ES2575367T3 - Inhibidores de anhidrasa carbónica y método de su producción - Google Patents

Abstract

Compuestos de fórmula general I**Fórmula** en la que el sustituyente X puede seleccionarse independientemente de un grupo que comprende BH, CH, BR1 y CR1, mientras que simultáneamente como mucho cuatro X, preferiblemente como mucho tres X, pueden ser CH o CR1 y mientras que está presente al menos un grupo BR1 o CR1; R1 en al menos un sustituyente X se selecciona de un grupo que comprende A-NHSO2NH2, A-SO2NH2 y AO- SO2NH2, y R1 en otros sustituyentes X puede seleccionarse independientemente de un grupo que comprende A-NHSO2NH2, A-SO2NH2, A-OSO2NH2, alquilo C1-C8, alquenilo C2-C8, arilo C6-C10, alquinilo C2- C8, heteroarilo C4-C10 que contiene un heteroátomo O, S o N, alcoxilo C1- C8, alquilhidroxilo C1-C8, alquilmercapto C1-C8, OH, NH2, NH3 +, alquilamonio C1-C8, alquilamino C1-C8, halógeno; A se selecciona de un grupo que comprende un enlace sencillo o cadena de hidrocarburo C1-C10 lineal bivalente, en el que al menos un átomo de carbono puede sustituirse opcionalmente por heteroátomos seleccionados de un grupo que comprende N, S, O, o por heteroarileno C4-C10, en el que el heteroátomo se selecciona de O, N y S; Y es MR2, o Y no está presente; M es un metal del grupo VIB o VIIIB de la tabla periódica, preferiblemente Cr, Fe, Ru o Co; R2 se selecciona de un grupo que comprende una estructura de fórmula general II**Fórmula** en la que X es tal como se definió anteriormente mientras que simultáneamente como mucho tres X pueden ser CH o CR1; R1 se selecciona independientemente de un grupo que comprende A-O-SO2NH2, A-SO2NH2, A-NHSO2NH2, alquilo C1-C8, alquenilo C2-C8, arilo C6-C10, alquinilo C2-C8, heteroarilo C4-C10 que contiene O, S o N como heteroátomo, alcoxilo C1-C8, alquilhidroxilo C1-C8, alquilmercapto C1-C8, OH, NH2, NH3 +, alquilamonio C1-C8, alquilamino C1-C8, halógeno, y A es tal como se describió anteriormente, ciclopentadienilo con enlace en η5, opcionalmente sustituido con de 1 a 5 metilos, y anillo de fenilo con enlace en η6, que lleva opcionalmente desde 1 hasta 6 grupos alquilo C1-C6; Z es H o no está presente; mientras que desde uno hasta tres Z son H sólo cuando Y no está presente; en la que alquilo indica un resto de hidrocarburo C1 - C8 lineal o ramificado que no comprende múltiples enlaces, que puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de un grupo que comprende OH, halógeno, NH2, COOH, CONH2, CN, NO2, SH; alquenilo indica una cadena de hidrocarburo C2 - C8 lineal o ramificada, que comprende al menos un doble enlace, que puede estar opcionalmente sustituida con uno o más sustituyentes seleccionados de un grupo que comprende OH, halógeno, NH2, COOH, CONH2, CN, NO2, SH, SO3H; alquinilo indica una cadena de hidrocarburo C2 - C8 lineal o ramificada, que comprende al menos un triple enlace y opcionalmente también al menos un doble enlace, que puede estar opcionalmente sustituida con uno o más sustituyentes seleccionados de un grupo que comprende OH, halógeno, NH2, COOH, CONH2, CN, NO2, SH, SO3H; arilo indica un grupo carbocíclico aromático C6 - C10, que comprende al menos un anillo aromático o anillos aromáticos condensados, que puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de un grupo que comprende OH, halógeno, NH2, COOH, CONH2, CN, NO2, SH, SO3H; heteroarilo indica un grupo carbocíclico aromático C4 - C10, que comprende al menos un anillo aromático o anillos aromáticos condensados, en el que al menos un átomo de carbono se sustituye por un heteroátomo seleccionado de un grupo que comprende N, S, O, que puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de un grupo que comprende OH, halógeno, NH2, COOH, CONH2, CN, NO2, SH, SO3H; alcoxilo indica un grupo monovalente derivado de alcohol C1 - C8 mediante la separación de un átomo de hidrógeno de un grupo hidroxilo; alquilamino es un grupo creado mediante una sustitución de uno o dos átomos de hidrógeno de un grupo amino por alquilo C1 - C8; alquilmercapto es un grupo monovalente derivado de tiol C1 - C8 mediante la escisión de un átomo de hidrógeno de un grupo SH; halógeno es átomo de flúor, cloro, bromo o yodo; cadena de hidrocarburo C1-C10 lineal bivalente se refiere a una cadena que contiene enlaces sencillos, opcionalmente también dobles enlaces, que se une mediante carbonos terminales; y sus sales y solvatos farmacéuticamente aceptables.

Description

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átomos de carbono pueden reemplazarse por heteroátomos elegidos de un grupo que comprende N, S, O, o por heteroarileno C4-C10, en el que un heteroátomo se elige de O, N o S; Y es MR3, o Y no está presente; M es un metal del grupo VIB o VIIIB de la tabla periódica, preferiblemente Cr, Fe, Ru o Co; R2 se selecciona de un grupo que comprende una estructura de fórmula general II

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en la que X es tal como se definió anteriormente, mientras que como mucho tres X pueden ser simultáneamente CH

o CR1; R1 se selecciona independientemente de un grupo que comprende A-O-SO2NH2, A-SO2NH2, A-NHSO2NH2, alquilo C1-C8, alquenilo C2-C8, arilo C6-C10, alquinilo C2-C8, heteroarilo C4-C10 que contiene O, S o N como

15 heteroátomo, alcoxilo C1-C8, alquilhidroxilo C1-C8, alquilmercapto C1-C8, OH, NH2, NH3+, alquilamonio C1-C8, alquilamino C1-C8, halógeno, en los que A es tal como se describió anteriormente, ciclopentadienilo con enlace en 5, opcionalmente sustituido con de 1 a 5 metilos y anillo de fenilo con enlace en 6, que lleva opcionalmente desde 1 hasta 6 grupos alquilo C1-C6; Z es H o no está presente; mientras que desde uno hasta tres Z son H sólo cuando Y no está presente,

20 se tratan mediante una sulfamida de fórmula H2NSO2NH2.

La reacción se lleva a cabo preferiblemente en un disolvente orgánico, especialmente en un disolvente orgánico preferiblemente seleccionado de un grupo que comprende dioxano, dimetilformamida, dimetil éter y dimetil éter de

25 dietilenglicol, mientras que el grupo amino se sustituye por grupo sulfamida.

El objeto de la invención también es un método de preparación del compuesto [8,8’--(CH2O(CH3))-(1,2-C2B9H10)2-3-CO] como producto intermedio para la producción de compuestos de fórmula general I, en el que una suspensión de sal de bis(dicarballuro) de cobalto en disolvente orgánico que es por ejemplo 1,2-dicloroetano se trata mediante

30 para-formaldehído o formaldehído en presencia de ácido inorgánico fuerte, seleccionado de HCl, H2SO4 y HSO3CF3, y el producto se aísla entonces mediante extracción y cromatografía o se usa en mezcla con otros productos eléctricamente neutros de la reacción directamente para la producción de compuestos de fórmula general I.

El objeto de la invención también es un método de producción de un compuesto de fórmula general I, caracterizado

35 porque compuestos conocidos de fórmula [(HO-(CH2)n)m(C2B9H11-p)2Co]-en la que n = 1-3, m = 1 ó 2, p= 0 ó 1 desprotonados por Cs2CO3, hidruro de sodio o terc-butóxido de potasio, se tratan mediante cloruro de sulfamoílo de fórmula general Cl-SO2NH2 en disolvente orgánico seleccionado de dioxano, dimetilformamida, tetrahidrofurano, dialquil éter de etilenglicol y dialquil éter de dietilenglicol, o en mezcla de disolvente orgánico con tolueno, xileno, cimeno o cumeno, en los que átomos de oxígeno terminales se sustituyen por grupo sulfamoílo.

40 El objeto de la invención también es un método de preparación de un compuesto de fórmula general I, en el que el compuesto de fórmula [8,8’--(CH2O(CH3))-(1,2-C2B9H10)2-3-Co] tal como se describió anteriormente, que lleva el sustituyente de puente {-O+(CH3)-CH2-} entre dos átomos de boro en metalocarborano, o compuestos conocidos sustituidos con anillo de dioxano o tetrahidropirano, que son [(8-O(CH2CH2)2O)-(1,2-C2B9H10)(1’,2’-C2B9H11)-3,3’-Co]

45 o [(8-(CH2)50-(1,2-C2B9H10)(1’,2’-C2B9H11)-3,3’-Co], que también comprenden un átomo de oxonio reactivo, se tratan mediante sulfamida en un disolvente orgánico seleccionado de dioxano, dimetilformamida, tetrahidrofurano, dialquil éter de etilenglicol y dialquil éter de dietilenglicol o en una mezcla de un disolvente orgánico con tolueno, xileno, cimeno o cumeno, en el procedimiento se produce una apertura del anillo así como una sustitución en posición terminal con un grupo sulfamida.

50 El objeto de la invención también es un método de preparación de compuesto de fórmula general I en el que el carborano icosaédrico 1,2-C2B10H12 que tiene átomos de carbono en posición vecinal, de los que al menos uno está sustituido con un grupo amino, se trata mediante una sulfamida en un disolvente seleccionado de dioxano, dimetilformamida, dimetil éter o en dialquil éteres de etilenglicol o en dialquil éteres de dietilenglicol en el que Y que

55 es BH se divide y simultáneamente se sustituye un grupo amino terminal por un grupo sulfamida y se sustituye un átomo de boro por un grupo de puente Z en el que Z es H.

El objeto de la invención también es un método de preparación de C-aminoderivados de fórmula [(H2N-(CH2)nC2B9H10)(C2B9H11)Co] como precursores de compuestos de fórmula general I, caracterizado porque una sal anhidra

60 de metalocarborano icosaédrico [(C2B9H11)2Co] se trata mediante R3Li, en el que R3 se selecciona de metilo, butilo,

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fenilo y t-butilo, en dimetil éter o dietil éter de etilenglicol y, tras establecerse un equilibrio, mediante bromo-o yodoalquilamina con un grupo amino protegido, en el que el grupo protector es ftalimida, bis(trimetilsililo) o t-Bu-carbonilo, se aíslan los productos mediante cromatografía de líquidos y cristalización y después se escinde el grupo protector usando etilendiamina o mediante acción de un agente reductor tal como NaBH4, ácido o reactivo alcalino.

El objeto de esta invención es un método de producción de C-aminoderivados de fórmula [(H3N-(CH2)n)m(C2B9H11p)Co], en la que n es n=1 a 3, m= 1 ó 2, p= 0 ó 1, como precursores de compuestos de fórmula general I según la reivindicación 1, caracterizado porque C-hidroxialquilderivados conocidos de cobaltocarborano icosaédrico [(HO(CH2)n)m(C2B9H11-p)2-Co]-, en el que n es n=1 a 3, m= 1 ó 2, p= 0 ó 1, que son sales de trimetilamonio o sales de cesio, se tratan en presencia de clorhidrato de trimetilamina mediante cloruro de toluensulfonilo o mediante cloruro de trifluorometilsulfonilo o mediante anhídrido de trifluorometilsulfonilo en acetonitrilo, tetrahidrofurano o dietil éter de etilenglicol en presencia de carbonato de metal alcalino, preferiblemente carbonato de cesio, o hidruro de sodio; se aíslan los ésteres resultantes mediante recristalización o mediante disolución de producto en metanol o etanol acuoso, después precipitación de las sales de tetrametilamonio y secado a vacío y se calientan las sales así obtenidas en acetonitrilo, tetrahidrofurano o dioxano con exceso de amoniaco y finalmente se aíslan usando una cristalización, precipitación en forma de sales poco soluble tales como R4N+, en el que R es alcano de C1 a C4, y recristalización o mediante cromatografía de líquidos. Usando esta ruta pueden prepararse compuestos de alquilamonio/alquilamina tanto monosustituidos como disustituidos de la fórmula mencionada anteriormente con buenos rendimientos.

El objeto de invención también es un método de preparación de C-aminoderivado de fórmula 7-H2N-(CH2)-C2B9H10 como precursor de compuestos de fórmula general I, caracterizado porque se trata un carborano icosaédrico de fórmula 1-Br-CH2-1,2-C2B10H11 mediante amoniaco acuoso en etanol o mediante amoniaco acuoso en tolueno y después se aísla el producto mediante una cromatografía de líquidos sobre gel de sílice.

La invención se ilustrará adicionalmente mediante los ejemplos que no se interpretan como limitativos.

Breve descripción de los dibujos

En figuras 1 a 20 los átomo de carbono sustituidos en la agrupación se representan mediante una esfera gris y el grupo CH se representa mediante una esfera negra. Cada vértice sin marcar está formado por un grupo BH o átomo de B si está sustituido.

La figura 1 muestra fórmulas estructurales de compuestos descritos en los ejemplos n.º 1-11.

La figura 2 muestra fórmulas estructurales de precursores descritos en los ejemplos n.º 12-19.

La figura 3 muestra un procedimiento para la preparación de compuesto CB-2, que es 7-metilensulfamida-(7,8-nidodicarbaundecaborato) (1-), descrito en el ejemplo 1.

La figura 4 muestra un procedimiento para la preparación de compuesto CB-4, que es 8-metilensulfamida-8’-metoxi3,3’-como-bis(1,2-dicarba-3-cobalta(III)-closo-dodecaborato) (1-), descrito en el ejemplo 2.

La figura 5 muestra un procedimiento para la preparación de compuesto CB-5, que es 1-metilensulfamida-3,3’-comobis(1,2-dicarba-3-cobalta(III)-closo-dodecaborato) (1-), descrito en el ejemplo 3.

La figura 6 muestra un procedimiento para la preparación de compuesto CB-6, que es 7-metilensulfamida-8-fenil(7,8-nido-dicarbaundecaborato) (1-), descrito en el ejemplo 4.

La figura 7 muestra un procedimiento para la preparación de compuestos isoméricos CB-10, que es 10-sulfamida-9’amina-2,2’-como-(1,7,10-tricarba-1’,7’,9’-tricarba-2-ferra(II)-closo-dodecaborano) y CB-11, que es 9-sulfamida-10’amina-2,2’-como-(1,7,9-tricarba-1’,7’,10’-tricarba-2-ferra(II)-closo-dodecaborano), descritos en los ejemplos 5 y 6.

La figura 8 muestra un procedimiento para la preparación de compuesto CB-12, que es 9-sulfamida-9’-amina-2,2’como-bis(1,7,9-tricarba-2-ferra(II)-closo-dodecaborano) descrito en el ejemplo 8.

La figura 9 muestra un procedimiento para la preparación de compuesto CB-13, que es 8-propilensulfamida-7-fenil(7,8-nido-dicarbaundecaborato) (1-), descrito en el ejemplo 8.

La figura 10 muestra un procedimiento para la preparación de compuesto CB-15, que es 8-sulfamida-8-etilaminometilsulfamida-8’-metoxi-3,3’-como-bis(decahidro-1,2-dicarba-3-cobalta(III)-closo-dodecaborato) (1-), descrito en el ejemplo 9.

La figura 11 muestra un procedimiento para la preparación de compuesto CB-15, que es 8-butiloxisulfamida-3,3’como-bis(decahidro-1,2-dicarba-3-cobalta(III)-closo-dodecaborato) (1-), descrito en el ejemplo 10.

La figura 12 muestra un procedimiento para la preparación de compuesto CB-17, que es 8-dietilenoxisulfamida-3,3’como-bis(decahidro-1,2-dicarba-3-cobalta(III)-closo-dodecaborato) (1-), descrito en el ejemplo 11.

La figura 13 muestra un procedimiento para la preparación de compuesto CB-4Pre, que es un derivado en puente 5 reactivo 8,8’-m-(CH2O(CH3))-(1,2-C2B9H10)2-3-Co, descrito en el ejemplo 12.

La figura 14 muestra un procedimiento para la preparación de compuesto CB-5am, que es 1-metilenamonio-3,3’como-bis(decahidro-1,2-dicarba-3-cobalta(III)-closo-dodecaborato) (1-), descrito en el ejemplo 13.

10 La figura 15 muestra un procedimiento para la preparación de compuesto CB-6am, que es 7-aminometil-8-fenil-(7,8nido-dicarbaundecaborato) (1-), descrito en el ejemplo 14.

La figura 16 muestra un procedimiento para la preparación de compuesto CB-13am, que es 8-propilamonio-7-fenil(7,8-nido-dicarbaundecaborato) (1-), descrito en el ejemplo 15.

15 La figura 17 muestra un procedimiento para la preparación de compuesto CB-15am, que es 8-(2-aminaetil)-amonio8’-metoxi-3,3’-como-bis(1,2-dicarba-3-cobalta(III)-closo-dodecaborato) (1-), descrito en el ejemplo 16.

La figura 18 muestra un procedimiento para la preparación de compuesto CB-16am, que es 8-(5-amoniopentoxi)20 3,3’-como-bis(1,2-dicarba-3-cobalta(III)-closo-dodecaborato) (1-), descrito en el ejemplo 17.

La figura 19 muestra un procedimiento para la preparación de compuesto CB-2am, 7-metilenamonio-(7,8-nidodicarbaundecaborato) (1-), descrito en el ejemplo 18.

25 La figura 20 muestra un procedimiento para la preparación de compuesto CB-17am, que es 8-(5-amonio-3-oxapentoxi)-3,3’-como-bis(1,2-dicarba-3-cobalta(III)-closo-dodecaborato) (1-), descrito en el ejemplo 19.

En la figura 21, átomos individuales están unidos mediante barras (representación mediante modelo de barras; la barra representa un enlace covalente; no se muestra la multiplicidad de enlaces). Las líneas discontinuas en negrita

30 sin números representan enlaces de coordinación de átomos de nitrógeno al catión de zinc (esfera gris), las líneas discontinuas en negrita con números representan enlaces de hidrógeno, el número corresponde a una distancia entre el donador y el aceptor de hidrógeno en nanómetros. Codificación en colores de átomos: los átomos de carbono se muestran en negro, los átomos de nitrógeno se muestran en blanco, los átomos de oxígeno se muestran en gris oscuro, los átomos de azufre se muestran en gris claro y el catión Zn2+ se representa como una esfera gris.

35 La figura 21 muestra una interacción de compuesto CB-2 con el sitio activo de hCA II revelado mediante cristalografía de rayos X.

La figura 22 muestra fórmulas estructurales de compuestos descritos en los ejemplos n.º 20-23 (compuestos CB-25, 40 26, 29 y 30).

La figura 23 muestra fórmulas estructurales de precursores descritos en los ejemplos n.º 24, 25 (compuestos CB29am a 30am).

45 La figura 24 muestra un procedimiento para la preparación de compuesto CB-25, que es 1,1’-bis(3-sulfamoilpropil)3,3’-como-bis(1,2-dicarba-3-cobalta(III)-closo-dodecaborato) y CB-26, que es 1-(3-sulfamoil-propil)-3,3’-como(decahidro-1,2-dicarba-3-cobalta(III)-undecahidro-1’,2’-dicarba-closo-dodecaborato) (1-), sal de sodio dihidratada, descrito en el ejemplo 20.

50 La figura 25 muestra un procedimiento para la preparación de compuesto CB-29, que es 1-propilensulfamida-3,3’como-bis(1,2-dicarba-3-cobalta(III)-closo-dodecaborato) (1-) (ejemplo 29) y CB-30, que es 1-etilensulfamida-3,3’como-bis(1,2-dicarba-3-cobalta(III)-closo-dodecaborato) (1-), descrito en el ejemplo 23.

La figura 26 muestra un procedimiento para la preparación de compuesto CB-29am, que es 1-propilenamonio-3,3’55 como-bis(decahidro-1,2-dicarba-3-cobalta(III)-closo-dodecaborato) (1-), y CB-30am, que es 1-etilenamonio-3,3’como-bis(decahidro-1,2-dicarba-3-cobalta(III)-closo-dodecaborato) (1-), descrito en los ejemplos 24 y 25.

La figura 27 muestra concentraciones en suero de ratones individuales y promedio de compuestos CB-4 (panel A) y CB-16 (panel B) durante 0,5-36 horas tras la administración (CI 50 CAIX = 50 nm en 28A, CI CAIX = 280 nm en 60 28B). Las marcas ●, ▲, ♦ representan los ratones 1, 2 y 3, □ representa los valores promedio.

Ejemplos

La invención se representa mediante ejemplos específicos a continuación; los ejemplos no limitan el alcance de la 65 invención.

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Lista de abreviaturas usadas:

h Hora TA Temperatura ambiente RMN Resonancia magnética nuclear ppm Partes por millón EM-ESI Espectrometría de masas con ionización por electropulverización CCF Cromatografía de capa fina HEPES Ácido hidroxietilpiperazin-N’-2-etanosulfónico DMSO Dimetilsulfóxido Et Etilo Me Metilo n-BuOH n-Butanol isoPrOH Alcohol isopropílico DME Dimetil éter DMF Dimetilformamida BNCT Terapia de captura de neutrones de boro MTT Bromuro de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio SDS Dodecilsulfato de sodio

Identificación de compuestos y control de su pureza

Espectroscopía de RMN multinuclear y espectrometría de masas.

Se midieron espectros de 1H, 13C y 11B-RMN con un instrumento Varian Mercury 400Plus. Los espectros de todos los compuestos se midieron inmediatamente tras la disolución. Los desplazamientos químicos de 11B-RMN (128 MHz) se facilitan en ppm a alta frecuencia (campo bajo) con respecto a F3B-OEt2 como referencia externa. Se usaron resonancias de 1H de disolvente residual como patrones secundarios internos. Se toman constantes de acoplamiento 1J(11B-1H) a partir de espectros de 11B de resolución potenciada con una resolución digital de 2 Hz. Los datos de RMN se presentan en el texto de la siguiente manera: 11B-RMN (9128 MHz): desplazamientos químicos de 11B (11B) (ppm), multiplicidad, las constantes de acoplamiento J(11B-1H) se facilitan en Hz. Las asignaciones de señales se basan en espectroscopía de RMN COSY de [11B-11B]. 1H-RMN (400 MHz) y 13C-RMN (100 MHz): los desplazamientos químicos (1H) se facilitan en ppm con respecto a Me4Si (0 ppm) como patrón externo, las constantes de acoplamiento J(H,H) se facilitan en Hz, la asignación de resonancias de (1H)-{11B} corresponde a picos de RMN observados en espectros de (1H)-{selectivo para 11B}.

Se realizaron mediciones de espectrometría de masas con un instrumento Thermo-Finnigan LCQ-Fleet Ion Trap usando ionización por electropulverización (ESI) para especies iónicas o ionización química a presión atmosférica (APCI) para derivados de carborano neutros con detección de iones negativos o positivos, respectivamente. Se introdujeron muestras disueltas en acetonitrilo (concentraciones de aproximadamente 100 ng.ml-1) en la fuente de iones mediante infusión de 0,25 ml.h-1, la temperatura de secado fue de 160ºC (ESI) o 300ºC (APCI), el flujo de gas de secado de 4 l·min-1, y la presión de gas de nebulización de 55,158 kPa.

Síntesis (método de preparación) de nuevos compuestos

Ejemplo 1

7-metilensulfamida-(7,8-nido-dicarbaundecaborato) (1-), (compuesto CB-2)

La fórmula estructural del compuesto CB-2 se representa en la figura 1. El esquema del procedimiento usado para la preparación del compuesto CB-2 se muestra en la figura 3.

Se añadió 1,4-dioxano (2 ml) a una mezcla sólida del derivado de amonio de partida 7-H3NCH2-7,8-nido-C2B9H11 (50 mg, 0,3 mmol) y sulfamida (145 mg, 1,5 mmol) bajo nitrógeno. Se agitó la suspensión resultante y se calentó a reflujo durante 72 h. Tras enfriar, se añadió gel de sílice (aproximadamente 5 cm3), se eliminaron los compuestos volátiles a presión reducida y se secó el sólido a vacío. Se vertieron los sólidos sobre una columna de gel de sílice seca (20 x 1,5 cm de D.I.) y se eluyeron los productos mediante cromatografía comenzando desde CH2Cl2 puro como fase móvil hasta una mezcla de CH2Cl2-CH3CN 1:1 aumentando gradualmente el contenido de acetonitrilo. Rendimiento de 56 mg (76 %), sólido blanco.

Hallado: 1H{11B} (B-H)-RMN (400 MHz; CD3CN, Me4Si) H/ppm: 4,31 (1H, s, CHcarborano), 3,14 (1H, t, NH), 3,05 (2H, s, NH2), 1,89 (2H, s, B9,11-H), 1,64 (1H, s, B2-H), 1,22 (2H, t, CH2), 1,20 (1 H, s, B3-H), 1,18 (1H, s, B4-H), 1,17 (1H, s, B6-H), 1,07 (1 H, s, B5H), 0,42 (1H, s, B1-H), -2,80 (1H, s, B(10)H); 11B-RMN (128 MHz; CD3CN; Et2O.BF3) B/ppm: 10,97 (1 B, d, J 143, B9), -11,31 (1 B, d, J 142, B11), -14,90 (1 B, d, J 159, B2), -16,94 (1 B, d, J = 159, B4), -18,39 (1 B, d, J= 140, B5), -19,13 (1 B, d, J= 128, B3), -22,22 (1 B, d, J 147, B6), -33,33 (1B, d, J 189, B10), -37,47 (1 B, d,

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Hallado 1H{11B}-RMN (400 MHz; CD3CN, Me4Si) H/ppm, 7,14 (2 H, t. a., NH2), 5,21 (4 H, s. a., CH2NH2SO2NH2), 3,89 (2 H, s, CHcarborano), 3,84 (2 H, s, CHcarborano), 3,44 (3H, s, CH3O), 3,27 (2H, q, CH2NH2), 3,13 (2H, p, CH2NH2), 2,98 (2 H, t, B(8’)H), 2,83 (1 H, s, B(10)H), 2,82 (2 H, s, B(4’, 7’)H), 2,72 (2 H, s, B(4, 7)H), 2,61 (1 H, s, B(10’)H), 1,88 (2 H, s, B(9, 12)H), 1,76 (2 H, s, B(9’, 12’)H), 1,57 (1 H, s, B(6)H), 1,57 (2 H, s, B(5’, 11’)H), 1,54 (2H, s, B(5, 11)H), 1,41 (1 H, s, B(6’)H); 11B-RMN (128 MHz; CD3CN; Et2O.BF3) B/ppm: 26,70 (1 B, s, B8’), 9,98 (1 B, s, B8), 0,20 (1 B, d, J 146, B10), -2,48 (1 B, d, J 143, B10’), -5,29 (2 B, d, J 153, B9, 12), -6,52 (4 B, d, J 162, B4, 7, 9’, 12’), -8,16 (2 B, d, J 208, B4’, 7’), -18,18 (2 B, d, J 143, B5, 11), -19,05 (2 B, d, J 146, B5’, 11’), -23,29 (1 B, d, J 198, B6), -28,19 (1 B, d, J 183, B6’); 13C-RMN (100 MHz; CD3CN; Me4Si) C/ppm: 58,15 (1 C, t, CH2), 51,50 (2 C, d, CHcarborano), 50,32 (2 C, t, CH2N), 48,42 (2 C, d, CHcarborano), 39,74 (1 C, q, CH3); m/z (ESI): 508,25 (15%), 505,25 (100%), calc. 508,25 (15%) 505,34 (100%) [M-H]-.

Ejemplo 10

8-butiloxisulfamida-3,3’-como-bis(decahidro-1,2-dicarba-3-cobalta(III)-closo-dodecaborato) (1-), (compuesto CB-16)

La fórmula estructural del compuesto CB-16 se representa en la figura 1. El procedimiento preparativo que conduce al compuesto CB-16 se muestra en la figura 11.

Se disolvió el derivado de amonio de partida [8-H3N-C4H8O-(1,2-C2B9H10)(1’,2’-C2B9H11)-3,3’-Co(III)], preparado según un procedimiento conocido (por ejemplo. Dalton Trans. 2008, 977-992), (102 mg, 0,24 mmol) en 1,4-dioxano (5 ml). Se añadió sulfamida sólida H2NSO2NH2 (225 mg, 2,34 mmol) bajo nitrógeno seguido por Na2CO3 anhidro (225 mg, 1,63 mmol) y se agitó intensamente la suspensión y se calentó a temperatura de reflujo durante 3 h. Se siguió el transcurso de la reacción con CCF (en CH3CN-CH2Cl2, 1:3) y mediante EM (ESI-) y cuando desapareció el compuesto de partida, se eliminaron los compuestos volátiles a presión reducida. Se trataron los sólidos resultantes mediante acetonitrilo (5 ml), se filtró la suspensión resultante y se evaporó el filtrado a presión reducida hasta sequedad. Se disolvió el residuo sólido en acetato de etilo (10 ml) y se trató en un embudo de extracción con HCl diluido (3 M 3 x 10 ml) a lo que se le añadió disolución saturada de NaCl (5 ml) para la precipitación con sales del producto. Se separó la fase orgánica y se eliminaron los compuestos volátiles a vacío. Después, se disolvió el producto en bruto en una mezcla de disolventes que comprendía CH2Cl2 y CH3OH (10:3 en v., 26 ml). Se recubrió en fases la disolución con hexano (80 ml) y se dejó reposar durante 3 d. Se separó el producto sólido naranja mediante decantación y se secó a vacío; rendimiento de 98 mg (82%).

Hallado 1H-RMN (400 MHz; CD3CN, Me4Si) H/ppm: 4,10 (2 H, s, CHcarborano), 3,98 (2 H, s, CHcarborano), 3,51 (2 H, t, CH2O), 2,92 (2 H, m, CH2N), 2,82 (1 H, s, B(10)H), 2,78 (1 H, s, B(8’)H), 2,65 (2 H, s, B(9’, 12’)H), 2,61 (2 H, s, B(9, 12)H), 2,58 (1 H, s, B(10’)H), 2,21 (4 H, s, H2NSO2NH2), 1,82 (2 H, s, B(4, 7)H), 1,70 (2 H, s, B(4’, 7’)H), 1,66 (1 H, s, B(6’)H); 1,62 (2 H, m, CH2), 1,55 (2 H, s, B(5’, 11’)H), 1,48 (2H, s, B(5, 11)H), 1,43 (2 H, m, CH2), 1,41 (1 H, s, B(6)H), 1,25 (2 H, m, CH2); 11B-RMN (128 MHz; CD3CN; Et2O.BF3) B/ppm: 23,87 (1 B, s, B8), 5,06 (1 B, d, J 140, B8’), -0,29 (1 B, d, J 140, B10), -2,88 (1 B, d, J 150, B10’), -2,79 (2 B, d, J 134, B9, 12), -5,12 (4 B, d, J 147, B4, 7, 9’, 12’), -6,31 (2 B, d, J 192, B4’, 7’), -7,48 (2 B, d, J 150, B5, 11), -17,51 (2 B, d, J 156, B5’, 11’), -20,37 (1 B, d, J 173, B6), -22,29 (1 B, d, J 174, B6’), -28,81 (1B, d, J 143, B6); 13C-RMN (100 MHz; CD3CN; Me4Si) C/ppm: 69,31 (1 C, t, CH2O), 53,45 (1 C, t, CH2N), 47,43 (2 C, d, CHcarborano), 40,93 (2 C, d, CHcarborano), 31,22 (1 C, t, CH2), 26,94 (1 C, t, CH2), 23,30 (1 C, t, CH2); m/z (ESI) 508,33 (10%), 504,42 (100%), calc. 508,33 (10%), 50434 (100%) [M-H]-.

Ejemplo 11

8-dietilenoxisulfamida-3,3’-como-bis(decahidro-1,2-dicarba-3-cobalta(III)-closo-dodecaborato) (1-), (compuesto CB17)

La fórmula estructural del compuesto CB-17 se representa en la figura 1. El procedimiento preparativo que conduce al compuesto CB-17 se muestra en la figura 12.

Se disolvió el compuesto zwitteriónico conocido [8-H3N-(C2H4O)2-(1,2-C2B9H10)2-3,3’-Co(III)] (101 mg, 0,23 mmol), preparado sin embargo mediante el nuevo procedimiento, en 1,4-dioxano (5 ml) bajo nitrógeno. Se añadió sulfamida sólida H2NSO2NH2 (224 mg, 2,33 mmol) seguido por Na2CO3 anhidro (246 mg, 2,32 mmol) y se agitó después vigorosamente la suspensión y se sometió a reflujo durante 2 h. Se monitorizó periódicamente la reacción mediante CCF (en CH3CN-CH2Cl2, 1:3) y mediante EM-ESI y se evaporó a presión reducida, cuando desapareció el derivado de partida. Se trataron los sólidos mediante acetonitrilo (5 ml), se filtró la suspensión resultante y se evaporó el filtrado a presión reducida. Se disolvió el sólido naranja en dietil éter (10 ml) y se trató en un embudo de extracción mediante HCl diluido (3 M, 3x 10 ml) y después mediante agua (2x 10 ml). Se separó la fase orgánica y se disolvió el bruto en una mezcla de CH2Cl2 y CH3OH (10:1 en v., 22 ml) y se dispuso en fases la disolución resultante con hexano y se dejó cristalizar durante la noche. Se decantó el producto semisólido y se secó a vacío lo que dio como resultado un sólido de tipo espumoso naranja. También se evaporaron las aguas de cristalización; rendimiento de 110 mg (93%).

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Hallado 1H-RMN (400 MHz; CD3CN, Me4Si) H/ppm: 4,15 (2 H, s, CHcarborano), 4,06 (2 H, s, CHcarborano), 3,60 (2H, t, CH2O), 3,53 (2H, t, CH2O), 3,49 (2H, t, CH2O), 3,14 (2H, m, CH2N), 2,80 (1 H, s, B(10)H), 2,77 (2 H, s, B(4’, 7’)H), 2,66 (1 H, s, B(8’)H), 2,65 (2 H, s, B(4, 7)H), 2,58 (2 H, s, B(9, 12)H), 2,57 (1 H, s, B(10’)H), 2,27 (5 H, s, NH2SO2NH3),1,67 (2 H, s, B(9’, 12’)H), 1,63 (1 H, s, B(6’)H), 1,54 (2 H, s, B(5’, 11’)H), 1,45 (2 H, s, B(5, 11)H), 1,38 (1 H, s, B(6)H); 11B-RMN (128 MHz; CD3CN; Et2O.BF3) B/ppm: 23,67 (1 B, s, B8), 4,77 (1 B, d, J 140, B8’), -0,11 (1 B, d, J 140, B10), -2,72 (1 B, d, J 143, B10’), -5,05 (2 B, d, J 153, B4, 7), -7,62 (4 B, d, J 146, B9, 12, 9’, 12’), -9,07 (2 B, d, J 186, B4’, 7’), -17,49 (2 B, d, J 153, B5, 11), -20,49 (2 B, d, J 156, B5’, 11’), -22,36 (1 B, d, J 167, B6), -28,62 (1 B, d, J 168, B6’); 13C-RMN (100 MHz; CD3CN; Me4Si) C/ppm: 72,42 (1 C, t, CH2O), 70,45 (1 C, t, CH2O), 69,19 (1 C, t, CH2O), 53,98 (2 C, d, CHcarborano), 47,53 (2 C, d, CHcarborano), 43,98 (1 C, t, CH2N); m/z (ESI): 506,42 (100%), 509,33 (14%), calc. 506,32 (100%), 509,33 (14%) [M-H]-.

Ejemplo 12

Síntesis del derivado en puente reactivo [8,8’--(CH2O(CH3))-(1,2-C2B9H10)2-3-Co], (compuesto CB-4-Pre, el producto intermedio en la preparación de CB-4)

La fórmula estructural del compuesto CB-4-Pre se representa en la figura 2. El procedimiento preparativo que conduce al compuesto CB-4-Pre se muestra en la figura 13.

A una suspensión de sal de Cs+ (u otra sal con catión adecuado, por ejemplo Rb+, K+) de bis(dicarballuro) de cobalto (Katchem, s.r.o., Praga) (2,29 g, 5 mmol) en 1,2-dicloroetano (10 ml) con agitación bajo nitrógeno, se le añadió HCl (al 35% v./v., 5 ml, 60 mmol) seguido por paraformaldehído (0,6 g, 20 mmol) y se calentó la mezcla de reacción hasta 60ºC (temperatura del baño) y se mantuvo a esa temperatura durante 2 h adicionales. Tras enfriar y reposar durante 2 h, se separó mediante filtración un sólido que precipitó y que contenía productos secundarios y se lavó con 1,2-dicloroetano (2x 10 ml). Se transfirió el filtrado a una extracción y se extrajo mediante agua (20 ml), después con Na2CO3 acuoso al 5% (3x 10 ml), agua (3x 10 ml) y se separó después la fase orgánica y se evaporó hasta sequedad a presión reducida. Este procedimiento condujo al aislamiento de una mezcla de dos especies electroneutras en 1,28 g (70% de rendimiento), que contenía una pequeña cantidad de otros compuestos (hasta el 5%). Puede aislarse un compuesto amarillo con fórmula [8,8’--(CH2O(CH3))-(1,2-C2B9H10)2-3-Co] a partir de la mezcla anterior de productos zwitteriónicos en forma pura mediante cromatografía sobre una columna de gel de sílice (2,5 x 30 cm) usando una mezcla de hexano y acetona 5:1 en v., rendimiento que puede aislarse de 0,39 g, 21%. Alternativamente, puede hacerse reaccionar la mezcla de ambos compuestos con sulfamida y puede separarse después el producto puro CB-4 mediante cromatografía de líquidos sobre gel de sílice.

Hallado para [(8,8’--(CH3OCH2)-(1,2-C2B9H10)2-3,3’-Co]0: Pureza mediante HPLC: 98,4%; Rf (CH2Cl2:hexano 3:1) 0,71; 1H-RMN H (400 MHz, CD3COCD3, Me4Si): 4,967 (s. a., 2H, CH2), 4,244 (s, 2H, CHcarborano), 4,208 (s, 3H, CH3O); 3,975 (s, 2H, CHcarborano); 11B-RMN (128 MHz, CD3COCD3, Et2O.BF3): 30,70 (s, 1 B), 13,01 (s, 1B), 0,67 (d, 1B, J= 143 Hz), -3,64 (d, 1B, solapamiento), -5,44 (d, 4B, J= 144), -8,82 (d, 4B, = 143 Hz), -14,43 (d, 2B, J= 159 Hz), -16,77 (d, 2B, J= 158 Hz), -23,78 (d, 1B, J= 171 Hz), -28,53 (d, 1 B, J= 174 Hz); 13C-RMN: C{1H}(100 MHz, CD3CN, Me4Si): 98,77 (CH2) 72,90 (CH3O), 51,74, 46,99 (CHcarborano); m/z (APCI-) 366,78 (100%), 370,29 (4%), calc. 366,78 (100%), 370,29 (4%) [M]-.

Ejemplo 13

1-metilenamonio-3,3’-como-bis(decahidro-1,2-dicarba-3-cobalta(III)-closo-dodecaborato) (1-), [(1-H3NCH2-1,2C2B9H10)(1’,2-C2B9H11)-3,3-Co], (compuesto CB-5am, el producto intermedio en la preparación de compuesto CB-5)

La fórmula estructural del compuesto CB-5am se representa en la figura 2. El procedimiento preparativo que conduce al compuesto CB-5am se muestra en la figura 14.

Se disolvió sal de cesio seca de bis(dicarballuro) de cobalto (Katchem, s.r.o., Praga), 2,71g (5,9 mmol), bajo argón en dimetil éter de etilenglicol (DME, 40 ml), y se enfrió hasta -78ºC (temperatura del baño), y se añadió después BuLi (4,0 ml de BuLi, 1,6 M en hexano; 6,4 mmol) a partir de una jeringa con agitación vigorosa. Tras agitar durante 15 min a baja temperatura, se dejó calentar el matraz hasta temperatura ambiente y volvió a enfriarse después. Después, se añadió lentamente la disolución de bromometil-ftalimida (1,50 g, 6,2 mmol) en 15 ml de DME a partir de una jeringa a lo largo de 15 min a -78ºC y se dejó calentar la mezcla de reacción hasta temperatura ambiente a lo largo de un periodo de 4 h. Tras reposar durante la noche, se filtraron los sólidos bajo argón, se lavaron con DME (2x 10 ml) y se evaporó un filtrado combinado rojo a vacío. Se disolvió el residuo sólido en una mezcla de CH2Cl2 -CH3CN (85:15, en v.) y se inyectó encima de una columna de gel de sílice (2,5x 25 cm). La elución usando una fase móvil de la misma composición condujo a la recuperación de una banda naranja que contenía el compuesto de partida (780 mg). La posterior elución con la misma mezcla de disolventes a la razón de 3:1 a 1:1 en v. seguida por evaporación de compuestos volátiles a presión reducida condujo al aislamiento de 1,93 g de producto intermedio rojo de la fórmula [(1-C6H4-(CO)2-N-CH2-1,2-C2B9H10)(1’,2’-C2B9H10)-3,3’-Co]Li, según RMN y EM.

Se disolvieron 500 mg (1,04 mmol) del producto intermedio anterior en 10 ml de n-butanol, se añadió etilendiamina

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mantuvo después la mezcla de reacción a baja temperatura durante 15 min y se dejó calentar después lentamente con agitación hasta temperatura ambiente a lo largo de 4 h y se dejó reposar durante la noche. Se eliminaron los sólidos mediante filtración bajo argón y se lavaron con DME (2x 10 ml). Se añadió ácido acético diluido (3 M, 0,5 ml) al filtrado y se eliminaron los compuestos volátiles a vacío. Se disolvieron los sólidos en benceno y se inyectaron encima de una columna de gel de sílice (25x 3 cm de D.I.). Se eluyó el compuesto de partida sin reaccionar (440 mg, al 22%) mediante benceno, mientras que se aisló el producto intermedio de propil-ftalimida mediante elución con benceno-CH3CN (95:5) y se evaporó hasta sequedad; rendimiento de 1,95 g (53%).

Se disolvió el derivado de propil-ftalimida 500 mg (1,23 mmol) en etanol acuoso (al 80%, 50 ml) y se trató con agitación con hidrato de hidrazina en exceso (0,7 ml, 14,4 mmol, Aldrich) durante 16 h a temperatura ambiente y después durante 4 h a reflujo. Tras enfriar, se eliminaron los compuestos volátiles a presión reducida. Se extrajo el producto en bruto en etil éter a partir del residuo sólido. Se evaporaron los extractos de éter combinados a presión reducida, produciendo un sólido incoloro (226 mg; 69%).

Hallado Rf (CH3CN:CH2Cl2 (1:3) 0,17; 1H{11B}-RMN (400 MHz; CD3CN, Me4Si) H/ppm: 7,70 (2H, d, Ph), 7,45 (1H, d, Ph), 7,32 (2H, d, Ph), 3,88 (3H, t, NH3), 2,42 (2H, m, CH2N), 2,15 (1 H, s, B(11)H), 2,00 (1 H, s, B(9)H), 1,99 (1 H, s, B(2)H), 1,92 (2H, p, CH2), 1,50 (2 H, s, B(3, 6)H), 1,49 (2H, t, CH2), 1,21 (1H, s, B(4)H), 1,21 (1 H, s, B(5)H), 0,55 (1 H, s, B(1)H), 0,10 (1 H, s, B(10)H), -2,25 (1 H, s, B-H-B); 11B-RMN (128 MHz; CD3CN; Et2O.BF3) B/ppm: -8,95 (1 B, d, J 134, B9), -10,83 (1 B, d, J 140, B11), -13,61 (1 B, d, J 156, B2), -17,34 (1 B, d, J 122, B5), -17,91 (1 B, d, J 92, B4), -19,05 (2 B, d, J 150, B3, 6), -33,85 (1 B, d, J 89, B10), -36,60 (1 B, d, J 137, B1); 13C-RMN (100 MHz; CD3CN; Me4Si) C/ppm: 133,05 (2C, d, Ph), 129,11 (1C, d, Ph), 127,54 (3C, m, Ph), 44,15 (1 C, s, Ccarborano), 42,68 (1 C, s, Ccarborano), 33,80 (1C, t, NCH2), 32,66 (1C, t, CH2), 30,82(1C, t, CH2); m/z (ESI-) 269,42 (10%), 267,25 (100%), calc. 269,27 (10%), 267,27 (100%) [M-H]-.

132,57 (2C, d, J=1,60, Ph), 132,04 (1C, t, J=1,69, Ph), 129,97 (1C, t, J=1,55, Ph), 128,05 (2C, t, J=1,60, Ph).

Ejemplo 16

8-(2-aminaetil)-amonio-8’-metoxi-3,3’-como-bis(1,2-dicarba-3-cobalta(III)-closo-dodecaborato) (1-), (compuesto CB15am, el producto intermedio para la preparación de CB-15)

La fórmula estructural del compuesto CB-15am se representa en la figura 2. El procedimiento preparativo que conduce al compuesto CB-15am se muestra en la figura 17.

Se secó el derivado en puente electroneutro de partida [-8-CH2-8’-CH3O-(1,2-C,B2H10)2-3,3’-Co(III)] (281 mg, 0,77 mmol) durante 12 h y se disolvió después en tetrahidrofurano (THF, 5 ml) bajo nitrógeno. Se añadió etilendiamina en exceso (0,51 ml, 7,65 mmol, Aldrich) a la disolución resultante y se agitó vigorosamente la mezcla de reacción a lo largo de un periodo de 30 min. Se monitorizó periódicamente el transcurso de la reacción mediante CCF. Se extinguió la reacción mediante adición de HCl diluido (3 M, 3 ml) y mediante eliminación del disolvente en un evaporador rotatorio a presión reducida. Se trató el residuo mediante cloruro de metileno (60 ml) y se separaron los sólidos mediante filtración. Después, se trató el filtrado mediante HCl diluido (3 M, 3x 20 ml) y se filtró el sólido naranja que precipitó y se secó al aire. Se disolvió el producto en bruto en acetato de etilo (10 ml) y se agitó la disolución con disolución acuosa al 10% de Na2CO3 (2x 20 ml). Después, se separó la fase orgánica y se evaporó hasta sequedad a presión reducida. Se disolvieron los sólidos en cloruro de metileno (10 ml) a lo que se añadieron algunas gotas de acetato de etilo, se filtró la disolución y se dispuso en fases mediante hexano (20 ml) y se dejó reposar durante 2 días. Se recuperó el producto sólido naranja mediante filtración y se secó, rendimiento de 193 mg (59%).

Hallado 1H{11B}-RMN (400 MHz; CD3CN, Me4Si) H/ppm: 6,15 (1H, t, NH), 3,88 (2 H, s, CHcarborano), 3,83 (2 H, s, CHcarborano), 3,41 (3H, s, CH3O), 3,27 (3H, m, CH2NH3), 2,92 (4H, p, CH2N), 2,87 (4H, s, B(4, 7, 9’, 12’)H), 2,86 (2H, t, BCH2N), 2,82 (1 H, s, B(10)H), 2,74 (2 H, s, B(4’, 7’)H), 2,60 (1 H, s, B(10’)H), 2,17 (2H, s, B(9, 12)H), 1,92 (3H, s, ), 1,87 (2 H, s, B(4’, 7’)H), 1,59 (1 H, s, B(6)H), 1,54 (4 H, s, B(5, 5’, 11, 11’)H), 1,40 (1 H, s, B(6’)H); 11B-RMN (128 MHz; CD3CN; Et2O.BF3) B/ppm: 26,79 (1 B, s, B8’), 10,36 (1 B, s, B8), -0,43 (1 B, d, J 140, B10), -2,58 (1 B, d, J 137, B10’), -5,38 (2 B, d, J 147, B9, 12), -6,69 (4 B, d, J 171, B4, 7, 9’, 12’), -8,16 (2 B, d, J 183, B4’, 7’), -18,13 (2 B, d, J 137, B5, 11), -19,10 (2 B, d, J 137, B5’, 11’), -23,60 (1 B, d, J 171, B6), -28,40 (1 B, d, J 159, B6’); 13C-RMN (100 MHz; CD3CN; Me4Si) C/ppm: 57,96 (1 C, t, CH2), 51,75 (2 C, t, CH2N), 51,39 (2 C, d, CHcarborano), 48,36 (2 C, d, CHcarborano), 37,07 (1 C, q, CH3); m/z (APCI-): 426,42 (100%), 429,42 (11%), calc. 426,36 (100%), 429,36 (11%), [M-H]-.

Ejemplo 17

8-(5-amoniopentoxi)-3,3’-como-bis(1,2-dicarba-3-cobalta(III)-closo-dodecaborato) (1-), (compuesto CB-16am, el producto intermedio para la preparación de CB-16)

La fórmula estructural del compuesto CB-16am se representa en la figura 2. El procedimiento preparativo que

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conduce al compuesto CB-16am se muestra en la figura 18.

Se disolvió el [8-C5H10O-(1,2-C2B9H10)(1’,2’-C2B9H11)-3,3’-Co(III)] zwitteriónico de partida (500 mg, 1,22 mmol), preparado según un procedimiento notificado (Dalton Trans. 2003, 556-561), bajo nitrógeno en THF (20 ml) y se enfrió la disolución hasta 0ºC. Después, se hizo burbujear amoniaco gaseoso a través de esta disolución a lo largo de un periodo de 5 min y se dejó reposar después la disolución durante 25 min adicionales a temperatura ambiente. Se analizó periódicamente la reacción usando CCF (en CH3CN-CH2Cl2 3:1 en v.). Se evaporó la disolución hasta sequedad a presión reducida usando un evaporador rotatorio. Se disolvió el producto en bruto en Et2O (30 ml) y se agitó después con HCl diluido (3 M, 3x 20 ml). Se separó la fase orgánica, se filtró a través de filtro de papel, y se eliminó el disolvente a presión reducida. Se cristalizó el producto en bruto mediante disolución en cloruro de metileno (20 ml con adición de 1 ml de metanol) y se dispuso cuidadosamente en fases con hexano (80 ml). Se filtró el sólido que se separó y se secó a vacío; rendimiento de 482 mg (92%).

Hallado 1H-RMN (400 MHz; CD3CN, Me4Si) H/ppm: 4,10 (2 H, s, CHcarborano), 3,98 (2 H, s, CHcarborano), 3,51 (2 H, t, CH2O), 2,93 (2 H, m, CH2N), 2,80 (1 H, s, B(10’)H), 2,77 (1 H, s, B(8’)H), 2,76 (2 H, s, B(4, 7)H), 2,59 (2 H, s, B(4’, 7’)H), 2,57 (1 H, s, B(10)H), 2,28 (3 H, s, NH3), 1,69 (4 H, s, B(9, 9’, 12, 12’)H), 1,63 (1 H, s, B(6’)H), 1,62 (2 H, m, CH2), 1,54 (2 H, s, B(5’, 11’)H), 1,50 (1 H, s, B(6)H), 1,48 (2 H, m, CH2), 1,45 (2H, s, B(5, 11)H), 1,41 (2 H, m, CH2);11B-RMN (128 MHz; CD3CN; Et2O.BF3) B/ppm: 23,87 (1 B, s, B8), 5,11 (1 B, d, J 140, B8’), -0,27 (1 B, d, J 143, B10), -2,86 (1 B, d, J 146, B10’), -5,21 (2 B, d, J 143, B4’7’), -7,55 (4 B, d, J 146, B 9, 9’, 12, 12’), -9,11 (2 B, d, J 201, B4, 7), -17,58 (2 B, d, J 153, B5’, 11’), -20,43 (2 B, d, J 153, B5, 11), -22,50 (1 B, d, J 153, B6’), -28,85 (1 B, d, J 168, B6); 13C-RMN (100 MHz; CD3CN; Me4Si) C/ppm: 69,33 (1 C, t, CH2O), 53,44 (1 C, t, CH2N), 47,45 (2 C, d, CHcarborano), 41,00 (2 C, d, CHcarborano), 31,20 (1 C, t, CH2), 26,92 (1 C, t, CH2), 23,50 (1 C, t, CH2); m/z (APCI): 426,42 (100%) 430,42 (8%), calc. 426,38 (100%) 430,38 (8%) [M-H]-.

Ejemplo 18

7-metilenamonio-(7,8-nido-dicarbaundecaborato) (1-), (compuesto CB2-am) mediante degradación de Br-CH2-1,2carborano-amoniaco (compuesto CB-2am, el producto intermedio para la preparación de CB-2)

La fórmula estructural del compuesto CB-2am se representa en la figura 2. El procedimiento preparativo que conduce al compuesto CB-2am se muestra en la figura 19.

Se disolvió el 1-Br-CH2-1,2-C2B10H11 comercialmente disponible (1,0 g, 4,2 mmol, adquirido de Katchem, Ltd., Praga) en etanol acuoso (al 96%, 10 ml) y se añadió amoniaco acuoso (al 24% en v., 5 ml). Se agitó la mezcla de reacción bajo nitrógeno durante 8 h, cuando un punto del compuesto de partida con CCF (RF 0,91, Silufol, CHCl3-CH3CN, 2:1 en v., detección: vapores de yodo y pulverización con AgNO3 al 1% -una reducción lenta para dar un color gris). Después, se eliminaron los compuestos volátiles a presión reducida. Se secó un residuo sólido, se disolvió en una mezcla de acetona:CH2Cl2 (4:1 en v.), y se aisló el producto mediante cromatografía sobre una columna de gel de sílice (20 x 2 cm de D.I.). Se monitorizó el transcurso de la cromatografía mediante CCF usando la misma mezcla de disolventes. Se recogió la primera banda principal que eluyó correspondiente a RF 0,33 con CCF. Se eliminaron inmediatamente los disolventes en frío a presión reducida y se secó después el producto y se cristalizó mediante disolución en CH2Cl2, disposición en fases con hexano y dejando reposar durante tres días. Esta reacción puede llevarse a cabo alternativamente con disolución en tolueno (seco) de los compuestos de partida y amoniaco gaseoso al 100% procedente de una botella de presión que se hace burbujear a través de la misma. El tiempo de reacción fue entonces de 3 h proporcionando una mezcla similar de productos idénticos, incluyendo sus razones mutuas; según CCF y RMN. Rendimiento para 1-H3N-CH2-1,2-C2B10H11 de 0,43 g (62%).

Hallado RF 0,33 (Silufol), 1H-RMN (400 MHz; CD3CN, Me4Si) H/ppm: 3,072 (1H, d, J= 13,4 Hz, CH2NH2), 2,866 (1H, d, J= 13,6 Hz, -CH2-NH), 1,855 (1H, s, CHcarborano), 1,988 (2H, s, BH), 1,695, 1,366 (2H, 2s, BH), 1,281, 1,066 (2H, 2s, BH), 1,332 (1 H, s, B(3)H), 0,553 (1H, s, B(1)H), 0,117 (1H, s, B(10)H), -2,738 (1H, s, m-BH); 11B-RMN (128 MHz; CD3CN; Et2O.BF3) B/ppm: -11,09 (2 B, d, J 43), -15,16 (2 B, d, J 142), -19,79 (2 B, d, J 159), -20,06 (1 B, d, J 147), 32,85 (1B, d, J 89, B10), -37,16 (1 B, d, J 140, B1); m/z (E.I.) 148 [C2B9H11CH2] (50), 164 (100), 165 (40), calc. 163,46, 165,21) [M]. Los datos espectrales concuerdan con los notificados anteriormente en la bibliografía (J.G. Wilson et al., Inorg. Chem. 36, 4756-4761, 1997).

El procedimiento dado a conocer comienza desde productos químicos comercialmente disponibles y representa un enfoque sencillo de una etapa, en comparación con el procedimiento de tres etapas notificado comenzando desde nido-decaborano (14) (J.G. Wilson, véase anteriormente), y proporciona un rendimiento superior del producto.

Ejemplo 19

8-(5-amonio-3-oxa-pentoxi)-3,3’-como-bis(1,2-dicarba-3-cobalta(III)-closo-dodecaborato) (1-), (compuesto CB-17am) (compuesto CB-17am, el producto intermedio para la preparación de CB-17)

La fórmula estructural del compuesto CB-17am se representa en la figura 2. El procedimiento preparativo que

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conduce al compuesto CB-17am se muestra en la figura 20.

El nuevo procedimiento descrito anteriormente para la preparación de CB-16am puede aplicarse a la preparación del compuesto CB-17am que ya se ha notificado en la bibliografía (J. Orgmet. Chem. 2002, 649, 1). Se hizo reaccionar el derivado de partida [8-C4H8O2-(1,2-C2B9H10)(1’,2’-C2B9H11)-3,3’-Co(III)] (500 mg, 1,22 mmol), preparado según un procedimiento notificado (Collect. Czech. Chem. Commun. 62, 1997, 47) (500 mg, 1,22 mmol) con amoniaco gaseoso en THF de manera similar al caso de CB-16am. Se llevó a cabo también el aislamiento mediante el mismo procedimiento que el usado en el caso de CB-16am; rendimiento de 511 mg (98%).

Hallado 1H-RMN (400 MHz; CD3CN, Me4Si) H/ppm: 7,86 (3H, t, NH3), 4,07 (2 H, s, CHcarborano), 3,98 (2 H, s, CHcarborano), 3,92 (2H, t, CH2O), 3,77 (2H, t, CH2O), 3,67 (2H, t, CH2O), 3,50 (2H, m, CH2N), 3,10 (1 H, s, B(10)H), 2,86 (2 H, s, B(4’, 7’)H), 2,64 (1 H, s, B(8’)H), 2,65 (2 H, s, B(4, 7)H), 2,10 (1 H, s, B(10’)H), 2,06 (2 H, s, B(9, 12)H), 1,85 (2 H, s, B(9’, 12’)H), 1,62 (1 H, s, B(6’)H), 1,55 (2 H, s, B(5’, 11’)H), 1,48 (2 H, s, B(5, 11)H), 1,38 (1 H, s, B(6)H); 11B-RMN (128 MHz; CD3CN; Et2O.BF3) B/ppm: 24,53 (1 B, s, B8), 6,91 (1 B, d, J 140, B8’), 0,61 (1 B, d, J 140, B10), -2,56 (1 B, d, J 143, B10’), -5,08 (2 B, d, J 195, B4, 7), -6,55 (4 B, d, J 147, B9, 9’, 12, 12’), -9,24 (2 B, d, J 153, B4’, 7’), -17,20 (2 B, d, J 156, B5, 11), -20,18 (2 B, d, J 156, B5’, 11’), -22,39 (1 B, d, J 162, B6), -28,64 (1 B, d, J 168, B6’); 13C-RMN (100 MHz; CD3CN; Me4Si) C/ppm: 76,95 (1 C, t, CH2O), 74,82 (1 C, t, CH2O), 71,89 (1 C, t, CH2O), 57,12 (2 C, d, CHcarborano), 52,37 (2 C, d, CHcarborano), 45,705 (1 C, t, CH2N); m/z (APCI): 427,42 (100%), 430,50 (14%), calc. 427,35 (100%), 430,34 (14%) [M-H]-. Los datos concuerdan con los publicados anteriormente para este compuesto en la bibliografía. (J. Orgmet. Chem. 649, 2002, 1). En comparación con el método publicado anterior que comprende varias etapas, el procedimiento dado a conocer en este caso es claramente más sencillo y proporciona rendimientos esencialmente cuantitativos.

Ejemplo 20

1,1’-bis(3-sulfamoilpropil)-3,3’-como-bis(1,2-dicarba-3-cobalta(III)-closo-dodecaborato) (1-) (compuesto CB-25)

La fórmula estructural del compuesto CB-25 se representa en la figura 22. El procedimiento preparativo que conduce al compuesto CB-5 se muestra en la figura 24.

Se secó el derivado conocido de partida Cs[HO-(CH2)3)C2B9H10)2-3,3’-Co] (500 mg, 0,9 mmol), preparado según el procedimiento anteriormente publicado (Grüner et al., Dalton Trans. 41, 2012, 7498), a vacío durante 24 h y se disolvió después bajo argón en 10 ml de acetonitrilo seco en un matraz de tipo Schlenk. Se añadió Cs2CO3 sólido (664 mg, 2,2 mmol) en una porción seguido, tras 30 min de agitación, por cloruro de sulfamoílo sólido (Cl-O-SO2-NH2, 302 mg, 3,0 mmol). Después, se agitó la mezcla de reacción durante 72 h adicionales a temperatura ambiente. Se monitorizó periódicamente el transcurso de la reacción mediante CCF en CH3CN:CHCl3 (1:3, en v.). Cuando casi había desaparecido el compuesto de partida, se retiraron los sólidos mediante filtración y se desecharon. Se evaporó el filtrado rojo hasta sequedad a presión reducida. Se disolvió el producto en bruto resultante en CH2Cl2 (20 ml), se dispuso en fases la disolución resultante con hexano y se dejó cristalizar. Se filtraron los sólidos y se secaron a vacío. Se obtuvo el producto en forma de sal de Cs+, rendimiento de 561 mg (88%). Con fines de someter a prueba la inhibición de enzimas CA, se transfirió esta sal a sal de sodio hidratada mediante reacción de doble desplazamiento.

Hallado 1H-RMN (CD3CN, 400 MHz, BF3.Et2O) H/ppm: 5,66 (4H, s.a., NH2), 4,01 (2H, t, CH2O), 3,96 (2H, t, CH2O), 3,82 (2H, s, B(8,8’)H), 3,50 (2H, s, CHcarborano), 3,13 (2H, s, B(9,9’)H), 3,03 (4H, t, CH2), 2,83 (4H, s.a., B(4,4’,7,7’)H), 2,77 (2H, s, B(10,10’)H), 2,38 (4H, t, CCH2), 1,72 (2H, s, B(6,6’)H), 1,64 (2H, s, B(12,12’)H), 1,61 (4H, s.a., B(5,5’,11,11’)H); 11B-RMN (CD3CN, 128 MHz, BF3.Et2O) B/ppm: 7,58 (2B, d, J=143, B8,8’), -0,22 (2B, d, J=72, B10,10’), -4,17 (2B, d, J=143, B9,9’), -5,45 (2B, d, J=146, B4,4’), -6,33 (2B, d, J=131, B7,7’), -9,14 (2B, d, J=140, B12,12’), -14,30 (2B, d, J=126, B5,5’), -16,06 (2B, d, J=171, B11,11’), -17,84 (1B, d, J=266, B6’), -19,41 (1B, d, J=156, B6); 13C-RMN (CD3CN, 100 MHz, BF3.Et2O) C/ppm: 71,80 (2C, Ccarborano), 57,50 (2C, CHcarborano), 32,45 (2C, CH2O), 23,20 (2C, CH2), 14,21 (2C, CH2); m/z (ESI): 598,40 (M-, (100%), 602,28 (5%), calculado 598,31 (M-, (100%), 602,30 (5%).

Ejemplo 21

1-(3-sulfamoil-propil)-3,3’-como-(decahidro-1,2-dicarba-3-cobalta(III)-undecahidro-1’,2’-dicarba-closo-dodecaborato) (1-), sal de sodio dihidratada (compuesto CB-26)

La fórmula estructural del compuesto CB-26 se representa en la figura 22. El procedimiento preparativo que conduce al compuesto CB-5 se muestra en la figura 24.

Se secó la sal de cesio conocida de partida de la fórmula Cs[1-HO-(CH2)3-1,2-C2B9H10)(1’,2’-C2B9H11)-3,3’-Co] (500 mg, 1,0 mmol), preparada según el procedimiento anteriormente publicado (Grüner et al., Dalton Trans. 41, 2012, 7498), a vacío a temperatura ambiente durante 24 h y se disolvió después bajo argón en 10 ml de acetonitrilo seco en un matraz de tipo Schlenk. Se añadió Cs2CO3 sólido (370 mg, 1,1 mmol) en una porción y se agitó después

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Hz, B 5’,11’), -19,221 (1B, d, J= 177 Hz, B6), -23,12 (1B, d, J= 165 Hz, B6’); 13C{1H}-RMN (100 MHz; Acetona-d6; Me4Si) C/ppm: 68,71 (1C, Ccarborano), 57,71 (1 C, CHcarborano), 53,82 (1 C, CHcarborano), 51,74 (1 C, CHcarborano), 48,39 (1 C, -CH2-NH3), 41,21 (1 C, CH2-CH2-NH3), 37,57 (1C, C-CH2); m/z (ESI-) 381,42 (100%), 385,42 (10%), calc.: 381,34 (100%), 385,34 (10%) [M-H]-.

Ejemplo 25

1-etilenamonio-3,3’-como-bis(decahidro-1,2-dicarba-3-cobalta(III)-closo-dodecaborato) (1-), [(1-H3N-(CH2)2-1,2C2B9H10)(1’,2’-C2B9H11)-3,3’-Co], (compuesto CB-30am, el producto intermedio en la preparación de compuesto CB30)

La fórmula estructural del compuesto CB-29am se representa en la figura 23. El procedimiento preparativo que conduce al compuesto CB-29am se muestra en la figura 26.

Se secó sal de trimetilamonio seca de 1-etilenhidroxi-1,2-cobalto-bis(dicarballuro), preparado según un procedimiento conocido (Grüner et al., Dalton Trans. 41, 2012, 7498), 0,50 g (1,17 mmol) durante 5 h a 80ºC y se disolvió después bajo nitrógeno en CH3CN seco (15 ml). Se añadió Cs2CO3 sólido (400 mg, 1,53 mmol) y se agitó la suspensión a 80ºC durante 30 min. Después, se añadió una disolución de cloruro de toluensulfonilo en acetonitrilo (490 mg, 2,56 mmol en 10 ml) a partir de una jeringa y se continuó la agitación y el calentamiento durante 1,5 h adicionales. Tras enfriar, se eliminaron los compuestos volátiles a presión reducida. Se trató el residuo sólido mediante el mismo procedimiento que el descrito anteriormente en el ejemplo 24 para el compuesto CB-29am. De manera similar al caso anterior, se obtuvo el tosilato esencialmente puro de la fórmula [(1-CH3-C6H4-SO2-O-(CH2)2-1,2-C2B9H10)(1’,2’-C2B9H10)-3,3’-Co]Me4N, según RMN y EM, que puede usarse como producto intermedio para la preparación del derivado de amonio CB-30am; rendimiento de 0,58 g (83%).

Hallado 1H-RMN (400 MHz; Acetona-d6, Me4Si) H/ppm, 7,799 (2H, d, J= 7,32 Hz, ArH), 7,497 (2H, d, J= 7,5 Hz, ArH), 4,155 (2H, 2q, -CH2-O), 3,728, 3,557, 3,456 (3H, 3 s. a., CHcarborano), 3,735, 3,668 (2H, 2s, B(8,8’)H), 3,456 (12H, s, NMe4+), 2,97, 2,877 (2H, 2s, B(10,10’)H), 3,046 y 2,706 (2H, 2m, -CH2-CH2-O), 2,671, 2,656, 2,009, 1,963 (8H, 4s, B(4,7,4’,7’,9,12, 9’,12’)H); 2,472 (3H, s, CH3), 1,617, 1,485 (2H, 2s, B(5, 11)H), 1,53 (2H, s, B(5’,11’)H), 1,618 (1H, s, B(6’)H), 1,557 (1H, s, B(6)H); 11B-RMN (128 MHz; Acetona-d6; Et2O.BF3) B/ppm: 6,77 (2B, d, J= 144 Hz, B8,8’), 1,11, 0,78 (2B, 2d, J= 147 y 149 Hz, B10,10’), -5,76, -6,99 (8B, 4d, solapamiento, B4,7,4’,7’,9,12, 9’,12’), 15,65, -16,42 (2B, 2d, J= 150 y 146 Hz, B5,11), -17,58 (2B, d, J= 156 Hz, B5’,11’), -19,91 (1B, d, J = 180 Hz, B6), 23,00 (1B, d, J = 169 Hz, B6’); 13C{1H}-RMN (100 MHz; Acetona-d6; Me4Si) C/ppm: 146,07 (1C, CAr), 134,08 (1C, CAr), 131,01 (2C, CAr), 128,63 (2C, CAr), 70,88 (1C, -CH2-O), 64,94 (1C, Ccarborano), 57,29 (1 C, CHcarborano), 56,07 (4C, Me4N+), 53,95 (1 C, CHcarborano), 51,94 (1 C, CHcarborano), 38,78 (1C, C-CH2), 21,58 (1 C, CH3); m/z (ESI-) 522,25 (100%), 525,17 (15%), calc.: 522,32 (100%), 525,31 (16%) [M]-.

Se disolvieron 150 mg (0,25 mmol) del tosilato anterior bajo nitrógeno en una mezcla de disolventes compuesta por tolueno seco (5 ml) y acetonitrilo (10 ml) en un tubo de vidrio de presión de Aldrich equipado con un septo de caucho con dos agujas inoxidables y una barra de agitación. Después, se enfrió la disolución con agitación hasta -33ºC (temperatura del baño) y se condensó un exceso de amoniaco (1 ml) en este tubo a través de una aguja. Después, se remplazó el septo por un tapón de rosca apretado y se dejó calentar la disolución hasta temperatura ambiente y se colocó después el tubo en un baño de aceite caliente a 85ºC y se mantuvo la mezcla de reacción a presión de amoniaco y con agitación a esta temperatura durante 48 h. Tras enfriar hasta -33ºC, se eliminaron los compuestos volátiles a presión reducida (con lento calentamiento hasta temperatura ambiente). Se disolvió el residuo en éter, se lavó con HCl diluido (3 M, 3x 30 ml), se lavó la fase orgánica con agua y se evaporó hasta sequedad. Se aisló el producto mediante cromatografía sobre gel de sílice usando una mezcla de disolventes de CH2Cl2-CH3CN (4:1, en v.); rendimiento de 85 mg (92%).

Hallado 1H-RMN (400 MHz; Acetona-d6, Me4Si) H/ppm, 7,8 (3H, s. a., NH3), 4,156, 3,843, 3,714 (3H, 3 s. a., CHcarborano), 3,983 y 3,464 (2H, 2q, -CH2-NH), 3,768, 3,558 (2H, 2s, B(8,8’)H), 3,411, 2,928 (2H, 2q, CH2CH2NH2), 3,080, 3,004 (2H, 2s, B(10,10’)H); 2,731, 2,705, 1,923, 1,875 (8H, 4s, B(4,7,4’,7’,9,12, 9’,12’)H); 1,989, 1,849 (2H, 2s, B(5,11)H), 1,748 (1H, 1s, B(6)H), 1,611 (1H, s, B(6’)H), 1,626 (2H, s, B(5’,11’)H); 11B-RMN (128 MHz; Acetonad6; Et2O.BF3) B/ppm: 6,99 (2B, d, J= 140 Hz, B8,8’), 1,35, 0,66 (2B, 2d, J= 143 y 144 Hz, B10,10’), -5,60, -7,00 (8B, 4d, solapamiento, B4,7,4’,7’,9,12, 9’,12’), -15,58, -16,32 (2B, 2d, solapamiento, B5,11), -17,45 (2B, d, J= 156 Hz, B 5’,11’), -19,67 (1B, d, J = 178 Hz, B6), -23,00 (1B, d, J = 171 Hz, B6’); 13C-RMN (100 MHz; CD3CN; Me4Si) C/ppm: 65,50 (1C, Ccarborano), 57,58 (1 C, CHcarborano), 53,59 (1 C, CHcarborano), 51,85 (1 C, CHcarborano), 49,35 (1 C, -CH2-NH3), 37,77 (1C, C-CH2)m/z (ESI-) 367,33 (100%), 370,33 (10%), calc.: 367,32 (100%), 370,31 (10%) [M-H]-.

Ejemplo 26

Pruebas para determinar la eficacia de sustancias in vitro

Se sometieron a ensayo los compuestos para determinar la actividad de inhibición de dos isoformas de anhidrasa carbónica humana: hCA II y hCA IX. Se adquirió la anhidrasa carbónica II humana (HCA II) de Sigma Aldrich (n.º de

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cat. C6165) en forma de proteína liofilizada, que se disolvió antes de su uso en HEPES 10 mmol.l-1, pH 7,0 hasta una concentración de 300 mol.l-1 y se diluyó adicionalmente según se requirió. Se preparó anhidrasa carbónica IX humana (HCA IX) mediante un sistema de expresión recombinante en insecto (sistema de expresión en Drosophila, Invitrogen). El constructo contenía el dominio de CA extracelular (residuos de aminoácido 139-390) clonado en el vector pMT/BiP/V5-His (Invitrogen) y se expresó la proteína diana en medio libre de suero SF 900 II (Gibco, Invitrogen). Se purificó adicionalmente esta proteína a partir del medio mediante soporte de cromatografía de quelación gel de afinidad de níquel His-Select (Sigma, n.º de cat. P6611) y cromatografía en gel (Superdex 200 GL 30/300, GE Healthcare) según las recomendaciones del fabricante.

Se realizaron pruebas para determinar la eficacia inhibidora de compuestos in vitro usando un método colorimétrico convencional (Maren, TH, Ellison, AC, Mol. Pharmacol. 3, 1967, 503-508) con algunas modificaciones según: (Brion, LP et al., Anal. Biochem. 175, 1988, 289-297). El principio del método se basa en medir la velocidad de acidificación de la disolución que se observa como el cambio de color del indicador de ácido-base (rojo de fenol). Se realizó la reacción en un tubo de vidrio colocado en un baño de hielo (0ºC, todas las disoluciones madre y enzimas se mantuvieron a la misma temperatura). En un experimento típico, a una enzima 5 mol.l-1 (HCA II y HCA IX) en 10 ml de HEPES 10 mmol.l-1, pH 7,0 se le añadieron cantidades variables de inhibidor de prueba disuelto en DMSO (de modo que la concentración final de DMSO no superó el 2% vol./vol.). Se añadió el volumen de una muestra a 100 ml de agua y se añadió la mezcla a una disolución de 800 ml de NaHCO3 1 mmol.l-1, pH 10,2 que contenía el 0,01% (p./vol.) de rojo de fenol. A esto le siguió una saturación de CO2 (flujo de corriente de 50 ml/min) usando una aguja (18G) hasta la transición de color del rojo de fenol de rojo a amarillo (normalmente 60 segundos por defecto). Tras la saturación, se añadió a la mezcla de 100 ml de NaHCO3 con una concentración de 500 mmol.l-1 y pH 10,2 (acompañado por una transición de color de vuelta a un color púrpura rojizo), se continuó después la saturación de CO2 en las mismas condiciones, y se midió el tiempo de cambio de color de vuelta al color amarillo. Se determinó el punto final de la reacción mediante comparación visual con un tubo de referencia que contenía indicador de ácidobase (rojo de fenol al 0,01% (p./vol.)) y se ajustó el pH a 7,0. El control negativo (sin enzima añadida) alcanzó normalmente el punto final dentro de un plazo de 58  2 s, en presencia de actividad enzimática se midió un tiempo correspondientemente más corto. La unidad de actividad enzimática (UE) de anhidrasa carbónica se define como la cantidad de enzima requerida para reducir el tiempo a la mitad, en comparación con el control negativo (Brion, LP, et al., Anal. Biochem. 175, 1988, 289-297). Se calculó la actividad molar según la fórmula:

log(tb/ts)CA(UE/moldeproteína  nprot log2

donde tB es el tiempo de control negativo sin enzima y tS es el tiempo medido con una muestra de enzima (e inhibidor), nprot es el número de moles de proteína presentes en la muestra. El valor de CI50 para la concentración de inhibidor corresponde a la concentración de inhibidor requerida para reducir la actividad específica a la mitad del valor de enzima sin inhibición. Se calculó la selectividad hacia el inhibidor de CA IX como la razón de valores de CI50 para la inhibición de HCA II frente al valor de CI50 para la inhibición de enzima CA IX. Los resultados se muestran en la tabla 1.

Tabla 1: valores de CI50 para sustancias individuales con enzimas hCA II y hCA IX.

CI50 (hCA II) [mol.l-1]

CI50 (hCA IX) [mol.l-1] Selectividad hacia hCA IX, CI50 (hCA II) / CI50 (hCA IX)

CB-2

4,60 2,60 1,77

CB-4

5,00 0,05 100

CB-5

3,70 0,04 92,5

CB-6

39,10 1,08 36,2

CB-10

67,9 9,68 7,0

CB-11

83,90 1,50 55,9

CB-12

14,90 1,49 10,0

CB-13

4,00 0,08 48,8

CB-15

14,00 2,00 7,00

CB-16

0,68 0,28 2,43

CB-17

12,00 0,35 34,3

CB-25

0,04 0,004 10

CB-26

0,11 0,014 7,9

CB-29

3,9 0,022 177

CB-30

0,57 0,0007 814

Ejemplo 27 La estructura cristalina de HCA II complejada con sustancia CB-2

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crecientes de daunorubicina o paclitaxel, respectivamente (Noskova et al., Neoplasnw 49, 2002, 418). Las células CEM-DNR a granel sobreexpresan la proteína MRP-1, mientras que las células K562-tax sobreexpresan la glicoproteína P, ambas proteínas pertenecen a la familia de transportadores de ABC y están implicadas en el fenómeno de resistencia a múltiples fármacos primaria y/o adquirida (Noskova et al., Neoplasma 49, 2002, 418). Se mantuvieron las células en matraces de cultivo tisular de plástico de 80 cm2 de Nunc/Corning y se cultivaron en medio de cultivo celular (DMEM/RPMI 1640 con glucosa 5 g/l, glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 g/ml, suero de ternero fetal al 10% y NaHCO3).

Ensayo de MTT

Se realizó este ensayo según Hajduch et al., Anti-Cancer Drugs 10, 1997, 1007. Se prepararon suspensiones celulares y se diluyeron según el tipo de célula particular y la densidad celular objetivo esperada (250030000 células/pocillo basándose en las características de crecimiento celular). Se añadieron células mediante pipeta (80 l) en placas de microtitulación de 96 pocillos. Se permitió a los inoculados un tiempo de preincubación de 24 h a 37ºC y CO2 al 5% para la estabilización. Se añadieron diluciones cuádruples, en alícuotas de 20 l, de la concentración de prueba prevista a los pocillos de la placa de microtitulación en el momento cero. Todas las concentraciones de compuestos de prueba se examinaron por duplicado. La incubación de las células con los compuestos de prueba duró 72 h a 37ºC, en una atmósfera de CO2 al 5% con una humedad del 100%. Al final del periodo de incubación, se sometieron a ensayo las células usando MTT. Se introdujeron con pipeta alícuotas (10 l) de la disolución madre de MTT en cada pocillo y se incubaron durante 1-4 h adicionales. Tras este periodo de incubación se disolvió el formazán producido mediante la adición de 100 l/pocillo de SDS ac. al 10% (pH = 5,5), seguido por una incubación adicional a 37ºC durante la noche. Se midió la densidad óptica (DO) a 540 nm con un instrumento Labsystem iEMS Reader MF. Se calculó la supervivencia de células tumorales (TCS) usando la siguiente ecuación: TCS = (DOpocillo expuesto a fármaco/DOpocillos de control media) X 100%. Se calculó el valor de TCS50, la concentración de fármaco mortal para el 50% de las células tumorales, a partir de curvas de dosis-respuesta apropiadas.

Tabla 2: valores de CI50 para compuestos individuales determinados para nueve tipos de líneas celulares (no) malignas

CI50 [M.l-1]

Línea celular

CCRF-CEM CEM-DNR A549 K562 K562-TAX

CB-2

98,3 ± 3,8 96,7 ± 3,8 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 99,9 ± 0,2

CB-4

61,7 ± 17,8 74,5 ± 2,8 95,5 ± 3,7 74,3 ± 3,7 55,2 ± 4,7

CB-5

85,4 ± 22,6 99,8 ± 0,4 100,0 ± 0,0 98,6 ± 2,2 66,4 ± 8,0

CB-6

20,2 ± 1,7 98,1 ± 3,0 77,8 ± 10,8 27,5 ± 7,1 56,9 ± 15,1

CB-10

79,5 ± 22,7 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 99,6 ± 1,1 73,6 ± 11,1

CB-12

100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0

CB-13

62,0 ± 3,0 68,0 ± 1,6 86,5 ± 4,6 71,8 ± 1,4 64,2 ± 4,5

CB-15

17,3 ± 1,2 47,9 ± 7,6 33,7 ± 7,7 17,7 ± 0,7 16,6 ± 1,2

CB-16

89,9 ± 6,0 95,1 ± 7,9 100,0 ± 0,0 98,6 ± 2,1 95,8 ± 4,4

CB-17

95,1 ± 5,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0

CI50 [M.l-1]

Línea celular

HCT116 HCT116p53-/- BJ MRC-5

CB-2

100,0 ± 0,0 99,9 ± 0,3 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0

CB-4

69,2 ± 3,0 71,9 ± 3,4 76,4 ± 3,3 779 ± 1,0

CB-5

75,3 ± 4,1 64,7 ± 9,1 100,0 ± 0,0 93,2 ± 7,0

CB-6

78,4 ± 17,0 24,2 ± 3,2 100,0 ± 0,0 99,7 ± 0,7

CB-10

96,4 ± 4,5 99,6 ± 0,9 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0

CB-12

100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0

CB-13

55,5 ± 1,8 61,3 ± 4,9 88,4 ± 6,1 75,6 ± 1,5

CB-15

16,6 ± 0,2 17,6 ± 0,9 65,2 ± 4,4 227,0 ± 4,8

CB-16

84,8 ± 3,0 78,4 ± 3,9 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0

CB-17

100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0

De manera sistemática con el mecanismo de acción propuesto (inhibición de anhidrasa carbónica IX), sólo se observó actividad citotóxica moderada en células tumorales independientemente de las características de origen histogenético, genéticas y de resistencia a fármacos. Sin embargo, los compuestos fueron sistemáticamente menos citotóxicos en líneas celulares de fibroblastos no malignas BJ y MRC-5, demostrando por tanto un perfil toxicológico in vitro favorable.

Ejemplo 29

15

25

35

45

55

65

Farmacología de los compuestos

Estudio de determinación de la dosis

Con el fin de demostrar el aprovechamiento farmacéutico de los presentes compuestos, se determinó la dosis máxima tolerada (MTD) y la toxicidad limitante de la dosis (DLT) de dos inhibidores prometedores de la anhidrasa carbónica IX (CB-4 y CB-16) tras la administración de una única dosis. Se disolvieron ambos compuestos en dimetilsulfóxido al 10%/agua (vol/vol) a una concentración madre de 10 mg/ml y se aplicaron por vía intraperitoneal a ratones hembra NMRI (mínimo de 3/grupo) en dosis ascendentes hasta que se alcanzó la MTD. Se alojaron los animales en condiciones libres de patógenos específicas, con agua y alimentos a voluntad. Se observaron clínicamente los ratones tratados cada hora durante las primeras 8 horas, después cada 12 horas hasta que se resolvieron los posibles efectos secundarios. Finalmente, se estimó que la MTD era de 125 mg/kg para CB-4 y 166 mg/kg para CB-16, respectivamente. La toxicidad limitante de la dosis fue similar para ambos de estos compuestos e incluyó algo de somnolencia, apatía e irritación local. En conjunto, la MTD alcanzada y la MDT observada respaldan un uso farmacéutico adicional de los inhibidores de anhidrasa carbónica IX.

Farmacocinética orientativa

Se sometió a prueba la capacidad de los compuestos para alcanzar concentraciones terapéuticamente relevantes en líquidos biológicos en un experimento de farmacocinética orientativa. Se administraron los compuestos CB-4 y CB-6 por vía intraperitoneal a ratones NMRI hembra a la MTD (125 y 166 mg/kg, respectivamente). Se sacrificaron los animales con anestesia mediante sangrado del plexo braquial tras 0,5, 1, 3, 6, 9, 12, 24 y 36 horas (3 ratones por grupo). Se recogió la sangre en hielo y se procesó para la separación de suero en el plazo de 60 minutos tras la toma de muestras. Se evaporó el suero hasta sequedad con un dispositivo ThermoScientific SPD SpeedVac (72 h, 50ºC) hasta que se analizó. Se precipitaron los residuos mediante 225 l de acetonitrilo con una adición de 25 l de SDS al 10% (p/p en agua), se agitaron después con vórtex durante 5 min y se centrifugaron durante 5 min a 14000 rpm a temperatura ambiente. Se transfirió una alícuota del sobrenadante a un vial de inyector automático de 250 l. Se determinaron las concentraciones de CB-4 o CB-16 en suero mediante el sistema de cromatografía de HPLC de Merck-Hitachi LaChrom 7000 equipado con un detector por red de diodos 7450 (DAD) y un inyector L7250 de Intelligent en la columna Merck LichroCARTR PurospherR STAR RP-8e, 250x2 mm, con un tamaño de partícula de 5 m. Condiciones de HPLC: la fase móvil contiene acetato de hexilamina 6,25 mmol/l (ajustado a pH 6,25) en acetonitrilo acuoso al 72%. Detección DAD (220-600 nm) con longitudes de onda fijadas a 312, 315, 318 y 286 nm. Intervalo de sensibilidad de 0,2 ó 0,02 A.U.F.S. (unidades de absorbancia a escala completa). Se usó un método de cromatografía de fase inversa de pares de iones con una elución isocrática a 300 l/min. Inyección de muestra: 20 l. La figura 22 muestra las concentraciones en suero de ratones individuales y promedio de los compuestos 0,536 horas tras la administración. Los datos sugieren que ambos de CB-4/CB-16 mostraron en condiciones in vivo una farmacocinética lineal con concentraciones en suero que superaron 120-12x la CI50 de anhidrasa carbónica IX in vitro (calculada a partir de los valores de cmáx) siendo T1/2 de 6,5-5 horas, lo que sugiere por tanto potencial para su uso farmacológico.

Ejemplo 30

El efecto de inhibidores de CAIX sobre el pH intracelular (pHi) en células tumorales que (no) expresan CA IX.

Se evaluó el efecto de inhibidores de carborano de CAIX (anhidrasa carbónica IX) sobre la línea celular de cáncer colorrectal HCT116 que expresa la enzima CAIX frente a la línea celular de leucemia linfoblástica T CCRF-CEM negativa para CA IX. Se usó acetazolamida, un inhibidor conocido de CAIX, como patrón. Se cultivaron células HCT116/CCRF-CEM en medio McCoy/RPMI complementado con FCS al 10% y antibióticos y se sembraron a alta densidad (1,56 células por placa de 3,5 cm) para inducir hipoxia pericelular y por tanto estimular la expresión de CA

IX. Se evaluó la medición del pHi tal como se describe en Cianchi et al. [Cianchi F., et al. Selective inhibition of carbonic anhydrase IX decreases cell proliferation and induces aramide-mediated apoptosis in human cancer cells. The Journal of Pharmacology and Experimetal Therapeutics, 2010, vol. 334, n.º 3, 710-719].

En resumen, se trataron las células mediante carboranos/acetazolamida durante 24 horas a una concentración subcitotóxica de 1/50 M. Se midió el pHi mediante citometría de flujo en cultivos celulares previamente tratados con 10 M de sonda sensible al pH éster 1-acetoximetílico de carboxiseminaftoroda-fluor (SNARF, Invitrogen, CA) durante 15 min a 37ºC. Tras la incubación, se lavaron las células dos veces con PBS. Dado que la adición de bicarbonato puede afectar al pHi, todas las incubaciones y lavados de células se realizaron en tampón libre de bicarbonato. Se excitó SNARF a 488 nm y se emitió a 580 y 640 nm. Después, se usó la razón de las longitudes de onda de emisión a 640/580 nm para estimar el pHi a partir de una curva de calibración. Se preparó la curva de calibración mediante la técnica de nigericina. En este método, tras marcar con SNARF las células no tratadas, se resuspendieron alícuotas de suspensiones celulares en un tampón con alto contenido en potasio a pH específico (habitualmente de 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6 y 7,8). Después, se fijaron las suspensiones celulares a un valor de pH específico mediante la adición de nigericina 0,03 M (Sigma-Aldrich). La nigericina es un ionóforo que permite el intercambio de iones H por K, eliminando por tanto el gradiente pH a través de la membrana celular. Cuando las

concentraciones de K interna y externa son aproximadamente iguales, el pH se equilibra rápidamente al pH de la disolución de baño. Se adquirió un total de 20.000 acontecimientos en un citómetro de flujo FACS ARIA II (Becton Dickinson) para su análisis adicional.

5 Se usaron adicionalmente los valores de razón de fluorescencia (640/580 nm) calculados para cada punto de pH para construir una curva de calibración en el software Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA), a partir de la cual se determinaron los valores de pHi en células tratadas (tabla 3).

Estos datos sugieren que el inhibidor de CAIX de control, acetazolamida, indujo una acidificación intracelular leve,

10 mientras que diversos derivados de carborano (CB-6, CB-15) fueron mejores que la acetazolamida a concentraciones 50 veces inferiores (50 frente a 1 M). Sin embargo, los compuestos no fueron activos en células CCRF-CEM sin expresión de CAIX, demostrando esto la especificidad de la inhibición. De manera interesante, no hubo ninguna correlación directa en entre los ensayos de CAIX enzimáticos y celulares, lo que sugiere una farmacología compleja, que implica lo más probablemente la estabilidad, unión a proteína y metabolismo de los

15 compuestos expuestos a células/organismos vivos.

Tabla 3: Medición mediante citometría de flujo de pHi. Efectos de acetazolamida 50 M y carboranos individuales a 1 M sobre células HCT116 tras 24 horas de incubación. Los valores en negrita indican los compuestos con mayor actividad inhibidora que la acetazolamida en células HCT116.

20

pHi

Compuesto

HCT116 CCRF-CEM

control

7,516 7,362

acetazolamida

7,47 7,34

CB-2

7,572 7,308

CB-4

7,538 7,385

CB-5

7,483 7,378

CB-6

7,192 7,352

CB-10

7,688 7,328

CB-12

7,704 7,395

CB-13

7,51 7,452

CB-15

7,343 7,472

CB-16

7,563 7,442

CB-17

7,571 7,412

Aplicabilidad industrial

La invención puede usarse en la industria farmacéutica y en medicina para el tratamiento de enfermedades 25 tumorales.

Claims (1)

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