CN104876902B - 7‑环己基甲基‑5‑(2’‑氨基)苯基白杨素及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及7‑环己基甲基‑5‑(2’‑氨基)苯基白杨素及其制备方法和应用，特别涉及7‑环己基甲基‑5‑(2’‑氨基)苯基白杨素及其与10‑羟基喜树碱组成的药物组合物在制备治疗癌症药物中的应用。本发明提供一种新的白杨素基化合物：7‑环己基甲基‑5‑(2’‑氨基)苯基白杨素，该化合物具有式I所示的结构：
Description
技术领域
本发明涉及7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素及其制备方法和应用，特别涉及7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素及其与10-羟基喜树碱组成的药物组合物在制备治疗肺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、脑瘤、肉瘤、卵巢癌或乳腺癌的药物中的应用。
背景技术
癌症是威胁人类健康的主要疾病之一。据世界卫生组织报道，在2008年癌症已导致760万人死亡(约占所有死亡人数的13％)，并且该死亡人数将会持续上升，预计到2030年将超过1310万。而且，大多数癌症死亡是由肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌和乳腺癌造成。目前用于癌症治疗的手段主要有三种，即手术、放疗和化疗，其中又以化疗为主。然而，现有的能治愈癌症的化疗药物则少之又少，且会因为溶解度差、毒副作用强、细胞耐药性等问题而制约它本身的应用。因此，研制新型的高效低毒化疗药物，则成为癌症治疗的聚焦点。另外，则是探求具有协同效应的化疗药物进行联合用药，以求达到减毒增效的作用。
白杨素(chrysin,5,7-二羟基黄酮)是一种广泛分布的天然黄酮，主要存在于紫葳科植物木蝴蝶的种子、茎皮，松科植物山白松的心木，芒松的心木等，且具有抗癌、降血脂、防心脑血管疾病、抗菌、消炎等多种活性。但它的活性不是很强，且结构相对简单，常被改造以提高其抗癌药物。
10-羟基喜树碱是喜树碱的第10位碳原子的氢被羟基取代，是从喜树中提取的另一种生物碱。它是一种细胞周期特异性药物，主要通过作用于拓扑异构酶I来抑制DNA复制，从而抑制细胞增殖。该药的抗癌谱广，与其它抗肿瘤药物无交叉耐药性，对肝癌、胃癌等多种恶性肿瘤具有显著疗效，在肿瘤的化疗方案中得到广泛的应用。但是，该药在水中几乎不溶解，而且服用过程中往往会产生一些毒副作用，例如恶心、呕吐、白细胞下降、脱发等症状。为了弥补这些缺陷，则可利用其他与其具有协同效应的低毒药物进行联合用药，从而使得它在达到同一药效时所用的浓度降低来减缓因它而产生的副反应。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的白杨素基化合物(7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素)，该化合物可单独使用作为抗肿瘤药物，也可以与10-羟基喜树碱共同作用作为高活性的抗肿瘤药物组合物。尤其当7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素与10-羟基喜树碱组合物作为抗肿瘤药物时，可以在达到相同药效的基础上降低10-羟基喜树碱的施药量，进而解决10-羟基喜树碱在作为抗肿瘤药物使用时毒副作用大的技术问题。
7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素，具有式I所示的结构：
本发明的另一目的是提供上述7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素的制备方法。
一种7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素的制备方法，包括下述步骤：碱性条件下，使白杨素依次与溴甲基环己烷和1-氟-2-硝基苯反应，得7-环己基甲基-5-(2’-硝基)苯基白杨素；还原性条件下，使7-环己基甲基-5-(2’-硝基)苯基白杨素中硝基还原为氨基，得7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素。
本发明一个优选的制备7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素的方法，包括下述步骤：
①将白杨素、溴甲基环己烷和无水碳酸钾按照摩尔比1:1.5:1溶于N-甲基吡咯烷酮(NMP)中，75℃下反应完全；加入与白杨素摩尔比为1:2:2的1-氟-2-硝基苯和无水碳酸钾，80℃反应完全、沉淀、过滤、干燥，得到7-环己基甲基-5-(2’-硝基)苯基白杨素。
②将冰乙酸与浓盐酸以体积比3:1混匀后，按照摩尔比4:1加入SnCl2.2H2O和7-环己基甲基-5-(2’-硝基)苯基白杨素，80℃下反应完全，沉淀、过滤、洗涤、干燥，得到7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素。
上述技术方案中，特别地，所述步骤①为：将白杨素、溴甲基环己烷和无水碳酸钾按照摩尔比1:1.5:1相继加入于N-甲基吡咯烷酮(NMP)中，75℃下反应；TLC检测反应完全后，相继加入与白杨素摩尔比为1:2:2的1-氟-2-硝基苯和无水碳酸钾，80℃反应；TLC检测反应完全后，倒入粗冰中，沉淀，过滤，干燥。
上述技术方案中，特别地，所述步骤②为：将冰乙酸与浓盐酸以体积比3:1混匀后，按照摩尔比4:1相继加入SnCl2.2H2O与7-环己基甲基-5-(2’-硝基)苯基白杨素，80℃下反应；TLC监测反应完全后，倒入粗冰中，沉淀，过滤，稀盐酸洗，水洗，弱碱洗，干燥。
本发明的又一目的是提供上述7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素在制备治疗癌症药物中的应用。
特别地，提供上述7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素在制备治疗子宫颈癌，肺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、脑瘤、肉瘤、卵巢癌或乳腺癌药物中的应用。
本发明的又一目的是提供包含上述7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素的药物组合物。
一种抗肿瘤药物组合物，包含10-羟基喜树碱和式I所示7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素，
本发明所述抗肿瘤药物组合物所有技术方案中优选所述药物组合物包含10-羟基喜树碱和式I所示7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素，其中10-羟基喜树碱和式I所示7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素的摩尔比为优选为0.003～10:1。
本发明的又一目的是提供上述抗肿瘤药物组合物在制备治疗癌症药物中的应用。
特别地，提供上述抗肿瘤药物组合物在制备治疗子宫颈癌，肺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、脑瘤、肉瘤、卵巢癌或乳腺癌药物中的应用。
本发明所述抗肿瘤药物组合物一个优选的技术方案为所述药物组合物包含10-羟基喜树碱和式I所示7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素，其中10-羟基喜树碱和式I所示7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素的摩尔比为优选为0.02～2.5:1。特别地，该技术方案所述组合物特别适用于制备治疗乳腺癌的药物。
本发明所述抗肿瘤药物组合物另一个优选的技术方案为所述药物组合物包含10-羟基喜树碱和式I所示7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素，其中10-羟基喜树碱和式I所示7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素的摩尔比为优选为0.003～1:1。特别地，该技术方案所述组合物特别适用于制备治疗胃癌的药物。
本发明所述抗肿瘤药物组合物另一个优选的技术方案为所述药物组合物包含10-羟基喜树碱和式I所示7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素，其中10-羟基喜树碱和式I所示7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素的摩尔比为优选为0.04～5:1。特别地，该技术方案所述组合物特别适用于制备治疗子宫颈癌的药物。
本发明所述抗肿瘤药物组合物还可包含可药用的辅料，更进一步地，本发明抗肿瘤药物组合物由10-羟基喜树碱、式I所示7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素和可药用辅料组成，其中，10-羟基喜树碱和式I所示7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素的摩尔比为0.003～10:1。
本发明的又一目的是提供上述抗肿瘤药物组合物在制备治疗癌症药物中的应用。
特别地，提供上述抗肿瘤药物组合物在制备治疗子宫颈癌，肺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、脑瘤、肉瘤、卵巢癌或乳腺癌药物中的应用。
本发明所述抗肿瘤药物组合物一个优选的技术方案为所述药物组合物包含10-羟基喜树碱、式I所示7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素和可药用辅料，其中10-羟基喜树碱和式I所示7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素的摩尔比为优选为0.02～2.5:1。特别地，该技术方案所述组合物特别适用于制备治疗乳腺癌的药物。
本发明所述抗肿瘤药物组合物另一个优选的技术方案为所述药物组合物包含10-羟基喜树碱、式I所示7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素和可药用辅料，其中10-羟基喜树碱和式I所示7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素的摩尔比为优选为0.003～1:1。特别地，该技术方案所述组合物特别适用于制备治疗胃癌的药物。
本发明所述抗肿瘤药物组合物另一个优选的技术方案为所述药物组合物包含10-羟基喜树碱、式I所示7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素和可药用辅料，其中10-羟基喜树碱和式I所示7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素的摩尔比为优选为0.04～5:1。特别地，该技术方案所述组合物特别适用于制备治疗子宫颈癌的药物。
本发明所述抗肿瘤药物组合物使用的辅料可采用本领域常规的辅料，但以不和本发明所述药物组合物发生反应或不影响本发明药物组合物的疗效为前提。本发明抗肿瘤药物组合物中的10-羟基喜树碱与7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素可以直接混合做成制剂；或分别和相应的辅料混合分别做成制剂，然后再按照本领域常规的方式包装或结合在一起；或分别和相应的辅料混合后，再混合做成制剂。根据制剂形式和制剂规格的不同，本发明药物组合物在制剂中的含量可在1-99wt％之间进行调整，优选10-90wt％。此外，本发明药物组合物的给药剂量可根据给药对象、给药途径或药物的制剂形式进行适当变化，但以保证该药物组合物在哺乳动物体内能够达到有效的血药浓度为前提。
本发明所述的抗肿瘤药物组合物，优选的情况下，所述10-羟基喜树碱与7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素的稀释溶剂为二甲基亚砜。
本发明的抗肿瘤药物组合物可应用于治疗各类肿瘤，所述肿瘤包括但不限于肺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、脑瘤、肉瘤、卵巢癌或乳腺癌。
本发明所述的抗肿瘤药物组合物，优选的情况下，所述10-羟基喜树碱与7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素的有效浓度分别为0.1～25μM和2.5～30μM；更优选的情况下，则分别为3～13μM和2.5～10μM。
本发明所述抗肿瘤药物组合物的应用，优选的情况下，所述7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素与10-羟基喜树碱同时添加；更优选的情况下，同时添加后作用30～50h。
本发明的抗肿瘤药物组合物可采用本领域常规的方法制成适于胃肠道给药或非胃肠道给药的制剂，优选将该药物组合物制成胃肠道给药的制剂，其制剂形式可以为常规片剂、胶囊、控释或缓释制剂。
本发明的有益效果为：本发明的药物组合物在治疗各种癌症，尤其是胃癌、乳腺癌、肝癌等中具有显著的协同效用，提高了药物的疗效，降低了用药剂量，减少了副作用的发生。
附图说明
图1是7-环己基甲基-5-(2’-硝基)苯基白杨素的质谱(a)和氢谱图(b)；
图2是7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素的质谱(a)和氢谱图(b)；
图3是展示7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素和10-羟基喜树碱单用时不同浓度对MCF7细胞增殖抑制与拟合方程的图；其中：A：7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素对MCF7细胞增殖抑制图；B：根据7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素的剂量与MCF7细胞存活率之间的关系进行拟合得到的直线图；C：10-羟基喜树碱对MCF7细胞增殖抑制图；D：根据10-羟基喜树碱的给药剂量与BGC823细胞存活率之间的关系进行拟合得到的直线图；
图4是展示7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素和10-羟基喜树碱合用时不同浓度对MCF7细胞增殖抑制的图；分别固定7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素的浓度为2.5μmoL/L(A)，10μmoL/L(B)和20μmoL/L(C)；显著性分析是以每组只加10-羟基喜树碱药药物为对照，若P<0.05，则为显著，表示为“*”；若P<0.01，则为极显著，表示为“**”；本发明所用“显著性分析”于软件SPSS 19.0中进行，利用软件SPSS 19.0的t检验进行分析，软件SPSS19.0可商业购得。
图5是展示7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素和10-羟基喜树碱单用时不同浓度对BGC823细胞增殖抑制与拟合方程的图；其中：A：7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素对BGC823细胞增殖抑制图；B：根据7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素的剂量与BGC823细胞存活率之间的关系进行拟合得到的直线图；C：10-羟基喜树碱对BGC823细胞增殖抑制图；D：根据10-羟基喜树碱(HCPT)的给药剂量与BGC823细胞存活率之间的关系进行拟合得到的直线图；
图6是展示7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素和10-羟基喜树碱合用时不同浓度对BGC823细胞增殖抑制的图；分别固定7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素的浓度为2.5μmoL/L(A)，30μmoL/L(B)；显著性分析是以每组只加10-羟基喜树碱药药物为对照，若P<0.05，则为显著，表示为“*”；若P<0.01，则为极显著，表示为“**”。
图7是展示7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素和10-羟基喜树碱单用时不同浓度对Hela细胞增殖抑制与拟合方程的图；其中：A：7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素对Hela细胞增殖抑制图；B：根据7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素的剂量与Hela细胞存活率之间的关系进行拟合得到的直线图；C：10-羟基喜树碱对Hela细胞增殖抑制图；D：根据10-羟基喜树碱的给药剂量与Hela细胞存活率之间的关系进行拟合得到的直线图；
图8是展示7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素和10-羟基喜树碱合用时不同浓度对Hela细胞增殖抑制的图；分别固定7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素的浓度为5μmoL/L(A)，10μmoL/L(B)和20μmoL/L(C)；显著性分析是以每组只加10-羟基喜树碱药物为对照，若P<0.05，则为显著，表示为“*”；若P<0.01，则为极显著，表示为“**”。
各图中，Ch_1表示7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素，HCPT表示10-羟基喜树碱。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下面结合实施例对本发明作进一步的阐述，但本发明并不受限于此，在不脱离本发明的思想和宗旨的情况下，对本发明的技术方案所做的任何变化都应落入本发明权利要求书所限定的范围内。
实施例1中所用的药品、合成路线和实验方法如下
药品：
白杨素，溴甲基环己烷，无水碳酸钾，1-氟-2-硝基苯，SnCl2.2H2O，冰乙酸，
N-甲基吡咯烷酮(N-methyl-2-pyrrolidone，NMP)均购于阿拉丁试剂有限公司；所述浓盐酸为市售浓度为37.5％的浓盐酸。
合成路线：
7-环己基甲基-5-(2’-硝基)苯基白杨素的制备方法：
(1)白杨素(508mg,2mmol)溶于NMP(25mL)，待其充分溶解后，相继加入溴甲基环己烷(440μL，3mmol)和无水碳酸钾(276mg,2mmol)，75℃下反应12h；TLC检测反应完全后，相继加入1-氟-2-硝基苯(440μL，4mmol)和无水碳酸钾(552mg,4mmol)，80℃反应3天；TLC检测反应完全后，倒入10倍体积的粗冰中，4℃沉淀12h，而后煮沸至澄清后趁热过滤，55℃烘干。
(2)将SnCl2.2H2O(980mg,4mmol)与7-环己基甲基-5-(2’-硝基)苯基白杨素(475mg,1mmol)相继加入冰乙酸(9mL)与浓盐酸(3mL)的混合液中，80℃下反应2h；TLC监测反应完全后，倒入5倍体积的粗冰中，待冰化后过滤，而后用稀盐酸(浓盐酸与水的体积比为1:20)洗3次，再用水洗至用NaOH调pH>7时滤液中不出现乳浊液，再用1g/L的NaOH溶液洗1次，55℃烘干。
实施例2中所用的生物材料、药品和实验方法如下：
细胞：MCF-7(人乳腺癌细胞株)、BGC823(人胃癌细胞株)，Hela(人子宫颈癌细胞株)可从商业途径中获得，例如中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
药品：准确称量白杨素以二甲基亚砜溶解，配成250mmol/L贮存液，在-20℃下保存；准确称量7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素以二甲基亚砜溶解，配成100mmol/L母液，该试剂必须现用现配；使用时用新鲜的培养基稀释到表1～3中所列举的合适的浓度，实施例1～3中使用的培养基为DMEM高糖培养基。
MTT检测细胞增殖：细胞于含10％胎牛血清、100kU/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM高糖培养基中，37℃、5％CO2的条件下培养。将细胞用胰酶消化后，用血细胞计数板进行计数。按每孔100μL体积接种于96孔细胞培养板(细胞接种量8000-10000个/孔，根据细胞大小和生长速度选择)，5％CO2、37℃培养箱中培养24h后加入不同浓度梯度的待测样品，5％CO2、37℃培养箱中孵育48小时。弃去培养基，用PBS洗一次，而后每孔加入含有0.5mg/mLMTT的无血清培养基100μL，5％CO2、37℃培养箱中孵育4h。将96孔板孔内的培养基吸去，然后每孔加入100μL二甲基亚砜。用酶标仪进行检测，检测波长为570nm，参考波长为630nm。
药物对细胞的抑制率采用IC50，GI50、TGI、LC50表示：
对使Ti≥Tz的浓度，生长抑制率(％)＝[(Ti-Tz)/(C-Tz)]×100％
对使Ti＜Tz的浓度，生长抑制率(％)＝[(Ti-Tz)/Tz]×100％
半数生长抑制浓度(GI50)：[(Ti-Tz)/(C-Tz)]×100％＝50％
半数抑制浓度(IC50)：[(C-Ti)/C]×100％＝50％
完全抑制浓度(TGI)：Ti＝Tz
半数致死浓度(LC50)：[(Ti-Tz)/Tz]×100％＝-50％
其中，Tz值：种板细胞培养24小时后测得的A值；C值：48小时后测得的正常对照组的A值；Ti值：48小时后加药组的A值
实施例3～5中所用的生物材料、药品和实验方法如下：
细胞：同实施例2
药品：准确称量10-羟基喜树碱(大连美仑生物技术有限公司)以二甲基亚砜或乙醇分别溶解，配成10-羟基喜树碱浓度为100mmol/L，在-20℃下保存；7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素的用法同实施例2；使用时用新鲜的培养基稀释到表4～13中所列举的合适的浓度，实施例4～12中使用的培养基为DMEM高糖培养基。
MTT检测细胞增殖：同实施例2。
合用指数(CI)的计算：
(1)确定给药剂量(D)与细胞存活率(fu)之间的关系式
存活率(fu)＝药物组OD值/对照组OD值
抑制率(fa)＝1-存活率(fu)
根据中效方程式：fa/fu＝(D/Dm)m，两边取对数，得
log(fa/fu)＝m logD-m log Dm，
设b＝m，a＝-m logDm，Y＝log(fa/fu)，X＝logD，
则给药剂量与细胞存活率关系式为Y＝bX+a(Dm为中效剂量)。
通过实验可以测得某种药物单独给药时不同给药剂量对应的细胞存活率。将给药剂量和细胞存活率数据代入上述方程计算出Y和X。对该组数据进行线性拟合，计算出对应的b值、a值，即得到对应于该药物的剂量与抑制率关系的方程Y＝bX+a。
(2)计算合用指数(CI)
由上述方程式中的a、b值求得中效剂量(Dm)及m值。
利用中效方程式D＝Dm(fa/fu)1/m，计算出达到两种药物合用的抑制效应时单独使用两种药物的理论给药剂量(D单1、D单2)。
由下列公式计算合用指数(CI)：CI＝D合1/D单1+D合2/D单2
(D合1和D合2为两药合用时每种药物在组合物中各自的剂量，为实施例实际使用的给药剂量。)
实施例1
(1)7-环己基甲基-5-(2’-硝基)苯基白杨素：最终得到米白色的固体粉末，产率为72％，MS(APCI positive)m/z:472.2[M+H]+(见图1a)；1H NMR(CDCl3,500MHz)δ:6.56-8.05(m,12H),3.85(d,2H,OCH2),1.05-1.87(m,11H,CH2,CH)(见图1b)。
(2)7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素：最终得到黄色的固体粉末，产率为97％,MS(ESI positive)m/z:442.08[M+H]+(见图2a)；1H NMR(DMSO-d6,500MHz)δ:6.41-8.13(m,12H),4.07(s,2H,NH2),3.90(d,2H,OCH2),1.05-1.87(m,11H,CH2,CH)(见图2b)。
实施例2
通过MTT法检测细胞增殖，白杨素与7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素(简称：Ch_1)在MCF7、BGC823、Hela细胞中的IC50，GI50、TGI、LC50的实验结果分别见表1、表2与表3。
表1白杨素与Ch_1对MCF7细胞的抑制作用
表2白杨素与Ch_1对BGC823细胞的抑制作用
表3白杨素与Ch_1对Hela细胞的抑制作用
由上表结果可知，本发明所得7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素(Ch_1)对肿瘤的抑制作用比白杨素强了10倍左右。
实施例3
(1)用含10％胎牛血清、100kU/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM高糖培养基培养基分别稀释7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素(Ch_1)与10-羟基喜树碱(HCPT)为表4～6的浓度，不同浓度的Ch_1与HCPT单用时对MCF7增殖抑制作用的实验结果见图3及表4与表5。
表4 Ch_1在不同给药剂量下的MCF7细胞存活关系参数计算
表5 HCPT在不同给药剂量下的MCF7细胞存活关系参数计算
以表4为例进行计算说明，先得出Ch_1作用于MCF7细胞的存活率，而后根据给药剂量与细胞存活率之间的关系进行拟合得到方程Y＝4.77X-8.40，则b＝4.77，a＝-8.40，m＝b＝4.77，Dm＝10(-a/m)＝57.68
由此推导出7-环己基甲基-5-(2’-氨基)的理论给药剂量与细胞存活率的关系式为：D单1＝Dm(fa/fu)1/m＝57.68[(1-fu)/fu)]1/4.77
同理可得10-羟基喜树碱的理论给药剂量与细胞存活率的关系式为：
D单2＝Dm(fa/fu)1/m＝4.44[(1-fu)/fu)]1/0.51
(2)7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素(Ch_1)与10-羟基喜树碱(HCPT)的组合协同增效促进MCF7细胞死亡的实验结果见表6及图4。
表6两种药物单用与联合用药时MCF7细胞存活率与CI值
一般情况下，联合用药会有3种结果：协同效应、拮抗效应和相加效应。一般采用合用指数CI来判断具体效果，CI值<1认为具有协同效应，CI值＝1认为具有相加效应，CI值>1认为具有拮抗效应，CI值<0.7认为具有显著的协同效应。从上述结果可以看出，7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素和10-羟基喜树碱同时给药时，CI值在一定剂量和配比下可以达到0.1-0.5之间，此时，二者合用对MCF7细胞的杀伤作用具有较好的协同作用。
以表6其中一组数据为例说明CI值的计算：
2.5μmol/L 7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素与1.56μmol/L 10-羟基喜树碱合用，同时加药时细胞存活率fu为40.62％±1.16％，则D合1＝2.5μM，D合2＝1.56μM。
将fu＝37.33分别代入7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素和10-羟基喜树碱的上述理论给药剂量与细胞存活率的关系式中，可得
D单1＝57.68[(1-fu)/fu)]1/4.77＝62.46μM
D单2＝4.44[(1-fu)/fu)]1/0.51＝9.35μM
代入合用指数(CI)的计算公式，可得
CI＝D合1/D单1+D合2/D单2＝2.5/62.46+1.56/9.35＝0.20
实施例4
(1)用含10％胎牛血清、100kU/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM高糖培养基培养基分别稀释7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素(Ch_1)与10-羟基喜树碱(HCPT)为表7～9的浓度，不同浓度的Ch_1与HCPT的单用时对BGC823增殖抑制作用的实验结果见图5及表7与表8。
表7 Ch_1在不同给药剂量下的BGC823细胞存活关系参数计算
表8 HCPT在不同给药剂量下的BGC823细胞存活关系参数计算
同理推导出7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素的理论给药剂量与细胞存活率的关系式为：
D单1＝Dm(fa/fu)1/m＝56.80[(1-fu)/fu)]1/2.26
10-羟基喜树碱的理论给药剂量与细胞存活率的关系式为：
D单2＝Dm(fa/fu)1/m＝8.61[(1-fu)/fu)]1/0.77
(2)7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素(Ch_1)与10-羟基喜树碱(HCPT)的组合协同增效促进BGC823细胞死亡的实验结果见表9及图6。
表9两种药物单用与联合用药时BGC823细胞存活率与CI值
一般情况下，联合用药会有3种结果：协同效应、拮抗效应和相加效应。一般采用合用指数CI来判断具体效果，CI值<1认为具有协同效应，CI值＝1认为具有相加效应，CI值>1认为具有拮抗效应，CI值<0.7认为具有显著的协同效应。从上述结果可以看出，7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素和10-羟基喜树碱同时给药时，CI值在一定剂量和配比下可以达到0.7以下，此时，二者合用对BGC823细胞的杀伤作用具有较好的协同作用。
实施例5
(1)用含10％胎牛血清、100kU/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM高糖培养基培养基分别稀释7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素(Ch_1)与10-羟基喜树碱(HCPT)为表10～12的浓度，不同浓度的Ch_1与HCPT的单用时对Hela增殖抑制作用的实验结果见图7及表10与表11。
表10 Ch_1在不同给药剂量下的Hela细胞存活关系参数计算
表11 HCPT在不同给药剂量下的Hela细胞存活关系参数计算
同理推导出7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素的理论给药剂量与细胞存活率的关系式为：
D单1＝Dm(fa/fu)1/m＝42.71[(1-fu)/fu)]1/3.41
10-羟基喜树碱的理论给药剂量与细胞存活率的关系式为：
D单2＝Dm(fa/fu)1/m＝75.37[(1-fu)/fu)]1/1.87
(2)7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素(Ch_1)与10-羟基喜树碱(HCPT)的组合协同增效促进Hela细胞死亡的实验结果见表12及图8。
表12两种药物单用与联合用药时Hela细胞存活率与CI值
一般情况下，联合用药会有3种结果：协同效应、拮抗效应和相加效应。一般采用合用指数CI来判断具体效果，CI值<1认为具有协同效应，CI值＝1认为具有相加效应，CI值>1认为具有拮抗效应，CI值<0.7认为具有显著的协同效应。从上述结果可以看出，7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素和10-羟基喜树碱同时给药时，CI值在一定剂量和配比下可以达到0.3-0.7之间，此时，二者合用对Hela细胞的杀伤作用具有较好的协同作用。
Claims (2)
1.7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素的制备方法，其特征在于：碱性条件下，使白杨素依次与溴甲基环己烷和1-氟-2-硝基苯反应，得7-环己基甲基-5-(2’-硝基)苯基白杨素；还原性条件下，使7-环己基甲基-5-(2’-硝基)苯基白杨素中硝基还原为氨基，得7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素，
所述7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素，具有式I所示的结构：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：包括下述步骤：
①将白杨素、溴甲基环己烷和无水碳酸钾按照摩尔比1:1.5:1溶于N-甲基吡咯烷酮中，75℃下反应完全；加入与白杨素摩尔比为1:2:2的1-氟-2-硝基苯和无水碳酸钾，80℃反应完全、沉淀、过滤、干燥，得到7-环己基甲基-5-(2’-硝基)苯基白杨素；
②将冰乙酸与浓盐酸以体积比3:1混匀后，按照摩尔比4:1加入SnCl2.2H2O和7-环己基甲基-5-(2’-硝基)苯基白杨素，80℃下反应完全，沉淀、过滤、洗涤、干燥，得到7-环己基甲基-5-(2’-氨基)苯基白杨素。
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