ES2575952T3 - Formación de imágenes fluorescentes ópticas que utiliza colorantes cianina - Google Patents
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Abstract
Compuesto de fórmula: **Fórmula** en el que (1) R11 es F, y R16 es F; o (2) R11 es H, y R16 es SO3-Na+; o (3) R11 es SO3-Na+, y R16 es H; o (4) R11 es H, y R16 es F; o (5) R11 es F, y R16 es H; o (6) R11 es SO3-Na+, y R16 es F; o (7) R11 es F, y R16 es SO3-Na+;
Description
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DESCRIPCION
Formacion de imageries fluorescentes opticas que utiliza colorantes cianina Antecedentes de la invencion
Los colorantes cianina han sido ampliamente utilizados para el marcado de ligandos o biomoleculas en una variedad de aplicaciones, tales como la secuenciacion de ADN. Vease, por ejemplo, la patente de US n° 5.571.388 para ver ejemplos de metodos de identificacion de cadenas de ADN que utilizan colorantes cianina. Los cientfficos prefieren el uso de colorantes cianina en aplicaciones biologicas, entre otras razones, porque muchos de ellos operan en la region del IR cercano (NIR) del espectro (600-1.000 nm). Esto hace que dichos colorantes cianina sean menos susceptibles a la interferencia por autofluorescencia de las biomoleculas.
Otras ventajas de los colorantes cianina son: 1) los colorantes cianina absorben y fluorescen la luz intensamente; 2) muchos colorantes cianina no palidecen rapidamente bajo el microscopio de fluorescencia; 3) pueden obtenerse derivados de colorantes cianina que sean reactivos de acoplamiento simples y eficaces; 4) estan disponibles muchas estructuras y procedimientos de sfntesis, y la clase de colorantes es versatil; y 5) los colorantes cianina son relativamente pequenos (tfpicamente tienen un peso molecular de aproximadamente 1.000 daltons), de modo que no provocan una interferencia esterica apreciable que pueda reducir la capacidad de una biomolecula marcada para alcanzar su sitio de union o llevar a cabo su funcion.
A pesar de sus ventajas, muchos de los colorantes cianina conocidos presentan una serie de desventajas. Algunos colorantes cianina conocidos no son estables en presencia de ciertos reactivos de uso comun en los bioensayos. Entre dichos reactivos se incluyen hidroxido de amonio, ditiotreitol (DTT), aminas primarias y secundarias, y persulfato de amonio (APS). Ademas, algunos colorantes cianina conocidos carecen de la estabilidad termica y la fotoestabilidad necesarias para aplicaciones biologicas, tales como la secuenciacion del ADN y la determinacion del genotipo.
Por estas razones se necesitan colorantes cianina estables y mejorados, especialmente para su utilizacion en el marcado de biomoleculas y la formacion de imagenes ("imaging") in vivo para el diagnostico y la valoracion del pronostico del cancer y otras enfermedades.
El cancer de prostata humano surge inicialmente como una neoplasia en el epitelio de la prostata. La progresion del tumor hacia una enfermedad invasiva y metastasica se puede producir a lo largo de un perfodo de anos y se retrasa mediante las terapias de ablacion de androgenos en las primeras etapas. A menudo, las celulas tumorales que retoman el crecimiento independientemente de los androgenos metastatizan en los ganglios linfaticos y huesos. Las complicaciones de las metastasis oseas son la causa mas comun de la mortalidad por cancer de prostata.
La expresion del receptor de EGF se eleva aproximadamente en un factor de 100 sobre los niveles celulares normales en muchos tipos de celulas tumorales, incluidas las de prostata, por lo que es un buen biomarcador general para la identificacion del tumor. Su ligando, el EGF, ha sido marcado con exito con FITC para caracterizar la union al receptor y la endocitosis (vease Carraway, K. L., 3a, y R. A. Cerione, 1993. Biochemistry 32(45):12039- 12045), y con Cy5.5 para monitorizar la terapia de dianas moleculares en xenoinjertos de cancer de mama in vivo (vease Shi K. y otros 2003, Cancer Research 63:7870-7875). Sin embargo, ni el FITC ni el Cy5.5 proporcionan la sensibilidad necesaria para la formacion de imagenes opticas.
El documento WO 2007/005222 A2 da a conocer colorantes cianina como silenciadores de NIR y sondas biologicas en ensayos biologicos. El documento WO 02/24815 A1 da a conocer colorantes cianina para su utilizacion en el marcado de biomoleculas. El documento WO 00/16810 A da a conocer agentes de contraste fluorescentes en el infrarrojo cercano. El documento WO 2004/065491 A1 da a conocer colorantes fluorescentes y conjugados de estos colorantes con biomoleculas.
Existe una necesidad de composiciones y metodos sensibles para detectar y medir un objetivo interno de forma no invasiva. Dichas composiciones y metodos deben facilitar el analisis de las respuestas a diversas terapias. La presente invencion satisface estas y otras necesidades.
Breve sumario de la invencion
Los compuestos de la presente invencion, tal como se definen en las reivindicaciones 1 a 3, resuelven, por lo menos, algunos de los problemas de la tecnica descrita anteriormente. Mientras que el alcance de la presente invencion se define en las reivindicaciones 1 a 3, la siguiente descripcion proporciona, ademas, una divulgacion general.
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En un aspecto de la presente divulgacion general, se da a conocer un compuesto de formula (I):
H, alquilo, o forman opcionalmente un anillo junto con el grupo
independientemente, numeros enteros comprendidos entre 0 y 5; X e Y son, cada uno independientemente, O, S, Se o cR19R20, donde R19 y R20 son, cada uno independientemente, alquilo, o forman opcionalmente un anillo junto con el atomo de carbono al que estan unidos; R8 y R13 son, cada uno independientemente, alquilo, (CH2)rR25 o (CH2)rR18, donde, por lo menos, uno de entre R8 y R13 es (CH2)rR18, y donde r es un numero entero comprendido entre 1 y 50, y R25 es un grupo funcional no reactivo, por ejemplo, que no reacciona directamente con un grupo carboxilo, hidroxilo, amino o tiol, y R18 es un grupo funcional que puede reaccionar con un grupo carboxilo hidroxilo, amino o tiol; y R9- R12 y R14-R17son, cada uno independientemente, H, alquilo, halo, amino, sulfonato, R21COOH, R21OR22, R21SR22 o R COOR , donde R es un enlace o alquileno y R es alquilo, o R y R forman, opcionalmente, junto con los atomos a los que estan unidos, un anillo aromatico, o R16 y R17 forman, opcionalmente, junto con los atomos a los que estan unidos, un anillo aromatico.
En otro aspecto de la presente divulgacion general, se da a conocer un compuesto de formula (V):
Cat+ es un cation; X e Y son, cada uno independientemente, O, S, Se o (CH3hC; y R8 y R13 son, cada uno independientemente, alquilo, (CH2)rR o (CH2)rR ; donde, por lo menos, uno de entre R y R es (CH2)rR , y donde r es un numero entero comprendido entre 1 y 20, y R25 es un grupo funcional no reactivo que no reacciona directamente con un grupo carboxilo, hidroxilo, amino o tiol, y R18 es un grupo funcional que puede reaccionar con un grupo carboxilo, hidroxilo, amino o tiol; R11 y R12 son H, sulfonato o forman, junto con los atomos a los que estan unidos, un anillo aromatico; y R16 y R17 son H, sulfonato o forman, junto con los atomos a los que estan unidos, un anillo aromatico. Para alcanzar la neutralidad de carga, el experto en la materia entendera que, tras el primer grupo “sufonato” adicional de R , R , R y R , se anade un Cat . El primer grupo “sufonato” se neutraliza con el nitrogeno cuaternario.
En otro aspecto de la presente divulgacion general, un metodo de marcado de una biomolecula utilizando un colorante de formula (I) comprende hacer reaccionar un colorante de formula (I) con la biomolecula. La biomolecula marcada con colorante resultante es otro aspecto de la divulgacion general.
En otro aspecto de la presente divulgacion general, un metodo de marcado de una biomolecula utilizando un colorante de formula (V) comprende hacer reaccionar un colorante de formula (V) con la biomolecula. La biomolecula marcada con colorante resultante es otro aspecto de la divulgacion general.
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En otro aspecto de la presente divulgacion general, un kit para el marcado de biomoleculas comprende un colorante de formula (I) y un tampon. De modo similar, en otro aspecto de la presente divulgacion general, un kit para el marcado de biomoleculas comprende un colorante de formula (V) y un tampon.
En otro aspecto, la presente divulgacion da a conocer un compuesto de formula XXI:
donde Cat+ es un cation; r es un numero entero igual a 1, 2 o 3; X e Y son, cada uno independientemente, O, S, Se
q 1 o ^ or 1 q
o (CH3)2C; y R y R son, cada uno independientemente, alquilo, L-R o L-B; donde, por lo menos, uno de entre R y R13 es L-B; R25 es un grupo funcional no reactivo que no reacciona directamente con un grupo carboxilo, hidroxilo, amino o tiol; L es un conector; B es un ligando; n es 0, 1, 2 o 3; R11 y R12 son, cada uno independientemente, F, H, sulfonato o forman, junto con los atomos a los que estan unidos, un anillo aromatico; y R16 y R17 son, cada uno independientemente, F, H, sulfonato o forman, junto con los atomos a los que estan unidos, un anillo aromatico. Para alcanzar la neutralidad de carga, el experto en la materia apreciara que, tras el primer grupo “sufonato” adicional de R , R , R y R , se anade un Cat . El primer grupo “sufonato” se neutraliza con el nitrogeno cuaternario. Preferentemente, r es 1.
La presente divulgacion da a conocer las caracterfsticas anteriores y otras, y las ventajas de la presente invencion se haran mas evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada de la presente divulgacion, tomada en consideracion junto con los ejemplos adjuntos. La descripcion detallada y los ejemplos son unicamente ilustrativos de la presente invencion y no limitativos del alcance de la misma, que resulta definida en las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripcion de las figuras
La figura 1 (graficos A-D) ilustra un analisis “in-cell Western” in vitro que caracteriza la eficacia de EGF-colorante 8b (del ejemplo 8) en las lfneas celulares PC3M-LN4 y 22Rv1. En el grafico A, se representa la union de la sonda EGF- colorante 8b a las celulas PC3M-LN4 y 22Rv1. El grafico B ilustra la baja afinidad del colorante 8b no conjugado y corresponde al nivel basal observado en el grafico A. En los graficos C y D, la union del colorante 8b marcado se bloqueo eficazmente mediante el pretratamiento de las celulas con EGF (C) o C225 (D) sin marcar.
La figura 2 muestra un perfil de eliminacion de EGF-colorante 8b de un raton negativo a tumor a lo largo de un perfodo de 24 horas.
La figura 3 muestra un perfil de eliminacion de EGF-colorante 8b de un tumor lateral subcutaneo a lo largo de un perfodo de 96 horas.
La figura 4 muestra el desarrollo temporal para el crecimiento tumoral de PC3M-LN4 a lo largo de un perfodo de 6 semanas.
La figura 5 muestra el desarrollo temporal para el crecimiento tumoral de 22Rv1 a lo largo de un perfodo de 6 semanas.
La figura 6 (graficos A-C) muestra los promedios para tumores de prostata 22Rv1 y PC3M-LN4 tras la extirpacion. El grafico A representa el volumen; el grafico B representa el peso y el grafico C es la SNR calculada a partir de imagenes tomadas en la semana 6.
La figura 7 ilustra comparaciones de los ganglios linfaticos de los tratamientos con EGF-colorante 8b y C225 + EGF- colorante 8b.
Descripcion detallada de la invencion
I. Definiciones
“Alcanoflo” significa un grupo alquilo-C(O) en el que el grupo alquilo es tal como se define en la presente memoria. Entre los grupos alcanoflo representativos se incluyen metoflo, etoflo y similares.
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“Alcoxialquilo” significa un grupo alquilo-O-alquileno en el que el alquilo y el alquileno son tal como se definen en la presente memoria. Entre los grupos alcoxialquilo representativos se incluyen metoxietilo, etoximetilo, n-butoximetilo y ciclopentilmetiloxietilo.
“Alcoxicarbonilo” significa un grupo ester; es decir, un grupo alquilo-O-CO- en el que el alquilo es tal como se define en la presente memoria. Entre los grupos alcoxicarbonilo representativos se incluyen metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, t-butiloxicarbonilo y similares.
“Carbamoflo” significa un grupo alquilo-NH-CO- en el que el grupo alquilo es tal como se define en la presente memoria. Los grupos carbamoflo preferidos son aquellos en los que el grupo alquilo es un alquilo inferior.
“Alcoxicarbonilalquilo” significa un grupo alquilo-O-CO-alquileno en el que el alquilo y el alquileno son tal como se definen en la presente memoria. Entre los alcoxicarbonilalquilos representativos se incluyen metoxicarbonilmetilo y etoxicarbonilmetilo, metoxicarboniletilo y similares.
“Alquilo” significa un grupo hidrocarburo alifatico, que puede ser de cadena lineal o ramificada, con entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 atomos de carbono en la cadena. Los grupos alquilo preferidos tienen de 1 a aproximadamente 12 atomos de carbono en la cadena. Ramificado significa que uno o mas grupos alquilo inferiores, tales como metilo, etilo o propilo, estan unidos a una cadena de alquilo lineal. “Alquilo inferior” significa de 1 a aproximadamente 6 atomos de carbono, preferentemente de aproximadamente 5 atomos de carbono en la cadena, que puede ser lineal o ramificada. El alquilo esta opcionalmente sustituido con uno o mas “sustituyentes del grupo alquilo”, que pueden ser iguales o diferentes, entre los que se incluyen los grup os halo, cicloalquilo, hidroxi, alcoxi, amino, carbamoflo, acilamino, aroilamino, carboxi, alcoxicarbonilo, aralquiloxicarbonilo o heteroaralquiloxicarbonilo. Entre los grupos alquilo representativos se incluyen metilo, trifluorometilo, ciclopropilmetilo, ciclopentilmetilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, 1-butilo, n-pentilo, 3-pentilo, metoxietilo, carboximetilo, metoxicarboniletilo, benciloxicarbonilmetilo y piridilmetiloxicarbonilmetilo.
En otros aspectos, “alquilo” es un grupo alifatico saturado, incluidos grupos alquilo de cadena lineal sustituidos y no sustituidos, grupos alquilo ramificados sustituidos y no sustituidos, y grupos cicloalquilo sustituidos y no sustituidos. El termino “alquilo” incluye grupos alcoxi, haloalquilo, hidroxialquilo y alquiloxialquil eter. En formas de realizacion preferidas, un alquilo de cadena lineal o ramificada tiene 50 atomos de carbono o menos en su cadena principal, mas preferentemente 30 o menos, y todavfa mas preferentemente 10 o menos. Los cicloalquilos preferidos tienen de 3 a 10 atomos de carbono en su estructura de anillo, y mas preferentemente tienen de 3 a 6 atomos de carbono. “Alquilo inferior” significa un grupo alquilo que tiene de 1 a 10 atomos de carbono en su cadena principal, mas preferentemente de 1 a 6 atomos de carbono. Los grupos alquilo cfclicos pueden ser monocfclicos o policfclicos y contener de 3 a 12 atomos por anillo, aunque preferentemente de 1 a 9 atomos en la cadena principal. Entre los sustituyentes preferidos en una cadena principal de alquilo se incluyen radicales alquilo sustituidos o no sustituidos, grupos halo, carboxilo, amino y sulfanato.
En otros aspectos, “alquenilo” y “alquinilo” son sustituyentes alifaticos insaturados analogos en longitud y posible sustitucion a los radicales alquilo descritos anteriormente, pero que contienen, por lo menos, un doble o triple enlace, respectivamente.
“Alquileno” significa una cadena de hidrocarburo bivalente lineal o ramificada con entre 1 y aproximadamente 6 atomos de carbono. El alquileno esta opcionalmente sustituido con uno o mas “sustituyentes del grupo alquileno”, que pueden ser iguales o diferentes, entre los que se incluyen los grupos halo, cicloalquilo, hidroxi, alcoxi, carbamoflo, carboxi, ciano, arilo, heteroarilo u oxo. El alquileno esta opcionalmente interrumpido por un heteroatomo, es decir, un carbono del mismo esta sustituido por -O-, -S(=O)m (donde m es 0-2), o -NR'- (donde R' es un alquilo inferior). Entre los grupos alquileno preferidos se incluyen los grupos alquileno inferiores que tienen de 1 a aproximadamente 4 atomos de carbono. Entre los grupos alquileno representativos se incluyen metileno, etileno y similares.
“Alquilenoxicarbonilo” significa un grupo ester; es decir, un grupo alquileno-O-CO- en el que el alquileno es tal como se define en la presente memoria.
“Alquilenocarbamoflo” significa un grupo alquileno-NH-CO- en el que el grupo alquileno es tal como se define en la presente memoria. Entre los grupos alquilenocarbamoflo preferidos se incluyen aquellos en los que el grupo alquileno es un alquileno inferior.
“Alquilenosulfonilo” significa un grupo alquileno-SO2- en el que el grupo alquileno es tal como se define en la presente memoria. Entre los grupos alquilenosulfonilo preferidos se incluyen aquellos en los que el grupo alquileno es un alquileno inferior.
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“Alquilenosulfonilcarbamoflo” significa un grupo alquileno-SO2-NH-CO- en el que el grupo alquileno es tal como se define en la presente memoria.
“Alquenileno” significa una cadena de hidrocarburo bivalente lineal o ramificada que contiene, por lo menos, un doble enlace carbono-carbono. El alquenileno esta sustituido opcionalmente con uno o mas “sustituyentes del grupo alquileno”, tal como se definen en la presente memoria. El alquenileno esta opcionalmente interrumpido por un heteroatomo, es decir, un carbono del mismo esta sustituido por -O-, -S(O)m (donde m es 0-2) o -NR'- (donde R' es un alquilo inferior). Entre los alquenilenos representativos se incluyen -CH=CH-, -CH2CH=CH-, -C(CH3)=CH-, - CH2CH=CHCH2- y similares.
“Alquilsulfinilo” significa un grupo alquilo-SO- en el que el grupo alquilo es tal como se ha definido anteriormente. Los grupos alquilsulfinilo preferidos son aquellos en los que el grupo alquilo es un alquilo inferior.
“Alquilsulfonilo” significa un grupo alquilo-SO2- en el que el grupo alquilo es tal como se define en la presente memoria. Los grupos alquilsulfonilo preferidos son aquellos en los que el grupo alquilo es un alquilo inferior.
“Alquilsulfonilcarbamoflo” significa un grupo alquilo-SO2-NH-CO- en el que el grupo alquilo es tal como se define en la presente memoria. Los grupos alquilsulfonilcarbamoflo preferidos son aquellos en los que el grupo alquilo es un alquilo inferior.
“Alquiltio” significa un grupo alquilo-S- en el que el grupo alquilo es tal como se define en la presente memoria. Los grupos alquiltio preferidos son aquellos en los que el grupo alquilo es un alquilo inferior. Entre los grupos alquiltio representativos se incluyen metiltio, etiltio, i-propiltio, heptiltio y similares.
“Alquinilo” significa un grupo hidrocarburo alifatico lineal o ramificado con entre 2 y aproximadamente 15 atomos de carbono, que contiene, por lo menos, un un triple enlace carbono-carbono. Los grupos alquinilo preferidos tienen de 2 a aproximadamente 12 atomos de carbono. Los grupos alquinilo mas preferidos contienen de 2 a aproximadamente 4 atomos de carbono. “Alquinilo inferior” significa alquinilo con entre 2 y aproximadamente 4 atomos de carbono. El grupo alquinilo puede estar sustituido con uno o mas sustituyentes del grupo alquilo, tal como se definen en la presente memoria. Entre los grupos alquinilo representativos se incluyen etinilo, propinilo, n-butinilo, 2-butinilo, 3-metilbutinilo, n-pentinilo, heptinilo, octinilo, decinilo y similares.
“Alquiniloxi” significa un grupo alquinilo-O- en el que el grupo alquinilo es tal como se define en la presente memoria. Entre los grupos alquiniloxi representativos se incluyen propiniloxi, 3-butiniloxi y similares.
“Amino” significa un grupo de formula Y1Y2N-, en el que Yi e Y2 son, independientemente, hidrogeno; acilo; o alquilo, o bien Y1 e Y2, considerados junto con el N a traves del cual estan unidos Y1 e Y2, forman un azaheterociclilo con entre 4 y 7 miembros. Entre los grupos amino representativos se incluyen amino (H2N-), metilamino, dimetilamino, dietilamino y similares. Alternativamente, “amino” es un grupo -NRR', en el que R y R' pueden ser iguales o diferentes y pueden ser H o alquilo. Preferentemente, por lo menos uno de entre R y R' es H. Opcionalmente, se puede anadir un sustituyente adicional, obteniendose un ion de amonio cuaternario.
“Aminoalquilo” significa un grupo amino-alquileno en el que el amino y el alquileno son tal como se definen en la presente memoria. Entre los grupos aminoalquilo representativos se incluyen aminometilo, aminoetilo, dimetilaminometilo y similares.
“Aralquenilo” significa un grupo arilo-alquenileno en el que el arilo y el alquenileno son tal como se definen en la presente memoria. Los aralquenilos preferidos contienen un resto alquenileno inferior. Un grupo aralquenilo representativo es el 2-fenetenilo.
“Aralquiloxi” significa un grupo aralquilo-O-, en el que el aralquilo es tal como se define en la presente memoria. Entre los grupos aralquiloxi representativos se incluyen benciloxi, naft-1-ilmetoxi, naft-2-ilmetoxi y similares.
“Aralquiloxialquilo” significa un grupo aralquilo-O-alquileno en el que el aralquilo y el alquileno son tal como se definen en la presente memoria. Un grupo aralquiloxialquilo representativo es el benciloxietilo.
“Aralquiloxicarbonilo” significa un grupo aralquilo-O-CO- en el que el aralquilo es tal como se define en la presente memoria. Un grupo aralcoxicarbonilo representativo es el benciloxicarbonilo.
“Aralquilo” significa un grupo arilo-alquileno en el que el arilo y el alquileno son tal como se definen en la presente memoria. Los aralquilos preferidos contienen un resto alquilo inferior. Entre los grupos aralquilo representativos se incluyen bencilo, 2-fenetilo, naftalenometilo y similares.
“Aralquiltio” significa un grupo aralquilo-S- en el que el aralquilo es tal como se define en la presente memoria. Un grupo aralquiltio representativo es el benciltio.
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“Arilo” significa un sistema de anillo aromatico monodclico o multidclico con entre 6 y aproximadamente 14 atomos de carbono, preferentemente con entre 6 y aproximadamente 10 atomos de carbono. El arilo esta opcionalmente sustituido con uno o mas “sustituyentes de sistema de anillo”, que pueden ser iguales o diferentes, y son tal como se definen en la presente memoria. Entre los grupos arilo representativos se incluyen fenilo y naftilo.
“Arileno” significa un radical de sistema de anillo aromatico monodclico o multidclico bivalente con entre 6 y aproximadamente 14 atomos de carbono, preferentemente con entre 6 y aproximadamente 10 atomos de carbono. El radical arileno esta opcionalmente sustituido con uno o mas “sustituyentes de sistema de anillo”, que pueden ser iguales o diferentes, y son tal como se definen en la presente memoria. Entre los grupos arilo representativos se incluyen fenileno y naftileno.
“Arilenosulfonilo” significa un grupo arileno-SO2- en el que el grupo arileno es tal como se define en la presente memoria.
“Arilenoxicarbonilo” significa un grupo ester; es decir, un grupo arileno-O-CO- en el que el arileno es tal como se define en la presente memoria.
“Arilenocarbamoflo” significa un grupo arileno-NHCO-, en el que el arileno es tal como se define en la presente memoria.
“Arilenosulfonilcarbamoflo” significa un grupo arileno-SO2-NH-CO- en el que el arileno es tal como se define en la presente memoria.
“Arilsulfinilo” significa un grupo arilo-SO- en el que el grupo arilo es tal como se define en la presente memoria.
“Aralquinilo” significa un grupo arilo-alquinileno- el que el arilo y el alquinileno son tal como se definen en la presente memoria. Entre los grupos aralquinilo representativos se incluyen fenilacetilenilo y 3-fenilbut-2-inilo.
“Arilcarbamono” significa un grupo arilo-NHCO- en el que el arilo es tal como se define en la presente memoria.
“Arilsulfinilo” significa un grupo arilo-SO- en el que el grupo arilo es tal como se define en la presente memoria. Los grupos arilsulfinilo preferidos son aquellos en los que el grupo arilo es un fenilo sustituido.
“Arilsulfonilo” significa un grupo arilo-SO2- en el que el grupo arilo es tal como se define en la presente memoria. Los grupos arilsulfonilo preferidos son aquellos en los que el grupo arilo es un fenilo sustituido.
“Arilsulfonilcarbamoflo” significa un grupo arilo-SO2-NH-CO- en el que el grupo arilo es tal como se define en la presente memoria. Los grupos arilsulfonilcarbamoflo preferidos son aquellos en los que el grupo arilo es un fenilo sustituido.
“Anillo aromatico”, tal como se utiliza en la presente memoria, incluye restos monocfclicos aromaticos o policfclicos fusionados con entre 5 y 12 miembros, que pueden incluir de cero a cuatro heteroatomos seleccionados entre el grupo que comprende oxfgeno, azufre, selenio y nitrogeno. Entre los ejemplos de grupos arilo se incluyen benceno, pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, triazol, pirazol, piridina, pirazina, piridazina, pirimidina, naftaleno, benzatiazolina, benzotiofeno, benzofuranos, indol, bencindol, quinolina, etc. El grupo arilo puede estar sustituido, en una o mas posiciones, con grupos halo, alquilo, alcoxi, alcoxicarbonilo, haloalquilo, ciano, sulfonato, aminosulfonilo, arilo, sulfonilo, aminocarbonilo, carboxi, acilamino, alquilsulfonilo, amino y sustituyentes sustituidos o no sustituidos.
“Biomolecula” es una molecula natural o sintetica que se utiliza en sistemas biologicos. Entre las biomoleculas preferidas se incluyen una protefna, un peptido, un sustrato de enzima, una hormona, un anticuerpo, un antfgeno, un hapteno, una avidina, una estreptavidina, un carbohidrato, un oligosacarido, un polisacarido, un acido nucleico, un acido desoxinucleico, un fragmento de ADN, un fragmento de ARN, trifosfatos de nucleotidos, trifosfatos de terminadores aciclo y PNA.
“Bencilo” significa un grupo fenil-CH2. “Bencilo sustituido” significa un grupo bencilo en el que el anillo de fenilo esta sustituido con uno o mas sustituyentes de sistema de anillo. Entre los bencilos representativos se incluyen 4- bromobencilo, 4-metoxibencilo, 2,4-dimetoxibencilo y similares.
“Carbamoflo” significa un grupo de formula Y1Y2NCO-, en el que Y1 e Y2 son, independientemente, hidrogeno; acilo; o alquilo, o bien Y1 e Y2, considerados junto con el N a traves del cual estan unidos Y1 e Y2, forman un azaheterociclilo con entre 4 y 7 miembros. Entre los grupos carbamoflo representativos se incluyen los grupos carbamilo (H2NCO-), dimetilaminocarbamoflo (Me2NCO-) y similares.
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“Carboxi” y “carboxilo” significan un grupo HO(O)C- (es decir, un acido carboxflico).
“Carboxialquilo” significa un grupo HO(O)C-alquileno-, en el que el alquileno es tal como se define en la presente memoria. Entre los carboxialquilos representativos se incluyen carboximetilo y carboxietilo.
“Cicloalquilo” significa un sistema de anillo no aromatico monodclico o multicfclico con entre aproximadamente 3 y aproximadamente 10 atomos de carbono, preferentemente con entre aproximadamente 5 y aproximadamente l0 atomos de carbono. Los anillos cicloalquflicos preferidos contienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 atomos en el anillo. El cicloalquilo esta opcionalmente sustituido con uno o mas “sustituyentes de sistema de anillo”, que pueden ser iguales o diferentes, y son tal como se definen en la presente memoria. Entre los cicloalquilos monocfclicos representativos se incluyen ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y similares. Entre los cicloalquilos multicfclicos representativos se incluyen 1-decalina, norbornilo, adamantilo y similares. El prefijo espiro antes del cicloalquilo significa que los sustituyentes geminales de un atomo de carbono se sustituyen para formar 1,1- cicloalquilo. “Cicloalquileno” significa un cicloalquilo bivalente que tiene de aproximadamente 4 a aproximadamente 8 atomos de carbono. Entre los grupos cicloalquilenilo preferidos se incluyen 1,2-, 1,3-, 1,4- cis o trans-ciclohexileno.
“Cicloalquenilo” significa un sistema de anillo no aromatico monodclico o multidclico con entre aproximadamente 3 y aproximadamente 10 atomos de carbono, preferentemente con entre aproximadamente 5 y aproximadamente 10 atomos de carbono, que contiene, por lo menos, un doble enlace carbono-carbono. Los anillos de cicloalquenilo preferidos contienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 atomos en el anillo. El cicloalquenilo esta opcionalmente sustituido con uno o mas “sustituyentes de sistema de anillo”, que pueden ser iguales o diferentes, y son tal como se definen en la presente memoria. Entre los grupos cicloalquenilo monocfclicos representativos se incluyen ciclopentenilo, ciclohexenilo, cicloheptenilo y similares. Un cicloalquenilo multicfclico representativo es el norbornilenilo.
De forma generica, “colorante de cianina” se refiere a un compuesto que tiene dos anillos heterodclicos que contienen nitrogeno, sustituidos o no sustituidos, unidos por un puente insaturado.
“Halo” o “halogeno” significa fluoro, cloro, bromo o yodo.
“Heteroaralquenilo” significa un grupo heteroarilo-alquenileno en el que el heteroarilo y el alquenileno son tal como se definen en la presente memoria. Los heteroaralquenilos preferidos contienen un resto alquenileno inferior. Entre los grupos heteroaralquenilo representativos se incluyen 4-piridilvinilo, tieniletenilo, piridiletenilo, imidazoliletenilo, piraziniletenilo y similares.
“Heteroaralquilo” significa un grupo heteroarilo-alquileno en el que el heteroarilo y el alquileno son tal como se definen en la presente memoria. Los heteroaralquilos preferidos contienen un grupo alquileno inferior. Entre los grupos heteroaralquilo representativos se incluyen tienilmetilo, piridilmetilo, imidazolilmetilo, pirazinilmetilo y similares.
“Heteroaralquiloxi” significa un grupo heteroaralquilo-O- en el que el heteroaralquilo es tal como se define en la presente memoria. Un grupo heteroaralquiloxi representativo es el 4-piridilmetiloxi.
“Heteroaralquinilo” significa un grupo heteroarilo-alquinileno en el que el heteroarilo y el alquinileno son tal como se definen en la presente memoria. Los heteroaralquinilos preferidos contienen un resto alquinileno inferior. Entre los grupos heteroaralquinilo representativos se incluyen pirid-3-ilacetilenilo, quinolin-3-ilacetilenilo, 4-piridiletinilo y similares.
“Heteroaroflo” significa un grupo heteroarilo-CO- en el que el heteroarilo es tal como se define en la presente memoria. Entre los grupos heteroaroflo representativos se incluyen tiofenoflo, nicotinoflo, pirrol-2-ilcarbonilo, piridinoflo y similares.
“Heterociclilo” significa un sistema de anillo no aromatico saturado monodclico o multidclico que tiene de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 atomos en el anillo, preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 atomos en el anillo, en el que uno o mas de los atomos del sistema de anillo son elementos distintos de carbono, por ejemplo, nitrogeno, oxfgeno o azufre. Los heterociclilos preferidos contienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 atomos en el anillo. El prefijo aza, oxa o tia antes de heterociclilo significa que, por lo menos, esta presente un atomo de nitrogeno, oxfgeno o azufre, respectivamente, como atomo del anillo. El heterociclilo esta opcionalmente sustituido con uno o mas “sustituyentes de sistema de anillo”, que pueden ser iguales o diferentes, y son tal como se definen en la presente memoria. El atomo de nitrogeno o azufre del heterociclilo esta opcionalmente oxidado al correspondiente N-oxido, S-oxido o S,S-dioxido. Entre los anillos heterociclilo monocfclicos representativos se incluyen piperidilo, pirrolidinilo, piperazinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, tiazolidinilo, 1,3-dioxolanilo, 1,4-dioxanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo y similares.
“Heteroarilo” significa un sistema de anillo aromatico monodclico o multidclico que tiene de aproximadamente 5 a aproximadamente 14 atomos en el anillo, preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 atomos en
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el anillo, en el que uno o mas de los atomos del sistema de anillo son elementos distintos de carbono, por ejemplo, nitrogeno, oxfgeno o azufre. Los heteroarilos preferidos contienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 atomos en el anillo. El “heteroarilo” esta opcionalmente sustituido con uno o mas “sustituyentes de sistema de anillo”, que pueden ser iguales o diferentes, y son tal como se definen en la presente memoria. El prefijo aza, oxa o tia antes de heteroarilo significa que, por lo menos, esta presente un atomo de nitrogeno, oxfgeno o azufre, respectivamente, como atomo del anillo. Un atomo de nitrogeno de un heteroarilo esta opcionalmente oxidado al correspondiente N-oxido. Entre los heteroarilos representativos se incluyen pirazinilo, furanilo, tienilo, piridilo, pirimidinilo, isoxazolilo, isotiazolilo, oxazolilo, tiazolilo, pirazolilo, furazanilo, pirrolilo, pirazolilo, triazolilo, 1,2,4- tiadiazolilo, pirazinilo, piridazinilo, quinoxalinilo, ftalazinilo, imidazo[1,2-a]piridina, imidazo[2,1-b]tiazolilo, benzofurazanilo, indolilo, azaindolilo, bencimidazolilo, benzotienilo, quinolinilo, imidazolilo, tienopiridilo, quinazolinilo, tienopirimidilo, pirrolopiridilo, imidazopiridilo, isoquinolinilo, benzoazaindolilo, 1,2,4-triazinilo, benzotiazolilo y similares.
“Heteroarileno” significa un radical de sistema de anillo aromatico monodclico o multidclico bivalente que tiene de aproximadamente 5 a aproximadamente 14 atomos en el anillo, preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 atomos en el anillo, en el que uno o mas de los atomos del sistema de anillo son elementos distintos de carbono, por ejemplo, nitrogeno, oxfgeno o azufre. Los heteroarilenos preferidos contienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 atomos en el anillo. El “heteroarileno” esta opcionalmente sustituido con uno o mas “sustituyentes de sistema de anillo”, que pueden ser iguales o diferentes, y son tal como se definen en la presente memoria.
“Heteroarilenoxicarbonilo” significa un grupo heteroarileno-O-CO- en el que el heteroarileno es tal como se define en la presente memoria.
“Heteroarilenocarbamono” significa un grupo heteroarileno-NH-CO- en el que el grupo heteroarileno es tal como se define en la presente memoria.
“Heteroarilenosufonilcarbamoflo” significa un grupo heteroarileno-SO2-NH-CO- en el que el grupo heteroarileno es tal como se define en la presente memoria.
“Hidroxialquilo” significa un grupo alquilo, tal como se define en la presente memoria, sustituido con uno o mas grupos hidroxi. Los hidroxialquilos preferidos contienen un alquilo inferior. Entre los grupos hidroxialquilo representativos se incluyen hidroximetilo y 2-hidroxietilo.
“Grupo enlazante” comprende los atomos que unen el colorante a la biomolecula. Por ejemplo, haciendo referencia a la tabla 1, la columna A es una lista de las funcionalidades reactivas, las cuales pueden encontrarse en el colorante o en la biomolecula. La columna B es una lista de los grupos complementarios, ya sea en la biomolecula o en el colorante (preferentemente, una funcionalidad carboxilo, hidroxilo, tiol o amino), que, junto con las funcionalidades reactivas, forman el enlace resultante de la columna C. El grupo enlazante comprende el enlace resultante y, opcionalmente, los atomos adicionales. Vease tambien R. Haugland, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular probes, Inc. (1992). En un aspecto, R18 representa un grupo enlazante antes de que ocurra la reaccion de union, y R30 representa la union resultante entre el colorante y la biomolecula. Entre los grupos enlazantes preferidos se incluyen grupos fosforamidita, ester de NHS, acido carboxflico activado, tiocianato, isotiocianato, maleimida y yodoacetamida. Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino “acido carboxflico activado” es un derivado de un grupo carboxilo que es mas susceptible al ataque nucleofilo que un grupo carboxilo libre; por ejemplo, anhfdridos de acido, tioesteres, haluros de acilo, ester de NHS y esteres de sulfo-NHS.
“Oxo” significa un grupo de formula >C=O (es decir, un grupo carbonilo).
“Fosforamiditilo” significa un atomo de fosforo trivalente unido a dos grupos -OR y un atomo de nitrogeno, en el que el nitrogeno esta opcionalmente sustituido.
“Sustituyentes de sistema de anillo” significa sustituyentes unidos a sistemas de anillo aromaticos o no aromaticos, incluidos hidrogeno, alquilo, arilo, heteroarilo, aralquilo, aralquenilo, aralquinilo, heteroaralquilo, heteroaralquenilo, heteroaralquinilo, hidroxi, hidroxialquilo, alcoxi, ariloxi, aralcoxi, acilo, aroflo, halo, nitro, ciano, carboxi, alcoxicarbonilo, ariloxicarbonilo, aralcoxicarbonilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, heteroarilsulfonilo, alquilsulfinilo, arilsulfinilo, carboxialquilo, heteroarilsulfinilo, alquiltio, ariltio, nitrilo, NO2 heteroariltio, aralquiltio, heteroaralquiltio, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterociclilo, heterociclenilo, arildiazo, heteroarildiazo, amidino y similares.
“Sulfonato” es un grupo SO3", preferentemente unido a un cation.
“Colorante sulfo-fenoxi” es un colorante cianina en el que el puente no saturado del colorante cianina esta sustituido con un enlace eter a un anillo de benceno sustituido con un grupo sulfonato, preferentemente en la posicion 4 del anillo de benceno.
Todos los demas acronimos y abreviaturas tienen el significado correspondiente segun lo publicado en revistas
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sobre la tecnica de la qufmica organica.
II. Colorantes cianina
En un aspecto, se da a conocer un colorante cianina de formula (I):
Preferentemente, Z es un heteroatomo que tiene, por lo menos, un par solitario de electrones. En un aspecto particular, Z es O, S o NR , donde R es H o alquilo. Si R es alquilo, R es preferentemente un alquilo inferior. Preferentemente, Z tiene una estructura tal que solo un atomo se encuentra en el enlace directo entre el anillo de
benceno unido a Z y a la cadena de polieno de formula unido a Z. Es aceptable la presencia de cadenas
laterales en el enlace entre el anillo de benceno y la cadena de polieno. En las formas de realizacion que tienen cadenas laterales, son preferidas las cadenas laterales de alquilo inferior.
R1-R5 son, cada uno independientemente, H, alquilo, halo, carboxilo, amino o SO3"Cat+, donde Cat+ es un cation y, por lo menos, uno de entre R1-R5 es SO3-Cat+. Preferentemente, R3 es SO3-Cat+. De forma particularmente preferida, Cat+ es H+ o un ion de metal alcalino, tal como Na+.
R6 y R7 son, cada uno, H, alquilo, o forman opcionalmente un anillo junto con el grupo al que estan unidos.
Preferentemente, R6 y R7, junto con los atomos a los que estan unidos, forman un anillo. Preferentemente, el anillo tiene de 4 a 10 atomos miembro, mas preferentemente 5 o 6 atomos miembro. En un aspecto, preferentemente, el anillo que incluye R6 y R7 esta sustituido, preferentemente con un radical sulfonato.
Los numeros enteros m y n son, cada uno independientemente, numeros enteros comprendidos entre 0 y 5. Preferentemente, tanto m como n son dos. Mas preferentemente, tanto m como n son uno. Todavfa mas preferentemente, tanto m como n son cero. A medida que aumentan m y n, aumenta tambien la longitud de onda del colorante. En general, la adicion de cada doble enlace en la cadena de polieno puede aumentar la longitud de onda en un valor comprendido entre 40 nm y 120 nm. Para los cambios de absorcion acompanados con trimetino a pentametino, o pentametino a heptametino, hay tfpicamente un desplazamiento batocromico (desplazamiento hacia el rojo) de aproximadamente 100 nm. Por ejemplo, cuando m y n son 0, la longitud de onda del colorante preferido es de aproximadamente 770 nm. Cuando m y n son 1, la longitud de onda del colorante preferido es de aproximadamente 950 nm. Los colorantes mas preferidos operan en el espectro IR cercano (600-1.000 nm).
X e Y son, cada uno independientemente, O, S, Se o CR19R20, donde R19 y R20 son, cada uno independientemente, alquilo, o forman opcionalmente un anillo junto con el atomo de carbono al que estan unidos. Preferentemente, X e Y son un heteroatomo, tal como O, S y Se. Cuando X o Y son CR19R20, R19 y R20 son, preferentemente, un alquilo inferior, y mas preferentemente los dos R19 y R20 son metilo.
o A O Op -d Q ft
R y R son, cada uno independientemente, alquilo, (CH2)rR o (CH2)rR ; donde, por lo menos, uno de entre R y R13 es (CH2)rR18, y donde r es un numero entero comprendido entre 1 y 50, y R25 es un grupo funcional no reactivo que no reacciona directamente con un grupo carboxilo, hidroxilo, amino o tiol, y R18 es un grupo funcional que puede reaccionar con un grupo carboxilo, hidroxilo, amino o tiol. En un aspecto, uno de entre R8 y R13 es (CH2)rR18 y el otro es (CH2)rR25. Dicho de otro modo, preferentemente, uno de entre R8 y R13 reacciona con la biomolecula formando un enlace con la misma y el otro no reacciona. El grupo R18 debe ser capaz de unirse covalentemente con la biomolecula que se marca. De forma particularmente preferida, los grupos R18 incluyen mercapto, carboxilo, amino, haloalquilo, fosforamiditilo, ester de N-hidroxisuccinimidilo, ester de sulfo-N-hidroxisuccinimidilo, isotiocianato, yodoacetamidilo y maleimidilo. Entre los grupos R25 particularmente preferidos se incluyen hidroxilo, tioacetilo y sulfonato.
R9-R12 y R14-R17 son, cada uno independientemente, H, alquilo, halo, amino, sulfonato, R21COOH, R21OR22, R21SR22 21 22 21 22 11 12 o R COOR , donde R es un enlace o alquileno y R es alquilo, o R y R forman, opcionalmente, junto con los
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atomos a los que estan unidos, un anillo aromatico, o R16 y R17 forman, opcionalmente, junto con los atomos a los que estan unidos, un anillo aromatico. En un aspecto, uno o ambos R11 y R16 son sulfonato. En otro aspecto, cuando R11 y R12, junto con los atomos a los que estan unidos, forman un anillo aromatico, el anillo esta sustituido, por lo menos en una posicion, con un grupo sulfonato. En otro aspecto, cuando R16 y R17, junto con los atomos a los que estan unidos, forman un anillo aromatico, el anillo esta sustituido, por lo menos en una posicion, con un grupo sulfonato, un grupo halo, un sustituyente alquilo o un sustituyente amino.
En otro aspecto, se da a conocer un colorante cianina de formula (V):
Cat+ es un cation. Preferentemente, Cat+ es H+ o un ion metalico. Mas preferentemente, Cat+ es un ion de metal alcalino, de la forma mas preferida Na+. X e Y son, cada uno independientemente, O, S, Se o (CH3)2C.
q a o or 4 Q q
R y R son, cada uno independientemente, alquilo, (CH2)rR o (CH2)rR ; donde, por lo menos, uno de entre R y R13 es (CH2)rR18, y donde r es un numero entero comprendido entre 1 y 50, y R25 es un grupo funcional que no reacciona directamente con un grupo carboxilo, hidroxilo, amino o tiol, y R18 es un arupo funcional que puede reaccionar con un grupo carboxilo, hidroxilo, amino o tiol. En un aspecto, uno de entre R8 y R13 es (CH2)rR18 y el otro es (CH2)rR25 Dicho de otro modo, preferentemente, uno de entre R8 y R13 reacciona con la biomolecula formando un enlace con la misma y el otro no reacciona. El grupo R18 debe ser capaz de unirse covalentemente con la biomolecula que se marca. De forma particularmente preferida, los grupos R18 incluyen mercapto, carboxilo, amino, haloalquilo, fosforamiditilo, ester de N-hidroxisuccinimidilo, ester de sulfo-N-hidroxisuccinimidilo, isotiocianato, yodoacetamidilo y maleimidilo. Entre los grupos R25 particularmente preferidos se incluyen hidroxilo, tioacetilo y sulfonato.
R11 y R12 son H, sulfonato o forman, junto con los atomos a los que estan unidos, un anillo aromatico. En una forma
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de realizacion preferida, R es sulfonato. En otro aspecto, cuando R y R , junto con los atomos a los que estan unidos, forman un anillo aromatico, el anillo esta sustituido, por lo menos en una posicion, con un grupo sulfonato.
R16 y R17 son H, sulfonato o forman, junto con los atomos a los que estan unidos, un anillo aromatico. En una forma de realizacion preferida, R16 es sulfonato. En otro aspecto, cuando R16 y R17, junto con los atomos a los que estan unidos, forman un anillo aromatico, el anillo esta sustituido, por lo menos en una posicion, con un grupo sulfonato.
Los colorantes cianina que se dan a conocer pueden ser excitados de manera eficiente por equipos comercialmente disponibles, que pueden adquirirse a traves de empresas como LI-COR, Toshiba, Phillips, Blue Sky Research y NEC.
Los colorantes cianina tienen suficiente solubilidad en soluciones acuosas para que, una vez unidos a una biomolecula soluble, la biomolecula mantenga su solubilidad. Los colorantes tambien tienen una buena solubilidad en medios organicos, lo que proporciona una considerable flexibilidad a los enfoques sinteticos al marcado de las biomoleculas deseadas.
Los colorantes cianina aumentan su estabilidad qufmica en presencia de hidroxido de amonio y DTT. Los colorantes cianina tienen una fotoestabilidad y una termoestabilidad mayores que las de los colorantes de fenoxicianina.
III. Preparacion de los colorantes cianina
Los colorantes cianina se preparan mediante metodos bien conocidos en la tecnica. En terminos generales, los colorantes cianina se preparan de acuerdo con los procedimientos descritos en Hamer, F. M., Cyanide Dyes and Related Compounds, Weissberger, Mass., ed. Wiley Interscience, N.Y. 1964. Ademas, las patentes US n° 4.337.063; 4.404.289 y 4.405.711 describen una sfntesis para una variedad de colorantes cianina que tienen grupos ester activos de N-hidroxisuccinimida. La patente US n° 4.981.977 describe una sfntesis de colorantes cianina que tienen grupos acido carboxflico. La patente US n° 5.268.486 da a conocer un metodo para preparar colorantes cianina de
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arilsulfonato. La patente US n° 6.027.709 da a conocer metodos para preparar colorantes cianina que tienen grupos fosforamidita. La patente US n° 6.048.982 da a conocer metodos para preparar colorantes cianina que tienen un grupo reactivo seleccionado entre el grupo que comprende isotiocianato, isocianato, fosforamidita, monoclorotriazina, diclorotriazina, piridina sustituida con monohalogeno o dihalogeno, diazina sustituida con monohalogeno o dihalogeno, aziridina, haluro de sulfonilo, haluro de acido, ester de hidroxisuccinimida, ester de hidroxisulfosuccinimida, ester de imido, glioxal y aldehfdo.
Una ruta de sfntesis comun comprende preparar sales cuaternarias de indolsulfonato sustituido o no sustituido segun los procedimientos bien conocidos en la tecnica, algunos de los cuales se detallan en los ejemplos de la presente memoria. Entre las sales cuaternarias de indol particularmente preferidas se incluyen, entre otras, una sal cuaternaria de indolsulfonato y una sal cuaternaria de bencindol alcohol, que se ilustran en la presente memoria.
A continuacion, este par de sales sintetizadas se hace reaccionar con una base de Schiff comercialmente disponible (a traves de ALDRICH), tal como monohidrocloruro de N-[(3-(anilinometilen)-2-cloro-1-ciclohexen-1-il)metilen]anilina, utilizando tecnicas y condiciones de reaccion bien conocidas en la tecnica, algunas de las cuales se detallan en los ejemplos de la presente memoria. A continuacion, el producto se hace reaccionar con un acido hidroxibencensulfonico, obteniendose un colorante segun la presente invencion. El colorante puede modificarse adicionalmente para obtener otros colorantes segun la presente invencion, por ejemplo, haciendo reaccionar el colorante con fosforamiditas comercialmente disponibles, tales como tetraisopropilfosforodiamidita de 2-cianoetilo, utilizando tecnicas y condiciones de reaccion bien conocidas en la tecnica, algunas de las cuales se detallan en los ejemplos de la presente memoria.
IV. Biomoleculas de marcado
Los colorantes cianina se pueden unir a las biomoleculas, que se han definido anteriormente. A traves de grupos enlazantes, el colorante cianina se puede enlazar a la biomolecula, por ejemplo, utilizando la qufmica de la fosforamidita, formando, en ultima instancia, un enlace fosfato entre el colorante y la biomolecula. Para ver ejemplos de dichos metodos de marcado, vease la patente US n° 6.027.709, que da a conocer muchos grupos enlazantes preferidos, metodos de union y biomoleculas que pueden marcarse facilmente. Preferentemente, en general, se prepara una fosforamidita de un colorante cianina para marcar moleculas de ADN en una maquina de sfntesis de ADN. Preferentemente, el colorante se une al extremo 5' de un oligonucleotido protegido, unido a un soporte, mediante la qufmica estandar de la fosforamidita. La sfntesis en una escala de 200 nmol produce habitualmente rendimientos en bruto de oligonucleotidos marcados con colorante de 50-60 nmol.
Muchos metodos de union de colorantes a diversos tipos de biomoleculas son bien conocidos en la tecnica. Para una sfntesis completa de los procedimientos de marcado de oligonucleotidos, vease R. Haugland en Excited States of Biopolymers, Steiner ed., Plenum Press (1983), Fluorogenic Probe Design and Synthesis: A Technical Guide, PE Applied Biosystems (1996), y G. T. Herman, Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996).
Preferentemente, el marcado de anticuerpos se lleva a cabo en un tampon, que incluye, opcionalmente, un codisolvente organico, en condiciones de pH basico y a temperatura ambiente. Tambien preferentemente, el anticuerpo marcado se purifica mediante cromatograffa de permeacion en gel, utilizando equipos como una columna de SEPHADEX G-50 para eliminar el colorante no conjugado, o mediante dialisis. Los expertos en la tecnica conoceran otras vfas y medios para la purificacion.
En un aspecto, se da a conocer un metodo de marcado de una biomolecula, en el que el grupo R18 de cualquiera entre el grupo R8 o el grupo R13 del colorante cianina reacciona con un tiol, un hidroxilo, un carboxilo o un grupo amino de una biomolecula, formando una union (R30) entre el colorante y la biomolecula. Habitualmente, esta reaccion se lleva a cabo en mezclas de tampon acuoso y un disolvente organico, tal como DMF, a un pH de entre 8 y 9. En una forma de realizacion preferida, utilizando la qufmica de la fosforamidita, es preferida la sfntesis en fase solida, tal como se da a conocer en la patente US n° 6.027.709.
Las biomoleculas pueden marcarse utilizando un kit. En una forma de realizacion preferida de un kit, el mismo comprende un colorante de formula (I) o (V) y un tampon. Preferentemente, el kit contiene un tampon de acoplamiento, tal como KH2PO4 1 M (pH 7,0). Preferentemente, el tampon tiene un fondo de baja fluorescencia.
Opcionalmente, el kit puede contener un subkit de purificacion. Tras marcar una biomolecula con uno de los colorantes, la biomolecula marcada puede separarse de cualquier producto de reacciones secundarias y de cualquier producto hidrolizado libre resultante de la hidrolisis normal. Para biomoleculas que contienen 13 aminoacidos o menos, la cromatograffa en capa fina preparativa (TLC) puede eliminar las impurezas. Invitrogen suministra un kit de purificacion de peptidos TLC especialmente disenado para purificar peptidos o protefnas marcados con colorante.
Para biomoleculas mas grandes, tales como peptidos o protefnas mas grandes, una resina SEPHADEX G-15 o G-25 puede eliminar los derivados no deseados. Invitrogen suministra un kit de filtracion en gel de protefnas disenado para separar peptidos y protefnas marcados con colorante del colorante libre. A menudo, las biomoleculas marcadas
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con colorante que permanecen tras la desalacion se pueden utilizar con exito sin mas purificacion. En algunos casos, puede ser necesario resolver y evaluar la actividad de los diferentes productos de colorante mediante HPLC u otras tecnicas cromatograficas.
Una vez marcada, una biomolecula marcada con colorante tal como se da a conocer presenta la siguiente formula (XV):
Todos los sustituyentes son tal como se han definido anteriormente. B es una biomolecula y R30 es (CH2)rL, donde r es un numero entero comprendido entre 1 y 50, y L es un grupo enlazante. Preferentemente, B es una protefna, un peptido, un sustrato de enzima, una hormona, un anticuerpo, un antfgeno, un hapteno, una avidina, una estreptavidina, un carbohidrato, un oligosacarido, un polisacarido, un acido nucleico, un acido desoxinucleico, un fragmento de ADN, un fragmento de ARN, trifosfatos de nucleotidos, trifosfatos de terminadores aciclo y PNA. Para una lista de terminadores de marcado preferidos para su utilizacion en la secuenciacion de ADN, vease la patente US n° 5.332.666.
Preferentemente, r esta comprendido entre 1 y 5. Preferentemente, L es fosforamiditilo u otro grupo enlazante, algunos de los cuales se ilustran en la patente de Estados Unidos n° 6.027.709. En un aspecto, L es un ester difosfato de amidita.
En otro aspecto, la biomolecula marcada con colorante presenta la formula (XX):
Todos los sustituyentes son tal como se han definido anteriormente. B es una biomolecula y R30 es (CH2)rL, donde r es un numero entero comprendido entre 1 y 50, y L es un grupo enlazante. Preferentemente, r esta comprendido entre 1 y 5. En una forma de realizacion preferida, cuando se forma la union, L es un diester de fosfato. En la patente US n° 6.027.709 se dan a conocer ejemplos de biomoleculas marcadas con colorante similares.
Secuenciacion de ADN
Las biomoleculas marcadas con colorante se pueden utilizar en aplicaciones biologicas, tales como secuenciacion de ADN. La biomolecula marcada, tal como un oligonucleotido, se puede utilizar, por ejemplo, como cebador en el metodo de secuenciacion de ADN de Sanger, como cebador con cola para genotipado o como sonda de hibridacion. Algunas tecnicas y condiciones de reaccion bien conocidas para la secuenciacion de ADN se detallan en los ejemplos de la presente memoria.
Se describen metodos bien conocidos de secuenciacion del ADN, que incluyen el metodo de degradacion qufmica de Maxam-Gilbert, en Maxam y otros, Met. in Enzym. 65:499 (1980), y la tecnica de terminacion de cadena didesoxi
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de Sanger, descrita en Sanger y otros, P.N.A.S. USA 74:5463 (1977). En cada metodo, se generan fragmentos de ADN marcados con 32P que se analizan por electroforesis en gel. El fosforo radiomarcado ya no suele utilizarse en estos metodos, ya que ha sido reemplazado por los colorantes.
La secuenciacion del ADN tambien se describe en artfculos de publicaciones. Vease, por ejemplo, Middendorf, L. R., Humphrey, P. G., Narayanan, N., y Roemer, R. C. “Sequencing Technology” en: Biotechnology. Rehm, H.-J. and Reed, G. (editores), Wiley-VCH Publishers, Alemania (capftulo presentado); B. Barrell, The FASEB Journal, 5, 40 (1991); y G. L. Trainor, Anal. Chem. 62, 418 (1990), y las referencias citadas en los mismos. El procedimiento qufmico de secuenciacion de ADN mas ampliamente utilizado es el metodo enzimatico de terminacion de la cadena de Sanger, mencionado anteriormente, que ha sido adoptado por varias estrategias de secuenciacion diferentes. Las reacciones de secuenciacion se llevan a cabo en solucion utilizando diferentes ADN polimerasas, tales como la ADN polimerasa Taq de termofila [M. A. Innes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 9436 (1988)] o la ADN polimerasa T7 especialmente modificada (“SEQUENASE”) [S. Tabor y C. C. Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 4767 (1987)], o en combinacion con la utilizacion de soportes polimericos. Vease, por ejemplo, S. Stahl y otros, Nucleic Acids Res., 16, 3025 (1988); M. Uhlen, solicitud PCT WO 89/09282; Cocuzza y otros, solicitud PCT WO 91/11533; y Jones y otros, solicitud PCT WO 92/03575.
En algunos aspectos, la presente divulgacion da a conocer un compuesto de formula XXI:
donde Cat+ es un cation; r es un numero entero igual a 1, 2 o 3; X e Y son, cada uno independientemente, O, S, Se
o 10 ^ 0c W o 1
o (CH3)2C; y R y R son, cada uno independientemente, alquilo, L-R o L-R ; donde, por lo menos, uno de entre R8 y R13 es L-B; R25 es un grupo funcional no reactivo que no reacciona directamente con un grupo carboxilo,
hidroxilo, amino o tiol; L es un conector; B es un ligando; n es 0, 1, 2 o 3; R11 y R12 son, cada uno
independientemente, F, H, sulfonato o forman, junto con los atomos a los que estan unidos, un anillo aromatico; y R16 y R17 son, cada uno independientemente, F, H, sulfonato o forman, junto con los atomos a los que estan unidos, un anillo aromatico. Preferentemente, X e Y son (CH3)2C. Preferentemente, r es 1.
Una amplia gama de grupos funcionales no reactivos son adecuados para R25. Entre los grupos adecuados se incluyen, por ejemplo, hidroxilo, tioacetilo, sulfonato, alquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carboxilo no activado opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido, sulfatos opcionalmente sustituidos, fosfatos opcionalmente sustituidos y de sales de amonio opcionalmente sustituidas.
En algunos aspectos, R y R son, cada uno independientemente, F, H, o sulfonato; R y R son, cada uno independientemente, F, H, o sulfonato; y n es 1. Preferentemente, Cat+ es H+ o un ion metalico. En algunos
aspectos, por lo menos uno de entre X e Y es (CH3)2C. Para alcanzar la neutralidad de carga, el experto en la
materia entendera que, tras el primer grupo “sufonato” adicional de R , R , R y R , se anade un Cat . El primer grupo “sufonato” se neutraliza con el nitrogeno cuaternario. r es preferentemente igual a 1.
En algunos aspectos, L es un miembro seleccionado entre el grupo que comprende un enlace directo o un enlace covalente, en el que el enlace covalente es lineal o ramificado, cfclico o heterocfclico, saturado o insaturado, que tiene de 1 a 60 atomos seleccionados entre el grupo que comprende C, N, P, O y S, en el que L puede tener atomos de hidrogeno adicionales para cubrir valencias, en el que el enlace contiene cualquier combinacion de enlaces eter, tioeter, amina, ester, carbamato, urea, tiourea, oxi o amida; o enlaces carbono-carbono simples, dobles, triples o aromaticos; o enlaces fosforo-oxfgeno, fosforo-azufre, nitrogeno-nitrogeno, nitrogeno-oxfgeno o nitrogeno-platino; o enlaces aromaticos o heteroaromaticos.
En otros aspectos, L es un miembro seleccionado dentro del grupo que comprende un PEG, un copolfmero de bloque de PEG-poliuretano y un PEG-polipropileno. En otros aspectos, L es un miembro seleccionado dentro del grupo que comprende un polisacarido, un polipeptido, un oligosacarido, un polfmero, un copolfmero y un oligonucleotido.
En algunos aspectos, L presenta la formula:
-X1-Y1-X2-
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en la que: X1 es un miembro seleccionado dentro del grupo que comprende un radical bivalente, un enlace directo, oxfgeno, un nitrogeno opcionalmente sustituido y azufre; Yi es un miembro seleccionado dentro del grupo que comprende un enlace directo y alquileno C1-C10 opcionalmente interrumpido por un heteroatomo; y X2 es un miembro seleccionado dentro del grupo que comprende un radical bivalente, un enlace directo, oxfgeno, un nitrogeno opcionalmente sustituido y azufre.
En algunos aspectos, el radical bivalente de X1 y X2 se seleccionan, cada uno independientemente, del grupo que comprende un enlace directo, alquileno opcionalmente sustituido, alquilenoxicarbonilo opcionalmente sustituido, alquilenocarbamoflo opcionalmente sustituido, alquilenosulfonilo opcionalmente sustituido, alquilenosulfonilcarbamoflo opcionalmente sustituido, arileno opcionalmente sustituido, arilenosulfonilo opcionalmente sustituido , arilenoxicarbonilo opcionalmente sustituido, arilenocarbamoflo opcionalmente sustituido, arilenosulfonilcarbamoflo opcionalmente sustituido, carboxialquilo opcionalmente sustituido, carbamoflo opcionalmente sustituido, carbonilo opcionalmente sustituido, heteroarileno opcionalmente sustituido, heteroarilenoxicarbonilo opcionalmente sustituido, heteroarilenocarbamoflo opcionalmente sustituido, heteroarilenosulfonilcarbamoflo opcionalmente sustituido, sulfonilcarbamoflo opcionalmente sustituido, tiocarbonilo opcionalmente sustituido, un sulfonilo opcionalmente sustituido, y sulfinilo opcionalmente sustituido.
En algunos aspectos, L es -(CH2)r-, donde r es un numero entero de 1 a 50. Por ejemplo, R8 y R13 son (CH2)rB, donde r es un numero entero de 1 a 5. En algunos aspectos, R25 es un grupo alquilo opcionalmente sustituido.
En algunos aspectos, el compuesto tiene la siguiente estructura:
o la siguiente estructura:
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En algunos aspectos, B es un ligando que tiene afinidad por un receptor seleccionado entre el grupo que comprende EGFR, Her2, PDGFR, IGFR, c-Ryk, c-Kit, CD24, integrinas, FGFR, KFGR, VEGFR, receptores senuelo de TRAIL, receptor de retinoides, receptor de factores de crecimiento, PPAR, receptor de vitaminas, receptor de glucocorticosteroides, receptor X de retinoides, RHAMM, receptores de folato de alta afinidad, receptor Met, receptor de estrogenos y Ki67.
Alternativamente, B se selecciona entre el grupo de somatostatinas, endostatinas, un carbohidrato, un monosacarido, un disacarido, un trisacarido, un oligosacarido, aptameros, liposomas y PEG.
En otros aspectos, B es 2-desoxi-D-glucosa, 2-desoxi-D-glucosamina, un derivado de glucosa, gliceraldehfdo, eritrosa, treosa, ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, alosa, altrosa, glucosa, manosa, gulosa, idosa, galactosa, talosa, eritrulosa, ribulosa, xilulosa, psicosa, fructosa, sorbosa y tagatosa.
En otros aspectos, B se selecciona entre el grupo de angiopoyetinas, angiostatina, angiotensina II, a2 -antiplasmina, anexina V, tetradecasulfato de p-ciclodextrina, endoglina, endosialina, endostatina, factor de crecimiento epidermico, fibrina, fibrinopeptido p, factor de crecimiento de fibroblastos, FGF-3, fibronectina basica, heparina, fumagilina, factor de crecimiento de hepatocitos, hialuronano, factores de crecimiento insulinoides, inhibidores de interferon a,p,
inhibidores de IL, laminina, factor inhibidor de leucemia, linomida, metaloproteinasa de matriz 2, metaloproteinasas, inhibidores de metaloproteinasas, anticuerpos o fragmentos, anticuerpos monoclonales o fragmentos, RGDd FV cfclico, factor de crecimiento placentario, protefna relacionada con la proliferina placentaria, plasminogeno, activador del plasminogeno, inhibidor de activador de plasminogeno 1, antagonistas del factor activador de plaquetas, factor 5 de crecimiento derivado de plaquetas, receptores del factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento de celulas endoteliales derivado de plaquetas, pleyotropina, proliferina, protefna relacionada con la proliferina, selectinas: selectina E, SPARC, venenos de serpiente, sustancia P, suramina, inhibidor tisular de las metaloproteinasas, talidomida, trombina, tetradecapeptido activador de receptor de trombina, factor de crecimiento transformante a,p, receptor del factor de crecimiento transformante, factor de crecimiento tumoral a, factor de
10 necrosis tumoral, vitronectina, avidina y estreptavidina.
En algunos aspectos, B es el factor de crecimiento epidermico. En otros aspectos, B es un resto que tiene afinidad por el hueso o puede incorporarse al mismo, tal como calcefna y derivados de calcefna.
15 En la tabla 1 se muestran ejemplos seleccionados de funcionalidades reactivas utiles para la fijacion del colorante al ligando o biomolecula, donde el enlace resulta de la reaccion de un colorante con un ligando o biomolecula. Los expertos en la materia conoceran otros enlaces adecuados para su utilizacion.
Tabla 1
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- A Funcionalidad reactiva (sobre colorante o biomolecula).
- B Grupo complementario (sobre biomolecula o colorante). C Enlace resultante (por ejemplo, R30)
- esteres activados *
- aminas/anilinas carboxamidas
- acrilamidas
- tioles tioeteres
- azidas de acilo**
- aminas/anilinas carboxamidas
- haluros de acilo
- aminas/anilinas carboxamidas
- haluros de acilo
- alcoholes/fenoles esteres
- acil nitrilos
- alcoholes/fenoles esteres
- acil nitrilos
- aminas/anilinas carboxamidas
- aldehfdos
- aminas/anilinas iminas
- aldehfdos o cetonas
- hidrazinas hidrazonas
- aldehfdos o cetonas
- hidroxilaminas oximas
- haluros de alquilo
- aminas/anilinas alquil aminas
- haluros de alquilo
- acidos carboxflicos esteres
- haluros de alquilo
- tioles tioeteres
- haluros de alquilo
- alcoholes/fenoles eteres
- anhfdridos
- alcoholes/fenoles esteres
- anhfdridos
- aminas/anilinas carboxamidas/imidas
- haluros de arilo
- tioles tiofenoles
- haluros de arilo
- aminas aril aminas
- aziridinas
- tioles tioeteres
- boronatos
- glicoles esteres de boronato
- acidos carboxflicos activados
- aminas/anilinas carboxamidas
- acidos carboxflicos activados
- alcoholes esteres
- acidos carboxflicos activados
- hidrazinas hidrazidas
- carbodiimidas
- acidos carboxflicos n-acilureas o anhfdridos
- diazoalcanos
- acidos carboxflicos esteres
- epoxidos
- tioles (aminas) tioeteres (alquil aminas)
- epoxidos
- acidos carboxflicos esteres
- haloacetamidas
- tioles tioeteres
- haloplatinato
- amino complejo de platino
- haloplatinato
- heterociclo compleio de platino
- halotriazinas
- aminas/anilinas aminotriazinas
- halotriazinas
- alcoholes/fenoles eteres de triazinilo
- imido esteres
- aminas/anilinas amidinas
- isocianatos
- aminas/anilinas ureas
- isocianatos
- alcoholes/fenoles uretanos
- isotiocianatos
- aminas/anilinas tioureas
- maleimidas
- tioles tioeteres
- fosforamiditas
- alcoholes esteres de fosfito
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- haluros de sililo
- alcoholes eteres de sililo
- esteres de sulfonato
- aminas/anilinas alquil aminas
- haluros de sulfonilo
- aminas/anilinas sulfonamidas
* Los esteres activados, tal como se entiende en la tecnica, presentan generalmente la formula -COM, donde M es un buen grupo saliente (por ejemplo, succinimidiloxi (-OC4H4O2), sulfosuccinimidiloxi (- OC4H3O2SO3H), -1-oxibenzotriazolil (-OC6H4N3); 4-sulfo-2,3,5,6-tetrafluorofenilo; o un grupo ariloxi o ariloxi sustituido una o mas veces por sustituyentes aceptores de electrones, tales como nitro, fluoro, cloro, ciano o trifluorometilo, o combinaciones de los mismos, que se utilizan para formar esteres de arilo activados; o un acido carboxflico activado por una carbodiimida para formar un anhfdrido o anhfdrido mixto -OCORa o OCNRaNHRb, donde Ra y Rb, que pueden ser iguales o diferentes, son alquilo C1-C6, perfluoroalquilo C1-C6 o alcoxi C1-C6; o ciclohexilo, 3-dimetilaminopropilo o N-morfolinoetilo).** Las azidas de acilo tambien pueden reorganizarse en isocianatos.
Cuando se enlaza un colorante que tiene un acido carboxflico con un ligando o biomolecula que contiene amina, el acido carboxflico del colorante se puede convertir primero en una forma mas reactiva con un reactivo de activacion, a fin de formar, por ejemplo, un ester de N-hidroxisuccinimida (NHS) o un anhfdrido mixto. El ligando o biomolecula que contiene amina se trata con el acido activado resultante, formandose un enlace amida. Habitualmente, esta reaccion se lleva a cabo en tampon acuoso con un codisolvente opcional con DMSO o DMF a un pH de entre 8 y 9.
De modo similar, la union de un colorante que contiene isotiocianato es analoga al procedimiento para el colorante carboxflico, pero no es necesaria ninguna etapa de activacion. El ligando o biomolecula que contiene amina se trata directamente con el colorante NCS para formar un enlace tiourea. Habitualmente, la reaccion se lleva a cabo en tampon acuoso con un codisolvente opcional con DMSO o DMF a un pH de entre 9 y 10.
Si el compuesto colorante tiene un grupo hidroxilo reactivo, se puede unir a un ligando o biomolecula, tal como ADN o ARN, a traves de la qufmica de la fosforamidita. La utilizacion de fosforamidita permite el marcado del ADN o ARN durante el proceso de sfntesis. El nucleotido protegido se marca mientras esta unido a un soporte en fase solida. El grupo 5'-OH libre se hace reaccionar con la fosforamidita y un activador de tetrazol para formar un enlace fosfito, que posteriormente se oxida a fosfato. A continuacion, el aDn o ARN marcado se separa de la fase solida utilizando amonfaco u otro procedimiento estandarizado.
En un aspecto, los colorantes tienen suficiente solubilidad en soluciones acuosas para que, una vez unidos a un ligando o biomolecula soluble, el ligando o biomolecula mantenga su solubilidad. Tambien tienen una buena solubilidad en medios organicos (por ejemplo, DMSO o DMF), lo que proporciona una considerable flexibilidad a los enfoques sinteticos al marcado de los materiales deseados.
En un aspecto, la presente divulgacion da a conocer un metodo o procedimiento para preparar un ligando o biomolecula marcados con colorante, comprendiendo dicho procedimiento: poner en contacto un ligando o biomolecula con un compuesto de formula la para generar el compuesto de formula If.
Segun la presente divulgacion, las biomoleculas pueden marcarse utilizando un kit. En un aspecto, dicho kit comprende un compuesto de formula I e instrucciones de uso. En otro aspecto, el kit comprende, ademas, un tampon. En otro aspecto, el kit contiene un tampon de acoplamiento, tal como NaHCO3/Na2CO3 0,2 M. En otro aspecto, el tampon tiene un fondo de baja fluorescencia.
En algunos aspectos, el enlace covalente entre L y B se selecciona entre el grupo que comprende un enlace directo, un enlace amida, un enlace ester, un enlace eter, un enlace oxima, un enlace ester de fosfato, un enlace sulfonamida, un enlace tioeter, un enlace tiourea y un enlace urea.
V. Aplicaciones adicionales
En otros aspectos, los compuestos colorantes se utilizan como agentes de formacion de imagenes opticas in vivo de tejidos y organos en diversas aplicaciones biomedicas, incluidas, aunque sin limitarse a las mismas, formacion de imagenes por tomograffa de organos, monitorizacion de funciones de organos, angiograffa coronaria, endoscopia de fluorescencia, formacion de imagenes de tumores, intervenciones quirurgicas guiadas por laser, metodos fotoacusticos y de sonofluorescencia, y similares. En un aspecto, los compuestos colorantes son utiles para la deteccion de la presencia de tumores y otras alteraciones mediante el control del perfil de eliminacion del colorante en la sangre. En otro aspecto, los compuestos colorantes son utiles para las intervenciones quirurgicas guiadas asistidas por laser para la deteccion de micrometastasis de tumores por laparoscopia. En otro aspecto, los compuestos colorantes son utiles en el diagnostico de placas ateroscleroticas y coagulos sangufneos.
En otros aspectos, los compuestos colorantes se utilizan en la formacion de imagenes de: (1) enfermedades oculares en oftalmologfa, por ejemplo, para mejorar la visualizacion de enfermedades coriorretinianas, tales como trastornos vasculares, retinopatfas, neovascularizacion y tumores mediante formacion directa de imagenes microscopicas; (2) enfermedades de la piel, tales como tumores de la piel, mediante la formacion directa de imagenes microscopicas; (3) enfermedades o tumores gastrointestinales, bucales, bronquiales, cervicales y urinarios
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mediante endoscopia; (4) placas ateroscleroticas y otras alteraciones vasculares a traves de cateteres endoscopicos flexibles; (5) tumores de mama mediante reconstruccion de imagenes bi o tridimensionales; y (6) tumores cerebrales, perfusion y accidente cerebrovascular mediante reconstruccion de imagenes bi o tridimensionales.
Los compuestos que son conjugados de colorantes son particularmente utiles para la obtencion de imagenes de tumores, tejidos y organos en un sujeto. Por ejemplo, la existencia de celulas cancerosas o tejidos cancerosos se puede verificar mediante el marcado de un anticuerpo antitumoral con un compuesto colorante y posterior administracion del anticuerpo conjugado con colorante al sujeto para la deteccion y la formacion de imagenes del tumor. Los conjugados entre el compuesto colorante y otros anticuerpos, peptidos, polipeptidos, protefnas, ligandos para receptores de la superficie celular, moleculas pequenas y similares tambien son agentes utiles para la formacion de imagenes in vivo de tumores, tejidos y organos en un sujeto.
Los compuestos pueden administrarse sistemica o localmente al organo o tejido del que se quieren obtener imagenes antes del procedimiento de formacion de imagenes. En un aspecto, los compuestos se administran por via intravenosa. En otro aspecto, los compuestos se administran por via parenteral. En otro aspecto, los compuestos se administran por via enteral. Habitualmente, las composiciones utilizadas para la administracion del compuesto contienen una cantidad eficaz del compuesto colorante o conjugado de colorante junto con vehfculos y excipientes farmaceuticos convencionales adecuados para el tipo de administracion contemplada. Por ejemplo, las formulaciones parenterales contienen, ventajosamente, una solucion o suspension acuosa esteril del compuesto colorante o conjugado de colorante segun la presente invencion. Habitualmente, las composiciones para la administracion enteral contienen una cantidad eficaz del colorante en solucion o suspension acuosa, que pueden incluir opcionalmente tampones, tensioactivos, agentes tixotropicos, agentes aromatizantes y similares.
Las composiciones se administran en dosis eficaces para obtener la imagen optica deseada de un tumor, tejido u organo. Dichas dosis pueden variar ampliamente, dependiendo del compuesto colorante o conjugado de colorante utilizado en concreto, del tumor, tejido u organo sometidos al procedimiento de formacion de imagenes, del equipo de formacion de imagenes utilizado y similares.
En el procedimiento de la presente divulgacion, se da a conocer la administracion al sujeto de una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto colorante; un agente de direccionamiento, tal como un conjugado de colorante; o mezclas de los mismos. En un aspecto, el agente de direccionamiento se une selectivamente al tejido diana. A continuacion, se administra luz a una longitud de onda o banda de onda que corresponde a la que es absorbida por el agente fotosensibilizante. En otro aspecto, los compuestos actuan como agentes capaces de unirse a uno o mas tipos de celulas o tejidos diana y que, cuando se exponen a la luz de una banda de onda adecuada, absorben la luz, haciendo que se produzcan sustancias que iluminan, danan o destruyen las celulas o tejidos diana. Preferentemente, el compuesto es no toxico para el sujeto al que se administra o es susceptible de ser formulado en una composicion no toxica que puede administrarse al sujeto. Ademas, despues de la exposicion a la luz, el compuesto en cualquier forma fotodegradada resultante tambien es preferentemente no toxico.
En otro aspecto, los compuestos se administran por cualquier medio conocido, incluidos, aunque sin limitarse a los mismos, ingestion, inyeccion, administracion transcutanea, administracion transdermica y transiluminacion. Preferentemente, los compuestos se administran a un sujeto por via transcutanea. Por ejemplo, tal como se utiliza en la presente memoria, “transcutanea” se refiere al paso de la luz a traves de tejido no roto. Cuando la capa de tejido es la piel o la dermis, el termino “transcutanea” incluye “transdermica” y se entiende que la fuente de luz es externa a la capa exterior de la piel. Sin embargo, tal como se utiliza en la presente memoria, el termino “transiluminacion” se refiere al paso de la luz a traves de una capa de tejido, tal como la capa de superficie exterior de un organo, por ejemplo, el hfgado, y, como resulta evidente, la fuente de luz es externa al organo, pero interna o implantada en el sujeto o paciente.
En otros aspectos, el tumor, tejido u organo diana del tratamiento se seleccionan entre el grupo que comprende tejido endotelial vascular, una pared vascular anomala de un tumor, un tumor solido, un tumor de la cabeza, un tumor del cuello, un tumor del tubo gastrointestinal, un tumor del hfgado, un tumor de la mama, un tumor de la prostata, un tumor del ovario, un tumor del utero, un tumor del testfculo, un tumor del pulmon, un tumor no solido, las celulas malignas de un tejido hematopoyetico o un tejido linfoide, lesiones en el sistema vascular, una medula osea enferma, tejido neuronal o tejido neuronal enfermo, y las celulas enfermas en las que la enfermedad es una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad inflamatoria. En otra forma de realizacion, el tejido diana es una lesion en el sistema vascular de un tipo seleccionado entre el grupo que comprende lesiones ateroscleroticas, malformaciones arteriovenosas, aneurismas y lesiones venosas.
En otros aspectos, entre las formas de energfa se incluyen, aunque sin limitarse a las mismas, luz (es decir, radiacion), energfa termica, sonica, ultrasonica, qufmica, lumfnica, de microondas, ionizante (tal como rayos X y rayos gamma), mecanica y electrica. Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino “radiacion” incluye todas las longitudes de onda y bandas de onda. Preferentemente, la longitud de onda o banda de onda de la radiacion se selecciona de modo que se corresponda, o por lo menos se solape, con las longitudes de onda o bandas de onda que excitan al agente fotosensibilizante. Habitualmente, los colorantes tienen una o mas bandas de onda de absorcion que los excitan para producir las sustancias que iluminan, danan o destruyen las celulas, tejidos, organos
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o tumores diana. Preferentemente, la longitud de onda o banda de onda de la radiacion coincide con la longitud de onda o banda de onda de excitacion del agente fotosensibilizante y tiene una baja absorcion por parte de las celulas no diana y el resto del sujeto, incluidas las protefnas de la sangre.
En otros aspectos, la presente divulgacion da a conocer un metodo para generar una imagen de un sujeto, comprendiendo dicho metodo: la administracion de un compuesto de formula XXI:
al sujeto; y la generacion de una imagen de dicho sujeto, en el que se ha distribuido dicho compuesto. En algunos aspectos, el compuesto se ha distribuido a un tumor, un hueso, un tejido o un organo. El sujeto puede ser un ser humano.
En algunos aspectos, los compuestos colorantes se utilizan para tenir o marcar directamente una muestra, de modo que dicha muestra pueda ser identificada o cuantificada. Por ejemplo, dichos colorantes se pueden anadir como parte de un ensayo para un analito diana biologico, tal como un elemento trazador detectable en un fluido biologico o no biologico; o para fines tales como la terapia fotodinamica de tumores, en la que una muestra tenida se irradia para destruir selectivamente las celulas y tejidos tumorales; o para la fotoablacion de placas o celulas arteriales, habitualmente mediante la produccion de oxfgeno singlete por fotosensibilizacion.
Habitualmente, la muestra se obtiene directamente de una fuente lfquida o como lfquido de lavado de un material solido (organico o inorganico) o un medio de crecimiento en el que se han introducido celulas para su cultivo, o una solucion tampon en la que se han colocado celulas para su evaluacion. Cuando la muestra comprende celulas, las mismas son, opcionalmente, celulas individuales, incluidos microorganismos, o celulas multiples asociadas con otras celulas en capas de dos o tres dimensiones, incluidos organismos multicelulares, embriones, tejidos, biopsias, filamentos, biopelfculas y similares.
Una respuesta optica detectable significa un cambio en una senal optica, o la aparicion de la misma, que es detectable mediante observacion o instrumentalmente. Habitualmente, la respuesta detectable es un cambio en la fluorescencia, tal como un cambio en la intensidad, la distribucion de longitudes de onda de excitacion o emision de fluorescencia, la vida util de fluorescencia, la polarizacion de fluorescencia o una combinacion de los mismos. El grado y/o la ubicacion de la tincion, en comparacion con una respuesta patron o esperada, indica si la muestra posee una determinada caracterfstica y en que grado la posee. Algunos colorantes de la presente invencion pueden exhibir poca emision de fluorescencia, pero siguen siendo utiles como colorantes cromoforos. Dichos cromoforos son utiles como aceptores de energfa en aplicaciones de FRET, o simplemente para impartir el color deseado a una muestra o porcion de una muestra.
Para aplicaciones biologicas, los compuestos colorantes se utilizan habitualmente en una solucion acuosa, mayoritariamente acuosa o miscible en agua, preparada segun metodos generalmente conocidos en la tecnica. La concentracion exacta de compuesto colorante depende de las condiciones experimentales y los resultados deseados, pero son posibles intervalos comprendidos entre 0,00001 mM y 0,1 mM, tal como entre aproximadamente 0,001 mM y aproximadamente 0,01 mM. La concentracion optima se determina mediante la variacion sistematica hasta obtener resultados satisfactorios con una fluorescencia minima de fondo.
De la forma mas ventajosa, los compuestos colorantes se utilizan para tenir muestras con componentes biologicos. La muestra puede comprender mezclas heterogeneas de componentes (por ejemplo, incluyendo celulas intactas, celulas fijadas, extractos celulares, bacterias, virus, organulos y mezclas de los mismos), o un solo componente o grupo homogeneo de componentes (por ejemplo, aminoacidos naturales o sinteticos, acidos nucleicos o polimeros de hidratos de carbono, o lipidos complejos de membrana). En general, estos colorantes son no toxicos para las celulas vivas y otros componentes biologicos, dentro de las concentraciones de uso.
El compuesto colorante se combina con la muestra de cualquier manera que facilite el contacto entre el compuesto colorante y los componentes de la muestra de interes. En general, simplemente se anade a la muestra el compuesto colorante o una solucion que lo contiene. Algunos colorantes, en particular aquellos que estan sustituidos con uno o mas restos de acido sulfonico, tienden a no traspasar las membranas de las celulas biologicas y habitualmente, una vez dentro de celulas viables, se mantienen bien retenidos. Los tratamientos que permeabilizan la membrana plasmatica, tales como electroporacion, tratamientos de choque o concentracion alta de ATP extracelular, se pueden
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utilizar para introducir compuestos colorantes seleccionados en las celulas. Alternativamente, los compuestos colorantes seleccionados se pueden insertar ffsicamente en las celulas, por ejemplo mediante microinyeccion a presion, carga por raspado, metodos de registro zonal o fagocitosis.
En cualquier momento posterior o simultaneo a la tincion, la muestra se ilumina con una longitud de onda de luz seleccionada para dar una respuesta optica detectable, y se observa con un medio para detectar la respuesta optica. Entre el equipo util para la iluminacion de los compuestos colorantes se incluyen, aunque sin limitarse a los mismos, lamparas ultravioleta manuales, lamparas de arco de mercurio, lamparas de xenon, laseres y diodos laser. Opcionalmente, estas fuentes de iluminacion estan integradas en escaneres laser, lectores de microplacas de fluorescencia, fluorometros estandar o minifluorometros, o detectores cromatograficos. Las formas de realizacion preferidas de la presente invencion son colorantes excitables exacta o aproximadamente a las longitudes de onda 633-636 nm, 647 nm, 660 nm, 680 nm y mayores de 700 nm, tal como 780 nm, 810 nm y 850 nm, ya que estas regiones coinciden estrechamente con la salida de fuentes de excitacion relativamente economicas.
Opcionalmente, la respuesta optica se detecta mediante inspeccion visual o utilizando cualquiera de los siguientes dispositivos: camaras CCD, camaras de video, pelmula fotografica, dispositivos de escaneo por laser, fluorometros, fotodiodos, contadores cuanticos, microscopios de epifluorescencia, microscopios de barrido, citometros de flujo, lectores de microplacas de fluorescencia o mediante elementos de amplificacion de la senal, tales como tubos fotomultiplicadores. Cuando la muestra se examina con un citometro de flujo, el examen de la misma incluye, opcionalmente, la clasificacion de porciones de la muestra en funcion de su respuesta de fluorescencia.
Ejemplos
La siguiente seccion muestra una de las smtesis preferidas para la preparacion de diversos compuestos obtenidos de acuerdo con la presente divulgacion, asf como los datos experimentales para determinados compuestos. Esta seccion tambien proporciona ejemplos para el uso de los compuestos. Los ejemplos pretenden ser ilustrativos, no limitativos.
Ejemplo de referenda 1: Smtesis de un colorante cianina intermedio
Etapa A: smtesis de sal cuaternaria de indolsulfonato: Se calento una mezcla de 160 g (1.000 mmol) de 1,1,2- trimetil-IH-indol (ALDRICH) y 340,4 g (256 ml; 2.500 mmol; ALDRICH) de butanosultona a 125°C en un matraz de fondo redondo de 1 l con 400 ml de diclorobenceno en atmosfera de nitrogeno. Tras 16 horas, la reaccion se detuvo y se enfrio a temperatura ambiente. El solido que cristalizo en la mezcla de reaccion se filtro y se lavo con eter (150 ml). El solido obtenido se disolvio en un volumen mmimo de metanol (300 ml) y se precipito mediante la adicion de
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acetona (1.600 ml). El solido se filtro y se lavo con acetona (150 ml x 2). Se seco al vacfo y se obtuvieron 261,3 g (88,5%) de la sal cuaternaria. Era lo suficientemente pura para su utilizacion en la siguiente etapa.
Etapa B: sfntesis de sal cuaternaria de bencindol alcohol: La sal cuaternaria se preparo de acuerdo con el procedimiento de la patente US n° 6.027.709. En este caso, se utilizaron 92,0 g de 1,1,2-trimetil-1H-bencindol (ACROS) y se obtuvieron 113,0 g (60% de rendimiento) de sal cuaternaria de bencindol alcohol pura.
Etapa C: sfntesis del colorante cloro: Una mezcla que contenfa sal cuaternaria de bencindol alcohol (39 g; 100 mmol), sal cuaternaria de indolsulfonato (20,5 g; 100 mmol), en etanol (400 ml) se agito en atmosfera de nitrogeno durante 10 a 15 min para obtener la solucion uniforme. A esta solucion se le anadio base de Schiff (35,9 g; 100 mmol; ALDRICH), seguido de la adicion de 100 ml de etanol. La solucion de color rojo oscuro se calento a 60°C. A esta temperatura, se anadio acetato de sodio (21,32 g; 130 mmol), seguido de 12,80 g de acetato de potasio (130 mmol). La temperatura se elevo para obtener un reflujo vigoroso (110°C a 115°C) y se mantuvo a este reflujo durante 35 a 40 min. La reaccion se detuvo y se enfrio a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se vertio sobre un bano de hielo (1 l) cuando se formo un producto oleoso que se deposito en el fondo. El agua se decanto y el procedimiento se repitio hasta que los lavados con agua eran transparentes. El producto oleoso se trituro con eter (150 ml x 3) y a continuacion con acetato de etilo (150 ml x 3). El producto parcialmente solidificado se disolvio en metanol (350 ml) y a continuacion el metanol se elimino por evaporacion en un rotavapor. El colorante solido se seco al vacfo. Se purifico adicionalmente por cromatograffa en columna (gel de sflice 60, 35-75 mm; gradiente de disolvente: 10% de metanol en acetonitrilo a 30% de metanol en acetonitrilo), obteniendose un colorante cloro puro (29,0 g; rendimiento del 40%).
Ejemplo de referencia 2: Sfntesis de un colorante cianina
Sfntesis de colorante sulfo-fenoxi: En 40 ml de DMF seco se disolvieron 2,95 g (12,70 mmol) de acido 4- hidroxibencenosulfonico. Tras anadir 1,08 g (60%; 26,8 mmol) de hidruro de sodio, la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 10 min en atmosfera de nitrogeno. El colorante cloro del ejemplo 1 (7,41 g; 10 mmol), disuelto en 25 ml de DMF seco, se anadio a la mezcla de reaccion y se agito adicionalmente durante 45 a 50 min. Un maximo de absorcion de 788 nm al final de este perfodo indico un desplazamiento hipocromico de 13 nm (colorante cloro, absorcion a 801 nm), y por consiguiente la formacion del colorante sulfo-fenoxi. Se anadio hielo seco a la mezcla de reaccion y el DMF se elimino al vacfo. El colorante en bruto se purifico por cromatograffa en columna (gel de sflice 60; gradiente de disolvente: 10% de metanol en acetonitrilo a 30% de metanol en acetonitrilo), obteniendose 4 g del colorante puro (rendimiento del 45%).
5 Sfntesis de un colorante sulfo-fenoxi: En 20 ml de cloruro de metileno seco se disolvieron 1,4 g (1,59 mmol) del colorante sulfo-fenoxi anterior y la solucion se enfrio en un bano de hielo-acetona con agitacion en atmosfera de nitrogeno. Tras anadir 0,6 g (1,01 ml; 3,18 mmol) de tetraisopropilfosforodiamidita de 2-cianoetilo y 0,045 g (1,3 ml; 0,64 mmol) de solucion de 1-H-tetrazol (0,5 M) a 0°C, la solucion se agito a temperature ambiente de 2 a 2,5 horas. Se anadio a la mezcla de reaccion cloruro de metileno que contenfa el 1% de trietilamina y a continuacion la mezcla 10 de reaccion se sometio a lavados con bicarbonato sodico al 5% (50 ml x 2) y agua (50 ml x 2). Tras el secado sobre sulfato de sodio anhidro, la solucion se filtro y el filtrado se concentro a 5 ml. La solucion concentrada se anadio a 0°C a hexano (50 ml) con agitacion y en atmosfera de nitrogeno. El residuo viscoso obtenido tras la decantacion del hexano se trituro con eter (50 ml), obteniendose un polvo solido. Se seco al vacfo, obteniendose un polvo verde de sulfo-fenoxi fosforamidita (1,0 g; rendimiento del 58%).
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Etapa A: sfntesis de 5-fluoro-indol: Una mezcla que contenfa clorhidrato de 4-fluorofenilhidrazina (5,0 g; 30,75 mmol; ALDRICH), 3-metil-2-butanona (3,7 g; 43 mmol; ALDRICH) y acido acetico (30 ml) se agito durante 30 min en atmosfera de nitrogeno, obteniendose una solucion transparente. A continuacion, la mezcla se sometio a reflujo a 130°C. La aparicion de un maximo de absorcion de UV-Vis a 255 nm y la desaparicion del pico a 282 nm confirmo la formacion del indol. Al cabo de 40 minutos, la reaccion se detuvo y la mezcla se vertio en hielo picado (100 g). El residuo se extrajo en acetato de etilo (100 ml x 2), se lavo con agua (100 ml x 2) y la capa de acetato de etilo se seco sobre sulfato de sodio anhidro. Tras la filtracion, se elimino el acetato de etilo y el residuo se seco, obteniendose 4,15 g del indol (rendimiento del 76%).
Etapa B: sfntesis de sal de carboxilato de 5-fluoroindol: Una mezcla que contenfa 5-fluoroindol (3,0 g; 16,9 mmol), acido 6-bromohexanoico (5,38 g; 27,6 mmol; ALDRICH) en 90 ml de butironitrilo se llevo a reflujo en atmosfera de nitrogeno a 140-145°C. La cuaternizacion se completo al cabo de entre 35 y 40 horas. La mezcla de reaccion se enfrio a temperatura ambiente y se trituro con eter, y finalmente se seco al vacfo, obteniendose el solido (6,0 g; rendimiento del 95%).
Etapa C: sfntesis de sal cuaternaria de bencindolsulfonato: Esta sal se preparo de acuerdo con el procedimiento descrito para la sfntesis de sal cuaternaria de indolsulfonato, tal como se ha descrito en la etapa A del ejemplo 1.
Etapa D: sfntesis de colorante cloro: El producto de la etapa C se convirtio en un colorante cloro mediante el procedimiento descrito en la etapa C del ejemplo 1. En este caso, se utilizaron 0,4 g (1 mmol) de sal de carboxilato de 5-fluoroindol y 0,35 g (1 mmol) de sulfonato de bencindol para obtener 0,27 g (rendimiento del 35%) del colorante cloro.
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Sfntesis de un colorante sulfo-fenoxi asimetrico: El colorante cloro del ejemplo 4 se convirtio en un colorante sulfo- fenoxi mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 2. Utilizando 0,7 g (0,91 mmol) del colorante cloro, se obtuvieron 0,4 g (rendimiento del 48%) del colorante sulfo-fenoxi puro.
Sfntesis de colorante de ester de NHS: Se disolvio colorante de carboxialquilo (0,27 g; 0,3 mmol) que contenfa 55 fluoroindol y un grupo sulfo-fenoxi central en una mezcla de DMF seco (3,0 ml) y piridina seca (0,3 ml). Se anadio carbonato de disuccinimidilo (DSC, ALDRICH, 0,115 g; 0,44 mmol) y la mezcla se agito a 60°C durante 2 horas en atmosfera de nitrogeno. Despues de diluir la mezcla con eter (15 ml) y decantar el sobrenadante, el producto se volvio a disolver en DMF seco (2 ml). Se anadio eter (15 ml) gota a gota con agitacion para obtener el precipitado solido. Se filtro y se seco al vacfo, obteniendose 0,25 g del colorante reactivo (rendimiento del 84%). La formacion 10 del ester activo se confirmo por HPLC.
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Etapa A: sfntesis de sal cuaternaria de 1-(4-sulfonatobutil)-2,3,3-trimetilindolinina: Se calentaron una mezcla de 1,2,3-trimetilindolenina (15,9 g, 100 mmol) y 1,4-butanosultona (27,2 g, 200 mmol) a 140°C en 250 ml de 1,2- diclorobenceno durante 16 horas. El residuo gomoso resultante se separo por decantacion del disolvente, se disolvio en una cantidad minima de metanol y se precipito con acetona. El precipitado de color rosa se filtro y se seco al vacfo. Rendimiento: 85%
Etapa B: sfntesis de sal cuaternaria de 1-(6-carboxipentil)-2,3,3-trimetilindolenina: Una mezcla de 1,2,3- trimetilindolenina (8 g, 50 mmol) y acido 6-bromohexanoico (19 g, 100 mmol) se calento a reflujo en 250 ml de butironitrilo durante 36 horas. El residuo gomoso resultante, obtenido tras la eliminacion del disolvente mediante rotavapor, se disolvio en una cantidad minima de cloroformo y se precipito con eter. El precipitado se trituro con eter para obtener un polvo seco de grano suelto. Rendimiento: 70%
Etapa C: sfntesis de colorante cloro: Una mezcla de 5 mmol de cada una de las sales cuaternarias de la etapa A y la etapa B, junto con monohidrocloruro de N-[(3-anilinoetilen)-2-cloro-1-ciclohexen-1-il)metilen]anilina (1,30 g, 5 mmol) y acetato de sodio (1,1 g, 13 mmol) se sometio a reflujo en 30 ml de etanol seco durante 1 hora. La mezcla de reaccion se enfrio para eliminar el etanol por rotavapor. El residuo se sometio a cromatograffa en columna de gel de sflice de fase inversa C18 (metanol-agua, 3:2), obteniendose un 30% del colorante cloro deseado.
Etapa D: sfntesis de colorante sulfo-fenoxi: Se preparo una solucion de sal disodica del acido 4- hidroxibencenosulfonico del siguiente modo: A una suspension del 60% de hidruro de sodio (120 mg, 3 mmol de NaH al 100%) en 10 ml de DMF seco, enfriada a 0°C en atmosfera de nitrogeno, se anadio una solucion en DMF (10 ml) de acido 4-hidroxi-bencenosulfonico dihidrato (2 mmol, ALDRICH). Despues de 10 minutos, los contenidos de
reaccion se calentaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuacion, los contenidos se transfirieron a un matraz que contema 1 mmol del colorante cloro en 30 ml de DMF con agitacion vigorosa a temperatura ambiente. La reaccion se controlo mediante el espectro de absorcion UV-Vis, que mostro un desplazamiento hipsocromico de 782 nm a 769 nm. Despues de 30 minutos, la reaccion se inactivo con hielo seco. El DMF se evaporo en un 5 rotavapor. La precipitacion con eter proporciono el producto en bruto en forma de polvo seco, que se purifico adicionalmente en columna de gel de sflice de fase inversa C18 utilizando metanol acuoso al 40%. Rendimiento: 75%. El producto puro se caracterizo por RMN de protones.
Etapa E: Smtesis del ester de NHS del colorante sulfo-fenoxi: Se disolvieron 2,6 mg del colorante sulfo-fenoxi 10 (0,0031 mmol) en 250 pl de DMF seco en un tubo de microcentnfuga de 1,5 ml, al que se anadieron 4,5 mg de N -
hidroxisuccinimida (0,039 mmol, ALDRICH) y 10 mg de DCC (0,05 mmol, ALDRICH). La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 16 horas y el progreso de la reaccion se controlo por HPLC. Los reactivos en exceso se eliminaron por precipitacion con eter y el colorante-NHSE en bruto se recogio por centrifugacion del precipitado y se purifico adicionalmente en columna de cromatograffa HPLC de fase inversa RPC18 preparativa (INERTSIL, ODS 15 3,5 pm, 250 x 4,6 mm). Se eluyo con un gradiente de disolvente de tampon AB 90-10% a amortiguador 100% B (A =
4% de acetonitrilo en TEEAc 0,1 M y B = 80% de acetonitrilo en TEEAc 0,1 M). Las fracciones se agruparon y el disolvente se elimino en evaporador Speed Vac, obteniendose 2 mg de ester puro. La presencia del ester de NHS se confirmo por HPLC.
5 Sfntesis de colorante de ester de NHS 8a-8i: El colorante de carboxialquilo del ejemplo 7 (2,6 mg; 0,0031 mmol) se disolvio en DMF seco (250 pl). A esta solucion se anadio N-hidroxisuccinimida (ALDRICH; 4,5 mg; 0,039 mmol) y diciclohexilcarbodiimida (DCC; ALDRICH; 10 mg; 0,05 mmol). La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 16 horas. La reaccion se controlo por HPLC y el ester de NHS se purifico pasandolo a traves de la columna de fase inversa (INERTSIL, ODS 3,5 pm, 250 x 4,6 mm) y eluyendo con un gradiente de disolvente desde 10% b (a = 4% de 10 acetonitrilo en acetato de trietilamonio 0,1 M; b = 80% de acetonitrilo en acetato de trietilamonio 0,1 M) hasta 100% a. El disolvente se elimino al vacfo, obteniendose 2 mg del ester de NHS puro. La presencia del grupo ester de NHS reactivo en el colorante 8a se confirmo por HPLC. Los colorantes 8b-8i (a continuacion) se pueden sintetizar por
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procedimientos analogos.
- Colorante
- R" R16
- 8a*
- H H
- * _Q 00
- SO3- SO3"
- 8c
- F F
- 8d
- H SO3"
- 8e
- SO3- H
- 8f
- H F
- 8g
- F H
- 8h
- SO3- F
- 8i
- F SO3"
* ejemplo de referencia
Sfntesis de diferentes conectores: El procedimiento mostrado anteriormente se puede llevar a cabo con una amplia variedad de conectores (L) para la fijacion del colorante a la biomolecula. Por ejemplo, entre los conectores adecuados se incluyen un enlace directo o un enlace covalente, en el que el enlace covalente es lineal o ramificado, cfclico o heterocfclico, saturado o insaturado, que tiene de 1 a 60 atomos seleccionados entre el grupo que comprende C, N, P, O y S, en el que L puede tener atomos de hidrogeno adicionales para cubrir valencias, en el que el enlace contiene cualquier combinacion de enlaces eter, tioeter, amina, ester, carbamato, urea, tiourea, oxi o amida; o enlaces carbono-carbono simples, dobles, triples o aromaticos; o enlaces fosforo-oxfgeno, fosforo-azufre, nitrogeno-nitrogeno, nitrogeno-oxfgeno o nitrogeno-platino; o enlaces aromaticos o heteroaromaticos.
Por ejemplo, haciendo referencia a la tabla 1, la columna A es una lista de las funcionalidades reactivas, que pueden encontrarse en el colorante o en la biomolecula. La columna B es una lista de los grupos complementarios, ya sea en la biomolecula o en el colorante (preferentemente, una funcionalidad carboxilo, hidroxilo, tiol o amino), que, junto con las funcionalidades reactivas, forman el enlace resultante de la columna C. El grupo enlazante comprende el enlace resultante y, opcionalmente, los atomos adicionales, tal como se ha descrito anteriormente.
En algunos aspectos, el conjugado colorante-biomolecula de los ejemplos 4 y 7 puede tener las siguientes estructuras:
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El colorante del ejemplo 8 se conjugo con exito a terminadores aciclo-ATP, GTP, CTP y UTP. Estos terminadores no marcados se obtuvieron a traves de NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, INC., Boston, Massachusetts. Los terminadores marcados con colorante se purificaron hasta una pureza > 95% por HPLC. Sus concentraciones se determinaron mediante espectros de absorcion de UV-visible obtenidos en tampon de fosfato acuoso. Los analogos marcados se utilizaron en secuenciacion de ADN y se obtuvo una escalera de secuencia de alta calidad con los analogos con el colorante incorporado. El aciclo-UTP marcado con colorante se ha ilustrado anteriormente.
Ejemplo de referencia 10: marcado de ADN
La fosforamidita del colorante sulfo-fenoxi del ejemplo 2 se utilizo para marcar moleculas de ADN preparadas en una maquina de sfntesis de ADN. El colorante se unio al extremo 5' del oligonucleotido protegido, unido a soporte, mediante la qufmica de desproteccion de fosforamidita. En sfntesis a escala de 200 nmol, los rendimientos crudos tfpicos de oligonucleotidos marcados con colorante fenoxi estan comprendidos entre 65 y 95 nmol. Los oligonucleotidos marcados con colorante sulfo-fenoxi se obtuvieron a razon de entre 100 nmol y 125 nmol.
Ejemplo de referencia 11: Estabilidad de colorante sulfo-fenoxi en NH4OH y ditiotreitol (DTT)
El colorante sulfo-fenoxi del ejemplo 2 y el correspondiente colorante fenoxi (200 nmol de cada) de la misma estructura, excepto con un H en lugar del sulfonato en el colorante fenoxi, se trataron con 400 pl de hidroxido de amonio concentrado y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Se anadio otro lote de 400 pl de hidroxido de amonio concentrado y se agito durante 5 horas adicionales. Estas son las condiciones que se utilizan en la desproteccion de los cebadores marcados con colorante. La reaccion se controlo por TLC en intervalos de 15
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minutos. En el caso del colorante fenoxi, la formacion de la impureza de color azul se observo al cabo de 15 minutos. La intensidad de esta impureza aumento con el tiempo. Al cabo de 1,5 horas, casi la mitad del colorante se descompuso para dar un colorante azul. La mancha azul se aislo y se obtuvieron los espectros de absorcion y emision. La impureza de color azul dio lugar a un maximo de absorcion a 655 nm y de emision a 747 nm. En condiciones identicas, el colorante sulfo-fenoxi no formo ninguna mancha de color azul que pudiera identificarse por TLC o absorcion. Esto muestra claramente que la presencia del grupo sulfonato en el fenoxi mejora la resistencia del colorante a la degradacion por amonfaco.
Para estudiar la resistencia al ataque por DTT, cada uno de estos dos colorantes (200 nmol de cada) se trato con 400 pl de DTT en acetonitrilo y se agito a temperature ambiente. Tras agitar durante la noche (16 horas), la TLC indico la formacion de nuevas manchas para el colorante sin el sulfonato en el grupo fenoxi. Estos productos de degradacion se aislaron y se obtuvieron los espectros de absorcion UV-Vis. Las tres manchas presentaron un maximo de absorcion a 786 nm, 738 nm y 392 nm, respectivamente. La absorcion a 738 nm indica la formacion de un nuevo colorante degradado debida a la descomposicion del colorante fenoxi, que absorbe a 787 nm. La mancha reconocible de impureza no aparecio hasta pasadas de 7 a 8 horas. En condiciones identicas durante la noche, el colorante sulfo-fenoxi del ejemplo 2 no dio lugar a ninguna mancha que absorbiera a 738 nm. Claramente, la presencia del grupo sulfonato en el anillo fenoxi mejora la resistencia del colorante al ataque por DTT.
Los dos colorantes (“fenoxi” y “sulfo-fenoxi”) tienen propiedades opticas similares, tales como el maximo de absorcion y el coeficiente de extincion. Estos datos muestran la estabilidad inesperadamente mejorada que se obtiene mediante la sustitucion de un hidrogeno del anillo fenoxi con un grupo sulfonato. Puesto que los problemas de estabilidad son comunes a los colorantes cianina de esta familia qufmica, tambien se obtiene una mejora similar para los otros colorantes.
El colorante 8a se utilizo para marcar la estreptavidina. Se saco del frigorffico una cantidad de estreptavidina y se sometio a analisis por UV-Vis para determinar la cantidad. A esta estreptavidina se le anadieron 2,5 equivalentes de colorante 8a. Se dejo progresar la reaccion de marcado (a pH 7,4) durante 2 horas a 4°C y a continuacion la mezcla de reaccion se transfirio a un casete de dialisis MWCO 10K. La dialisis se llevo a cabo durante aproximadamente 64 horas, con un total de 3 cambios de tampon de 1 litro de 1X PBS cada uno. El analisis por UV-Vis de la estreptavidina tras la dialisis puso de manifiesto que la estreptavidina estaba marcada con el colorante 8a.
Ejemplo 12
A. Caracterizacion del conjugado EGF-colorante 8b (ensayos in vitro)
Se marco EGF comercialmente disponible en los grupos amino libres utilizando un derivado de ester de NHS del colorante 8b del ejemplo 8, de modo similar al marcado de la estreptavidina con el colorante 8b descrito anteriormente. El conjugado de colorante se purifico por procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia. Se evaluaron la especificidad y la actividad del EGF-colorante 8b con cultivos confluentes de celulas PC3M- LN4 y 22Rv1 utilizando un ensayo en microplaca in vitro (In-cell Western; Chen, H. y otros 2005. Anal. Biochem. 338:136-142) escaneado en Aerius™. (LI-COR® Biosciences, Lincoln, Nebraska). La actividad biologica del conjugado se verifico por su capacidad para estimular la actividad de la cinasa del receptor de EGF. La figura 1 muestra el resultado de las provocaciones de especificidad realizadas in vitro. En el grafico A, se representa la union de la sonda EGF-colorante 8b a las celulas PC3M-LN4 y 22Rv1. El grafico B ilustra la baja afinidad del colorante 8b no conjugado y corresponde al nivel basal observado en el grafico A. En los graficos C y D, la union del colorante 8b marcado se bloqueo eficazmente mediante el pretratamiento de las celulas con EGF (C) o C225 (D) sin marcar a 1,25 pg/ml o 9,4 pg/ml, respectivamente.
B. Formacion de imagenes de animales in vivo
Se implantaron celulas PC3M-LN4 o 22Rv1 (106) por via subcutanea en la region costal de ratones SCID (4 animales por tipo de celula). El crecimiento de los tumores se controlo durante 6 semanas por palpacion, medicion del calibre y formacion de imagenes opticas. Para la formacion de imagenes, se inyecto una sonda EGF-colorante 8b esterilizada por filtracion (1-2 nmol por animal) a traves de la vena caudal en ratones anestesiados con isoflurano. A continuacion se recogieron imagenes en los puntos temporales indicados. Se llevo a cabo una formacion de imagenes por fluorescencia en el IR cercano de animales vivos con un prototipo de generador de imagenes LI-COR Biosciences para animales pequenos. El instrumento LI-COR® es una caja hermetica a la luz equipado con una camara CCD refrigerada, iluminacion de areas a traves de diodos laser y filtros de luz sintonizados para el colorante 8b. Se obtuvieron imagenes y se analizaron con el software Wasabi de Hamamatsu Fotonics (Hamamatsu, Japon).
C. Analisis de imagenes
Las imagenes analizadas en una serie se normalizaron a la misma LUT (“look-up table” cuadro de busqueda) con un valor mfnimo y maximo comun para su presentacion visual. Las regiones de interes (ROI) de igual area se utilizaron para las regiones tumoral y de fondo. Las ROI se cuantificaron mediante los valores de pfxeles totales y pfxeles medios. La desviacion estandar de la media de los fondos se calculo utilizando de 3 a 5 ROI. Este calculo
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proporciona el numero de desviaciones estandar sobre el fondo que representarfa un tumor sospechoso.
SNR = (Tumor de intensidad media) - (Media de intensidad de fondo) Desviacion estandar de la media de fondos
D. Cinetica de la eliminacion de la sonda
En primer lugar, se evaluo la eliminacion de la sonda en un animal sin presencia de tumor. La figura 2 ilustra la eliminacion del EGF-colorante 8b a lo largo de 24 horas. Se analizaron dos ROI. La ROI grande cubrfa todo el interior del organismo, mientras que la ROI pequena se centraba unicamente en la region abdominal.
Los resultados mostraron la senal de pico del EGF-colorante 8b a las 3,75 horas de la inyeccion, independientemente del tamano de la ROI. La acumulacion en la vejiga se observaba claramente al cabo de 1 hora y el 95% de la intensidad de senal total habfa disminuido al cabo de 24 horas. A continuacion, se evaluo la eliminacion de la sonda en un animal con tumor utilizando la SNR como una medida. Se tomaron una serie de imagenes para determinar el tiempo optimo de formacion de imagenes posterior a la inyeccion a fin de llevar a cabo un estudio longitudinal. Tras la inyeccion a traves de la vena caudal, se obtuvieron imagenes del raton a las 0,3, 24, 48, 72 y 96 horas, observandose la mayor SNR en el dfa 4 (figura 3).
E. Deteccion precoz de tumores
La formacion de imagenes se inicio dos semanas despues de implantar celulas tumorales en los ratones SCID. El lfmite de deteccion se determino mediante la evaluacion de una imagen que contenfa dos manchas pequenas (< 0,5 mm) en el area de interes. Se determino que las SNR eran de 3,20 y 2,43 para las dos manchas pequenas en la semana 2. Al cabo de una semana, se repitieron la inyeccion y la formacion de imagenes. La imagen de la semana 3 puso de manifiesto que la primera mancha es mayor y se confirmo que era una senal de tumor mediante palpacion, mientras que la segunda mancha ya no era visible y se determino que era un artefacto.
F. Analisis de la seccion tisular
Se llevo a cabo una provocacion competitiva durante la semana 5 con un animal que recibio uno de los siguientes tratamientos: 1) EGF-colorante 8b (2 nmol); 2) solo colorante 8b (3 nmol); 3) 2 mg/ml de C225 (un anticuerpo monoclonal para el receptor de EGF (Erbitux, ImClone) mas EGF-colorante 8b (2 nmol) 24 horas despues de la inyeccion de C225, y 4) 0,9% de inyeccion simulada de solucion salina. Tras la formacion final de imagenes (dfa 4 despues de la inyeccion), los animales se sacrificaron. Los tumores se pesaron, se midieron y se prepararon secciones congeladas de los mismos (0,8 mm de espesor) para analizarlas en el sistema de imagenes por infrarrojos Odyssey® (LI-COR). Las comparaciones de las secciones tisulares entre EGF-colorante 8b y C225 + EGF-colorante 8b mostraron una disminucion del 54% de la senal cuando se administro C225 24 horas antes del EGF-colorante 8b. Cuando unicamente se administro colorante 8b, se mantuvo cierta cantidad de senal en el tumor, tal como se observa tambien in vitro.
- Tratamiento
- ID Int 700 Int 800 Area (mm2) Int 800/area (mm2) Media
- A) Solucion salina al 0,9%
- C2P0 4,5 0,89 65,32 0,01 0,01
- 3,5 0,34 65,33 0,01
- B) colorante 8b
- C2P2 1,45 18,7 30,06 0,62 0,56
- 1,24 13,18 26,22 0,50
- C) EGF-colorante 8b
- C1P0 1,08 14,08 21,73 0,65 0,70
- 0,98 15,13 20,49 0,74
- D) C225 + EGF-colorante 8b
- C1P2 2,27 15,43 39,49 0,39 0,38
- 1,99 13,71 37,86 0,36
Conclusiones
Tal como se muestra en la presente memoria, la sonda EGF-colorante 8b es especffica y sensible con respecto a las lfneas celulares de cancer de prostata PC3M-LN4 y 22Rv1, tanto in vitro como in vivo. Esta sonda tambien es util para otros tipos de cancer, ya que el receptor de EGF aumenta en muchos modelos de tumores.
Ejemplo 13
A. Materiales y metodos
A ratones NOD/SCID macho de seis semanas de edad se les inyectaron ortotopicamente 105 celulas tumorales. Se evaluaron dos lfneas de celulas tumorales humanas de prostata: PC3M-LN4, una lfnea celular altamente oncogena y metastasica, y celulas 22Rv1, no caracterizadas anteriormente en este sistema modelo. El biomarcador, EGF- colorante 8b, se utilizo para la deteccion de tumores. En la semana 1 tras la implantacion de las celulas tumorales, se inyecto 1 nmol de conjugado de colorante a traves de la vena caudal. El progreso temporal de la eliminacion del
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colorante mediante la relacion senal a ruido (SNR) como lectura establecio la maxima especificidad a las 96 horas. Se recogieron imagenes semanalmente durante cinco semanas 96 horas despues de la inyeccion de colorante. Se incluyo una provocacion competitiva en la que se utilizo el anticuerpo bloqueante C225 anti-receptor de EGF para confirmar la especificidad de la sonda en los tumores de prostata y los ganglios linfaticos.
Se obtuvieron imagenes de fluorescencia en el infrarrojo cercano de animales vivos anestesiados con isoflurano con un prototipo de generador de imagenes LI-COR® Biosciences para animales pequenos (Lincoln, Nebraska). Se obtuvieron imagenes y se analizaron con el software Wasabi de Hamamatsu Fotonics (Hamamatsu, Japon).
Al final del estudio, se obtuvieron imagenes de los tumores, que se extirparon, se pesaron, se les midio el calibre y se prepararon secciones tisulares.
B. Resultados y conclusion
Cuando se lleva a cabo un procedimiento de formacion de imagenes del crecimiento de un tumor interno en un estudio longitudinal, una preocupacion importante es la capacidad de seguir y estimar correctamente el tamano del tumor. La figura 7 (tumor PC3M-LN4) y la figura 8 (tumor 22Rv1) muestran los resultados para un animal observado a lo largo del perfodo del experimento. Por consiguiente, solo los pfxeles que igualaban o excedfan la SNR estandar en la region de interes se incluyeron en la estimacion del tamano del tumor a lo largo del tiempo. Se determinaron el area (mm2), la intensidad de la senal del tumor por mm2 y la SNR de pico. Estos parametros mostraron tendencias similares a lo largo del tiempo para las dos lfneas celulares de tumor de prostata. El crecimiento tumoral se controlo eficazmente con EGF-colorante 8b en el modelo de tumor ortotopico con profundidades de tumor de hasta 1 cm.
Cuando se compararon el volumen (mm2), el peso (mg) y la SNR para el tumor, el grupo de tratamiento de 22Rv1 mantuvo una media mas alta en todas las categorfas de analisis en comparacion con los tumores PC3M-LN4 (figura 9, A, B y C respectivamente).
Se obtuvo una confirmacion adicional de la especificidad de EGF-colorante 8b para los tumores de prostata mediante la recuperacion de los tumores y los ganglios linfaticos al finalizar el estudio.
El analisis mostro que, cuando se administraba C225, un anticuerpo monoclonal que bloquea el receptor de EGF, 24 horas antes del EGF-colorante 8b, se alcanzaba aproximadamente el 39% de bloqueo (figura 10). La deposicion del EGF-colorante 8b en todo el tumor se pudo observar en las dos secciones que recibieron biomarcador marcado.
Un objetivo principal de este estudio fue determinar la afectacion de los ganglios linfaticos con las dos lfneas celulares y evaluar el EGF-colorante 8b como indicador de metastasis. Se sabe que la lfnea PC3M-LN4 produce metastasis en los ganglios linfaticos paraaorticos, mientras que la lfnea 22Rv1 no estaba caracterizada. Al finalizar el estudio, se formaron imagenes de los tumores de prostata y las regiones de los ganglios linfaticos en las cavidades abdominales abiertas. No se observaron crecimiento ni signos de metastasis para los animales con tumores de prostata 22Rv1, a pesar de que dichos tumores eran, en promedio, 3 veces mayores en peso y volumen que los tumores de prostata PC3MLN4. Los ganglios linfaticos de los animales con tumores de prostata PC3MLN4 aparecieron ampliados y opacos, y visualmente presentaban las caracterfsticas tfpicas de metastasis. Al obtener imagenes de los ganglios linfaticos en un abdomen abierto con un tumor de prostata grande, la senal de los ganglios linfaticos, aunque se detecta, esta amortiguada por la elevada senal de la region. Sin embargo, si el tumor se extirpa o se cubre, la senal de los ganglios linfaticos se observa claramente.
Los ganglios linfaticos de los animales provocados se extirparon y se escanearon en un equipo Odyssey a fin de confirmar la presencia de EGF-colorante 8b en los ganglios linfaticos paraaorticos de los animales PC3M-LN4. Aunque los ratones que recibieron las celulas 22Rv1 desarrollaron tumores de prostata grandes, no mostraron signos de metastasis en los ganglios linfaticos a la semana 6. Los ganglios PC3MLN4 extirpados se analizaron en Odyssey y se determino la senal por unidad de superficie (mm2). Las comparaciones de los ganglios linfaticos procedentes de tratamientos con EGF-colorante 8b y C225 + EGF-colorante 8b mostraron aproximadamente un 34% de bloqueo en los ganglios linfaticos en comparacion con el 39% observado en los tumores de prostata. Estos resultados sugieren que el efecto del C225 se extiende al sitio de metastasis, lo que confirma la especificidad del biomarcador con este sistema de modelo de tumor.
- Canal Intensidad Area, mm2 Senal/area, mm2 % bloqueado
- NC
- 700 0,15 10,63 0,014
- 800 0,16 10,63 0,015
- EGF-colorante 8b
- 700 0,14 6,26 0,022
- 800 7,20 6,26 1,150
- C225+
- 700 0,07 3,91 0,018
- 800 2,98 3,91 0,762 33,74
Ganglios linfaticos de los animales positivos (tumores derivados de PC3M-LN4) junto con un ganglio de control negativo (izquierda). El color verde representa la senal del canal de 800 nm, y el rojo representa la senal del canal
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de 700 nm (autofluorescencia y fondo). Conclusiones
A diferencia de los tumores PC3M-LN4, los tumores 22Rv1 no mostraron metastasis espontanea a los ganglios linfaticos paraaorticos, incluso con presencia de grandes tumores de prostata. La utilizacion del biomarcador EGF- colorante 8b y de la formacion de imagenes por fluorescencia optica no invasiva permite hacer un seguimiento del tamano del tumor en los tumores abdominales profundos, asf como en los ganglios linfaticos, lo que confirma las metastasis y proporciona al investigador una confirmacion inmediata sin la necesidad de examen histologico. El antagonismo de la senal in vivo por el anticuerpo C225 confirma la especificidad del biomarcador EGF-colorante 8b.
Ejemplo 14
La formacion de imagenes in vivo de sondas moleculares especfficas, o formacion de imagenes moleculares, es un campo emergente para el estudio de modelos animales de cancer, enfermedades cardiovasculares y enfermedades neurodegenerativas. La formacion de imagenes opticas utilizando sondas de direccionamiento o trazadores marcados con fluorescencia es particularmente adecuada para la formacion de imagenes moleculares, ya que las sondas fluorescentes son inocuas, sensibles y pueden conjugarse especfficamente con moleculas pequenas, anticuerpos, peptidos y protefnas. La formacion de imagenes opticas puede controlar el crecimiento y la regresion de tumores de un modo continuo y no invasivo. Los fluoroforos con emisiones en la region visible del espectro tienen graves limitaciones de sensibilidad debidas al fondo autofluorescente de los tejidos y la sangre. Los agentes de fluorescencia mas utiles han demostrado ser los que presentan emisiones comprendidas entre 780 nm y 850 nm (vease Weissleder, Nature Biotechnology, vol. 19, p. 316-317 (2001)). Dado que los espectros de absorbancia de los fluidos y tejidos corporales exhiben mfnimos locales en la region del infrarrojo cercano (IR cercano), la formacion de imagenes en el infrarrojo cercano ofrece las ventajas de una penetracion relativamente profunda en el tejido y una autofluorescencia baja.
Las ventajas de disponer de un marcador oseo o un compuesto que pueda introducirse activamente en el hueso durante la remodelacion y la resorcion proporcionarfa puntos de referencia para otros agentes de formacion de imagenes (una radiograffa optica, si se quiere) o para la investigacion dedicada a las metastasis osteoblasticas. El agente de direccionamiento tambien puede beneficiar a los que se encargan de evaluar sitios de lesion mecanica, que pueden poner al descubierto sitios de union para el agente. Sin embargo, la mineralizacion osea ofrece el mayor numero de sitios de union para el agente de direccionamiento. Algunos colorantes son capaces de unirse durante la calcificacion osea, como tetraciclinas o derivados de fluorescefna verde, tales como calcefna o DCAF, entre otros. Los presentes solicitantes han utilizado un fluorocromo conocido (calcefna, excitacion a 488 nm y emision a 520 nm) y lo han marcado con el colorante 8b del ejemplo 8 para alcanzar dos objetivos: 1) incorporar el compuesto en el hueso en crecimiento activo y desplazar la deteccion del compuesto en la region del IR cercano para aprovechar la mayor sensibilidad de deteccion, y 2) producir un compuesto marcado dualmente para una mayor versatilidad.
B. Sfntesis
1) El material de partida, la calcefna, se adquirio como un unico isomero puro y uno de sus grupos carboxilato se activo por TSU en presencia de DIPEA en DMSO.
2) A continuacion, el grupo carboxilato activado de ester de NHS se conjugo con etilendiamina (EDA) protegida con Boc para generar una amina primaria potencial que porta el derivado de calcefna.
3) El grupo protector Boc se elimino con TFA para liberar la amina primaria de la calcefna-EDA. Y este
precursor, calcefna-EDA, se purifico por HPLC antes de la conjugacion final con el colorante 8b.
4 El marcador oseo final (calcefna-colorante 8b) se obtuvo por conjugacion de la calcefna-EDA anterior con colorante 8b de ester de NHS en una razon molar de uno a uno. Este producto se purifico adicionalmente por HPLC para eliminar el acido libre de colorante 8b y la calcefna-EDA. Tras la purificacion por HPLC, el producto se seco en un evaporador Speed Vac a temperatura ambiente y a continuacion se almaceno en un congelador a -20°C hasta su utilizacion.
Se realizo un seguimiento de la sfntesis por HPLC y espectrometrfa de masas durante todo el proceso. Los
procedimientos anteriores se pueden resumir en el siguiente esquema de sfntesis (el producto indicado es una
mezcla de isomeros).
Claims (3)
- 5101520251. Compuesto de formula:
imagen1 en el que(1) R11 es F, y R16 es F; o(2) R11 es H, y R16 es SO3'Na+; o(3) R11 es SO3-Na+, y R16 es H; o(4) R11 es H, y R16 es F; o(5) R11 es F, y R16 es H; o(6) R11 es SO3-Na+, y R16 es F; o(7) R11 es F, y R16 es SO3-Na+; - 2. Compuesto de formula:
imagen2 5101520253035404550en el quea) R11 es H, y R16 es H; ob) R11 es SO3-Na+, y R16 es SO3-Na+; oc) R11 es F, y R16 es F; od) R11 es H, y R16 es SO3-Na+; oe) R11 es SO3-Na+, y R16 es H; of) R11 es H, y R16 es F; og) R11 es F, y R16 es H; oh) R11 es SO3-Na+, y R16 es F; oi) R11 es F, y R16 es SO3-Na+;para su utilizacion en un procedimiento de formacion de imagenes opticas in vivo,- en el que la formacion de imagenes es una formacion de imagenes de tumores; o- en el que la formacion de imagenes es el diagnostico de placas ateroescleroticas o coagulos sangufneos; o- en el que la formacion de imagenes esta destinada a(1) las enfermedades oculares en oftalmologfa;(2) las enfermedades de la piel;(3) las enfermedades o los tumores gastrointestinales, bucales, bronquiales, cervicales o urinarios mediante endoscopia;(4) las placas ateroescleroticas u otras alteraciones vasculares a traves de cateteres endoscopicos flexibles;(5) los tumores de mama mediante reconstruccion de imagenes en 2D o 3D; o(6) los tumores cerebrales, la perfusion o el accidente cerebrovascular mediante reconstruccion de imagenes en 2D o 3D; o- el procedimiento comprende verificar la existencia de celulas cancerosas o tejidos cancerosos mediante el marcado de un anticuerpo, peptido, polipeptido, protefna, ligando para receptores de la superficie celular o una molecula pequena, con el compuesto colorante y, administrar a continuacion el conjugado de colorante al sujeto para la deteccion y la formacion de imagenes del tumor. - 3. Compuesto de formula:5101520
imagen3 en el que(1) R11 es F, y R16 es F; o(2) R11 es H, y R16 es SO3'Na+; o(3) R11 es SO3-Na+, y R16 es H; o(4) R11 es H, y R16 es F; o(5) R11 es F, y R16 es H; o(6) R11 es SO3-Na+, y R16 es F; o(7) R11 es F, y R16 es SO3-Na+;para su utilizacion en un procedimiento de formacion de imagenes opticas in vivo, en el que la formacion de imagenes es una formacion de imagenes tomograficas de organos, una monitorizacion de funciones de organos, una angiograffa coronaria, una endoscopia de fluorescencia, una cirugfa guiada por laser o un procedimiento fotoacustico o de sonofluorescencia.
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