CN110128483B

CN110128483B - 一种碳酸酐酶靶向的四价铂配合物及其制备方法和应用

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Publication number: CN110128483B
Application number: CN201910464269.8A
Authority: CN
Inventors: 毛宗万; 周丹捷; 杨刚刚; 潘正银; 曹乾; 黄华珍
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2019-05-30
Filing date: 2019-05-30
Publication date: 2021-01-15
Anticipated expiration: 2039-05-30
Also published as: CN110128483A

Abstract

本发明公开了一种碳酸酐酶靶向的四价铂配合物及其制备方法和应用。本发明首先提供了一种碳酸酐酶靶向的四价铂配合物，该配合物具有碳酸酐酶CAIX的靶向特点，能够特异性识别肿瘤细胞，有效地抑制CAIX的活性，对正常细胞无毒，在乏氧情况下毒性增强，具有显著的抗肿瘤活性；该配合物相对于二价铂药，具有提高肿瘤选择性，减少肝损伤，降低肾毒性，无毒副作用的特点，可实现其与抗肿瘤靶点的特异性结合，增加铂药在乏氧环境的敏感性。本发明还提供了该配合物的制备方法，将CAIXi和Pt(IV)‑COOH_x于含有N,N‑二异丙基乙胺的DMF溶液中混合进行缩合反应，即可得到所述配合物。其制备方法简单，成本较低，具有良好的抗肿瘤药物应用前景和广阔的发展空间。

Description

一种碳酸酐酶靶向的四价铂配合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于药物化学技术领域，更具体地，涉及一种碳酸酐酶靶向的四价铂配合物及其制备方法和应用。

背景技术

铂类药物在1978年被美国FDA批准用于治疗癌症药物，其中，顺铂作为第一代铂类药物，因能够将睾丸癌患者的死亡率降到10％以下而引人注目，主要用于卵巢癌、膀胱癌、肺癌、宫颈癌和头颈癌等的治疗。但是，顺铂具有较大的毒副作用，比如肾毒性、耳毒性、以及神经毒性等。随着铂类药物的发展，卡铂和奥沙利铂已通过国际市场批准；另外，奈达铂、乐铂和庚铂也在局部地区批准上市。目前，铂类药物的毒副作用和耐药性严重限制了其在临床应用上的发展，其产生毒副作用的原因是：药物不能区分正常细胞和肿瘤细胞，在体内会攻击所有快速增殖的细胞，包括骨髓细胞、胃肠道细胞、头皮毛囊细胞等，对于正常细胞具有同样的杀伤作用，在血液循环过程中和进入细胞未到达靶点前，均有可能与体内环境中存在的含硫生物分子(如半胱氨酸、含硫蛋白及相关酶)反应，导致一系列的毒副作用。

四价铂配合物属于二价铂药物的前药，分子自身对癌细胞的杀伤能力较低，该类化合物在生理条件下易被还原并释放二价铂发挥活性。四价铂配合物具有六配位构型，配位稳定结构，稳定性强于二价铂，血液稳定性较高；易于结构修饰，可方便地引入不同功能的基团优化药物结构，使其成为新的铂类药物的发展契机；在轴向上引入一些功能性配体，可以帮助解决顺铂水溶性差、生物利用率低、半衰期短、作用时效短和毒副作用较大等问题。目前，四价铂配合物已成为铂类药物研究开发的重点。

碳酸酐酶(CA)有15种亚型，其中，碳酸酐酶IX(CAIX)位于细胞膜上，是癌细胞在过度生长的过程中，为了适应乏氧微环境而表达的酶。该酶用于其自身的pH的调节，帮助癌细胞转移，在肿瘤如乳腺恶性肿瘤、脑(胶质母细胞瘤)、肾、结肠、头颈部、膀胱和肺等部位的肿瘤中高表达，而在正常细胞中不表达，使得其成为肿瘤特异性的受体，可用于解决铂类药物选择性和特异性差的问题。因此，开发一种无毒副作用、高稳定性、高选择性和高靶向特异性的四价铂配合物，对于肿瘤的治疗具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有化疗药物毒副作用较大、选择性和特异性差的缺陷和不足，提供一种无毒副作用、高稳定性、高选择性和高靶向特异性的四价铂配合物，以细胞膜表面过表达的CAIX作为切入点，改善现有化疗药物的选择性和乏氧毒性。

本发明的第一个目的是提供一种碳酸酐酶靶向的四价铂配合物。

本发明的第二个目的是提供上述配合物的制备方法。

本发明的第三个目的是提供上述配合物或上述方法制备得到的配合物的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明首先提供了一种碳酸酐酶靶向的四价铂配合物，其结构式如式(I) 所示：

其中，CAIXi为4-甲基苯磺酰胺基，4-乙基苯磺酰胺基，4-丙基苯磺酰胺基， 5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-磺酰胺基，4-脲基苯磺酰胺基，2-甲基糖精基或5-羰基苯磺酰胺基中的任意一种；

X、Y为单独配体时，X为氯原子，Y为氯原子；或者X、Y为复合式配体时，X、Y为环丁烷二酸；

R1、R2为单独配体时，R1为NH₃，R2为NH₃；或者R1、R2为复合式配体时，R1、R2为1,2-环己二胺。

优选地，所述X、Y为单独配体，X为氯原子，Y为氯原子。

优选地，所述R1、R2为单独配体，通过N原子和Pt配位，R1为NH₃， R2为NH₃。

本发明还提供了所述碳酸酐酶靶向的四价铂配合物的制备方法，将CAIXi 和Pt(IV)-COOH_x于含有N,N-二异丙基乙胺的二甲基甲酰胺溶液中混合，进行缩合反应，即可得到所述配合物；

其中，所述Pt(IV)-COOH_x的结构式如式(II)所示：

当二价铂药为顺铂(X为氯原子、Y为氯原子；R1为NH₃、R2为NH₃)时，制备碳酸酐酶靶向的四价铂配合物的反应式为：

产物为顺式-二胺二氯-二磺胺琥珀酸合铂(IV)，简称为配合物1。

当二价铂药为奥沙利铂(X、Y为环丁烷二酸，R1、R2为1,2-环己二胺)时，制备碳酸酐酶靶向的四价铂配合物的反应式为：

产物为顺式-草酸(反式-1，2-环己二胺)-二磺胺琥珀酸合铂(IV)，简称为配合物2。

优选地，所述碳酸酐酶靶向的四价铂配合物的制备方法，具体步骤如下：

S1.将二价铂药中的二价铂经过氧化还原反应氧化成四价铂，然后与丁二酸酐发生酸酐反应，得到轴向酯键连接的Pt(IV)-COOH_x；

S2.将步骤S1所得Pt(IV)-COOH_x与CAIXi在含有N,N-二异丙基乙胺的 DMF溶液中混合，然后在缩合剂作用下进行缩合反应，即可得到所述碳酸酐酶靶向的四价铂配合物。

优选地，步骤S2所述Pt(IV)-COOH_x、CAIXi、缩合剂和N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1：1～4：2～4：2～5。

更优选地，步骤S2所述Pt(IV)-COOH_x、CAIXi、缩合剂和N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1：2.4：3：2.5。

优选地，步骤S2所述缩合剂为2-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。

优选地，步骤S2所述缩合反应的温度为30℃～70℃。

更优选地，步骤S2所述缩合反应的温度为30℃。

优选地，步骤S2所述缩合反应的时间为24～48h。

更优选地，步骤S2所述缩合反应的时间为24h。

优选地，步骤S1所述四价铂和丁二酸酐的摩尔比为1：1～3。

更优选地，步骤S1所述四价铂和丁二酸酐的摩尔比为1：2.2。

优选地，步骤S1所述酸酐反应的温度为25℃～70℃。

更优选地，步骤S1所述酸酐反应的温度为25℃。

优选地，步骤S1所述酸酐反应的时间为12～48h。

更优选地，步骤S1所述酸酐反应的时间为24h。

优选地，步骤S1所述氧化还原反应的温度为50℃～70℃。

更优选地，步骤S1所述氧化还原反应的温度为65℃。

优选地，步骤S1所述氧化还原反应的时间为4～6h。

更优选地，步骤S1所述氧化还原反应的时间为5h。

优选地，步骤S1所述二价铂药的物质的量(mmol)和双氧水的体积(mL) 之比为1：6～12。

更优选地，步骤S1所述二价铂药的物质的量(mmol)和双氧水的体积(mL) 之比为1：6。

另外，上述碳酸酐酶靶向的四价铂配合物或上述方法制备得到的碳酸酐酶靶向的四价铂配合物在作为或制备抗肿瘤药物中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

所述抗肿瘤药物为抗三阴性乳腺癌、抗肝癌和/或抗宫颈癌的药物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明制备得到的碳酸酐酶靶向的四价铂配合物具有碳酸酐酶CAIX的靶向特点，能够特异性识别肿瘤细胞，有效地抑制CAIX的活性，对正常细胞无毒，在乏氧情况下毒性增强近10倍，具有显著的抗肿瘤活性；该配合物相对于二价铂药，具有提高肿瘤选择性，减少肝损伤，降低肾毒性，无毒副作用的特点，可实现其与抗肿瘤靶点的特异性结合，增加铂药在乏氧环境的敏感性。另外，该配合物的制备方法简单，成本较低，可大范围推广应用，具有良好的抗肿瘤药物应用前景和广阔的发展空间。

附图说明

图1是实施例1制备得到的配合物1的质谱图。

图2是实施例1制备得到的配合物1的核磁共振氢谱图。

图3是实施例2制备得到的配合物2的质谱图。

图4是实施例2制备得到的配合物2的核磁共振氢谱图。

图5是实施例1制备得到的配合物1对细胞内CAIX表达水平影响结果图。

图6是实施例1制备得到的配合物1的活体抗肿瘤效果研究结果；其中，图 A为肿瘤抑制生长曲线，图B为取出的肿瘤照片，图C为裸鼠体重变化曲线，图D为裸鼠的血液生化检测分析结果。

图7是给药配合物1后裸鼠的肝、肾、脾、心、肺的HE染色图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1碳酸酐酶靶向的四价铂配合物的制备

1、实验方法

S1.将顺铂(2.0mmol，600.0mg)溶解于35.0mL的去离子水中，磁力搅拌下加入12.0mL 30％的双氧水(H₂O₂)，在65℃下进行氧化还原反应5h，然后室温反应过夜，过滤除去H₂O₂，得到淡黄色的固体，即为顺式-二胺二氯二羟合铂(IV)；

S2.将步骤S1得到的顺式-二胺二氯二羟合铂(IV)(333.0mg，1.0mmol)加入3.0mL无水二甲基亚砜(DMSO)中，磁力搅拌下加入丁二酸酐(240.2mg，2.2mmol)，25℃进行酸酐反应24h，反应结束后加入100.0mL水，冻干除去溶剂，用冰丙酮、冰乙醚将固体洗三遍，得到白色固体，即为顺式-二胺二氯二羧基合铂(IV)；

S3.称取步骤S2得到的顺式-二胺二氯二羧基合铂(IV)(530.3mg，1.0mmol) 溶解于5mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入含有2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(1140.7mg，3mmol)的DMF溶液，室温搅拌10min，将磺胺(413.3mg，2.4mmol)与N,N-二异丙基乙基胺(323.1 mg，2.5mmol)混合于1mL的无水DMF中，然后将所得混合溶液滴加到顺式- 二胺二氯二羧基合铂(IV)溶液中，25℃进行缩合反应24h；

S4.反应结束后，旋蒸溶液以去掉溶剂，加入5.0mL的丙酮洗涤沉淀，离心，弃掉上清液，然后用5.0mL甲醇溶解，滴加到15.0mL的乙醚中，离心得沉淀，再用二氯甲烷、乙醚多次洗涤，得到的黄色固体即为顺式-二胺二氯-二磺胺琥珀酸合铂(IV)，简称为配合物1，其产率为65.0％。

本实施例中制备配合物1的反应式为：

2、实验结果

本实施例制备得到的配合物1的结构式为：

本实施例制备得到的配合物1的质谱图和核磁共振氢谱图分别如图1和图2 所示，其结构表征如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.29(s,2H),7.74(s,8H),7.24(s,4H),6.54 (s,6H),2.60(s,4H),2.55(s,4H)；¹³C NMR(126MHz,DMSO)δ180.22(s):171.52 (s),142.67(s),138.47(s),127.09(s),118.97(s),32.76(s),30.99(s).ESI-MS (CH₃OH):839.02,found:841.00。

实施例2碳酸酐酶靶向的四价铂配合物的制备

1、实验方法

S1.将奥沙利铂(795.0mg，2mmol)溶解于35.0mL的去离子水中，磁力搅拌下加入12.0mL 30％的H₂O₂，在70℃下进行氧化还原反应4h，然后室温反应过夜，过滤除去H₂O₂，得到灰色的固体，即为顺式-草酸(反式-1，2-环己二胺) 二羟合铂(II)；

S2.将步骤S1得到的顺式-草酸(反式-1，2-环己二胺)二羟合铂(II)(429.3mg,1.0mmol)加入3.0mL无水DMF中，磁力搅拌下加入丁二酸酐(240.2mg,2.4 mmol)，70℃反应48h，反应结束后加入100.0mL水，冻干除去溶剂，用冰丙酮、冰乙醚将固体洗三遍，得到棕灰色固体，即为顺式-草酸(反式-1，2-环己二胺)二丁二酸合铂(IV)；

S3.称取步骤S2得到的顺式-草酸(反式-1，2-环己二胺)二丁二酸合铂(IV)(629.1mg,1mmol)溶解于5.0mL无水DMF中，加入含有HATU(1140.7mg， 3mmol)的DMF溶液，室温搅拌10min，将磺胺(413.3mg，2.4mmol)与N,N- 二异丙基乙基胺(620.4mg，4.8mmol)混合于1mL的无水DMF中，然后将所得混合溶液滴加到顺式-草酸(反式-1，2-环己二胺)二丁二酸合铂(IV)溶液中，70℃ 缩合反应48h；

S4.反应结束后，旋蒸溶液以去掉溶剂，加入5mL的水洗涤沉淀，离心，弃掉上清液，然后用5mL甲醇溶解，滴加到15mL的乙醚中，离心得沉淀，先用冰水洗涤，然后用二氯甲烷、甲醇、乙醚多次洗涤，得到的黄色固体即为顺式 -草酸(反式-1，2-环己二胺)-二磺胺琥珀酸合铂(IV)，简称为配合物2，其产率为 44.9％。

本实施例中制备配合物2的反应式为：

2、实验结果

本实施例制备得到的配合物2的结构式为：

本实施例制备得到的配合物2的质谱图和核磁共振氢谱图分别如图3和图4 所示，其结构表征如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO):δ10.30(s,2H),8.39(s,2H),8.17(s,2H),7.73(s, 8H),7.23(s,4H),2.62(s,10H),2.09(s,2H),1.59-1.02(m,8H)；¹³C NMR(126MHz, DMSO):δ180.57(s),171.46(s),163.81(s),142.59(s),138.54(s),127.06(s),118.89 (s),61.21(s),32.44(s),31.39(s),30.92(s),23.88(s)；ESI-MS(CH₃OH):938.53， found:937.81。

以实施例1得到的配合物1和实施例2得到的配合物2进行抗肿瘤研究，经测试比较，配合物1的抗肿瘤效果更好，抗肿瘤测试结果如下：

实施例3配合物1对多种肿瘤细胞株活性的研究

1、实验方法

细胞毒性采用四唑盐(MTT)比色法测定。细胞用胰酶消化、收集，并用培养基重悬成单细胞悬液，通过细胞计数将细胞浓度调整为5×10⁴/mL，并接种于 96孔培养板，每孔160μL，在37℃、含5％CO₂的培养箱中培养24h后，再分别加入不同浓度的药物(加药孔：加入以上实施例1制备得到的配合物1；对照孔：加入顺铂)，继续孵育72h，在结束前4h，于每孔加入20μL MTT(5mg/mL)， 4h后小心除去上清液，每孔加入150μL DMSO，于室温振荡10min，再用酶标仪测定每孔在波长为595nm处的OD值。

细胞存活率通过以下公式进行计算，然后再通过作图求得半数杀伤浓度 (IC50)。

细胞存活率％＝加药孔平均OD值/对照孔平均OD值×100％。

受试细胞株分别为：MDA-MB-231(三阴性乳腺癌细胞)、HepG2(人肝癌细胞株)、HeLa(人宫颈癌细胞株)、MCF-10A(人正常乳腺上皮细胞)、LO2 (人正常肝细胞)、HLF细胞(人胚肺成纤维细胞)。

2、实验结果

碳酸酐酶靶向的四价铂配合物1对多种肿瘤细胞株的毒性如表1所示，可以看出，在常氧下，该配合物1对MDA-MB-231细胞、HeLa细胞、HepG2细胞都具有杀伤效果，效果和顺铂的毒性相当，IC50分别是18.0μM，12.6μM，28.6 μM；而在乏氧下，该配合物1的毒性增强，IC50分别是1.9μM，3.6μM，8.3μM，而顺铂的毒性降低，IC50分别是21.9μM，28.2μM，20.2μM。

乏氧(1％O₂)下，配合物1对MDA-MB-231细胞、HeLa细胞、HepG2细胞的细胞毒性分别是顺铂的11.5倍、7.8倍、2.4倍。这是因为在乏氧下，肿瘤细胞的碳酸酐酶9表达增加，配合物1通过CAIX受体介导的胞吞和主动运输，使得配合物1在细胞的摄取增加，进而导致乏氧情况下配合物1对细胞的毒性增强。这种铂类配合物1进入癌细胞后，细胞内还原性物质还原，脱去其轴向官能团HL，氯原配体水解使能够作用于DNA，从而抑制DNA的复制，诱导细胞死亡。

在MDA-MB-231细胞中，在常氧下，配合物1的选择性系数是顺铂的6.6 倍；而在乏氧下，配合物1的选择性系数是顺铂的94.1倍。在HepG2细胞中，常氧下配合物1的选择性系数是顺铂的8.3倍；而在乏氧下，配合物1的选择性系数是顺铂的2.4倍。以上结果说明：CAIX抑制剂的引入有利于提高顺铂药物的选择性。

表1配合物1对不同细胞中72h细胞毒性的IC50值(μM)

注：“N.D”表示正常细胞由于乏氧适应性较差而无法测定IC50值；“SI”表示选择性系数，它被定义为IC50(正常细胞)/常氧或者乏氧下的IC50(癌细胞)。

实施例4配合物1对CAIX活性的体外抑制活性研究

1、实验方法

体外抑制活性按照文献方法测定(Hou Z,Lin B,Bao Y,et al.Eur J Med Chem,2017,132:1-10.)。实验原理：底物4-硝基苯乙酸酯(4-NPA)经过碳酸酐酶9 (CA9)的水解，生成4-硝基苯酚；4-硝基苯酚在405nm有吸收峰，可用酶标仪测定405nm处的光吸收值的变化，衡量CA9的活力。

以上实验原理的反应式为：

样品：CAIX液体蛋白市售得到，初始浓度为6mg/mL，用PBS进行稀释成浓度为0.25mg/mL的CAIX液体蛋白；将底物4-NPA稀释到2mM。

实验步骤如下：

(1)加入36μL CA9到透明的96孔板的样品处理孔上，空白孔加入36μL 的PBS；

(2)加入4μL不同浓度的以上实施例1制备得到的配合物1到96孔板的样品处理孔上，室温下摇动15min，形成比较稳定的抑制剂-酶复合物(E-I)，阳性对照孔和空白孔则加4μL与抑制相同的缓冲液；

(3)15min后，每孔加40μL 4-NPA(2mM,Sigma-Aldrich,St.Louis,MI, USA)，37℃孵育4～5h；

(4)在405nm处读取相应的吸光度。

空白孔：36μL PBS+4μL缓冲液+40μL 4-NPA

样品处理孔：36μL CA9+4μL抑制剂+40μL 4-NPA

阳性对照孔：36μL CA9+4μL缓冲液+40μL 4-NPA

酶活力计算按以下公式：

抑制率％＝(样品处理孔OD值-空白孔平均OD值)/(阳性对照孔-空白孔平均OD值)×100％，然后再通过作图求得画出对应的曲线，并计算出相应的IC₅₀值。

2、实验结果

配合物1对CAIX活性的体外抑制活性结果如表2所示，其中，乙酰唑胺为阳性对照，文献参考IC₅₀值为25～32nM，可以看出，与未引入CAIX抑制剂(IC₅₀值为354.8±4.4nM)相比，本发明制备得到的配合物1可以有效地抑制CAIX 的活性。

表2配合物1对CAIX活性的体外抑制活性

实施例5配合物1对细胞内CAIX表达水平影响研究

1、实验方法

实验用到的抗体均购买于Abcam公司。

将MDA-MB-231细胞接种于100mm的Corning培养皿中，待细胞贴壁后，换液，加入一定浓度的以上实施例1制备得到的配合物1，再孵育24h；胰酶将细胞消化、收集，用冷的PBS洗2～3次；加入RIPA细胞裂解液(50μL，含0.1 mM PMSF)在冰上裂解MDA-MB-231细胞15min，离心，收集上清液。

根据目标蛋白选择合适浓度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，电泳分离目标蛋白后，在200mA进行转膜，转移到PVDF膜上(Millipore,USA)；将PVDF膜浸泡于Western封闭液中，室温震摇2h；除去封闭液，用洗涤液进行洗涤，然后与相应的一抗4℃孵育过夜；除去一抗后，用洗涤液洗三次，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温孵育1h；最后用化学发光(ECL)试剂盒(Amersham Inc,USA)进行检测并显影。

2、实验结果

配合物1对细胞内CAIX表达水平影响结果如图5所示，可以看出，本发明制备得到的配合物1可以有效地下调细胞内CAIX表达水平，并随着配合物1浓度的升高，抑制作用增强，表现出明显的浓度依赖性。这是因为配合物1利用自身的空间位阻和活性基团与CAIX的活性空腔发生相互作用，有效抑制了CAIX 的催化活性的发挥。

实施例6配合物1的活体抗肿瘤效果研究

1、实验方法

SPF级的4～5周龄的雌性裸鼠购自中山大学实验动物中心，所有的实验操作都严格按照中山大学动物关爱和使用协会制定的操作规范进行。

于裸鼠背部右侧靠后皮下注射约1×10⁶个MDA-MB-231细胞，建立裸鼠体内肿瘤模型；当肿瘤体积长到约80mm³时，将裸鼠随机分成3组(每组4只) 然后进行如下给药：

组1(生理盐水)：尾静脉注射与加药组体积相同的缓冲液；

组2(顺铂)：尾静脉注射剂量为5mg/kg裸鼠体重的顺铂；

组3(配合物1)：尾静脉注射剂量为5mg/kg裸鼠体重的配合物1。

加药时，通过尾静脉进行注射药物、相应对照药物以及用于对照的缓冲溶液，每3天加药5mg/kg裸鼠体重，共4次；每3天用游标卡尺进行测量肿瘤长径(a) 和短径(b)；称体重一次；肿瘤体积(V)用公式V＝ab²/2进行计算，得到肿瘤体积大小，总共观察24天，以观察天数和肿瘤体积进行作图得到肿瘤抑制曲线；然后处死裸鼠，取出肿瘤进行拍照。

对裸鼠的肝功能指标(血清总蛋白TP、白蛋白ALB)和肾功能指标(尿素氮BUN、肌酐CRE和尿酸UA)采用全自动生化分析仪进行分析，上样后仪器自动检测，不同指标按照试剂盒说明书进行操作。

在以上实验观察终点，将裸鼠处死，取出肝、肾、脾、心、肺并制成切片，对切片脱蜡，并用乙醇逐步脱水，先用苏木素染色5min，用水洗2min并吸干；然后用75％乙醇(含1％盐酸)分化，用水冲洗15min并吸干；在组织切片上滴加伊红染色2min，然后用蒸馏水洗30s，最后脱水脱蜡、封片，用光学显微镜观察组织并拍照。

2、实验结果

配合物1的活体抗肿瘤效果研究结果如图6所示，可以看出：该配合物1能有效抑制肿瘤的生长，在实验终点配合物1组肿瘤体积是对照组的42.14％，而顺铂组是对照组的56.59％，配合物1组比顺铂组效果有所提升。说明本发明制备得到的配合物1可以提高抗肿瘤的效果。

由图6中的C可以看出：在给药观察期间，该配合物1组的裸鼠体重没有明显变化，而顺铂组的裸鼠体重明显下降，说明本发明制备得到的配合物1对裸鼠的损伤减少。

由图6中的D可以看出：该配合物1可以有效缓解肝功能指标中血清总蛋白TP、白蛋白ALB的降低，减少肝损伤；且该配合物1组与对照组肾功能指标中尿素氮BUN、肌酐CRE和尿酸UA相比，两组较为相近，而顺铂组各肾功能指标上升显著；以上结果说明本发明制备得到的配合物1可以有效减少肝损伤、降低肾毒性。

给药配合物1后裸鼠的肝、肾、脾、心、肺的HE染色图如图7所示，可以看出，该配合物1与对照组相比，肝、肾、脾、心、肺组织无明显病变，细胞呈现正常形态，没有出现核质分离、空泡化、气球样性变化等；而顺铂组肝损伤和肾损伤明显，肝组织中广泛可见大量肝细胞水肿，胞质空泡化(黑色箭头)，局部汇管区周围及组织边缘可见较多肝细胞气球样变性，细胞肿胀，核居中，胞质空泡化(黄色箭头)，局部支气管管腔内可见少量嗜酸性粘液分泌(红色箭头)，肾小体外膜系细胞增生较多(白色箭头)；以上结果说明本发明制备得到的配合物1可有效降低顺铂对裸鼠的损伤和毒副作用。

以上具体实施方式为便于理解本发明而说明的较佳实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种碳酸酐酶靶向的四价铂配合物，其特征在于，其结构式如式（1）所示：

。

2.权利要求1所述碳酸酐酶靶向的四价铂配合物在制备抗肿瘤药物中的应用。