JP4713341B2 - Ca−ix特異的阻害剤 - Google Patents
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Description
図1A〜Cは、1522塩基対(bps)からなるMN/CA9 cDNA配列の全長(配列番号1)および459個のアミノ酸から構成されるMN/CA-IXアミノ酸(aa)配列の全長(配列番号2)を示す。図2A〜Fは、10,898bpからなるMN/CA9のゲノム配列(配列番号3)を示す。
CA-IXの発現と腫瘍内低酸素症(微小電極によって測定、または低酸素症マーカー物質であるピモニダゾール(pimonidazole)の取込によって検出、あるいは壊死の程度によって評価)との間には強い関係があることが子宮頸管、乳房、頭および首、膀胱ならびに非小細胞性肺癌(NSCLC)において示されている(参考文献番号8、11、21、35、48、56、111、122)。さらに、NSCLCおよび乳癌においては、血管形成、アポトーシス阻害および細胞−細胞間接着破壊に関与しているタンパク質の型とCA-IXとの間に相関関係が観察されており、該酵素の強い関与が、臨床転帰が良くないことの一因であると考えられる(参考文献番号8)。低酸素症は、腫瘍の浸潤を助長させる細胞外環境の酸性化に関係しており、そのような過程の中において、CA-IXは、その触媒活性を介して作用するものと考えられる(参考文献番号86)。従って、特異的阻害剤を用いてMN/CA-IXを阻害することは、CA-IXを発現している癌の治療に対して新規な方法を確立するものである。
非特許文献4においては、CA阻害剤(CAI)の基本型であるアセタゾラミドは、別異の細胞毒性物質と組み合わせることによって抗癌治療における調節物質として作用することが報告されており、そのような細胞毒性物質としては、アルキル化剤;ヌクレオシドアナログ類;プラチナ誘導体類、ならびに、いくつかの腎腫瘍細胞系(Caki-1、Caki-2、ACHNおよびA-498)に対して腫瘍転移を抑制し、浸潤能を低下させるようなその他の物質などが挙げられる。そのような研究においては、CAIは、ひとつまたはそれ以上のCAアイソザイム類を過剰発現する腫瘍の制御に使用できることが示されている。アセタゾラミド(単独または組み合わせて)の抗癌効果は、CA阻害後に生じた腫瘍内環境の酸性化によるものであるという仮説が立てられた(参考文献番号20)が、このとき、該薬物のその他の作用機構については除外されていない。非特許文献5は、臨床的に使用されている2つの強力なスルホンアミドCAI類、すなわちメタゾラミドおよびエトクスゾラミドを用いてヒトリンパ腫細胞の細胞培養系を処理した場合にイン・ビトロ(in vitro)増殖阻害が起こったことは、CA阻害の結果、ヌクレオチド合成のための重炭酸塩(HCO3 -はカルバモイルリン酸合成酵素IIの基質である)の蓄えが減少したからではないかという仮説を記載している(参考文献番号20)。
炭酸脱水酵素(CA類)は、生理学的に非常に重要な亜鉛金属酵素をコードしている遺伝子群からなる大きなファミリーを形成している。二酸化炭素の水和に関する可逆的触媒として、これらの酵素は、呼吸、石灰化、酸塩基平衡、骨吸収、房水の生成、髄液、唾液および胃酸を含む多様な生物学的過程に関与している(非特許文献8)。CA類は、生物に広く分布している。ヒトを含む高等脊椎動物においては、14種類の別異のCAアイソザイムまたはCA関連タンパク質(CARP)について文献に記載されており、細胞レベル下での局在および組織分布が非常に異なっている(参考文献番号40、93、95、94、102)。基本的には、数種のサイトゾル型(CA-I〜III、CA-VII)、4種の膜結合アイソザイム(CA-IV、CA-IX、CA-XIIおよびCA-XIV)、1種類のミトコンドリア型(CA-V)、ならびに分泌されたCAアイソザイムであるCA-VIが存在する(参考文献番号40、93、94、95、102)。
本発明は、(1)癌関連、低酸素状態誘導性のMN/CA-IXを選択的に標的とするある種の炭酸脱水酵素阻害剤(CAI類)、好ましくはスルホンアミド類を認識すること;(2)そのようなCAI類、好ましくはスルホンアミド類を先導化合物としてMN/CA-IX特異的阻害剤の設計および合成に使用すること;(3)MN/CA-IXを介した腫瘍微小環境の酸性化を阻害することに基づく抗癌治療に該MN/CA-IX特異的阻害剤を使用すること;(4)造影法(シンチグラフィーなど)を含む診断/予後診断法、ならびに遺伝子治療にMN/CA-IX特異的な強力阻害剤を使用することに関する。特に、本発明は、抗癌特性を有する薬物の開発にCA-IX特異的阻害剤を使用すること、ならびに、CA-IX発現、特にCA-IXの過剰発現によって特徴付けられる腫瘍発生前および腫瘍性疾患に対して従来から行われている化学療法を調節することに関する。
a)化合物の一連の希釈液、ならびに、MN/CA-IXタンパク質もしくはMN/CA-IXタンパク質の炭酸脱水酵素ドメインを含有するフラグメントの一連の希釈液を調製し;
b)前記化合物の希釈液を、前記MN/CA-IXタンパク質もしくは該MN/CA-IXタンパク質のフラグメントの希釈液と混合して、20℃で10分間プレインキュベートし;
c)反応容器内において、前記化合物の希釈液と前記MN/CA-IXタンパク質もしくはタンパク質のフラグメントの希釈液との混合物をプレインキュベートしたものを、飽和CO2溶液、0.2mMのフェノールレッド、0.1MのNa2SO4、および10mMのHepes緩衝液(pH7.5 )から実質的になる基質と、20℃で10〜100秒かけて混合し;
d)同時に、ストップフロー分光光度計を用いて、反応容器の内容物について吸収極大波長557nmにおける吸光度を測定し;さらに、
e)前記化合物の阻害定数KIを求め;
このとき、該阻害定数KIが約50nM未満の場合に、該化合物はMN/CA-IX酵素活性の強力な阻害剤であると判断され;さらに、該化合物は、アセタゾラミド、エトクスゾラミド、メタゾラミドおよびシアナートよりなる群から選択されたものではない。前記哺乳類は、好ましくはヒトであり、KIは、好ましくは約35nM未満、より好ましくは約25nM未満、さらに好ましくは約10nM未満である。
a)化合物の一連の希釈液およびCA-IIの一連の希釈液を調製し;
b)前記化合物の希釈液をCA-IIの希釈液と混合して、20℃で10分間プレインキュベートし;
c)前記化合物と前記CA-IIとの混合物をプレインキュベートしたものを、反応容器内の無水アセトニトリル中の4−ニトロフェニルアセタートから実質的になる基質溶液に、25℃において1〜3分間かけて加え;
d)同時に、分光光度計を用いて、前記反応容器の内容物について、吸収極大波長400nmにおける吸光度を測定し;さらに、
e)前記化合物の阻害定数KI を求める。
a)化合物の一連の希釈液、ならびに、MN/CA-IXタンパク質もしくはMN/CA-IXタンパク質の炭酸脱水酵素ドメインを含有するフラグメントの一連の希釈液を調製し;
b)前記化合物の希釈液を、前記MN/CA-IXタンパク質もしくは該MN/CA-IXタンパク質のフラグメントの希釈液と混合して、20℃で10分間プレインキュベートし;
c)反応容器内において、前記化合物の希釈液と前記MN/CA-IXタンパク質もしくはタンパク質のフラグメントの希釈液との混合物をプレインキュベートしたものを、飽和CO2溶液、0.2mMのフェノールレッド、0.1MのNa2SO4、および10mMのHepes緩衝液(pH7.5 )から実質的になる基質と、20℃で10〜100秒かけて混合し;
d)同時に、ストップフロー分光光度計を用いて、反応容器の内容物について吸収極大波長557nmにおける吸光度を測定し;さらに、
e)前記膜不透過性化合物の阻害定数KIを求め;
このとき、該阻害定数KIが約50nM未満の場合に、該膜不透過性化合物はMN/CA-IX酵素活性の強力な阻害剤であると判断される。前記哺乳類は、好ましくはヒトであり、KIは、好ましくは約35nM未満、より好ましくは約25nM未満、さらに好ましくは約10nM未満である。
a)膜不透過性化合物の一連の希釈液およびCA-IVの一連の希釈液を調製し;
b)前記膜不透過性化合物の希釈液をCA-IVの希釈液と混合して、20℃で10分間プレインキュベートし;
c)前記化合物と前記CA-IVとの混合物をプレインキュベートしたものを、反応容器内の無水アセトニトリル中の4−ニトロフェニルアセタートから実質的になる基質溶液に、25℃において1〜3分間かけて加え;
d)同時に、分光光度計を用いて、前記反応容器の内容物について、吸収極大波長400nmにおける吸光度を測定し;さらに
e)前記膜不透過性化合物の阻害定数KI を求める。
nは0、1または2であり;
R2、R3、R4およびR6は、水素、炭素数が1〜12であるアルキル部位、およびアリール部位よりなる群からそれぞれ独立して選択される。さらに好ましくは、そのような化合物は、
R2は、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、tert−ブチルおよびフェニルよりなる群から選択され;
R3は、水素およびメチルよりなる群から選択され;
R4は、水素、メチルおよびフェニルよりなる群から選択され;さらに、
R6は、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピルおよびフェニルよりなる群から選択される。またさらに好ましくは、そのような化合物は、
R3は水素であり;
R4およびR6はフェニルであり;
nが0の場合には、R2は、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチルおよびフェニルよりなる群から選択され;さらに、
nが1または2の場合には、R2は、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、tert−ブチルおよびフェニルよりなる群から選択される。その他の好ましい化合物としては、
R3が水素であり;
R4はフェニルであり;さらに、
nが0の場合にはR2とR6は同じ置換基であって、メチル、エチル、n−プロピルおよびイソプロピルよりなる群から選択され;さらに、
nが1または2の場合にはR2とR6は同じ置換基であって、メチル、エチル、n−プロピルおよびイソプロピルよりなる群から選択される。その他の好ましい化合物としては、R2、R3、R4およびR6がメチルであるものが挙げられる。さらに好ましいCA-IX特異的阻害剤化合物は、
nが0、1または2の場合には、R2、R4およびR6はメチルであり、R3は水素であり;あるいは、
nが1または2の場合には、R2はイソプロピルであり、R3は水素であり、R4はメチルであり、R6はメチルもしくはイソプロピルであり;あるいは、
nが1または2の場合には、R2およびR6はフェニルであり、R3およびR4は水素である。
nが2の場合に、R2およびR6はメチルであり、R3は水素であり、R4はフェニルであり;あるいは、
nが2の場合に、R2およびR6はエチルであり、R3は水素であり、R4はフェニルであり;あるいは、
nが2の場合に、R2、R3、R4およびR6はメチルである。
R1は、メチル、エチル、イソプロピル、n−プロピル、n−ブチル、tert−ブチルおよびフェニルよりなる群から選択され;
R2は、水素およびメチルよりなる群から選択され;
R3は、水素、メチル、n−ノニルおよびフェニルよりなる群から選択され;
R4は、水素およびメチルよりなる群から選択され;さらに、
R5は、メチル、エチル、イソプロピル、n−プロピル、n−ブチル、tert−ブチル、n−ノニルおよびフェニルよりなる群から選択される。さらに好ましい化合物においては、
R2およびR4は水素であり;
R3はメチルであり;さらに、
R1およびR5は、同じ置換基であって、メチル、イソプロピルおよびtert−ブチルよりなる群から選択される。またさらに好ましい化合物においては、
R2およびR4は水素であり;
R3はフェニルであり;さらに、
R1およびR5は、同じ置換基であって、メチル、エチル、イソプロピル、n−プロピル、n−ブチルおよびフェニルよりなる群から選択される。さらに好ましい化合物においては、
R1は、メチル、エチル、イソプロピル、n−プロピルおよびn−ブチルよりなる群から選択され;
R2およびR4は水素であり;さらに、
R3およびR5はフェニルである。その他の好ましい化合物においては、
R2およびR4は水素であり、R3は水素またはメチルであり、R1およびR5はフェニルである;あるいは、
R1、R2およびR5はメチルであり、R3はフェニルであり、R4は水素である;あるいは、
R1およびR4はメチルであり、R2は水素であり、R3およびR5はn−ノニルである。
R1はメチルまたはイソプロピルであり、R3およびR5はメチルであり、R2およびR4は水素である;あるいは、
R1およびR5は同じ置換基であって、メチルまたはエチルであり、R2およびR4は水素であり、R3はフェニルである;あるいは、
R1、R2、R3およびR5はメチルであり、R4は水素である。
R2は、水素およびメチルよりなる群から選択され;
R3は、水素、メチル、n−ノニルおよびフェニルよりなる群から選択され;
R4は、水素およびメチルよりなる群から選択され;さらに
R5は、メチル、エチル、イソプロピル、n−プロピル、n−ブチル、tert−ブチル、n−ノニルおよびフェニルよりなる群から選択されるが、例外的に次のような場合がある
R2およびR4が水素であって、R3およびR5がメチルである場合には、R1はメチルではない;さらに、
R2およびR4が水素であって、R3がフェニルであって、R5がメチルである場合には、R1はメチルではない;さらに、
R2およびR4が水素であって、R3およびR5がフェニルである場合には、R1はフェニルではない。複素環式スルホンアミド類の好ましいピリジニウム誘導体類としては、
R2およびR4は水素であり;
R3はメチルであり;さらに、
R1およびR5は同じ置換基であって、イソプロピルおよびtert−ブチルよりなる群から選択されるものであり、ならびに、
R2およびR4は水素であり;
R3はフェニルであり;さらに、
R1およびR5は同じ置換基であって、エチル、イソプロピル、n−プロピルおよびn−ブチルよりなる群から選択されるのもであり;ならびにさらに好ましくは、
R1は、メチル、エチル、イソプロピル、n−プロピル、n−ブチルおよびtert−ブチルよりなる群から選択され;
R2およびR4は水素であり;
R3およびR5はフェニルであるものが挙げられる。複素環式スルホンアミド類のさらに好ましいピリジニウム誘導体類としては、
R1はイソプロピルであり、R3およびR5はメチルであり、R2およびR4は水素であるもの;あるいは、
R2およびR4は水素であり、R3は水素またはメチルであり、R1およびR5はフェニルであるもの;あるいは、
R1、R2およびR5はメチルであり、R3はフェニルであり、R4は水素であるもの;あるいは、
R1、R2、R3およびR5はメチルであり、R4は水素であるもの;あるいは、
R1およびR4はメチルであり、R2は水素であり、R3およびR5はn−ノニルであるものが挙げられる。
本明細書においては以下の略号を使用している:
aa−アミノ酸
AAZ−アセタゾラミド
ATCC−アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)
bp−塩基対
BRL−ベセスダ研究所(Bethesda Research Laboratories)
BRZ−ブリンゾラミド
BSA−ウシ血清アルブミン
CA−炭酸脱水酵素
CAI−炭酸脱水酵素阻害剤
CAM−細胞接着分子
CARP−炭酸脱水酵素関連タンパク質
Ci−キュリー
cm−センチメートル
CNS−中枢神経系
cpm−カウント/分
C-末端−カルボキシ末端
℃−摂氏温度
DCP−ジクロロフェナミド
DEAE−ジエチルアミノエチル
DMEM−ダルベッコ変形イーグル培地(Dulbecco modified Eagle medium)
ds−二重らせんの
DZA−ドルゾラミド
EDTA−エチレンジアミン四酢酸
EZA−エトクスゾラミド
F−繊維芽細胞
FCS−ウシ胎仔血清
FITC−フルオレセインイソチオシアナート
H−HeLa細胞
IC−細胞内
kb−キロベース
kbp−キロベース対
kdまたはkDa−キロダルトン
KI−阻害定数
KS−ケラタン硫酸
LTR−長末端反復
M−モル濃度
mA−ミリアンペア
MAb−モノクローナル抗体
ME−メルカプトエタノール
MEM−最小必須培地
min.−分
mg−ミリグラム
ml−ミリリットル
mM−ミリモル濃度
MMC−マイトマイシンC
mmol−ミリモル
MZA−メタゾラミド
N−正常濃度
NEG−ネガティブ、負、マイナス
ng−ナノグラム
nm−ナノメーター
nM−ナノモル濃度
nt−ヌクレオチド
N-末端−アミノ末端
ODN−オリゴデオキシヌクレオチド
ORF−オープンリーディングフレーム
PA−プロテインA
PBS−リン酸緩衝生理食塩水
PCR−ポリメラーゼ連鎖反応
PG−プロテオグリカン
pI−等電点
PMA−フォルボール12−ミリステート13−アセテート
POS−ポジティブ、正、プラス
Py−ピリミジン
QAS−スルホニルアミド4級アンモニウム塩
QSAR−定量的構造活性相関
RACE−cDNA末端の迅速増幅
RCC−腎細胞癌
RIA−ラジオイムノアッセイ
RIP−放射免疫沈降
RIPA−放射免疫沈降アッセイ
RNP−リボヌクレアーゼ保護アッセイ
RT-PCT−逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
SAC−黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)細胞
SAR−構造活性相関
sc−皮下
SDS−ドデシル硫酸ナトリウム
SDS-PAGE−ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
SINE−短い散在反復配列
SP−シグナルペプチド
SP-RIA−固相ラジオイムノアッセイ
TBE−Tris−ホウ酸/EDTA電気泳動緩衝液
TC−組織培養
TCA−トリクロロ酢酸
TC培地−組織培養培地
tk−チミジンキナーゼ
TM−膜貫通
Tris−tris(ヒドロキシメチル)アミノメタン
μCi−マイクロキュリー
μg−マイクログラム
μl−マイクロリットル
μM−マイクロモル濃度
細胞系
BL21(DE3)−リンズコッグ(Lindskog)らのグループによって記載されている大腸菌(Escherichia coli)株(CA-I,II発現用)(リンズコッグ(Lindskog)ら、「部位特異的突然変異誘発によって実験を行ったヒト炭酸脱水酵素IIの構造活性相関(Structure-function relations in human carbonic anhydrase II as studied by site-directed mutagenesis 」、「炭酸脱水酵素−生化学および遺伝学から生理学および臨床薬物まで(Carbonic anhydrase-From biochemistry and genetics to physiology and clinical medicine)」より(ボトレ(Botre)ら編、VCH、ワインハイム、pp.1-13(1991))
BL21-GOLD(DE3)−CA-IXの発現用に使用した大腸菌(Escherichia coli)株(ストラタジーン(Stratagene)社)
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列記号
本明細書においては、以下の記号を用いてヌクレオチドを表記する:
塩基
記号 意味
A アデニン
C シトシン
G グアニン
T チミン
U ウラシル
I イノシン
M AまたはC
R AまたはG
W AまたはT/U
S CまたはG
Y CまたはT/U
K GまたはT/U
V AまたはCまたはG
H AまたはCまたはT/U
D AまたはGまたはT/U
B CまたはGまたはT/U
N/X AまたはCまたはT/U
アミノ酸は20個あり、それらは、隣接する3個のヌクレオチドの別異の配列(トリプレットコードまたはコドン)によって特定され、特定の順序で連結されることにより、特徴的なタンパク質を形成する。本明細書においては、3文字または1文字協定を用いてそのようなアミノ酸を特定し、以下のように取り決める(例えば、図1参照):
アミノ酸名 3文字略号 1文字略号
アラニン Ala A
アルギニン Arg R
アスパラギン Asn N
アスパラギン酸 Asp D
システイン Cys C
グルタミン酸 Glu E
グルタミン Gln Q
グリシン Gly G
ヒスチジン His H
イソロイシン Ile I
ロイシン Leu L
リシン Lys K
メチオニン Met M
フェニルアラニン Phe F
プロリン Pro P
セリン Ser S
スレオニン Thr T
トリプトファン Trp W
チロシン Tyr Y
バリン Val V
未知のもの、その他 X
実施例1においては、腫瘍関連アイソザイムであるCA-IXの阻害に関して、1〜26のスルホンアミド類(図4A〜Bに示す)について調べた。化合物1〜6、11〜12、20および26は市販されているが、7〜10(参考文献番号43)、13〜19(参考文献番号24、90、97)および21〜25(参考文献番号79)については既報に従って調製した。臨床的に使用されている6個の化合物についてもアッセイを行った。実施例2の化合物(芳香環式スルホンアミド類のピリジニウム誘導体類)に関しては、スルファニルアミドであるホモスルファニルアミドまたは4−(2−アミノエチル)−ベンゼンスルホンアミドと2,6−ジ−、2,4,6−トリ−または2,3,4,6−テトラ置換ピリリウム塩とを反応させることにより、本明細書において実験を行ったピリジニウム塩27〜70が得られた(一般的なバイエル−ピカード合成による)(参考文献番号9、10、97)。
化学:アミノベンゾールアミド(5−(4−アミノベンゼンスルホニルアミノ)−1,3,4−チアジアゾール−2−スルホンアミド)(参考文献番号97)に2,6−ジ−、2,4,6−トリ−もしくは2,3,4,6−テトラ置換ピリリウム塩を反応させるにあたっては、求核剤を用いたそのような誘導体類の一般的な合成法に従うことにより(図5のスキーム1に示す)、本明細書において実験を行ったピリジニウム塩71〜91が得られた(参考文献番号6、26、108)。
本明細書において使用している「MN/CA-IX」および「MN/CA-9」とは、MNと同義である。また、G250は、MNタンパク質/ポリペプチドをさすものと考えられている(参考文献番号112)。
図1A〜Cには、ザヴァダ(Zavada)らによるWO 95/34650に記載されている単離されたMN cDNAクローンの全長(配列番号1)のヌクレオチド配列を表示している。図2A〜Fは、完全なMN ゲノム配列(配列番号3)を表示している。
本明細書におけるアッセイは、MNタンパク質の酵素活性を阻害する化合物をスクリーニングするためのものである。そのようなアッセイにおいては、該化合物に該MNタンパク質、ならびに飽和CO2および4−ニトロフェニルアセタートよりなる群から選択される基質、好ましくは飽和CO2を加えてインキュベートし、該化合物の阻害定数KIを計算したが、このとき、MNタンパク質の該酵素活性は、ストップフロー分光光度計を用い、インジケーターのpH変化によって測定した。
多数のX線結晶構造が利用可能な(単独、または阻害剤と活性剤とのコンプレックスとして)hCA-II(参考文献番号1、2、14、15、19a、19b、37、38)とは全く異なり、現在のところ、アイソザイムIXのX線結晶構造は得られていない。これら2種類のアイソザイムの活性部位残基およびhCA-IIの構造を調べることは、上記の阻害データおよびCA-IX特異的阻害剤に関する関連性を説明する一助になるはずである。
本発明に従うMN特異的阻害剤は、有機性および/もしくは無機性、好ましくは有機性であり、また、上に概説したように、単独で、または他の化学療法剤と組み合わせて腫瘍および/もしく腫瘍発生前疾患の治療に使用することができる。
一般法−融点:加熱プレート顕微鏡(補正なし);IRスペクトル:KBr錠法、400〜4000cm-1、Perkin-Elmer 16PC FTIRスペクトロメーター;1H-NMRスペクトル:Varian 300CXP装置(化学シフトは、Me4Siを標準物質とし、相対的δ値で表した);元素分析:Carlo Erba Instrument CHNS Elemental Analyzer,Model 1106。全ての反応は、0.25mmのプレコートシリカゲルプレート(E.メルク(Merck)社)を用いた薄層クロマトグラフィー(TLC)によってモニターした。ピリリウム塩は文献(参考文献番号6、26、108)の記載に従い、一般的に、オレフィン(またはそれらの前駆体)のビスアシル化によって調製したが、アミノベンゾールアミドに関してはより早い時期に文献に記載されていた(参考文献番号97)。標準物質として使用したその他のスルホンアミド類は購入可能であった。
5mlの無水メタノール中に2.9mMのアミノベンゾールアミド(参考文献番号97)および2.9mMのピリリウム塩(図5に図示)を懸濁させ、14.5mMのトリエチルアミンと5.8mMの無水酢酸との撹拌混合物中に加えた。5分間撹拌した後、反応混合物中にさらに10mlのメタノールを加え、これを加熱して15分間還流させた。次に、14.5mMの無水酢酸を加え、さらに2〜5時間加熱を続けた。無水酢酸の役割は、ピリリウム塩と芳香環式アミンとの間の縮合反応中に生成した水と反応することであり、一般式(B)(上述)で表されるピリジニウム塩の生成を平衡化するためである。アミノベンゾールアミドの場合には、この方法が、許容できる収量のピリジニウム塩が得られる唯一の方法であるが、これはおそらく、アミン基上のスルファモイルアミノチアジアゾール部位が脱活性化されることによるものであり、これらの反応試薬に対する該部位の求核性が低下し、反応性が消失する。沈殿したピリジニウム塩は、濃アンモニア溶液で処理することによって精製し(また、この操作により、未反応のピリリウム塩が酸性溶媒に可溶性の対応するピリジンに転換する)、過塩素酸を用いて再沈殿させ、さらに、2〜5%のHClO4を加えた水から再結晶させた。
hCA-IXの触媒性ドメインのcDNA(パストレック(Pastorek)らの記載(参考文献番号72)に従って単離した)は、PCRおよびベクターpCAL-n-FLAG(ストラタジーン(Stratagene)社から購入)用の特異的プライマーを用いて増幅させた。得られた構築体は、pCAL-n-FLAGベクターに挿入し、大腸菌(Escherichia coli)株BL21-GOLD(DE3)(ストラタジーン(Stratagene)社から購入)内でクローニング、発現させた。ウィンゴ(Wingo)らの記載(参考文献番号116)に従い、4Mの尿素および2%のTriton X-100を含む緩衝溶液(pH8)中でバクテリア細胞を溶解し、ホモジネートした。可溶性タンパク質および膜関連タンパク質、ならびにその他の細胞残渣を除去することを目的として、得られたホモジネートを十分に遠心分離した。残留尿素およびTriton X-100を除去することを目的として、水中でのホモジネーションおよび遠心分離を繰り返すことによって、得られたペレットを洗浄した。精製したCA-IX含有部は、6Mの塩酸グアニジンで変性させ、次に、100mMのMES(pH6)、500mMのL-アルギニン、2mMのZnCl2、2mMのEDTA、2mMの還元グルタチオン、1mMの酸化グルタチオンを含む溶液ですばやく希釈することによって活性型に戻した。活性型CA-IXは、10mMのHEPES(pH7.5)、10mMのTris−塩酸、100mMのNa2SO4および1mMのZnCl2を含む溶液中で十分に透析した。タンパク質量は分光光度計を用いた測定により、また活性はCO2を基質とするストップフロー測定(参考文献番号44)によって求めた。追加として、スルホンアミドアフィニティークロマトグラフィーによってタンパク質をさらに精製し(参考文献番号44)、酵素量は分光光度計を用いた測定により、活性はCO2を基質とするストップフロー測定(参考文献番号44)によって求めた(参考文献番号44)。
リンズコッグ(Lindskog)らの研究グループによって記載されているプラスミドpACA/hCA-IおよびpACA/hCA-IIを用い(参考文献番号54)、大腸菌(Escherichia coli)株BL21(DE3)内でヒトCA-IおよびCA-IIのcDNAを発現させた。細胞増殖の条件については参考文献番号12に記載されており、酵素は、カリファー(Khalifah)らの方法(参考文献番号45)に従ってアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。酵素濃度は280nmにおいて分光光度測定することによって求めたが、このとき、モル吸光度は、CA-Iに対しては49mM-1・cm-1、CA-IIに対しては54mM-1・cm-1であり、また、CA-Iに対してはMr=28.85kDaであり、CA-IIに対してはMr=29.3kDaであった(参考文献番号53、84)。CA-IVは、マレン(Maren)らの記載に従い、ウシ肺ミクロソームから単離し、エトクスゾラミドを用いた滴定によって濃度を求めた(参考文献番号59)。
CAの炭酸ヒドラーゼ活性のアッセイ
SX.18MV-R Applied Photophysicsストップフロー装置を用いてCAの炭酸ヒドラーゼ活性を調べた(参考文献番号44)。ポーカー(Poker)およびストーン(Stone)の分光光度法(参考文献番号76)のストップフロー変数を採用し、上述したSX.18MV-R Applied Photophysicsストップフロー装置を使用した(参考文献番号43)。指示薬としてフェノールレッド(濃度0.2mM)を使用し、吸収極大を557nmに設定し、緩衝液として10mMのHEPES(pH7.5)、0.1MのNs2SO4(イオン強度を一定に保つため)を用い、10〜100秒間の間、CAを触媒とする二酸化炭素の水和反応の経過を記録した。基質として、20℃においてCO2を飽和させた水溶液を使用した(参考文献番号44)。阻害剤のストック溶液(1mM)は、10〜20%(v/v)のDMSO(この程度の濃度では阻害作用はない)を加えた蒸留脱イオン水で調製し、その後、蒸留脱イオン水を用いて0.01Mに希釈した。阻害剤と酵素溶液の混合物は、アッセイ前に室温で10分間プレインキュベートすることによってE-Iコンプレックスを形成させた。各阻害剤濃度において3回実験を行い、文献に報告している値は、それらの結果の平均値である。
別異のCAアイソザイムによって触媒される4−ニトロフェニルアセタートの加水分解の初期速度は、IBMコンパチブルPCを配備したCary3装置を使用し、400nmにおいて分光光度計を用いてモニターした(参考文献番号76)。基質溶液は、無水アセトニトリルで調製し、基質濃度は2×10-2〜1×10-6Mとし 、25℃で行った。文献(参考文献番号76)に報告されているように、実験条件(pH7.40)下においては、加水分解によって生成した4−ニトロフェノラートのモル吸光係数εとしては18,400M-1cm-1を用いた。観察された速度から非酵素性加水分解速度を常に差し引いた。阻害剤の各濃度について3回実験を行い、文献に報告した値は各結果の平均値である。阻害剤のストック溶液(1〜3mM)は、10〜20%(v/v)のDMSO(この程度の濃度では阻害作用はない)を加えた蒸留脱イオン水で調製し、その後、蒸留脱イオン水を用いて0.01Mに希釈した。阻害剤と酵素溶液の混合物は、アッセイ前に室温で10分間プレインキュベートすることによってE-Iコンプレックスを形成させた。阻害定数KIは、参考文献番号44、76の記載に従って求めた。
Tris緩衝液(pH7.40、5mM)を用い、用時単離したヒト赤血球細胞(10ml)を数回十分に洗浄し、10分間遠心分離した後、2mMのスルホンアミド阻害剤25mlを加えて処理した。インキュベーションは、37℃において穏やかに撹拌しながら30〜120分間行った。30、60または120分間インキュベーションを行った後、赤血球を再度10分間遠心分離し、上清を傾捨し、上記緩衝液10mlを用いて細胞を3回洗浄することにより、結合していない阻害剤を除去した(参考文献番号81、96、98)。次に、25mlの蒸留水中で細胞を溶解させ、遠心分離して膜およびその他の不溶性不純物を除去した。得られた溶液を100℃で5分間加熱し(CAを変性させるため)、3種類の方法により、各サンプル中に存在していると考えられるスルホンアミド類をアッセイした:HPLC法(参考文献番号36);分光光度法(参考文献番号4);酵素法(参考文献番号76)。
腫瘍関連膜貫通炭酸脱水酵素IX(CA-IX)を阻害することに関しては、臨床的に使用されている6種類の化合物を含む一連の芳香環式および複素環式スルホンアミド類を用いて研究されてきた。臨床的に使用されている化合物としては、アセタゾラミド、メタゾラミド、エトクスゾラミド、ジクロロフェナミド、ドルゾラミドおよびブリンゾラミドが挙げられる。比較のために、生理学的に関連のあるアイソザイムIおよびII(サイトゾル型)ならびにIV(膜結合型)に対する阻害データも提供されている。
これまで、このような型の膜不透過性のCAIを用いたCA-IX阻害実験は報告されていない。従って、発明者らは、一般式(A)で表されるピリジニウム誘導体類のうちのいくつかについて、発明者らが最近クローニング、精製した腫瘍関連アイソザイムIX(参考文献番号33、43、114、115、117)の触媒性ドメインとの相互作用、ならびに、サイトゾル性で生理学的に関連のあるアイソザイムCA-I、II、および膜結合性アイソザイムCA-IVとの相互作用(参考文献番号88、96)について調査することにした。
表2のデータは、化合物27〜70の大多数が有効なCA-IX阻害剤として作用することをはっきりと示しており、このアイソザイムに対する化合物の親和性は、サイトゾル性アイソザイムCA-IおよびII、ならびに膜関連アイソザイムCA-IVに対する親和性と比較するとかなり異なっていた。
アミノベンゾールアミド(5−(4−アミノベンゼンスルホニルアミノ)−1,3,4−チアジアゾール−2−スルホンアミド)と、ピリジニウム環にアルキル−、アリール−またはアルキルおよびアリール基の組み合わせを有するトリ−/テトラ−置換ピリリウム塩とを反応させることによって、正の電荷を帯びた一連のスルホンアミド類が得られた。これらの新規化合物は、塩様の性質を有することから膜不透過性であり、生理学的に関連のある4種の炭酸脱水酵素(CA、EC 4.2.1.1)アイソザイム類、すなわち、サイトゾル性のhCA-IおよびII、膜結合性のbCA-IVならびに膜結合性腫瘍関連アイソザイムhCA-IXに対する阻害作用をアッセイした。これら新規誘導体は、腫瘍関連アイソザイムCA-IXに対する親和性が高く、膜不透過性であることから、腫瘍関連アイソザイムのみを選択的に阻害し、サイトゾル性のアイソザイムは阻害しないような(新規誘導体はサイトゾル性アイソザイムに対しても高い阻害作用を有しているが)興味深いCA阻害剤候補となり得る。
CA阻害:化合物71〜91を用いたアイソザイムI、II、IVおよびIXに対する阻害データを表3に示す。
発明者らは、正の電荷を帯び、膜不透過性のスルホンアミドCA阻害剤であって、サイトゾル性アイソザイムCA-IおよびCA-II、ならびに膜結合性のCA-IVおよびCA-IXに対する親和性が高い化合物の調製に関する一般的方法を報告している。そのような化合物は、アミノベンゾールアミド(それ自身が非常に強力なCA阻害剤である)に置換ピリジニウム部位を結合させることによって得た。イクス・ビボ(ex vivo)実験から、本明細書に報告している新規分類の阻害剤は、膜結合性アイソザイムとサイトゾル性アイソザイムとを識別することが示された。これらの化合物のうちのいくつかは、腫瘍関連アイソザイムCA-IXに対して低nMレベルの親和性を有することと相関して、本報告は、イン・ビボ(in vivo)において腫瘍関連CA-IXのみを標的とし、一方、サイトゾル性アイソザイムには影響を与えないという選択的阻害の基礎を呈示している。
1−N−[5−スルファモイル−1,3,4−チアジアゾール−2−イル−(アミノスルホニル−4−フェニル)]−2,4,6−トリメチル−ピリジニウムパークロラート71:白色結晶、融点>300℃;IR(KBr法)、cm-1:(斜体文字で示したバンドは陰イオン由来):595,625,664,787,803,884,915,1100,1150,1190,1200,1285,1360,1495,1604,3065;1H-NMR(D2O)、δ、ppm:3.08(s,6H,2,6-Me2);3.11(s,3H,4-Me),7.30-8.06(m,AA'BB',4H,フェニレン由来のArH);9.05(s,2H,ArH,ピリジニウム由来の3,5-H);この溶媒中では、溶媒とのプロトン交換が非常に迅速なため、スルホンアミドプロトンは観察されなかった。元素分析C16H18N5O4S3 +ClO4 -(C,H,N)
1−N−[5−スルファモイル−1,3,4−チアジアゾール−2−イル−(アミノスルホニル−4−フェニル)]−2−イソプロピル−4,6−ジメチルピリジニウムパークロラート72:無色結晶、融点290〜1℃;IR(KBr法)、cm-1:625,680,720,1100,1165,1330,1640,3020,3235;1H-NMR(TFA)、δ、ppm:1.50(d,6H,イソプロピル由来の2Me);2.80(s,3H,6-Me);2.90(s,3H,4-Me);3.49(ヘプテット、1H,イソプロピル由来のCH);7.25-8.43(m,AA'BB',4H,1,4−フェニレン由来のArH);7.98(s,2H,ArH,ピリジニウム由来の3,5-H)。元素分析C18H22N5O4S3 +ClO4 -(C,H,N)
1−N−[5−スルファモイル−1,3,4−チアジアゾール−2−イル−(アミノスルホニル−4−フェニル)]−2,6−ジイソプロピル−4−メチルピリジニウムパークロラート73:黄褐色結晶、融点278〜9℃;IR(KBr法)、cm-1:625,685,820,1100,1165,1340,1635,3030,3250;1H-NMR(TFA)、δ、ppm:1.51(d,12H,2−イソプロピル由来の4Me);2.83(s,3H,4-Me);3.42(ヘプテット、2H,2−イソプロピル由来の2CH);7.31-8.51(m,AA'BB',4H,1,4−フェニレン由来のArH);8.05(s,2H,ArH,ピリジニウム由来の3,5-H)。元素分析C20H26N5O4S3 +ClO4 -(C,H,N)
1−N−[5−スルファモイル−1,3,4−チアジアゾール−2−イル−(アミノスルホニル−4−フェニル)]−2,6−ジメチル−4−フェニルピリジニウムパークロラート75:白色結晶、融点>300℃;IR(KBr法)、cm-1:625,690,770,1100,1170,1330,1635,3030,3260,3330;1H-NMR(TFA)、δ、ppm:2.62(s,6H,2,6-Me2);8.10-9.12(m,11H,1,4−フェニレン、ピリジニウムおよび4-Ph由来のArH)。元素分析C21H20N5O4S3 +ClO4 -(C,H,N)
1−N−[5−スルファモイル−1,3,4−チアジアゾール−2−イル−(アミノスルホニル−4−フェニル)]−2,6−ジエチル−4−フェニルピリジニウムパークロラート76:黄褐色結晶、融点267〜8℃;IR(KBr法)、cm-1:625,695,765,1100,1180,1340,1630,3040,3270,3360;1H-NMR(TFA)、δ、ppm:1.43(t,6H,エチル由来の2Me);2.82(q,4H,Et由来の2CH2);7.68-8.87(m,11H,1,4−フェニレン、ピリジニウムおよび4-Ph由来のArH)。元素分析C23H24N5O4S3 +ClO4 -(C,H,N)
1−N−[5−スルファモイル−1,3,4−チアジアゾール−2−イル−(アミノスルホニル−4−フェニル)]−2,6−ジ−n−プロピル−4−フェニルピリジニウムパークロラート77:無色結晶、融点235〜7℃;IR(KBr法)、cm-1:625,695,770,1100,1180,1340,1630,3050,3220,3315;1H-NMR(TFA)、δ、ppm:1.06(t,6H,プロピル由来の2Me);1.73(ゼクステット,4H,n−プロピル由来の2CH2(β));2.84(t,4H,n−プロピル由来の2CH2(α));7.55-8.71(m,11H,1,4−フェニレン、ピリジニウムおよび4-Ph由来のArH)。元素分析C25H28N5O4S3 +ClO4 -(C,H,N)
1−N−[5−スルファモイル−1,3,4−チアジアゾール−2−イル−(アミノスルホニル−4−フェニル)]−2,6−ジイソプロピル−4−フェニルピリジニウムパークロラート79:白色結晶、融点278〜9℃;IR(KBr法)、cm-1:625,690,765,1100,1180,1340,1625,3040,3270,3315;1H-NMR(TFA)、δ、ppm:1.45(d,12H,イソプロピル由来の4Me);2.95(ヘプテット,2H,イソプロピル由来の2CH);7.92-8.97(m,11H,1,4−フェニレン、ピリジニウムおよび4-Ph由来のArH)。元素分析C25H28N5O4S3 +ClO4 -(C,H,N)
1−N−[5−スルファモイル−1,3,4−チアジアゾール−2−イル−(アミノスルホニル−4−フェニル)]−2−メチル−4,6−ジフェニルピリジニウムパークロラート80:白色結晶、融点298〜99℃;IR(KBr法)、cm-1:625,710,770,1100,1170,1345,1625,3040,3245,3350;1H-NMR(TFA)、δ、ppm:2.75(s,3H,2-Me);7.53-8.70(m,16H,1,4−フェニレン、ピリジニウムおよび4,6-Ph2由来のArH)。元素分析C26H22N5O4S3 +ClO4 -(C,H,N)
1−N−[5−スルファモイル−1,3,4−チアジアゾール−2−イル−(アミノスルホニル−4−フェニル)]−2−エチル−4,6−ジフェニルピリジニウムパークロラート81:白色結晶、融点245〜5℃;IR(KBr法)、cm-1:625,700,770,1100,1180,1340,1620,3040,3250,3350;1H-NMR(TFA)、δ、ppm:1.52(t,3H,エチル由来のMe);2.97(q,2H,CH2);7.40-8.57(m,16H,1,4−フェニレン、ピリジニウムおよび4,6-Ph2由来のArH)。元素分析C27H24N5O4S3 +ClO4 -(C,H,N)
1−N−[5−スルファモイル−1,3,4−チアジアゾール−2−イル−(アミノスルホニル−4−フェニル)]−2−n−プロピル−4,6−ジフェニルピリジニウムパークロラート82:白色結晶、融点214〜5℃;IR(KBr法)、cm-1:625,700,770,1100,1180,1340,1620,3030,3270,3350;1H-NMR(TFA)、δ、ppm:1.03(t,3H,プロピル由来のMe);1.95(ゼクステッド,2H,n−プロピル由来のβ−CH2);2.88(t,2H,n−プロピル由来のα−CH2);7.39-8.55(m,16H,1,4−フェニレン、ピリジニウムおよび4,6-Ph2由来のArH)。元素分析C28H26N5O4S3 +ClO4 -(C,H,N)
1−N−[5−スルファモイル−1,3,4−チアジアゾール−2−イル−(アミノスルホニル−4−フェニル)]−2−イソプロピル−4,6−ジフェニルピリジニウムパークロラート83:白色結晶、融点186〜8℃;IR(KBr法)、cm-1:625,700,770,1100,1170,1340,1620,3040,3250,3360;1H-NMR(TFA)、δ、ppm:1.51(d,6H,イソプロピル由来の2Me);2.50-3.27(m,1H,イソプロピル由来のCH);7.32-8.54(m,16H,1,4−フェニレン、ピリジニウムおよび4,6-Ph2由来のArH)。元素分析C28H26N5O4S3 +ClO4 -(C,H,N)
1−N−[5−スルファモイル−1,3,4−チアジアゾール−2−イル−(アミノスルホニル−4−フェニル)]−2−n−ブチル−4,6−ジフェニルピリジニウムパークロラート84:白色結晶、融点241〜3℃;IR(KBr法)、cm-1:625,710,770,1100,1180,1335,1625,3040,3260,3345;1H-NMR(TFA)、δ、ppm:0.93(t,3H,ブチル由来のMe);1.12-2.14(m,4H,n−ブチル由来のCH3-CH2-CH2-CH2);2.96(t,3H,n−ブチル由来のα−CH2);7.21-8.50(m,16H,1,4−フェニレン、ピリジニウムおよび4,6-Ph2由来のArH)。元素分析C29H28N5O4S3 +ClO4 -(C,H,N)
1−N−[5−スルファモイル−1,3,4−チアジアゾール−2−イル−(アミノスルホニル−4−フェニル)]−2−tert−ブチル−4,6−ジフェニルピリジニウムパークロラート85:白色結晶、融点203〜5℃;IR(KBr法)、cm-1:625,705,765,1100,1160,1310,1620,3060,3250,3270;1H-NMR(TFA)、δ、ppm:1.91(s,9H,t-Bu);6.80-8.74(m,16H,1,4−フェニレンおよび4,6-Ph2由来のArH、ならびにピリジニウム由来の3,5−H)。元素分析C29H28N5O4S3 +ClO4 -(C,H,N)
1−N−[5−スルファモイル−1,3,4−チアジアゾール−2−イル−(アミノスルホニル−4−フェニル)]−2,4,6−トリフェニルピリジニウムパークロラート87:淡黄色結晶、融点>300℃;IR(KBr法)、cm-1(斜体文字で示したバンドは陰イオン由来):625,635,703,785,896,1100,1150,1204,1355,1410,1520,1600,3065;1H-NMR(D2O)、δ、ppm:7.50-8.60(m,19H,1ArH,3Ph+C6H4);9.27(s,2H,ArH,ピリジニウム由来の3,5-H);この溶媒中では、溶媒とのプロトン交換が非常に迅速なため、スルホンアミドプロトンは観察されなかった。。元素分C31H24N5O4S3 +ClO4 -(C,H,N)
1−N−[5−スルファモイル−1,3,4−チアジアゾール−2−イル−(アミノスルホニル−4−フェニル)]−2,6−ジフェニルピリジニウムパークロラート88:黄色結晶、融点218〜20℃;IR(KBr法)、cm-1:625,705,765,1100,1160,1335,1615,3050,3260;1H-NMR(TFA)、δ、ppm:6.75-8.43(m,17H,1,4−フェニレン、2,6−Ph2由来のArHならびにピリジニウム由来の3,4,5−H)。元素分析C25H20N5O4S3 +ClO4 -(C,H,N)
1−N−[5−スルファモイル−1,3,4−チアジアゾール−2−イル−(アミノスルホニル−4−フェニル)]−2,3,4,6−テトラメチルピリジニウムパークロラート89:黄褐色結晶、融点>300℃;IR(KBr法)、cm-1:625,800,1100,1165,1330,1630,3030, 3305;1H-NMR(TFA)、δ、ppm:2.62(s,3H,4-Me);2.74(s,3H,3-Me);2.88(s,6H,2,6-(Me)2);7.21-8.50(m,AA'BB',4H,1,4−フェニレン由来のArH);7.93(s,1H,ArH,ピリジニウム由来の5-H)。元素分析C17H20N5O4S3 +ClO4 -(C,H,N)
以下に示す本発明の実施態様は例示および説明を目的とするものである。これらは本発明を網羅するためのものでも範囲を制限するためのものでもなく、上述の狭義に基づいて多様な変形および変更が可能なことは明らかである。実施態様は、本発明の原理を説明することを目的として選択、記述したものであり、本発明の実用化については、当業者であれば、特定の使用目的に添うように多様な実施態様および多様な変形を活用することによって可能である。
Claims (11)
- 哺乳類サンプルにおいて異常なMN/CA IX過剰発現に関連する低酸素前癌細胞あるいは癌細胞を検出する方法であって、哺乳類サンプルに、標識または可視化手段に結合した強力なMN/CA IX特異的スルホンアミド阻害剤を接触させ、さらに該サンプル中の細胞上の前記標識または可視化手段を検出または検出および定量することにより、該サンプル中の細胞上のMN/CA IXに対する前記強力なMN/CA IX特異的スルホンアミド阻害剤の結合を検出または検出および定量する工程を含み、前記サンプルでの検出または検出および定量のレベルが対照サンプルにおけるものよりも高かった場合に、該サンプル中にMN/CA IXを過剰発現する低酸素前癌細胞あるいは癌細胞が存在することが示唆され;
前記スルホンアミド阻害剤が、芳香族スルホンアミドおよび複素環式スルホンアミドより成る群から選択され、かつスルホンアミド阻害剤の阻害定数K1を特定することを含むスクリーニングアッセイにおいて、阻害定数K1が50nM未満であることによってMN/CA IX酵素活性の強力な阻害剤であると判断され、さらにCA I、CA IIおよびCA IVよりなる群から選択されるいずれの炭酸脱水酵素の酵素活性に対するよりもMN/CA IX酵素活性に対してより強力な阻害剤であることによってMN/CA IX特異的スルホンアミド阻害剤であると判断されたものであり、さらに、
該MN/CA IX特異的スルホンアミド阻害剤が、以下の化合物
よりなる群から選択されることを特徴とする方法。 - 活性MN/CA IXタンパク質が検出または検出および定量され、活性MN/CA IXタンパク質の存在が、前記サンプルを提供した哺乳類は予後がよくないことを示唆し、さらに該哺乳類に対する治療判断をするのに有用な情報となることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記MN/CA IX特異的スルホンアミド阻害剤が膜不透過性であることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 患者の体内でMN/CA IXタンパク質を発現する低酸素腫瘍および/または転移を画像化するための組成物であって、造影化剤に結合させた強力なMN/CA IX特異的スルホンアミド阻害剤を含有し、
該スルホンアミド阻害剤が、芳香族スルホンアミドおよび複素環式スルホンアミドより成る群から選択され、かつスルホンアミド阻害剤の阻害定数K1を特定することを含むスクリーニングアッセイにおいて、阻害定数K1が50nM未満であることによってMN/CA IX酵素活性の強力な阻害剤であると判断され、さらにCA I、CA IIおよびCA IVよりなる群から選択されるいずれの炭酸脱水酵素の酵素活性に対するよりもMN/CA IX酵素活性に対してより強力な阻害剤であることによってMN/CA IX特異的スルホンアミド阻害剤であると判断されたものであり、さらに
該MN/CA IX特異的スルホンアミド阻害剤が、以下の化合物
よりなる群から選択されることを特徴とする組成物。 - 活性MN/CA IXタンパク質が検出または検出および定量され、活性MN/CA IXタンパク質の存在が、前記患者は予後がよくないことを示唆し、さらに該患者に対する治療判断をするのに有用な情報となることを特徴とする請求項4記載の組成物。
- 前記MN/CA IX特異的スルホンアミド阻害剤が、膜不透過性の芳香族スルホンアミドまたは膜不透過性の複素環式スルホンアミドであることを特徴とする請求項4記載の組成物。
- 哺乳類においてMN/CA IXタンパク質を過剰発現することによって特徴付けられる低酸素前癌性もしくは癌性疾患を治療するための組成物であって、膜不透過性のスルホンアミドを含有し、
該スルホンアミドが、芳香族スルホンアミドおよび複素環式スルホンアミドより成る群から選択され、かつスルホンアミド阻害剤の阻害定数K1を特定することを含むスクリーニングアッセイにおいて、阻害定数K1が50nM未満であることによってMN/CA IX酵素活性の強力な阻害剤であると判断され、さらにCA I、CA IIおよびCA IVよりなる群から選択されるいずれの炭酸脱水酵素の酵素活性に対するよりもMN/CA IX酵素活性に対してより強力な阻害剤であることによってMN/CA IX特異的スルホンアミド阻害剤であると判断されたものであり、さらに
該MN/CA IX特異的スルホンアミド阻害剤が、以下の化合物
よりなる群から選択されることを特徴とする組成物。 - 腫瘍細胞がMN/CA IXタンパク質を過剰発現することによって特徴付けられる腫瘍を有する患者において腫瘍増殖を阻害するための組成物であって、スルホンアミドを含有し、
該スルホンアミドが、アセタゾラミド、エトクスゾラミドおよびメタゾラミド以外の芳香族スルホンアミドおよび複素環式スルホンアミドより成る群から選択され、かつスルホンアミド阻害剤の阻害定数K1を特定することを含むスクリーニングアッセイにおいて、阻害定数K1が50nM未満であることによってMN/CA IX酵素活性の強力な阻害剤であると判断され、さらにCA I、CA IIおよびCA IVよりなる群から選択されるいずれの炭酸脱水酵素の酵素活性に対するよりもMN/CA IX酵素活性に対してより強力な阻害剤であることによってMN/CA IX特異的スルホンアミド阻害剤であると判断されたものであり、さらに
該MN/CA IX特異的スルホンアミド阻害剤が、以下の化合物
よりなる群から選択されることを特徴とする組成物。 - 前記スルホンアミドが放射性同位元素に結合していることを特徴とする請求項8記載の組成物。
- 従来の抗癌剤、化学療法剤、癌関連経路に対する様々な阻害剤、生体還元性薬物、CA IX特異的抗体、およびCA IX特異的抗体の生物学的に活性なフラグメントよりなる群から選択される1種またはそれ以上の腫瘍増殖を阻害するための化合物と併用されることを特徴とする請求項8記載の組成物。
- 哺乳類においてMN/CA IXタンパク質を過剰発現することによって特徴付けられる前癌性もしくは癌性疾患を治療するための組成物であって、スルホンアミドを含有し、
該スルホンアミドが、アセタゾラミド、エトクスゾラミドおよびメタゾラミド以外の芳香族スルホンアミドおよび複素環式スルホンアミドより成る群から選択され、かつスルホンアミドの阻害定数K1を特定することを含むスクリーニングアッセイにおいてMN/CA IX酵素活性の強力でかつ特異的な阻害剤であると判断されたものであり、前記スクリーニングアッセイが:
a)前記スルホンアミドの一連の希釈液、ならびに、MN/CA IXタンパク質もしくはMN/CA IXタンパク質の炭酸脱水酵素ドメインを含むフラグメントの一連の希釈液を調製し;
b)前記スルホンアミドの希釈液を、前記MN/CA IXタンパク質もしくはMN/CA IXタンパク質のフラグメントの希釈液と混合して、20℃で10分間プレインキュベートし;
c)反応容器内において、前記スルホンアミドの希釈液と前記MN/CA IXタンパク質もしくはタンパク質のフラグメントの希釈液との混合物をプレインキュベートしたものを、飽和CO2溶液、0.2mMのフェノールレッド、0.1MのNa2SO4、および10mMのHepes緩衝液(pH7.5 )から実質的になる基質と、20℃で10〜100秒かけて混合し;
d)同時に、ストップフロー分光光度計を用いて、反応容器の内容物について吸収極大波長557nmにおける吸光度を測定し;さらに、
e)前記スルホンアミドの阻害定数KIを求める;
工程を含み、
ここで、阻害定数KIが50nM未満の場合に、該スルホンアミドはMN/CA IX酵素活性の強力な阻害剤であると判断され、
CA I、CA IIおよびCA IVよりなる群から選択されるいずれの炭酸脱水酵素の酵素活性に対するよりもMN/CA IX酵素活性に対してより強力な阻害剤である場合にMN/CA IX特異的スルホンアミド阻害剤であると判断され、さらに
該MN/CA IX特異的スルホンアミド阻害剤が、以下の化合物
よりなる群から選択されることを特徴とする組成物。
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- 2010-11-08 JP JP2010250142A patent/JP2011075570A/ja active Pending
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