KR20220008802A - 변형된 시아닌 염료 및 그것의 콘쥬게이트 - Google Patents

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로베르타 나폴리타노
로라 오리오
로레나 피즈토
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Abstract

본 발명은 광학 이미징 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 개선된 물리화학적 및 생물학적 특성을 특징으로 하는 시아닌계 화합물 및 그것의 생물학적 리간드와의 콘쥬게이트에 관한 것이다. 발명은 또한 고체 종양의 이미징 또는 치료법에서 광학 진단제로서의 이들 화합물의 용도, 그것의 제조 방법 및 그것을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

변형된 시아닌 염료 및 그것의 콘쥬게이트
본 발명은 광학 이미징 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 개선된 물리화학적 및 생물학적 특성을 특징으로 하는 시아닌계 화합물 및 그것의 생물학적 리간드와의 콘쥬게이트에 관한 것이다. 발명은 또한 고체 종양의 이미징 또는 치료법에서 광학 진단제로서의 이들 화합물의 용도, 그것의 제조 방법 및 그것을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
염료는 광 여기시 특정 파장의 광자를 흡수하고, 양자 효율에 따라 일반적으로 더 긴 파장에서 그 에너지의 일부를 재방출하는 화학적 실체이다. 특히, 시아닌 염료는 폴리메틴 가교에 걸쳐 있고 2개의 질소 원자 사이에 한정된 비편재화된 전자 시스템을 특징으로 하는 형광 유기 분자이다. 유리한 광학 특성, 낮은 독성 및 수성 매질에서의 양호한 용해도를 가지는, 그것들 중 일부는 생체의학 이미징을 위한 조영제로서 사용될 수 있다.
생체의학 이미징에 현재 사용되는 형광 분자, 예컨대 인도시아닌 그린 (Indocyanine green, ICG), 플루오레세인, 메틸렌 블루 및 5-아미노레불린산 (5-ALA)은 조직에서 수동적으로 확산하고 상이한 귀한 메카니즘 덕분에 병리적 영역에 축적될 수 있다. 플루오레세인 및 ICG와 같은 형광단은 수동적 확산과 향상된 투과성 및 유지력 (EPR) 효과의 조합에 의해 종양 조직에 분포한다 (Onda N. et al., Int J Cancer 2016, 139, 673-682). 5-ALA와 같은 대사 중간체는 증가된 대사로 조직에 축적된다 (Stummer W. et al., Neurosurgery 2015, 77(5), 663-673). 특정 분자 표적에 대해 지시되지 않는 다른 형광단은 대조-강화 X-선 또는 자기 공명 이미징의 원리에 따라, 종양-생리적 특성 (즉, 향상된 관류 및 투과도)을 이용한다 (Licha et al., Photochemistry and Photobiology, 2000, 72(3), 392-398). 일반적으로, 이들 형광 조영제는 적절한 시각화를 위해 상대적으로 대량 선량을 필요로 한다. 더욱이, 위양성 및 위음성은 그것의 사용과 관련된 일반적인 임상 결과이다 (Tummers Q. et al., PlosOne 2015).
검출의 민감도 및 특이성을 개선하기 위하여, 과다발현된 종양 수용체를 표적화하는, 담체 모이어티에 콘쥬게이션된 염료의 사용을 이용하는, 광학 이미징에 대한 추가 조영제가 개발 중에 있다 (Achilefu S. et al, J Med Chem 2002, 45, 2003-2015).
그러나, 염료-생체분자 콘쥬게이트의 생체내 거동은 형광 모이어티의 생물학적 특성에 의해 강하게 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 시아닌 Cy5의 작은 구조적 변형은 관련된 생체콘쥬게이트의 종양 및 표적 외 조직에서의 축적을 강하게 조절한다 (Bunschoten A. et al., Bioconjugate Chem. 2016, 27, 1253-1258). 표적 조직에 대해 낮은 비특이적 축적 및 높은 선택성을 가진 형광 조영제가 살아있는 유기체에서의 적용에 바람직할 것이다.
Institut fur Diagnostikforschung GmbH 명의의 US 6,913,743 B2는 예를 들어 조영제로서 새로운 수용성 염료 및 그것의 생체분자 부가물을 사용하는 생체내 진단 과정을 개시한다.
Bracco Imaging SpA 명의의 WO2018/189136 및 WO2016/097317은 수술 중 이미징에서 종양 가장자리의 경계 지정을 위해 사용된 화합물 DA364를 개시한다. 그러한 화합물은 설포-Cy5.5 염료와 콘쥬게이션된 아자비사이클로알칸계 고리형 RGD 펩타이드이다.
cRGD 펩타이드에 연결된, ICG의 콘쥬게이트의 예는 Capozza et al, Photoacoustics, 2018, 11, 36-45에서 개시되고, 거기에서 콘쥬게이트는 종양의 광음향 이미징에 사용된다.
Schering AG 명의의 US 6,329,531 B1은 NIR 방사선에 의해 신경퇴행성 질환의 진단을 위한 광학 진단제에 관한 것이고, 형광 표지로서 특히 헵타메틴 시아닌 염료를 개시한다. 이들 시아닌 염료의 일부는 또한 예를 들어 논문 Licha et al., Photochemistry and Photobiology, 2000, 72(3), 392-398 및 Ebert et al., J. Biomed. Optics, 2011, 16(6), 066003에서 개시되며, 거기에서 임상적으로 승인된 염료인 ICG와 비교된다. 특히, 후자는 SIDAG로 명명된 화합물을 개시하는데, 그것은 MRI 조영제의 특성과 유사한 물리화학적 특성을 보였으며, ICG와는 달리, 혈관외 분포가 특징적이었고, 세포외 수분 범위의 분포 부피를 가졌다. SIDAG는 그것의 무시할 수 있을만한 혈관외 유출 및 빠른 간 흡수의 기술적 문제점을 해결하기 위해 설계된 ICG의 친수성 대안이다. 그러나, 그러한 화합물, 특히 SIDAG의, 분자 이미징을 위한 형광 프로브로서의 가능한 용도에 대해, 그리고 그러한 대칭성 시아닌 유도체의 기능적 유도체화 및 추가의 콘쥬게이션에 대해서는 언급되지 않았다. 예를 들어, SIDAG는 가도펜테틱산 (Gd-DTPA)과 같은 MRI 조영제의 거동을 모방하기 위해 혈관외 분포 패턴을 가지는 생물학적으로 비활성인 염료로서 제안되었다. SIDAG는 변경된 종양 혈관의 기공을 통해 빠르게 확산할 수 있고, 그로써 수동 확산을 통해 종양 조직의 더 깊은 영역에 도달할 수 있지만, 분자 이미징 적용을 위한 원하는 특징, 예컨대 고효율로 내재화되고 축적하는 능력 및 병리적 세포 및 조직 내에서의 특이성은 결핍되어 있다.
Amersham Health AS 명의의 WO2005/123768은 혈관신생 관련 질환의 진단을 위한 광학 이미징에서의 조영제로서 적합한 적어도 하나의 시아닌 염료 리포터로 표지화된 새로운 펩타이드-기반 화합물을 기술한다.
Pierce Biotechnology Inc. 및 Dyomics Gmbh 명의의 WO2012/088007은 2 내지 4개의 설폰산 기능 및 인돌 헤테로고리 스캐폴드를 가진 시아닌 염료를 개시한다.
적합한 조영제 (imaging agent)를 찾기 위한 여러 노력에도 불구하고, 최적의 안정성 및 형광 효율, 뿐만 아니라 최적의 물리화학적 및 생물학적 특성이 부여되고, 살아있는 유기체의 광학 이미징을 위해 설계된 개선된 염료를 찾아야 할 필요성이 여전히 있다. 이런 필요성은 특히 미세한 분자 변화를 이미지화하고 표적 세포에서 고효율로 축적할 수 있는 능력을 가진, 고도로 특수한 도구를 필요로 하는 분자 이미징 적용에, 예컨대 염료가 분자 에피토프 또는 병리적 조직 (예컨대 종양)과 특이적으로 결합하는 생체분자에 콘쥬게이션될 때 가장 중요하다. 본 발명은 이들 및 다른 필요성을 해결한다.
일반적으로, 본 발명의 목적은 광학 이미징을 위한 조영제로서 유용하고 위에서 언급된 문제들을 해결하는 것을 목적으로 하는 새로운 시아닌 염료, 특히 그것의 결합 모이어티에 대한 상응하는 콘쥬게이트를 제공하는 것이다. 특히, 본 발명은 분자 이미징 적용을 위하여 최적의 특성을 가진 광학 조영제를 얻는 기술적 문제를 해결한다. 예를 들어, 발명의 새로운 시아닌 유도체는 생물학적 기질과 상호작용하고 병리적 세포 및 조직에서 축적되는 특히 적합한 특성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
본원에서 기술되는 새로운 시아닌 유도체는 놀랍게도 낮은 질량 선량에서 개선된 이미징 효율 및 개선된 신호 대 잡음 비율로 이어지는 현저한 광학적 특성이 부여된다. 나아가, 본 발명자들은 새로운 시아닌 염료를 합성하고 그것을 결합 부위로서 작용하는 적합한 작용기를 통해 상이한 표적화 모이어티에 콘쥬게이션함으로써, 광학 이미징을 위한 매우 특이적이고 민감한 조영제를 제공하깅 적합한 과정을 발견하였다. 본 발명에서 제공되는 바와 같이, 염료, 스페이서 및 표적화 모이어티의 신규한 조합은 놀랍게도 최적의 세포 내재화 효율 및 분자 이미징을 위한 전체적 특성을 광학 조영제에 부여한 화합물을 제공하였다.
상세하게 설명하면, 본 발명의 화합물에 의해, 특히 결합 모이어티와의 콘쥬게이트의 경우 달성될 수 있는 여러 장점 중에서, 다음의 특징, 예를 들어: 낮은 혈장 단백질 상호작용, 표적 조직에 대한 선택성 및 다른 조직과의 비특이적인 상호작용으로 인한 낮은 축적, 물에서의 높은 용해도, 전신 투여 후 무시할 수 있을만한 또는 관찰되지 않는 이상 반응, 투여 후 혈장에서의 양호한 화학적 및 광학 용해도가 강조될 수 있다.
특히, 발명의 화합물은 인간 알부민에 대한 매우 낮은 결합 친화도를 가지는 것으로 나타났고, 그것은 이들 화합물이 인간에서 이미징에 사용될 때 특히 유리하며: 상기 낮은 친화도는 혈액에 존재하는 큰 단백질, 예컨대 알부민에 의한 혈장 구획에서의 화합물의 격리, 및 결과적으로 관심의 조직에서 축적에 이용될 수 있는 유리 염료의 분획의 감소를 방지한다. 실제로, 고분자량의 알부민이 결합된 염료의 거동을 지시하기 때문에, 염료의 알부민-결합 분획은 거대분자의 수송 속도로 조직에서 축적할 수 있을 것이고, 건강한 조직 및 장기에서 원치 않는 비특이적인 축적을 유발할 수 있을 것이다. 이런 생물학적 특성은 특히 염료-콘쥬게이트의 경우에 중요한데, 그것의 (알부민에 결합되지 않은) 유리 분획만이 분자 표적과 적절하게 상호작용할 수 있고 특정 항원을 발현하는 세포에 의해 효율적으로 내재화될 수 있기 때문이다.
발명의 추가의 측면은 진단제로서, 특히 인간 또는 동물 장기 또는 조직의 광학 이미징에 사용하기 위한, 광학 이미징 방법에 사용하기 위한 그러한 염료-콘쥬게이트에 관한 것이며, 여기서 이미징은 장기의 단층촬영 이미징, 혈관조영술, 요로 이미징, 담관 이미징, 신경 이미징, 수술중 암 확인, 형광-유도 수술, 형광 팽성 이미징, 단파 적외선 이미징, 형광 내시경, 형광 복강경, 로봇 수술, 야외 수술, 레이저 유도 수술, 또는 광음향성 또는 초음파형광 방법을 포함한 장기 기능의 모니터링이다.
더욱이 발명은 제공된 염료, 그것의 상응하는 콘쥬게이트 및/또는 제약학적으로 허용되는 염의 제제를 위한 제조 과정, 및 진단제 제조에서의 그것의 용도에 관한 것이다.
추가의 측면에 따르면, 발명은 발명의 적어도 하나의 염료 또는 염료-콘쥬게이트 화합물, 또는 그것의 제약학적으로 허용되는 염을 하나 이상의 생리적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합하여 포함하는 제약학적으로 허용되는 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 특히 인간 또는 동물 장기 또는 조직의 유요한 이미징을 제공하기 위한 광학 조영제로서 유용하다.
또 다른 측면으로, 본 발명은 유효량의 발명의 화합물의 사용을 포함하는 광학 이미징 기법의 사용에 의한 신체 장기, 조직 또는 영역의 광학 이미징 방법에 관한 것이다.
도 1은 Balb/c nu/nu 마우스 (n=5마리/그룹)에서 화합물 1의 3 용량 (0.3 nmol/마우스, 원형; 1 nmol/마우스, 사각형; 3 nmol/마우스, 삼각형)의 정맥 내 투여 후 건강한 근육 조직에서의 형광 신호 감쇠를 도시한다.
도 2는 10 x 106개의 U87MG 세포로 이식된 Balb/c nu/nu 마우스에서 1 nmol의 화합물 1의 정맥내 투여 후 종양 (검은색 원형) 및 근육 조직 (백색 원형)에서의 형광 감쇠 (왼쪽 y-축), 및 시간 경과에 따른 종양 대 배경 비율 (사각형, 오른쪽 y-축)을 도시한다.
도 3은 2.5 x 106개의 Detroit-562 세포로 이식된 Balb/c nu/nu 마우스 (n=5마리)에서 3 nmol/마우스의 용량으로 투여된 화합물 1의 종양 대 배경 비율 (TBR)을 도시한다.
도 4는 5 x 106개의 HT-29 세포로 이식된 무흉선 누드 마우스에서 (n=5마리) 1 nmol의 화합물 1의 투여 후 종양 (검은색 원형) 및 근육 조직 (백색 원형)에서의 형광 감쇠 (왼쪽 y-축), 및 시간 경과에 따른 종양 대 배경 비율 (사각형, 오른쪽 y-축)을 도시한다.
모든 데이터는 평균 ± 표준 편차로서 표시된다.
따라서, 본 발명의 제1 목적은 식 (I)의 화합물, 또는 그것의 제약학적으로 허용되는 염을 제공하는 것이며,
Figure pct00001
식에서
R1 및 R2는 독립적으로 -CO-NH-Y 기이고, 여기서 Y는 적어도 2개의 하이드록실 기에 의해 치환된 선형 또는 분지된 알킬, 사이클로알킬 및 헤테로사이클릴로부터 선택되며;
R3은 -NH2, -SO3H, -COOH 및 -CONH2로부터 선택된 기에 의해 치환된 선형 또는 분지된 알킬이고;
R4는 선형 또는 분지된 이가 알킬이며;
R5는 -COO- 및 -CONH-로부터 선택되고;
S는 스페이서이며;
T는 표적화 모이어티이고;
n은 1, 2 또는 3과 동등한 정수이며; 그리고
m은 0 또는 1과 동등한 정수이다.
본 발명은 식 (II)의 중간 화합물, 또는 그것의 제약학적으로 허용되는 염으로 표시되는 상응하는 기능화된 염료를 추가로 제공하며,
Figure pct00002
식에서
R1, R2, R3, R4 및 n은 위에서 정의된 것과 같고
R5'는 -COOH, -CONH2, -COO-Pg 및 -CONH-Pg로부터 선택되며, 여기서 Pg는 보호기이다.
본 발명은 또한 합성 전환 단계에 의해 식 (I) 또는 (II)의 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
발명은 또한 유도 수술에서 종양 가장자리의 검출을 위한 형광 프로브로서 사용하기 위한 식 (I)의 화합물을 포함한다.
정의
본 설명에서, 및 다르게 제공되지 않는 한, 본원에서 사용되는 다음의 용어 및 구절은 다음의 의미를 갖는 것으로 의도된다.
표현 "직쇄 또는 분지된 알킬"은 사슬에 1 내지 8개의 탄소 원자를 가지는, 직쇄 또는 분지된 사슬일 수 있는, 지방족 탄화수소 라디칼 기를 나타낸다. 예를 들어, "C4 알킬"은 그 의미 안에 4개의 탄소 원자를 포함하는 선형 또는 분지된 사슬을 포함한다. 대표적이고 바람직한 알킬 기로는 메틸, 에틸, n-프로필, iso-프로필, n-부틸, tert-부틸, 펜틸 및 헥실을 들 수 있다. 다르게 명시되지 않는 한, 직쇄 또는 분지된 알킬은 일가 라디칼 기이다. 일부 경우에 그것은 그것은 "이가" 또는 "다가" 라디칼 기일 수 있고, 여기서 둘 이상의 수소 원자는 상기 탄화수소 라디칼 기로부터 제거되고 치환될 수 있는데, 예컨대 메틸렌, 에틸렌, iso-프로필렌 기 등과 같다.
본원에서 사용되는 용어 "사이클로알킬"은 그것의 의미 안에 3 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 포화된 (즉 지환족) 탄소고리형 고리를 포함한다. 적합한 예로는 C5-C7 탄소고리형 고리, 예컨대 사이클로헥실 고리를 들 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "헤테로사이클릴"은 포화된 지환족 고리, 바람직하게 5-7-원 포화된 고리를 포함하며, 추가로 고리형 사슬에 N, O 및 S로부터 선택된 헤테로원자를 포함한다. 바람직하게, 그것은 테트라하이드로푸란을 나타낸다.
용어 "하이드록시알킬"은 하나 이상의 수소 원자가 하이드록실 기에 의해 대체되어 있는 임의의 상응하는 알킬 사슬을 나타낸다.
용어 "알콕시"는 그것의 의미 안에 추가로 하나 이상의 산소 원자를 포함하는 상기에서 정의된 알킬 사슬을 포함하며; 예를 들어, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 아이소-프로폭시 등과 같은 알킬-옥시 기, 및 알킬 사슬이 하나 이상의 산소 원자에 의해 차단된 알킬-(폴리)옥시 기를 들 수 있다.
본 설명에서 용어 "보호기" (Pg)는 그것이 결합되는 기의 기능을 보존하기 위해 적응된 보호기를 나타낸다. 구체적으로, 보호기는 아미노, 하이드록실 또는 카르복실 기능을 보존하기 위해 사용된다. 적절한 보호기로는, 예를 들어, 벤질, 카르보닐, 예컨대 포르밀, 9-플루오로메틸옥시카르보닐 (Fmoc), 벤질옥시카르보닐 (Cbz), t-부톡시카르보닐 (Boc), 아이소프로필옥시카르보닐 또는 알릴옥시카르보닐 (Alloc), 알킬, 예컨대 tert-부틸 또는 트라이페닐메틸, 설포닐, 아세틸 기, 예컨대 트라이플루오로아세틸, 벤질 에스테르, 알릴, 또는 기술분야에 숙련된 사람에게 잘 알려져 있는 그러한 기능의 보호를 위해 일반적으로 사용되는 기타 치환기를 들 수 있다 (예를 들어, 일반적 참고문헌 T.W. Green and P.G.M.Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, N.Y. 2007, 4th Ed., Ch. 5 참고).
보다 구체적으로, 발명은 R5'의 작용기, 즉 카르복실산 또는 카르복시아미드가 상기에서 정의된 적절한 보호기 (Pg)로, 바람직하게 알킬 기로 보호되어 있는 식 (II)의 화합물을 포함한다. 그러한 유도체는 예를 들어 식 (I)의 원하는 화합물 또는 그것의 염의 제조에서 적합한 전구체 또는 중간체 화합물로서 사용될 수 있다.
필요에 따라, R1 및 R2의 하이드록실 기 및/또는 R3의 작용기가 또한 식 (I) 또는 (II)의 화합물의 제조 중에 적절한 보호기 (Pg)로 보호되고, 그로써 예를 들어 아세톡시, 알콕시, 에스테르 또는 아미드 기가 형성될 수 있다.
표현 "결합 시약"은 예를 들어 카르복실 모이어티와 아미노 모이어티 사이의 아미드 결합의 형성에 사용된 시약을 나타낸다. 반응은 2개의 연속 단계: 카르복실 모이어티의 활성화 및 그런 후 활성화된 카르복실산으로의 아미노기의 아실화로 이루어질 수 있다. 그러한 결합제의 비제한적인 예는 다음으로 이루어지는 군으로부타 선택된다: 카르보다이이미드, 예컨대 N,N'-다이아이소프로필카르보다이이미드 (DIC), N,N'-다이사이클로헥실카르보다이이미드 (DCC), 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필) 카르보다이이미드 (EDAC), 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카르보다이이미드 (EDC) 및 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카르보다이이미드 (WSC); 포스포늄 시약, 예컨대 (벤조트라이아졸-1-일옥시)트리스(다이메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (BOP), (벤조트라이아졸-1-일옥시)트라이피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyBOP), 7-아자벤조트라이아졸-1-일옥시-트라이피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyAOP), [에틸 시아노(하이드록시이미노)아세테이토-O2]트라이-1-피롤리디닐포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyOxim), 브로모트라이피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyBrOP) 및 3-(다이에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트라이아진-4(3H)-온 (DEPBT); 및 아미늄/우로늄-이모늄 시약, 예컨대 O-(N-석신이미딜)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TSTU), N,N,N',N'-테트라메틸-O-(벤조트라이아졸-1-일)우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU), N,N,N',N'-테트라메틸-O-(1H-벤조트라이아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU), N,N,N',N'-테트라메틸-O-(7-아자벤조트라이아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU), O-(1H-6-클로로벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HCTU), 1-[1-(시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴-아미노옥시)-다이메틸아미노-모르폴리노]-우로늄 헥사플루오로포스페이트 (COMU) 및 플루오로-N,N,N',N'-테트라메틸포름아미디늄 헥사플루오로포스페이트 (TFFH) 또는 기술분야의 숙련된 사람에게 잘 알려져 있는 기타 화합물.
표현 "활성화된 카르복실산"은 유리 카르복실 기보다 친핵 공격에 더 민감한 카르복실 기의 유도체를 나타내며; 적합한 유도체로는 예를 들어 산 무수물, 티오에스테르, 아실 할로겐화물, NHS 에스테르 및 설포 NHS 에스테르를 들 수 있다.
용어 "모이어티" 또는 "잔류물"은 본원에서 직접적으로 또는 적합한 링커 및/또는 스페이서를 통해 분자의 나머지에 적절하게 부착되거나 콘쥬게이션된 후 주어진 분자의 잔류 부분을 정의하는 것으로 의도된다.
용어 "조영제"는, 적합한 진단 이미징 기법과 관련하여 사용될 때, 살아있는 포유류 환자, 바람직하게, 인간 환자로부터 기원하는 세포, 생물학적 유체 및 생물학적 조직, 뿐만 아니라 인체 장기, 영역, 또는 조직을 포함한 생물학적 요소를 시험관내에서 또는 생체내에서 시각화하거나 또는 검출하기 위해 사용될 수 있는 검출 가능한 실체를 나타낸다.
표적화 모이어티 (T)
발명에 따르면, 표적화 모이어티 (T)는 신체의 특정 조직 또는 부분에서 생물학적 표적에 대해 특정 선택성으로 결합하고 조영제의 축적을 용이하게 하는 분자이다. 일반적으로, 그것은 생물학적 시스템에서 사용하기 위한 천연 또는 합성 분자로 표시된다.
그러한 특정 결합은 리간드, 예컨대 예를 들어 관심의 조직 또는 세포 표면에서 발현된 특정 생물학적 표적과 상호작용하는 소분자, 단백질, 펩타이드, 펩타이드 모방물, 효소 기질, 항체 또는 그것의 단편 또는 압타머를 통해 달성될 수 있다.
발명의 화합물에 대해 적합한 생물학적 표적은 예를 들어 표피 성장 인자 (EGF) 수용체, 예컨대 EGFR 또는 HER2; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 수용체, 예컨대 VEGFR1 또는 VEGFR2; 탄산 무수효소 (CA) 효소, 예컨대 CAIX, CAII 또는 CAXII; 뮤신 당단백질, 예컨대 MUC1; 글루코스 수송자, 예컨대 GLUT-1; 나트륨-수소 역수송체(antiporter), 예컨대 NHE1; 암종배아 당단백질, 예컨대 암종배아 항원 (CEA); 케모카인 수용체, 예컨대 케모카인 수용체 유형 4 (CXCR4); 세포 부착 분자, 예컨대 ICAM, EPCAM, VCAM, E-셀렉틴, P-셀렉틴; 간세포 성장 인자 HGFR (c-met); 트랜스페린에 대한 수용체; 에프린 수용체, 예컨대 EPHA2; 엽산에 대한 수용체, 예컨대 FR-알파; 당단백질 결합 히알루론산, 예컨대 CD44; 봄베신 수용체, 예컨대 BB1, BB2, BB3; N-아세틸-L-아스파르틸-L-글루타메이트 (NAAG) 펩티다제, 예컨대 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 및, 특히, 인테그린 수용체, 예컨대 αvβ3, αvβ5, αvβ6 또는 α5β1 인테그린 수용체일 수 있다.
예를 들어, 인테그린 수용체 표적화 모이어티는 서열 Arg-Gly-Asp (RGD)를 포함하는 선형 또는 고리형 펩타이드로 표시된다. 이 트라이펩타이드는 수용체에 대해 높은 결합 특이성을 가지며, 세포막에 위치한 인테그린 수용체 패밀리에 의해 리간드로서 인식된다. 실제로, 일부 세포외 매트릭스 당단백질, 예컨대 피브로넥틴 또는 비트로넥틴에서, 세포 부착을 매개하기 위해 이 RGD 모티프를 이용하는 것이 확인되었다.
그러므로, 서열 Arg-Gly-Asp (RGD)를 함유하는 선형 및 고리형 펩타이드 및 펩타이드 모방물, 예컨대 예를 들어 cRGD, cRGDfK, cRGDyK, cRGDfC, RGD-4C, RGD-2C, AH111585, NC100692, RGD-K5 (Kapp et al., Sci Rep, 2017, 7:3905), 또는 그것들의 유사체 및 그것의 유도체는 세포막 인테그린이 건강한 조직에 비교하여 상향조절되는 암 조직을 표적화하는 결합 모티프의 잘 알려진 예이다.
한 구체예에서, 발명의 화합물은 다른 소분자, 펩타이드, 단백질 또는 항체, 예컨대 예를 들어 이미 치료법에 사용되는 단클론성 항체에 콘쥬게이션될 수 있다.약물 아세타졸아미드를 함유한 소분자, 예컨대 예를 들어 화합물 4a, 5a, 6a, 7a 및 8a (Wichert et al., Nat Chem 2015, 7: 241-249), 또는 그것들의 유사체 및 그것의 유도체가 효소 CAIX를 표적화하는 소분자의 예이다. 선형 및 고리형 펩타이드 및 펩타이드 모방물, 예컨대 펩타이드 GE11 (Li et al., FASEB J 2005, 19:1978-85에서 기술됨) 및/또는 펩타이드 L1 (Williams et al., Chem Biol Drug Des 2018, 91:605-619에서 기술됨), 또는 그것들의 유사체 및 그것의 유도체가 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)를 표적화하는 펩타이드의 예이다. 단백질 중에서, 표피 성장 인자 (EGF)의 유도체가 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)를 표적화하는 작은 단백질의 예이다. 항체 중에서, 파니투무맙(panitumumab) 및 세툭시맙(cetuximab)이 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)를 표적화하는 단클론성 항체의 예이다.
바람직하게, 발명의 표적화 리간드는 종양 세포 또는 조직을 선택적으로 연결할 수 있다. 특히 그것은 뇌암, 유방암, 두경부암, 난소암, 전립선암, 식도암, 피부암, 위암, 췌장암, 방광암, 구강암, 폐암, 신장암, 자궁암, 갑상선암, 간암, 및 대장암으로부터 선택된 종양을 연결할 수 있다. 더불어, 표적화 리간드는 원발성 공급원과 상이한 조직 및 장기에서 상기 언급된 암의 전이성 확산을 연결할 수 있다. 나아가, 표적화 리간드는 상이한 조직 및 장기에서 전-종양 병변과 이형성증을 연결할 수 있다.
한 구체예에서 표적화 모이어티는 또한 금속을 착체화하고 그것에 단단하게 결합하는 킬레이터일 수 있다. 그러한 금속 킬레이터의 예는 기술분야에 숙련된 사람에게 알려져 있고 선행 기술에서 보고되었으며 예를 들어 DOTA, NODAGA, TETA, CB-TE2A, EDTA, DTPA, 데페록사민(Deferoxamine), NOTA, AAZTA, 등의 분자로 표시될 수 있다. 이들 킬레이터는 Gd3+ 또는 Mn2+와 같은 금속을 착체화하기 위해 사용될 수 있고 자기 공명 이미징에서 조영제로서 적용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 킬레이터는 테크니튬(Technitium), 인듐, 불화 알루미늄, 지르코늄, 이트륨, 루티튬(Lutitium), 스칸듐(Scandium), 아티늄(Attinium), 갈륨(Gallium) 또는 구리와 같은 방사성 금속을 착체화하기 위해 사용될 수 있고, 양전자 방출 단층촬영, 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영 및 감마 카운팅을 사용하는 분석에서 예를 들어 조영제로서 사용될 수 있다.
스페이서 S
발명에 따르면, S는 표적화 모이어티를 염료로부터 분리시키는, 선택적으로 존재하는 스페이서이다.
스페이서의 존재는 특히 표적화 모이어티 및 염료가 서로 불리하게 상호작용할 위험이 있는 일부 구체예와 관련된다. 더욱이, 스페이서의 존재는 염료가 상대적으로 크고 표적화 모이어티가 표적 부위에 결합하는 것을 간섭할 수 있을 때 필요할 수 있다.
스페이서는 염료가 표적으로부터 멀리 배향되도록 유연 (예컨대, 간단한 알킬 사슬)하거나 견고하다 (예컨대, 사이클로알킬 또는 아릴 사슬). 스페이서는 또한 살아있는 유기체에서 조영제로서 사용된 식 (I)의 콘쥬게이트의 약동학 및 대사를 변형시킬 수 있다.
친수성 스페이서는 혈장 단백질과의 상호작용을 감소시킬 수 있고, 혈액 순환을 감소시킬 수 있으며 배설을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 만약 스페이서가 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 모이어티이면, 생체내에서 조영제의 약동학 및 혈액 제거율이 변경될 수 있다. 그러한 구체예에서, 스페이서는 배경 조직 (즉, 근육, 혈액)으로부터 조영제의 제거율을 개선할 수 있어서, 높은 표적 대 배경 대비로 인해 더 나은 진단 이미지를 제공할 수 있다. 더욱이, 특정 친수성 스페이서를 도입하는 것이 조영제의 제거를 간으로부터 신장으로 이동시킬 수 있어서, 전체적인 신체 체류를 감소시킬 수 있다.
그러므로, 한 바람직한 구체예에서, 스페이서는 -NH(CH2)pCOO-, -NH(CH2CH2O)pCH2CH2COO- 및 -NH(CH2CH2O)pCH2CH2NH-로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기서 p는 0 내지 20의 정수이다. 바람직하게 p는 2, 6 또는 12이다.
필요하지 않은 경우, 스페이서는 바람직하게 없다, 즉 m은 0이고 S는 직접 결합을 나타낸다.
스페이서, 또는 대안으로 스페이서가 없을 때 표적화 모이어티는 식 (I)의 화합물에서, 식 (II)의 화합물에서는 연결 모이어티 R5'로 표시된, R5 잔기에서 연결될 수 있다.
5'의 연결기는 화학적 결합의 형성에 의해 염료가 표적화 모이어티에 콘쥬게이션되기에 적합한 카르복실릭 또는 카르복사미도 잔기와 같은 반응성 작용기이다.
예를 들어, 아민-함유 표적화 모이어티 (T)가 R5'가 카르복실산인 식 (II)의 화합물과 콘쥬게이션될 때, 이 카르복실산은 콘쥬게이션이 수행되기 전에 활성화 시약을 사용하여 보다 반응성 형태로 전환되는 것을 통해 선택적으로 활성화되어, 예를 들어 N-하이드록시 석신이미드 (NHS) 에스테르 또는 혼합 무수물을 형성할 수 있다. 그런 후, 상응하는 식 (I)의 화합물을 얻기 위하여, 아민-함유 표적화 모이어티가 결과적으로 활성화된 산으로 처리되어 아미드 결합이 형성된다. 전형적으로, 이 반응은 수성 완충액에서 수행된다.
그렇지 않으면 "비활성화" 카르복실산을 사용하는 직접 콘쥬게이션이 수행될 수 있다.
유사하게, R5'의 연결기가 카르복사미도 기인 경우, 적합한 표적화 모이어티의 부착 과정은 유사하지만, 링커의 활성화 단계가 일반적으로 필요하지 않고 염료 및 표적화 모이어티는 직접 처리된다.
상기 식 (I) 또는 (II)의 화합물은 하나 이상의 비대칭, 그렇지 않으면 키랄 탄소 원자로서 언급되는 탄소 원자를 가질 수 있고, 그로써 부분입체 이성질체 및 광학 이성질체가 유발될 수 있다. 다르게 제공되지 않는 한, 본 발명은 모든 그러한 가능한 부분입체 이성질체뿐만 아니라 그것들의 라세미 혼합물, 그것들의 실질적으로 순수한 분해된 거울상 이성질체, 모든 가능한 기하학적 이성질체, 및 그것들의 제약학적으로 허용되는 염을 추가로 포함한다.
본 발명은 추가로, R3 및/또는 R5'의 작용기, 예컨대 설포닐, 예컨대 설포닐, 카르복시아미노 또는 카르복실릭 기가 제약학적으로 허용되는 염의 형태로 있을 수 있는, 상기 식 (I) 또는 (II)의 화합물에 관한 것이다.
한 구체예에서, 발명은 R1 및 R2가 독립적으로 -CO-NH-Y의 기이고, 선택적으로 R1 및 R2에 대해 동일한 모이어티인 Y는 2 내지 5개의 하이드록실 기로 치환된 선형 또는 분지된 알킬, 사이클로알킬 및 헤테로사이클릴로부터 선택되는, 식 (I) 또는 (II)의 화합물에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서 발명은 n이 3이고, R3이 -SO3H에 의해 치환된 알킬이며, R1 및 R2는 동일하거나 상이하고 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 식 (I) 또는 (II)의 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00003
,
Figure pct00004
,
Figure pct00005
,
Figure pct00006
,
Figure pct00007
및
Figure pct00008
.
보다 바람직하게 n은 3이고, R3은 -SO3H에 의해 치환된 알킬이며, R1과 R2는 동일하다.
발명의 또 다른 구체예에서 m은 0이고 스페이서 (S)는 직접 결합에 의해 표시되거나 또는 m은 1이고 스페이서는 알킬, 사이클로알킬 또는 아릴 기를 포함하는 친수성 모이어티이다.
바람직하게, 스페이서는 -NH(CH2)pCOO-, -NH(CH2CH2O)pCH2CH2COO- 및 -NH(CH2CH2O)pCH2CH2NH-로부터 선택되며, 여기서 p는 0 내지 20의 정수이다. 바람직하게 p는 2, 6 또는 12이다.
추가의 구체예에서 T는 소분자, 단백질, 펩타이드, 펩타이드 모방물, 효소 기질, 항체 또는 그것의 임의의 단편 및 압타머로부터 선택된 표적화 모이어티이다.
바람직하게 T는 펩타이드, 특히 인테그린 수용체, 예컨대 αvβ3, αvβ5, αvβ6, α5β1 등, 바람직하게 αvβ3 인테그린 수용체와 상호작용하는 모이어티에 의해 표시된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 발명은 n이 3이고, R3이 -SO3H로 치환된 C4-알킬이며 R1 및 R2가 둘 다 상기에서 정의된 것과 같은 기 (iv)이거나, 그렇지 않으면 각각 다음의 식 (Ia) 또는 (IIa)로 표시되는 식 (I) 또는 (II)의 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00009
Figure pct00010
식에서 R4, R5, R5', S, m 및 T는 상기에서 정의된 것과 같다.
또 다른 구체예에서, 발명은 n이 1 또는 2인 식 (I) 또는 (II)의 화합물에 관한 것이다.
특히 바람직한 것은 표 Ia 및 Ib에서 열거된 식 (I) 또는 (II)의 화합물이다.
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
본 발명은 또한 다음의 설명에서 예시되는 식 (I) 및 (II)의 화합물을 합성하는 방법에 관한 것이다. 발명의 화합물은 인간 및 동물에서 전부 종양의 검출에서 조영제로서 유용하다. 따라서, 발명은 개별 환자의 유도 수술에서, 특히 종양이 인테그린 수용체의 감소된 또는 가변적인 과다발현을 보여주는 종양인 경우에 종양 가장자리의 검출 및 경계 지정을 위한 형광 프로브로서 사용하기 위해 상기 정의된 식 (I)의 화합물을 제공한다. 바람직하게 이미지화된 대상체는 인간이다.
발명은 또한 상기 정의된 형광 프로브로서 사용하기 위한 식 (I)의 화합물을 제공하며, 종양 가장자리의 검출 및 경계 지정은 NIR 방사선 하에서 수행된다.
본 발명의 추가의 측면은 상기 정의된 식 (I)의 콘쥬게이트 또는 식 (II)의 염료, 또는 그것의 염, 및 하나 이상의 제약학적으로 허용되는 보조제, 부형제 또는 희석제를 포함하는 제약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 정의된 식 (I)의 콘쥬게이트를 포함하는 진단 키트에 관한 것이다. 더불어, 키트는 광학 이미징을 실행하기 위한 추가 보조제를 함유할 수 있다. 이들 보조제는, 예를 들어, 적합한 완충제, 용기, 검출 시약 또는 사용 지침이다. 키트는 바람직하게 발명의 화합물의 정맥내 투여를 위한 모든 물질을 함유한다.
발명의 화합물은 이미징 과정 전에, 이미지화될 장기 또는 조직에 전신적으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 화합물은 정맥내로 투여될 수 있다. 또 다른 구체예에서 그것은 비경구로 또는 장으로 투여될 수 있다. 조성물은 종양, 조직 또는 장기의 원하는 광학 이미지를 달성하기에 효과적인 선량으로 투여될 수 있고, 그것은 사용된 화합물, 이미징 과정이 적용되는 조직, 사용되는 이미징 장비 등에 따라 광범위하게 달라질 수 있다. 조영제의 정확한 농도는 실험 조건 및 원하는 결과에 따라 좌우되지만, 전형적으로 0.000001 mM 내지 0.1 mM의 범위일 수 있다. 최적 농도는 최소 배경 형광으로 만족할만한 결과가 얻어질 때까지 체계적인 변화에 의해 측정된다. 투여된 후에는, 발명의 조영제는 조직 층을 통과할 수 있는 빛, 또는 다른 형태의 에너지에 노출된다. 바람직하게 방사선 파장 또는 파장대는 감광제의 여기 파장 또는 파장대와 매칭되고, 비표적 세포 및 혈액 단백질을 포함한 대상체의 나머지에 의한 흡수율이 낮다. 전형적으로, 광학 신호는 관찰에 의해서나 기기에 의해 검출 가능하고 그것의 반응은 형광 또는 빛의 강도, 분포 및 수명에 관련된다.
합성의 설명
식 (I) 또는 (II)의 화합물 자체 또는 생리적으로 허용되는 염의 형태로의 제조는 발명의 추가 목적을 나타낸다. 발명의 시아닌 염료 및 염료-콘쥬게이트는 예를 들어 다음 섹션 및 실험 부분에서 기술된 방법에 따라 제조될 수 있다. 시아닌 염료의 제조에 관한 일반적인 교시는 설포인도시아닌 염료의 합성 및 표지화와 관련된 문헌인 Mujumdar R.B. et al., Bioconjugate Chem. 1993, 4(2), 105-111에서 찾아볼 수 있다. 그러나, 본 발명의 시아닌은 기술분야의 화합물에 존재하지 않는 특수한 기능화를 특징으로 하며, 그것을 위해서는 적절한 합성 접근법의 설정이 필요하였다. 실제로, 다른 공지된 시아닌과 달리, 발명의 화합물은 상이한 방식으로 유도체화될 심지어 3개의 기능성 모이어티 (카르복실산 또는 아미노/아미드 기)를 포함하여서, 대부분의 경우 원하는 작용기에 대한 반응을 지시하기 위해 보호기의 사용이 필요하였다.
보호기의 제거에 필요한 강력한 pH 및 온도 조건에서 시아닌을 조작할 때 어려움이 발생할 수 있는 것으로 알려져 있는데, 왜냐하면 폴리메틴 스캐폴드의 안정성이 일부 경우에 염료의 심각한 분해로 손상될 수 있기 때문이다.
더욱이, R5의 카르복실기를 보호할 때 아미드 기 R1 및 R2의 가능한 가수분해 및 분해로 인해 추가의 장애물을 만날 수 있다 (전형적으로, 아미드 유도체는 농축 알칼리성 배지에서 가수분해될 수 있다, 예를 들어 Yamana et al, Chem. Pharm. Bull., 1972, 20(5), 881-891 참고). 예상했던 것과 대조적으로, 발명의 화합물은 염기성 pH (즉 약 pH 11)에서 매우 안정적이고 보호기의 제거 중에 관찰되는 분해는 없거나 무시할 수 있을 정도였다.
한 바람직한 구체예에서, 모이어티 R5'에 대한 보호기는 에스테르 기이다.
보다 바람직하게, 에틸 에스테르 기가 유리하게 사용될 수 있다.
식 (II)의 시아닌 염료의 제조
발명에 따르면, 식 (II)의 화합물은 R1이 R2와 동일한 경우의 구체예의 경우 다음의 계획 1, 또는 R1과 R2가 상이한 의미를 가지는 구체예의 경우 계획 2에 보고된 일반적인 합성 과정을 통해 제조될 수 있다.
Figure pct00015
계획 1
상기 계획 1에서, R1, R2, R3, R4, 및 n은 상기에서 정의된 것과 같고, R5''는 -COOPg 또는 -CONHPg이며, 여기서 Pg는 보호기이고, R5'''는 -COOH 또는 -CONH2이며 X는 할로겐, 메실레이트 또는 트리플레이트와 같은 적합한 이탈기이다.
따라서, 본 발명의 과정은 다음의 단계를 포함한다:
a) 일정량의 5-카르복시-2,3,3-트라이메틸인돌레닌 (III)을 친핵체 R3-X (IV)로 처리함으로써 중간체 (VI)을 얻는 단계, 여기서 R3은 상기에서 정의된 것과 같고 X는 적합한 이탈기, 예컨대 할라이드 기이거나, 또는 R3-X는 C1-C6-알칸설톤 분자를 나타내는 것인 단계;
b) 또 다른 일정량의 5-카르복시-2,3,3-트라이메틸인돌레닌 (III)을 친핵체 R5''-R4-X (V)로 처리함으로써 중간체 (VII)을 얻는 단계, 여기서 R5'' 및 R4는 상기에서 정의된 것과 같고 X는 할라이드 기와 같은 적합한 이탈기인 것인 단계;
c) 중간체 (VI) 및 중간체 (VII)을 시약 (VIII)과 함께 반응시켜서 시아닌 스캐폴드 (IX)를 얻는 단계, 여기서 n, R3, R4 및 R5''는 상기에서 정의된 것과 같인 단계;
d) 인돌렌 고리 상의 카르복실산 기를 폴리하이드록실화된 아민, 예컨대 예를 들어 글루카민, 메글루민, 글루코사민, 트로메타몰, 세리놀 또는 아이소세리놀로 유도체화하는 단계;
e) 선택적으로, 결과적으로 얻어지는 중간체 (X)로부터 임의의 보호기를 제거하고 식 (II)의 화합물 또는 그것의 염을 분리하는 단계.
단계 a) 및 b)에 따르면 유도체 (III)의 친핵체 R3-X (IV) 또는 R5''-R4-X (V)와의 반응은 순수한 또는 고비등점 용매, 예컨대 부티로니트릴, 설포란, 1,2-다이클로로벤젠, 다이메틸아세타미드, 다이메틸포름아미드 또는 다이메틸설폭사이드에서, 고온, 예를 들어 90℃ 내지 180℃에서, 여러 시간, 전형적으로 12시간 내지 5일 동안 수행될 수 있다.
단계 c)에 따르면 반응은 빌스마이어 시약(Vilsmeier reagent)을 사용하여 비스 아닐리도 형태로 (계획 1에서 보고된 것과 같이) 또는 비스 알데하이도 형태로 수행될 수 있다. 반응은 예를 들어 에탄올, 메탄올, 아세트산 무수물 또는 아세트산과 같은 여러 용매 중에서, 상이한 염기, 예컨대 트라이메틸아민, 피리딘, 아세트산 나트륨, 아세트산 칼륨 등을 첨가하거나 첨가하지 않고, 45℃ 내지 120℃의 범위의 상이한 온도에서 여러 시간 (전형적으로 2-24시간) 동안 혼합물을 교반하여 수행될 수 있다.
단계 d)에 따르면 반응은 여러 결합제, 예컨대 TBTU, HBTU, HATU, PyBOP, DCC, DSC, DCC-NHS 및 TEA, DIPEA, NMM, 피리딘, 등과 같은 여러 유기 염기를 사용하여 다이메틸포름아미드, 다이메틸아세타미드, 다이메틸설폭사이드, 아세토니트릴 등과 같은 용매에서, 실온에서 30분 내지 수시간 범위의 적합한 시간 동안 수행될 수 있다.
선택적 단계 e)에 따르면, 중간체 (X)의 임의의 보호기는, 예를 들어 in T.W. Green and P.G.M.Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, N.Y. 2007, 4th Ed., Ch. 5에서 기술된 공지된 과정을 따라 모이어티 R5''로부터 제거된다.
대안으로, 상기에서 기술된 것과 같이, R1이 R2와 상이한 경우에 식 (II)의 화합물은 다음의 계획 2에서 예시된 것과 같이 제조될 수 있다 :
Figure pct00016
계획 2
식에서 R1, R2, R3, R4, 및 n은 상기에서 정의된 것과 같고, R5''는 -COOPg 또는 -CONHPg이며, 여기서 Pg는 보호기이고, R5'''는 -COOH 또는 -CONH2이며 X는 할로겐, 메실레이트 또는 트리플레이트와 같은 적합한 이탈기이다.
계획 2에 따르면, 폴리하이드록실화된 아민은 단계 b')에서 중간체 (VII)와 반응하여 잔기 -R2를 포함하는 중간체 (XI)를 형성한 후에, 단계 c)의 빌스마이어 반응을 수행하여 시아닌 (IX)을 형성한다. 다른 상이한 잔기 -R1은 그런 후에 제2 인돌레닌 고리 상에서 첨가될 수 있다.
대안으로, 기 -R1은 또한 단계 c)가 수행되기 전에 상응하는 단계 a')에서 중간체 (VI)에 도입될 수 있다.
따라서, 단계 b'), 및/또는 선택적으로 a')는 단계 d)에 대해 상기에서 기술된 것과 같이 수행된다.
추가의 구체예에서, 발명의 방법에 따라 제조된 식 (II)의 화합물은 잘 알려져 있는 조건에 따라 작동시킴으로써 또 다른 식 (II)의 화합물로 편리하게 전환될 수 있고, 다음은 가능한 전환의 예이다:
f) R5'''가 -COOH인 식 (II)의 화합물, 즉 식 (IIb)의 화합물을, R5'''가 -CONH2인 상응하는 식 (II)의 화합물, 즉 식 (IIc)의 화합물로 전환시키는 단계:
Figure pct00017
단계 f)에 따르면, 식 (IIb)의 카르복실산의 식 (IIc)의 상응하는 카르복사미드로의 전환은 카르복사미드의 제조에 대해 기술분야에 광범위하게 알려져 있는 다양한 방법 및 실험 조건으로 달성될 수 있다. 예로서, 카르복실산은 먼저 적합한 활성화 에스테르로 전환된 후 암모늄 염, 예컨대 NH4Cl과, 바람직하게 결합제, 예컨대 HBTU의 존재 하에 반응할 수 있다.
식 (I)의 콘쥬게이트 화합물의 제조
식 (II)의 시아닌 유도체, 또는 그것의 염은, 그런 후에 선택적으로 스페이서가 삽입되어, 적합한 표적화 모이어티와 콘쥬게이션되어 계획 2에서 보고된 것과 같이 상응하는 식 (I)의 화합물이 얻어진다:
Figure pct00018
계획 3
콘쥬게이션은 기술분야에 알려져 있는 다음의 상이한 과정에 의해, 예컨대 예를 들어, 즉 작용기 R5'''가 표적화 모이어티의 친핵성 잔기와 직접 반응하는 직접 결합을 통해, 또는 선택적으로 스페이서와 반응하거나, 또는 R5'''의 작용기, 전형적으로 산이 결합 전에 더 반응성이 큰 기, 예컨대 NHS와 같은 에스테르에서 변환되는 이전의 활성화에 의해 달성될 수 있다.
만약 상기 기술된 과정에 따라 제조된 식 (I) 또는 (II)의 화합물이 이성질체의 혼합물로서 얻어진다면, 종래 기법을 사용하여 식 (I) 또는 (II)의 상응하는 단일 이성질체로 분리되는 것은 본 발명의 범주 내에 있다.
최종 화합물은 종래 과정, 예를 들어 크로마토그래피 및/또는 결정화 및 염 형성을 사용하여 분리 및 정제될 수 있다.
상기에서 정의된 것과 같은 식 (I) 또는 (II)의 화합물은 제약학적으로 허용되는 염으로 전환될 수 있다. 상기에서 정의된 것과 같은 식 (I) 또는 (II)의 화합물, 또는 그것의 제약학적으로 허용되는 염은 계속해서 제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제로 제형화되어 제약학적 조성물이 제공될 수 있다.
도면의 설명
도 1은 Balb/c nu/nu 마우스 (n=5마리/그룹)에서 화합물 1의 3 용량 (0.3 nmol/마우스, 원형; 1 nmol/마우스, 사각형; 3 nmol/마우스, 삼각형)의 정맥 내 투여 후 건강한 근육 조직에서의 형광 신호 감쇠를 도시한다.
도 2는 10 x 106개의 U87MG 세포로 이식된 Balb/c nu/nu 마우스에서 1 nmol의 화합물 1의 정맥내 투여 후 종양 (검은색 원형) 및 근육 조직 (백색 원형)에서의 형광 감쇠 (왼쪽 y-축), 및 시간 경과에 따른 종양 대 배경 비율 (사각형, 오른쪽 y-축)을 도시한다.
도 3은 2.5 x 106개의 Detroit-562 세포로 이식된 Balb/c nu/nu 마우스 (n=5마리)에서 3 nmol/마우스의 용량으로 투여된 화합물 1의 종양 대 배경 비율 (TBR)을 도시한다.
도 4는 5 x 106개의 HT-29 세포로 이식된 무흉선 누드 마우스에서 (n=5마리) 1 nmol의 화합물 1의 투여 후 종양 (검은색 원형) 및 근육 조직 (백색 원형)에서의 형광 감쇠 (왼쪽 y-축), 및 시간 경과에 따른 종양 대 배경 비율 (사각형, 오른쪽 y-축)을 도시한다.
모든 데이터는 평균 ± 표준 편차로서 표시된다.
실험 부분
다음의 부분에서 기술된 발명 및 그것의 특정 구체예는 단지 예시이며 본 발명의 제한으로서 간주되지 않아야 한다: 그것은 본 발명이 수행되는 방법을 보여주며 발명의 범주를 제한하지 않으면서 예시적인 것을 의미한다.
물질 및 장비
반응에 사용한 모든 화학물질 및 용매는 시약 등급이었다. 분석 등급 용매를 크로마토그래피 정제에 사용하였다 대부분의 시약은, 다르게 기록되지 않는 한, 표적화 모이어티 (예컨대 파니투무맙 (Vectibix, Amgen; CAS Registry Number of the active substance: 339177-26-3); 세툭시맙 (Erbitux, Merck; CAS Registry Number of the active substance: 205923-56-4))을 포함하여, 상업적 제품이다.
모든 합성된 화합물을 역상 크로마토그래피 (RP-HPLC)에 의해 정제하고 UV-VIS 검출기 및 ESI 공급원이 장착된 LC/MS 기기를 사용하는 질량 분광법에 의해 특성화하였다. 분석을 상 A CH3COONH4 10mM 및 상 B 아세토니트릴의 구배를 사용하는 Waters Atlantis dC18 5νm, 4.6 Х 150 mm 칼럼을 사용하여 수행하였다. 측정된 질량/전하 비율을 각 화합물에 대해 열거한다. 이중 빔 UV-VIS 분광 광도계 (Lambda 40, Perkin Elmer)를 사용하여 발명의 화합물의 흡수율 (Ab)을 측정하였다. 방출/여기 (Em/Ex) 스펙트럼 및 절대 형광 양자 수율 (φ) 측정을 F-3018 통합 구형 액세서리가 장착된 분광 형광계 (FluoroLog-3 1IHR-320, Horiba Jobin Yvon) 상에서 수행하였다. 측정을 상이한 염료의 최대 흡광도에서 여기 파장을 사용하여 수행하였고, 샘플을 450 W Xenon 광원으로 여기시켰다. 검출을 광전자 증배관 (RMT-NIR) 냉각된 검출기 또는 TBX-04 검출기에 의해 수행하였다. 염료 용액을 재흡수 현상을 최소화하기 위하여 0.1 (광학 밀도)보다 낮은 흡광도를 갖도록 세심하게 제조하였다.
생체내 이미징 실험을 IVIS 스펙트럼 생체내 이미징 시스템 (Perkin Elmer Inc.)을 사용하여 수행하였다. 시스템에는 430 내지 850 nm에 걸쳐 있는 10개의 협대역 여기 필터 (30 nm 대역폭) 및 18개의 협대역 방출 필터 (20 nm 대역폭)이 장착되어 있다.
관찰 목록
Figure pct00019
개별 아미노산 잔기에 대한 약어는 종래와 같다: 예를 들어, Asp 또는 D는 아스파르트산이고, Gly 또는 G는 글리신이며, Arg 또는 R은 아르기닌이다. 본원에서 언급된 아미노산은 다르게 주지되지 않는 한 L-이성질체 형태의 것인 것으로 이해되어야 한다.
실시예 1: 화합물 4의 합성
Figure pct00020
중간체 (VIa)의 제조, 단계 a
둥근 바닥 플라스크에, 5-카르복시-2,3,3-트라이메틸인돌레닌 (1.50 g, 7.38 mmol), 2,4-부탄설톤 (1.11 g, 8.15 mmol) 및 부티로니트릴 (2 g)을 첨가하였다. 혼합물을 120℃에서 2일 동안 가열하였다. 그런 후 고체를 드라이 아세톤으로 처리하고, 진공 하에 여과하고 아세톤으로 2회 세척하였다. 핑크색 고체를 진공 하에 건조시키고 추가의 정제 없이 사용하였다 (2.40 g, 96%). 270 nm에서의 HPLC 순도 94%, MS: [M + H]+ 339.2.
중간체 (VIIa)의 제조, 단계 b
둥근 바닥 플라스크에 중간체 III (1.5 g, 7.38 mmol), 에틸 6-브로모헥사노에이트 (1.97 g, 8.85 mmol) 및 설포란 (6.8 g)을 첨가하였다. 현탁액을 90℃에서 3일 동안 가열하였다. 그런 후, 에틸 아세테이트 (25 mL)를 첨가하고, 자주색 분산액을 실온에서 15분 동안 교반하고 진공 하에 여과하였다. 고체를 에틸 아세테이트로 3회 세척한 후, 새로운 에틸 아세테이트 (15 mL)에 다시 분산시키고, 실온에서 15분 동안 교반하고, 진공 하에 여과하고 에틸 아세테이트로 세척하였다. 이 조작을 다시 2회 반복하였다. 마지막으로, 원하는 생성물 및 출발 물질을 모두 함유하고 있는 핑크색/보라색 고체를 진공 하에 건조시켰다. 그런 후 아세토니트릴 (4 mL)에 분산시키고, 조밀한 분산액을 실온에서 15분 동안 건조시키고 여과하였다. 고체를 적은 부피의 저온 아세토니트릴로 세척하였다. 모액은 원하는 생성물을 우세하게 함유한 반면, 고체는 출발 물질을 함유하였다. 아세토니트릴을 진공 하에 증발시키고 고체를 다시 아세토니트릴 (4 mL)에 분산시키고, 15분 동안 교반하고, 여과하고 고체를 저온 아세토니트릴로 세척하였다. 용액을 진공 하에 농축하여 270 nm에서 92%의 HPLC 순도를 가지는 핑크색/보라색 고체를 얻었다 (브로민 염으로서 1.25 g, 40%). MS: [M + H]+ 346.5.
중간체 (IXa)의 제조, 단계 c
둥근 바닥 플라스크에 글루타콘알데하이드 다이아닐 염산염 (0.48 g, 1.4 mmol), 아세트산 무수물 (47 mL) 및 아세트산 (13 mL)을 첨가하였다. 오렌지색-갈색 용액을 60℃에서 3시간 동안 가열하였다. 그런 후 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 에탄올 (10 mL) 중의 중간체 (IVa) (0.60 g, 1.4 mmol)의 용액을 실온에서 약 20분에 걸쳐 적하하였다. 적색 용액을 35℃에서 2시간 동안 가열한 후, 온도를 50℃로 증가시키고 에탄올 (19 mL) 중의 중간체 (III) (0.48 g, 1.4 mmol) 및 아세트산 나트륨 (0.11 g, 1.3 mmol) 용액을 첨가하였다. 그 직후에, 피리딘 (2.0 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 1.5시간 동안 가열한 후, 용매를 진공 하에 증발시키기고 진한 오일을 냉수 (100 mL)에서 침전시켰다. 진한 녹색 고체가 여과되었고 냉수로 세척하였다. 그런 후, 그것을 최소량의 에탄올에 용해시키고 이 용액을 교반 하에 에틸 아세테이트 (400 mL)에 적하하였다. 고체를 여과하고, 에틸 아세테이트로 세척하고, 다이클로로메탄에 용해시키고 느린 다이클로로메탄-메탄올 구배로 실리카 겔 상에서 정제하였다. 순수한 생성물을 함유한 분획을 조합하고, 진공 하에 증발시키고 건조시켜서 녹색-청색 고체를 얻었다 (350 mg, 33% 수율). 756 nm에서 HPLC 순도 94%, MS: [M + H]+ 747.3.
화합물 4의 합성, 단계 d 및 e
건조한 둥근 바닥 플라스크에서, 건조한 DIPEA (115 μL, 0.56 mmol)를 DMF (2 mL) 중의 중간체 (IXa) (150 mg, 70% 순도, 0.14 mmol) 용액에 첨가하였다. 질소 흐름 하에서 30분 동안 교반한 후에, DMF (2 mL) 중의 TBTU (309 mg, 0.67 mmol) 용액을 첨가하였다. 1시간 후, DMF (2 mL) 중의 D-글루카민 (87 mg, 0.336 mmol)의 현탁액을 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반한 후, 농축하고 사전-패킹된 C18 실리카 칼럼 상에서 물-아세토니트릴 구배로 정제하였다. 순수한 생성물을 함유한 분획을 수집하고, 농축하고 냉동 건조시켜서 녹색-청색 분말을 얻었다 (95.8 mg, 64% 수율). 756 nm에서 HPLC 순도 97%, MS: [M + Na]+ 1095.3.
그렇게 얻어진 중간체 (Xa) (95 mg, 0.089 mmol)를 물 (10 mL, pH 6.35)에 용해시킨 후, 2N NaOH를 pH가 11.14가 될 때까지 첨가하였다. 0.1N NaOH의 첨가를 통해 pH를 11에서 유지하면서 용액을 실온에서 교반하였다. 40시간 후 반응이 완료되었고, 혼합물을 1 N HCl로 중화시키고 사전-패킹된 C18 실리카 칼럼 상에서 물-아세토니트릴 구배로 정제하였다. 순수한 생성물을 함유한 분획을 수집하고, 농축하고 냉동 건조시켜서 녹색-청색 분말을 얻었다 (81 mg, 86% 수율). 756 nm에서 HPLC 순도 98%, MS: [M + H]+ 1045.3.
실시예 2 : 화합물 5의 합성
Figure pct00021
단계 f
건조한 둥근 바닥 플라스크에서, N-메틸모르폴린 (10 μL, 0.091 mmol)을 건조한 DMF (1 mL) 중의 실시예 1에서와 같이 제조한 화합물 4 (10 mg, 0.0096 mmol)의 용액에 첨가하였다. 질소 흐름 하에서 30분 동안 교반한 후, DMF (1 mL) 중의 HBTU (13 mg, 0.03 mmol) 용액을 첨가하였다. 1시간 후, DMF (1 mL) 중의 NH4Cl (10 mg, 0.19 mmol)의 현탁액을 첨가하였다. 혼합물을 교반 하에 2일 동안 유지한 후, 진공 하에 건조시키고 사전-패킹된 C18 실리카 칼럼 상에서 물-아세토니트릴 구배로 정제하였다. 순수한 생성물을 함유한 분획을 조합하고, 농축하고 냉동 건조시켜서, 청색 고체를 얻었다 (2.56 mg, 20% 수율). 756 nm에서 HPLC 순도 97.5%, MS: [M + H]+ 1043.1.
실시예 3 : 화합물 7의 합성
Figure pct00022
중간체 Xb의 제조, 단계 d
중간체 IXb를 실시예 1의 과정을 따라 제조하되, 단계 c)에 대해 말론알데하이드 다이아닐리드 염산염 시약을 사용하였다. 중간체 IXb (58 mg, 0.081 mmol)를 건조한 DMF (10 mL)에 현탁시켰다. 트로메타몰 (23.5 mg, 0.194 mmol), DIPEA (61 μL, 0.352 mmol) 및 HATU (73.77 mg, 0.194 mmol)를 첨가하였다. 반응을 실온에서 비활성 분위기 하에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 증류하고 미정제물을 사전-패킹된 C18 실리카 칼럼 상에서 물-아세토니트릴 구배로 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 생성물을 함유한 분획을 조합하고 진공 하에 증류하고 냉동 건조시켜서, 밝은 청색 고체를 얻었다 (60 mg, 80% 수율). 655 nm에서 HPLC 순도: 99.6%. MS: [M + H]+ 927.3.
화합물 7의 합성, 단계 e
중간체 Xb (110 mg. 0.106 mmol)를 에탄올 (2 mL)에 용해시키고 물 (18 mL)을 첨가하였다. 용액을 40℃에서 가열하고 가수분해가 완료될 때까지 pH를 0.1 N NaOH를 사용하여 11로 유지하였다 (대략 6시간). pH를 0.1 N HCl을 사용하여 7로 만들고 미정제물을 사전-패킹된 C18 실리카 칼럼 상에서 물/메탄올 구배로 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 생성물을 함유한 분획을 조합하고, 진공 하에 증류하고 냉동 건조시켜서, 밝은 청색 고체를 얻었다 (18.7 mg, 19% 수율). 655 nm에서 HPLC 순도: 95.7%. MS: [M + H]+ 899.3.
실시예 4 : 화합물 8의 합성
Figure pct00023
중간체 VIc 및 VIIc를 중간체 VIa 및 VIIa에 대해 상기 기술된 과정을 따라 제조하였다. 실시예 1과 유사하게, 그것들을 상응하는 시약 N,N-다이페닐-포름아미딘으로 처리하여, 트라이메틴 중간체 IXc를 얻었다.
중간체 Xc의 제조, 단계 d
중간체 IXc (62 mg, 0.089 mmol)를 건조한 DMF (15 mL)에 현탁시켰다. D-글루카민 (33.9 mg, 0.187 mmol), DIPEA (62 μL, 0.356 mmol) 및 HATU (71.10 mg, 0.187 mmol)를 첨가하고 반응을 비활성 분위기 하에서 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 증류하고 미정제물을 사전-패킹된 C18 실리카 칼럼 상에서 물/아세토니트릴 구배로 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 생성물을 함유한 분획을 조합하고, 진공 하에 증류하고 냉동 건조시켜서, 밝은 핑크색 고체를 얻었다 (82.4 mg, 91% 수율). 560 nm에서 HPLC 순도: 99.8%. MS: [M + H]+ 1021.3.
화합물 8의 합성, 단계 e
중간체 Xc (81.4 mg. 0.08 mmol)를 에탄올 (2 mL)에 용해시키고 물 (18 mL)을 첨가하였다. 용액을 실온에서 교반하고 가수분해가 완료될 때까지 (대략 46시간) pH를 0.1 N NaOH로 11로 유지하였다. 그런 후, pH를 0.1 N HCl로 7로 조정하고 미정제물을 사전-패킹된 C18 실리카 칼럼 상에서 물/아세토니트릴 구배로 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 생성물을 함유한 분획을 조합하고, 진공 하에 증류하고 냉동 건조시켜서, 밝은 핑크색 고체를 얻었다 (79 mg, 99.4% 수율). 560 nm에서 HPLC 순도: 100%. MS: [M + H]+ 993.3.
실시예 5 : 화합물 1의 합성
Figure pct00024
화합물 1을 화합물 4에 상응하는 염료와 고리형 펜타펩타이드 c-RGDfK의 콘쥬게이션에 의해 합성하였고, 여기서 콘쥬게이션을 2개의 대체 과정 A 또는 B에 의해 수행하였다. 화합물 4를 실시예 1에서 기술한 것과 같이 제조하였다. 표적화 모이어티를 나타내는 펩타이드 c-RGDfK는 상업적 시약이다.
과정 A - 직접 결합을 통한 콘쥬게이션 단계
건조한 둥근 바닥 플라스크에서, N-메틸모르폴린 (10 μl, 0.09 mmol)을 건조한 DMF (1 mL) 중의, 실시예 1에서 기술한 것과 같이 제조한 화합물 4 (10 mg, 0.009 mmol)의 용액에 첨가하였다. 질소 흐름 하에서 30분 동안 교반한 후에, DMF (1 mL) 중의 TBTU (6 mg, 0.02 mmol) 용액을 첨가하였다. 1시간 후, DMF (1 mL) 중의 c(RGD)fK (6 mg, 0.009 mmol) 용액을 첨가한다. 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반한 후, 다른 TBTU (4 mg) 및 N-메틸모르폴린 (2 μL)을 첨가하고, 2시간 후에 c(RGD)fK (2 mg)를 첨가하였다. 혼합물을 추가로 6시간 동안 교반한 후, 농축하고 미정제물을 C18 실리카 칼럼 상에서 0.1% 암모늄 아세테이트-아세토니트릴 구배로 분석적 HPLC로 정제하였다. 순수한 생성물을 함유한 분획을 수집하고, 농축하고 3회 냉동 건조시켜서, 청색 고체를 얻었다 (4.4 mg, 29% 수율). 756 nm에서 HPLC 순도 99%, MS: [M/2]+ 841.0.
과정 B - NHS 에스테르를 사용한 이전 활성화를 통한 콘쥬게이션 단계
실시예 1에서 기술된 것과 같이 제조한 화합물 4 (4 mg, 0.0038 mmol)를 건조한 DMF (3 mL)에 질소 흐름 하에서 현탁시켰다. N-메틸모르폴린 (0.8 μl, 0.0076 mmol) 및 TSTU (2.3 mg, 0.0076 mmol)를 첨가하고 용액을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 원하는 생성물을 저온 다이에틸 에테르의 첨가에 의해 침전시키고, 원심분리하고 다이에틸 에테르로 2회 세척하였다.
고체를 pH 9의 보레이트 완충액 (2 mL) 중의 c(RGD)fK (3.0 mg, 0.0042 mmol) 용액에 용해시켰다. 용액을 밤새도록 교반한 후, pH를 1 N HCl로 6으로 조정하고 미정제물을 C18 실리카 칼럼 상에서 0.1% 암모늄 아세테이트/아세토니트릴 구배로 분석적 HPLC로 정제하였다. 순수한 생성물을 함유한 분획을 수집하고, 농축하고 3회 냉동 건조시켜서, 청색 고체를 얻었다 (5.2 mg, 83% 수율). 756 nm에서 HPLC 순도 99%, MS: [M/2]+ 841.0.
실시예 6 : 화합물 3의 합성
Figure pct00025
건조한 둥근 바닥 플라스크에서, N-메틸모르폴린 (10 μl, 0.09 mmol)을 건조한 DMF (1 mL) 중의 실시예 1에서 기술한 것과 같이 제조한 화합물 4 (10 mg, 0.009 mmol)의 용액에 첨가하였다. 질소 흐름 하에서 15분 동안 교반한 후에, DMF (1 mL) 중의 HBTU (3.6 mg, 0.01 mmol) 용액을 첨가하였다. 30분 후에, DMF (1 mL) 중의 아자-cRGD-NH2 (5.7 mg, 0.01 mmol) 용액을 첨가하였다. 혼합물을 2일 동안 교반한 후, 진공 하에 농축하고 C18 실리카 칼럼 상에서 0.1% 암모늄 아세테이트/아세토니트릴 구배로 분석적 HPLC로 정제하였다. 순수한 생성물을 함유한 분획을 수집하고, 농축하고 3회 냉동 건조시켜서, 청색 고체를 얻었다 (3.57 mg, 21% 수율). 756 nm에서 HPLC 순도 99%, MS: [M/2]+ 780.8.
실시예 7 : 화합물 9의 합성
단클론성 항체 EGFR 리간드 파니투무맙 (6 mg)을 PBS에 최대 5 mg/mL로 희석하고 120 μL의 1.0 M 인산 칼륨 pH 9를 첨가함으로써 pH를 조정하였다. 화합물 4-NHS 에스테르 (실시예 5, 과정 B에서 기술한 것과 같이 제조함)를 DMSO에 10 mg/ml의 농도로 용해시켰다; 그런 후 염료 및 항체를 즉시 2.5:1의 몰비로 혼합하고 실온에서 어두운 곳에서 3시간 동안 유지하였다. 3시간 후, 콘쥬게이션 반응 혼합물을 포스페이트 완충 식염수 (PBS)-평형 Zeba Spin 칼럼 상에 층으로 올려 놓고 1500 g에서 2분 동안 원심분리하여 콘쥬게이트를 유리 염료로부터 분리시켰다. 0.22-μm 폴리에테르설폰 (PES) 막을 통해 여과한 후, pH 7.4의 PBS 중의 콘쥬게이션된 파니투무맙 용액을 SE-HPLC, RP-HPLC, UV/VIS 분광법에 의해 분석하여 농도 및 순도를 측정하였다. 콘쥬게이션 몰비 (항체당 결합된 염료 분자)는 약 1.3이었다.
실시예 8 : 화합물 10의 합성
단클론성 항체 EGFR 리간드 세툭시맙 (5 mg/mL)을 10 K Da MWCO 막에서 PBS에 대해 투석하였다. 10 mg의 투석된 MAb (4.52 mg/mL, 68.8 nmol)를 221 μL의 1 M 포스페이트 완충액 pH 9에 첨가하였다. 화합물 4-NHS 에스테르 (실시예 5, 과정 B에서 기술한 것과 같이 제조함)를 DMSO에 6.86 mM의 농도로 용해시켰다. 43.3 μL의 염료를 세톡시맙 용액 (몰비 4.3:1)에 첨가하고 실온에서 어두운 곳에서 3시간 동안 유지하였다. 이 시간 후, 콘쥬게이션 반응 혼합물을 포스페이트 완충 식염수 (PBS)-평형 Zeba Spin 칼럼 상에 층으로 올려 놓고 1000 g에서 2분 동안 원심분리하여 콘쥬게이트를 유리 염료로부터 분리시켰다. 0.22 μm 폴리에테르설폰 (PES) 막을 통해 여과한 후, pH 7.4의 PBS 중의 콘쥬게이션된 세툭시맙 용액을 SE-HPLC, RP-HPLC, UV/VIS 분광법에 의해 분석하여 농도 및 순도를 측정하였다. 콘쥬게이션 몰비 (항체당 결합된 염료 분자)는 약 1.1이었다.
실시예 9 : 화합물 11의 합성
Figure pct00026
Wichert et al., Nat Chem 2015, 7, 241-249에서 기술된 소분자 CAIX 리간드 4a를 그 문헌에서 개시된 과정을 따라 제조하고 화합물 4에 콘쥬게이션하였다. 11 mg의 화합물 4 (10.0 μmol)를 1 mL의 DMF에 용해시킨 후, 5.5 mg의 PyBOP (10.0 μmol) 및 7 μL의 DIPEA (40.0 μmol)를 연속적인 교반 하에 첨가하였다. 20분 후에, 9 mg의 소분자 4a (15.0 μmol)를 1 mL의 DMF에 용해시키고 반응 혼합물에 첨가하여 그것을 추가로 30분 동안 실온에서 교반하였다. 정제를 예비용 HPLC에 의해 수행하였고 수율은 60%였다. 분리한 순수한 생성물을 Waters Atlantis dC18 칼럼 (μm, 4.6 x 150 mm)을 사용하여 HPLC-UV-VIS-MS-ESI (+)에 의해 특성화하였다. 758 nm에서 HPLC 순도: 98%; MS: [M/2]+ 823.3.
실시예 10 : 화합물 12의 합성
Figure pct00027
Wichert et al., Nat Chem 2015, 7, 241-249에서 기술된 소분자 CAIX 리간드 8a를 그 문헌에서 개시된 과정을 따라 제조하고 화합물 4에 콘쥬게이션하였다. 15 mg의 화합물 4 (14.0 μmol)를 1 mL의 DMF에 용해시킨 후, 7.3 mg의 PyBOP (14.0 μmol) 및 10 μL의 DIPEA (57.0 μmol)를 연속적인 교반 하에 첨가하였다. 20분 후에, 22 mg의 소분자 8a (21.0 μmol)를 1 mL의 DMF에 용해시키고 반응 혼합물에 첨가하여 그것을 추가로 30분 동안 실온에서 교반하였다. 정제를 예비용 HPLC에 의해 수행하였고 수율은 34%였다. 분리한 순수한 생성물을 Waters Atlantis dC18 칼럼 (μm, 4.6 x 150 mm)을 사용하여 HPLC-UV-VIS-MS-ESI (+)에 의해 특성화하였다.
758 nm에서 HPLC 순도: 95%; MS: [M/2]+ 1051.8.
실시예 11 : 중간체 (Xa)의 안정성
실시예 1 단계 d)ㅇ에서 기술한 것과 같이 제조된 중간체 (Xa)의 안정성을 최적 조건에서 에틸 에스테르의 가수분해를 수행하기 위하여 상이한 조건에서 평가하였다. 실제로, 그러한 유형의 시아닌은 산성 및 염기성 배지에서 상당히 안정적이지 못한 것으로 알려져 있다.
다른 유사한 내재 폴리설포닐 기, 예컨대 예를 들어 WO2018/189136에 기술된, 산성 조건에서 보다 안정적인 화합물 DA364와 대조적으로, 중간체 (Xa)는 예상외로, 강력한 조건, 예컨대 pH 11 및 45℃에서 여러 시간 동안 가수분해가 수행될 때, R1 및 R2 기의 분해 없이 현저한 안정성을 보여주었다.
놀랍게도, 양호한 결과가 또한 효소적 돼지 및 토끼 간 추출물을 사용하여 PBS 완충액에서 1 mg/mL로, pH 8 및 38℃에서 작동되는 가수분해를 수행하여 얻어졌다. 완전한 전환은 어떠한 분해 없이 20-24시간 후에만 얻어졌다.
실시예 12 : 광학 특성
발명의 화합물을 수성 배지 (즉, 물/PBS pH 7.4) 및 인간 혈청의 화학적 조성 및 광학 특성을 모방하는 임상 화학 대조군 혈청 (Seronorm, Sero SA)에서 그것들의 시험관내 광학 특성의 관점에서 특성화하였다. 모든 염료 또는 염료-콘쥬게이트 용액을 새롭게 제조하였다.
특히, 대표적인 식 (I)의 화합물 및 상응하는 식 (II)의 염료의 최대 여기 및 방출 및 절대 형광 양자 수율을, 상업적인 이중-설폰화 헵타메틴 염료 인도시아닌 그린 (ICG, Sigma), 이중-설폰화 펜타메틴 염료 설포-Cy5 (Lumiprobe) 및 이중-설폰화 트라이메틴 염료 설포-Cy3 (Lumiprobe)과 비교하여 표 2에 나타낸다.
식 (I)의 화합물 (화합물 1 및 3) 및 (II)의 화합물 (화합물 4, 6, 7, 8)의 최대 여기/방출 및 절대 형광 양자 수율
Cy7 최대 여기/방출
(nm, PBS pH 7.4) 		Φ
(PBS pH 7.4) 		Φ
(세로놈(Seronorm))
ICG (참조) 780/810 1.5% 7.8%
화합물 1 757/786 9.8% 13.0%
화합물 3 757/785 10.6% 11.7%
화합물 4 755/785 8.9% 13.4%
Cy5 최대 여기/방출(nm, PBS pH 7.4) Φ
(PBS pH 7.4) 		Φ
(세로놈)
설포-Cy5 (참조) 645/665 27.0% 35.6%
화합물 6 656/675 35.6% 35.9%
화합물 7 655/675 35.1% 35.1%
Cy3 최대 여기/방출(nm, PBS pH 7.4) Φ
(PBS pH 7.4) 		Φ
(세로놈)
설포-Cy3 (참조) 548/565 6.8% n/a
화합물 8 557/573 14.5% 20.0%
n/a, 이용할 수 없음
발명의 화합물은 약 550 nm 내지 760 nm 범위에 포함된 흡수 최대를 특징으로 한다. 발명의 화합물에 대해 얻어진 형광 양자 수율은 참조 화합물보다 더 뚜렷하게 높았는데, 동일한 길이의 폴리메틴 사슬을 가진 상응하는 참조 화합물보다 약 1.5 내지 7배 더 큰 값을 가졌다. 현저하게, 발명의 화합물은 유사한 용해도 특성을 가진 참조 화합물보다 수성 완충액 PBS에서 더 큰 양자 수율을 나타냈다.
실시예 13 : 인간 알부민에 대한 친화도
인간 알부민에 대한 발명의 화합물의 결합 친화도의 분석을 수행하였고 결과를 참조 인도시아닌 그린 (ICG)과 비교하였다.
인간 혈청 알부민 (HSA; Sigma Aldrich, A9511)에 대한 결합 친화도를 화합물의 결합 친화도 수준에 따라 2가지 방법을 사용하여 측정하였다.
HSA와 강력하게 상호작용하는 화합물에 가장 적합한 첫 번째 방법은 염료를 HSA를 함유한 용액에서 인큐베이션한 후 흡광도 스펙트런 피크 이동의 분석을 토대로 한다. 간단하게 설명하면, 샘플을 측정 전에 25℃의 분광계에서 포스페이트 완충액에서 HSA로 희석된 (1x10-6 - 4x10-4 M) 고정 농도 (1 μM)에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 측정을 이동된 피크의 최대 흡광 파장에서 수행하였다.
HSA에 대해 친화도가 낮은 화합물에 가장 적합한 두 번째 방법은 염료 및 다양한 농도의 HSA를 함유한 용액의 한외여과 후의 흡광도의 변화를 측정하는 것을 토대로 한다. 간단하게 설명하면, 각각의 화합물을 포스페이트 완충액에서, HSA로 희석된 (1x10-6 - 4x10-4 M) 고정 농도 (2 μM)에서 인큐베이션하였다. 샘플을 Microcon 장치 (10 kDa MWCO, Ultracel-10 막을 포함한 Amicon Ultra-0.5 원심분리 필터, Millipore)에서 원심분리하고 (30분 동안 25℃에서 10,000 g에서) 형광단의 최대 흡수 파장에서 분광계를 사용하여 여과물의 흡광도를 측정하였다.
두 방법에 대해, 미가공 데이터를 다음의 식에 맞춤으로써 친화도 상수 (KA, M-1)를 계산하였다:
Figure pct00028
식에서
△A/b = 측정된 흡광도 (b = 1 cm)
KRL = 회귀 분석 (곡선 피팅)에 의해 계산된 KA
△ε
Figure pct00029
회귀 분석 (곡선 피팅)에 의해 계산된 Rt
[L] = 알부민 농도이다.
첫 번째 방법에서, △A/b는 각 샘플에 대해 측정된 흡광도에 상응하는 반면, 두 번째 방법에서 △A/b는 대조군 샘플 (HSA가 없는 염료)의 흡광도에서 서로의 샘플의 흡광도를 빼서 얻어진다.
첫 번째 방법 (HSA KA = 215,000 M-1) 및 두 번째 방법 (HSA KA = 216,000 M-1)을 사용하여 상업적 시아닌 염료 IRDye 800CW 카복실레이트 (LI-COR Inc., Lincoln, USA)에 대해 수행된 병렬 실험에 의해 나타난 바, 두 방법 모두 비슷한 결과를 제공하는 것으로 입증되었다. 그러나, 친화도 상수의 측정은 적합한 방법이 화합물의 친화도 수준의 함수로서 사용될 때 더 정확하다.
발명의 대표적인 화합물에 대해 두 방법 중 하나로 측정된 결합 친화도의 결과를 표 3에 보고하며 참조 화합물로서 임상적으로 이용 가능한 ICG 염료 및 ICG-RGD 및 DA364에 대해 얻어진 결과와 비교하였다.
인간 혈청 알부민 (HSA)에 대한 결합 친화도
화합물 HSA 친화도 (K A , M -1 )
ICG (참조 화합물) 347,000
ICG-RGD (참조 화합물) 219,000
DA364 (참조 화합물) 28,670
화합물 1 6,290
화합물 3 4,200
화합물 4 5,110
화합물 6 <1,000
화합물 7 3,460
화합물 8 2,070
표 3에서 나타낸 것과 같이, 발명의 염료 및 염료-콘쥬게이트는 이용 가능한 ICG 및 많은 다른 알려진 시아닌 화합물과 비교하여 인간 알부민에 대해 현저하게 낮은 결합 친화도를 나타내며, 친화도 상수는 1 또는 2배 더 낮다. 이런 유리한 특징은 표적화 모이어티 (예컨대 화합물 1 및 3)에 콘쥬게이션될 때 식 (II)의 염료 (예컨대 화합물 4) 및 상응하는 염료 둘 다에 관련되며, 염료와 표적화 모이어티의 콘쥬게이션이 인간 알부민에 대한 친화도에 영향을 미치지 않는 것을 시사한다.
오히려, 식 (I)의 RGD 콘쥬게이트, 예컨대 대표적인 화합물 1 및 3이 예상외로 RGD 표적화 모이어티와 콘쥬게이션되었을 때 기술분야에 알려져 있는 다른 염료보다 인간 알부민에 대해 훨씬 더 낮은 친화도를 나타냈는데, 예컨대 표 3에서 보고된 것과 같이 ICG-RGD (HSA KA = 219,000 M-1, Capozza et al., 2018) 또는 DA364 (HSA KA = 28,670 M-1, WO2016/097317)였다. 더욱이, 참조 화합물 DA364는 본 발명의 화합물과 동일한 실험 조건에서 정확하게 분석되었을 때, 110,000 M-1의 친화도 상수 (KA)로, 더 높은 HSA 친화도를 나타냈다.
실시예 14 : 수용체 결합 친화도
식 (I)의 콘쥬게이트의 특정 수용체에 대한 결합 친화도를 측정하여 분자 벡터의 표적화 효능이 발명의 염료로 표지화된 후 보존되는지 여부를 평가하였다.
펩타이드/펩타이드 모방물 분자 콘쥬게이트
펩타이드/펩타이드 모방물 콘쥬게이트의 예로서, 대표적인 인테그린 결합 콘쥬게이트의 수용체 친화도를, 이전에 보고된 것과 같이 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)를 사용하여, 그것의 IC50 (절반 최대 억제 농도)의 계산을 통해 평가하였다 (Kapp et al., Sci. Rep. 2017, 7, 39805).
간단하게 설명하면, 96-웰 ELISA 플레이트를 4℃에서 밤새도록 탄산염 완충액 (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9.6) 중의 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질 비트로넥틴으로 코팅하였다. 그런 후 각 웰을 PBS-T-완충액 (포스페이트 완충 식염수/Tween20, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 0.01% Tween20, pH 7.4)로 세척하고 1시간 동안 실온에서 TS-B-완충액 (트리스-식염수/BSA 완충액; 20 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl2, pH 7.5, 1% BSA)으로 차단하였다. 중간에, 화합물 및 내부 표준의 희석 시리즈를 가외 플레이트에서 제조하였다. 검정 플레이트를 PBS-T로 3회 세척한 후, 50 μL의 희석 시리즈를 각 웰로 옮겼다. TS-B-완충액 중의 인간 재조합 인테그린 αvβ3 (R&D Systems, 1 μg/mL)의 50 μL 용액을 웰에 옮기고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-T 완충액으로 3회 세척한 후, 일차 항체 항-αvβ3을 플레이트에 첨가하였다. 인큐베이션 및 PBS-T로 3회 세척한 후, 이차 항-IgG 과산화효소-표지화된 항체를 플레이트에 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-T로 3회 세척한 후, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB)을 빠르게 첨가함으로써 플레이트를 전개시키고 5분 동안 어두운 곳에서 인큐베이션하였다. 반응을 3 M H2SO4로 중단시키고, 흡광도를 450 nm에서 플레이트 판독기 (Victor3, Perkin Elmer)를 사용하여 측정하였다.
대표적인 화합물 1 및 3의 IC50을 이중으로 테스트하였고, 결과적으로 얻어진 억제 곡선을 윈도우용 GraphPad Prism 버전 4.0 (GraphPad Software)을 사용하여 분석하였다. 변곡점은 IC50 값을 규정한다. 모든 실험을 내부 표준으로서 c(RGDfK)를 사용하여 수행하였다.
c(RGDfK)에 (즉 화합물 1) 또는 c(RGD)아자에 (즉 화합물 3) 결합된 테스트된 분자 프로브는, 표 4에서 보고된 것과 같이, 인간 αvβ3 수용체에 대해 비슷한 친화도, 및 콘쥬게이션되지 않은 참조 펩타이드 모방물 c(RGDfK)에 대해 유사한 친화도를 보였다.
펩타이드 모방물 c(RGDfK)과 비교된 화합물 1 및 3의 인간 α v β 3 인테그린 수용체에 대한 결합 친화도.
화합물 수용체 친화도 (IC 50 , nM)
c(RGDfK) 2.69 ± 0.70
화합물 1 2.96 ± 0.49
화합물 3 2.64 ± 0.35
소분자 콘쥬게이트
소분자 콘쥬게이트의 예로서, CAIX 효소를 향한 대표적인 콘쥬게이트의 억제 활성을 상업적으로 이용 가능한 열량측정 키트 K473 (BioVision)을 사용하여 평가하였다. 프로토콜을 제조사의 설명서를 따라 수행하였고, 콘쥬게이트의 억제 효능 (절반 최대 억제 농도, IC50)을 콘쥬게이션되지 않은 아세타졸아미드의 그것과 비교하였다. 간단하게 설명하면, 키트는 발색 생성물을 방출하는 에스테르 기질에 미치는 활성 탄산 무수효소 효소의 에스테라제 활성을 활용한다. 방출된 생성물은 흡광도 마이크로플레이트 판독기 (흡광도: 405 nm)를 사용하여 정량화된다. 아세타졸아미드 및 식 (I)의 콘쥬게이트에 대해서와 같이 탄산 무수효소 특이적 억제제의 존재 하에, 효소는 그것의 활성을 잃어버리고 흡광도의 감소를 초래한다. 식 (I)의 소분자 콘쥬게이트는 효소 탄산 무수효소에 대해 높은 억제 효능을 보였는데, IC50 값은 콘쥬게이션되지 않은 아세탁솔아미드의 그것과 비슷한 낮은 나노몰 범위였다 (아세타졸아미드: 3.7 nM; 화합물 11: 6.5 nM; 화합물 12: 1.2 nM).
단백질 분자 콘쥬게이트
단백질 분자 콘쥬게이트의 예로서, 대표적인 EGFR-결합 콘쥬게이트의 수용체 친화도를 AlphaLISA 키트 AL366H (Perkin Elmer)를 사용하여 평가하였다. 이 AlphaLISA 검정에서, 비오티닐화된 EGF는 스트렙타비딘-코팅된 알파 도너 비드에 결합하는 한편, EGFR-Fc는 안-인간 IgG Fc-특이적 AlphaLISA 억셉터 비드에 의해 포획된다. EGF가 EGFR에 결합될 때, 도너 비드 및 억셉터 비드는 밀접하게 근접하게 된다. 도너 비드의 여기는 싱글렛 산소 분자의 방출을 자극하여 억셉터 비드의 에너지 전달의 캐스케이드를 촉발시켜서, 615 nm에서 광 방출의 예리한 피크를 초래한다. 실험을 콘쥬게이트의 상대적인 미표지 분자 벡터에 대한 친화도를 비교함으로써 수행하였다. EGFR 수용체에 결합하지 않는 미표지된 항체 트라스투주맙(Trastuzumab)을 음성 대조군으로서 사용하였다. 샘플 (화합물 9 및 화합물 10, 및 각각 상대적인 미표지된 분자 벡터 파니투무맙 및 세툭시맙)의 희석 시리즈를 30분 동안 EGFR 억셉터 비드와 인큐베이션한 후, 30분 동안 비오티닐화된 EGF와 함께 인큐베이션하였다. 그로써, 스트렙타비딘-콘쥬게이션된 도너 비드가 플레이트에 첨가되었고 그것을 30분 동안 인큐베이션하였다. 흡광도를 플레이트 판독기 (EnSight, Perkin Elmer)를 사용하여 615 nm에서 측정하였다. 항체 트라스투주맙에 대해 특이적 결합은 관찰되지 않았다. 상이하게, 특이적 수용체 결합이 화합물 9 (IC50, 0.2 nM) 및 화합물 10 (IC50, 0.4 nM)에 대해 관찰되었고, 이것은 각각 표지화되지 않는 부모 항체 파니투무맙 (IC50, 0.5 nM) 및 세툭시맙 (IC50, 0.4 nM)과 비슷하였다. 예상 외로, 세툭시맙 및 파니투무맙과 같은 큰 분자는 발명의 염료와 콘쥬게이션된 후에도 천연 항원 결합 특성을 유지한 것으로 나타났다.
전체적으로, 이들 결과는 소분자, 펩타이드/펩타이드 모방물 또는 단백질 모이어티 중 어느 하나의 식 (II)의 염료 화합물에 대한 콘쥬게이션이 최종 화합물 (I)의 표적에 대한 결합 친화도를 손상시키지 않는 것을 입증한다.
실시예 15: 세포 흡수
인간 흑색종 세포주 WM-266-4 (ATCC, CRL-1676)를 이들 세포의 막 상에서의 인테그린 수용체, 특히 αvβ3의 고발현을 토대로, 대표적인 인테그린-결합 화합물 1 및 3의 세포 흡수를 평가하기 위한 시험관내 모델로서 사용하였다 (Capasso et al., PlosOne 2014).
약 70% 합류의 부착 세포를 화합물 1 또는 3 (1 μM)과 함께 2시간 동안 37℃ (5% CO2)에서 10% FBS, 2 mM 글루타민, 100 IU/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 둘베코 변형 이글스 배지 (DMEM)의 존재 하에 인큐베이션하였다. PBS로의 2회 세척 단계 후에, 세포를 PBS 중의 0.1 mM EDTA를 사용하여 탁착시키고, 원심분리하고 유동 세포분석 실험을 위해 완충액 (PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3)에 현탁시켰다. 형광 활성 세포 분류 (FACS)를 사용하여 세포 흡수의 척도로서 세포 내에서의 형광 신호를 검출하였다. 샘플을 아르곤 레이저로 여기시키고 방출을 670 nm 롱패스 필터를 사용하여 검출하였다. 형광 강도의 값을 기기 소프트웨어에 의해 생성된 히스토그램 통계로부터 얻었다.
수용체-매개 세포 흡수의 특이성을 평가하기 위하여, 세포를 경쟁자로서 고농도 (100 μM)의 미표지 분자 벡터 c(RGDfK)의 존재 하에 분자 프로브와 함께 인큐베이션함으로써 실험을 수행하였다. 경쟁자의 부재 하에 형광 강도의 값을 100%로 고려하여 잔류 내재화를 계산하였다.
나아가, 세포 흡수에 미치는 생물학적 유체의 영향을 평가하기 위하여, 세포를 남성 AB 혈장으로부터의 인간 혈청 (Sigma Aldrich, H4522) 또는 인간 알부민 (Sigma Aldrich, A9511)의 존재 하에 발명의 화합물과 함께 인큐베이션하는 병렬 실험을 수행하였다. 혈청의 부재 하에 형광 강도의 값을 100%로 고려하여 잔류 내재화를 계산하였다. 그러한 흡수 평가는 또한, 관심의 조직 및 표적화된 특정 수용체에 도달하기 전에 혈관 구획을 통해 확산될 때, 혈장 단백질, 특히 알부민에 의해 격리되는 화합물의 백분율의 표시를 나타낸다.
표 5에서 발명의 대표적인 화합물 1 및 3의 세포 흡수 성능을 나타낸다.
본 발명의 화합물은 인간 혈청의 존재 하에 또는 4% HSA (화합물 1, 잔류 흡수 70%)의 존재 하에 높은 세포 흡수를 나타낸 한편, 그것들은 경쟁자로서 벡터 c(RGDfK)의 존재 하에 낮은 잔류 흡수를 나타냈다 (화합물 1, 잔류 흡수 10%; 화합물 3, 잔류 흡수 15%). 그러므로, 본 발명의 화합물의 경우, 세포에서의 내재화가 수용체-매개되며 인간 혈청 단백질, 특히 알부민에의 결합에 의해 단지 약간 영향을 받는 것 (약 10-20%의 잔류 흡수)이 관찰되며, 본 발명의 화합물의 인간 알부민에 대한 중간 내지 낮은 결합 친화도를 확인시켜준다 (실시예 10에서 제시된 바, KA = 약 1-6 x 103 M-1).
더욱이, 표 5는 화합물 1 및 3의 경우 인간 혈청의 존재 하에 잔류 세포 흡수를, ICG-RGD에 대한 것과 동일한 방법으로 제조된 참조 화합물 DA364, ICG-RGD (Capozza et al., Photoacoustic 2018, 11, 36-45) 및 ICG-c(RGDfK)와 비교한 것을 보고한다. 이들 결과는 본 발명의 화합물이 놀랍게도 기술분야에 알려져 있는 유사한 화합물과 관련하여 세포 내재화에 있어 더 높은 효능을 부여받았음을 나타낸다.
인간 혈청의 존재 하에 WM-266-4 인간 흑색종 세포로의 인테그린-결합 형광 프로브의 흡수.
화합물 인간 혈청의 존재 하에 잔류 세포 흡수
Cy5.5-cRGD (DA364) 15%
ICG-cRGD 12%
ICG-c(RGDfK) 8%
화합물 1 80%
화합물 3 75%
특히, 세포 표면 상에서 본 발명의 화합물의 수용체와의 상호작용이나, 세포 내에서 수용체-프로브 복합체의 내재화는 어느 것도 콘쥬게이션된 염료의 구조, 특히 매우 친수성이고 높은 입체 장애를 가진 모이어티의 화합물의 위치 R1 및 R2의 존재에 의해 손상되지 않았다. 그러므로, 콘쥬게이션된 염료 상의 친수성 모이어티의 존재는 혈장 단백질 및 알부민의 존재 하에서도 매우 효율적이고 특이적인 수용체 결합 및 프로브 내재화를 제공하며, 그것은 친수성 모이어티가 없고 결합 효율에 부정적으로 영향을 미칠 콘쥬게이트를 격리시킬 것이다.
실시예 16 : 생체내 분포 및 제거
발명의 형광제의 생체내 분포 및 제거를 생후 6-10주령의 수컷 Balb/c nu/nu 마우스 (Charles River Laboratories)에서 정맥내 투여 후 광학 이미징에 의해 평가하였다.
간단하게 설명하면, 케이지당 4마리의 마우스를 하우징하고 순응 기간 (5일)이 끝날 때까지 VRF1 (P) 멸균 식단 (Special Diets Services Ltd)을 공급하였다. 그런 후, 자가 형광을 감소시키는 특수 식단인 조사된(irradiated) AIN-76a 설치류 식단 (연구 식단)을 실험이 끝날 때까지 사용하였다. 이미징 실험을 전임상 광학 시스템 IVIS 스펙트럼 (Perkin Elmer)을 사용하여 수행하였다.
생체내 이미징을 가스 마취 (산소 중의 세보플루오란 6-8%) 하에서 수행하였다. 동물을 화합물로 정맥내 주입하고 투여 후 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 및 24시간 후에 세로 방향으로 이미지화하였다. 그로써, 동물을 마취 과용량에 의해 안락사키시고, 관심의 주요 조직 및 장기를 생체외 광학 이미징을 위해 절개하였다. 모든 시점에서 각각의 형광 이미지에 대해 관심 영역 (ROI)을 관심의 조직 위에 그려서 신호 강도 (평균 복사 효율로서 표시됨)를 평가하였다. 그런 후 근육 (배경 조직)에서의 형광 신호와 배설 장기 (신장, 간)에서의 형광 신호 사이의 비율을 계산하여 대비를 평가하였다. 조직 반감기를 GraphPad Prism 소프트웨어 (윈도우용 버전 5)를 사용하여 근육에서의 형광 신호 감쇠를 이중 지수 감쇠 방정식 모델로 피팅함으로써 계산하였다.
화합물 1의 조직 동역학을 도 1에 도시하며, 여기서 근육 조직에서의 형광 신호를 시간 대비하여 플롯화하여 상이한 용량에서 생성물의 세척을 평가하였다. 뚜렷하게, 화합물 1은 빠른 조직 세척과 함께 매우 유리한 제거 동역학을 보였고 신체 제거를 개선시켰는데, 특히 그것은 모든 테스트된 용량 (0.3, 1, 3 nmol/마우스)에서 매우 짧은 (< 1시간) 조직 반감기를 나타냈다. 화합물은 신체에서 빠르게 분포하였고 방광에 축적되었는데, 신장 제거를 시사한다. 더욱이, 그것은 빠른 신체 제거 및 낮은 체류를 나타냈고, 이것은 유리하게도 투여 후 조기 이미징을 가능하게 한다.
표 6은 절개된 배설 장기 (간 및 신장) 대비 근육에서 1 nmol/마우스의 화합물 1 또는 3의 정맥내 (iv) 투여 후 24시간 후의 광학 이미징에 의해 검출된 형광 신호 사이의 비율을 나타낸다.
절개된 장기 및 조직의 생체외 이미징은 배설 장기인 신장 및 간에서, 더 빠른 신체 제거 및 감소된 비특이적 축적과 관련된, 화합물 1 및 3의 매우 낮은 체류를 드러냈다.
정맥내 투여 후 24시간 후의 배설 장기 및 근육에서의 형광 신호 감쇠 사이의 비율.
화합물 신장 대 근육 비율 간대 근육 비율
화합물 1 3.18 ± 0.32 2.92 ± 0.21
화합물 3 2.90 ± 0.55 2.50 ± 0.32
실시예 17 : 종양 흡수
본 발명의 화합물의 종양 흡수를 마우스에서 정맥내 투여 후 광학 이미징에 의해 평가하였다.
종양 흡수 실험을 인테그린 수용체, 특히 αvβ3을 과다발현하는 인간 교모세포종 (피하)의 동물 모델에서 수행하였다. 간단하게 설명하면, 인간 교모세포종 U87MG 세포 (ATCC, HTB-14)를 10% 소 태아 혈청 (FBS), 2 mM 글루타민, 100 IU/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 이글스 최소 필수 배지 (EMEM)에서 배양하였다. 생후 4-6주령의 수컷 Balb/c nu/nu 마우스 (Charles River Laboratories)에 0.1 mL의 EMEM에 현탁된 약 1 x 107개의 세포로 피하 이식 (우측 옆구리)을 진행하였다. 마우스를 사료와 물이 임의대로 공급되는 케이지당 4마리씩 하우징하였다. 동물에게 순응 기간 (5일)이 끝날 때까지 VRF1 (P) 멸균 식단 (Special Diets Services Ltd)을 공급하였다. 그런 후, 자가 형광을 감소시키는 특수 식단인 조사된 AIN-76a 설치류 식단 (연구 식단)을 실험이 끝날 때까지 사용하였다. 종양 성장을 최대 300-600 mm3의 표적 크기 (세포 이식 후 3-4주)까지 캘리퍼스를 사용하여 세로방향 평가에 의해 모니터링하였다. 이미징 실험을 전임상 광학 시스템 IVIS 스펙트럼 (Perkin Elmer)을 사용하여 수행하였다.
생체내 이미징을 가스 마취 (산소 중의 세보플루오란 6-8%) 하에서 수행하였다. 동물을 화합물로 정맥내 주입하고 (측면 꼬리 정맥) 투여 후 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 및 24시간 후에 세로 방향으로 이미지화하였다. 모든 시점에서 각각의 형광 이미지에 대해 관심 영역 (ROI)을 관심의 조직 위에 그려서 신호 강도 (평균 복사 효율로서 표시됨)를 평가하였다. 그런 후 종양 및 근육 (배경 조직)에서의 형광 신호 사이의 비율을 계산하여 대비를 평가하였다.
종양 및 근육 조직에서의 대표적인 화합물 1의 형광 감쇠 값 및 종양 대 배경 비율을 도 2에 도시한다. 이들 결과는 매우 높은 종양 대 배경 대비 (TBR 약 2-2.5) 및 건강한 조직에서의 낮은 체류를 제공하며, 종양-특이적 축적을 시사하는, 초기 시점 (투여 후 1-2시간 후)에서 이미 대표적인 화합물 1에 대한 현저하게 높은 종양 흡수를 보인다.
실제로, 본 발명의 화합물은 신체로부터, 특히 건강한 조직 (근육)으로부터 빠르게 제거된 한편, 상당한 표적-매개 축적이 표적화된 조직에서 식 (I)의 콘쥬게이션된 염료에 대해 관찰될 수 있다.
병렬 실험을 인간 두경부암 (정위)의 동물 모델에서, 특히 인테그린 수용체 αvβ3을 과다발현하는 디트로이트-562 세포를 사용하여 수행하였다. 간단하게 설명하면, 인간 인두 암종 세포 디트로이트-562 (ATCC, CCL-138)를 10% 소 태아 혈청 (FBS), 2 mM 글루타민, 100 IU/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 이글스 최소 필수 배지(EMEM)에서 배양하였다. 생후 4-6주령의 수컷 Balb/c nu/nu 마우스 (Charles River Laboratories)에 0.03 mL의 다이 EMEM에 현탁된 약 2.5 x 106개의 세포로 혀의 앞부분에 정위 이식을 진행하였다. 마우스를 사료와 물이 임의대로 공급되는 케이지당 4마리씩 하우징하였다. 동물에게 순응 기간 (5일)이 끝날 때까지 VRF1 (P) 멸균 식단 (Special Diets Services Ltd)을 공급하였다. 그런 후, 자가 형광을 감소시키는 특수 식단인 조사된 AIN-76a 설치류 식단 (연구 식단)을 실험이 끝날 때까지 사용하였다. 종양 성장을 최대 10-20 mm3의 표적 크기 (세포 이식 후 7-10일)까지 캘리퍼스를 사용하여 세로방향 평가에 의해 모니터링하였다. 이미징 실험을 전임상 광학 시스템 IVIS 스펙트럼 (Perkin Elmer)을 사용하여 수행하였다.
동물을 3 nmol/마우스로 정맥내 주사하였고 (측면 꼬리 정맥), 투여 후 24시간째에 마취 과다용량에 의해 안락사되었고, 혀를 생체외 광학 이미징을 위해 절개하였다. 관심 영역 (ROI)을 혀의 앞부분 (종양 세포 이식 부위)에 및 후방 영역 (건강한 조직)에 그려서 종양 대 배경 비율을 이끌어냈다. 한 마리의 건강한 동물 (종양 이식 없음)에게 3 nmol/마우스의 화합물 1을 투여하였고 상기 기술된 것과 같이 이미지화하여 음성 대조군으로서 사용하였다.
화합물 1의 투여 후 24시간 후에 수행한 생체외 이미징은 종양 세포를 이식한 혀 부위에서 밝은 영역을 드러냈다. 상이하게, 혀 뒷부분의 건강한 영역은 건강한 마우스에서 검출된 것과 유사한 낮은 신호를 보였고, 이것은 건강한 조직에서의 낮은 체류를 시사한다. 발명의 화합물의 투여는 높은 종양 대 배경 대비를 보인 종양의 이치를 드러낸다 (도 3에서 도시된 바와 같음).
병렬 실험을 저수준의 인테그린 수용체를 발현하는 HT-29 세포를 사용하여 인간 대장암 (피하)의 동물 모델에서 수행하였다. 간단하게 설명하면, 인간 대장 선암종 세포 HT-29 (ATCC, HTB-38)를 10% 소 태아 혈청, 2 mM 글루타민, 100 IU/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 맥코이 5A 배지에서 배양하였다. 생후 4-6주령의 수컷 무흉선 누드 마우스 (Envigo)에 0.1 mL의 혈청-유리 배지에 현탁된 약 5 x 106개의 세포로 피하 이식 (우측 옆구리)을 진행하였다. 마우스를 사료와 물이 임의대로 공급되는 케이지당 4마리씩 하우징하였다. 동물에게 순응 기간 (5일)이 끝날 때까지 VRF1 (P) 멸균 식단 (Special Diets Services Ltd)을 공급하였다. 그런 후, 자가 형광을 감소시키는 특수 식단인 조사된 AIN-76a 설치류 식단 (연구 식단)을 실험이 끝날 때까지 사용하였다. 종양 성장을 최대 300-600 mm3의 표적 크기 (세포 이식 후 3-4주)까지 캘리퍼스를 사용하여 세로방향 평가에 의해 모니터링하였다. 이미징 실험을 전임상 광학 시스템 IVIS 스펙트럼 (Perkin Elmer)을 사용하여 수행하였다.
생체내 이미징을 가스 마취 (산소 중의 세보플루오란 6-8%) 하에서 수행하였다. 동물을 관심의 화합물로 정맥내 주입하고 (측면 꼬리 정맥), 투여 후 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 및 24시간 후에 세로 방향으로 이미지화하였다. 모든 시점에서 각각의 형광 이미지에 대해 관심 영역 (ROI)을 관심의 조직 위에 그려서 신호 강도 (평균 복사 효율로서 표시됨)를 평가하였다. 그런 후 종양 및 근육 (배경 조직)에서의 형광 신호 사이의 비율을 계산하여 대비를 평가하였다.
종양 및 조직에서의 형광 감쇠 값 및 종양 대 배경 비율을 화합물 1에 대해 도 4에 도시한다.
이들 결과는 초기 시점에서 이미 대표적인 화합물 1에 대한 높은 종양 흡수 및 건강한 조직으로부터의 빠른 제거와, 그 결과 건강한 배경으로부터 종양 조직을 선명하게 묘사하기에 충분한 적당한 종양 대 배경 비율 (TBR 약 1.2-1.5)이 초래되는 것을 보여준다.
대표적인 화합물 1의 표적 특이성을 상기에서 기술된 것과 같이 인간 인테그린 수용체 αvβ3을 과다발현하는 인간 암의 동물 모델에서 참조 화합물 DA364의 그것과 비교하였다. 두 화합물을 모두 1 nmol/마우스의 용량으로 과량의 미표지 cRGD 펩타이드 모방물 (200 nmol/마우스)과 함께 (차단 그룹) 또는 없이 (대조군 그룹) 투여하였다. 주사 후 24시간 후, 마우스를 안락사시키고, 종양 조직을 절개하고 IVIS 스펙트럼 형광 시스템 (Perkin Elmer)을 사용하여 이미지화하였다. 차단 프로토콜은 DA364가 투여된 동물의 종양 조직에서 형광 신호 강도의 10% 감소 (흡수의 이미징 대리)를 촉발시켰다. 상이하게, 차단 프로토콜은 화합물 1을 받은 동물의 종양에서 형광의 75% 감소를 촉발시켰고, 발명의 화합물에 대한 더 높은 생체내 수용체 특이성을 나타냈다 (표 7 참고).
차단 실험에 의핸 생체내 특이성의 측정.
화합물 수용체 차단 후 종양 형광의 감소
DA364 (참조) 10% (n=5/그룹)
화합물 1 75% (n=5/그룹)
참고문헌
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Claims (15)

  1. 식 (I)의 화합물 또는 그것의 제약학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00030

    식에서
    R1 및 R2는 독립적으로 -CO-NH-Y 기이고, 여기서 Y는 적어도 2개의 하이드록실 기에 의해 치환된 선형 또는 분지된 알킬, 사이클로알킬 및 헤테로사이클릴로부터 선택되며;
    R3은 -NH2, -SO3H, -COOH 및 -CONH2로부터 선택된 기에 의해 치환된 선형 또는 분지된 알킬이고;
    R4는 선형 또는 분지된 이가 알킬이며;
    R5는 -COO- 및 -CONH-로부터 선택되고;
    S는 스페이서이며;
    T는 표적화 모이어티이고;
    n은 1, 2 또는 3과 동등한 정수이며; 그리고
    m은 0 또는 1과 동등한 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, n은 3이고, R3은 -SO3H에 의해 치환된 알킬이며, R1 및 R2는 독립적으로 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 식 (I)의 화합물:
    Figure pct00031
    ,
    Figure pct00032
    ,
    Figure pct00033
    ,
    Figure pct00034
    ,
    Figure pct00035
    및
    Figure pct00036
    .
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 식 (Ia)로 표시되는 것을 특징으로 하는 식 (I)의 화합물:
    Figure pct00037

    식에서 R4, R5, S, m 및 T는 제1항에서 정의된 것과 같다.
  4. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, S는 -NH(CH2)pCOO-, -NH(CH2CH2O)pCH2CH2COO- 및 -NH(CH2CH2O)pCH2CH2NH-로부터 선택되고, 여기서 p는 0 내지 20의 정수인 것을 특징으로 하는 식 (I)의 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, T는 소분자, 단백질, 펩타이드, 펩타이드 모방물, 효소 기질, 항체 또는 그것의 단편 및 압타머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 표적화 모이어티인 것을 특징으로 하는 식 (I)의 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, T는 인테그린 수용체와 상호작용하는 모이어티인 것을 특징으로 하는 식 (I)의 화합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 개별 환자의 유도 수술에서 종양 가장자리의 검출 및 경계 지정을 위한 형광 조영제로서 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 식 (I)의 화합물.
  8. 제7항에 있어서, 종양 가장자리의 검출 및 경계 지정은 NIR 방사선 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 식 (I)의 화합물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 종양은 뇌암, 유방암, 두경부암, 난소암, 전립선암, 식도암, 피부암, 위암, 췌장암, 방광암, 구강암, 폐암, 신장암, 자궁암, 갑상선암, 간암, 및 대장암으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 식 (I)의 화합물.
  10. 제1항에서 정의된 식 (I)의 화합물 및 적어도 하나의 제약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약학적 진단 조성물.
  11. 광학 이미징을 실행하기 위해 제1항에서 정의된 식 (I)의 화합물을 그것의 추가 보조제와 함께 포함하는 진단 키트.
  12. 제1항에 있어서, 하기 식으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 식 (I)의 화합물:
    Figure pct00038

    및
    Figure pct00039
    .
  13. 식 (II)의 중간체 화합물 또는 그것의 제약학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00040

    식에서
    R1, R2, R3, R4 및 n은 제1항에서 정의된 것과 같고
    R5'는 -COOH, -CONH2, -COO-Pg 및 -CONH-Pg로부터 선택되며, 여기서 Pg는 보호기이다.
  14. 제13항에 있어서, n은 3이고, R3은 -SO3H에 의해 치환된 알킬이며, R1 및 R2는 독립적으로 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 식 (II)의 중간체:
    Figure pct00041
    ,
    Figure pct00042
    ,
    Figure pct00043
    ,
    Figure pct00044
    ,
    Figure pct00045
    및
    Figure pct00046
    .
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 식 (IIa)로 표시되는 것을 특징으로 하는 식 (II)의 중간체:
    Figure pct00047

    식에서 R4 및 R5'는 제13항에서 정의된 것과 같다.
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