra.

La amplificación por PCR normalmente comprende tres etapas: desnaturalización, hibridación de cebadores y extensión, que juntas forman un ciclo de PCR. Los ciclos de PCR se pueden repetir hasta que se amplifique una cantidad deseada del producto. El ciclo de PCR típico dura aproximadamente un minuto. Los termocicladores de PCR más avanzados son capaces de realizar un ciclo de PCR en unos 20 segundos.

Por esta razón, para reducir el tiempo de prueba es crucial proporcionar un procedimiento para calentar rápidamente la muestra (por ejemplo, varias muestras). La técnica anterior logra este objetivo mediante radiación infrarroja, un procedimiento de calentamiento sin contacto que permite un calentamiento directo y rápido de la muestra, especialmente si el volumen de la muestra es bajo.

El documento WO 2013/100859 A1 se refiere a un procedimiento y dispositivo para ajustar la temperatura de una muestra calentando un sustrato con una luz de diodo láser. En otras palabras, el sustrato que forma un lugar de muestra y transporta la muestra se calienta con la energía convertida de la luz proyectada sobre el sustrato. Luego, el sustrato calentado transfiere el calor a la muestra al hacer contacto con la muestra. Tal disposición basada en contacto no permite calentar directamente la muestra con radiación electromagnética (es decir, luz) y, por lo tanto, no permite ciclos térmicos ultrarrápidos de las muestras.

El documento US 2002/0047003 A1 se refiere a dispositivos, sistemas y procedimientos para procesar materiales de muestra ubicados en cámaras de proceso de un dispositivo, que gira durante el calentamiento de los materiales de muestra. Después de la distribución del material de muestra en las cámaras de proceso, las cámaras individuales pueden calentarse selectivamente mediante energía electromagnética adecuada suministrada por una fuente de energía electromagnética. La fuente de energía electromagnética está preferentemente alejada del dispositivo. La parte inferior del dispositivo puede mantenerse en contacto con una placa base, lo que ayuda así a enfriar los materiales de muestra entre ciclos de calentamiento. El dispositivo no permite la irradiación simultánea de materiales de muestra ubicados en múltiples cámaras de proceso mediante una única fuente de energía electromagnética.

Para proporcionar un diagnóstico preciso, es fundamental realizar pruebas para detectar tantos organismos patógenos potenciales como sea posible, para eliminar los resultados falsos negativos, lo que requiere que una gran cantidad de reacciones de PCR se ciclen térmicamente de manera uniforme y simultánea. En consecuencia, la presente invención proporciona medios para homogeneizar la distribución de intensidad espacial de la radiación electromagnética que mejora sustancialmente la uniformidad del perfil del ciclo térmico dentro de las muestras analizadas. El ciclado térmico ultrarrápido de múltiples muestras de ácido nucleico mediante calentamiento por infrarrojos requiere una cantidad sustancial de energía. Además, la PCR en tiempo real también exige una alta energía de luz de excitación fluorescente para lograr una alta sensibilidad de detección. Las pérdidas de luz electromagnética darían como resultado un calentamiento más lento de las muestras o defectos en la detección y podrían provocar un calentamiento no deseado del ciclador térmico. La presente invención aborda este problema de dos maneras: en primer lugar, proporcionando una manera eficaz de recoger y transmitir radiación electromagnética y excitación de fluorescencia a la muestra (por ejemplo, múltiples muestras) y en segundo lugar proporcionando medios para el enfriamiento eficaz de las partes del ciclador térmico que se calentaron por las pérdidas restantes de energía radiada.

El uso de la presente invención proporciona ciclos de PCR uniformes, simultáneos y ultrarrápidos (por ejemplo, hasta 3,7 segundos, por ejemplo, hasta 7 segundos, por ejemplo, en el rango entre 3 y 7 segundos) a través de múltiples muestras (por ejemplo, múltiples muestras de PCR). Se contempla en la presente invención que aumentando la energía de la radiación es posible alcanzar el límite de velocidad de polimerización de la polimerasa utilizada en una reacción de PCR (por ejemplo, ADN polimerasa), lo que se traduce en aproximadamente 1 segundo ciclo de PCR. Si bien el uso de radiación electromagnética para calentar es conocido en la técnica anterior (Kim H., Dixit S., Green CJ., Faris GW., 2009, Optics Express, vol. 17, n.° 1), ninguno de los dispositivos de la técnica anterior proporciona ciclos térmicos uniformes, simultáneos y ultrarrápidos en múltiples muestras (por ejemplo, múltiples muestras de PCR).

La técnica anterior también enseña a acelerar el enfriamiento de una muestra encerrada en un chip de microfluidos mediante un elemento Peltier. Sin embargo, el control de la temperatura del bloque térmico no es suficiente para cambiar con precisión la temperatura de la muestra durante el ciclo térmico. En consecuencia, existe una necesidad en la técnica anterior de medios y procedimientos que permitan ciclos térmicos uniformes, simultáneos y ultrarrápidos entre muestras (o múltiples muestras, por ejemplo, múltiples muestras de PCR).

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un dispositivo de ciclado térmico que comprende: a) una ubicación de muestra configurada para recibir múltiples muestras (4); b) una tubería de luz hueca, que comprende una sección de tubería de luz que comprende un primer y un segundo extremo, en el que dicha sección de tubería de luz está configurada para homogeneizar la distribución de intensidad espacial de la radiación electromagnética mediante medios de reflexión, preferentemente superficies internas de dicha sección de tubería de luz son reflexivas; c) un primer medio de calentamiento (3) que es una fuente de calor de contacto, en el que dicho primer medio de calentamiento está configurado para llevar una muestra en dicha ubicación de muestra a al menos aproximadamente una primera temperatura; d) un segundo medio de calentamiento (2) que es una fuente de radiación electromagnética, en el que dicho segundo medio de calentamiento está configurado para llevar simultáneamente múltiples muestras en dicha ubicación de muestra a una segunda temperatura dirigiendo la radiación electromagnética al extremo de la primera sección de la tubería de luz y la sección de tubería de luz está configurada para dirigir dicha radiación electromagnética que tiene una distribución de intensidad espacial homogeneizada a través de su segundo extremo simultáneamente a las múltiples muestras recibidas en la ubicación de la muestra (4). En una realización, la invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico, en el que dicha radiación electromagnética dirigida a dicha ubicación de muestra (4) provoca un aumento de temperatura de al menos 5 °C de dicha muestra; preferentemente un aumento de temperatura de al menos 10 °C de dicha muestra; más preferentemente un aumento de temperatura de al menos 15 °C de dicha muestra; más preferentemente un aumento de temperatura de al menos 20 °C de dicha muestra. En otra realización, la invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico, en el que dicha radiación electromagnética dirigida a dicha ubicación de muestra (4) está configurada para provocar simultáneamente un aumento de temperatura de al menos 5 °C de dichas múltiples muestras; preferentemente un aumento de temperatura de al menos 10 °C de dichas múltiples muestras; más preferentemente un aumento de temperatura de al menos 15 °C de dichas múltiples muestras; lo más preferentemente, un aumento de temperatura de al menos 20 °C de dichas múltiples muestras. En otra realización, la invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico, en el que dicha sección de tubería de luz está configurada para homogeneizar la distribución de intensidad espacial de dicha radiación electromagnética mediante reflexión. En otra realización, la invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico, en el que: a) dicho segundo medio de calentamiento (2) es una fuente de radiación electromagnética; preferentemente una fuente de radiación electromagnética infrarroja; b) dicho primer medio de calentamiento (3) es una fuente de calor de contacto; c) una tubería de luz (1) comprende dicha sección de tubería de luz, en el que dicha tubería de luz está configurada para homogeneizar la distribución de intensidad espacial de la radiación electromagnética de calentamiento; en el que dicha tubería de luz es una tubería de luz hueca. En otra realización, la invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico, en el que dicha tubería de luz está configurada para iluminar dichas múltiples muestras en dicha ubicación de muestra (4) con luz durante el ciclado térmico. En otra realización, la invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico, en el que dicha tubería de luz está configurada para iluminar simultáneamente dichas múltiples muestras en dicha ubicación de muestra (4) con luz durante el ciclado térmico por medio de reflexión. En otra realización, la invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico, en el que dicha tubería comprende una cámara que tiene una superficie reflectante en un lado y una superficie semirreflectante en el otro lado, preferentemente dicha cámara está dentro de dicha tubería de luz (1). En otra realización, la invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico, en el que dicha tubería tiene una sección transversal seleccionada del grupo que consiste en: sección transversal rectangular, cuadrada y hexagonal. En otra realización, la invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico, en el que la uniformidad de la distribución de energía electromagnética desde el segundo medio de calentamiento (2) hasta las muestras en la ubicación de la muestra (4) es al menos el 90 %, preferentemente al menos el 95 %, más preferentemente al menos el 98 %. En otra realización, la invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico, en el que la uniformidad de la distribución de energía electromagnética desde el segundo medio de calentamiento (2) hasta dichas múltiples muestras en la ubicación de la muestra (4) es al menos 90 %, preferentemente al menos 95 %, más preferentemente al menos 98 %. En otra realización, la invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico, en el que dicho dispositivo comprende además: e) fuente de luz (5), preferentemente dicha fuente de luz es una fuente de excitación de fluorescencia, f) al menos un espejo dicroico (6), preferentemente un conjunto de espejos dicroicos (6, 7), más preferentemente el espejo dicroico (6) es un espejo dicroico de fluorescencia multibanda, g) cámara (8), preferentemente dicha cámara es una cámara de detección de luz fluorescente emitida, h) al menos un filtro de fluorescencia (9), preferentemente dicho filtro de fluorescencia es un filtro de emisión, más preferentemente múltiples filtros de fluorescencia, lo más preferentemente dicho al menos un filtro de fluorescencia es un filtro de fluorescencia multibanda, i) opcionalmente un filtro adicional (10), en el que dicho filtro adicional refleja longitudes de onda por debajo del infrarrojo. .

En otra realización, la invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico, en el que el filtro de fluorescencia (9) está configurado para medir los cambios de intensidad de fluorescencia de un tinte sensible a la temperatura agregado a la muestra, preferentemente dicho tinte sensible a la temperatura es rodamina B, más preferentemente dicho filtro de fluorescencia es un filtro de fluorescencia multibanda. Según otro aspecto, la presente invención proporciona un uso del dispositivo de ciclado térmico de la presente invención para ciclado térmico uniforme (por ejemplo, al menos 90 %, preferentemente al menos 95 %, más preferentemente al menos 98 %) y simultáneo de muestras, preferentemente para ciclos térmicos uniformes, simultáneos y ultrarrápidos (ciclo de PCR, por ejemplo, hasta 3,7 segundos, por ejemplo, hasta 7 segundos, por ejemplo, en el rango entre 3 y 7 segundos) de muestras (por ejemplo, múltiples muestras de PCR). En otra realización, la presente invención proporciona un uso del dispositivo de la presente invención para medir la temperatura de las muestras en tiempo real. En otra realización, la invención proporciona un uso de la tubería de luz (1) en un dispositivo de ciclado térmico, en el que dicho dispositivo de ciclado térmico comprende dicha tubería de luz (1), comprendiendo dicho uso: a) homogeneización de la distribución de intensidad espacial de la radiación electromagnética de un fuente de radiación electromagnética (2) por medio de reflexión; y b) dirigir dicha radiación electromagnética al lugar de muestra (4); y c) iluminación de dicha muestra en dicha ubicación de la muestra con luz durante el ciclo térmico; y d) opcionalmente, dicha iluminación se combina con detección de fluorescencia en tiempo real, preferentemente detección de fluorescencia en tiempo real de productos de PCR amplificados. Según otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para la amplificación uniforme y simultánea de muestras con PCR usando un dispositivo de ciclado térmico según la presente invención, comprendiendo dichas muestras un ácido nucleico o un fragmento del mismo, combinado con la detección en tiempo real de producto amplificado, comprendiendo dicho procedimiento: (a) mantener la temperatura del primer medio de calentamiento (3) a una temperatura específica, en el que dicha temperatura específica es inferior o igual a la temperatura de hibridación de los cebadores de PCR; (b) mientras se mantiene dicha temperatura constante, encender la fuente de radiación electromagnética (2) a una energía constante durante un período de tiempo específico, calentando uniforme y simultáneamente dichas muestras hasta que alcancen la temperatura de desnaturalización del ADN; (c) mientras se mantiene la temperatura del primer medio de calentamiento (3), apagar la fuente de radiación electromagnética (2) durante un período de tiempo específico, enfriando dichas muestras; preferentemente repetir las etapas (b) - (c) al menos 15 veces, más preferentemente repetir las etapas (b) - (c) al menos 20 veces, lo más preferentemente repetir las etapas (b) - (c) al menos 30 veces; más preferentemente repetir las etapas (b) - (c) al menos 40 veces; (d) después de un período de tiempo específico, encender la fuente de excitación de fluorescencia (5), excitando de manera uniforme y simultánea dichas muestras, y realizando simultáneamente la detección de la luz fluorescente emitida usando la cámara (8). Según otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para controlar la temperatura de muestras en un dispositivo de la presente invención en tiempo real durante el ciclado térmico, comprendiendo dicho procedimiento: mantener encendida la fuente de excitación de fluorescencia (5) o encenderla periódicamente, mientras se leen simultáneamente los cambios de excitación de fluorescencia causados por el cambio de temperatura usando la cámara (8) durante el ciclo térmico. En otra realización, la presente invención proporciona un dispositivo de ciclado térmico, en el que dicho primer medio de calentamiento (3) es una fuente de calor eléctrica; preferentemente dicho primer medio de calentamiento (3) es un bloque térmico o cámara térmica, más preferentemente dicho bloque térmico comprende una pluralidad de elementos calentadores. En otra realización, la presente invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico inventivo, en el que dicho dispositivo comprende solo una tubería de luz hueca (1) o múltiples tuberías de luz huecos, en el que cada uno de dichos múltiples tuberías de luz huecos está conectado a una fuente separada de radiación electromagnética, en el que cada uno de dichos múltiples tuberías de luz huecos también está conectado a una sección de tubería de luz más grande que está configurada: a) para homogeneizar la distribución de intensidad espacial de la radiación electromagnética mediante reflexión; b) dirigir dicha radiación electromagnética que tiene una distribución de intensidad espacial homogeneizada simultáneamente a múltiples muestras recibidas en la ubicación de la muestra (4); c) iluminar dichas múltiples muestras en dicha ubicación de muestra (4) con luz durante el ciclo térmico. En otra realización de la invención, el dispositivo de la presente invención es un cicladortérmico de PCR. En otra realización de la invención, el dispositivo de la presente invención se utiliza para el ciclado térmico de muestras por PCR.

En otra realización, la presente invención proporciona un dispositivo de ciclado térmico para un ciclado térmico uniforme (por ejemplo, al menos el 90 %, preferentemente al menos el 95 %, más preferentemente al menos el 98 %) y simultáneo de muestras que comprende: a) una tubería de luz hueca (1), que comprende una sección de tubería de luz que comprende un primer y un segundo extremo, en el que dicha sección de tubería de luz está configurada para distribuir uniformemente (por ejemplo, al menos el 90 %, preferentemente al menos el 95 %, más preferentemente al menos el 98 %) y simultáneamente distribuir energía electromagnética desde una fuente de calor electromagnético a las muestras e iluminar uniforme y simultáneamente dichas muestras con luz durante dicho ciclo térmico, b) fuente de calor electromagnético, en el que dicha fuente de calor electromagnético es una fuente de radiación electromagnética (2), preferentemente una fuente de radiación electromagnética infrarroja , c) un primer medio de calentamiento (3) que es una fuente de calor de contacto, d) ubicación de muestra (4) (por ejemplo, recipiente de muestra o soporte de muestra) configurado para recibir múltiples muestras. Según la presente invención, la tubería de luz (1) es una tubería de luz hueca, que comprende una sección de tubería de luz que comprende un primer y un segundo extremo, en el que dicha sección de tubería de luz está configurada para homogeneizar la distribución de intensidad espacial de la radiación electromagnética por medio de reflexión. En la presente invención el término "uniformemente" tiene el significado de tener al menos un 90 % de uniformidad, preferentemente al menos un 95 % de uniformidad, más preferentemente al menos un 98 % de uniformidad. En la presente invención, el término "ubicación de la muestra" (4) puede, por ejemplo, ser un recipiente para muestras o un portamuestras. En otra realización, la presente invención proporciona un dispositivo de ciclado térmico para ciclado térmico uniforme y simultáneo de muestras que comprende: a) una tubería de luz hueca (1) que comprende una sección de tubería de luz que comprende un primer y un segundo extremo, en el que dicha sección de tubería de luz está configurada para homogeneizar la distribución de intensidad espacial de la radiación electromagnética mediante reflexión, en el que la sección de la tubería de luz no es circular, en el que las superficies internas de dicha tubería de luz son reflectantes y el volumen encerrado por dicha tubería es transmisivo, en el que dicha tubería de luz (1) está configurada para distribuir de manera uniforme y simultánea energía electromagnética desde una fuente de calor electromagnética a las muestras y para iluminar de manera uniforme y simultánea dichas muestras con luz durante dicho ciclo térmico, b) fuente de calor electromagnética, en el que dicha fuente de calor electromagnética es una fuente de radiación electromagnética (2), preferentemente una fuente de radiación electromagnética infrarroja, en el que dicha segunda fuente de calor está configurada para llevar simultáneamente múltiples muestras en dicha ubicación de muestra a una segunda temperatura dirigiendo la radiación electromagnética al extremo de la primera sección de tubería de luz y la sección de tubería de luz está configurada para dirigir dicha radiación electromagnética que tiene una distribución de intensidad espacial homogeneizada a través de su segundo extremo simultáneamente a las múltiples muestras recibidas en la ubicación de la muestra (4), c) un primer medio de calentamiento (3) que es una fuente de calor de contacto, d) la ubicación de la muestra (4) (por ejemplo, contenedor de muestras o soporte de muestras) configurado para recibir múltiples muestras. Según la presente invención, el primer medio de calentamiento (3) es una fuente de calor de contacto. En otra realización de la invención, un primer medio de calentamiento (3) es una fuente de calor eléctrica, preferentemente dicho primer medio de calentamiento (3) es un bloque térmico o cámara térmica. En otra realización de la invención, el dispositivo de la presente invención comprende sólo una tubería de luz (1) como se define de acuerdo con la presente invención. En otra realización de la invención, la tubería de luz (1) tal como se define de acuerdo con la presente invención comprende una cámara que tiene una superficie reflectante en un lado y una superficie semirreflectante en el otro lado. En otra realización más de la invención, la tubería de luz (1) tal como se define de acuerdo con la presente invención tiene una sección transversal seleccionada del grupo que consiste en: sección transversal rectangular, cuadrada y hexagonal. En otra realización de la invención, la tubería de luz (1) como se define de acuerdo con la presente invención tiene una relación ancho-largo de aproximadamente 1 (por ejemplo, igual a 1), preferentemente dicha relación ancho-largo es mayor que 3, más preferentemente dicha relación entre ancho y longitud es mayor que 5. En otra realización de la invención, la uniformidad de la distribución de energía electromagnética desde una fuente de calor electromagnética, en la que dicha fuente de calor electromagnética es una fuente de radiación electromagnética (2) hasta las muestras en la ubicación de la muestra, es de al menos el 90 %, preferentemente al menos el 95 %, más preferentemente al menos el 98 %. En otra realización de la invención el dispositivo de la presente invención comprende además: e) fuente de luz (5), preferentemente dicha fuente de luz es una fuente de excitación de fluorescencia, f) al menos un espejo dicroico (7), preferentemente un conjunto de espejos dicroicos espejos (6, 7), más preferentemente el espejo dicroico (6) es un espejo dicroico de fluorescencia multibanda, g) cámara (8), preferentemente dicha cámara es una cámara de detección de luz fluorescente emitida, h) al menos un filtro de fluorescencia (9), preferentemente dicho filtro de fluorescencia es un filtro de emisión, más preferentemente filtros de fluorescencia múltiples, lo más preferentemente dicho al menos un filtro de fluorescencia es un filtro de fluorescencia multibanda, i) opcionalmente un filtro adicional (10), en el que dicho filtro adicional refleja longitudes de onda por debajo del infrarrojo. En una realización adicional de la invención, el ciclado térmico de muestras es un ciclado térmico de muestras por PCR.

En otra realización de la invención, el dispositivo de ciclado térmico para ciclado térmico uniforme y simultáneo de muestras es el dispositivo de ciclado térmico de PCR para ciclado térmico uniforme y simultáneo de muestras. En otra realización de la invención, el dispositivo de ciclado térmico de PCR para ciclado térmico uniforme y simultáneo de muestras es el dispositivo de ciclado térmico de PCR para ciclado térmico uniforme y simultáneo de muestras de PCR. En otra realización de la invención, un dispositivo de ciclado térmico de la presente invención es un dispositivo de ciclado térmico de PCR. En otra realización de la invención, se utiliza un dispositivo de ciclado térmico de la presente invención para el ciclado térmico de PCR. En otra realización de la invención, la fuente de luz (5) está configurada para ser una fuente de excitación de fluorescencia. En otra realización de la invención, la cámara (8) está configurada para detectar la luz fluorescente emitida. En otra realización de la invención, el dispositivo de ciclado térmico de la presente invención se utiliza para ciclado térmico uniforme y simultáneo de muestras. En otra realización de la invención, el dispositivo de ciclado térmico se utiliza para ciclado térmico uniforme y simultáneo de muestras de PCR. En otra realización de la invención, el dispositivo de ciclado térmico de la presente invención se usa para ciclos de PCR uniformes, simultáneos y ultrarrápidos (por ejemplo, con un ciclo de PCR, por ejemplo, de hasta 3,7 segundos, por ejemplo, de hasta 7 segundos, por ejemplo, en el rango entre 3 y 7 segundos) ciclado térmico de muestras de PCR. En otra realización de la invención, la tubería de luz (1) tal como se define de acuerdo con la presente invención se usa para distribuir de manera uniforme y simultánea energía electromagnética desde una fuente de calor electromagnética a las muestras durante el ciclo térmico en un dispositivo de ciclo térmico. En otra realización de la invención, la tubería de luz (1) tal como se define de acuerdo con la presente invención se usa para distribuir de manera uniforme y simultánea energía electromagnética desde una fuente de calor electromagnética a las muestras durante el ciclo térmico de PCR en un dispositivo de ciclo térmico. En otra realización de la invención, la tubería de luz (1) tal como se define de acuerdo con la presente invención se usa para distribuir de manera uniforme y simultánea energía electromagnética desde una fuente de calor electromagnética a las muestras durante el ciclado térmico de PCR en un dispositivo de ciclado térmico de PCR. En otra realización de la invención, la tubería de luz (1) tal como se define de acuerdo con la presente invención se usa para distribuir uniforme y simultáneamente energía electromagnética desde una fuente de calor electromagnética a las muestras durante el ciclo térmico en un dispositivo de ciclo térmico de PCR. En otra realización de la invención, la tubería de luz (1) tal como se define de acuerdo con la presente invención se usa para distribuir de manera uniforme y simultánea energía electromagnética desde una fuente de calor electromagnética a las muestras de PCR durante el ciclado térmico de PCR en un dispositivo de ciclado térmico de PCR. En una realización adicional de la invención, el ciclado térmico es el ciclado térmico de PCR. En otra realización de la invención, el dispositivo de ciclado térmico es el dispositivo de ciclado térmico de PCR. En una realización adicional de la invención, las muestras son muestras de PCR (por ejemplo, mezclas de reacción de PCR).

En otra realización de la invención, la tubería de luz (1) tal como se define de acuerdo con la presente invención se usa para distribuir uniforme y simultáneamente energía electromagnética desde una fuente de calor electromagnética a las muestras durante el ciclo térmico en un dispositivo de ciclo térmico y para iluminar uniforme y simultáneamente dichas muestras con luz durante dicho ciclo térmico. En otra realización de la invención, la tubería de luz (1) tal como se define de acuerdo con la presente invención se usa para distribuir uniforme y simultáneamente energía electromagnética desde una fuente de calor electromagnética a las muestras durante el ciclo térmico en un dispositivo de ciclo térmico y para iluminar uniforme y simultáneamente dicha muestras con luz durante dicho ciclo térmico, en el que dicha iluminación se combina con detección de fluorescencia en tiempo real, preferentemente detección de fluorescencia en tiempo real de productos de PCR amplificados. En otra realización de la invención, la tubería de luz (1) tal como se define de acuerdo con la presente invención, en el que las superficies internas de dicha tubería de luz son reflectantes y el volumen encerrado por dicha tubería es transmisivo, se usa para distribuir de manera uniforme y simultánea energía electromagnética desde fuente de calor electromagnética para muestras durante el ciclo térmico en un dispositivo de ciclo térmico y para iluminar uniforme y simultáneamente dichas muestras con luz durante dicho ciclo térmico, en el que dicha iluminación se combina con detección de fluorescencia en tiempo real, preferentemente detección de fluorescencia en tiempo real de productos de PCR amplificados. La invención también proporciona un procedimiento para la amplificación uniforme y simultánea de muestras con PCR usando el dispositivo de ciclado térmico de la invención, comprendiendo dichas muestras un ácido nucleico o un fragmento del mismo, combinado con la detección en tiempo real del producto amplificado, comprendiendo dicho procedimiento: (a) mantener la temperatura del primer medio de calentamiento (3) a una temperatura específica, en el que dicha temperatura específica es inferior o igual a la temperatura de hibridación de los cebadores de PCR; (b) mientras se mantiene dicha temperatura constante, encender la fuente de radiación electromagnética (2) a una energía constante durante un período de tiempo específico, calentando uniforme y simultáneamente dichas muestras hasta que alcancen la temperatura de desnaturalización del ADN; (c) mientras se mantiene la temperatura del primer medio de calentamiento (3), apagar la fuente de radiación electromagnética (2) durante un período de tiempo específico, enfriando dichas muestras; preferentemente repetir las etapas (b) - (c) al menos 15 veces, más preferentemente repetir las etapas (b) - (c) al menos 20 veces, lo más preferentemente repetir las etapas (b) - (c) al menos 30 veces; además preferentemente repetir las etapas (b) - (c) al menos 40 veces; (d) después de un período de tiempo específico, encender la fuente de excitación de fluorescencia, excitando de manera uniforme y simultánea dichas muestras, y realizando simultáneamente la detección de la luz de fluorescencia emitida usando el cámara (8). Según otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para la amplificación uniforme y simultánea de muestras con PCR usando el dispositivo de ciclado térmico de la invención, comprendiendo dichas muestras un ácido nucleico o un fragmento del mismo, combinado con la detección en tiempo real del producto amplificado, dicho procedimiento que comprende: (a) mantener la temperatura de un primer medio de calentamiento (3) a una temperatura específica, en el que dicha temperatura específica es inferior o igual a la temperatura de hibridación de los cebadores de PCR; (b) mientras se mantiene dicha temperatura constante, encender la fuente de radiación electromagnética (2) a una energía constante durante un período de tiempo específico, en el que se calientan uniforme y simultáneamente dichas muestras a través de la tubería de luz (1) hasta que alcanzan la temperatura de desnaturalización del ADN ; (c) mientras se mantiene la temperatura del primer medio de calentamiento (3), apagar la fuente de radiación electromagnética (2) durante un período de tiempo específico, enfriando dichas muestras; preferentemente repetir las etapas (b) - (c) al menos 15 veces, más preferentemente repetir las etapas (b) - (c) al menos 20 veces, lo más preferentemente repetir las etapas (b) - (c) al menos 30 veces; además preferentemente repetir las etapas (b) - (c) al menos 40 veces; (d) después de un período de tiempo específico, encender la fuente de excitación de fluorescencia, excitando de manera uniforme y simultánea dichas muestras, y realizando simultáneamente la detección de la luz de fluorescencia emitida usando el cámara (8).

En otra realización, la presente invención proporciona un dispositivo de ciclado térmico como se define de acuerdo con la presente invención que comprende: a) una ubicación de muestra (4) configurada para recibir múltiples muestras; b) una primera sección de tubería de luz que puede funcionar al menos para recoger radiación electromagnética; c) una segunda sección de tubería de luz al menos operable para recoger excitación fluorescente y transmitir luz de emisión fluorescente; d) una tercera sección de tubería de luz al menos operable para iluminar simultáneamente dichas múltiples muestras en la ubicación de la muestra (4) con radiación electromagnética y excitación fluorescente respectivamente y para transmitir luz de emisión fluorescente a la segunda sección de tubería de luz; e) un filtro óptico configurado para reflejar la luz visible y transmitir radiación electromagnética; en el que cada sección de tubería de luz está configurada para homogeneizar la distribución de intensidad espacial de la luz y la radiación electromagnética mediante reflexión.

En otra realización, la presente invención proporciona un dispositivo de ciclado térmico como se define de acuerdo con la presente invención que comprende: a) una ubicación de muestra (4) configurada para recibir múltiples muestras; b) una primera sección de tubería de luz que puede funcionar al menos para recoger radiación electromagnética; c) una segunda sección de tubería de luz al menos operable para recoger excitación fluorescente y transmitir luz de emisión de fluorescencia, preferentemente dicha segunda sección de tubería de luz está configurada para homogeneizar la intensidad de excitación fluorescente; d) una tercera sección de tubería de luz al menos operable para iluminar simultáneamente dichas múltiples muestras en la ubicación de la muestra (4) con radiación electromagnética y excitación fluorescente respectivamente y para transmitir luz de emisión fluorescente a la segunda sección de tubería de luz, en el que dicha tercera sección de tubería de luz está configurada para homogeneizar la intensidad de excitación fluorescente; e) un filtro óptico configurado para reflejar la luz visible y transmitir radiación electromagnética; en el que al menos una sección de tubería de luz está configurada para homogeneizar la distribución de intensidad espacial de la luz y la radiación electromagnética mediante reflexión.

En otra realización de la presente invención, una intensidad de excitación fluorescente se homogeneiza mediante una tercera sección de tubería de luz, en el que una segunda sección de tubería de luz solo está configurada preferentemente para homogeneizar dicha intensidad de excitación fluorescente.

En otra realización, la presente invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico de la presente invención que comprende además una tubería de luz (1) como se define de acuerdo con la presente invención, en el que dicha tubería de luz (1) comprende dichas primera, segunda y tercera secciones de tubería de luz. En otra realización, la presente invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico de la presente invención, que comprende además: un primer medio de calentamiento (3) que es una fuente de calor de contacto, en el que dicho primer medio de calentamiento está configurado para llevar una muestra en dicha ubicación de muestra a al menos aproximadamente una primera temperatura; un segundo medio de calentamiento (2), en el que dicho segundo medio de calentamiento (2) es una fuente de radiación electromagnética, en el que dicho segundo medio de calentamiento está configurado para llevar simultáneamente múltiples muestras en dicha ubicación de muestra a una segunda temperatura dirigiendo la radiación electromagnética al el primer extremo de la sección de la tubería de luz y la sección de la tubería de luz está configurada para dirigir dicha radiación electromagnética que tiene una distribución de intensidad espacial homogeneizada a través de su segundo extremo simultáneamente a las múltiples muestras recibidas en la ubicación de la muestra (4); una fuente de luz (5); y una cámara (8). En otra realización, la presente invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico de la presente invención, en el que: a) dicha primera sección de tubería de luz es al menos operable para recoger radiación electromagnética de dicho segundo medio de calentamiento (2); b) dicha segunda sección de tubería de luz es al menos operativa para recoger la excitación fluorescente de dicha fuente de luz (5) y transmitir una luz de emisión de fluorescencia desde dicha tercera sección de tubería de luz a dicha cámara (8); c) dicha tercera sección de tubería de luz es al menos operable para iluminar dichas múltiples muestras en la ubicación de la muestra (4) con dicha radiación electromagnética y dicha excitación fluorescente y para transmitir dicha luz de emisión fluorescente desde dichas múltiples muestras en la ubicación de la muestra (4) a dicha segunda sección de tubería de luz. En otra realización, la presente invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico de la presente invención, en el que dicho primer medio de calentamiento (3) es un medio de calentamiento por contacto. En otra realización, la presente invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico de la presente invención, en el que al menos una de dichas primera, segunda o tercera secciones de tubería de luz está hecha de metal. En otra realización, la presente invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico de la presente invención, en el que dicha tubería de luz (1) está hecha de metal. En otra realización, la presente invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico de la presente invención, en el que dicha tercera sección de tubería de luz o dicha tubería de luz (1) está configurada para presionar dicha ubicación de muestra (4) contra dicho medio de calentamiento de contacto (3). En otra realización, la presente invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico de la presente invención, en el que dicha tubería de luz (1), tal como se define de acuerdo con la presente invención, está configurada para presionar dicha ubicación de muestra (4) contra dicho medio de calentamiento de contacto (3). En otra realización, la presente invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico de la presente invención, en el que al menos dicha tercera sección de tubería de luz o tubería de luz (1) tiene una estructura rígida.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1-4 y 9-10 describen dispositivos ejemplares de la presente invención. Las figuras 5-8 y 11 describen análisis de curvas de fusión ejemplares de muestras amplificadas en el dispositivo de la presente invención mediante el procedimiento de la presente invención.

Descripción detallada de la invención

La uniformidad del calentamiento basada en radiación electromagnética es fundamental para lograr ciclos de temperatura uniformes, simultáneos y ultrarrápidos de las muestras en la ubicación de la muestra (por ejemplo, varias muestras), lo cual es especialmente importante para aplicaciones de alto rendimiento (por ejemplo, aplicaciones de PCR de alto rendimiento). Además, la detección precisa de fluorescencia de múltiples productos de reacción en un dispositivo de ciclado térmico solo es posible con una iluminación homogeneizada (o uniforme) y un ciclado térmico uniforme en todas las muestras. Una fuente de radiación electromagnética sin medios que mejoren la uniformidad frente a una ubicación de muestra que comprende múltiples muestras en un dispositivo de ciclado térmico entregaría energía electromagnética de manera desigual a diferentes muestras en la ubicación de la muestra y, por lo tanto, calentaría de manera desigual dichas muestras. La presencia de dispositivos ópticos adicionales dentro de dicho dispositivo de ciclo térmico complicaría aún más las limitaciones espaciales para entregar radiación electromagnética homogeneizada en la ubicación de la muestra. Por lo tanto, el problema que debe resolver la presente invención es, entre otros, proporcionar dispositivos de ciclado térmico basados en radiación electromagnética mejorados libres de los inconvenientes conocidos de la técnica anterior, especialmente cuando se someten a ciclos térmicos múltiples muestras en un dispositivo de ciclado térmico basado en radiación electromagnética. El otro problema por resolver por la presente invención es proporcionar un dispositivo de ciclado térmico con características mejoradas de consumo de energía y/o control de temperatura y/o desgaste y/o seguridad y/o costes.

En particular, la presente invención aborda este problema de dos maneras: en primer lugar, proporcionando una forma eficaz de recoger y transmitir radiación electromagnética y excitación de fluorescencia a múltiples muestras en la ubicación de la muestra y, en segundo lugar, proporcionando medios para el enfriamiento eficaz de las piezas que fueron calentadas por las pérdidas restantes de energía radiada.

El problema se resuelve, entre otras cosas, según las reivindicaciones 1-13 de la presente invención.

De acuerdo con la presente invención el término "tubería de luz" o "tubería" se utiliza como sinónimo de "tubería de luz hueca" y se define para significar "tubería de luz hueca" (1), que comprende una sección de tubería de luz que comprende una primera y una segunda extremo, en el que dicha sección de tubería de luz está configurada para homogeneizar la distribución de intensidad espacial de la radiación electromagnética mediante reflexión.

De acuerdo con la presente invención, el término "dispositivo de ciclado térmico de la presente invención" o "dispositivo de ciclado térmico inventivo" o "dispositivo de ciclado térmico" se define como el dispositivo de ciclado térmico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

Por lo tanto, la presente invención proporciona una tubería de luz hueca (1), que comprende una sección de tubería de luz que comprende un primer y un segundo extremo, en el que dicha sección de tubería de luz se usa para homogeneizar la distribución de intensidad espacial de la radiación electromagnética de calentamiento y por lo tanto proporcionar un aumento significativo de la uniformidad del calentamiento basado en radiación electromagnética. En una realización de la invención, la uniformidad lograda de la radiación electromagnética en la ubicación de la muestra es de al menos el 90 %. En otra realización, la uniformidad lograda de la radiación electromagnética en la ubicación de la muestra es de al menos el 95 %. En otra realización de la invención, la uniformidad lograda de la radiación electromagnética en la ubicación de la muestra es de al menos el 98 %. La presente invención proporciona además dispositivos, medios y procedimientos para ciclos de temperatura uniformes, simultáneos y ultrarrápidos de muestras (o muestras múltiples, por ejemplo, múltiples muestras de PCR) que permiten ciclos térmicos uniformes, simultáneos y ultrarrápidos a través de dichas muestras (por ejemplo, ciclos de PCR de hasta de 3,7 segundos, por ejemplo, ciclos de PCR de hasta 7 segundos, por ejemplo, en el rango entre ciclos de PCR de 3 y 7 segundos). En otra realización, la presente invención proporciona dispositivos, medios y procedimientos para la detección de fluorescencia en tiempo real de productos de reacción, que permiten monitorear el progreso de la reacción de las muestras. El dispositivo de ciclado térmico de la presente invención comprende: a) una ubicación de muestra (4) configurada para recibir múltiples muestras; b) una tubería de luz hueca (1), que comprende una sección de tubería de luz que comprende un primer y un segundo extremo, en el que dicha sección de tubería de luz está configurada para homogeneizar la distribución de intensidad espacial de la radiación electromagnética mediante reflexión; c) un primer medio de calentamiento (3) que es una fuente de calor de contacto, en el que dicho primer medio de calentamiento está configurado para llevar una muestra en dicha ubicación de muestra a al menos aproximadamente una primera temperatura; d) un segundo medio de calentamiento (2) que es una fuente de radiación electromagnética, en el que dicho segundo medio de calentamiento está configurado para llevar simultáneamente múltiples muestras en dicha ubicación de muestra a una segunda temperatura dirigiendo la radiación electromagnética al extremo de la primera sección de la tubería de luz y la sección de tubería de luz está configurada para dirigir dicha radiación electromagnética que tiene una distribución de intensidad espacial homogeneizada a través de su segundo extremo simultáneamente a las múltiples muestras recibidas en la ubicación de la muestra (4). Por lo tanto, la presencia de dos medios de calentamiento proporciona un cambio rápido de temperatura de las múltiples muestras en la ubicación de la muestra, por ejemplo, porque una temperatura de referencia (por ejemplo, al menos aproximadamente una primera temperatura) se lleva a las múltiples muestras en la ubicación de la muestra mediante un primer medio de calentamiento (3), mientras que un segundo medio de calentamiento (2) está configurado para llevar dichas múltiples muestras a un segundo temperatura (por ejemplo, calentar aún más dichas múltiples muestras a partir de dicha temperatura de referencia). Según la presente invención, dicho segundo medio de calentamiento es una fuente de radiación electromagnética. En otra realización, "al menos aproximadamente una primera temperatura" es "primera temperatura", por ejemplo, aproximadamente la temperatura de hibridación de los cebadores de PCR. En una realización de la presente invención, dicha primera temperatura no es igual a dicha segunda temperatura. En otra realización de la invención, dicha primera temperatura es menor que dicha segunda temperatura. En otra realización de la invención, dicha primera temperatura es inferior o igual a la temperatura de hibridación de los cebadores de PCR. En otra realización de la invención, dicha segunda temperatura es una temperatura de desnaturalización del ADN (por ejemplo, desnaturalización del ADN de productos de amplificación por PCR). Una tubería de luz hueca (1) (o sección de tubería de luz) de la presente invención es multifuncional porque permite distribuir uniforme y simultáneamente energía electromagnética desde una fuente de calor electromagnética a las muestras e iluminar uniforme y simultáneamente dichas muestras con luz durante dicho ciclo térmico. En otra realización de la invención, la tubería de luz proporciona medios para distribuir la luz de manera uniforme, simultánea y ultrarrápida para el termociclado, la iluminación y la detección de una multitud de cámaras de reacción independientes. Según la presente invención, una sección de tubería de luz de la presente invención está configurada para homogeneizar la distribución de intensidad espacial de la radiación electromagnética. En el marco de la presente invención, el término "configurado para" puede tener el significado de influir directa o indirectamente en el parámetro (o parámetros) especificados. En alguna realización de la invención, dicho término "configurado para" se selecciona para que tenga el significado de influir directamente en el parámetro (o parámetros) especificados. En otra realización más de la invención, la sección de la tubería de luz tiene propiedades y/o dimensiones de la tubería de luz (1) como se describe en el presente documento. En otra realización más, la tubería de luz (o sección de tubería de luz) es una parte integral del dispositivo de ciclado térmico de la presente invención.

En una realización de la invención, la tubería de luz (1) (o sección de tubería de luz) es una tubería de luz hueca de metal (o una sección de tubería de luz hueca de metal). En la realización más preferida de la invención, la tubería de luz (1) (o sección de tubería de luz) es hueca y reflectante. En otra realización de la invención, la tubería de luz (1) (o sección de tubería de luz) tiene preferentemente una sección transversal rectangular y está hecho de espejos de superficie frontal. Alternativamente, está hecho de metal sólido recubierto de plata u oro para aumentar la reflectividad. La tubería de luz hueca (1) (o sección de tubería de luz) de la presente invención se puede fabricar a partir de cualquier material que pueda recubrirse con metal de manera que la superficie sea reflectante y sea capaz de soportar radiación de alta energía. Alternativamente, el material de la tubería de luz hueca (1) (o sección de la tubería de luz) de la presente invención tiene un revestimiento óptico, de modo que forma un espejo dieléctrico reflectante. En otra realización de la invención, la fuente de radiación electromagnética (2) emite una longitud de onda cercana a la longitud de onda de la luz visible, de modo que la superficie de la tubería de luz (1) (o sección de la tubería de luz) tiene propiedades similares para proporcionar uniformidad de calentamiento con energía electromagnética y uniformidad de iluminación. A medida que la energía electromagnética y/o la luz no uniforme emitida por una fuente respectiva ingresa a la tubería de luz (1) (o sección de la tubería de luz) se refleja muchas veces desde sus superficies y después de cada reflexión la uniformidad de la radiación y/o la luz se aumenta. Sin embargo, en un objetivo común, las paredes reflectantes son un gran inconveniente porque reflejan los rayos perdidos y distorsionan la imagen, por lo que los productores de objetivos suelen hacer que las paredes de un objetivo sean negras (es decir, no reflectantes). Según la presente invención, la tubería de luz (o la sección de la tubería de luz) de la presente invención no es un objetivo (por ejemplo, no es una lente de objetivo, por ejemplo, no es una lente de objetivo de 10X). Según la presente invención, la tubería de luz (o la sección de la tubería de luz) de la presente invención no es circular. En una realización de la invención, la uniformidad de al menos el 90 % (preferentemente al menos el 95 %, más preferentemente más del 95 %) se logra con la elección particular de la longitud de la tubería. En dicha realización de la invención la tubería de luz tiene las siguientes dimensiones: 16 x 17 x 150 mm y la uniformidad lograda de la radiación electromagnética y la distribución de la luz en la ubicación de la muestra es del 90 %. Como fuentes de luz y radiación electromagnética se utilizan dos barras de diodos con lentes divergentes. En otra realización de la invención se utilizan pilas de diodos verticales como fuentes de radiación electromagnética y luz. En una realización de la presente invención, los términos "luz" (o "luz visible") y "radiación electromagnética" se seleccionan para que no se superpongan: el término "luz" (o "luz visible") se selecciona del rango de longitudes de onda que se puede utilizar para excitar tintes fluorescentes; por tanto, el término "luz" (o "luz de excitación") se selecciona entre longitudes de onda que oscilan entre 100 nm y aproximadamente 800 nm (por ejemplo, menos de 800, por ejemplo, 799 nm); el rango de excitación se superpone con el rango de emisión (detección); el término "radiación electromagnética" se selecciona del rango de longitudes de onda que se pueden usar para calentar la muestra en la ubicación de la muestra, preferentemente se usa para calentar agua mediante la absorción de la radiación, por ejemplo, el agua comienza a absorber a 500 nm, pero preferentemente el límite inferior prácticamente útil es aproximadamente 800 nm (por ejemplo, igual a 800 nm o más de 800 nm). El límite superior del rango de calentamiento es prácticamente ilimitado, por ejemplo, se pueden utilizar incluso 100 micrómetros. Por lo tanto, en una realización preferida la "luz" se selecciona entre longitudes de onda de excitación en el intervalo de 100 nm a aproximadamente 800 nm (por ejemplo, menos de 800, por ejemplo 799 nm), mientras que la "radiación electromagnética" se selecciona entre longitudes de onda de calentamiento en el intervalo de 800 nm (por ejemplo, igual a 800 nm o más de 800 nm) hasta al menos 100 micrómetros. En una realización de la invención, se utiliza una longitud de onda de 976 nm o 1470 nm para calentar la muestra en la ubicación de la muestra.

Ventajosamente, la absorción de radiación por el agua es muy elevada a 1470 nm. En una realización de la invención, se usa preferentemente una longitud de onda de 1470 nm para calentar muestras en la ubicación de la muestra (por ejemplo, pequeñas alícuotas de la mezcla de amplificación por PCR) y/o se usa preferentemente para alícuotas localizadas en un dispositivo de microfluidos). Por otro lado, la absorción de luz a 976 nm por el agua es mucho más débil. Sin embargo, en otra realización de la invención se usa preferentemente una longitud de onda de 976 nm para calentar volúmenes de muestra más grandes (por ejemplo, recipientes de la mezcla de amplificación por PCR) y/o en aplicaciones en las que no se conoce el volumen exacto de las alícuotas. La desventaja de utilizar una longitud de onda que se absorbe más débilmente es que se pierde la mayor parte de la energía emitida por el emisor. La ventaja, sin embargo, es que la muestra se calienta (absorbe) de manera más uniforme a lo largo de su altura. En otra realización de la invención, la longitud de la tubería de luz es aproximadamente igual al tamaño lateral de la tubería, en el que dicha longitud de la tubería se define como la longitud óptica a lo largo de la cual la luz puede reflejarse en las paredes de la tubería. En otra realización de la invención, la anchura de la tubería es la dimensión característica de la sección transversal de la tubería, perpendicular al camino óptico. Para secciones transversales cuadradas, el ancho es el ancho del cuadrado, para secciones transversales rectangulares hay dos anchos de sección. En otra realización de la invención, la tubería de luz (1) tiene una longitud variable (por ejemplo, al menos 2 cm, preferentemente la longitud entre 2 y 20 cm). En una realización de la invención, la tubería de luz (1) tiene un tamaño variable y/o una anchura variable. En una realización preferida de la invención, la tubería de luz (1) tiene una relación ancho-largo de aproximadamente 1, preferentemente dicha relación ancho-largo es mayor que 3, más preferentemente dicha relación ancho-largo es mayor que 5. En otra realización preferida de la invención se utiliza una tubería más larga si dicha tubería tiene buena reflectividad porque una tubería más larga proporciona una mejor uniformidad.

Las tuberías circulares se comportan de manera diferente: enfocan la radiación y producen un punto caliente en el medio.

Por lo tanto, según la presente invención la tubería de luz de la presente invención, por ejemplo, en un dispositivo de ciclado térmico de la presente invención, no puede ser una única tubería circular (por ejemplo, en el que la tubería de luz no es una tubería circular o en el que la tubería de luz no es una tubería única circular). En otra realización de la invención, la tubería de luz (1) comprende una cámara que tiene una superficie reflectante en un lado y una superficie semirreflectante en el otro lado para imitar una sección de tubería mucho más larga. Esto permite acortar la tubería de luz (1), lo cual es especialmente ventajoso para ubicaciones de muestras grandes (por ejemplo, contenedores o soportes) que requerirían tuberías largas. En otra realización de la invención, la tubería de luz (1) tiene superficies internas que son reflectantes y el volumen encerrado por la tubería es transmisivo (por ejemplo, lleno de gas o con un material transparente diferente). En otra realización de la invención, la sección transversal de la tubería de luz (1) es variable (por ejemplo, cuadrada, hexagonal y rectangular). Los tamaños de la ubicación de la muestra (por ejemplo, contenedor) pueden ser variables, por ejemplo, 20x20 mm, 45x45 mm y similares. También son posibles tamaños mayores, que también están abarcados por la presente invención. Según la presente invención, la ubicación de muestra (4) (por ejemplo, soporte de muestra o recipiente de muestra) está configurada para recibir múltiples muestras (por ejemplo, 5, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 42, 45). , 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170 , 175, 180, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300 , 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 384, 385, 390, 395, 400 muestras y así sucesivamente). El dispositivo de la presente invención no está limitado por el número de muestras acomodadas por la ubicación de la muestra (4). En realizaciones adicionales, el tamaño de la ubicación de la muestra (4) es 20x20 mm o 45x45 mm, o una dimensión similar. En otra realización de la invención, la ubicación de la muestra (4) (por ejemplo, recipiente de muestra o soporte de muestra) está configurada para recibir una microplaca de PCR (por ejemplo, placa de PCR de 384 pocillos o de 96 pocillos) o una tira de 8 tuberías o un chip de microfluidos que contiene 56 compartimentos de 0,6 j l y 8 compartimentos de 3,5 |jl conocidos del estado de la técnica. En otra realización de la invención, la ubicación de muestra (4) (por ejemplo, recipiente de muestra o soporte de muestra) está configurada para recibir múltiples muestras (por ejemplo, múltiples muestras de PCR) y se coloca en un primer medio de calentamiento (3) (por ejemplo, bloque de calentamiento) o dicha ubicación de la muestra (4) está en contacto con un primer medio de calentamiento (3) (por ejemplo, cámara térmica) mediante el uso de, por ejemplo, calentamiento/enfriamiento con un medio gaseoso o líquido. En otra realización de la invención, un primer medio de calentamiento (3), además de los medios para calentar las muestras, comprende además medios para enfriar las muestras y/o medios para estabilizar la temperatura. En otra realización de la invención, el dispositivo de la presente invención comprende medios para estabilizar la temperatura en la ubicación de la muestra (4) (por ejemplo, recipiente de muestra o soporte de muestra). En otra realización de la invención, la cámara (8) (por ejemplo, utilizada en detección) comprende un objetivo que solo permite que pase la luz proveniente directamente del recipiente de muestra (4) (o soporte de muestra) (es decir, sin que ninguna luz se refleje en las paredes de la tubería). En otra realización de la invención, el posicionamiento de la cámara (8) y/o fuente de luz (5) (preferentemente, fuente de excitación) y/o fuente de calor electromagnética, en el que dicha fuente de calor electromagnética es una fuente de radiación electromagnética (2) (preferentemente, la fuente infrarroja (o IR)) es variable (por ejemplo, figura 1 y figura 2). En otra realización más de la invención, la tubería de luz (o la sección de tubería de luz) de la presente invención comprende en su interior al menos un filtro óptico descrito en el presente documento (por ejemplo, figuras 1-4, 9-10). Esto aumenta ventajosamente la eficiencia y/o precisión del dispositivo de la presente invención. Como se mencionó anteriormente, la tubería de luz (1) (o sección de tubería de luz) de la presente invención es multifuncional porque permite distribuir de manera uniforme y simultánea energía electromagnética desde una fuente de calor electromagnética a múltiples muestras e iluminar de manera uniforme y simultánea dichas múltiples muestras con luz durante dicho ciclo térmico. Por lo tanto, en otra realización más, la tubería de luz (1) (o sección de tubería de luz) de la presente invención comprende al menos dos ramas reflectantes (por ejemplo, para fuente de IR, cámara, etc.) que están interconectadas ópticamente mediante un filtro óptico dentro de la tubería de luz (o sección de tubería de luz). Por consiguiente, en otra realización más, el dispositivo de ciclado térmico de la presente invención comprende dicha tubería de luz (o la sección de la tubería de luz), es decir, con al menos un filtro óptico en su interior (por ejemplo, figuras 1-4, 9-10). En otra realización de la invención, la fuente de radiación se coloca directamente encima de la entrada de la tubería (por ejemplo, figura 2). En otra realización de la invención, el dispositivo de la presente invención comprende al menos un espejo dicroico (6), preferentemente un conjunto de espejos dicroicos (6, 7), más preferentemente el espejo dicroico (6) es un espejo dicroico de fluorescencia multibanda, y más preferentemente los espejos dicroicos (6 y 7) son espejos dicroicos de fluorescencia multibanda. En otra realización de la invención, filtro adicional (9), por ejemplo, filtro de emisión de fluorescencia o, por ejemplo, un filtro de emisión de fluorescencia multibanda está colocado entre la tubería de luz (1) y la cámara (8) (por ejemplo, figura 1), preferentemente dicho filtro refleja IR y deja pasar la luz visible. En otra realización de la presente invención, se puede utilizar un filtro adicional, por ejemplo, el filtro de excitación de fluorescencia o filtro de excitación de fluorescencia multibanda está colocado entre la tubería de luz (1) y la fuente de luz (5) (por ejemplo, fuente de excitación de fluorescencia), preferentemente dicho filtro de excitación refleja el infrarrojo (IR) y deja pasar la luz visible.

En otra realización de la invención, el espejo dicroico (7) refleja IR y deja pasar la luz visible (por ejemplo, figura 1). En otra realización de la invención, el espejo dicroico (7) deja pasar IR y deja pasar la luz visible o refleja la luz visible de forma selectiva (por ejemplo, figura 2). En otra realización de la invención, el filtro adicional (10) refleja la luz visible y deja pasar el IR (por ejemplo, figura 1). En otra realización de la presente invención, el espejo dicroico (7) deja pasar IR y refleja la luz visible o deja pasar selectivamente la luz visible (por ejemplo, figura 2). En otra realización de la presente invención, el espejo dicroico (7) es un espejo dicroico de fluorescencia multibanda (por ejemplo, figuras 1 y 2). En otra realización de la presente invención, los espejos dicroicos (6 y 7) son espejos dicroicos de fluorescencia multibanda (por ejemplo, figuras 1 y 2). En otra realización de la invención, el espejo dicroico (6) refleja la luz visible y deja pasar IR (por ejemplo, figura 2). En otra realización de la invención (por ejemplo, figura 1 o 3), un dispositivo de ciclado térmico comprende: a) una ubicación de muestra (4) configurada para recibir múltiples muestras; b) una tubería de luz hueca (1), que comprende una sección de tubería de luz que comprende un primer y un segundo extremo, en el que dicha sección de tubería de luz está configurada para homogeneizar la distribución de intensidad espacial de la radiación electromagnética mediante reflexión; c) un primer medio de calentamiento (3) que es una fuente de calor de contacto, en el que dicho primer medio de calentamiento está configurado para llevar una muestra en dicha ubicación de muestra a al menos aproximadamente una primera temperatura; d) un segundo medio de calentamiento (2) que es una fuente de radiación electromagnética, en el que dicho segundo medio de calentamiento está configurado para llevar simultáneamente dichas múltiples muestras a una segunda temperatura dirigiendo la radiación electromagnética al extremo de la primera sección de la tubería de luz (o preferentemente al primer extremo de la tubería de luz (1)) y la sección de la tubería de luz (o preferentemente la tubería de luz (1)) está configurado para dirigir dicha radiación electromagnética que tiene una distribución de intensidad espacial homogeneizada a través de su segundo extremo simultáneamente a las múltiples muestras recibidas en la ubicación de la muestra (4); e) fuente de luz (5), preferentemente dicha fuente de luz es una fuente de excitación de fluorescencia, f) al menos un espejo dicroico (6), preferentemente un conjunto de espejos dicroicos (6, 7), más preferentemente el espejo dicroico (6) es un espejo dicroico de fluorescencia multibanda, más preferentemente los espejos dicroicos (6 y 7) son espejos dicroicos de fluorescencia multibanda; además preferentemente el espejo dicroico (7) refleja IR y deja pasar la luz visible; g) cámara (8), preferentemente dicha cámara es una cámara de detección de luz fluorescente emitida; h) al menos un filtro de fluorescencia (9), preferentemente dicho filtro de fluorescencia es un filtro de emisión, más preferentemente dicho al menos un filtro de fluorescencia es múltiples filtros de fluorescencia, lo más preferentemente dicho al menos un filtro de fluorescencia es un filtro de fluorescencia multibanda, más preferentemente dicho al menos un filtro de emisión de fluorescencia es un filtro de emisión de fluorescencia multibanda; además, preferentemente el filtro (9) está colocado entre la cámara (8) y la tubería de luz (1) (por ejemplo, figura 1); i) opcionalmente un filtro adicional (10), preferentemente en el que dicho filtro adicional refleja longitudes de onda por debajo del infrarrojo; más preferentemente dicho filtro adicional (10) refleja la luz visible y deja pasar IR; además, preferentemente el filtro (10) está colocado entre el segundo medio de calentamiento (2) y la tubería de luz (1) (por ejemplo, figura 1); i) opcionalmente un filtro de excitación adicional (11), preferentemente colocado entre la fuente de luz (5) y la tubería de luz (1) (por ejemplo, figura 3); más preferentemente dicho filtro de excitación es un filtro de excitación de fluorescencia multibanda.

En otra realización de la invención (por ejemplo, mostrada en la figura 2 o 4), un dispositivo de ciclado térmico comprende: a) una ubicación de muestra (4) configurada para recibir múltiples muestras; b) una tubería de luz hueca (1), que comprende una sección de tubería de luz que comprende un primer y un segundo extremo, en el que dicha sección de tubería de luz está configurada para homogeneizar la distribución de intensidad espacial de la radiación electromagnética mediante reflexión; c) un primer medio de calentamiento (3) que es una fuente de calor de contacto, en el que dicho primer medio de calentamiento está configurado para llevar una muestra en dicha ubicación de muestra a al menos aproximadamente una primera temperatura; d) un segundo medio de calentamiento (2) que es una fuente de radiación electromagnética, en el que dicho segundo medio de calentamiento está configurado para llevar simultáneamente dichas múltiples muestras a una segunda temperatura dirigiendo la radiación electromagnética al extremo de la primera sección de la tubería de luz (o primer tubería de luz (1) extremo) y la sección de la tubería de luz (o tubería de luz (1)) está configurada para dirigir dicha radiación electromagnética que tiene una distribución de intensidad espacial homogeneizada a través de su segundo extremo simultáneamente a las múltiples muestras recibidas en la ubicación de la muestra (4); e) fuente de luz (5), preferentemente dicha fuente de luz es una fuente de excitación de fluorescencia; f) al menos un espejo dicroico (6), preferentemente, dicho al menos un espejo dicroico (6) refleja la luz visible y deja pasar el IR; más preferentemente un conjunto de espejos dicroicos (6, 7), más preferentemente el espejo dicroico (6) es un espejo dicroico de fluorescencia multibanda, más preferentemente los espejos dicroicos (6, 7) son espejos dicroicos de fluorescencia multibanda; además preferentemente el espejo (7) deja pasar IR y deja pasar la luz visible o refleja la luz visible selectivamente; g) cámara (8), preferentemente dicha cámara es una cámara de detección de luz fluorescente emitida; h) al menos un filtro de fluorescencia (9), preferentemente dicho filtro de fluorescencia es un filtro de emisión, más preferentemente dicho filtro de fluorescencia es múltiples filtros de fluorescencia, lo más preferentemente dicho al menos un filtro de fluorescencia es un filtro de fluorescencia multibanda, además preferentemente dicho al menos un el filtro de emisión de fluorescencia es un filtro de emisión de fluorescencia multibanda; más preferentemente dicho filtro (9) está colocado entre la cámara (8) y la tubería de luz (1); además preferentemente el filtro (9) refleja IR y deja pasar la luz visible; i) opcionalmente un filtro de excitación adicional (11), preferentemente colocado entre la fuente de luz (5) y la tubería de luz (1) (por ejemplo, figura 4); más preferentemente dicho filtro de excitación es un filtro de excitación de fluorescencia multibanda; además preferentemente dicho filtro de excitación refleja IR y deja pasar la luz visible. En otra realización de la presente invención, la detección de fluorescencia mediante cámara no utiliza reflejos de la pared interior de la tubería de luz (preferentemente la cámara no detecta dichos reflejos y está configurada de tal manera que detecte solo fluorescencia proveniente directamente de las múltiples muestras, sin reflejado en las paredes de la tubería, por ejemplo, mediante el uso de un teleobjetivo o un diafragma). En otra realización de la invención, el dispositivo de la presente invención comprende al menos un filtro de fluorescencia (9), preferentemente dicho filtro de fluorescencia es un filtro de emisión, más preferentemente múltiples filtros de fluorescencia, lo más preferentemente dicho al menos un filtro de fluorescencia es un filtro de fluorescencia multibanda. En otra realización de la invención, el dispositivo de la presente invención comprende un filtro de excitación que está colocado justo después de la fuente de luz (5) (por ejemplo, justo después de la fuente de excitación, por ejemplo, entre la fuente de excitación y la tubería de luz). En otra realización de la invención, el dispositivo de la presente invención comprende un filtro para la fuente de radiación, preferentemente colocado, por ejemplo, en una pared justo entre una fuente de radiación electromagnética y la tubería de luz. En otra realización de la invención, los filtros de fluorescencia de excitación y/o emisión y/o espejos dicroicos son opcionalmente multibanda. En otra realización de la invención, un filtro de excitación y/o un filtro de emisión de fluorescencia y/o espejos dicroicos de la presente invención dejan pasar el IR. En otra realización de la invención, un dispositivo de la presente invención no comprende detección de fluorescencia, en cuyo caso el espejo dicroico (7) es redundante y no está presente en el dispositivo de la presente invención. En otra realización más de la invención, se utilizan filtros ópticos adicionales que están diseñados para retener la función de la tubería de luz reflejando la longitud de onda deseada en lugares donde podría haber un orificio en la pared de la tubería de luz, por ejemplo, en una pared de la tubería de luz en la figura 1 podría ser el filtro (10), mientras que, por ejemplo, en la figura 2, el filtro de excitación (por ejemplo, entre la cámara y la tubería de luz) y/o el filtro de emisión (por ejemplo, entre la fuente de luz y la tubería de luz) pueden tener esta funcionalidad. En otra realización de la invención, el dispositivo de la presente invención comprende muchas tuberías de luz, cada uno de los cuales contiene una fuente separada de radiación electromagnética, conectados a la tubería de luz principal, más grande, que en última instancia calienta la muestra (o muestras). En otra realización de la invención no se lleva a cabo ninguna detección y la fuente de radiación se coloca encima (por ejemplo, directamente encima) de la entrada (por ejemplo, el primer extremo) de la tubería de luz. En otra realización de la invención, el dispositivo de la presente invención proporciona medios de detección del progreso de la reacción durante el ciclado térmico (preferentemente medios de detección en tiempo real, más preferentemente medios de detección de fluorescencia en tiempo real de amplificación por PCR). En otra realización de la invención el dispositivo de la presente invención comprende una fuente láser como fuente de radiación electromagnética (2). En otra realización de la invención, se utiliza una lente divergente de un eje (por ejemplo, en forma de medio cilindro) directamente sobre la fuente de IR (por ejemplo, un diodo IR). El diodo IR emite de manera diferente en las dos direcciones en el plano del diodo. La luz colima en una dirección, mientras que en la otra dirección es fuertemente divergente. Por lo tanto, el haz procedente de una fuente de infrarrojos diverge en la dirección en la que fue colimado originalmente para obtener un haz lo más uniformemente divergente posible. Por lo tanto, los haces están configurados para tener un número similar de reflexiones en todas las direcciones antes de impactar las muestras. En otra realización de la invención, el dispositivo de la presente invención comprende una ventana de vidrio transparente en un extremo de la tubería para proteger el dispositivo del polvo. En otra realización de la invención, se agrega un filtro adicional al dispositivo de la presente invención para reflejar la luz de excitación desde la abertura que permite la entrada de iluminación IR (o viceversa si la fuente de IR se coloca encima de la fuente de excitación).

En otra realización, el dispositivo de la presente invención comprende una lámpara halógena de alta energía (por ejemplo, cientos de vatios) (por ejemplo, múltiples lámparas halógenas) en lugar de una fuente láser como segundo medio de calentamiento (2) (por ejemplo, como fuente de radiación electromagnética (2). Ventajosamente, esto permite lograr ciclos térmicos rápidos en un área grande y reduce los costes, ya que una fuente láser es más de 100 veces más cara que una lámpara halógena por vatio de energía. El área se considera grande desde el punto de vista de los microfluidos si cubre múltiples compartimentos de microfluidos (por ejemplo, el área grande puede ser de 23 x 26 mm2, preferentemente, la longitud lateral puede estar entre 1 y 200 mm). La cantidad de energía requerida de dicha lámpara halógena de alta energía depende de la velocidad de calentamiento requerida, el área de la superficie de salida de la tubería y la profundidad del compartimiento de microfluidos que influye en la eficiencia de absorción y puede ser calculada fácilmente por una persona experta en la técnica utilizando una metodología estándar. La velocidad de calentamiento de dicha lámpara halógena de alta energía puede estar entre 1 y 1000 K/s y preferentemente entre 3 y 100 K/s. En una realización preferida, se utilizan dos lámparas halógenas Osram HPL 93729 LL de 750 W y 230 V, cada una de las cuales tiene 750 W para alcanzar una velocidad de calentamiento de 20 K/s en compartimentos de microfluidos que tienen 400 pm de profundidad.

En otra realización preferida, el dispositivo de la presente invención comprende una lámpara (o lámparas) halógenas de la presente invención que es una fuente omnidireccional de energía que está encerrada dentro de la tubería de luz de la presente invención (preferentemente con un extremo de la tubería de luz cerrado), por ejemplo, el extremo donde se encuentra la lámpara halógena) para aumentar significativamente la eficiencia del dispositivo de la presente invención (por ejemplo, figuras 9 y 10).

En otra realización, el dispositivo de la presente invención comprende medios para bloquear completamente la radiación electromagnética, por ejemplo, un obturador mecánico que bloquea completamente la radiación electromagnética cuando está cerrado. El obturador mecánico de la presente invención, por ejemplo, puede ser una placa metálica que se desliza (por ejemplo, horizontalmente) dentro de una abertura (por ejemplo, una hendidura) en la pared de la tubería de luz (o la sección de la tubería de luz) de la presente invención, por ejemplo, mediante un motor eléctrico controlado por ordenador. Preferentemente, la placa se puede pulir para reducir el calentamiento térmico. El uso de un obturador mecánico en el dispositivo de la presente invención es especialmente beneficioso para lograr ciclos térmicos precisos (por ejemplo, control preciso sobre los parámetros que influyen en el ciclo de PCR, como el halógeno en el tiempo) con una lámpara (o lámparas) halógenas como fuente. de radiación electromagnética (2), ya que una lámpara halógena puede tener una gran inercia térmica y largos tiempos de conmutación (por ejemplo, las halógenas de alta energía necesitan cientos de milisegundos para estabilizar la temperatura de su filamento y, en consecuencia, la energía radiada cuando se encienden o apagan). Sin embargo, el uso de un obturador mecánico en el dispositivo de la presente invención también es beneficioso cuando se utilizan diodos láser como fuente de radiación electromagnética (2) porque la conmutación frecuente de los diodos láser provoca tensión térmica en la estructura del diodo y, por lo tanto, acelera su envejecimiento.

En otra realización, el dispositivo de la presente invención comprende medios de enfriamiento de la tubería de luz o una sección de la tubería de luz (por ejemplo, primera, segunda o tercera) de la presente invención (preferentemente medios de enfriamiento externos). Por lo tanto, debido al aumento de energía, las pérdidas de radiación electromagnética pueden provocar un calentamiento sustancial de la tubería de luz (o de una sección de la tubería de luz) con el tiempo, por ejemplo, si la tubería de luz (o una sección de la tubería de luz) no está provisto de medios externos de refrigeración, puede calentarse a más de 200 grados centígrados si se enciende el halógeno constantemente. Sin embargo, este problema puede resolverse ventajosamente mediante refrigeración (por ejemplo, refrigeración por aire o líquido) de la tubería de luz (o de la sección de la tubería de luz) en el caso de la alta conductividad térmica del material de la tubería de luz, lo que, entre otras cosas, aumenta el perfil de seguridad del dispositivo de la presente invención.

Los halógenos tienen un amplio espectro de radiación que se extiende aproximadamente desde 300 nm a 4000 nm y por esta razón puede ser difícil obtener filtros ópticos (por ejemplo, filtros para colocar dentro de la tubería de luz (o sección de la tubería de luz) como se describe en este documento) que tendrían características requeridas. Por lo tanto, en otra realización el dispositivo de la presente invención comprende un filtro óptico de paso largo (12) (por ejemplo, figura 9). Un filtro óptico de paso largo (12) de este tipo puede, por ejemplo, dividir las partes de detección y calentamiento del dispositivo de la presente invención (por ejemplo, figuras 9, 10). El filtro óptico de paso largo (12) de la presente invención, por ejemplo, refleja la luz visible y deja pasar la luz infrarroja. Preferentemente, un filtro óptico de paso largo (12) de la presente invención es un espejo dicroico, por ejemplo, filtro dicroico de paso largo n.° 69-902 de Edmund Optics, 650 nm, 25,2 x 35,6 mm.

En otra realización el dispositivo de la presente invención comprende un filtro óptico de paso largo (12), un filtro opcional (13) que puede, por ejemplo, compensar una abertura (por ejemplo, un orificio) en la pared de la tubería de luz (o la luz sección de tubería) de la presente invención reflejando la radiación IR y dejando pasar la luz visible y un filtro opcional (14), que, por ejemplo, puede ser exactamente del mismo tipo que el filtro (13) y que puede, por ejemplo, usarse para aumentar la simetría de la tubería de luz causada por el comportamiento no ideal del filtro (13) y sirve para aumentar la uniformidad de la radiación (por ejemplo, figura 10). Esta realización es particularmente ventajosa porque permite el uso de un cubo de filtro de fluorescencia disponible en el mercado, que preferentemente tiene filtros multibanda. En una realización, el filtro óptico de paso largo (12) puede, por ejemplo, reflejar la radiación electromagnética y dejar pasar la luz visible para mejorar la eficiencia del dispositivo.

En una realización particular, un dispositivo de la presente invención comprende adicionalmente: una fuente de luz (5), una cámara (8) y un filtro óptico de paso largo (12) (por ejemplo, figura 9). En otra realización particular, un dispositivo de la presente invención comprende adicionalmente: una fuente de luz (5), una cámara (8), un filtro óptico de paso largo (12), un filtro opcional (13) y un filtro opcional (14) (por ejemplo, figura 10).

Como se mencionó anteriormente, la técnica anterior enseña a acelerar el enfriamiento de una muestra encerrada en un chip de microfluidos mediante un elemento Peltier. Sin embargo, el control de la temperatura del bloque térmico no es suficiente para cambiar con precisión la temperatura de la muestra durante el ciclo térmico. Un parámetro que es igualmente importante es la conductancia del contacto térmico que influye significativamente en la tasa de transferencia de calor, especialmente durante los ciclos térmicos rápidos. El coeficiente de conductancia de contacto térmico tiene un significado habitual conocido en la técnica y describe la capacidad de conducir calor entre dos cuerpos en contacto. El factor que más influye en el valor del parámetro de conductancia de contacto térmico es la presión de contacto. Por ejemplo, la presión de contacto resulta de la fuerza que actúa sobre la superficie del chip de microfluidos cuando se presiona contra el bloque calefactor. La presión preferida puede ser de alrededor de 0,1-100 MPa. La presente invención, en particular, proporciona una manera de controlar el valor de la conductancia de contacto térmico mediante la presión ejercida a través de la estructura rígida del conjunto de tubería ligero (o conjunto de sección de tubería ligero) de una manera que permita la distancia más corta posible entre los chips y la tubería de luz (o una sección de tubería de luz) y facilita la carga del chip en el dispositivo de la presente invención. Por lo tanto, durante el curso de la presente invención se observó sorprendentemente que el aumento en la presión ejercida sobre la ubicación de la muestra (4) (por ejemplo, chip de microfluidos) en el dispositivo de la presente invención provoca un enfriamiento más rápido de las múltiples muestras en la ubicación de la muestra (4). Además, si la ubicación de la muestra (4) (por ejemplo, un chip, un chip de microfluidos) que comprende múltiples muestras se coloca en el primer medio de calentamiento (3) (por ejemplo, un bloque calefactor) sin aplicar presión, las diferencias en la velocidad de calentamiento entre diferentes chips, que, por ejemplo, podrían producirse problemas como resultado de una repetibilidad no ideal del proceso de producción de chips. Este problema se puede resolver ventajosamente usando material intersticial que llene espacios microscópicos entre una ubicación de muestra (por ejemplo, chip) y el primer medio de calentamiento (3) (por ejemplo, bloque calefactor) tal como aceite mineral o mediante presión externa aplicada sobre la ubicación de la muestra (o ambos), que son realizaciones de la presente invención.

Por lo tanto, en una realización el dispositivo de la presente invención comprende una tubería de luz (o una sección de tubería de luz) de estructura rígida y medios para mover la tubería de luz (o la sección de tubería de luz) (por ejemplo, verticalmente) y ejercer fuerza (por ejemplo, fuerza constante) en la ubicación de la muestra (4). Cualquier medio que pueda mover la tubería de luz (o una sección de la tubería de luz) y ejercer una fuerza en el rango de 1 a 10000 N en la ubicación de la muestra (4) es adecuado (por ejemplo, un accionamiento mecánico). La fuerza requerida depende de la presión de contacto deseada. Un medio de ejemplo para mover la tubería de luz (o una sección de tubería de luz) (por ejemplo, accionamientos mecánicos) que se puede usar en el dispositivo de la presente invención es un actuador de tornillo lineal o un motor lineal. La tubería de luz (o una sección de tubería de luz) de estructura rígida puede, por ejemplo, estar hecha de un metal grueso (aproximadamente 3 mm), y puede presionar directamente (por ejemplo, presionar constantemente) la ubicación de la muestra (4) (por ejemplo, un chip de microfluidos) sin doblarse ni romperse con una fuerza en el rango de 1 a 10000 N. Una persona experta en la técnica puede evaluar fácilmente si el conjunto de tubería de luz (o sección de tubería de luz) puede operarse de manera segura con tal fuerza. En una realización preferida, el dispositivo de la presente invención comprende un accionamiento mecánico y una tubería de luz (o una sección de tubería de luz) de estructura rígida para presionar directamente un chip de microfluidos al primer medio de calentamiento (3) (por ejemplo, un bloque térmico) con una fuerza controlada (por ejemplo, fuerza constante) en el rango de 1 a 10000 N. Este enfoque tiene múltiples ventajas, por ejemplo, en primer lugar, compensa las imprecisiones de la superficie del chip, en segundo lugar, permite una rápida transferencia de calor durante el enfriamiento y/o calentamiento y, en tercer lugar, permite una fácil colocación del chip debajo de la tubería de luz (o la sección de la tubería de luz) de la presente invención. En otra realización, un dispositivo de la presente invención comprende una placa colocada entre la tubería de luz (o la sección de la tubería de luz) de la presente invención y la ubicación de la muestra (4). Por lo tanto, presionar más uniformemente dicha placa (por ejemplo, una placa de vidrio, una placa de vidrio gruesa) en el extremo de la tubería de luz (por ejemplo, en el extremo que está en contacto con (o más cercano a) la ubicación de la muestra (4)) puede usarse en el dispositivo de la presente invención que también protege el dispositivo de la presente invención del polvo. En ausencia de dicha placa, la tubería de luz (o la sección de la tubería de luz) de la presente invención presiona la ubicación de la muestra (4) (por ejemplo, un chip de microfluidos) sólo con sus lados, lo que en caso de una ubicación de la muestra (4) no perfectamente plana (por ejemplo, un chip de microfluidos), puede provocar una falta de contacto físico con un primer medio de calentamiento (3) (por ejemplo, un bloque calefactor) en el medio de la ubicación de la muestra (4) (por ejemplo, un chip de microfluidos) y, en consecuencia, diferencias en transferencia de calor a través de la ubicación de la muestra (4). El espesor requerido de la placa depende en gran medida de la presión. El espesor ejemplar está entre 0,5 y 10 mm y preferentemente entre 1 y 5 mm. El material de la placa que presiona la ubicación de la muestra (4) (por ejemplo, un chip de microfluidos) es rígido y al menos parcialmente translúcido. Alternativamente, se puede presionar una ubicación de muestra (4) (por ejemplo, un chip de microfluidos) con una placa de metal que tiene aberturas sobre los compartimentos de microfluidos para permitir el paso de la radiación electromagnética. Alternativamente, todavía se puede presionar una ubicación de muestra (4) (por ejemplo, un chip de microfluidos) usando los bordes de la tubería de luz (o la sección de la tubería de luz) de la presente invención.

En una realización, la presente invención proporciona un dispositivo de ciclado térmico que comprende: a) una ubicación de muestra (4) configurada para recibir múltiples muestras; b) una tubería de luz hueca (1), que comprende una sección de tubería de luz que comprende un primer y un segundo extremo, en el que dicha sección de tubería de luz está configurada para homogeneizar la distribución de intensidad espacial de la radiación electromagnética mediante reflexión, preferentemente la reflectancia es mayor superior al 50 %, más preferentemente superior al 90 %; c) un primer medio de calentamiento (3) que es una fuente de calor de contacto, en el que dicho primer medio de calentamiento está configurado para llevar una muestra en dicha ubicación de muestra a al menos aproximadamente una primera temperatura; d) un segundo medio de calentamiento (2) que es una fuente de radiación electromagnética, en el que dicho segundo medio de calentamiento está configurado para llevar simultáneamente múltiples muestras en dicha ubicación de muestra a una segunda temperatura dirigiendo la radiación electromagnética al extremo de la primera sección de la tubería de luz y a la sección de tubería de luz está configurada para dirigir dicha radiación electromagnética que tiene una distribución de intensidad espacial homogeneizada a través de su segundo extremo simultáneamente a las múltiples muestras en la ubicación de la muestra (4); e) opcionalmente, medios de bloqueo completo de la radiación electromagnética, preferentemente un obturador mecánico que bloquee completamente la radiación electromagnética cuando está cerrado; f) opcionalmente, medios de enfriamiento de dicha sección de tubería de luz (o medios de enfriamiento de la tubería de luz), preferentemente medios de enfriamiento externo; g) opcionalmente, un filtro óptico de paso largo (12); h) opcionalmente, filtro adicional (13); i) opcionalmente, filtro adicional (14); j) opcionalmente, medios para mover la sección de la tubería de luz (o medios para mover la tubería de luz) y ejercer fuerza sobre la ubicación de la muestra (4); k) opcionalmente, una placa colocada entre la sección de la tubería de luz (o la tubería de luz) y la ubicación de la muestra (4).

En otra realización, la presente invención proporciona un dispositivo de ciclado térmico que comprende además: a) una primera sección de tubería de luz que puede funcionar al menos para recoger radiación electromagnética, preferentemente de al menos una lámpara halógena; b) una segunda sección de tubería de luz al menos operable para recoger excitación fluorescente y transmitir luz de emisión de fluorescencia, preferentemente dicha segunda sección de tubería de luz está configurada para homogeneizar la intensidad de excitación fluorescente; c) una tercera sección de tubería de luz al menos operable para iluminar dichas múltiples muestras en la ubicación de la muestra (4) con radiación electromagnética y excitación fluorescente y para transmitir luz de emisión fluorescente a la segunda sección de tubería de luz, preferentemente dicha tercera sección de tubería de luz está configurada para homogeneizar la intensidad de excitación fluorescente; d) un filtro óptico configurado para reflejar la luz visible y transmitir radiación electromagnética; en el que al menos una sección de tubería de luz está configurada para homogeneizar la distribución de intensidad espacial de la luz y la radiación electromagnética mediante reflexión, preferentemente cada sección de tubería de luz está configurada para homogeneizar la distribución de intensidad espacial de la luz y la radiación electromagnética mediante reflexión, más preferentemente la reflectancia es mayor que el 50 %, más preferentemente la reflectancia es mayor que el 90 %; e) opcionalmente, medios de bloqueo completo de la radiación electromagnética, preferentemente un obturador mecánico que bloquee completamente la radiación electromagnética cuando está cerrado; f) opcionalmente, medios de enfriamiento de al menos una sección de tubería de luz (o medios de enfriamiento de la tubería de luz), preferentemente medios de enfriamiento externo; g) opcionalmente, un filtro óptico de paso largo (12); h) opcionalmente, filtro adicional (13); i) opcionalmente, filtro adicional (14); j) opcionalmente, medios para mover la sección de la tubería de luz (o medios para mover la tubería de luz) y ejercer fuerza sobre la ubicación de la muestra (4); k) opcionalmente, una placa colocada entre la tercera sección de la tubería de luz (o la tubería de luz) y la ubicación de la muestra (4). En otra realización, la presente invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico de la presente invención que comprende además una tubería de luz (1), en el que dicha tubería de luz (1) comprende dicha primera, segunda y tercera secciones de tubería de luz.

En otra realización de la presente invención, una intensidad de excitación fluorescente se homogeneiza al menos mediante una tercera sección de tubería de luz, en el que una segunda sección de tubería de luz solo está configurada preferentemente para homogeneizar dicha intensidad de excitación fluorescente.

En otra realización, la presente invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico de la presente invención, que comprende, además: una fuente de luz (5), preferentemente dicha fuente de luz es una fuente de excitación de fluorescencia; y una cámara (8), preferentemente dicha cámara es una cámara de detección de luz fluorescente emitida. En otra realización, la presente invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico de la presente invención, en el que: a) dicha primera sección de tubería de luz es al menos operable para recoger radiación electromagnética de dicho segundo medio de calentamiento (2); b) dicha segunda sección de tubería de luz es al menos operativa para recoger la excitación fluorescente de dicha fuente de luz (5) y transmitir una luz de emisión de fluorescencia desde dicha tercera sección de tubería de luz a dicha cámara (8); c) dicha tercera sección de tubería de luz es al menos operable para iluminar dicha ubicación de muestra (4) con dicha radiación electromagnética y dicha excitación fluorescente y para transmitir dicha luz de emisión fluorescente desde dicha ubicación de muestra (4) a dicha segunda sección de tubería de luz. Según la presente invención, dichos primeros medios de calentamiento (3) son medios de calentamiento por contacto. En otra realización, la presente invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico de la presente invención, en el que al menos una de dicha primera, segunda o tercera secciones de tubería de luz está hecha de metal, preferentemente para facilitar el enfriamiento de dicha sección de tubería de luz, por ejemplo, refrigeración externa y/o para proporcionar rigidez estructural que pueda usarse para presionar la ubicación de la muestra (4), por ejemplo, chip microfluídico, a primeros medios de calentamiento, por ejemplo, bloque térmico.

En otra realización, la presente invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico de la presente invención, en el que dicha tubería de luz (1) está hecho de metal, preferentemente para facilitar el enfriamiento de dicha tubería de luz, por ejemplo, enfriamiento externo, y/o para proporcionar una rigidez estructural que pueda usarse para presionar la ubicación de la muestra (4), por ejemplo, un chip microfluídico, al primer medio de calentamiento, por ejemplo, un bloque térmico.

En otra realización, la presente invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico de la presente invención, en el que dicha tercera sección de tubería de luz o dicha tubería de luz (1) está configurado para presionar dicha ubicación de muestra (4) contra dicho medio de calentamiento de contacto (3). En otra realización, la presente invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico de la presente invención, en el que dicha tubería de luz (1) está configurada para presionar dicha ubicación de muestra (4) contra dicho medio de calentamiento de contacto (3). En otra realización, la presente invención proporciona el dispositivo de ciclado térmico de la presente invención, en el que al menos dicha tercera sección de tubería de luz o tubería de luz (1) tiene una estructura rígida.

En otra realización más de la presente invención, la tubería de luz hueca o la sección de tubería de luz hueca (por ejemplo, primera, segunda o tercera) de la presente invención es capaz de transmitir (o dirigir) luz (por ejemplo, excitación fluorescente desde la fuente de luz (5) y emisión fluorescente desde la ubicación de la muestra (4)) en ambas direcciones (por ejemplo, hacia y desde la ubicación de la muestra (4), lo cual es particularmente ventajoso para la detección de fluorescencia. Una ventaja particular del uso de una tubería de luz hueca de la presente invención es que, aunque la tubería de luz homogeneiza la distribución de intensidad espacial de la excitación de la fluorescencia, siempre es posible observar directamente la fluorescencia emitida desde la ubicación de la muestra (4) (por ejemplo, un chip de microfluidos) (por ejemplo, sin reflejos en los lados de la tubería de luz) si se mira directamente a través de la tubería de luz.

En otra realización de la invención el ciclado térmico es el ciclado térmico de PCR (preferentemente ciclado térmico de PCR en tiempo real o ciclado térmico de PCR digital). En otra realización de la invención, un dispositivo de ciclado térmico es un dispositivo de ciclado térmico de PCR (preferentemente un dispositivo de ciclado térmico de PCR en tiempo real o un dispositivo de ciclado térmico de<p>C<r>digital). En una realización adicional de la invención, las muestras son muestras de PCR (por ejemplo, mezclas de reacción de PCR) (preferentemente muestras de PCR en tiempo real o muestras de PCR digitales). La PCR en tiempo real es extremadamente sensible al ciclo térmico no uniforme y, por lo tanto, la uniformidad del ciclo térmico es crucial para un procedimiento (o procedimiento) de PCR en tiempo real preciso y confiable. En una realización adicional de la invención, un dispositivo de la presente invención comprende una unidad de detección de fluorescencia. La uniformidad (u homogeneidad) de la iluminación también es crucial para la detección de fluorescencia (por ejemplo, en PCR en tiempo real), porque permite comparar cuantitativamente las intensidades de fluorescencia entre muestras en diferentes ubicaciones del contenedor. En otra realización de la invención, el uso de la tubería de luz de la presente invención (por ejemplo, una tubería metálico hueco) permite utilizar elementos ópticos, por ejemplo, como espejos dicroicos, dentro de la tubería de luz, lo que crea una barrera de seguridad entre la unidad de detección de fluorescencia y una fuente de radiación electromagnética. En otra realización de la invención, se utiliza un espejo dicroico (7) para reflejar la radiación electromagnética mientras deja pasar la luz fluorescente de excitación y emisión. En otra realización de la invención se utiliza un espejo dicroico (6) para reflejar la luz de excitación y dejar pasar la luz de emisión. En otra realización de la invención, el filtro de emisión (9) se utiliza para bloquear aún más la luz de excitación parásita mientras deja pasar la luz de emisión. En otra realización de la invención, el dispositivo de la presente invención comprende opcionalmente un filtro adicional (10), en el que dicho filtro adicional refleja longitudes de onda por debajo del infrarrojo (figura 1). En otra realización de la invención se utiliza un filtro (10) para conservar la función de la tubería de luz a pesar del orificio en su pared. En otra realización de la presente invención, el dispositivo de la presente invención comprende un espejo dicroico (6) y/o un filtro de emisión (9), que son filtros de fluorescencia multibanda para permitir la detección simultánea de muchos colorantes, por ejemplo, juego de filtros DA/FI/TR/Cy5-A-000 de Semrock, que permite la detección de DAPI, FITC, TRITC y Cy5. En otra realización de la presente invención, el dispositivo de la presente invención comprende espejos dicroicos multibanda para la detección multiplexada de productos de amplificación por PCR, eliminando la necesidad de múltiples espejos dicroicos de banda única y mecano ópticos precisos para alinear la luz de múltiples fuentes de LED. En otra realización de la invención, la fuente de luz (5) (por ejemplo, fuente de luz de excitación de fluorescencia) es LED RGB (diodos emisores de luz rojo, verde y azul). En otra realización de la invención, la fuente de luz (5) (por ejemplo, fuente de luz de excitación fluorescente) es una multitud de fuentes de luz de diferentes tipos, lo que no compromete la calidad de la iluminación porque la falta de uniformidad de la fuente de luz se reduce completamente mediante el uso de tuberías de luz de la presente invención, por ejemplo, tubería de luz metálica. En otra realización preferida más de la invención, el dispositivo de la presente invención comprende filtros multibanda (9) que permiten la detección de un colorante fluorescente sensible a la temperatura, por ejemplo, Rodamina B, permitiendo así medir la temperatura de la muestra en tiempo real durante la PCR. En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para controlar la temperatura de muestras en tiempo real durante el ciclo térmico, comprendiendo dicho procedimiento: mantener encendida la fuente de excitación de fluorescencia (5) o encenderla periódicamente mientras se leen simultáneamente los cambios de excitación de fluorescencia causados por el cambio de temperatura utilizando la cámara (8) durante el ciclo térmico. Las lecturas de temperatura de las muestras permiten establecer tiempos de calentamiento y enfriamiento descritos en los procedimientos de la presente invención. En otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento para la amplificación uniforme, simultánea y ultrarrápida de muestras (por ejemplo, múltiples muestras) con PCR usando el dispositivo de ciclado térmico de la invención, comprendiendo dichas muestras ácido nucleico o fragmento de este, combinado con detección en tiempo real de productos amplificados (por ejemplo, productos de PCR) que utilizan matrices intercaladas como, por ejemplo, SybrGreen. En otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento para la amplificación uniforme y simultánea de muestras con PCR usando el dispositivo de ciclado térmico de la invención, comprendiendo dichas muestras un ácido nucleico o un fragmento de este, combinado con la detección en tiempo real del producto amplificado, comprendiendo dicho procedimiento:

(a) mantener la temperatura del primer medio de calentamiento (3) a una temperatura específica (por ejemplo, a 55 °C o, por ejemplo, 55 °C ± 10 °C o, por ejemplo, 55 °C ± 15 °C), en el que dicha temperatura específica está por debajo o igual a la temperatura de hibridación de los cebadores de PCR;

(b) mientras se mantiene dicha temperatura constante, encender la fuente de radiación electromagnética (2) a una energía constante durante un período de tiempo específico (por ejemplo, 15 W de energía total durante 2 segundos), calentando uniforme y simultáneamente dichas muestras hasta que alcancen la temperatura de desnaturalización del ADN;

(c) mientras se mantiene la temperatura del primer medio de calentamiento (3), apagar la fuente de radiación electromagnética (2) durante un período de tiempo específico (por ejemplo, 5 segundos), enfriando dichas muestras (preferentemente enfriando rápidamente dichas muestras, por ejemplo, a una velocidad de 6 °C/segundo o a una velocidad de 15 °C/segundo); preferentemente repetir las etapas (b) - (c) al menos 15 veces, más preferentemente repetir las etapas (b) - (c) al menos 20 veces, lo más preferentemente repetir las etapas (b) - (c) al menos 30 veces; más preferentemente repetir las etapas (b) - (c) al menos 40 veces; además preferentemente repetir las etapas (b) - (c) al menos 60 veces;

(d) después de un período de tiempo específico (por ejemplo, 4 segundos desde el final de la etapa b)) encender la fuente de excitación de fluorescencia, excitando de manera uniforme y simultánea dichas muestras, y realizando simultáneamente la detección de la luz de fluorescencia emitida usando la cámara (8).

En otra realización de la presente invención, se crea un gradiente térmico constante en el primer medio de calentamiento (3), que es una fuente de calor de contacto (por ejemplo, bloque de calentamiento) durante la PCR (por ejemplo, el lado izquierdo se establece a 50 °C y el lado derecho - a 60°C con temperaturas intermedias). Durante el ciclado de la PCR, una fuente de radiación electromagnética proporciona la misma cantidad de energía a cada muestra, pero la temperatura del primer medio de calentamiento (3) (por ejemplo, bloque calefactor) es diferente para cada una de ellas, por lo que experimentan diferentes condiciones de ciclado (por ejemplo, diferentes temperaturas de recocido). Después de realizar la PCR, un usuario puede verificar qué condiciones de ciclado han sido óptimas (por ejemplo, verificadas por una gran cantidad de un producto específico) y luego usar la temperatura óptima (por ejemplo, temperatura de recocido óptima) del primer medio de calentamiento (3) (por ejemplo, bloque de calentamiento) para futuros experimentos. En otra realización de la presente invención, se ejecutan en paralelo diferentes temperaturas de PCR (es decir, diferentes temperaturas de recocido en un procedimiento de la presente invención) en el primer medio de calentamiento (3). En otra realización de la invención, la temperatura del primer medio de calentamiento (3) se usa para eliminar (o compensar) cualquier falta de uniformidad en la temperatura de la muestra en la ubicación de la muestra causada por faltas de uniformidad residuales en la intensidad de la distribución de la radiación en la ubicación de la muestra mediante la introducción cambios espaciales en la temperatura del primer medio calefactor (3) (por ejemplo, elemento calefactor). En otra realización de los procedimientos de la invención, las etapas (b) - (c) comprenden un ciclo de PCR y se repiten periódicamente hasta que el recuento de ciclos alcanza el número especificado (por ejemplo, deseado). En otra realización de la invención, la ubicación de la muestra (4) (por ejemplo, recipiente de muestra o soporte de muestra) es un chip de microfluidos que contiene multitud de compartimentos. En una realización adicional, es una microplaca de PCR, que es, por ejemplo, una placa de PCR pipeteada por un operador experto o un robot. La invención está respaldada además por los siguientes ejemplos y figuras sin limitarse a dichas figuras y ejemplos.

Modos de llevar a cabo la invención, incluido el mejor modo de llevar a cabo la invención

Ejemplos de la invención

Las figuras 1-4 y 9-11 proporcionan realizaciones preferidas ejemplares no limitantes de la presente invención:

La figura 1 describe un dispositivo ejemplar de la presente invención que comprende: a) una ubicación de muestra (4) configurada para recibir múltiples muestras; b) una tubería de luz hueca (1), que comprende una sección de tubería de luz que comprende un primer y un segundo extremo, en el que dicha sección de tubería de luz está configurada para homogeneizar la distribución de intensidad espacial de la radiación electromagnética mediante reflexión; c) un primer medio de calentamiento (3) que es una fuente de calor de contacto, en el que dicho primer medio de calentamiento está configurado para llevar una muestra en dicha ubicación de muestra a al menos aproximadamente una primera temperatura; d) un segundo medio de calentamiento (2) que es una fuente de radiación electromagnética, en el que dicho segundo medio de calentamiento está configurado para llevar simultáneamente múltiples muestras en dicha ubicación de muestra a una segunda temperatura dirigiendo la radiación electromagnética al extremo de la primera sección de la tubería de luz y a la sección de tubería de luz está configurada para dirigir dicha radiación electromagnética que tiene una distribución de intensidad espacial homogeneizada a través de su segundo extremo simultáneamente a las múltiples muestras recibidas en la ubicación de la muestra (4), una fuente de luz (5), una cámara (8), un espejo dicroico (6), un espejo dicroico (7), en el que al menos los espejos dicroicos (6,7)están colocados dentro de la tubería de luz hueca (1), un filtro de fluorescencia (9) y un filtro adicional (10), en el que dicho filtro adicional (10) refleja longitudes de onda por debajo del infrarrojo.

La figura 2 describe un dispositivo ejemplar de la presente invención que comprende, además: una fuente de luz (5), una cámara (8), un espejo dicroico (6) y un espejo dicroico (7), en el que al menos los espejos dicroicos (6, 7) se colocan en el interior de la tubería de luz (1).

La figura 3 describe un mejor modo de llevar a cabo la invención: un dispositivo ejemplar de la presente invención, en el que el dispositivo de ciclado térmico inventivo comprende adicionalmente: una fuente de luz (5), una cámara (8), un espejo dicroico (6), un espejo dicroico (7), en el que los espejos dicroicos (6, 7) están colocados dentro de la tubería de luz hueca (1), un filtro de fluorescencia (9), un filtro adicional (10), en el que dicho filtro adicional (10) refleja longitudes de onda por debajo infrarrojos, y un filtro de excitación (11).

La figura 4 describe un dispositivo ejemplar de la presente invención que comprende, además: una fuente de luz (5), una cámara (8), un espejo dicroico (6), un espejo dicroico (7), en el que al menos los espejos dicroicos (6, 7) se encuentran en el interior de la tubería de luz (1), un filtro de fluorescencia (9) y un filtro de excitación (11).

La figura 9 describe un dispositivo ejemplar de la presente invención que comprende, además: una tubería de luz hueca (1) de estructura rígida, preferentemente hecho de metal grueso, una fuente de luz (5), una cámara (8) y un filtro óptico de paso largo (12), en el que el filtro óptico de paso largo (12) está dentro de la tubería de luz (1) y colocado entre la fuente de radiación (2) y la ubicación de la muestra (4).

La figura 10 describe un dispositivo ejemplar de la presente invención que comprende adicionalmente: una tubería de luz (1) de estructura rígida, preferentemente hecho de metal grueso, en el que dicha tubería de luz (1) tiene al menos una abertura en su pared, dicha abertura colocada opuesta un filtro óptico (13), una fuente de luz (5), una cámara (8), un filtro óptico de paso largo (12), en el que el filtro óptico de paso largo (12) está dentro de la tubería de luz (1) y colocado entre la fuente de radiación (2) y la ubicación de muestra (4), un filtro óptico (13), en el que el filtro óptico (13) está dentro de la tubería de luz (1), colocado frente a la abertura en la pared de la tubería de luz (1) y refleja radiación IR y deja pasar la luz visible y un filtro óptico (14), donde el filtro óptico (14) es del mismo tipo que el filtro óptico (13), colocado en la abertura en la pared de la tubería de luz (1) y está configurado para aumentar la simetría óptica de la tubería de luz (1) y para aumentar la uniformidad de la radiación.

Las figuras 5-8 y 11 describen análisis de curvas de fusión ejemplares de muestras amplificadas en el dispositivo de la presente invención:

Amplificación por PCR Ejemplo 1

El uso de una tubería de luz hueca como se describe en el presente documento proporciona una forma altamente eficiente y rentable de lograr una distribución uniforme, simultánea y ultrarrápida de energía electromagnética a las muestras y la iluminación de dichas muestras con luz con fines de detección. El uso del dispositivo (por ejemplo, como se describe en la figura 1), la tubería de luz y los procedimientos de la presente invención demostró un ciclo térmico uniforme, simultáneo y ultrarrápido de 42 muestras de PCR de dos tamaños diferentes. El tiempo requerido para cada ciclo de PCR que consta de las etapas b)-c) del procedimiento fue de solo 3,7 segundos o 7 segundos, lo que se verificó con éxito mediante análisis de seguimiento de la presencia de un producto de amplificación de PCR específico (por ejemplo, análisis de curva de fusión). Las curvas de fusión muestran la fusión de las 42 muestras (figura 5), una fila de 7 muestras (figura 6) y una única curva de fusión de una única muestra (figura 7) que se amplificaron simultáneamente en el dispositivo descrito en la presente invención. La PCR se realizó utilizando el plásmido pJET con el gen LepA clonado de Mycobacterium smegmatis como plantilla. El fragmento amplificado tenía 126 pb de largo y contenía el 58 % de los pares de GC. Cebador directo (FP1-SEQ ID No. 1): tcttgccctctttctgcttc, cebador inverso (RP1-SEQ ID No. 2): cgcaatgattctcgagccgatc. El tiempo del ciclo de PCR fue de 7 segundos y se realizaron 60 ciclos. El volumen inicial de muestra fue de 0,65 pl y se diluyó a 10 pl para el análisis de la curva de fusión que se llevó a cabo en el sistema de PCR en tiempo real rápido 7500 de Applied Biosystems.

Amplificación por PCR Ejemplo 2

Otra curva de fusión muestra la fusión del mismo objetivo amplificado con un tiempo de ciclo de 3,7 segundos, el volumen de la muestra fue de 3 pl y la muestra se diluyó como en el ejemplo anterior a 10 pl (figura 8). Un ligero cambio en la temperatura de fusión se debe a cambios en la composición del tampón debido a la dilución.

Amplificación por PCR Ejemplo 3

Se llevó a cabo otro experimento de amplificación por PCR en el dispositivo según la figura 9, lo que permitió obtener la fusión directamente en el chip. La p Cr se realizó utilizando el plásmido pJET con un fragmento del gen GAPDH humano clonado. El fragmento amplificado tenía una longitud de 125 pb y contenía el 53 % de los pares de GC. El cebador directo fue (FP2-SEQ ID No. 3): TCTCCTCTGACTTCAACAGCGAC, cebador inverso - (RP2-SEQ ID No. 4): CCCTGTTGCTGTAGCCAAATTC. El tiempo de calentamiento fue de 1,75 segundos (por ejemplo, con halógeno encendido), el tiempo de enfriamiento fue de 5 segundos y se realizaron 60 ciclos. La figura 11 (eje y: medición de fluorescencia, eje x: temperatura) muestra el análisis de la curva de fusión de las 55 muestras que se amplificaron en el chip del dispositivo según la figura 9.

Todas las curvas de fusión muestran un producto de amplificación por PCR específico sin dímeros de cebador (por ejemplo, figuras 5-8, 11). Por lo tanto, el dispositivo de la presente invención (por ejemplo, como se describe en las figuras 1 y 9) produjeron productos de amplificación por<p>C<r>específicos.

En el sentido de la presente invención, cualquier realización única de la presente invención mencionada en el presente documento se puede combinar con otra realización única o múltiple de la presente invención mencionada en el presente documento.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un dispositivo de ciclado térmico que comprende:

a) una ubicación de muestra (4) configurada para recibir múltiples muestras;

b) una tubería de luz hueca (1), que comprende una sección de tubería de luz que comprende un primer y un segundo extremo, en el que dicha sección de tubería de luz está configurada para homogeneizar la distribución de intensidad espacial de la radiación electromagnética mediante reflexión;

c) un primer medio de calentamiento (3) que es una fuente de calor de contacto, en el que dicho primer medio de calentamiento está configurado para llevar una muestra en dicha ubicación de muestra a al menos aproximadamente una primera temperatura;

d) un segundo medio de calentamiento (2) que es una fuente de radiación electromagnética, en el que dicho segundo medio de calentamiento está configurado para llevar simultáneamente múltiples muestras en dicha ubicación de muestra a una segunda temperatura dirigiendo la radiación electromagnética al extremo de la primera sección de la tubería de luz y la sección de tubería de luz está configurada para dirigir dicha radiación electromagnética que tiene una distribución de intensidad espacial homogeneizada a través de su segundo extremo simultáneamente a las múltiples muestras recibidas en la ubicación de la muestra (4).

2. El dispositivo de ciclado térmico de la reivindicación 1, en el que dicho segundo medio de calentamiento (2) es una fuente de radiación electromagnética infrarroja.

3. El dispositivo de ciclado térmico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicha tubería de luz está configurada para iluminar simultáneamente dichas múltiples muestras en dicha ubicación de muestra (4) con luz durante el ciclado térmico por medio de reflexión.

4. El dispositivo de ciclado térmico de cualquiera de las reivindicaciones 2-3,

en el que dicha tubería comprende una cámara que tiene una superficie reflectante en un lado y una superficie semirreflectante en el otro lado.

5. El dispositivo de ciclado térmico de cualquiera de las reivindicaciones 1-4,

en el que dicha tubería tiene una sección transversal seleccionada del grupo que consiste en: sección transversal rectangular, cuadrada y hexagonal.

6. El dispositivo de ciclado térmico de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

en el que dicho dispositivo comprende, además:

e) fuente de luz (5), preferentemente dicha fuente de luz es una fuente de excitación de fluorescencia, f) al menos un espejo dicroico (6), preferentemente un conjunto de espejos dicroicos (6, 7), más preferentemente el espejo dicroico (6) es un espejo dicroico de fluorescencia multibanda,

g) cámara (8), preferentemente dicha cámara es una cámara de detección de luz fluorescente emitida, h) al menos un filtro de fluorescencia (9), preferentemente dicho filtro de fluorescencia es un filtro de emisión, más preferentemente múltiples filtros de fluorescencia, lo más preferentemente dicho al menos un filtro de fluorescencia es un filtro de fluorescencia multibanda,

i) opcionalmente un filtro adicional (10), en el que dicho filtro adicional refleja longitudes de onda por debajo del infrarrojo.

7. El dispositivo de ciclado térmico de la reivindicación 6, en el que el filtro de fluorescencia (9) está configurado para medir los cambios de intensidad de fluorescencia de un tinte sensible a la temperatura añadido a la muestra, preferentemente dicho tinte sensible a la temperatura es rodamina B, más preferentemente dicho filtro de fluorescencia es un filtro multibanda.

8. Un uso del dispositivo de ciclado térmico de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para ciclado térmico uniforme y simultáneo de muestras, preferentemente para ciclado térmico uniforme, simultáneo y ultrarrápido de muestras.

9. Un uso del dispositivo según la reivindicación 7 para medir la temperatura de las muestras en tiempo real.

10. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, en el que dicha radiación electromagnética dirigida a dicha ubicación de muestra (4) está configurada para provocar simultáneamente un aumento de temperatura de al menos 5 °C de dichas múltiples muestras; preferentemente un aumento de temperatura de al menos 10 °C de dichas múltiples muestras; más preferentemente un aumento de temperatura de al menos 15°C de dichas múltiples muestras; lo más preferentemente, un aumento de temperatura de al menos 20 °C de dichas múltiples muestras.

11. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, en el que la uniformidad de la distribución de energía electromagnética desde el segundo medio de calentamiento (2) hasta dichas múltiples muestras en la ubicación de la muestra (4) es al menos el 90 %, preferentemente al menos el 95 %, más preferentemente a menos el 98 %.

12. Un procedimiento para la amplificación uniforme y simultánea de muestras con PCR usando un dispositivo de ciclado térmico según la reivindicación 6, comprendiendo dichas muestras un ácido nucleico o un fragmento de este, combinado con la detección en tiempo real del producto amplificado, comprendiendo dicho procedimiento:

(a) mantener la temperatura del primer medio de calentamiento (3) a una temperatura específica, en el que dicha temperatura específica es inferior o igual a la temperatura de hibridación de los cebadores de PCR;

(b) mientras se mantiene dicha temperatura constante, encender la fuente de radiación electromagnética (2) a una energía constante durante un período de tiempo específico, calentando uniforme y simultáneamente dichas muestras hasta que alcancen la temperatura de desnaturalización del ADN;

(c) mientras se mantiene la temperatura del primer medio de calentamiento (3), apagar la fuente de radiación electromagnética (2) durante un período de tiempo específico, enfriando dichas muestras; preferentemente repetir las etapas (b) - (c) al menos 15 veces, más preferentemente repetir las etapas (b) - (c) al menos 20 veces, lo más preferentemente repetir las etapas (b) - (c) al menos 30 veces; además preferentemente repetir las etapas (b) - (c) al menos 40 veces;

(d) después de un período de tiempo específico, encender la fuente de excitación de fluorescencia (5), excitando de manera uniforme y simultánea dichas muestras, y realizando simultáneamente la detección de la luz fluorescente emitida usando la cámara (8).

13. Un procedimiento para controlar la temperatura de muestras en el dispositivo de la reivindicación 7 en tiempo real durante el ciclo térmico, comprendiendo dicho procedimiento: mantener encendida la fuente de excitación de fluorescencia (5) o encenderla periódicamente, mientras se leen simultáneamente los cambios de excitación de fluorescencia causados por el cambio de temperatura utilizando la cámara (8) durante el ciclo térmico.