ES2628459T3

ES2628459T3 - Compuestos novedosos de sulfonamida para la inhibición del crecimiento de tumores metastásicos

Info

Publication number: ES2628459T3
Application number: ES11817596.7T
Authority: ES
Inventors: Claudiu Supuran; Shoukat Dedhar; Paul C. Mcdonald; Fabrizio Carta
Original assignee: Welichem Biotech Inc
Current assignee: Welichem Biotech Inc
Priority date: 2010-07-09
Filing date: 2011-06-22
Publication date: 2017-08-02
Anticipated expiration: 2031-06-22
Also published as: JP2013532158A; US20130190396A1; WO2012021963A1; US20170007627A1; EP2590938A1; CN103221388A; CN103221388B; EP2590938A4; US9962398B2; EP2590938B1; US9463171B2; CA2841217A1; CA2841217C; JP5918227B2

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende: a. 4-{[(4'-Fluorofenil)carbamoil]amino}bencenosulfonamida (MST-104); o b. 4-{[(3'-Nitrofenil)carbamoil]amino}bencenosulfonamida (MST-119) para el uso en terapia.

Description

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Los composiciones farmacéuticas conforme a la invención se caracterizan porque inhiben la actividad de ACIX y ACXII relacionadas con el tumor en mayor medida que inhiben la actividad de ACI y ACII in vitro. 5 Se proporcionan además composiciones farmacéuticas y su uso para inhibir la invasión, y/o inducir la muerte celular de las células de cáncer de mama humano en hipoxia.

Se proporcionan además composiciones farmacéuticas y su uso para deteriorar el mantenimiento de células madre del cáncer de mama a través de la inhibición de la actividad de ACIX.

10 Se proporcionan además composiciones farmacéuticas y su uso para agotar la población de las células madre del cáncer en el cáncer de mama humano mediante la inhibición de la actividad de ACIX.

La composición farmacéutica para el uso en un método de tratar el cáncer metastásico o hipóxico conforme a la presente invención comprende MST-119, o MST-104.

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Se proporcionan también las composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos de la invención.

Otros aspectos y funciones de la presente invención se harán evidentes a aquellos ordinariamente cualificados en el arte al revisar la siguiente descripción de realizaciones específicas de la invención conjuntamente con las figuras, tablas,

20 fórmulas y ejemplos acompañantes.

DECRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra los análisis Kaplan-Meier de la asociación de expresión de ACIX con la supervivencia libre de

25 recidiva (A), supervivencia libre de recidiva a distancia (B) y la supervivencia específica de cáncer de mama (C), logrando niveles muy altos de significación estadística (p<10-17, p<10-16, y p<10-13, respectivamente). Las tasas de supervivencia libre de recidiva a distancia y de supervivencia específica del cáncer de mama a 10 años en los grupos de ACIX positiva versus los de ACIX negativa fueron del 57% en comparación con el 73%, y el 62% en comparación con el 78%, respectivamente. En los análisis multivariados, incluyendo todas las variables estándares de pronóstico y los

30 subtipos biológicos, la expresión de ACIX permaneció un factor fuerte independiente de mal pronóstico con una razón de riesgo de 1.4.

La figura 2 muestra (A) cultivos celulares para tres líneas celulares 67NR, 66cI4 y 4T1 juntos con modelos de ratón que demuestran un marcaje bioluminiscente de las células tumorales in vivo y (B) una tabla de expresión de genes inducida

35 por hipoxia para los tres tipos de tumores (expresión alta, oscurecido; expresión baja, claro).

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4-{[(4'-Fluorofenil)carbamoil]amino}bencenosulfonamida (MST-104); 4-{[(4'-Bromofenil)carbamoil]amino}bencenosulfonamida (MST-105); 4-{[(Pentafluorofenil)carbamoil]amino}bencenosulfonamida (MST-107); 4-{[(2'-Metoxifenil)carbamoil]amino}bencenosulfonamida (MST-108); 5 4-{[(4'-Acetilfenil)carbamoil]amino}bencenosulfonamida (MST-109); 4-{[(2'-iso-Propilfenil)carbamoil]amino}bencenosulfonamida (MST-110); 4-{[(4'-iso-Propilfenil)carbamoil]amino}bencenosulfonamida (MST-111); 4-{[(4'-n-Butilfenil)carbamoil]amino}bencenosulfonamida (MST-112); 4-{[(4'-Butoxifenil)carbamoil]amino}bencenosulfonamida (MST-113); 10 4-{[(4'-n-Octilfenil)carbamoil]amino}bencenosulfonamida (MST-114); 4-{[(4'-Cianofenil)carbamoil]amino}bencenosulfonamida (MST-115); 4-{[(2'-Cianofenil)carbamoil]amino}bencenosulfonamida (MST-116); 4-{[(4'-Fenoxifenil)carbamoil]amino}bencenosulfonamida (MST-117); 4-{[(Bifenil-2'-il)carbamoil]amino}bencenosulfonamida (MST-118); 15 4-{[(3'-Nitrofenil)carbamoil]amino}bencenosulfonamida (MST-119); 4-{[(4'-Metoxi-2'-metilfenil)carbamoil]amino}bencenosulfonamida (MST-120); 4-[(Ciclopentilcarbamoil)amino]bencenosulfonamida (MST-122); 4-{([(3',5'-Dimetilfenil)amino]carbonilamino)}bencenosulfonamida (MST-123); 4-{[(4'-Clorofenil)carbamoil]amino}bencenosulfonamida (MST-124); 20 4-{[(2',3'-Dihidro-1H-inden-5'-ilamino]carbonilamino)}bencenosulfonamida (MST-125); 4-{[([4'-(Trifluorometil)fenil]aminocarbonil)amino]}bencenosulfonamida (MST-126); 4-{[([3',5'-bis(Trifluorometil)fenil]aminocarbonil)amino]}bencenosulfonamida (MST-127); 3-(3-(4'-Yodofenil)ureido)bencenosulfonamida (MST-128); 3-(3-(4'-Fluorofenil)ureido)bencenosulfonamida (MST-129); 25 3-(3-(3'-Nitrofenil)ureido)bencenosulfonamida (MST-130); 3-(3-(4'-Acetilfenil)ureido)bencenosulfonamida (MST-131); 3-(3-(2'-Isopropilfenil)ureido)bencenosulfonamida (MST-132); 3-(3-(Perfluorofenil)ureido)bencenosulfonamida (MST-133); 4-(3-(4'-cloro-2-fluorofenil)ureido)bencenosulfonamida (MST-134);

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MST-108: 2-MeOC6H4 92 4070 465 61,2

MST-109: 4-AcC6H4 388 1060 5,4 4,6

MST-110: 2-i-PrC6H4 9,0 3,3 0,5 4,2

MST-111: 4-i-PrC6H4 4330 5005 541 49,7

MST-112: 4-n-BuC6H4 5530 2485 376 28,5

MST-113: 4-n-BuOC6H4 11,3 2,1 0,8 2,5

MST-114: 4-n-octil-C6H4 536 9600 47,1 52,8

MST-115: 4-NCC6H4 57,0 64,7 6,0 6,5

MST-116: 2-NCC6H4 10,9 2,4 0,3 4,6

MST-117: 4-PhOC6H4 604 85 69,1 7,1

MST-118: 2-PhC6H4 1170 9,7 65,7 65,1

MST-119: 3-O2NC6H4 23,4 15 0,9 5,7

MST-120: 4-MeO-2-MeC6H3 89,2 3310 73,3 6,0

MST-121: 9H-fluoren-2-il 1700 908 102 55,4

MST-122: Ciclopentil 470 2265 7,3 7,0

MST -123: 3,5-Me2C6H3 6530 1765 6,9 6,2

MST-124: 4-CIC6H4 2150 781 58 5,3

MST-125: Indan-5-il 9,8 8,9 7,0 2,5

MST-126: 4-CF3C6H4 9,7 1150 6,2 2,3

MST-127: 3,5-(CF3)2C6H3 3690 75 53 39

Los compuestos de la invención son útiles para la preparación de medicamentos así como en un método para el tratamiento de un tumor hipóxico que tiene ACIX o ACXII altamente sobreexpresada. La "sobreexpresión" ("overexpression") significa la expresión excesiva de un gen, usualmente al producir demasiado de su efecto o producto.

5 Los medicamentos tienen una acción inhibidora sobre ACIX, y son particularmente efectivos en revertir la acidificación de un tumor hipóxico y su ambiente circundante.

Los compuestos de la invención son también capaces de deteriorar y/o erradicar las células madre del cáncer. Se cree que las células madre del cáncer son una base de resistencia por los tumores a agentes o técnicas terapéuticas tradicionales, tales como los quimioterapéuticos o la radiación.

10 En la mayoría de la terapia del cáncer, los agentes múltiples con modalidades complementarias de acción se utilizan típicamente como parte de un "coctel" de quimioterapia. Se anticipa que las composiciones farmacéuticas descritas en esta invención pueden usarse en tal cóctel que puede contener uno o más de los agentes antineoplásicos adicionales dependiendo de la naturaleza del cáncer que se esté tratando. Otros agentes quimioterapéuticos, tales como antimetabolitos (es decir, 5-fluorouracilo, floxuridina, tioguanina, citarabina, fludarabina, 6-mercaptopurina, metotrexato,

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Como se demuestra en los datos, ACIX y ACXII están asociadas con hipoxia y metástasis. Por lo tanto, un tumor hipóxico y metastásico no necesitaría ser probado para demostrar los niveles elevados de ACIX y ACXII para indicar el tratamiento utilizando los compuestos de la invención debido a los datos que ya respaldan la suposición. Sin embargo, la Patente de EE.UU. Núm. US7378091 de Gudas et al. revela anticuerpos de ACIX útiles en la detección y el diagnóstico. Los anticuerpos contra ACXII, así como sondas de ARN, se pueden usar para evaluar la sobreexpresión de ACXII en muestras de tumores biopsiadas.

ACXII se evalúa también en Battke et al., (2011) Cancer Immunol Immunother. May;60(5):649-58.

Se puede decir que el crecimiento, la persistencia y/o la propagación del tumor son suprimidos por los compuestos descritos en la invención, o por su uso en el tratamiento de mamíferos afligidos de esta manera. La "supresión" en este uso puede significar la inducción de regresión, la inhibición de crecimiento, y la inhibición de propagación, especialmente como estos términos se refieren a tumores y cánceres sufridos por mamíferos, particularmente los humanos.

Se pueden usar agentes quimioterapéuticos típicos incluyendo, pero no limitándose a docetaxel, alcaloides de vinca, mitoxantrona, cisplatino, paclitaxel, 5-FU, Herceptin, Avastin, Gleevec en combinación con los compuestos de la invención. De forma similar, la terapia de radiación se puede combinar con los programas de administración que incluyen los compuestos de la invención.

Cuando se lleva a cabo la intervención quirúrgica, los compuestos y composiciones farmacéuticas de la invención pueden utilizarse preoperatoriamente, perioperatoriamente o, posoperatoriamente. La dosificación se determina típicamente mediante programas de dosificación que usan el tamaño y el peso del paciente para calcular el área de la superficie corporal del paciente, que se correlaciona con el volumen de sangre, para determinar la dosificación inicial. Las dosificaciones iniciales se resuelven generalmente durante las pruebas clínicas de los compuestos terapéuticos.

Los antecedentes y enfoques actuales para el enfoque clínico al tratamiento de tumores se pueden encontrar en Takimoto CH, Calvo E. "Principles of Oncologic Pharmacotherapy" en Pazdur R, Wagman LD, Camphausen KA, Hoskins WJ (Eds) Cancer Management: A Multidisciplinary Approach. 11 ed. 2008, que está disponible gratuitamente en http://www.cancernetwork.com/cancer-management-11/chapter03/article/10165/1402628.

Los siguientes ejemplos se usan para ilustrar aspectos de la invención.

Ejemplo 1

Preparaciones de compuestos específicos (compuestos MST-101 a MST-127 inclusive)

Procedimiento general para la preparación de los compuestos de la Fórmula (I)

Métodos en la química: Los espectros 1H, 13C y 19F se registraron usando un espectrómetro Bruker Advance III 400 MHz. Los desplazamientos químicos se registran en partes por millón (ppm) y las constantes de acoplamiento (J) se expresan en Hertzios (Hz). Los espectros de infrarrojos se registraron en un espectrómetro Perkin Elmer Spectrum R XI como sólidos en placas de KBr. Se midieron los puntos de fusión (p.f.) en tubos capilares abiertos, a menos que se indique de otra manera, usando un aparato de punto de fusión Buchi Melting Point B-540, y no son corregidos. La cromatografía en capa fina (TLC) se llevó a cabo en placas con dorso de aluminio, gel de sílice 60 F254, de Merck. La elución de las placas se llevó a cabo utilizando acetato de etilo—éter de petróleo como sistema de elución. La visualización se logró con luz UV a 254 nm, a través de sumergirla en una solución de tinción TLC de ninhidrina y calentarla con una pistola de aire caliente. La cromatografía en columna flash se llevó a cabo utilizando gel de sílice (obtenido de Aldrich Chemical Co., Milán, Italia) como adsorbente. El producto bruto se introdujo en la columna como una solución en el mismo sistema de elución con disolvente.

Se utilizaron disolventes y productos químicos como suministrados por Aldrich Chemical Co., Milán, Italia.

Se disolvió 4-aminobencenosulfonamida (2,9 mmoles) en acetonitrilo (20-30 mL) y luego se trató con una cantidad estequiométrica de un isocianuro. La mezcla se agitó a Ta (temperatura ambiente) o se calentó a 50oC durante 2 horas,

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hasta su terminación (monitorización mediante TLC). El precipitado pesado formado se separó por filtración, se lavó con éter dietílico y se secó al vacío.

4-[(anilinocarbonil)amino]bencenosulfonamida (MST-101):

Se trató 4-aminobencenosulfanilamida (0,50 g, 2,90 mmoles) con isocianato de fenilo (0,23 g; 2,90 mmoles) y la reacción se agitó a Ta (temperatura ambiente) durante 1 día, tratada como se describe en el procedimiento general anteriormente indicado para dar MST-101 como un sólido blanco con un rendimiento del 43,7%. p.f. 233-235oC (Lit1); TLC con gel de sílice Rf 0,63 (acetato de etilo/éter de petróleo al 33%); vmax (KBr) cm-1, 3340 (N-H urea), 1656 (C=O urea), 1595 (aromático); δH (400 MHz, DMSO-d6) 7,00 (1H, tt, J 7,4, 0,8, 4'-H), 7,20 (2H, s, SO2NH2), 7,29 (2H, dd, J 8,2, 0,8, 2 x 3'-H), 7,47 (2H, dd, J 8,2, 1,2, 2 x 2'-H), 7,61 (2H, d, J 9,0, 2 x 3-H), 7,73 (2H, d, J 9,0, 2 x 2-H), 8,82 (1H, s, NH), 9,09 (1H, s, NH); δC (100 MHz, DMSO-d6) 153,2 (C=O urea), 143,8, 140,2, 137,8, 129,8, 127,7, 123,1, 119,4, 118,4.

4-{[(Bencilamino)carbonil]amino}bencenosulfonamida (MST-102):

Se trató 4-aminobencenosulfanilamida (0,50 g; 2,90 mmoles) con isocianato de bencilo (0,39 g; 2,90 mmoles) y la reacción se agitó a Ta durante 4 horas, tratada como se describe en el procedimiento general anteriormente indicado para dar MST-102 como un sólido blanco con un rendimiento del 42,3%. p.f. 194-196 °C; TLC con gel de sílice Rf 0,58 (acetato de etilo/éter de petróleo al 33%); vmax (KBr) cm-1, 3313 (N-H urea), 1674 (C=O urea), 1591 (aromático); δH (400 MHz, DMSO-d6) 4,35 (2H, d, J 6,0, 1'-H2), 6,81 (1H, t, J 6,0, NH), 7,19 (2H, s, SO2NH2), 7,28 (1H, tt, J 6,8, 2,0, 5'-H), 7,35 (4H, m, 2 x 3'-H, 2 x 4'-H), 7,59 (2H, d, J 9,0, 2 x 3-H), 7,71 (2H, d, J 9,0, 2 x 2-H), 9,0 (1H, s, NH); δc (100 MHz, DMSOd6) 155,8 (C=O urea), 144,5, 141,0, 137,1, 129,3, 128,1, 127,8, 127,7, 117,8, 43,7 (C-1').

4-{[(Benzhidrilamino)carbonil]amino}bencenosulfonamida (MST-103):

Se trató 4-aminobencenosulfanilamida (0,50 g; 2,90 mmoles) con isocianato de benzhidrilo (0,61 g; 2,90 mmoles) y la reacción se agitó durante 2 horas, tratada como se describe en el procedimiento general anteriormente indicado para dar MST-103 como un sólido blanco con un rendimiento del 42,4%. p.f. 235-236 °C; TLC con gel de sílice Rf 0,76 (acetato de etilo/éter de petróleo al 33%); vmax (KBr) cm-1, 3338 (N-H urea), 1696 (C=O urea), 1592 (aromático); δH (400 MHz, DMSO-d6) 6,0 (1H, d, J 7,6, NH), 7,19 (2H, s, SO2NH2), 7,29 (2H, tt, J 7,2, 1,6, 2 x 4'-H), 7,38 (9H, m, 1'-H, 4 x 3'-H, 4 x 4'-H) 7,56 (2H, d, J 8,8, 2 x 3-H), 7,70 (2H, d, J 8,8, 2 x 2-H), 8,9 (1H, s, NH); δc (100 MHz, DMSO-d6) 154,9 (C=O urea), 144,2, 143,8, 137,2, 129,5, 127,9, 127,8, 127,7, 117,7, 57,8 (C-1').

4-{[(4'-Fluorofenil)carbamoil]amino}bencenosulfonamida (MST-104):

Se trató 4-aminobencenosulfanilamida (0,50 g; 2,90 mmoles) con isocianato de 4-fluorofenilo (0,40 g; 2,90 mmoles) y la reacción se agitó a Ta durante 2 días, tratada como se describe en el procedimiento general anteriormente indicado para dar MST-104 como un sólido blanco con un rendimiento del 55,5%. p.f. 242-243 °C; TLC con gel de sílice Rf 0,53 (acetato de etilo/éter de petróleo al 33%); vmax (KBr) cm-1, 3338 (N-H urea), 1697 (C=O urea), 1593 (aromático); δH (400 MHz, DMSO-d6) 7,17 (2H, t, J 9,0, 2 x 2'-H), 7,24 (2H, s, SO2NH2), 7,51 (2H, dd, J 9,0, 4,8, 2 x 3'-H), 7,64 (2H, d, J 8,8, 2 x 3-H), 7,76 (2H, d, J 8,8, 2 x 2-H), 8,86 (1H, s, NH), 9,09 (1H, s, NH); δC (100 MHz, DMSO-d6) 158,5 (d, JC-F 237, C-4'), 153,3 (C=O urea), 143,7, 137,8, 136,6 (d, 4JC-F 3, C-1'), 127,7, 121,2 (d, 3 JC-F 7, C-2'), 118,4, 116,3 (d, 2JC-F 22, C-3'); δF (376,5 MHz, DMSO-d6) –121,0 (1F, s).

4-({[(4'-Bromofenil)amino]carbonil}amino)bencenosulfonamida (MST-105):

Se trató 4-amino-bencenosulfanilamida (0,50 g; 2,90 mmoles) con isocianato de 4-bromofenilo (0,57 g; 2,90 mmoles) y la reacción se agitó a Ta durante 1 día, tratada como se describe en el procedimiento general anteriormente indicado para dar MST-105 como un sólido blanco con un rendimiento del 43,1%. p.f. 269-271 °C; TLC con gel de sílice Rf 0,38 (acetato de etilo/éter de petróleo al 33%); vmax (KBr) cm-1, 3328 (N-H urea), 1652 (C=O urea), 1590 (aromático); δH (400 MHz, DMSO-d6) 7,24 (2H, s, SO2NH2), 7,49 (2H, d, J 9,2, 2 x 2'-H), 7,51 (2H, d, J 9,2, 2 x 3'-H), 7,64 (2H, d, J 8,8, 2 x 3-H), 7,76 (2H, d, J 8,8, 2 x 2-H), 8,99 (1H, s, NH), 9,15 (1H, s NH); δC (100 MHz, DMSO-d6) 152,6 (C=O urea), 143,1, 139,3, 137,5, 132,0, 127,3, 120,9, 118,1, 114,1.

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4-{([(2'-Cianofenil)amino]carbonil)amino}bencenosulfonamida (MST-116):

Se trató 4-aminobencenosulfanilamida (0,50 g; 2,90 mmoles) con isocianato de 2-cianofenilo (0,41 g; 2,90 mmoles) y la reacción se agitó durante 1 día hasta que se formó un precipitado. El crudo obtenido se purificó mediante la cromatografía en columna con gel de sílice eluyendo con acetato de etilo/éter de petróleo 1/1 para dar MST-116 como un sólido blanco. p.f. 256-258 °C; TLC con gel de sílice Rf 0,73 (acetato de etilo/éter de petróleo al 33%); vmax (KBr) cm-1 , 3310 (N-H urea), 2231 (C≡ N), 1696 (C=O urea), 1587 (aromático); δH (400 MHz, DMSO-d6) 7,26 (1H, ddd, J 7,6, 7,2, 0,8, 4'-H), 7,27 (2H, s, SO2NH2), 7,67 (2H, d, J 9,0, 2 x 3-H), 7,70 (1H, ddd, J 8,4, 7,2, 1,6, 5'-H), 7,80 (2H, d, J 9,0, 2 x 2-H), 7,82 (1H, dd, 7,6, 1,6, 3'-H), 8,1 (1H, dd, J 8,4, 0,4, 6'-H), 8,90 (1H, s, NH), 9,78 (1H, s, NH); δC (100 MHz, DMSO-d6) 152,8 (C=O urea), 143,2, 142,4, 138,4, 135,0, 134,1, 127,8, 124,5, 122,6, 118,7, 117,8, 103,6 (C≡N).

4-({[(4'-Fenoxifenil)amino]carbonil}amino)bencenosulfonamida (MST-117):

Se trató 4-aminobencenosulfanilamida (0,50 g; 2,90 mmoles) con isocianato de 4-fenoxifenilo (0,61 g; 2,90 mmoles) y la reacción se agitó a Ta durante 5 horas, tratada como se describe en el procedimiento general anteriormente indicado para dar MST-117 como un sólido blanco con un rendimiento del 46,8%. p.f. 236-237 °C; TLC con gel de sílice Rf 0,41 (acetato de etilo/éter de petróleo al 33%); vmax (KBr) cm-1, 3328 (N-H urea), 1653 (C=O urea), 1595 (aromático); δH (400 MHz, DMSO-d6) 7,00 (2H, dd, J 8,8, 1,2, 3'-H), 7,03 (2H, d, J 9,0, 6'-H), 7,13 (1H, dt, J 7,5, 0,8, 8'-H), 7,24 (2H, s, SO2NH2), 7,40 (2H, dd, J 9,0, 7,5, 7'-H), 7,52 (2H, d, J 8,8, 2'-H), 7,65 (2H, d, J 9,2, 3-H), 7,76 (2H, d, J 9,2, 2-H), 8,84 (1H, s, NH), 9,08 (1H, s, NH); δC (100 MHz, DMSO-d6) 158,5 (C=O urea), 153,3, 151,9, 143,8, 137,7, 136,2, 130,9, 127,7, 123,8, 121,2, 120,7, 118,7, 118,4.

4-[(Bifenil-2'-ilcarbamoil)amino]bencenosulfonamida (MST-118):

Se trató 4-aminobencenosulfanilamida (0,50 g; 2,90 mmoles) con isocianato de bifenil-2-ilo (0,57 g; 2,90 mmoles) y la reacción se agitó a Ta durante 1 día, tratada como se describe en el procedimiento general anteriormente indicado para dar MST-118 como un sólido blanco con un rendimiento del 40,0%. p.f. 229-231 °C; TLC con gel de sílice Rf 0,75 (acetato de etilo/éter de petróleo al 33%); vmax (KBr) cm-1, 3365 (N-H urea), 1675 (C=O urea), 1584 (aromático); δH (400 MHz, DMSO-d6) 7,20 (1H, d, J 7,4), 7,22 (2H, s, SO2NH2), 7,27 (1H, dd, J 7,4, 1,6), 7,39 (1H, dt, J 8,4, 1,6, 10'-H), 7,46 (2H, dt, J 6,8, 1,6), 7,54 (1H, d, J 7,6 , 6'-H), 7,58 (2H, d, J 9,2, 2 x 3-H), 7,74 (2H, d, J 9,2, 2 x 2-H), 7,83 (1H, s, NH), 7,95 (1H, d, J 8,0, 3'-H), 9,41 (1H, s, NH); δC (100 MHz, DMSO-d6) 153,6 (C=O urea), 144,0, 139,5, 137,8, 136,4, 134,2, 131,5, 130,2, 129,9, 128,9, 128,6, 127,9, 124,8, 124,0, 118,3.

4-{[(3'-Nitrofenil)carbamoil]amino}bencenosulfonamida (MST-119):

Se trató 4-aminobencenosulfanilamida (0,50 g; 2,90 mmoles) con isocianato de 3-nitrofenilo (0,47 g; 2,90 mmoles) y la reacción se agitó a Ta durante 1 día, tratada como se describe en el procedimiento general anteriormente indicado para dar MST-119 como un sólido amarillo con un rendimiento del 44,3%. p.f. 246-248 °C; TLC con gel de sílice Rf, 0,39 (acetato de etilo/éter de petróleo al 33%); vmax (KBr) cm-1, 3370 (N-H urea), 1709 (C=O urea), 1592 (aromático); δH (400 MHz, DMSO-d6) 7,23 (2H, s, SO2NH2), 7,59 (1H, dd, J 8,4, 8,0, 5'-H), 7,65 (2H, d, J 9,0, 2 x 3-H), 7,73 (1H, ddd, J 8,4, 2,0, 0,8, 6'-H), 7,76 (2H, d, J 9,0, 2 x 2-H), 7,86 (1H, ddd, J 8,0, 2,4, 0,8, 4'-H), 8,58 (1H, t ap, J 2,2, 2'-H)—donde "t ap" indica triplete aparente—, 9,25 (1H, s, NH), 9,35 (1H, s, NH); δC (100 MHz, DMSO-d6) 153,2 (C=O urea), 149,1, 143,3, 141,6, 138,3, 131,1, 127,7, 125,5, 118,8, 117,6, 113,3.

4-{([(4'-Metoxi-2'-metilfenil)amino]carbonil)amino}bencenosulfonamida (MST-120):

Se trató 4-aminobencenosulfanilamida (0,50 g; 2,90 mmoles) con isocianato de 4-metoxi-2-metilfenilo (0,47 g; 2,90 mmoles) y la reacción se agitó a Ta durante la noche, tratada como se describe en el procedimiento general anteriormente indicado para dar MST-120 como un sólido blanco con un rendimiento del 40,1%. p.f. 240-241 °C; TLC con gel de sílice Rf 0,35 (acetato de etilo/éter de petróleo al 33%); vmax (KBr) cm-1, 3313 (N-H urea), 2835 (C-H alifático), 1647 (C=O urea), 1591 (aromático); δH (400 MHz, DMSO-d6) 2,25 (3H, s, CH3), 3,76 (3H, s, OCH3), 6,78 (1H, dd, J 8,8, 2,8, 5'-H), 6,84 (1H, d, J 2,8, 3'-H), 7,22 (2H, s, SO2NH2), 7,55 (1H, d, J 8,8, 6'-H), 7,63 (2H, d, J 8,8, 2 x 3-H), 7,75 (2H, d, J 8,8, 2 x 2-H), 7,96 (1H, s, NH), 9,26 (1H, s, NH), δC (100 MHz, DMSO-d6) 156,6 (C=O urea), 153,7, 144,2, 137,4, 132,3, 130,7, 127,8, 125,3, 118,1, 116,4, 112,2, 56,1 (OCH3), 19,0 (CH3).

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4-{[(9H-Fluoren-2-ilamino)carbonil]amino}bencenosulfonamida (MST-121):

Se le añadió gota a gota isocianato de 9H-fluoren-2-ilo (0,59 g, 2,90 mmoles) disuelto en 10 ml de acetonitrilo a una solución de 4-aminobencenosulfanilamida (0,50 g; 2,90 mmoles) en acetonitrilo (20 ml). La reacción se agitó durante 1 hora a Ta, tratada como se describe en el procedimiento general anteriormente indicado para dar MST-121 como un sólido blanco con un rendimiento del 62,0%. p.f. 280-285 °C; TLC con gel de sílice Rf 0,52 (acetato de etilo/éter de petróleo al 33%); vmax (KBr) cm-1, 3329 (N-H urea), 1648 (C=O urea), 1591 (aromático); δH (400 MHz, DMSO-d6) 3,94 (2H, s, CH2), 7,24 (2H, s, SO2NH2), 7,29 (1H, t ap, J 7,2, 4'-H), 7,39 (1H, t ap, J 7,2, 5'-H), 7,46 (1H, d, J 7,2, 3'-H), 7,58 (1H, d, J 7,2, 6'-H), 7,67 (1H, d, J 8,4, 2 x 3-H), 7,78 (1H, d, J 8,4, 2 x 2-H), 7,83 (3H, m, 2'-H, 7'-H, 8'-H), 8,94 (1H, s, NH), 9,14 (1H, s, NH); δC (100 MHz, DMSO-d6) 153,2 (C=O urea), 144,9, 143,8, 143,5, 142,0, 139,3, 137,7, 136,4, 127,8, 127,6, 126,8, 125,9, 121,2, 120,2, 118,4, 118,2, 116,2, 37,4 (CH2).

4-[(Ciclopentilcarbamoil)amino]bencenosulfonamida (MST-122):

Se trató 4-aminobencenosulfanilamida (0,50 g; 2,90 mmoles) con isocianato de ciclopentilo (0,32 g; 2,90 mmoles) y la reacción se agitó a 50 °C durante 2 horas, tratada como se describe en el procedimiento general anteriormente indicado para dar MST-122 como un sólido blanco con un rendimiento del 68,8%. p.f. 224-226 °C; TLC con gel de sílice Rf 0,57 (acetato de etilo/éter de petróleo al 33%); vmax (KBr) cm-1 , 3328 (N-H urea), 3055 (C-H alifático), 1684 (C=O urea), 1591 (aromático); δH (400 MHz, DMSO-d6) 1,41 (2H, m, 2 x 3'-Hax), 1,58 (2H, m, 2 x 2'-Hax), 1,67 (2H, m, 2 x 2'-Hecuatorial), 1,88 (2H, m, 2 x 3'-Hecuatorial), 3,98 (1H, sext, J 6,8, 1'-H), 6,35 (1H, d, J 6,8, NH), 7,18 (2H, s, SO2NH2), 7,55 (2H, d, J 8,8, 2 x 3-H), 7,70 (2H, d, J 8,8, 2 x 2-H), 8,68 (1H, s, NH); δC (100 MHz, DMSO-d6) 155,3 (C=O urea), 144,6, 136,8, 127,7, 117,6, 51,8 (C-1'), 33,7 (C-2'), 24,1 (C-3').

4-{([(3,5-dimetilfenil)amino]carbonilamino)}bencenosulfonamida (MST-123):

Se trató 4-aminobencenosulfanilamida (0,50 g; 2,90 mmoles) con 3,5-dimetilfenil isocianato (0,43 g; 2,90 mmoles) y la reacción se agitó a Ta durante la noche, tratada como se describe en el procedimiento general anteriormente indicado para dar MST-123 como un sólido blanco con un rendimiento del 60,6%. p.f. 235-236 °C; TLC con gel de sílice Rf 0,58 (acetato de etilo/éter de petróleo al 33%); vmax (KBr) cm-1, 3343 (N-H urea), 2860 (C-H alifático), 1686 (C=O urea), 1595 (aromático); δH (400 MHz, DMSO-d6) 2,27 (6H, s, 2x CH3), 6,68 (1H, s, 4'-H), 7,12 (2H, s, 2'-H), 7,23 (2H, s, SO2NH2), 7,64 (2H, d, J 8,8, 2 x 3-H), 7,76 (2H, d, J 8,8, 2 x 2-H), 8,67 (1H, s, NH), 9,06 (1H, s, NH); δC (100 MHz, DMSO-d6) 153,1 (C=O, urea), 143,8, 140,1, 138,7, 137,7, 127,7, 124,7, 118,3, 117,1, 22,0 (2 x CH3).

4-{([(4'-clorofenil)amino]carbonilamino)}bencenosulfonamida (MST-124):

Se trató 4-aminobencenosulfanilamida (0,50 g; 2,90 mmoles) con isocianato de 4-clorofenilo (0,44 g, 2,90 mmoles) y la reacción se agitó a Ta durante la noche, tratada como se describe en el procedimiento general anteriormente indicado para dar MST-124 como un sólido blanco con un rendimiento del 89,4%. p.f. 239-240 °C; TLC con gel de sílice Rf 0,44 (acetato de etilo/éter de petróleo al 33%); vmax (KBr) cm-1, 3327 (N-H urea), 1652 (C=O urea), 1592 (aromático); δH (400 MHz, DMSO-d6) 7,24 (2H, s, SO2NH2), 7,38 (2H, d, J 8,8, 2 x 2'-H), 7,53 (2H, d, J 8,8, 2 x 3'-H), 7,64 (2H, d, J 8,8, 2 x 3-H), 7,76 (2H, d, J 8,8, 2 x 2-H), 8,97 (1H, s, NH), 9,13 (1H, s, NH); δC (100 MHz, DMSO-d6) 153,1 (C=O, urea), 143,6, 139,2, 137,9, 129,6, 127,7, 126,6, 120,9, 118,5.

4-{[(2,3-dihidro-1H-inden-5-ilamino]carbonilamino)}bencenosulfonamida (MST-125):

Se trató 4-aminobencenosulfanilamida (0,50 g; 2,90 mmoles) con 5-indanilisocianato (0,46 g; 2,90 mmoles) y la reacción se agitó a Ta durante la noche, tratada como se describe en el procedimiento general anteriormente indicado para dar MST-125 como un sólido blanco con un rendimiento del 60,6%. p.f. 233-235 °C; TLC con gel de sílice Rf 0,61 (acetato de etilo/éter de petróleo al 33%); vmax (KBr) cm-1, 3333 (N-H urea), 2844 (C-H alifático), 1653 (C=O urea), 1592 (aromático); δH (400 MHz, DMSO-d6) 2,04 (2H, c ap, J 7,4, 2'-H), en donde "c ap" indica cuarteto aparente, 2,85 (4H, c ap, J 7,4, 2 x 1'-H, 2 x 3'-H), 7,16 (1H, d ap, J 8,2, 6'-H), en donde "d ap" indica doblete aparente, 7,19 (1H, dd ap, J 8,2, 1,6, 7'-H), en donde "dd ap" indica doble doblete aparente, 7,25 (2H, s, SO2NH2), 7,42 (1H, s, 4'-H), 7,63 (2H, d, J 8,8, 2 x 3-H), 7,75 (2H, d, J 8,8, 2 x 2-H), 8,70 (1H, s, NH), 9,06 (1H, s, NH); δC (100 MHz, DMSO-d6) 153,2 (C=O, urea), 145,2, 143,9, 138,4, 137,6, 127,8, 125,2, 118,3, 117,7, 115,7, una señal de carbono con solapamiento, 33,48, 32,64, 26,15 (3 x CH2).

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4-{[([4-(trifluorometil)fenil]amino}carbonil)amino]bencenosulfonamida (MST-126):

Se trató 4-aminobencenosulfanilamida (0,50 g; 2,90 mmoles) con 4-trifluorometil-fenilisocianato (0,54 g; 2,90 mmoles) y la reacción se agitó a Ta durante una noche, tratada como se describe en el procedimiento general anteriormente indicado para dar MST-126 como un sólido blanco con un rendimiento del 96,1%. p.f. 281-283 °C; TLC con gel de sílice RF 0,49 (acetato de etilo/éter de petróleo al 33%); vmax (KBr) cm-1, 3334 (N-H urea), 1657 (C=O urea), 1592 (aromático); δH (400 MHz, DMSO-d6) 7,27 (2H, s, SO2NH2), 7,66 (2H, d, J 8,8, 2 x 3-H), 7,72 (4H, m, 2 x 2'-H, 2 x 3'-H), 7,78 (2H, d, J 8,8, 2 x 2-H), 9,24 (1H, s, NH), 9,26 (1H, s, NH); δC (100 MHz, DMSO-d6) 153,0 (C=O, urea), 144,0 (m, C-1'), 143,4 (C4), 138,2 (C-1), 127,7 (2 x C-2), 127,0 (c, 3JC-F 3,8, C-3'), donde "c" indica cuarteto, 125,4 (c, JC-F 269, CF3), 123,0 (c, 2JC-F 32, C-4'), 119,0 (2 x C-2'), 118,7 (2 x C-3); δF (376,5 MHz, DMSO-d6) –60,1 (3F, s).

4-{[([3,5-bis(trifluorometil)fenil]aminocarbonil)amino]}bencenosulfonamida (MST-127):

Se trató 4-aminobencenosulfanilamida (0,50 g; 2,90 mmoles) con 3,5-bis(trifluorometil)fenilisocianato (0,74 g; 2,90 mmoles) y la reacción se agitó a Ta durante una noche, tratada como se describe en el procedimiento general anteriormente indicado para dar MST-127 como un sólido blanco con un rendimiento del 81,4%. p.f. 228-229 °C; TLC con gel de sílice Rf 0,62 (acetato de etilo/éter de petróleo al 33%); vmax (KBr) cm-1, 3374 (N-H urea), 1653 (C=O urea), 1596 (aromático); δH (400 MHz, DMSO-d6), 7,27 (2H, s, SO2NH2), 7,69 (2H, d, J 9,0, 3-H), 7,71 (1H, s, 4'-H), 7,79 (2H, d, J 9,0, 2-H), 8,16 (2H, s, 2 x 2'-H), 9,43 (1H, s, NH), 9,54 (1H, s, NH); δC (100 MHz, DMSO-d6) 153,2 (C=O, urea), 143,1, 142,5, 138,5, 131,7 (c, 2JC-F 32, 2 x C-3'), 127,7 (2 x C-2), 124,2 (c, JC-F 272, 2 x CF3), 119,2 (m, 2 x C-2'), 119,1 (2 x C3), 115,7 (m, C-4'); δF (376,5 MHz, DMSO-d6) –61,7 (6F, s).

Compuestos Ureido-sustituidos (MST-128-133):

Materiales y métodos

Los disolventes anhidros y todos los reactivos se compraron de Sigma-Aldrich, Alfa Aesar y TCI. Todas las reacciones que implican compuestos sensibles al aire o a la humedad se llevaron a cabo bajo una atmósfera de nitrógeno utilizando técnicas de cristalería y jeringas secas para transferir soluciones. Los espectros de infrarrojos (IR) se registraron como placas de KBr y se expresan en cm-1. Los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) (1H-RMN, 13C-RMN, DEPT, HSQC, HMBC) se registraron usando un espectrómetro Bruker Advance III 400 MHz en MeOH-d4 o en DMSO-d6. Los desplazamientos químicos se indican en partes por millón (ppm) y las constantes de acoplamiento (J) se expresan en Hertzios (Hz). Los patrones de división se designan como se indica: s, singlete; d, doblete; sept, septeto; t, triplete; c, cuarteto; m, multiplete; s ancho, singlete ancho ("broad singlet"); dd, doble doblete; t ap, triple aparente ("apparent triplet"); c ap, cuarteto aparente ("apparent quartet"). La asignación de protones intercambiables (OH y NH) se confirmó mediante la adición de D2O. La cromatografía analítica en capa fina (TLC) se llevó a cabo en placas de gel de sílice F254 de Merck. Las purificaciones de cromatografía flash se realizaron en gel de sílice 60 de Merck (230-400 de malla ASTM ) como la fase estacionaria y se utilizaron el acetato de etilo/n-hexano o MeOH/DCM como eluyentes. Los puntos de fusión (p.f.) se realizaron en tubos capilares abiertos y no son corregidos.

3-(3-(4'-Yodofenil)ureido)bencenosulfonamida (MST-128):

3-(3-(4'-Yodofenil)ureido)bencenosulfonamida (A): p.f. 256-258 °C; vmax (KBr) cm-1, 3165, 3265, 1643, 1589; δH (400 MHz, DMSO-d6) 7,34-7,66 (9H, m, Ar-H, SO2NH2, intercambio con D2O), 8,10 (1H, d, J, 2,1, 2-H), 8,79 (1H, s, NH, intercambio con D2O), 9,08 (1H, s, NH, intercambio con D2O); δC (100 MHz, DMSO-d6) 153,1 (C=O), 145,6, 140,9, 140,3, 138,3, 130,3, 122,1, 121,6, 119,9, 116,1, 85,9; Elem. Anal. Calc. [C, 37,42; H, 2,90; N, 10,07]; Encontrado [C, 37,06; H, 2,79; N, 9,82]; m/z (ESI+) 418 (M+Na)+.

3-(3-(4'-Fluorofenil)ureido)bencenosulfonamida (MST-129):

3-(3-(4'-Fluorofenil)ureido)bencenosulfonamida (B): p.f. 233-235 °C; vmax (KBr) cm-1, 3377, 3352, 1685, 1557; δH (400 MHz, DMSO-d6) 7,17 (1H, dd, J 8,8, Ar-H), 7,45 (2H, s, SO2NH2, intercambio con D2O), 7,47-7,60 (5H, m, Ar-H), 8,10 (1H, d, J, 2,1, 2-H), 8,78 (1H, s, NH, intercambio con D2O), 9,04 (1H, s, NH, intercambio con D2O); δC (100 MHz, DMSOd6) 158,4 (d, JC-F 237, C-4'), 153,4 (C=O), 145,6, 141,1, 136,6, 130,3, 122,0, 121,2, 119,8, 116,3, 116,1; δF (376 MHz,

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Síntesis de Ureido-sulfonamidas Correspondientes a MST-134-148

4-(3-(4'-cloro-2-fluorofenil)ureido)bencenosulfonamida (MST-134):

4-(3-(4'-Cloro-2-fluorofenil)ureido)bencenosulfonamida: vmax (KBr) cm-1, 3166, 3270, 1640, 1592; δH (400 MHz, DMSO-d6) 7,26-7,30 (3H, s ancho, SO2NH2, intercambio con D2O, 5'/6'-H), 7,52 (1H, dd, J, 8,2, 2,1, 5'/6'-H), 7,64 (2H, d, J 8,2, 2 x 2/3-H), 7,78 (2H, d, J 8,2, 2 x 2/3-H), 8,19 (1H, dd, J 9,0, 8,2, 3'-H), 8,79 (1H, s, NH, intercambio con D2O), 9,47 (1H, s, NH, intercambio con D2O); δC (100 MHz, DMSO-d6) 152,8 (d, J1 C-F 245, C-2'), 152,7 (C=O), 143,2, 138,2, 127,8, 127,4, (d, J C-F 10), 126,7 (d, J C-F 10), 125,6, 122,5, 118,4, 116,6 (d, J C-F 23); δF (376 MHz, DMSO-d6) –126,38.

4-(3-(4'-bromo-2'-fluorofenil)ureido)bencenosulfonamida (MST-135):

4-(3-(4'-Bromo-2'-fluorofenil)ureido)bencenosulfonamida: vmax (KBr) cm-1 , 3166, 3270, 1640, 1592; δH (400 MHz, DMSO-d6) 7,27 (2H, s, SO2NH2, intercambio con D2O), 7,40 (1H, d, J, 9,2 5'/6'-H), 7,64 (3H, m, 2 x 2/3-H, 5'/6'-H), 7,78 (2H, d, J 9,2, 2 x 2/3-H), 8,16 (1H, t, J 8,8, 3'-H), 8,79 (1H, s , NH, intercambio con D2O), 9,48 (1H, s, NH, intercambio con D2O); δC (100 MHz, DMSO-d6) 152,8 (d, J1 C-F 245, C-2'), 152,7 (C=O), 143,2, 138,2, 128,5, 127,9, 127,7 (d, J C-F 6), 122,8, 119,2 (d, J C-F 22), 118,4, 114,0 (d, J C-F 9); δF (376 MHz, DMSO-d6) –126,38.

4-(3-(2'-fluoro-5'-nitrofenil)ureido)bencenosulfonamida (MST-136):

4-(3-(2'-Fluoro-5'-nitrofenil)ureido)bencenosulfonamida: vmax (KBr) cm-1, 3166, 3270, 1640, 1592; δH (400 MHz, DMSOd6) 7,28 (2H, s, SO2NH2, intercambio con D2O), 7,60 (1H, dd, J, 9,2, 6,8, 6'-H), 7,70 (2H, d, J 9,2, 2 x 2/3-H), 7,80 (2H, d, J 9,2, 2 x 2/3-H), 7,96 (1H, m, 4'-H), 9,13 (1H, s, NH, intercambio con D2O), 9,18 (1H, m, 6'-H), 9,57 (1H, s, NH, intercambio con D2O); δC (100 MHz, DMSO-d6) 156,0 (d, J1 C-F 251, C-2'), 154,8 (C=O), 144,9, 142,9, 138,6, 129,3 (d, J C-F 12), 127,9, 119,0 (d, J C-F 9), 118,7, 117,0 (d, J C-F 22), 115,7; δF (376 MHz, DMSO-d6) –119,43.

4-(3-(2',4',5'-trifluorofenil)ureido)bencenosulfonamida (MST-137):

4-(3-(2',4',5'-Trifluorofenil)ureido)bencenosulfonamida: vmax (KBr) cm-1, 3166, 3270, 1640, 1592; δH (400 MHz, DMSO-d6) 7,27 (2H, s, SO2NH2, intercambio con D2O), 7,68 (3H, m, 2 x 2/3-H, 3'-H), 7,78 (2H, d, J 9,2, 2 x 2/3-H), 8,22 (1H, m, 6'-H), 8,58 (1H, s, NH, intercambio con D2O), 9.47 (1H, s, NH, intercambio con D2O); δC (100 MHz, DMSO-d6) 152,7 (C=O), 148,2 (dd, J1 C-F 240, 12,2), 146,4 (d, J1 C-F 237, 15,8), 144,4 (dd, J1 C-F 250, 12,0), 143,3, 138,3, 127,8, 125,0 (m), 118,5, 109,5 (dd, J C-F 24,5, 2,9), 106,4 (dd, J C-F 25,6, 22,0); δF (376 MHz, DMSO-d6) –130,64 (d, J F-F 13,9), –141,75 (m), – 143,06 (d, J F-F 24,4).

4-(3-(2'-fluoro-5'-(trifluorometil)fenil)ureido)bencenosulfonamida (MST-138):

4-(3-(2'-Fluoro-5'-(trifluorometil)fenil)ureido)bencenosulfonamida: vmax (KBr) cm-1, 3166, 3270, 1640, 1592; δH (400 MHz, DMSO-d6) 7,28 (2H, s, SO2NH2, intercambio con D2O), 7,47 (1H, m, 4'-H), 7,55 (1H, dd, J 10,8, 8,8, 3'-H), 7,67 (2H, d, J 8,8, 2 x 2/3-H), 7,79 (2H, d, J 8,8, 2 x 2/3-H), 8,63 (1H, m, 6'-H), 9,03 (1H, s, NH, intercambio con D2O), 9,56 (1H, s, NH, intercambio con D2O); δC (100 MHz, DMSO-d6) 154,0 (d, J1 C-F 247, C-2'), 152,8 (C=O), 143,0, 138,5, 129,30 (d, J C-F 11,3), 127,9, 126,2 (dd, J C-F 31,8, 3,3), 123,5, 120,7 (m), 118,6, 117,7, 117,0 (d, J C-F 20,5); δF (376 MHz, DMSO-d6) – 60,7 (3F, C-F3), -123,8 (1F, 2'-F).

4-(3-(2'-fluoro-3'-(trifluorometil)fenil)ureido)bencenosulfonamida (MST-139):

4-(3-(2'-fluoro-3'-(trifluorometil)fenil)ureido)bencenosulfonamida: vmax (KBr) cm-1, 3166, 3270, 1640, 1592; δH (400 MHz, DMSO-d6) 7,27 (2H, s, SO2NH2, intercambio con D2O), 7,43 (2H, m, 5'-H, 6'-H), 7,65 (2H, d, J 8,8, 2 x 2/3-H), 7,79 (2H, d, J 8,8, 2 x 2/3-H), 8,46 (1H, m, 4'-H), 8,96 (1H, s, NH, intercambio con D2O), 9,53 (1H, s, NH, intercambio con D2O); δC (100 MHz, DMSO-d6) 152,7 (C=O), 150,0 (d, J1 C-F 250, C-2'), 143,1, 138,3, 129,4 (d, J C-F 9), 127,8, 125,9 (d, J C-F 43,9), 124,9, 122,2, 120,4, 118,7, 117,5 (dd, J C-F 32,1, 3,2); δF (376 MHz, DMSO-d6) –59,8 (3F, d, J F-F 13,2, C-F3), -132,2 (1F, c, J 13,2, 2'-F).

imagen15

4-(3-(2',6'-difluorofenil)ureido)bencenosulfonamida (MST-147):

4-(3-(2',6'-Difluorofenil)ureido)bencenosulfonamida: vmax (KBr) cm-1, 3164, 3270, 1641, 1590; δH (400 MHz, DMSO-d6) 7,33 (4H, m, SO2NH2, intercambio con D2O, 2 x 5'-H), 7,37 (1H, m, 4'-H), 7,64 (2H, d, J 8,8, 2 x 2/3-H), 7,76 (2H, d, J 8,8,

5 2 x 2/3-H), 8,30 (1H, s, NH, intercambio con D2O), 9,38 (1H, s, NH, intercambio con D2O); δC (100 MHz, DMSO-d6) 158 (d, J1 C-F 247, C-2', C-6'), 153,27 (C=O), 143,7, 138,0, 128,3 (m), 127,7, 118,5, 115,9 (t, J C-F 16, C-4'), 112,6 (d, J C-F 23, 2 x C-3'); δF (376 MHz, DMSO-d6) –118,73.

4-(3-(perclorofenil)ureido)bencenosulfonamida (MST-148):

10 4-(3-(perclorofenil)ureido)bencenosulfonamida: vmax (KBr) cm-1, 3168, 3275, 1641, 1590; δH (400 MHz, DMSO-d6) 7,24 (2H, m, SO2NH2, intercambio con D2O) 7,64 (2H, d, J 8,8, 2 x 2/3-H), 7,75 (2H, d, J 8,8, 2 x 2/3-H), 8,29 (1H, s, NH, intercambio con D2O), 9,38 (1H, s, NH, intercambio con D2O); δC (100 MHz, DMSO-d6) 153,2 (C=O), 142,0, 139,2, 130,1 (señales con solapamiento), 127,4, 125,5.

15

Tabla 3: Los datos de inhibición de AC con las sulfonamidas ureido-sustituidas MST-134-148

Compuesto: Ki(nM)

AC Ih: AC IIh AC IXh AC XIIh

MST-134: 436 162 5,1 7,9

MST-135: 373 418 6,3 7,4

MST-136: 519 276 7,3 7,6

MST-137: 569 215 7,6 6,2

MST-138: 363 170 7,4 10,1

MST-139: 395 196 8,7 8,5

MST-140: 484 335 9,6 6,4

MST-141: 550 33,0 7,7 7,3

MST-142: 275 60,6 3,7 7,1

MST-143: 158 10,0 8,4 8,5

MST-144: 747 58,2 8,9 6,8

MST-145: 307 0,94 8,2 6,1

MST-146: 192 0,97 8,4 8,2

MST-149: 158 0,93 6,1 8,3

MST-150: 538 362 6,3 7,6

Para los ejemplos restantes, los siguientes métodos e información adicional serán una referencia útil.

20 Ha de notar que los compuestos no incluidos dentro del ámbito de las reivindicaciones no forman parte de la presente invención.

Cultivo celular y exposición hipóxica

25 La adquisición, la generación y el cultivo de las líneas celulares 4T1, 66cl4 y 67NR de cáncer de mama de ratón y las líneas celulares MDA-231 y MDA-231 LM2-4 de cáncer de mama humano que expresan la luciferasa se han descrito anteriormente (Lou et al, (2008) Dev Dyn 237:2755-2768; Lou et al, (2011) Cancer Res, 71:3364-3376). Para el cultivo en hipoxia, las células se mantuvieron en O2 al 1% y en CO2 al 5% equilibrado con N2 a 37°C en una incubadora

30 humidificada en una estación de trabajo anaeróbica sellada.

Generación de células estables

Los vectores de ARNhc micro-adaptado ("shRNAmir")que actúan sobre ACIX de ratón y una secuencia no silenciadora

35 (Open Biosystems) se transfectaron en células confluentes al 90% usando LipofectAMINEPLUS™ (Invitrogen Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Debido a la utilización previa de puromicina, las células transfectadas se seleccionaron usando higromicina. Se derivaron clones estables de ACIXhc mediante la clonación de dilución limitada. Para la (re-)introducción de ACIX en las células, ACIX humana (regalo del Dr. Jacques Pouysségur, Universidad de Niza) se transfretó en células 4T1 siguiendo el mismo procedimiento y se utilizó la Zeocina para la

40 selección.

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Medición del pH extracelular

Los cambios en el pH de la solución se evaluaron utilizando procedimientos publicados previamente. En resumen, las células se plaquearon a una densidad apropiada (1x104 células/cm2 para las células 4T1 y sus derivados transfectados, 2x104 células/cm2 para las células 66cl4, 1x104 células/cm2 para células 67NR y sus derivados transfectados) en portaobjetos de 60 mm y se les permitió recuperar durante la noche. A continuación se añadió un volumen estándar de 3 ml de medio fresco/portaobjetos y se incubaron las células en normoxia (aire + CO2 al 5%) o hipoxia (O2 al 1% y CO2 al 5% equilibrado con nitrógeno) durante 72 horas. Se tomó la precaución de asegurar que los cultivos cultivados en normoxia e hipoxia estuvieron de confluencia similar y que contuvieron números de células similares en el momento de recoger el medio. Los medios gastados que se recogieron se mantuvieron a 37°C y el pH se midió inmediatamente usando un pH-metro digital. Se realizaron recuentos de células para asegurar que los números de células para una determinada línea celular fueron comparables en ambas condiciones ambientales. Las células se obtuvieron en hielo para análisis de qRT-PCR y Western blot.

Inhibidores farmacológicos

Las propiedades químicas de la sulfonamida, MST-017, se han descrito anteriormente bajo el nombre de ACI 17 ("CAI 17" en inglés) (Supuran, C. 2008, Nature. Vol. 7: 168 -181). Las ureido sulfonamidas son nuevas. Para los estudios in vitro, los compuestos se disolvieron en DMSO, se mantuvieron a -80°C y se diluyeron en el medio de cultivo justo antes de la aplicación. Las células subconfluentes se incubaron con MST-017 durante 72 horas en normoxia o en hipoxia, se lavaron 3 veces en PBS (tampón fosfato salino) y se captaron imágenes utilizando un microscopio de epifluorescencia Zeiss Axioplan™. Para los estudios in vivo, el inhibidor MST-017 se administró mediante inyección por vía i.p. (las dos primeras dosis se administraron por vía i.v.) a 75 mg/kg y 150 mg/kg 3 veces por semana durante 2 semanas. Las concentraciones y programas de dosificación para los otros inhibidores se indican en los ejemplos apropiados que siguen. Los compuestos se solubilizaron en PEG400/etanol/solución salina antes de la inyección. Los componentes de excipiente se mantuvieron constantes a medida que se variaron las concentraciones de inhibidor.

Análisis de ARNm y expresión de proteína

La técnica PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) se llevó a cabo en placas de 384 pocillos en un instrumento de Applied Biosystems utilizando una Roche Universal Probe Library (UPL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.En resumen, 1 μg de ARN total de células subconfluentes o de tejido congelado instantáneamente se utilizó para fabricar ADNc.

Se cargaron en cada pocillo 10 μI de mezcla de qRT-PCR que contenía 100 nM de sonda UPL, 200 nM de cada cebador (Invitrogen) y mezcla maestra de PCR de TaqMan™ (Applied Biosystems) durante 40 ciclos de PCR (44). Los datos de la cuantificación de la expresión génica relativa se adquirieron y se analizaron usando un sistema de detección de secuencias ABI Prism 7900HT y el método estándar de 2-ΔΔct usando la β-actina como el gen constitutivo. Para la inmunotransferencia, las células o el tejido de tumor congelado instantáneo se lisaron en tampón de Triton X-100 al 1% (50 mM Hepes, pH=7,5, 150 mM de NaCl, glicerol al 10%, 1 mM de EGTA y 2 mM de EDTA), suplementado con los inhibidores apropiados. Se cargaron cantidades iguales de proteína en geles SDA-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico). Para mejorar la detección de HIF-1α antes de la degradación, las células a densidades iguales se lisaron directamente en tampón de carga de 4x SDS en hipoxia. Se realizaron los Western blot usando los anticuerpos ACIX de ratón (1:500), HIF-1α (1:250), ACIX humana (1:1000) (todos de R & D Systems) y βactina (1:10.000, Sigma).

Modelos de tumor de ratón

Todos los estudios y procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Animal Care Committee del BC Cancer Research Center y la Universidad de British Columbia (Vancouver, BC, Canadá).

Tumores ortotópicos singénicos y metástasis espontánea

Se implantaron ortotópicamente las células 4T1 (1 x 106) o células 67NR (2 x 106) en la cuarta almohadilla de grasa mamaria de ratones hembras BALB/c de 7 a 9 semanas de edad como se ha descrito anteriormente (Lou et al, (2011) Cancer Res 71: 3364-3376; Lou et al, (2008) Dev Dyn 237:2755-2768). La inyección de números de células de esta magnitud es estándar para la propagación de estos tumores, y los números están muy por debajo de los usados en otros modelos de crecimiento tumoral (Erler, JT. Bennewith, KL ,. Icolau, M. Nature 440: 1222-1226). Las tasas de crecimiento del tumor primario se calcularon a través de las medidas por calibre usando la fórmula elipsoide modificada (LxW2)/2. Se monitorizaron y se cuantificaron la formación de tumores y la progresión de metástasis utilizando bioluminiscencia por

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imágenes como se ha descrito anteriormente (Ebos et al., (2009) Cancer Cell 15:232-239.; Lou et al., (2008) Dev Dyn 237:2755-2768).

Ensayos de metástasis

Para los estudios que implican el agotamiento génico de ACIX, se inyectaron células 4T1 o 67NR (5x105) directamente en la vena de la cola de ratones hembras BALB/c de 7 a 9 semanas de edad. Se captaron imágenes de los ratones una vez por semana para seguir el crecimiento de las metástasis. Se les aplicó la eutanasia a los ratones 20 días después de la inyección y se resecaron los pulmones para un análisis posterior. La carga tumoral en el pulmón se cuantificó contando manualmente los nódulos visibles en la superficie pulmonar. Para los estudios que utilizaron inhibidores de sulfonamidas, se inyectaron células 4T1 (1-5x105) como se ha descrito anteriormente (Pacchiano et al, (2011) J Med Chem 54:1896-1902).

Tumores de xenoinjerto humano

Para los estudios que implican el agotamiento del ACIX, 1 x 107 de células MDA-MB-231 suspendidas en una solución de Matrigel/PBS al 50% se implantaron subcutáneamente en ratones hembras NOD.CB17-prkdcscid/J de 6 a 8 semanas de edad. Para los xenoinjertos de tumores de mama primarios que usaban la variante MDA-MB-231 LM2-4Luc+ (Ebos etal, (2009) Cancer Cell 15:232-239), se implantaron 2x106 de células ortotópicamente en ratones como se ha descrito anteriormente. La terapia se inició cuando los tumores alcanzaron 200 mm3. Para ambos modelos, el crecimiento tumoral se monitorizó con la medición por calibre.

Ensayo de invasión de 3D Matrigel

Se realizó un ensayo de cultivo "en la parte superior" de 3D Matrigel ("3D "on top" Matrigel"), como se ha descrito anteriormente (Lee et al, (2007) Nat Methods 4:359-365). En resumen, se resuspendieron las células MDA-231 LM2-4 Luc+ (1,5x104 células/cm2) en medios de cultivo de 100 μl/pocillo que contenían 2 veces la concentración final del inhibidor y se plaquearon en portaobjetos de cámaras de 8 pocillos previamente recubiertas con Matrigel. Las células se dejaron unir durante 45 minutos con agitación de lado a lado cada 10-15 minutos para evitar la aglutinación de células en el centro del pocillo. Se les añadió a las células un medio adicional de 100 μl/pocillo que contenía Matrigel al 10% y los cultivos se incubaron en hipoxia durante 4 días. Se captaron las imágenes y se fijaron los cultivos para TUNEL usando la metodología de "fijación completa del cultivo" ("whole culture fixation") descrita en Lee et al. (2007) Nat Methods 4:359365).

Cultivo de tumoresferas

Se cultivaron las células 4T1 como monocapas con subcultivo dos veces por semana en DMEM (Gibco) que contenía el 5% de suero bovino fetal (FBS) (Sigma). Posteriormente, las células 4T1 de NShc y ACIXhc se cultivaron como tumoresferas en medios de MammoCult™ (StemCell Technologies, Vancouver, B.C., Canadá) según las instrucciones del fabricante.

(Los tumoresferas son estructuras tridimensionales (a menudo de forma esférica) compuestas de células de cáncer adherentes que se forman cuando las células tumorales se cultivan in vitro bajo condiciones de crecimiento específicas (Fillmore y Kuperwasser, (2008) Breast Cancer Res. 10: R25). Los tumoresferas generalmente crecen en cultivos desuspensión y se consideran el sustituto in vitro de tumores in vivo.)

Análisis citométrico de flujo

Los tumoresferas 4T1 se incubaron con tripsina, se lavaron una vez en tampón HF, "HF Buffer", (HBSS que contenía un 2% de suero bovino fetal), luego se tiñeron con anti-CD24-APC y anti-CD44-PECy7 usando 0,3 μl de anticuerpo por 106 células en 100 μl de HF, y se incubaron en hielo durante 10 min. Después de la incubación, las células se lavaron una vez con tampón HF y se resuspendieron en 300 μl de tampón HF que contenía 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; concentración final, 1 μg/ml). Las células se separaron en un clasificador de células Aria (BD Biosciences, San José, California, EE.UU.). Las células vivas se separaron según la dispersión frontal y lateral, y las células individuales se separaron según la dispersión frontal y el ancho de pulso. Los portales, o "gates", se determinaron mediante un análisis de células no teñidas, controles con especificidad de isotipo, y tinciones individuales. Las células CD44+CD24-/baja o CD44+CD24+ no se evaluaron en cuanto a la pureza debido al bajo número de células obtenidas. El contador de células de los citómetros de flujo se utilizó para determinar el número de células. Se recogieron las células en un medio de DMEM o tampón de HF.

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Inmunohistoquímica

Dos horas antes de la escisión del tumor, los ratones se inyectaron por vía i.p. con una solución salina que contenía 1500 mg/kg de BrdUrd (Sigma) y 60 mg/kg de Pimonidazole (Chemicon), y por vía i.v. 5 minutos antes con DiOC7(3) (70 μl, 0,6 mg/ml; Molecular Probes). Se cortaron criosecciones de tumores en serie (10 μm) con un Cryostar™ HM560 (Microm International), se secaron al aire durante 24 horas, y se captaron imágenes para la fluorescencia de tejido con DiOC7(3) para visualizar el flujo sanguíneo. Las secciones se fijaron en acetona/metanol al 50% (v/v) durante 10 min a temperatura ambiente. La tinción se realizó utilizando el anticuerpo anti-PECAM/CD31 (clon 1:2000, 2H8, BD Pharmingen) y anti-hámster secundario Alexa 647 (1:200, Invitrogen) para la vasculatura, anti-pimonidazole policlonal de conejo (1:2000, Hydroxyprobe Inc.) y anti-conejo secundario Alexa 488 (1:200, Molecular Probes) para la hipoxia, TUNEL (Roche Diagnostics) con dUTP marcado con un TMR rojo ("TMR red tagged") para la apoptosis. Después de captar las imágenes por fluorescencia los portaobjetos se transfirieron a agua destilada durante 10 min seguido de 1 hora de tratamiento con 2 M de HCl y 5 minutos de neutralización con 0,1 M de borato de sodio.

El BrdUrd incorporado por el ADN se detectó usando anticuerpo conjugado de peroxidasa anti-BrdUrd monoclonal de rata (1:500, clon BU1/75, Sigma) y anti-ratón (1:200, Sigma) y un sustrato de DAB reforzado con metal (1:10, Pierce). Los portaobjetos contrateñidos con hematoxilina se deshidrataron y se montaron utilizando Permount (Fisher Scientific) antes de captar las imágenes. La adquisición y el análisis de imágenes se realizaron como se ha descrito anteriormente (Kyle, AH., Huxham, LA., Yeoman, DM., et al 2007. Clin Cancer Res 13:2804-2810). Las secciones tumorales embebidas en parafina también se tiñeron para ACIX (1:100 para tumores primarios, 1:50 para metástasis pulmonares, Santa Cruz Biotechnology) y HIF-1α (1:100, R&D Systems) como se ha descrito anteriormente (Luo et al.). Para los estudios de linfangiogénesis, las secciones de tejido congelado se fijaron con PFA al 2% durante 20 minutos, y se tiñeron con anti-LYVE-1 de conejo (1:100, R&D Systems) y anti-CD31 de rata (1:100, BD Pharmigen) disuelto en PBS que contenía albúmina de suero bovino al 10% y suero de cabra al 2% durante 1 hora a temperatura ambiente en un recipiente con humidificación. Los anticuerpos anti-conejo Alexa 488 y anti-rata Alexa 546 se usaron como anticuerpos secundarios durante 1 hora seguida del medio de montaje Vectashield (Vector Laboratories) que contenía tinción de contraste nuclear DAPI para su montaje.

Ensayo de proliferación celular

El crecimiento celular se midió usando un kit de proliferación celular MTT (Roche Applied Science) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las células se plaquearon en portaobjetos de 96 pocillos a una densidad de 5x103 células/cm2 y se dejaron recuperar durante la noche. Muestras paralelas luego se incubaron en normoxia e hipoxia durante 48 a 72 horas antes de realizar el ensayo.

Ensayo de Apoptosis

Se empleó el marcado TUNEL (Roche Applied Science) para el análisis de la apoptosis en su mayoría de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las células subconfluentes cultivadas en cubreobjetos se incubaron durante 48 horas bajo normoxia o hipoxia en suero al 1%, secadas al aire, fijadas en paraformaldehído al 4% durante 60 minutos y permeabilizadas durante 10 minutos en PBS y Triton-X-100 al 0,1% a temperatura ambiente. Las capas celulares luego se incubaron con los reactivos TUNEL durante 60 minutos a 37°C, se lavaron en PBS y se contratiñeron con una dilución de H33342, 1:10.000.

Análisis Clínico Histórico

Una micromatriz de tejido (TMA, o "tissue microarray") de 4.444 pacientes con un nuevo diagnóstico de cáncer de mama invasivo en la provincia de Columbia Británica de 1986 a 1992 se creó basada en muestras tumorales entregadas a un laboratorio central de receptores de estrógenos. Los métodos usados para crear las TMA se han descrito (Cheang, MD., Chia, SK., Vodu, D et al. 2009. J Natl Cancer Inst 101:736-750). La cohorte de TMA representaba aproximadamente el 70% de todos los casos de cáncer de mama diagnosticados durante este tiempo que fueron referidos a la British Columbia Cancer Agency. 3.630 casos tuvieron resultados adecuados de tumores y tinción para la evaluación de todos los biomarcadores. La inmunohistoquímica para ER, PR, HER2, CK 5/6, EGFR y Ki67 se realizó concurrentemente en secciones en serie y se puntuó como se ha descrito anteriormente (Cheang MD et al.). Se evaluó la expresión de ACIX usando un anticuerpo monoclonal murino (M75; 1:50) (Choi, SW., Kim, JY., Park, JY. 2008 Hum Pathol 39:1317-1322). La puntuación de la expresión de ACIX fue 0: nada de tinción o 1: algo de tinción y se realizadó de forma independiente y a ciegas por 2 patólogos. La aprobación previa del estudio se obtuvo del Comité de Ética, "Ethics Committee", de la Universidad de Columbia Británica.

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una razón de riesgo de 1,4. Estos datos confirman y amplían los resultados de estudios previos que han demostrado que ACIX es un marcador pronóstico en un gran número de pacientes con cáncer de mama.

Este ejemplo proporciona evidencia de que los compuestos descritos en la invención serán terapéuticos para cualquiera de los cánceres susceptibles a metástasis, o aquellos que sobreexpresan ACIX, una diana ("target") mostrada en una gran base de datos de pacientes que se asocia con la supervivencia disminuida en pacientes.

Tabla 4. Expresión de ACIX según el subtipo biológico

Subtipo de Cáncer de Mama: N Total N positivas en ACIX % positivas en ACIX

LumA (ER o PR +, Her2 -, ki67 -): 1437 120 8%

LumB (ER o PR +, Her2-, ki67 +): 815 88 11%

Lum/HER2+ (Her2 +, ER o PR +): 213 36 17%

Her2+ (Her2+, ER -, PR-): 239 80 33%

Basal (ER-, PR-, Her2 -, CK56 o EGFR +): 327 168 51%

10 Arriba, LumA es luminal A; LumB es luminal B; ER es receptor de estrógeno; PR es receptor de progesterona; EGFR es receptor de factor de crecimiento epitelial.

Ejemplo 3

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Los tumores metastásicos 4T1 se caracterizan por hipoxia y la expresión de ACIX

La Figura 2 muestra cultivos celulares, modelos de ratón con marcado bioluminiscente, y una tabla de expresión génica inducida por hipoxia para tres líneas celulares tumorales. En resumen, se inocularon las líneas celulares metastásicas

20 (4T1, 66cl4) y no metastásicas (67NR) de tumor mamario de ratón que expresan la luciferasa de forma estable en la almohadilla de grasa mamaria de ratones. La formación de tumores y la progresión metastásica fueron monitorizadas por imágenes bioluminiscentes. Se aislaron las células de tumores primarios por la microdisección por captura láser y se realizó el análisis de expresión génica diferencial en células tumorales aisladas. (B) Se analizó el tejido tumoral de tres ratones de cada modelo celular para determinar la expresión de genes inducidos por hipoxia (expresión alta, oscurecido;

25 expresión baja, claro).

Los tumores 67NR no metastásicos exhibían una alta densidad vascular, carecían en gran medida de hipoxia, y tenían un bajo número de células apoptóticas. Por el contrario, los tumores primarios derivados de las líneas celulares metastásicas, especialmente la línea celular 4T1, estaban mal vascularizados, y tenían grandes áreas de hipoxia y

30 necrosis con un alto número de células apoptóticas (Figura 2). Entre los genes inducibles por hipoxia identificados en estos tumores, la expresión de ACIX, en particular, estaba elevada en ambas variantes metastásicas (Figuras 2 y 2).

Observamos niveles elevados de proteína ACIX localizada en la membrana plasmática en los tumores metastásicos, mientras que la expresión de ACIX estaba ausente en los tumores 67NR no metastásicos. En la Figura 3 se reproduce

35 un Western blot que muestra la sobreexpresión de ACIX en los tumores primarios. NMG = glándula mamaria normal. La beta-actina sirvió como control de la carga.

Estos datos indican que la expresión de ACIX inducida por hipoxia puede ser crítica para aumentar el potencial metastásico de los tumores de mama primarios.

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Ejemplo 4

Validación del modelo 4T1 con respecto a la expresión de ACIX, la regulación del pH y la supervivencia celular en hipoxia

45 Para estos experimentos, las células 4T1 se cultivaron durante 48 horas en normoxia o hipoxia y los niveles de expresión de ACIX se analizaron utilizando qRT-PCR y los Western blot con la beta-actina sirviendo de control. Los datos se expresan como media ± s.e.m. n = 3, **P<0,005, ***P<10-3. En un segundo paso, las células 4T1 expresando ARNhc no silenciador (NShc) o ARNhc que actúan sobre ACIX (ACIXhc) se incubaron durante 72 horas. Se analizaron dos clones

50 independientes (C2, C5) que expresaban ACIXhc. Los datos se expresan como medias ± s.e.m. n = 3. *** P<0,0005, en comparación con células cultivadas en normoxia. La expresión génica de ACIX en las células 4T1 se silenció mediante constructos de expresión estable que actúan sobre ACIX de ratón y se cultivaron las células en hipoxia para determinar la eficacia de ARNhc para inhibir la expresión de ACIX inducida por hipoxia.

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Figura 7 ilustra la evidencia de que el agotamiento estable de ACIX en un modelo de tumor de mama humano inhibe el crecimiento del tumor primario. Las células MDA-MB-231 que expresan NShc o ACIXhc y las células MDA-MB-231 parentales fueron inoculadas subcutáneamente en el flanco de ratones NOD.CB17-prkdcscid/J y se monitorizaron los animales para el crecimiento tumoral (n=7 para cada grupo) . *P<0,01 con una prueba t de Student bilateral, en

5 comparación con los tumores de control de NShc. En el diagrama de Figura 7, las células MDA-MB-231 que expresan ARNhc micro-adaptado ("shRNAmir") que actúan sobre ACIX humana (ACIXhc) o una secuencia de control no silenciadora (NShc) se cultivaron en normoxia o hipoxia durante 72 horas y se analizaron para determinar la expresión de ACIX inducida por hipoxia. Se muestra el Western blot. La β -actina sirvió como control de la carga.

10 Ejemplo 7

Modelo de metástasis

La línea celular 4T1 inyectada por vía intravenosa formó metástasis pulmonares fornidas y se les aplicó la eutanasia a

15 los ratones dentro de 3 semanas posteriores a la inyección debido a la progresión metastásica, pero no se observó metástasis en los ratones que habían sido inoculados con las células con depleción de ACIX (Figura 8A). Las células tumorales con depleción de ACIX mostraron casi ninguna metástasis visible en los pulmones y permanecen completamente sanas (Figura 8B). Las células 67NR de control negativo, que no son espontáneamente metastásicas, muestran poca evidencia de metástasis después de tres semanas posteriores a la inyección, a pesar de que las células

20 se concentraron en los pulmones a las 24 horas posteriores a la inyección.

Un análisis de los pulmones de los animales inyectados con las células que expresan ACIX mostró un gran número de nódulos en la superficie pulmonar, mientras que los pulmones de ratones inyectados con células con depleción de ACIX eran esencialmente normales (Figura 8C). El agotamiento estable de ACIX inhibe el establecimiento de metástasis

25 pulmonares en el modelo 4T1.

La expresión de ACIX localizada en la membrana fue evidente en secciones histológicas de pulmones de animales de control, pero no de los ratones que tenían células con depleción de ACIX (Figura 8D).

30 Ejemplo 8

(Ejemplo de referencia)

Selectividad de MST-017

35 Las células se cultivaron durante 72 horas en presencia de 10 µM de MST-017. La Figura 9 muestra imágenes representativas del inhibidor marcado con FITC ligado a las líneas celulares en las condiciones indicadas. (C) Las células se cultivaron durante 72 horas con o sin MST-017 (400, 600 y 400 μM para las células 4T1, 66cl4 y 67NR, respectivamente). n=3. Se muestran los cambios medios de pH extracelular ± s.e.m.. Para cada línea celular, los

40 cambios de pH extracelular en hipoxia se evaluaron con respecto a los valores basales del pH extracelular medidos en cultivos paralelos cultivados en normoxia. * P<0,001 con una prueba t de Student bilateral, en comparación con las células cultivadas sin el inhibidor.

El pH extracelular disminuyó drásticamente en hipoxia en las líneas celulares metastásicas 66cl4 y 4T1 que expresan

45 ACIX, pero se mantuvo al mismo nivel en los cultivos de 67NR que no expresan ACIX. El tratamiento de las células con MST-017 revirtió la acidificación del medio extracelular en condiciones de hipoxia en los cultivos de células 66cl4 y 4T1 (Figura 9C).

Ejemplo 9

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(Ejemplo de referencia)

Inhibición de tumor in vivo usando el compuesto de sulfonamida MST-017

55 El actuar sobre la actividad de ACIX con un inhibidor específico de molécula pequeña atenúa el crecimiento de tumores primarios 4T1 (Figura 10). En la Figura 10 (A), las células 4T1 se cultivaron en normoxia o hipoxia y los niveles de expresión de ACIX se analizaron mediante Western blot.

Los animales se inocularon ortotópicamente con células 4T1. Se dejaron establecer los tumores durante 14 días. Se

60 inyectaron los ratones con las dosis indicadas de MST-017 3 veces por semana durante 2 semanas. En el panel izquierdo, el crecimiento tumoral se monitorizó con la medición por calibre. La iniciación y la terminación del tratamiento

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se indican con las flechas (Figura 10B). Los animales tratados y no tratados con excipiente sirvieron de control. *P <0,02,**P <0,01 usando una prueba t de Student bilateral, en comparación con los controles de excipiente.

Los pesos de los animales tratados se monitorizaron como una medida de la toxicidad general del inhibidor. Los ratones se pesaron justo antes de cada dosis del inhibidor de ACIX. No se observaron diferencias significativas en los pesos entre los diversos grupos de tratamiento y control (Figura 10C).

Por consiguiente, el tratamiento de ratones que tenían los tumores 4T1 establecidos con MST-017 mostró una inhibición significativa de crecimiento tumoral en los ratones tratados en comparación con los controles de excipiente. Las concentraciones del inhibidor y el programa de dosificación se toleraron bien, ya que no se observó una reducción significativa de peso en los ratones tratados.

Los ratones tratados que tenían los tumores derivados de 67NR establecidos con concentraciones idénticas de MST-017 no mostraron ningún efecto significativo del inhibidor en comparación con el control de excipiente (Figura 11) y no se observó una reducción significativa de peso.

Ejemplo 10

Inhibición de metástasis in vivo con sulfonamidas novedosas, MST-104 y MST-119

El inhibidor de ACIX novedoso, MST-119, reduce la formación de metástasis por las células tumorales mamarias 4T1. La estructura química del inhibidor de ACIX, MST-119, se muestra en la Figura 12A. Las imágenes bioluminiscentes representativas de metástasis establecidas después de la inyección intravenosa de células 4T1 y el tratamiento con MST-119 se muestran en la figura 12B. Los animales se trataron 24 horas posteriores a la inoculación de las células. Se administraron tres dosis mediante inyección por vía i.p. durante 6 días y se captaron imágenes de los ratones 24 horas después de la tercera dosis del inhibidor. MST-119 se suministró en un excipiente compuesto del 37,5% de PEG400, el 12,5% de etanol y el 50% de solución salina. La cuantificación de la bioluminiscencia derivada del tumor se muestra en la figura 12C. Las regiones de interés se situaron alrededor de focos metastásicos y se calculó el flujo total (fotones/segundo) en la superficie del ratón. Los datos se informan como la media ± s.e.m. N = 4 por grupo. *P<0,05.

El inhibidor de ACIX novedoso, MST-104, reduce la formación de metástasis por las células tumorales mamarias 4T1 (Figura 13). Las células 4T1 se inyectaron directamente en la vena de cola de ratones BALB/c. El tratamiento diario durante 5 días con excipiente o MST-104 se inició a las 24 horas posteriores a la inoculación de las células y se captaron imágenes de los ratones 24 horas después de la dosis final. El excipiente y el inhibidor se administraron mediante una inyección por vía i.p.. Se muestran las imágenes representativas de la bioluminiscencia derivada de células tumorales en los animales de control y los tratados con inhibidores. (B) El gráfico muestra la cuantificación de la bioluminiscencia derivada del tumor. n = 6 por grupo. *P<0,01. La cuantificación de la señal bioluminiscente reveló una disminución estadísticamente significativa en la formación de metástasis en los ratones tratados. Estos datos proporcionan unejemplo adicional de la inhibición de la formación de metástasis pulmonares por las células de cáncer de mama en respuesta a la inhibición que actúa sobre ACIX usando sulfonamidas novedosas.

Ejemplo 11

Inhibición del crecimiento del tumor de mama primario humano con sulfonamidas novedosas

El inhibidor de ACIX novedoso, MST-104, reduce el crecimiento de los xenoinjertos de cáncer de mama primarios humanos. Las células MDA-MB-231 LM2-4Luc+ metastásicas se implantaron ortotópicamente en ratones NOD/SCID. Cuando los tumores alcanzaron un promedio de 200 mm3, los animales recibieron las dosis indicadas de MST-104 diariamente mediante la administración por vía i.p. y el crecimiento del tumor se cuantificó usando mediciones por calibre. Se indican la iniciación y la terminación del tratamiento con inhibidor. n = 8/grupo. *P<0,03, **P<0,001. Diagrama, Western blot que muestra la expresión de ACIX por las células LM2-4Luc+ cultivadas en normoxia (N) e hipoxia (H).

Para evaluar el efecto de la inhibición farmacológica de la actividad de ACIX in vivo, tratamos ratones que tenían tumores MDA-231 LM2-4 establecidos (Ebos et al., 2009) con MST-104. Se observó que estas células indujeron fuertemente ACIX en hipoxia (Figura 14, diagrama). Observamos inhibición significativa, dependiente de la dosis, del crecimiento tumoral en ratones tratados con el inhibidor, en comparación con los controles de excipiente (Figura 14). Estos datos muestran la capacidad de los inhibidores de ACIX basados en sulfonamidas de actuar específicamente sobre los tumores de mama humanos que expresan ACIX.

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Claims

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