ES2957133T3 - Tintes de cianina modificados y sus conjugados - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere al campo de la formación de imágenes ópticas. Más particularmente, se refiere a compuestos de la familia de las cianinas caracterizados por propiedades fisicoquímicas y biológicas mejoradas y a sus conjugados con ligandos biológicos de los mismos. La invención también se refiere al uso de estos compuestos como agentes de diagnóstico óptico en la obtención de imágenes o en la terapia de tumores sólidos, a los métodos para su preparación y a las composiciones que los comprenden. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Tintes de cianina modificados y sus conjugados
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la formación de imágenes ópticas. Más particularmente, se refiere a compuestos de la familia de las cianinas caracterizados por propiedades fisicoquímicas y biológicas mejoradas, y a sus conjugados con ligandos biológicos de los mismos. La invención también se refiere al uso de estos compuestos como agentes de diagnóstico óptico en la obtención de imágenes o en la terapia de tumores sólidos, a los métodos para su preparación, y a las composiciones que los comprenden.
Antecedentes de la técnica
Los tintes son entidades químicas que absorben fotones de una longitud de onda específica con la excitación de la luz y reemiten parte de esa energía, dependiendo de la eficiencia cuántica, generalmente en una longitud de onda más larga. En particular, los tintes de cianina son moléculas orgánicas fluorescentes caracterizadas por un sistema de electrones deslocalizado que se extiende sobre un puente de polimetino y está confinado entre dos átomos de nitrógeno. Algunos de ellos, que tienen propiedades ópticas favorables, baja toxicidad y buena solubilidad en medios acuosos, pueden usarse como agentes de contraste para imágenes biomédicas.
Las moléculas fluorescentes usadas actualmente para imágenes biomédicas, tal como el verde de indocianina (ICG), la fluoresceína, el azul de metileno y el ácido 5-aminolevulénico (5-ALA), se difunden pasivamente en los tejidos y pueden acumularse en regiones patológicas gracias a diferentes mecanismos de localización. Los fluoróforos como la fluoresceína y el ICG se distribuyen en los tejidos tumorales mediante una combinación de difusión pasiva y efecto de permeabilidad y retención mejoradas (EPR) (Onda N. et al., Int J Cancer 2016, 139, 673-682). Los intermediarios metabólicos como el 5-ALA se acumulan en tejidos con metabolismo aumentado (Stummer W. et al., Neurosurgery 2015, 77(5), 663-673). Otros fluoróforos, que no están dirigidos contra una diana molecular específica, aprovechan las propiedades fisiológicas del tumor (es decir, perfusión y permeabilidad mejoradas) para generar el contraste de la imagen, siguiendo los principios de la formación de imágenes por resonancia magnética o rayos X con contraste mejorado (Licha et al., Photochemistry and Photobiology, 2000, 72(3), 392-398). En general, estos agentes de contraste fluorescentes requieren una dosis masiva relativamente grande para una visualización adecuada. Además, los falsos positivos y los falsos negativos son hallazgos clínicos comunes asociados con su uso (Tummers Q. et al., PlosOne 2015).
Se están desarrollando otros agentes de contraste para imágenes ópticas que aprovechan el uso de un tinte conjugado con un resto portador, dirigido contra un receptor tumoral sobreexpresado, para mejorar la sensibilidad y especificidad de la detección (Achilefu S. et al, J Med Chem 2002, 45, 2003-2015).
Sin embargo, el comportamientoin vivode los conjugados tinte-biomolécula puede verse fuertemente afectado por las propiedades biológicas del resto fluorescente. Por ejemplo, pequeñas modificaciones estructurales de una cianina Cy5 modulan fuertemente la acumulación en tumores y tejidos fuera de la diana de los bioconjugados relativos (Bunschoten A. et al., Bioconjugate Chem. 2016, 27, 1253-1258). Para aplicaciones en organismos vivos serían preferibles agentes de contraste fluorescentes con baja acumulación no específica y alta selectividad para el tejido diana.
El documento US 6.913.743 B2 a nombre de Institut fur Diagnostikforschung GmbH describe, por ejemplo, un procedimiento de diagnósticoin vivoque usa nuevos tintes solubles en agua y sus aductos de biomoléculas como medio de contraste.
Los documentos WO2018/189136 y WO2016/097317, ambos a nombre de Bracco Imaging SpA, describen el compuesto DA364 usado para la demarcación de márgenes tumorales en imágenes intraoperatorias. Dicho compuesto es un péptido RGD cíclico basado en aza-bicicloalcano conjugado con un tinte sulfo-Cy5.5.
Un ejemplo de conjugado de ICG, que está unido a un péptido cRGD, se describe en Capozza et al, Photoacoustics, 2018, 11,36-45, en el que se usa para la obtención de imágenes fotoacústicas de tumores.
El documento US 6.329.531 B1, a nombre de Schering AG, se refiere a agentes de diagnóstico óptico para el diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas mediante radiación NIR, y describe en particular tintes de heptametino cianina como marcadores fluorescentes. Algunos de estos tintes de cianina también se describen, por ejemplo, en artículos Licha et al., Photochemistry and Photobiology, 2000, 72(3), 392-398 y Ebert et al., J. Biomed. Optics, 2011, 16(6), 066003, en los que se comparan con el tinte ICG clínicamente aprobado. En particular, estos últimos describen un compuesto denominado SIDAG, que mostró propiedades fisicoquímicas similares a las de los medios de contraste de MRI, y, a diferencia del ICG, se caracterizó por una distribución extravascular, con volúmenes de distribución en el intervalo del agua extracelular. SIDAG es una alternativa hidrófila al ICG diseñada para resolver el problema técnico de su extravasación insignificante y su rápida absorción hepática. Sin embargo, no se mencionó el posible uso de tales compuestos, y en particular SIDAG, como sondas fluorescentes para la formación de imágenes moleculares, ni sobre ningún enfoque sintético para una derivatización funcional y una conjugación adicional de tales derivados simétricos de cianina. Por ejemplo, se propuso SIDAG como tinte biológicamente inerte con un patrón de distribución extravascular para imitar el comportamiento de los agentes de contraste de MRI como el ácido gadopentético (Gd-DTPA). SIDAG se puede difundir rápidamente a través de los poros de los vasos tumorales alterados, y por lo tanto puede alcanzar regiones más profundas del tejido tumoral mediante difusión pasiva, pero carece de las características deseadas para aplicaciones de imágenes moleculares, tal como la capacidad de internalizarse y acumularse con alta eficiencia y especificidad dentro de las células patológicas y tejidos.
El documento WO2005/123768, a nombre de Amersham Health AS, describe nuevos compuestos basados en péptidos marcados con al menos un tinte indicador de cianina adecuado como agente de contraste en imágenes ópticas para el diagnóstico de enfermedades relacionadas con la angiogénesis.
El documento WO2012/088007, a nombre de Pierce Biotechnology Inc. y Dyomics Gmbh, describe tintes de cianina que tienen de dos a cuatro funciones de ácido sulfónico en el esqueleto del heterociclo de indol.
A pesar de varios esfuerzos para encontrar agentes de obtención de imágenes adecuados, todavía existe la necesidad de encontrar tintes mejorados dotados de estabilidad y eficiencia de fluorescencia óptimas, así como propiedades fisicoquímicas y biológicas óptimas, y diseñados para obtener imágenes ópticas de organismos vivos. Esta necesidad es primordial, particularmente para aplicaciones de imágenes moleculares que requieren herramientas altamente específicas, con capacidad para obtener imágenes de cambios moleculares finos y acumularse con alta eficiencia en las células diana, tal como cuando el tinte se conjuga con una biomolécula que se une específicamente a un epítopo molecular o a un tejido patológico (por ejemplo, un tumor). La presente invención aborda estas y otras necesidades.
Sumario de la invención
Generalmente, el objeto de la presente invención es proporcionar nuevos tintes de cianina, y en particular sus correspondientes conjugados con restos de unión, útiles como medio de contraste para imágenes ópticas y destinados a resolver los problemas mencionados anteriormente. En particular, la presente invención aborda el problema técnico de obtener un agente de formación de imágenes ópticas con propiedades óptimas para aplicaciones de formación de imágenes moleculares. Por ejemplo, se ha descubierto que los nuevos derivados de cianina de la invención presentan propiedades particularmente adecuadas para interactuar con sustratos biológicos y acumularse en células y tejidos patológicos.
Los nuevos derivados de cianina descritos aquí están sorprendentemente dotados de propiedades ópticas notables que conducen a una eficiencia de imagen mejorada en dosis máscias bajas y una relación señal-ruido mejorada. Además, los presentes inventores han encontrado procedimientos adecuados para sintetizar los nuevos tintes de cianina y conjugarlos con diferentes restos dianizadores a través de grupos funcionales adecuados que actúan como sitios de unión, proporcionando así agentes de contraste muy específicos y sensibles para la obtención de imágenes ópticas. Las nuevas combinaciones de tinte, espaciador, y resto dianizador, tal como se proporcionan en la presente invención, han proporcionado sorprendentemente compuestos dotados de una eficiencia de internalización celular óptima y propiedades generales para la formación de imágenes moleculares en un agente de formación de imágenes ópticas.
En detalle, entre las diversas ventajas que se pueden conseguir mediante los presentes compuestos, particularmente para los conjugados con un resto de unión, se pueden destacar, por ejemplo, las siguientes características: baja interacción con las proteínas plasmáticas, selectividad para el tejido diana, y baja acumulación debido a interacción no específica con otros tejidos, alta solubilidad en agua, reacciones adversas insignificantes o no observadas después de la administración sistémica, buena estabilidad química y óptica en plasma después de la administración.
En particular, se ha descubierto que los compuestos de la invención tienen una afinidad de unión muy baja por la albúmina humana, lo que es particularmente ventajoso cuando estos compuestos se usan para obtener imágenes en seres humanos: dicha baja afinidad evita el secuestro de los compuestos en los compartimentos del plasma por las grandes proteínas presentes en la sangre, tal como la albúmina, y la consiguiente reducción de la fracción de tinte libre disponible para su acumulación en el tejido de interés. De hecho, la fracción de tintes unida a la albúmina se acumularía en los tejidos a la velocidad de transporte de una macromolécula, ya que el alto peso molecular de la albúmina dicta el comportamiento del tinte unido, y provocaría su acumulación inespecífica indeseada en tejidos y órganos sanos. Esta propiedad biológica es particularmente importante en el caso de conjugados de tintes, ya que sólo su fracción libre (no unida a la albúmina) puede interactuar adecuadamente con la diana molecular y puede ser internalizada eficientemente por las células que expresan un antígeno particular.
Un aspecto adicional de la invención se refiere a tales conjugados de tintes como agentes de diagnóstico, en particular para uso en formación de imágenes ópticas de un órgano o tejido humano o animal, para uso en un método de formación de imágenes ópticas, en el que la formación de imágenes es una formación de imágenes tomográficas de órganos, monitorización de las funciones de los órganos, incluida angiografía, imágenes del tracto urinario, imágenes de las vías biliares, imágenes de los nervios, identificación intraoperatoria del cáncer, cirugía guiada por fluorescencia, imágenes de fluorescencia de por vida, imágenes infrarrojas de onda corta, endoscopia de fluorescencia, laparoscopia de fluorescencia, cirugía robótica, cirugía de campo abierto, cirugía guiada por láser, o un método fotoacústico o de sonofluorescencia.
Además, la invención se refiere a un procedimiento de fabricación para la preparación de los tintes proporcionados, los conjugados correspondientes y/o sus sales farmacéuticamente aceptables, y a su uso en la preparación de un agente de diagnóstico.
Según un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacéuticamente aceptable que comprende al menos un tinte o compuesto conjugado de tinte de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en una mezcla con uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables. Dichas composiciones son útiles en particular como agentes de formación de imágenes ópticas para proporcionar imágenes útiles de órganos o tejidos humanos o animales.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la obtención de imágenes ópticas de un órgano, tejido o región del cuerpo mediante el uso de una técnica de obtención de imágenes ópticas, que comprende el uso de una dosis eficaz de un compuesto de la invención.
Descripción detallada de la invención
Por consiguiente, un primer objeto de la presente invención es proporcionar un compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
en la que
R1yR2son independientemente un grupo -CO-NH-Y, en el que Y se selecciona de alquilo lineal o ramificado, cicloalquilo y heterociclilo, sustituido con al menos dos grupos hidroxilo;
R3es alquilo lineal o ramificado sustituido con un grupo seleccionado de -NH2, -SO3H, -COOH y - CONH2;
R4es alquilo bivalente lineal o ramificado;
R5se selecciona de -COO- y -CONH-;
Ses un espaciador;
Tes un resto dianizador;
nes un número entero igual a 1,2 o 3; y
mes un número entero igual a 0 o 1.
La presente invención proporciona además los tintes funcionalizados correspondientes representados por un compuesto intermedio de fórmula (II), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
en la que
R1, R2, R3, R4ynson como se definen anteriormente y
R5'se selecciona de -COOH, -CONH2, -COO-Pg and -CONH-Pg, en el que Pg es un grupo protector. La presente invención también se refiere a métodos para preparar los compuestos de fórmula (I) o (II) mediante etapas de transformaciones sintéticas.
La invención también comprende compuestos de fórmula (I) para uso como sondas fluorescentes para la detección de un margen tumoral en cirugía guiada.
Definiciones
En la presente descripción, y a menos que se indique lo contrario, los siguientes términos y frases como se usan aquí pretenden tener los siguientes significados.
La expresión "alquilo lineal o ramificado" se refiere a un grupo radical hidrocarbonado alifático, que puede ser de cadena lineal o ramificada, que tiene de 1 a 8 átomos de carbono en la cadena. Por ejemplo, "alquilo C4" comprende en su significado una cadena lineal o ramificada que comprende 4 átomos de carbono. Los grupos alquilo representativos y preferidos incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, terc-butilo, pentilo y hexilo. A menos que se especifique lo contrario, el alquilo lineal o ramificado es un grupo radical monovalente. En algunos casos puede ser un grupo radical "bivalente" o "multivalente", en el que dos o más átomos de hidrógeno se eliminan del grupo radical hidrocarbonado anterior y se sustituyen, por ejemplo grupos metileno, etileno, isopropileno y similares. El término "cicloalquilo", como se utiliza allí, comprende en su significado un anillo carbocíclico saturado (es decir, cicloalifático) que comprende de 3 a 7 átomos de carbono. Los ejemplos adecuados incluyen un anillo carbocíclico de C5-C7, por ejemplo un anillo de ciclohexilo.
El término "heterociclilo", como se utiliza allí, comprende un anillo cicloalifático saturado, preferiblemente un anillo saturado de 5-7 miembros, que comprende además un heteroátomo en la cadena cíclica, seleccionado de N, O y S. Preferiblemente, se refiere a tetrahidropirano.
El término "hidroxialquilo" se refiere a cualquiera de las cadenas alquílicas correspondientes en las que uno o más átomos de hidrógeno están reemplazados por grupos hidroxilo.
El término "alcoxi" comprende en su significado una cadena alquílica como se define anteriormente que comprende además uno o más átomos de oxígeno; los ejemplos incluyen, por ejemplo, grupos alquiloxi tales como metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi y similares, y grupos alquil-(poli)oxi en los que la cadena alquílica está interrumpida por uno o más átomos de oxígeno.
En la presente descripción, la expresión "grupo protector" (Pg) designa un grupo protector adaptado para preservar la función del grupo al que está unido. Específicamente, se usan grupos protectores para preservar las funciones amino, hidroxilo o carboxilo. Los grupos protectores apropiados pueden incluir, por ejemplo, bencilo, carbonilo, tal como formilo, 9-fluorometiloxicarbonilo (Fmoc), benciloxicarbonilo (Cbz), t-butoxicarbonilo (Boc), isopropiloxicarbonilo o aliloxicarbonilo (Alloc), alquilo, por ejemplo grupos terc-butilo o trifenilmetilo, sulfonilo, acetilo, tales como trifluoroacetilo, ésteres bencílicos, alilo, u otros sustituyentes comúnmente usados para la protección de dichas funciones, que son bien conocidos por el experto en la técnica (véase, por ejemplo, la referencia general T.W. Green and P.G.M.Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, N.Y. 2007, 4a Ed., Cap. 5). Más particularmente, la invención comprende compuestos de fórmula (II) en los que los grupos funcionales de R5', es decir, un ácido carboxílico o carboxamida, están protegidos con un grupo protector apropiado (Pg) como se define anteriormente, preferiblemente con grupos alquilo. Dichos derivados encuentran aplicación, por ejemplo, como precursores adecuados o compuestos intermedios en la preparación de un compuesto deseado de fórmula (I) o sus sales.
Si es necesario, los grupos hidroxilo de R1 y R2 y/o los grupos funcionales de R3 también pueden protegerse con un grupo protector apropiado (Pg) durante la preparación de los compuestos de fórmula (I) o (II), formando así, por ejemplo, grupos acetoxi, alcoxi, éster o amida.
La expresión "reactivo de acoplamiento" se refiere a un reactivo usado, por ejemplo, en la formación de un enlace de amida entre un resto carboxílico y un resto de amino. La reacción puede consistir en dos etapas consecutivas: activación del resto carboxílico, y después, acilación del grupo amino con el ácido carboxílico activado. Los ejemplos no limitativos de tales agentes de acoplamiento se seleccionan del grupo que consiste en: carbodiimidas, tales como N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC), N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDAC), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (WSC); reactivos de fosfonio, tales como hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tris(dimetilamino)fosfonio (BOP), hexafluorofosfato de (benzotriazol-1 -iloxi)tripirrolidinofosfonio (PyBOP), hexafluorofosfato de 7-azabenzotriazol-1-iloxitripirrolidinofosfonio (PyAOP), hexafluorofosfato de [etilciano(hidroxiimino)acetato-O2]tri-1-pirrolidinilfosfonio (PyOxim), hexafluorofosfato de bromotripirrolidinofosfonio (PyBrOP) y 3-(dietoxifosforiloxi)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-ona (DEPBT); y reactivos de aminio/uronio-imonio, tales como tetrafluoroborato de O-(N-succinimidil)-1,1,3,3-tetrametiluronio (TSTU), tetrafluoroborato de N,N,N',N'-tetrametil-O-(benzotriazol-1 -il)uronio (TBTU), hexafluorofosfato de N,N,N',N'-tetrametil-O-(1H-benzotriazol-1-il)uronio (HBTU), hexafluorofosfato de N,N,N',N'-tetrametil-O-(7-azabenzotriazol-1-il)uronio (HATU), hexafluorofosfato de O-(1H-6-clorobenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HCTU), hexafluorofosfato de 1-[1-(ciano-2-etoxi-2-oxoetiliden-aminooxi)-dimetilamino-morfolino]-uronio (COMU) y hexafluorofosfato de fluoro-N,N,N',N'-tetrametilformamidinio (TFFH), u otros compuestos bien conocidos por el persona experta en la técnica.
La expresión "ácido carboxílico activado" se refiere a un derivado de un grupo carboxilo que es más susceptible al ataque nucleofílico que un grupo carboxilo libre; derivados adecuados pueden incluir, por ejemplo, anhídridos de ácido, tioésteres, haluros de acilo, ésteres de NHS, y ésteres de sulfo NHS.
Los términos "resto" o "residuo" pretenden definir la porción residual de una molécula dada una vez unida o conjugada adecuadamente, ya sea directamente o a través de un enlazador y/o espaciador adecuado, al resto de la molécula.
La expresión "agente de formación de imágenes" se refiere a una entidad detectable que puede usarse para visualizar o detectarin vitrooin vivoun elemento biológico que incluye células, fluidos biológicos y tejidos biológicos que se originan de un paciente mamífero vivo, y preferiblemente de un paciente humano, así como de órganos, regiones o tejidos del cuerpo humano, cuando dicha entidad detectable se usa en asociación con una técnica de diagnóstico por imágenes adecuada.
Resto dianizador(T)
Según la invención, un resto dianizador (T) es una molécula que se une con particular selectividad a una diana biológica y facilita la acumulación del agente de contraste en un tejido o parte del cuerpo específico. Generalmente, está representado por una molécula natural o sintética para uso en sistemas biológicos. Dicha unión específica se puede lograr a través de un ligando, tal como por ejemplo una molécula pequeña, una proteína, un péptido, un peptidomimético, un sustrato enzimático, un anticuerpo o fragmento del mismo, o un aptámero, que interactúa con una diana biológica específica expresada en la superficie de los tejidos o células de interés.
Dianas biológicas adecuadas para los compuestos de la invención pueden ser, por ejemplo, un receptor del factor de crecimiento epitelial (EGF), tales como EGFR o HER2; un receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), tales como VEGFR1 o VEGFR2; una enzima anhidrasa carbónica (CA), tales como CAIX, CAII o CAXII; una glicoproteína de mucina, tal como MUC1; un transportador de glucosa, tal como GLUT-1; un antiportador de sodiohidrógeno, tal como NHE1; una glicoproteína carcinoembrionaria, tal como el antígeno carcinoembrionario (CEA); un receptor de quimiocina, tal como el receptor de quimiocina tipo 4 (CXCR4); una molécula de adhesión celular, tal como ICAM, EPCAM, VCAM, E-Selectina, P-Selectina; el factor de crecimiento de hepatocitos HGFR (c-met); un receptor para la transferrina; un receptor de efrina, tal como EPHA2; un receptor para el ácido fólico, tal como FR-alfa; una glicoproteína que se une al ácido ialurónico, tal como CD44; un receptor de bombesina, tales como BB1, BB2, BB3; una N-acetil-L-aspartil-L-glutamato peptidasa (NAAG), tal como el antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA); y, en particular, un receptor de integrina, tales como receptores de integrina avp3, avp5, avp6 o asp1.
Por ejemplo, los restos dirigidos contra receptores de integrina están representados por péptidos lineales o cíclicos que comprenden la secuencia Arg-Gly-Asp (RGD). Este tripéptido tiene una alta especificidad de unión por el receptor, siendo reconocido como ligando por la familia de receptores de integrinas ubicados en la membrana celular. De hecho, se ha identificado en algunas glicoproteínas de la matriz extracelular, tal como la fibronectina o la vitronectina, que aprovechan este motivo RGD para mediar la adhesión celular.
Por lo tanto, péptidos y peptidomiméticos lineales y cíclicos que contienen la secuencia Arg-Gly-Asp (RGD), tales como por ejemplo cRGD, cRGDfK, cRGDyK, cRGDfC, RGD-4C, RGD-2C, AH111585, NC100692, RGD-K5 (Kapp et al., Sci Rep, 2017, 7:3905), o sus análogos y derivados de los mismos, son un ejemplo bien conocido de motivo de unión dirigido contra tejidos cancerosos en los que las integrinas de la membrana celular están aumentadas en comparación con los tejidos sanos.
En una realización, los compuestos de la invención se pueden conjugar con otras moléculas pequeñas, péptidos, proteínas o anticuerpos, tales como, por ejemplo, anticuerpos monoclonales ya usados para terapia. Pequeñas moléculas que contienen el fármaco acetazolamida, tales como por ejemplo los compuestos 4a, 5a, 6a, 7a and 8a (Wichert et al., Nat Chem 2015, 7: 241-249), o sus análogos y derivados, son ejemplos de pequeñas moléculas dirigidas contra la enzima CAIX. Péptidos y peptidomiméticos lineales y cíclicos, tales como el péptido GE11 (descrito en Li et al., FASEB J 2005, 19:1978-85) y/o el péptido L1 (descrito en Williams et al., Chem Biol Drug Des 2018, 91:605-619), o sus análogos y derivados de los mismos, son ejemplos de péptidos dirigidos contra el receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR). Entre las proteínas, los derivados del factor de crecimiento epitelial (EGF) son ejemplos de proteínas pequeñas dirigidas contra el receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR). Entre los anticuerpos, panitumumab y cetuximab son ejemplos de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR).
Preferiblemente, los ligandos dianizadores de la invención son capaces de unirse selectivamente a células o tejidos tumorales. En particular, son capaces de unirse a tumores seleccionados de cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de esófago, cáncer de piel, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer oral, cáncer de pulmón, cáncer renal, cáncer de útero, cáncer de tiroides, cáncer de hígado, y cáncer colorrectal. Además, los ligandos dianizadores son capaces de vincular diseminaciones metastásicas de los cánceres mencionados anteriormente en tejidos y órganos diferentes de la fuente primaria. Además, los ligandos dianizadores pueden vincular lesiones preneoplásicas y displasia en diferentes tejidos y órganos.
En una realización, el resto dianizador también puede ser un agente quelante que forma complejos y se une firmemente a metales. Los expertos en la técnica conocen ejemplos de tales agentes quelantes de metales y se dan a conocer en la técnica anterior, y pueden estar representados, por ejemplo, por moléculas de DOTA, NODAGA, TETA, CB-TE2A, EDTA, DTPA, deferoxamina, NOTA, AAZTA, etc. Estos agentes quelantes se pueden usar para formar complejos con metales tales como Gd3+ o Mn2+ y aplicarse como agentes de contraste en imágenes por resonancia magnética. En una realización preferida, los agentes quelantes pueden usarse para formar complejos con radiometales tales como tecnicio, indio, fluoruro de aluminio, circonio, itrio, lutecio, escandio, actinio, galio o cobre, y encuentran aplicación, por ejemplo, como agentes de formación de imágenes en análisis con tomografía por emisión de positrones, tomografía computarizada por emisión de fotón único, y recuento gamma.
EspaciadorS
Según la invención,Ses un espaciador, opcionalmente presente, que separa el resto dianizador del tinte. La presencia de un espaciador es particularmente relevante para algunas realizaciones en las que el resto dianizador y el tinte corren el riesgo de interactuar negativamente entre sí. Además, la presencia del espaciador puede ser necesaria cuando el tinte es relativamente grande y puede interferir con la unión del resto dianizador al sitio diana.
El espaciador puede ser flexible (por ejemplo, cadenas alquílicas simples) o rígido (por ejemplo, cadenas cicloalquílicas o arílicas), de modo que el tinte esté orientado lejos de la diana. El espaciador también puede modificar la farmacocinética y el metabolismo de los conjugados de fórmula (I) usados como agentes de formación de imágenes en un organismo vivo.
Los espaciadores hidrófilos pueden reducir la interacción con las proteínas plasmáticas, reducir el tiempo de circulación sanguínea, y facilitar la excreción. Por ejemplo, si el espaciador es un resto de polietilenglicol (PEG), la farmacocinética y las velocidades de aclaramiento sanguíneo del agente de formación de imágenesin vivopueden alterarse. En tales realizaciones, el espaciador puede mejorar la eliminación del agente de formación de imágenes del tejido de fondo (es decir, músculo, sangre), proporcionando así una mejor imagen de diagnóstico debido al alto contraste entre la diana y el fondo. Además, la introducción de un espaciador hidrófilo particular puede cambiar la eliminación del agente de contraste de la vía hepática a la renal, reduciendo así la retención corporal general.
Por lo tanto, en una realización preferida, el espaciador se selecciona del grupo que consiste en -NH(CH2)pCOO-, -NH(CH2CH2O)pCH2CH2COO- y -NH(CH2CH2O)pCH2CH2NH-, en el que p es un número entero entre 0 y 20. Preferiblemente, p es 2, 6 o 12.
Cuando no es necesario, el espaciador está preferiblemente ausente, es decir, m es 0, y S representa un enlace directo.
El espaciador, o alternativamente el resto dianizador cuando el espaciador está ausente, se puede conectar en un compuesto de fórmula (I) en el residuo R5, representado por el resto enlazante R5' en los compuestos de fórmula (II). Los grupos enlazantes de R5' son grupos funcionales reactivos tales como residuos carboxílicos o carboxamido adecuados para conjugar el tinte con el resto dianizador mediante la formación de un enlace químico.
Por ejemplo, cuando un resto dianizador que contiene amina (T) se conjuga con un compuesto de fórmula (II) en la que R5' es un ácido carboxílico, este ácido carboxílico puede activarse opcionalmente antes de llevar a cabo la conjugación mediante conversión en una forma más reactiva usando un reactivo activador, formando por ejemplo un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) o un anhídrido mixto. Después, para obtener el compuesto de fórmula (I) correspondiente, el resto dianizador que contiene amina se trata con el ácido activado resultante, para formar un enlace de amida. Normalmente, esta reacción se lleva a cabo en un amortiguador acuoso.
De lo contrario, se puede llevar a cabo una conjugación directa usando el ácido carboxílico "no activado".
De manera similar, cuando el grupo enlazador de R5' es un grupo carboxamido, el procedimiento para la unión del resto dianizador adecuado es análogo, pero generalmente no se requiere ninguna etapa de activación del enlazador, y el tinte y el resto dianizador se tratan directamente.
Los compuestos de la fórmula (I) o (II) anterior pueden tener uno o más átomos de carbono asimétricos, también denominados átomos de carbono quirales, y de este modo pueden dar lugar a diastereómeros e isómeros ópticos. A menos que se indique lo contrario, la presente invención incluye además todos estos posibles diastereómeros, así como sus mezclas racémicas, sus enantiómeros resueltos sustancialmente puros, todos los posibles isómeros geométricos y sus sales farmacéuticamente aceptables.
La presente invención se refiere además a compuestos de la fórmula (I) o (II) anterior en la que los grupos funcionales de R3 y/o R5', por ejemplo los grupos sulfonilo, carboxiamino o carboxílico, pueden estar en forma de una sal farmacéuticamente aceptable.
En una realización, la invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) o (II) en la que R1 y R2 son independientemente un grupo -CO-NH-Y en el que Y, opcionalmente el mismo resto para R1 y R2, se selecciona de un grupo alquilo lineal o ramificado, cicloalquilo y heterociclilo, sustituidos con de dos a cinco grupos hidroxilo.
En una realización preferida, la invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) o (II) en la que n es 3, R3 es alquilo sustituido con -SO3H, y R1 y R2 pueden ser iguales o diferentes y se seleccionan del grupo que consiste en
Más preferiblemente n es 3, R3 es alquilo sustituido con -SO3H, y R1 y R2 son iguales.
En otra realización de la invención, m es 0, y el espaciador (S) está representado por un enlace directo, o m es 1, y el espaciador es un resto hidrófilo que comprende grupos alquilo, cicloalquilo o arilo.
Preferiblemente, el espaciador se selecciona de -NH(CH2)pCOO-, -NH(CH2CH2O)pCH2CH2COO- y -NH(CH2CH2O)pCH2CH2NH-, en el que p es un número entero entre 0 y 20. Preferiblemente, p es 2, 6 o 12.
En una realización adicional, T es un resto dianizador seleccionado de una molécula pequeña, una proteína, un péptido, un peptidomimético, un sustrato enzimático, un anticuerpo o cualquier fragmento del mismo, y un aptámero.
Preferiblemente T está representado por un péptido, y en particular por un resto que interactúa con un receptor de integrina, tal como el receptor av03, av05, av06, a501 y similares, preferiblemente con el receptor av03 de integrina. En otra realización preferida, la invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) o (II) en la que n es 3, R3 es alquilo de C4 sustituido con -SO3H, y tanto R1 como R2 son un grupo (iv) como se define anteriormente, representado de otro modo por la siguiente fórmula (Ia) o (IIa) respectivamente:
en la que R4, R5, R5', S, m y T son como se definen anteriormente.
En otra realización, la invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) o (II) en la que n es 1 o 2. Se prefieren especialmente los compuestos de fórmula (I) o (II) enumerados en las Tablas Ia y Ib.
Tabla la -Compuestos preferidos de la formula(!)
La presente invención también se refiere a métodos para sintetizar los compuestos de fórmula (I) y (II) preparados como se ilustra en lo siguiente de la descripción. Los compuestos de la invención son útiles como agentes de formación de imágenes en la detección de tumores tanto en seres humanos como en animales. Por consiguiente, la invención proporciona los compuestos de fórmula (I) como se definen anteriormente, para uso como sondas fluorescentes para la detección y demarcación de un margen tumoral en cirugía guiada de un paciente individual, en particular en la que dicho tumor es un tumor que muestra una sobreexpresión reducida o variable de receptores de integrinas. Preferiblemente, el sujeto fotografiado es un ser humano.
La invención también proporciona un compuesto de fórmula (I) para uso como sonda fluorescente como se define anteriormente, en la que la detección y demarcación del margen tumoral se lleva a cabo bajo radiación NIR.
Un aspecto adicional de esta invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un conjugado de fórmula (I) o un tinte de fórmula (II) como se define anteriormente, o una sal del mismo, y uno o más adyuvantes, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
Otro aspecto de esta invención se refiere a un kit de diagnóstico que comprende un conjugado de fórmula (I) como se define anteriormente. Además, el kit puede contener adyuvantes adicionales para implementar la formación de imágenes ópticas. Estos adyuvantes son, por ejemplo, amortiguadores, recipientes, reactivos de detección, o instrucciones de uso adecuados. El kit contiene preferiblemente todos los materiales para la administración intravenosa de los compuestos de la invención.
Los compuestos de la invención se pueden administrar sistémica o localmente al órgano o tejido del que se van a obtener imágenes, antes del procedimiento de obtención de imágenes. Por ejemplo, los compuestos se pueden administrar por vía intravenosa. En otra realización, pueden administrarse por vía parenteral o enteral. Las composiciones se administran en dosis eficaces para lograr la imagen óptica deseada de un tumor, tejido u órgano, que puede variar ampliamente, dependiendo del compuesto usado, el tejido sometido al procedimiento de obtención de imágenes, el equipo de obtención de imágenes que se usa, y similares. La concentración exacta de los agentes de formación de imágenes depende de las condiciones experimentales y de los resultados deseados, pero normalmente puede oscilar entre 0,000001 mM y 0,1 mM. La concentración óptima se determina mediante variación sistemática hasta que se obtengan resultados satisfactorios con una fluorescencia de fondo mínima. Una vez administrados, los agentes de formación de imágenes de la invención se exponen a una luz, u otra forma de energía, que puede atravesar una capa de tejido. Preferiblemente, la longitud de onda o banda de ondas de radiación coincide con la longitud de onda o banda de ondas de excitación del agente fotosensibilizante, y tiene una baja absorción por parte de las células no dianas y del resto del sujeto, incluidas las proteínas sanguíneas. Normalmente, la señal óptica es detectable mediante observación o instrumentalmente, y su respuesta está relacionada con la fluorescencia o intensidad de la luz, su distribución y su vida útil.
DESCRIPCIÓN DE LAS SÍNTESIS
La preparación de los compuestos de fórmula (I) o (II), como tales o en forma de sales fisiológicamente aceptables, representa otro objeto de la invención. Los tintes de cianina y los conjugados de tintes de la invención se pueden preparar, por ejemplo, según los métodos descritos en las siguientes secciones y en la parte experimental. Puede encontrarse una enseñanza general sobre la preparación de tintes de cianina en Mujumdar R.B. et al., Bioconjugate Chem. 1993, 4(2), 105-111, que se refiere a la síntesis y el marcaje de tintes de sulfoindocianina. Sin embargo, las cianinas de la presente invención se caracterizan por un patrón de funcionalización específico que no está presente en los compuestos de la técnica, para lo cual se requirió el establecimiento de un enfoque sintético adecuado. De hecho, a diferencia de otras cianinas conocidas, los compuestos de la invención llevan incluso tres restos funcionales (grupos ácido carboxílico o amino/amida) que pueden derivatizarse de diferentes maneras, de modo que fue necesario el uso de grupos protectores en la mayoría de los casos para dirigir las reacciones sobre el grupo funcional deseado.
Se sabe que pueden surgir dificultades al manipular las cianinas en las fuertes condiciones de pH y temperatura necesarias para la eliminación de los grupos protectores, ya que la estabilidad del esqueleto de polimetino puede verse comprometida en algunos casos, con una degradación severa de los tintes.
Además, se pueden encontrar obstáculos adicionales debido a una posible hidrólisis y degradación de los grupos amida R1 y R2 al desproteger el grupo carboxílico de R5 (normalmente, los derivados de amida pueden hidrolizarse en un medio alcalino concentrado, véase por ejemplo Yamana et al, Chem. Pharm. Bull., 1972, 20(5), 881-891). Al contrario de lo que se esperaba, se ha encontrado que los compuestos de la invención son muy estables a pH básico (es decir, a alrededor de pH 11), y se ha observado una degradación nula o insignificante durante la eliminación de los grupos protectores.
En una realización preferida, el grupo protector del resto R5' es un grupo éster.
Más preferiblemente, se puede usar ventajosamente un grupo éster etílico.
Preparación de tintes de cianina de fórmula (II)
Según la invención, los compuestos de fórmula (II) se pueden preparar mediante un procedimiento sintético general como se da a conocer en el siguiente Esquema 1, para las realizaciones en las que R1 es el mismo que R2, o en el Esquema 2, para las realizaciones en las que R1 y R2 tienen un significado diferente.
Esquema 1
En el Esquema 1 anterior, R1, R2, R3, R4 y n son como se definen anteriormente, R5" es -COOPg o -CONHPg, en el que Pg es un grupo protector, R5m es -COOH o -CONH2, y X es un grupo saliente adecuado tal como halógeno, mesilato o triflato.
Por consiguiente, un procedimiento de la presente invención comprende las siguientes etapas:
a) tratar una cantidad de 5-carboxi-2,3,3-trimetilindolenina(III)con un nucleófilo R3-X(IV),en el que R3 es como se define anteriormente y X es un grupo saliente adecuado, tal como un grupo haluro, o R3-X representa una molécula de alcanosultona C1-C6, obteniendo así el intermedio(VI);
b) tratar otra cantidad de 5-carboxi-2,3,3-trimetilindolenina(III)con un nucleófilo R5"-R4-X(V),en el que R5" y R4 son como se definen anteriormente y X es un grupo saliente adecuado tal como un grupo haluro, obteniendo así el intermedio(VII);
c) hacer reaccionar el intermedio(VI)y el intermedio(VII)junto con el reactivo(VIII),para obtener el esqueleto de cianina(IX),en el que n, R3, R4 y R5" son como se definen anteriormente;
d) derivatizar los grupos ácido carboxílico de los anillos indolénicos con una amina polihidroxilada, tal como por ejemplo glucamina, meglumina, glucosamina, trometamol, serinol o isoserinol;
e) opcionalmente, eliminar cualquier grupo protector del intermedio(X)resultante, y aislar el compuesto de fórmula (II) o su sal.
Según las etapas a) y b), la reacción del derivado (III) con un nucleófilo R3-X (IV) o R5"-R4-X (V) se puede llevar a cabo pura o en disolventes de alto punto de ebullición, tales como butirronitrilo, sulfolano, 1,2-diclorobenceno, dimetilacetamida, dimetilformamida o dimetilsulfóxido, agitando la disolución a alta temperatura, por ejemplo entre 90°C y 180°C, durante varias horas, típicamente de 12 horas a 5 días.
Según la etapa c), la reacción se puede llevar a cabo usando el reactivo de Vilsmeier en forma de bis anilido (como se indica en el Esquema 1) o en forma de bis aldehido. La reacción se puede llevar a cabo en varios disolventes, tales como por ejemplo etanol, metanol, anhídrido acético o ácido acético, con o sin adición de diferentes bases, tales como trimetilamina, piridina, acetato de sodio, acetato de potasio, etc., agitando la mezcla a diferentes temperaturas que oscilan de 45°C a 120°C durante varias horas (normalmente 2-24 horas).
Según la etapa d), la reacción se puede llevar a cabo usando varios agentes de acoplamiento, tales como TBTU, HBTU, HATU, PyBOP, DCC, DSC, DCC-NHS, y varias bases orgánicas, tales como TEA, DIPEA, NMM, piridina, etc., en disolventes tales como dimetilformamida, dimetilacetamida, dimetilsulfóxido, acetonitrilo, etc., a temperatura ambiente durante un tiempo adecuado que oscila de 30 minutos hasta varias horas.
Según la etapa opcional e), cualquier grupo protector del intermedio (X) se elimina del resto R5" según los procedimientos conocidos, descritos, por ejemplo, en T.W. Green and P.G.M.Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, N.Y. 2007, 4a Ed., Cap. 5.
Alternativamente, como se menciona anteriormente, cuando R1 es diferente de R2, un compuesto de fórmula (II) se puede preparar como se ilustra en el siguiente Esquema 2:
Esquema 2
en el que R1, R2, R3, R4 y n son como se definen anteriormente, R5" es -COOPg o -CONHPg, en el que Pg es un grupo protector, R5m es -COOH o -CONH2, y X es un grupo saliente adecuado tal como halógeno, mesilato o triflato. Según el Esquema 2, una amina polihidroxilada se hace reaccionar en la etapa b') con un intermedio (VII) para formar el intermedio (XI), que porta el residuo -R2, antes de llevar a cabo la reacción de Vilsmeier de la etapa c) para formar la cianina (IX). El otro residuo diferente -R1 se puede añadir después en el segundo anillo de indolenina.
Alternativamente, el grupo -R1 también puede introducirse en el intermedio (VI), en una etapa a') correspondiente, antes de llevar a cabo la etapa c).
Por consiguiente, la etapa b'), y/o opcionalmente a'), se lleva a cabo como se describió anteriormente para la etapa d).
En una realización adicional, un compuesto de fórmula (II), preparado según los procedimientos de la invención, se puede convertir convenientemente en otro compuesto de fórmula (II) operando según condiciones sintéticas bien conocidas, siendo los siguientes ejemplos de posibles conversiones:
f) convertir un compuesto de fórmula (II) en la que R5'" es -COOH, es decir, un compuesto de fórmula (IIb), en un compuesto correspondiente de fórmula (II) en la que R5" es -CONH2, es decir, un compuesto de fórmula (IIc):
Según la etapa f), la conversión de un ácido carboxílico de fórmula (IIb) en la correspondiente carboxamida de fórmula (IIc) se puede lograr de diversas formas y condiciones experimentales, que son ampliamente conocidas en la técnica para la preparación de carboxamidas. Como ejemplo, el ácido carboxílico puede convertirse primero en un éster activado adecuado, y luego hacerse reaccionar con una sal de amonio, tal como NH4Cl, preferiblemente en presencia de un agente de acoplamiento, tal como HBTU.
Preparación de compuestos conjugados de fórmula (I)
Los derivados de cianina de fórmula (II), o sus sales, se pueden conjugar entonces con un resto dianizador adecuado, opcionalmente con la inserción de un espaciador, para obtener los compuestos de fórmula (I) correspondientes, como se da a conocer en el Esquema 3:
Esquema 3
La conjugación se puede lograr siguiendo diferentes procedimientos conocidos en la técnica, tal como por ejemplo mediante acoplamiento directo, en el que el grupo funcional R5" se hace reaccionar directamente con un residuo nucleofílico del resto dianizador, u opcionalmente con el espaciador, o mediante activación previa. en el que el grupo funcional de R5", normalmente un ácido, se transforma en un grupo más reactivo, por ejemplo un éster tal como NHS, antes del acoplamiento.
Si un compuesto de fórmula (I) o (II) preparado según los procedimientos descritos anteriormente se obtiene como mezcla de isómeros, su separación usando técnicas convencionales en el único isómero correspondiente de fórmula (I) o (II) está dentro del alcance de la presente invención.
Los compuestos finales se pueden aislar y purificar usando procedimientos convencionales, por ejemplo cromatografía y/o cristalización y formación de sales.
Un compuesto de fórmula (I) o (II) como se define anteriormente se puede convertir en una sal farmacéuticamente aceptable. Los compuestos de fórmula (I) o (II) como se definen anteriormente, o la sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, pueden formularse posteriormente con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable para proporcionar una composición farmacéutica.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 representa la disminución de la señal de fluorescencia en el tejido muscular sano después de la administración intravenosa de tres dosis (0,3 nmol/ratón, círculos; 1 nmol/ratón, cuadrados; 3 nmol/ratón, triángulos) del compuesto 1 en ratones Balb/c nu/nu (n=5/grupo).
La Figura 2 representa la disminución de la fluorescencia (eje y izquierdo) en el tumor (círculos negros) y el tejido muscular (círculos blancos) después de la administración iv de 1 nmol del compuesto 1 en ratones Balb/c nu/nu a los que se les implantaron 10 millones de células U87MG, y la relación tumor-fondo (cuadrados, eje y derecho) a lo largo del tiempo.
La Figura 3 muestra la relación tumor-fondo (TBR) del compuesto 1 administrado a una dosis de 3 nmol/ratón en ratones Balb/c nu/nu a los que se les implantaron 2,5 millones de células Detroit-562 (n=5).
La Figura 4 representa la disminución de la fluorescencia (eje y izquierdo) en el tumor (círculos negros) y el tejido muscular (círculos blancos) después de la administración de 1 nmol del compuesto 1 en ratones atímicos a los que se les implantaron 5 millones de células HT-29 (n= 5), y la relación tumor-fondo (cuadrados, eje y derecho) a lo largo del tiempo.
Todos los datos se expresan como media ± desviación estándar.
PARTE EXPERIMENTAL
La invención y sus realizaciones particulares descritas en la siguiente parte son sólo ejemplares, y no deben considerarse como una limitación de la presente invención: muestran cómo se puede llevar a cabo la presente invención, y pretenden ser ilustrativos sin limitar el alcance de la invención.
Materiales y equipo
Todos los productos químicos y disolventes usados para las reacciones fueron de grado reactivo. Se usaron disolventes de calidad analítica para las purificaciones cromatográficas. La mayoría de los reactivos, a menos que se indique lo contrario, son productos comerciales, incluidos los restos dianizadores (por ejemplo, Panitumumab (Vectibix, Amgen; Número de Registro CAS del principio activo: 339177-26-3); Cetuximab (Erbitux, Merck; Número de Registro CAS del principio activo: 205923-56-4)).
Todos los compuestos sintetizados se purificaron mediante cromatografía de fase inversa (RP-HPLC), y se caracterizaron mediante espectroscopia de masas usando un instrumento LC/MS equipado con un detector UV-VIS y una fuente ESI.
Los análisis se realizaron con una columna Waters Atlantis dC18 de 5 ^m, 4,6 x 150 mm usando un gradiente de fase A CH3COONH410 mM y fase B acetonitrilo. Las relaciones masa/carga medidas se enumeran para cada compuesto. Se usó un espectrofotómetro UV-VIS de doble haz (Lambda 40, Perkin Elmer) para determinar la absorbancia (Abs) de los compuestos de la invención. Los espectros de emisión/excitación (Em/Ex) y las medidas del rendimiento cuántico de fluorescencia absoluto (9) se llevaron a cabo en un espectrofluorómetro (FluoroLog-3 1IHR-320, Horiba Jobin Yvon) equipado con un accesorio de esfera integradora F-3018. Las medidas se realizaron usando una longitud de onda de excitación a máxima absorbancia de diferentes tintes, y la muestra se excitó con una fuente de luz de xenón de 450 W. La detección se realizó mediante un detector enfriado con tubos fotomultiplicadores (PMT-NIR) o mediante un detector TBX-04. Las disoluciones de tinte se prepararon cuidadosamente para que tuvieran una absorbancia menor que 0,1 (densidades ópticas), para minimizar los fenómenos de reabsorción.
Los experimentos de formación de imágenes in vivo se realizaron usando el sistema de formación de imágenes in vivo IVIS Spectrum (Perkin Elmer Inc.). El sistema está equipado con 10 filtros de excitación de banda estrecha (ancho de banda de 30 nm) y 18 filtros de emisión de banda estrecha (ancho de banda de 20 nm) que abarcan 430 - 850 nm.Lista de abreviaturas
DCC N,N'-diciclohexilcarbodiimida
DIPEA N,N-Diisopropiletilamina
DMF Dimetilformamida
DMSO Dimetilsulfóxido
DSC Carbonato de N,N'-disuccinimidilo
HATU Hexafluorofosfato de 3-óxido de 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio
HBTU Hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio
HPLC Cromatografía de líquidos de alta resolución
PBS Disolución salina amortiguada con fosfato
NHS N-hidroxisuccinimida
NMM N-metilmorfolina
RT Temperatura ambiente
PyBOP Hexafluorofosfato de (benzot ri azol-1 -iloxi)tripi rrolid inofosfonio
TEA Trietilamina
TBTU Tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
TSTU Tetrafluoroborato de O-(N-succinimidil)-1,1,3,3-tetrametiluronio
μl Microlitro
μM Micromolar
tR Tiempo de retención (HPLC)
cRGDfK Ciclo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)
aza-cRGD-NH2Aza-ciclo-(Arg-Gly-Asp)
Las abreviaturas de residuos de aminoácidos individuales son convencionales: por ejemplo, Asp o D es ácido aspártico, Gly o G es glicina, Arg o R es arginina. Debe entenderse que los aminoácidos aquí mencionados tienen la configuración del isómero L, a menos que se indique lo contrario.
Ejemplo 1: Síntesis del Compuesto 4
Preparación del intermedio(Via), Etapa a
En un matraz de fondo redondo, se añadieron 5-carboxi-2,3,3-trimetilindolenina (1,50 g, 7,38 mmol), 2,4-butanosulfona (1,11 g, 8,15 mmol) y butironitrilo (2 g). La mezcla se calentó a 120°C durante 2 días. El sólido se trató después con acetona seca, se filtró a vacío, y se lavó dos veces con acetona. El sólido rosa se secó a vacío, y se usó sin purificación adicional (2,40 g, 96%). Pureza por HPLC a 270 nm 94%, MS: [M H]+ 339,2.
Preparación del intermedio(Viia), Etapa b
En un matraz de fondo redondo, se añadieron intermedio III (1,5 g, 7,38 mmol), 6-bromohexanoato de etilo (1,97 g, 8,85 mmol) y sulfolano (6,8 g). La suspensión se calentó a 90°C durante 3 días. Entonces, se añadió acetato de etilo (25 ml), la dispersión púrpura se agitó a RT durante 15 minutos, y se filtró a vacío. El sólido se lavó con acetato de etilo tres veces, después se redispersó en acetato de etilo nuevo (15 ml), se agitó a RT durante 15 minutos, se filtró a vacío, y se lavó con acetato de etilo. Esta operación se repitió otras dos veces. Finalmente, el sólido rosa/violeta, que contenía tanto el producto deseado como el material de partida, se secó a vacío. Después, se dispersó en acetonitrilo (4 ml), la dispersión densa se agitó a RT durante 15 minutos, y se filtró. El sólido se lavó con un pequeño volumen de acetonitrilo frío. Las aguas madres contenían predominantemente el producto deseado, mientras que el sólido contenía el material de partida. El acetonitrilo se evaporó a vacío, y el sólido se dispersó nuevamente en acetonitrilo (4 ml), se agitó durante 15 minutos, se filtró, y el sólido se lavó con acetonitrilo frío. La disolución se concentró a vacío, obteniendo un sólido rosa/violeta con una pureza por HPLC del 92% a 270 nm (1,25 g como sal de bromo, 40%). MS:
[M H]+ 346,5.
Preparación del intermedio(iXa), Etapa c
En un matraz de fondo redondo, se añadieron hidrocloruro de glutaconaldehído dianilo (0,48 g, 1,4 mmol), anhídrido acético (47 ml) y ácido acético (13 ml). La disolución de color marrón anaranjado se calentó a 60°C durante 3 h. Después, la mezcla de reacción se enfrió a RT, y la disolución del intermedio (Via) (0,60 g, 1,4 mmol) en etanol (10 ml) se añadió gota a gota a RT en alrededor de 20 minutos. La disolución roja se calentó a 35°C durante 2 h, después se aumentó la temperatura a 50°C, y se añadió una disolución del intermedio (Viia) (0,48 g, 1,4 mmol) y acetato de sodio (0,11 g, 1,3 mmol) en etanol (19 ml). Inmediatamente después, se añadió piridina (2,0 ml). La mezcla de reacción se calentó a 60°C durante 1,5 h, entonces los disolventes se evaporaron a vacío, y el aceite oscuro se precipitó en agua fría (100 ml). El sólido verde oscuro se filtró y se lavó con agua fría. Entonces, se disolvió en una cantidad mínima de etanol, y esta disolución se vertió con agitación en acetato de etilo (400 ml). El sólido se filtró, se lavó con acetato de etilo, se disolvió en diclorometano, y se purificó sobre gel de sílice con un gradiente lento de diclorometano-metanol. Las fracciones que contenían el producto puro se combinaron, se evaporaron a vacío, y se secaron, obteniendo un sólido verde azulado (350 mg, 33% de rendimiento). Pureza por HPLC a 756 nm 94%, MS: [M H]+ 747,3.
Síntesis del Compuesto 4, Etapas J y e
En un matraz de fondo redondo seco, se añadió DIPEA seca (115 gl, 0,56 mmol) a una disolución del intermedio (IXa) (150 mg, 70% de pureza, 0,14 mmol) en DMF (2 ml). Después de 30 minutos de agitación bajo caudal de nitrógeno, se añadió una disolución de TBTU (309 mg, 0,67 mmol) en DMF (2 ml). Tras 1 h, se añadió una suspensión de D-glucamina (87 mg, 0,336 mmol) en DMF (2 ml). La mezcla se agitó durante 2 h a RT, entonces se concentró y se purificó en una columna de sílice C18 precargada con un gradiente de agua-acetonitrilo. Las fracciones que contenían el producto puro se recogieron, se concentraron, y se liofilizaron, obteniendo un polvo verde azulado (95,8 mg, 64% de rendimiento). Pureza por HμLC a 756 nm 97%, MS: [M Na]+ 1095,3.
El intermedio (Xa) así obtenido (95 mg, 0,089 mmol) se solubilizó en agua (10 ml, pH 6,35), después se añadió NaOH 2 N hasta pH 11,14. La disolución se agitó a temperatura ambiente, manteniendo el pH 11 mediante adición de NaOH 0,1 N. Tras 40 h, la reacción se completó, la mezcla se neutralizó con HCl 1 N, y se purificó en una columna de sílice C18 precargada con un gradiente de agua-acetonitrilo. Las fracciones que contenían el producto puro se recogieron, se concentraron, y se liofilizaron, obteniendo un polvo verde azulado (81 mg, 86% de rendimiento). Pureza por HPLC a 756 nm 98%, MS: [M H]+ 1045,3.
Ejemplo 2: Síntesis del compuesto 5
Etapa f
En un matraz de fondo redondo seco, se añadió N-metilmorfolina (10 gl, 0,091 mmol) a una disolución del Compuesto 4 preparado como en el ejemplo 1 (10 mg, 0,0096 mmol) en DMF seca (1 ml). Después de 30 minutos de agitación bajo caudal de nitrógeno, se añadió una disolución de HBTU (13 mg, 0,03 mmol) en DMF (1 ml). Tras 1 h, se añadió una suspensión de NH4Cl (10 mg, 0,19 mmol) en DMF (1 ml). La mezcla se mantuvo en agitación durante 2 días, después se secó a vacío, y se purificó en una columna de sílice C18 precargada con un gradiente de agua-acetonitrilo. Las fracciones que contenían el producto puro se combinaron, se concentraron y se liofilizaron, obteniendo un sólido azul (2,56 mg, 20% de rendimiento). Pureza por HPLC a 756 nm 97,5%, MS: [M H]+ 1043,1.
Ejemplo 3: Síntesis del compuesto 7
Preparación del intermedio Xb, Etapa J
El intermedio IXb se preparó según el procedimiento del Ejemplo 1, pero usando el reactivo hidrocloruro de malonaldehído dianilida para la etapa c). El intermedio IXb (58 mg, 0,081 mmol) se suspendió en DMF seca (10 ml). Se añadieron trometamol (23,5 mg, 0,194 mmol), DIPEA (61 gl, 0,352 mmol) y HATU (73,77 mg, 0,194 mmol). La reacción se agitó en atmósfera inerte a RT durante 2 horas. El disolvente se destiló a presión reducida, y el bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en una columna de sílice C18 precargada con un gradiente de agua/metanol. Las fracciones que contenían el producto puro se combinaron, se destilaron a vacío y se liofilizaron, dando un sólido azul brillante (60 mg, 80% de rendimiento). Pureza por HPLC a 655 nm: 99,6%. MS: [M H]+ 927,3.
Síntesis del compuesto 7, Etapa e
El intermedio Xb (110 mg, 0,106 mmol) se disolvió en etanol (2 ml), y se añadió agua (18 ml). La disolución se calentó a 40°C, y el pH se mantuvo en 11 con NaOH 0,1 N, hasta que se completó la hidrólisis (aprox. 6 horas). El pH se llevó hasta 7 con HCl 0,1 N, y el bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en una columna de sílice C18 precargada con un gradiente de agua/metanol. Las fracciones que contenían el producto puro se combinaron, se destilaron a vacío y se liofilizaron, dando un sólido azul brillante (18,7 mg, 19% de rendimiento). Pureza por HPLC a 655 nm: 95,7%. MS: [M H]+ 899,3.
Ejemplo 4: Síntesis del compuesto 8
Los intermedios VIc y VIIc se prepararon según el procedimiento descrito anteriormente para los intermedios Via y VlIa. De manera análoga al Ejemplo 1, se trataron con el reactivo correspondiente N,N-difenilformamidina para obtener el intermedio de trimetino IXc.
Preparación del intermedio Xc, Etapa J
El intermedio IXc (62 mg, 0,089 mmol) se suspendió en DMF seca (15 ml). Se añadieron D-glucamina (33,9 mg, 0,187 mmol), DIPEA (62 gl, 0,356 mmol) y HATU (71,10 mg, 0,187 mmol), y la reacción se agitó en atmósfera inerte a RT durante 4 horas. El disolvente se destiló a presión reducida, y el bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en una columna de sílice C18 precargada con un gradiente de agua/acetonitrilo. Las fracciones que contenían el producto puro se combinaron, se destilaron a vacío y se liofilizaron, dando un sólido rosa brillante (82,4 mg, 91% de rendimiento). Pureza por HPLC a 560 nm: 99,8%. MS: [M H]+ 1021,3.
Síntesis del compuesto 8, Etapa e
El intermedio Xc (81,4 mg, 0,08 mmol) se disolvió en etanol (2 ml), y se añadió agua (18 ml). La disolución se agitó a RT, y el pH se mantuvo en 11 con NaOH 0,1N, hasta que se completó la hidrólisis (aprox. 46 horas). Después, el pH se ajustó hasta 7 con HCl 0,1N, y el bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna de sílice C18 preempaquetada, con un gradiente de agua/acetonitrilo. Las fracciones que contenían el producto puro se combinaron, se destilaron a vacío y se liofilizaron, dando un sólido rosa brillante (79 mg, 99,4% de rendimiento). Pureza por HPLC a 560 nm: 100%. MS: [M H]+ 993,3.
Ejemplo 5: Síntesis del compuesto 1
El Compuesto 1 se sintetizó mediante conjugación del tinte correspondiente al Compuesto 4 y el pentapéptido cíclico c-RGDfK, en el que la conjugación se llevó a cabo mediante dos procedimientos alternativos A o B. El Compuesto 4 se preparó como se describe en el Ejemplo 1. El péptido c-RGDfK, que representa el resto dianizador, es un reactivo comercial.
Procedimiento A-Etapa de conjugación mediante acoplamiento directo
En un matraz de fondo redondo seco, se añadió N-metilmorfolina (10 μl, 0,09 mmol) a una disolución del Compuesto 4, preparado como se describe en el Ejemplo 1, (10 mg, 0,009 mmol) en DMF seca (1 ml). Después de 30 minutos de agitación bajo caudal de nitrógeno, se añadió una disolución de TBTU (6 mg, 0,02 mmol) en DMF (1 ml). Después de 1 hora, se añade una disolución de c(RGD)fK (6 mg, 0,009 mmol) en DMF (1 ml). La mezcla se agitó a RT durante 20 horas, después se añadieron más TBTU (4 mg) y N-metilmorfolina (2 μl), y después de 2 horas se añadió c(RGD)fK (2 mg). La mezcla se agitó durante 6 h más, entonces se concentró, y el bruto se purificó mediante HPLC analítica en una columna de sílice C18 con un gradiente de acetato de amonio-acetonitrilo al 0,1 %. Las fracciones que contenían el producto puro se recogieron, se concentraron y se liofilizaron tres veces, para dar un sólido azul (4,4 mg, 29% de rendimiento). Pureza por HPLC a 756 nm 99%, MS: [M/2]+ 841,0.
Procedimiento B-Etapa de conjugación mediante activación previa con éster de NHS
El Compuesto 4, preparado como se describe en el Ejemplo 1, (4 mg, 0,0038 mmol), se suspendió en DMF seca (3 ml) bajo un caudal de nitrógeno. Se añadieron N-metilmorfolina (0,8 μl, 0,0076 mmol) y TSTU (2,3 mg, 0,0076 mmol), y la disolución se agitó a RT durante 20 h. El producto deseado se precipitó mediante adición de éter dietílico frío, se centrifugó, y se lavó dos veces con éter dietílico.
El sólido se disolvió en una disolución de c(RGD)fK (3,0 mg, 0,0042 mmol) en amortiguador de borato a pH 9 (2 ml). La disolución se agitó durante la noche, después el pH se ajustó hasta 6 con HCl 1N, y el bruto se purificó mediante HPLC analítica en una columna de sílice C18 con un gradiente de acetato de amonio al 0,1%/acetonitrilo. Las fracciones que contenían el producto puro se recogieron, se concentraron y se liofilizaron tres veces, para dar un sólido azul (5,2 mg, 83% de rendimiento). Pureza por HPLC a 756 nm 99%, MS: [M/2]+841,0.
Ejemplo 6: Síntesis del compuesto 3
En un matraz de fondo redondo seco, se añadió N-metilmorfolina (10 μl, 0,09 mmol) a una disolución del Compuesto 4 preparado como se describe en el Ejemplo 1 (10 mg, 0,009 mmol) en DMF seca (1 ml). Después de 15 minutos de agitación bajo caudal de nitrógeno, se añadió una disolución de HBTU (3,6 mg, 0,01 mmol) en DMF (1 ml). Después de 30 minutos, se añadió una disolución de aza-cRGD-NH2(5,7 mg, 0,01 mmol) en DMF (1 ml). La mezcla se agitó durante 2 días, entonces se concentró a vacío y se purificó mediante HPLC analítica en una columna de sílice C18 con un gradiente de acetato de amonio al 0,1%/acetonitrilo. Las fracciones que contenían el producto puro se recogieron, se concentraron y se liofilizaron tres veces, para dar un polvo azul (3,57 mg, 21% de rendimiento). Pureza por HPLC a 756 nm 99%, MS: [M/2]+ 780,8.
Ejemplo 7: Síntesis del compuesto 9
El anticuerpo monoclonal anti-EGFR Panitumumab (6 mg) se diluyó hasta 5 mg/ml en PBS, y el pH se ajustó añadiendo 120 μl de fosfato potásico 1,0 M, pH 9. Se disolvió éster de NHS del Compuesto 4 (preparado como se describe en el Ejemplo 5, Procedimiento B) en DMSO a una concentración de 10 mg/ml; después, el tinte y el anticuerpo se mezclaron inmediatamente en una relación molar de 2,5:1, y se mantuvieron a temperatura ambiente en la oscuridad durante 3 h. Después de 3 h, la mezcla de reacción de conjugación se colocó en capas sobre columnas Zeba Spin equilibradas con disolución salina amortiguada con fosfato (PBS), y se centrifugó a 1500 g durante 2 minutos para separar el conjugado del tinte libre. Después de la filtración a través de una membrana de polietersulfona (PES) de 0,22 μm, la disolución de Panitumumab conjugado en PBS a pH 7,4 se analizó mediante espectrofotometría SE-HPLC, RP-HPLC y UV/VIS para determinar la concentración y la pureza. La relación molar de conjugación (moléculas de tintes acopladas por anticuerpo) fue alrededor de 1,3.
Ejemplo 8: Síntesis del compuesto 10
El anticuerpo monoclonal anti-EGFR Cetuximab (5 mg/ml) se dializó contra PBS en una membrana de MWCO de 10 K Da. Se añadieron 10 mg de MAb dializado (4,52 mg/ml, 68,8 nmol) a 221 μl de amortiguador de fosfato 1 M, pH 9. El éster de NHS del Compuesto 4 (preparado como se describe en el Ejemplo 5, Procedimiento B) se disolvió en DMSO a una concentración de 6,86 mM. Se añadieron 43,3 μl de tinte a la disolución de Cetuximab (relación molar 4,3:1), y se mantuvieron a temperatura ambiente en la oscuridad durante 3 h. Después de este tiempo, la mezcla de reacción de conjugación se colocó en capas sobre una columna Zeba Spin equilibrada con disolución salina amortiguada con fosfato (PBS), y se centrifugó a 1000 g durante 2 minutos para separar el conjugado del tinte libre. Después de la filtración a través de una membrana de polietersulfona (PES) de 0,22 μm, la disolución de Cetuximab conjugado en PBS a pH 7,4 se analizó mediante espectrofotometría SE-HPLC, RP-HPLC y UV/VIS para determinar la concentración y la pureza. La relación molar de conjugación (moléculas de tintes acopladas por anticuerpo) fue alrededor de 1,1.
Ejemplo 9: Síntesis del compuesto 11
La molécula pequeña ligando 4a de CAIX, descrita en Wichert et al., Nat Chem 2015, 7, 241-249, se preparó según el procedimiento allí descrito, y se conjugó con el compuesto 4. Se disolvieron 11 mg del compuesto 4 (10,0 pmol) en 1 ml de DMF, después se añadieron 5,5 mg de PyBOP (10,0 pmol) y 7 μl de DIPEA (40,0 pmol) bajo agitación continua. Después de 20 minutos, se disolvieron 9 mg de la molécula pequeña 4a (15,0 pmol) en 1 ml de DMF, y se añadieron a la mezcla de reacción, que se agitó durante 30 minutos más a temperatura ambiente. La purificación se realizó mediante HPLC preparativa con un rendimiento del 60%. El producto puro aislado se caracterizó por HPLC-UV-VIS-MS-ESI (+) usando una columna Waters Atlantis dC18 (μm, 4,6 x 150 mm). Pureza por HPLC a 758 nm: 98%; MS:
[M/2]+ 823,3.
Ejemplo 10: Síntesis del compuesto 12
La molécula pequeña ligando 8a de CAIX, descrita en Wichert et al., Nat Chem 2015, 7, 241-249, se preparó según el procedimiento allí descrito, y se conjugó con el Compuesto 4. Se disolvieron 15 mg del Compuesto 4 (14,0 pmol) en 1 ml de DMF, después se añadieron 7,3 mg de PyBOP (14,0 pmol) y 10 μl de DIPEA (57,0 pmol) con agitación continua. Después de 20 minutos, se disolvieron 22 mg de la molécula pequeña 8a (21,0 pmol) en 1 ml de DMF, y se añadieron a la mezcla de reacción, que se agitó durante 30 minutos más a RT. La purificación se realizó mediante HPLC preparativa con un rendimiento del 34%. El producto puro aislado se caracterizó por HPLC-UV-VIS-MS-ESI (+) usando una columna Waters Atlantis dC18 (μm, 4,6 x 150 mm).
Pureza por HPLC a 758 nm: 95%; MS: [M/2]+ 1051,8.
Ejemplo 11: Estabilidad del intermedio (Xa)
La estabilidad del intermedio (Xa), preparado como se describe en el Ejemplo 1 etapa d), se ha evaluado en diferentes condiciones para realizar la hidrólisis del éster etílico en las condiciones óptimas. De hecho, se sabe que este tipo de cianinas no son considerablemente estables en medios ácidos y básicos. A diferencia de otros análogos que portan grupos polisulfonilo, tal como por ejemplo el compuesto DA364 descrito en el documento WO2018/189136, que es más estable en condiciones ácidas, el intermedio (Xa) mostró inesperadamente una estabilidad notable cuando se lleva a cabo la hidrólisis en condiciones fuertes, tales como a pH 11 y 45°C durante varias horas, sin degradación de los grupos R1 y R2.
Sorprendentemente, también se obtuvieron buenos resultados realizando la hidrólisis con extractos enzimáticos de hígado de porcino y de conejo, trabajando a 1 mg/ml, pH 8 y 38°C en amortiguador de PBS. La conversión completa se obtuvo sólo después de 20-24 horas, sin ninguna degradación.
Ejemplo 12: Propiedades ópticas
Los compuestos de la invención se han caracterizado en términos de sus propiedades ópticasin vitroen medio acuoso (es decir, agua/PBS pH 7,4) y en un suero de control de química clínica (Seronorm, Sero SA), que imita la composición química y propiedades ópticas del suero humano. Todas las disoluciones de tinte o conjugado de tinte estaban recién preparadas.
En particular, los máximos de excitación y emisión y el rendimiento cuántico de fluorescencia absoluto (O) de compuestos representativos de fórmula (I) y tintes correspondientes de fórmula (II) se muestran en la Tabla II en comparación con el tinte de heptametino bisulfonado comercial Verde de Indocianina (ICG, Sigma), tinte de pentametino bisulfonado sulfo-Cy5 (Lumiprobe) y tinte de trimetino bisulfonado sulfo-Cy3 (Lumiprobe).
Tabla II-Máximos de excitación/emisión y rendimientos cuánticos de fluorescencia absolutos de compuestos de fórmula(I)(compuestos 1 y 3) y(II)(compuestos 4, 6, 7, 8)
Los compuestos de la invención se caracterizan por máximos de absorción comprendidos en el intervalo de alrededor de 550 nm a 760 nm. Los rendimientos cuánticos de fluorescencia obtenidos para los compuestos de la invención fueron notablemente superiores a los del compuesto de referencia, con valores de alrededor de 1,5 a 7 veces mayores que los correspondientes compuestos de referencia con la misma longitud de cadena de polimetino. Sorprendentemente, los compuestos de la invención mostraron un mayor rendimiento cuántico en el amortiguador acuoso PBS que los compuestos de referencia con propiedades de solubilidad similares.
Ejemplo 13: Afinidad por albúmina humana
Se llevó a cabo un análisis de la afinidad de unión de los compuestos de la invención por albúmina humana, y los resultados se compararon con el Verde de Indocianina (ICG) de referencia.
La afinidad de unión por seroalbúmina humana (HSA; Sigma Aldrich, A9511) se midió usando dos métodos, según el nivel de afinidad de unión de los compuestos.
El primer método, óptimo para compuestos que interactúan fuertemente con HSA, se basa en el análisis del desplazamiento del pico del espectro de absorbancia tras la incubación del tinte en disoluciones que contienen HSA. Brevemente, las muestras se incubaron a una concentración fija (1 μM) con diluciones de HSA (1x10-6 - 4x10<-4>M), en amortiguador de fosfato durante 5 min en el espectrofotómetro a 25°C antes de las medidas. La medida se llevó a cabo a la longitud de onda de máxima absorbancia del pico desplazado.
El segundo método, óptimo para compuestos con baja afinidad por HSA, se basa en medir la variación de la absorbancia de disoluciones que contienen el tinte y diversas concentraciones de HSA después de la ultrafiltración. Brevemente, cada compuesto se incubó a una concentración fija (2 μM) con diluciones de HSA (1x10-6 - 4x10<-4>M), en amortiguador de fosfato. Las muestras se centrifugaron (10.000 g durante 30 min a 25°C) en un dispositivo Microcon (MWCO de 10 kDa, unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-0,5 con membrana Ultracel-10, Millipore), y las medidas de absorbancia de los filtrados se obtuvieron con el espectrofotómetro a la longitud de onda de máxima absorbancia del fluoróforo.
Para ambos métodos, la constante de afinidad (KA, M-1) se calculó ajustando los datos sin procesar con la siguiente fórmula:
en la que
ΔA/b = Absorbancia medida (b = 1 cm)
KRL = KA calculado mediante análisis de regresión (ajuste de curvas)
Aε • Rt calculado mediante análisis de regresión (ajuste de curvas)
[L] = Concentración de albúmina
En el primer método, ΔA/b corresponde a la absorbancia medida para cada muestra, mientras que en el segundo método, ΔA/b se obtiene restando la absorbancia de la muestra de control (tinte sin HSA) a la absorbancia de cada otra muestra.
Ambos métodos han demostrado proporcionar resultados comparables, como lo demuestran experimentos paralelos realizados con el tinte de cianina comercial IRDye 800CW carboxilato (LI-COR Inc., Lincoln, EE. U<u>.) usando el primer método (HSA KA= 215.000 M-1) y el segundo método (HSA KA= 216.000 M-1) Sin embargo, la medida de la constante de afinidad es más precisa cuando se usa el método adecuado en función del nivel de afinidad del compuesto. Los resultados de la afinidad de unión medida para compuestos representativos de la invención con uno de los dos métodos se presentan en la Tabla III, y se comparan con los resultados obtenidos para el tinte ICG clínicamente disponible y para ICG-RGD y DA364 como compuestos de referencia.
Tabla III Afinidad de unión por seroalbúmina humana(HSA)
Como se muestra en la Tabla III, los tintes y los conjugados de tintes de la invención muestran una afinidad de unión notablemente baja por la albúmina humana en comparación con el ICG disponible y con muchos otros compuestos de cianina conocidos, con constantes de afinidad de uno o dos órdenes de magnitud menores. Esta característica ventajosa se refiere tanto a los tintes de fórmula (II) (por ejemplo, Compuesto 4) como al tinte correspondiente cuando se conjuga con un resto dianizador (por ejemplo, Compuestos 1 y 3), lo que sugiere que la conjugación de los tintes con un resto dianizador no afecta la afinidad por la albúmina humana.
Más bien, los conjugados de RGD de fórmula (I), tales como los Compuestos 1 y 3 representativos, han mostrado inesperadamente una afinidad mucho menor por la albúmina humana que otros tintes conocidos en la técnica cuando se conjugan con el resto dianizador RGD, tal como ICG-RGD (HSA KA= 219.000 M-1, Capozza et al., 2018) o DA364 (HSA KA= 28.670 M-1, documento WO2016/097317), como se da a conocer en la Tabla III. Además, el compuesto de referencia DA364, cuando se analizó exactamente en las mismas condiciones experimentales de los presentes compuestos, mostró una mayor afinidad por HSA, con una constante de afinidad (KA) de 110.000 M-1.
Ejemplo 14: Afinidad de unión al receptor
Se determinó la afinidad de unión de los conjugados de fórmula (I) a un receptor específico para evaluar si la eficacia direccionadora del vector molecular se conserva después del marcaje con los tintes de la invención.
Conjugados de péptido/molécula peptidomimética
Como ejemplo de conjugados péptido/peptidomimético, la afinidad del receptor de conjugados representativos de unión a integrina se evaluó mediante el cálculo de su IC50 (la mitad de la concentración inhibidora máxima), usando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), como se informó anteriormente (Kapp et al., Sci. Rep. 2017, 7, 39805). Brevemente, se recubrieron placas de ELISA de 96 pocillos durante la noche a 4°C con la proteína de matriz extracelular (ECM) Vitronectina en amortiguador de carbonato (Na2CÜ315 mM, NaHCÜ335 mM, pH 9,6). Cada pocillo se lavó entonces con amortiguador de PBS-T (disolución salina amortiguada con fosfato/Tween20, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPÜ4, 2 mM KH2PO4, 0,01% Tween20, pH 7,4), y se bloquéo durante 1 h a<r>T con amortiguador de TS-B (amortiguador de Tris-disolución salina/BSA; 20 mM T ris-Hcl, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl2, pH 7,5, 1% de BSA). Mientras tanto, se preparó una serie de diluciones del compuesto y el patrón interno en una placa adicional. Tras lavar la placa de ensayo tres veces con PBS-T, se transfirieron 50 μl de la serie de diluciones a cada pocillo. Se transfirieron 50 μl de una disolución de integrina avp3 recombinante humana (R&D Systems, 1 μg/ml) en amortiguador de TS-B a los pocillos, y se incubaron durante 1 h. La placa se lavó tres veces con amortiguador de PBS-T, y después se añadió a la placa el anticuerpo primario anti-avp3. Después de la incubación y el lavado tres veces con PBS-T, se añadió a la placa el anticuerpo secundario anti-IgG marcado con peroxidasa, y se incubó durante 1 h. Tras lavar la placa tres veces con PBS-T, la placa se reveló mediante adición rápida de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB), y se incubó durante 5 minutos en la oscuridad. La reacción se detuvo con 3 M H2SO4, y la absorbancia se midió a 450 nm con un lector de placas (Victor3, Perkin Elmer).
La IC50 de los compuestos 1 y 3 representativos se ensayó por duplicado, y las curvas de inhibición resultantes se analizaron usando GraphPad Prism versión 4.0 para Windows (GraphPad Software). El punto de inflexión define el valor de IC50. Todos los experimentos se realizaron usando c(RGDfK) como patrón interno.
Las sondas moleculares analizadas, ya sea acopladas a c(RGDfK) (es decir, Compuesto 1) o a c(RGD)aza (es decir, Compuesto 3), mostraron una afinidad comparable con el receptor avp3 humano, y afinidad similar por el peptidomimético de referencia no conjugado c(RGDfK), como se indica en la Tabla IV.
Tabla IV-Afinidad de unión por el receptor de integrina av@3 humano de los compuestos 1 y 3 en comparación con el peptidomimético c(RGDfK).
Conjugados de moléculas pequeñas
Como ejemplo de conjugados de moléculas pequeñas, la actividad inhibidora de los conjugados representativos hacia la enzima CAIX se evaluó usando el kit colorimétrico K473 (BioVision) comercialmente disponible. El protocolo se realizó según las instrucciones del fabricante, y se comparó la potencia inhibidora (la mitad de la concentración inhibidora máxima, IC50) de los conjugados con la de la acetazolamida no conjugada. Brevemente, el kit utiliza la actividad de esterasa de una enzima anhidrasa carbónica activa sobre un sustrato éster que libera un producto cromogénico. El producto liberado se cuantifica mediante un lector de microplacas de absorbancia (absorbancia: 405 nm). En presencia de un inhibidor específico de la anhidrasa carbónica, como ocurre con la acetazolamida y los conjugados de fórmula (I), la enzima pierde su actividad, lo que da como resultado una disminución de la absorbancia. Los conjugados de moléculas pequeñas de fórmula (I) mostraron una alta potencia inhibidora hacia la enzima anhidrasa carbónica, con valores de IC50 en el intervalo nanomolar bajo, comparable al de la acetaxolamida no conjugada (acetazolamida: 3,7 nM; Compuesto 11: 6,5 nM; Compuesto 12: 1,2 nM).
Conjugados de moléculas de proteínas
Como ejemplo de conjugados de moléculas de proteínas, la afinidad del receptor de conjugados de unión a EGFR representativos se evaluó usando el kit AlphaLISA AL366H (Perkin Elmer). En este ensayo AlphaLISA, un EGF biotinilado se une a las perlas Alpha Donor recubiertas de estreptavidina, mientras que EGFR-Fc es capturado por perlas aceptoras AlphaLISA específicas de Fc anti-IgG humana. Cuando el EGF se une al EGFR, las perlas donantes y las perlas aceptoras se acercan mucho. La excitación de las perlas Donantes provoca la liberación de moléculas de oxígeno singlete que desencadenan una cascada de transferencias de energía en las perlas Aceptadoras, lo que da como resultado un pico agudo de emisión de luz a 615 nm. Los experimentos se realizaron comparando la afinidad del conjugado con el vector molecular no marcado relativo. Como control negativo, se usó el anticuerpo no marcado Trastuzumab, que no se une al receptor EGFR. Se incubaron series de dilución de las muestras (Compuesto 9 y Compuesto 10, y los vectores moleculares relativos no marcados Panitumumab y Cetuximab, respectivamente) durante 30 minutos con las perlas Aceptoras de EGFR, seguido de incubación durante 30 minutos con el EGF biotinilado. Así, se añadieron a la placa las perlas Donantes conjugadas con estreptavidina, y se incubaron durante 30 minutos. La absorbancia se midió a 615 nm usando un lector de placas (EnSight, Perkin Elmer). No se observó unión específica para el anticuerpo Trastuzumab. De manera diferente, se observó unión específica al receptor para el Compuesto 9 (IC50, 0,2 nM) y el Compuesto 10 (IC50, 0,4 nM), comparable a los anticuerpos parentales no marcados Panitumumab (IC50, 0,5 nM) y Cetuximab (IC50, 0,4 nM), respectivamente. Inesperadamente, se descubrió que moléculas grandes como Cetuximab y Panitumumab mantenían las propiedades de unión al antígeno nativo incluso después de la conjugación con los tintes de la invención.
En general, estos resultados demuestran que la conjugación de moléculas pequeñas, péptidos/peptidomiméticos o restos proteicos con un compuesto de tinte de fórmula (II) no perjudica la afinidad de unión del compuesto final (I) a la diana.
Ejemplo 15: Captación celular
La línea celular de melanoma humano WM-266-4 (ATCC, CRL-1676) se usó como modeloin vitropara evaluar la captación celular de los Compuestos representativos 1 y 3 de unión a integrinas, basándose en la alta expresión de los receptores de integrinas, particularmente avp3, en la membrana de estas células (Capasso et al., PlosOne 2014).
Las células adherentes con alrededor de 70% de confluencia se incubaron con los compuestos 1 o 3 (1 μM) durante 2 h a 37°C (5% de COz) en presencia de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con FBS al 10%, glutamina 2 mM, 100 UI/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina. Tras dos etapas de lavado con PBS, las células se separaron usando EDTA 0,1 mM en PBS, se centrifugaron, y se suspendieron en amortiguador (PBS, BSA al 0,5%, NaN3 al 0,1%), para experimentos de citometría de flujo. Se usó la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para detectar la señal de fluorescencia dentro de las células, como medida de la captación celular. Las muestras se excitaron con un láser de argón, y la emisión se detectó usando un filtro de paso largo de 670 nm. Los valores de la intensidad de fluorescencia se obtuvieron a partir de la estadística del histograma producida por el software del instrumento.
Para evaluar la especificidad de la captación celular mediada por receptores, se llevaron a cabo experimentos incubando las células con sondas moleculares en presencia de una alta concentración (100 μM) del vector molecular no marcado c(RGDfK) como competidor. La internalización residual se calculó considerando el valor de la intensidad de fluorescencia en ausencia del competidor como 100%.
Además, para evaluar el efecto de los fluidos biológicos sobre la captación celular, se llevaron a cabo experimentos paralelos incubando las células con compuestos de la invención en presencia de suero humano de plasma AB masculino (Sigma Aldrich, H4522) o albúmina humana (Sigma Aldrich, A9511). La internalización residual se calculó considerando el valor de la intensidad de fluorescencia en ausencia del suero como 100%. Tal evaluación de la absorción también representa una indicación del porcentaje de compuesto que es secuestrado por las proteínas plasmáticas, en particular la albúmina, cuando se difunde a través del compartimento vascular antes de alcanzar el tejido de interés y el receptor dianizado particular.
En la Tabla V se muestra el comportamiento de la captación celular de los Compuestos 1 y 3 representativos de la invención.
Los presentes compuestos mostraron una alta captación celular ya sea en presencia de suero humano o en presencia de HSA al 4% (Compuesto 1, absorción residual 70%), mientras que mostraron una baja absorción residual en presencia del vector c(RGDfK) como competidor (Compuesto 1, absorción residual 10%; Compuesto 3, absorción residual 15%). Así, para los presentes compuestos, se observa que la internalización en las células está mediada por receptores, y sólo se ve ligeramente afectada por la unión a proteínas séricas humanas, en particular a la albúmina (alrededor de 10-20% de la absorción residual), lo que confirma la afinidad de unión media a baja por la albúmina humana de los presentes compuestos (KA= alrededor de 1-6 x 103 M-1, como se muestra en el ejemplo 10).
Además, la Tabla V informa una comparación de la captación celular residual en presencia de suero humano para los Compuestos 1 y 3 con los compuestos de referencia DA364, ICG-RGD (Capozza et al., Photoacoustic 2018, 11, 36 45) e ICG-c(RGDfK), preparados con el mismo método para ICG-RGD. Estos resultados muestran que se ha encontrado sorprendentemente que los compuestos de la presente invención están dotados de una mayor eficacia en la internalización celular con respecto a compuestos similares conocidos en la técnica.
Tabla V-Captación de las sondas fluorescentes de unión a integrina en células de melanoma humano WM-266-4 en presencia de suero humano.
En particular, ni la interacción de los presentes compuestos con el receptor en la superficie celular ni la internalización del complejo receptor-sonda dentro de la célula se vieron perjudicadas por la estructura de los colorantes conjugados, y particularmente por la presencia en la posición R1 y R2 de los compuestos de restos fuertemente hidrófilos y con alto impedimento estérico. Por lo tanto, la presencia de restos hidrófilos en los tintes conjugados proporciona una unión al receptor altamente eficaz y específica y una internalización de la sonda incluso en presencia de proteínas plasmáticas y albúmina, lo que secuestraría un conjugado que carece de restos hidrófilos y afectaría negativamente a la eficacia de la unión.
Ejemplo 16: Biodistribución y eliminación
La biodistribución y eliminación de los agentes fluorescentes de la invención se evaluaron mediante imágenes ópticas después de la administración intravenosa en ratones Balb/c nu/nu machos, de 6 a 10 semanas (Charles River Laboratories). Brevemente, los ratones se enjaularon 4 por jaula y se alimentaron con dieta estéril VRF1 (P) (Special Diets Services Ltd) hasta el final del período de aclimatación (5 días). Después, hasta el final de los experimentos se usó dieta para roedores irradiada AIN-76a (Research Diets), una dieta especial que reduce la autofluorescencia. Los experimentos de formación de imágenes se realizaron usando el sistema óptico preclínico IVIS Spectrum (Perkin Elmer).
La formación de imágenesin vivose realizaron bajo anestesia gaseosa (sevofluorano al 6-8% en oxígeno). A los animales se les inyectaron los compuestos por vía intravenosa, y se les tomaron imágenes longitudinalmente a los 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 6 h y 24 h después de la administración. Por lo tanto, los animales se sacrificaron mediante sobredosis de anestesia, y los principales tejidos y órganos de interés se extirparon para obtener imágenes ópticasex vivo.Se dibujaron regiones de interés (ROI) en los tejidos de interés para cada imagen de fluorescencia en cada momento para evaluar la intensidad de la señal (expresada como eficiencia radiante promedio). Después, se calculó la relación entre la señal de fluorescencia en el músculo (tejido de fondo) y los órganos excretores (riñón, hígado), para evaluar el contraste. La vida media del tejido se calculó ajustando la caída de la señal de fluorescencia en el músculo con un modelo de ecuación de caída biexponencial usando el software GraphPad Prism (versión 5 para Windows).
La cinética tisular del Compuesto 1 se muestra en la Figura 1, en la que se representó gráficamente la caída de la señal de fluorescencia en el tejido muscular frente al tiempo para evaluar la eliminación del producto a diferentes dosis. Sorprendentemente, el Compuesto 1 mostró una cinética de eliminación muy favorable, con una eliminación rápida del tejido y una eliminación corporal mejorada, y en particular, mostró vidas medias tisulares muy cortas (< 1 hora) en todas las dosis (0,3, 1, 3 nmol/ratón) probadas. El compuesto se distribuyó rápidamente en el cuerpo, y se acumuló en la vejiga, lo que sugiere eliminación renal. Además, mostró una rápida eliminación del cuerpo y una baja retención, lo que permitió ventajosamente obtener imágenes tempranas después de la administración.
La Tabla VI muestra las relaciones entre la señal de fluorescencia detectada mediante imágenes ópticas en los órganos excretores extirpados (hígado y riñón) frente al músculo, 24 horas después de la administración intravenosa (iv) de 1 nmol/ratón del Compuesto 1 o 3.
La formación de imágenesex vivode órganos y tejidos extirpados revelaron una retención muy baja de los Compuestos 1 y 3 en los órganos excretores, riñón e hígado, asociada con una eliminación corporal más rápida y una acumulación no específica reducida.
Tabla VI-Relación entre la disminución de la señal de fluorescencia en los órganos excretores y en el músculo 24 horas después de la administración iv.
Ejemplo 17: Captación tumoral
La captación tumoral de los compuestos de la presente invención se ha evaluado mediante imágenes ópticas tras la administración intravenosa en ratones.
Se llevaron a cabo experimentos de captación tumoral en un modelo animal de glioblastoma humano (subcutáneo) que sobreexpresa los receptores de integrina, en particular avp3. Brevemente, se cultivaron células de glioblastoma humano U87MG (ATCC, HTB-14) en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10%, glutamina 2 mM, penicilina 100 Ul/ml y estreptomicina 100 μg/ml. Ratones Balb/c nu/nu machos, de 4 a 6 semanas (Charles River Laboratories), se sometieron a una implantación subcutánea (flanco derecho) de alrededor de 10 millones de células suspendidas en 0,1 ml de EMEM. Se alojaron 4 ratones por jaula con comida y agua ad libitum. Los animales se alimentaron con dieta estéril VRF1 (P) (Special Diets Services Ltd) hasta el final del período de aclimatación (5 días). Después, hasta el final de los experimentos se usó dieta para roedores irradiada AIN-76a (Research Diets), una dieta especial que reduce la autofluorescencia. El crecimiento del tumor se monitorizó mediante evaluaciones longitudinales usando un calibrador hasta el tamaño diana de 300-600 mm3 (3-4 semanas después de la implantación de las células). Los experimentos de formación de imágenes se realizaron usando el sistema óptico preclínico IVIS Spectrum (Perkin Elmer).
La formación de imágenesin vivose realizaron bajo anestesia gaseosa (sevofluorano al 6-8% en oxígeno). A los animales se les inyectaron por vía intravenosa (vena lateral de la cola) los compuestos, y se les tomaron imágenes longitudinalmente a los 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, y 24 h después de la administración. Se dibujaron regiones de interés (ROI) en los tejidos de interés para cada imagen de fluorescencia en cada momento para evaluar la intensidad de la señal (expresada como eficiencia radiante promedio). Entonces se calculó la relación entre la señal de fluorescencia en el tumor y en el músculo (tejido de fondo), para evaluar el contraste.
Los valores de disminución de la fluorescencia del Compuesto 1 representativo en el tejido tumoral y muscular y la relación tumor-fondo se muestran en la Figura 2. Estos resultados muestran una captación tumoral notablemente alta para el Compuesto 1 representativo ya en puntos de tiempo tempranos (1-2 horas después de la administración), proporcionando un contraste muy alto entre el tumor y el fondo (TBR ~2-2,5) y una baja retención en el tejido sano, lo que sugiere una acumulación específica del tumor.
De hecho, los presentes compuestos se eliminan rápidamente del cuerpo, particularmente de los tejidos sanos (músculo), mientras que se puede observar una considerable acumulación mediada por la diana para los tintes conjugados de fórmula (I) en los tejidos dianizados.
Se realizaron experimentos paralelos en un modelo animal de cáncer de cabeza y cuello humano (ortotópico), usando células Detroit-562, que sobreexpresan en particular el receptor de integrina avp6. Brevemente, las células de carcinoma faríngeo humano Detroit-562 (ATCC, CCL-138) se cultivaron en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10%, glutamina 2 mM, penicilina 100 UI/ml, estreptomicina 100 μg/ml. Ratones Balb/c nu/nu machos, de 4 a 6 semanas (Charles River Laboratories), se sometieron a una implantación ortotópica en la porción anterior de la lengua de alrededor de 2,5 millones de células suspendidas en 0,03 ml de EMEM. Se alojaron 4 ratones por jaula con comida y agua ad libitum. Los animales se alimentaron con dieta estéril VRF1 (P) (Special Diets Services Ltd) hasta el final del período de aclimatación (5 días). Después, hasta el final de los experimentos se usó dieta para roedores irradiada AIN-76a (Research Diets), una dieta especial que reduce la autofluorescencia. El crecimiento del tumor se monitorizó mediante evaluaciones longitudinales usando un calibrador hasta el tamaño diana de 10-20 mm3 (7-10 días después de la implantación de las células).
Los experimentos de formación de imágenes se realizaron usando el sistema óptico preclínico IVIS Spectrum (Perkin Elmer). A los animales se les inyectó por vía intravenosa (vena lateral de la cola) 3 nmol/ratón; 24 horas después de la administración se les practicó la eutanasia mediante sobredosis de anestesia, y las lenguas se extirparon para obtener imágenes ópticasex vivo.Se dibujaron regiones de interés (ROI) en la porción anterior de la lengua (sitio de implantación de células tumorales) y en la región posterior (tejido sano), para derivar la relación tumor-fondo. A un animal sano (sin implantación de tumor) se le administraron 3 nmol/ratón del Compuesto 1, y se tomaron imágenes como se describe anteriormente para usarlo como control negativo.
La formación de imágenesex vivorealizadas 24 horas después de la administración del compuesto 1 revelaron una región brillante en el sitio de implantación de las células tumorales de la lengua. Por el contrario, la región sana en la parte posterior de la lengua mostró una señal baja, similar a la detectada en ratones sanos, lo que sugiere una baja retención en el tejido sano. La administración del compuesto de la invención revela la ubicación del tumor con un alto contraste entre el tumor y el fondo (como se muestra en la Figura 3).
Se realizaron experimentos paralelos en un modelo animal de cáncer colorrectal humano (subcutáneo), usando células HT-29, que expresan niveles bajos de receptores de integrina. Brevemente, las células de adenocarcinoma colorrectal humano HT-29 (ATCC, HTB-38) se cultivaron en medio 5A de McCoy suplementado con suero fetal bovino al 10%, glutamina 2 mM, penicilina 100 UI/ml y estreptomicina 100 μg/ml. Ratones atímicos machos, de 4 a 6 semanas (Envigo), se sometieron a una implantación subcutánea (flanco derecho) de alrededor de 5 millones de células suspendidas en 0,1 ml de medio sin suero. Se alojaron 4 ratones por jaula con comida y agua ad libitum. Los animales se alimentaron con dieta estéril VRF1 (P) (Special Diets Services Ltd) hasta el final del período de aclimatación (5 días). Después, hasta el final de los experimentos se usó dieta para roedores irradiada AIN-76a (Research Diets), una dieta especial que reduce la autofluorescencia. El crecimiento del tumor se monitorizó mediante evaluaciones longitudinales usando un calibrador hasta el tamaño diana de 300-600 mm3 (3-4 semanas después de la implantación de las células). Los experimentos de formación de imágenes se realizaron usando el sistema óptico preclínico IVIS Spectrum (Perkin Elmer).
La formación de imágenesin vivose realizaron bajo anestesia gaseosa (sevofluorano al 6-8% en oxígeno). A los animales se les inyectaron por vía intravenosa (vena lateral de la cola) los compuestos de interés, y se les tomaron imágenes longitudinalmente a los 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 6 h, y 24 h después de la administración. Se dibujaron regiones de interés (ROI) en los tejidos de interés para cada imagen de fluorescencia en cada momento para evaluar la intensidad de la señal (expresada como eficiencia radiante promedio). Entonces se calculó la relación entre la señal de fluorescencia en el tumor y en el músculo (tejido de fondo), para evaluar el contraste.
Los valores de disminución de la fluorescencia en el tumor y el tejido muscular y la relación tumor-fondo se muestran en la Figura 4 para el Compuesto 1.
Estos resultados muestran una alta captación tumoral para el Compuesto 1 representativo ya en puntos de tiempo tempranos y una rápida eliminación de los tejidos sanos, lo que da como resultado una relación tumor-fondo moderada (TBR ~1,2-1,5) suficiente para delinear claramente el tejido tumoral del fondo sano.
La especificidad diana del Compuesto 1 representativo se comparó con la del compuesto de referencia DA364 en un modelo animal de cáncer humano que sobreexpresa el receptor de integrina humano aVp3, como se describió anteriormente. Ambos compuestos se administraron a una dosis de 1 nmol/ratón junto con (grupo bloqueador) o sin (grupo de control) un exceso de peptidomimético cRGD no marcado (200 nmol/ratón). Después de 24 horas desde la inyección, se sacrificó a los ratones, se extirparon los tejidos tumorales, y se tomaron imágenes usando el sistema de fluorescencia IVIS Spectrum (Perkin Elmer). El protocolo de bloqueo provocó una reducción del 10% en la intensidad de la señal de fluorescencia (el sustituto de formación de imágenes de la captación) en el tejido tumoral de los animales a los que se les administró DA364. De manera diferente, el protocolo de bloqueo provocó una reducción del 75% en la fluorescencia en los tumores de los animales que recibieron el Compuesto 1, lo que denota una mayor especificidad del receptorin vivopara el compuesto de la invención (véase la Tabla VII).
Tabla VII-Determinación de la especificidad del receptor in vivo mediante experimento de bloqueo.
Referencias
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Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto de fórmula (I)
  2. en la que R1yR2son independientemente un grupo -CO-NH-Y, en el que Y se selecciona de alquilo lineal o ramificado, cicloalquilo y heterociclilo, sustituido con al menos dos grupos hidroxilo; R3es alquilo lineal o ramificado sustituido con un grupo seleccionado -NH2, -SO3H, -COOH Y -CONH2; R4es alquilo bivalente lineal o ramificado; R5se selecciona de -COO- y -CONH-; Ses un espaciador; Tes un resto dianizador; nes un número entero igual a 1,2 o 3; y mes un número entero igual a 0 o 1. o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 2. El compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, en el que n es 3, R3 es alquilo sustituido con -SO3H, y R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en
  3. 3. El compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1 o 2, que está representado por la fórmula (la)
    en la que R4, R5, S, m y T son como se definen en la reivindicación 1.
  4. 4. El compuesto de fórmula (I) según las reivindicaciones 1,2 o 3, en el que S se selecciona de - NH(CH2)pCOO-, -NH(CH2CH2O)pCH2CH2COO- y -NH(CH2CH2O)pCH2CH2NH-, en los que p es un número entero comprendido entre 0 y 20.
  5. 5. El compuesto de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que T es un resto dianizador seleccionado del grupo que consiste en una molécula pequeña, una proteína, un péptido, un peptidomimético, un sustrato enzimático, un anticuerpo o fragmento del mismo, y un aptámero.
  6. 6. El compuesto de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que T es un resto que interactúa con un receptor de integrina.
  7. 7. El compuesto de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para uso como agente de contraste de fluorescencia para la detección y demarcación de un margen tumoral en cirugía guiada de un paciente individual.
  8. 8. El compuesto de fórmula (I) para uso según la reivindicación 7, en el que la detección y demarcación del margen tumoral se lleva a cabo bajo radiación NIR.
  9. 9. El compuesto de fórmula (I) para uso según la reivindicación 8, en el que dicho tumor es un tumor seleccionado de cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de esófago, cáncer de piel, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer oral, cáncer de pulmón, cáncer renal, cáncer de útero, cáncer de tiroides, cáncer de hígado, y cáncer colorrectal.
  10. 10. Una composición farmacéutica de diagnóstico que comprende un compuesto de fórmula (I) como se define en la reivindicación 1 y al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
  11. 11. Kit de diagnóstico que comprende un compuesto de fórmula (I) como se define en la reivindicación 1, junto con adyuvantes adicionales del mismo para implementar la formación de imágenes ópticas.
  12. 12. Un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, seleccionado de
    y
  13. 13. Un compuesto intermedio de fórmula (II)
  14. en la que R1, R2, R3, R4ynson como se definen en la reivindicación 1, y R5'se selecciona de -COOH, -CONH2, -COO-Pg y -CONH-Pg, en el que Pg es un grupo protector, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 14. Un intermedio de fórmula (II) según la reivindicación 13, en el que n es 3, R3 es alquilo sustituido con -SO3H y R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en
  15. 15. Un intermedio de fórmula (II) según las reivindicaciones 13 o 14, que está representado por la fórmula (IIa)
    en la que R4 y R5' son como se definen en la reivindicación 13.
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