ES2574810T3 - Péptidos de unión a calcio - Google Patents
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Abstract
Una composición que comprende uno o más péptidos de unión a calcio, en donde dichos péptidos de unión a calcio comprenden cada uno la secuencia (X-Y-Z)n, en donde: X es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de ácido glutámico y ácido aspártico; Y y Z son aminoácidos seleccionados de alanina, serina, treonina, fosfoserina, y fosfotreonina, y Y y Z son lo mismo; n es un número de 3 a 15; dichos péptidos tienen una longitud de hasta 100 aminoácidos; y dichos péptidos se unen a una superficie que comprende fosfato de calcio.
Description
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superior) confirma la presencia de cristales, mientras que la imagen de fluorescencia de la misma región (parte inferior) confirma que el oxalato de calcio tiene fluorescencia no visible bajo estas condiciones. La parte derecha de la figura muestra cristales de oxalato de calcio teñidos con el péptido 8DSS marcado con 5(6)-carboxifluoresceína. La imagen de campo brillante (parte superior) confirma la presencia de cristales, y la imagen de fluorescencia de la misma región (parte inferior) muestra la tinción brillante de los cristales por el péptido marcado.
Descripción detallada
La siguiente descripción de la invención es meramente destinada a ilustrar la invención. Como tal, las modificaciones específicas discutidas no se deben interpretar como limitaciones en el alcance de la invención. Resultarán evidentes para aquel con experiencia en la técnica que diversos equivalentes, cambios y modificaciones pueden hacerse sin apartarse del alcance de la invención, y se entiende que tales realizaciones equivalentes son para ser incluidas en este documento.
Abreviaturas
Las siguientes abreviaturas se usan en la presente descripción: BE, esmalte basal; CE, esmalte cortical; CL, lesión de caries; CLSM, microscopía confocal láser de barrido; CPD, dentina circumpulpal; D, dentina; DEJ, unión dentinaesmalte; DPP, fosfoproteína de dentina; E, esmalte; DSPP, sialofosfosproteína de dentina; HA, hidroxiapatita; MD, dentina del manto; MIC concentración inhibitoria mínima; P, pared de la cavidad pulpar; PB, hueso periodontal; SEM, microscopía electrónica de barrido; RTD, dentina punta de la raíz; λ, longitud de onda de excitación.
Los aminoácidos se abrevian usando el sistema estándar que se expone más abajo.
- Aminoácido
- Abreviatura de una letra Abreviatura de tres letras
- Alanina
- A Ala
- Arginina
- R Arg
- Asparagina
- N Asn
- Ácido aspártico
- D Asp
- Cisteina
- C Cys
- Ácido glutámico E
- Glu
- Glutamina
- Q Gln
- Glicina
- G Gly
- Histidina
- H His
- Isoleucina
- I Ile
- Leucina
- L Leu
- Lisina
- K Lys
- Metionina
- M Met
- Fenilalanina
- F Phe
- Fosfoserina
- SP Sep
- Prolina
- P Pro
- Serina
- S Ser
- Treonina
- T Thr
- Triptófano
- W Trp
- Tirosina
- Y Tyr
- Valina
- V Val
A menos que se indique de cualquier otra forma por un prefijo "D", por ejemplo, D-Ala, la estereoquímica del carbono alfa de los aminoácidos y residuos aminoacilo en los péptidos descritos en la presente descripción es la configuración natural o "L".
Péptidos de unión a calcio
Los compuestos actualmente disponibles para la remineralización directa de tejidos descalcificados consisten principalmente de varias formulaciones de fosfato de calcio y/o fluoruro de sodio libre o unido a proteínas. La mejora de la calcificación en los tejidos biológicos generalmente se logra mediante la manipulación de la señalización celular en las células precursoras de los huesos y dientes, o mediante el aumento de la concentración total de calcio usando alimentos fortificados con calcio, suplementos dietéticos, u otros tratamientos ricos en calcio libre o unido a
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densidad. En estas aplicaciones, una composición que comprende uno o más péptidos de unión a calcio como se describió anteriormente se aplica en o cerca del sitio del hueso o huesos afectados. Las composiciones que comprenden los péptidos de unión a calcio divulgadas en la presente se pueden usar para tratar la calcificación, lesiones calcáreas, o defectos mineralizados en tejidos y órganos distintos del hueso, que incluye la placa arterial.
"Tratar" o "tratamiento" de una afección como se utiliza en la presente puede referirse a prevenir o reparar la afección, retrasar o demorar la aparición o la velocidad de desarrollo de la afección, reducir el riesgo de desarrollar la afección, prevenir o retrasar el desarrollo de los síntomas asociados con la afección, reducir o acabar con los síntomas asociados con la afección, generar una regresión completa o parcial de la afección, o alguna combinación de estos.
Las composiciones que comprenden los péptidos de unión a calcio descritas en la presente se pueden usar como un medio para la unión específica de unidades estructurales químicas o partículas deseables a las superficies calcificadas, tales como la de huesos y dientes. A diferencia de los enfoques actuales para la remineralización de las superficies de los dientes que dependen de las inundaciones de la cavidad oral con formulaciones de calcio libre o unido a proteínas, estos compuestos causan agregados de fosfato de calcio que específicamente se adhieren a la superficie del diente, aumentando así la concentración local de calcio y fosfato y aumentando la probabilidad de que este fosfato de calcio será incorporado en regiones desmineralizadas del diente. Las terapias farmacéuticas actuales para las lesiones o enfermedades de los tejidos calcificados dependen de que comprendan el área de la superficie deseada, ya sea directamente (en forma tópica) o por administración sistémica, con soluciones libres del compuesto terapéutico de interés con la esperanza de que alguna fracción interactuará con la superficie calcificada.
Las composiciones que comprenden los péptidos de unión a calcio divulgadas en la presente se pueden usar para ensayos in situ e in vivo para la calcificación inadecuada. Por ejemplo, estas composiciones se pueden usar para diagnosticar, identificar, localizar, o tratar la calcificación, lesiones calcáreas o defectos de mineralización de los tejidos y órganos que no sean huesos, que incluyen, por ejemplo placa arterial, cálculos renales, o sesamoideos. Los ensayos actualmente en uso para determinar la presencia de calcificación incluyen métodos de unión de colorante, incorporación de isótopos radiactivos, análisis de transmisión de rayos X, y análisis químico cuantitativo. Cada uno de estos métodos sufre de ciertas desventajas. En los métodos de unión de colorante, la muestra se expone a un colorante fluorescente quelante de calcio, tal como tetraciclina, calceína, o alizarina, y se visualiza la incorporación del colorante en el tejido de interés. Aunque los colorantes se pueden introducir in vivo, la visualización de la señal requiere la escisión del tejido de interés. El tratamiento de tejido fijado con iones de plata (tinción von Kossa) se puede usar además para identificar los sitios de calcificación, pero este método no se puede aplicar in vivo y está sujeto a importantes niveles de tinción de fondo. La incorporación de isótopos radiactivos tales como 45Ca proporciona información precisa y cuantitativa sobre la localización y la velocidad de calcificación in vivo, pero tiene el inconveniente de exponer a los sujetos experimentales a altos niveles de radiación ionizante. El análisis de transmisión de rayos X proporciona una alta resolución espacial y se puede lograr de animales vivos, pero no puede únicamente identificar depósitos de calcio entre las otras características visibles en una imagen de rayos X. El análisis químico cuantitativo in vitro de los depósitos de calcio proporciona determinaciones robustas del tipo y cantidad del mineral presente, pero estos métodos son de mucho trabajo y resultan en la pérdida de información acerca del lugar y la estructura del tejido involucrado.
Las composiciones que comprenden los péptidos de unión a calcio divulgadas en la presente se pueden marcar fluorescentemente de cualquier otra forma y utilizar como un medio mejorado de visualización de regiones calcificadas en un tejido de interés. Estos péptidos se pueden sintetizar fácilmente con altos rendimientos, y tienen seguridad mejorada, toxicidad, y facilidad de uso en comparación con los métodos disponibles en la actualidad. La secuencia o composición del péptido se puede alterar para cambiar la afinidad relativa del péptido de tejido específico o tipos de superficie. Esto permitirá al péptido discriminar entre la dentina, esmalte, hueso y otros tejidos o superficies calcificadas, y entre los tejidos sanos y enfermos. Esta propiedad permite a estos compuestos que se usen como sondas para lesiones o lesiones patológicas en el tejido calcificado. Los péptidos se pueden usar solos, o junto con otros métodos conocidos para la detección de calcificación. En contraste con los fluoróforos de unión a calcio actualmente disponibles, que se limitan a los que pueden quelar iones de calcio mientras que conservan su fluorescencia, los péptidos descritos en la presente pueden unirse a cualquier fluoróforo. Esto expande en gran medida la paleta de colores que se puede usar para marcar superficies calcificadas, y permite la adaptación precisa de longitudes de onda de emisión y tecnologías de detección para cada experimento individual. Conjugando estos péptidos con colorantes o indicadores fluorescentes, colorimétricos, radiactivos, NMR-activo, u otros y tratando las muestras biológicas con estos conjugados, se vuelve posible hacer observaciones cuantitativas de la extensión de la calcificación in situ e in vivo sin fijar o en gran medida perturbar la muestra. Debido a su alta especificidad y las velocidades de unión rápidas, tales conjugados pueden proporcionar tinción de fondo inferiores que los métodos de tinción de von Kossa/ión plata. La amplia variedad de etiquetas que se pueden conectar a estos péptidos de unión a calcio ofrece una enorme flexibilidad en cuanto a las condiciones de unión y los métodos de detección, lo que aumenta en gran medida la facilidad y la calidad con la que se pueden conducir la investigación biológica, biomédica, biotecnológica, medioambiental, y otras.
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intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intrapulmonar, intraespinal, intraesternal, intratecal, intrauterina, intravenosa, subaracnoidea, subcapsular, subcutánea, transmucosal, o transtraqueal. La administración "transdérmica" puede realizarse usando una crema tópica, ungüento, o pomada, o por medio de un parche transdérmico. En aplicaciones en donde las composiciones se usan para tratar una afección dental o alterar las características dentales tales como la densidad mineral, se puede administrar en o cerca del sitio del diente afectado u objetivo. Del mismo modo, cuando la composición se usa para tratar una afección ósea o alterar las características óseas, se puede administrar en o cerca del sitio del hueso afectado u objetivo.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar mejor la invención reivindicada y no se deben interpretar como limitante del alcance de la invención. Hasta el punto que se mencionan los materiales específicos, es sólo para fines de ilustración y no se pretende limitar la invención. Una persona con experiencia en la técnica puede desarrollar medios o reactivos equivalentes sin el ejercicio de la capacidad inventiva y sin apartarse del alcance de la invención. Se entenderá que muchas variaciones se pueden hacer en los procedimientos descritos en la presente mientras que permanezcan aun dentro de los límites de la presente invención. Es intención de los inventores que tales variaciones se incluyan dentro del alcance de la invención.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Unión de péptidos DSS a hidroxiapatita de calcio:
Se generaron cuatro péptidos DSS que contienen dos (2DSS, sec. con núm. de ident.: 12), cuatro (4DSS, sec. con núm. de ident.: 13), seis (6DSS, sec. con núm. de ident.: 14), u ocho (8DSS, sec. con núm. de ident.: 15) repeticiones (DSS) Asp-Ser-Ser. Los péptidos se marcaron con fluoresceína, y diversas concentraciones de los péptidos marcados (0-100 µM) se mezclaron con una cantidad fija (0.3 mg) de nanocristales de hidroxiapatita con un área de superficie específica de100 m2/g (Berkeley Advanced Biomaterials, Inc.). Las muestras se incubaron durante diez minutos, seguido de la eliminación de la hidroxiapatita por centrifugación. La cantidad de péptido en la mezcla se midió tanto antes como después de la eliminación de la hidroxiapatita por absorbancia espectroscópica a 480 nm (la absorbancia máxima del marcador de fluoresceína). La cantidad de péptido unido se calculó comparando la relación de las absorbancias final (Af) e inicial (Ai) con la concentración inicial (P0) [Punido = (Af /Ai) P0]. Los gráficos se generaron ilustrando la cantidad de péptido unido por m2 del área de superficie de hidroxiapatita en función de la concentración de péptido no unido en el equilibrio. Las isotermas resultantes se ajustaron a la isoterma de Langmuir (x/m=(KANMaxCeq)/(1+KACeq)) (Calis 1995), que describe la actividad de unión de una molécula en términos de una combinación de la afinidad de unión (KA) y la avidez (NMax)-KA representa la constante de afinidad del péptido para la superficie de hidroxiapatita. En esta ecuación, x/m representa la cantidad molar de péptido unido por unidad de área de superficie de hidroxiapatita, NMax representa la concentración superficial máxima (mol/m2), y Ceq representa la concentración molar de péptido no unido en el equilibrio. La isoterma de Langmuir describe la unión de moléculas a las superficies con las condiciones que 1) todos los sitios de unión tienen la misma afinidad por el péptido, y 2) el péptido formará una monocapa en la superficie pero no podrá acumularse a niveles más altos. El ajuste excelente de la isoterma de Langmuir a los datos experimentales valida estas condiciones, y las constantes de afinidad se usaron para las comparaciones entre los péptidos. Como se muestra en la Figura 1A, la afinidad de unión de los diversos péptidos para la hidroxiapatita aumentó con un aumento en el número de repeticiones DSS (2DSS, KA=57,000 M-1; 4DSS, KA=94,000 M-1; 8DSS KA=300,000 M-1).
Varias variantes de péptidos DSS se ensayaron para determinar el efecto de varias alteraciones de aminoácidos en la afinidad de unión. Estas variantes de péptidos incluyen un péptido de cuatro repeticiones que contiene la cadena lateral más larga en la primera posición (4ESS, sec. con núm. de ident.: 16), tres péptidos de cuatro repeticiones que contienen grupos hidroxilo estéricamente más impedidas en las posiciones segunda y tercera (4DTT, sec. con núm. de ident.: 17; 4NTT, sec. con núm. de ident.: 18; y 4ETT, sec. con núm. de ident.: 19), un péptido de cuatro repeticiones que carece de un grupo con carga en la primera posición (4NSS, sec. con núm. de ident.: 20), un péptido de ocho repeticiones que carece de un grupo con carga en la primera posición (8ASS, sec. con núm. de ident.: 21 ), y dos péptidos de ocho repeticiones que carecen de grupos hidroxilo en las posiciones segunda y tercera (8DAA, sec. con núm. de ident.: 22; 8NAA, sec. con núm. de ident.: 23). Mediante la comparación de isotermas de unión de cada una de las variantes de péptidos que contienen DSS del mismo tamaño, se determinó que la eliminación del residuo negativamente cargado (4NSS, KA=41 ,000 M-1 ; 4NTT, KA=18,000 M-1 ; 8ASS, KA=170,000 M-1) (Figura 1B, 1C) o la sustitución de los residuos de serina con treonina o alanina (4DTT, KA=161 ,000 M-1; 4ETT, KA=61 ,000 M-1; 8DAA, KA=300,000 M-1) (Figura 1B, 1C) disminuye significativamente la actividad de unión. La sustitución tanto del residuo ácido en la primera posición como las serinas condujo a una pérdida casi total de la afinidad de unión (4NTT; 8NAA, KA=20,000 M-1) (Figura 1B, 1C). La sustitución del residuo de ácido aspártico con un residuo de ácido glutámico causó sólo una ligera disminución de la afinidad de unión (4ESS, KA=81 ,000 M-1) (Figura 1 B). Estos datos sugieren que tanto el residuo ácido como las repeticiones de serina son cruciales para la avidez de estos péptidos en las superficies de hidroxiapatita. Se encontró que el DSS era la secuencia de repetición óptima para la generación de la actividad de unión a hidroxiapatita, no obstante, los péptidos variantes mostraron unión marcadamente reducida a hidroxiapatita in vitro.
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sumergieron después en un fluido corporal simulado (SBFn), destinado a acelerar la nucleación de los cristales de hidroxiapatita (HA), durante 4 horas. Después de la etapa de nucleación, las muestras se sumergieron en una solución libre de magnesio y bicarbonato (SBFg) para dejar crecer los cristales de HA nucleados. La Tabla 1 muestra la composición de las soluciones SBFn y SBFg en comparación con el plasma sanguíneo. Ambas soluciones se ajustaron a pH 6.8. Los cristales se cultivaron para amplificar los cristales nucleados para una fácil visualización por SEM.
Tabla 1: Composición de solución SBFn y SBFg:
La superficie del esmalte no desmineralizada, tratada, y no tratada con tampón permaneció en gran parte amorfo, lo que indica poco o ningún crecimiento de cristales (y por lo tanto poca o ninguna nucleación) (Figura 5, dos filas superiores). Sin embargo, el crecimiento significativo de cristal (indicando nucleación temprana y robusta) se observó en el esmalte desmineralizado expuesto al péptido 8DSS (Figura 5, dos filas superiores). Esto indica que los péptidos DSS puede reconocer específicamente el esmalte desmineralizado y el crecimiento de hidroxiapatita nucleado en la superficie del esmalte desmineralizado.
La superficie de la dentina no desmineralizada presentó cierto grado de crecimiento del cristal en las muestras tratadas y sin tratar con tampón. Sin embargo, el crecimiento más significativo, y por lo tanto la nucleación más temprana y más robusta, se produjo en la muestra tratada con el péptido 8DSS (sec. con núm. de ident.: 15) (Figura 5, dos filas inferiores). Mientras que el Ejemplo 5 demostró la capacidad de los péptidos DSS, en conjunto con los regímenes de remineralización existentes, para provocar la deposición de capas gruesas de fosfato de calcio suficientes para ocluir los túbulos dentarios en la dentina desmineralizada, estos resultados indican que con un tratamiento ligeramente diferente se produce la nucleación del cristal principalmente sobre la dentina no desmineralizada. Así, dependiendo del régimen de tratamiento específico empleado, los péptidos DSS se pueden usar para depositar capas de fosfato de calcio sobre la dentina desmineralizada o provocar nucleación robusta del crecimiento del cristal de hidroxiapatita en las superficies totalmente mineralizadas. Esto significa que los péptidos DSS se pueden usar, por ejemplo, para tratar la sensibilidad del diente debido a la exposición de los túbulos dentinarios, para remineralizar caries de implicadas en la dentina mecánicamente desbridadas, o para reparar superficies dentarias fracturadas.
Ejemplo 7: Especificación del tejido en la unión del péptido DSS
Dientes humanos sagitalmente seccionados fueron ya sea desmineralizados mediante la incubación con 0.5 M de EDTA durante 15 minutos o se dejaron sin desmineralizar. Las muestras se incubaron después durante diez minutos en una solución de 12,5 µM de 8DSS marcado con 5(6)-carboxifluoresceína, 10 mM de NaCl, y 50 mM de HEPES, pH 7.0. Las muestras control se incubaron sin péptido. Las secciones se enjuagaron y fotografiaron por CLSM usando parámetros idénticos de láser y cámara.
En las muestras desmineralizadas, la unión del péptido DSS se observó principalmente en el esmalte (Figura 6, panel izquierdo, E), con poca o ninguna unión en la dentina (Figura 6, panel izquierdo, D). De acuerdo con los resultados discutidos en el Ejemplo 1, el patrón opuesto se observó en la muestra no desmineralizada, donde el péptido se unió principalmente con la dentina y presentó poca o ninguna unión con el esmalte (figura 6, panel derecho, comparar D y E). La unión esmalte-dentina fue claramente delimitada tanto en las muestras desmineralizadas como no desmineralizadas (Figura 6, DEJ). La capacidad del péptido DSS para unirse específicamente a la porción de esmalte de las secciones de diente desmineralizado, mientras que no muestra unión significativa al esmalte no desmineralizado es consistente con el hallazgo del Ejemplo 6 donde péptidos DSS pueden reconocer específicamente esmalte desmineralizado y el crecimiento de la hidroxiapatita nucleada en la superficie del esmalte desmineralizado.
Ejemplo 8: Remineralización del hueso:
Para determinar si los resultados de la remineralización observados en los tejidos de los dientes pueden extenderse al hueso, se obtuvieron fémures de rata de animales sacrificados en virtud de un protocolo de tejido compartido. Las muestras de ensayo se desmineralizaron con gel de EDTA al 19% durante una hora, seguido por inmersión en agua desionizada y ultrasonicación para eliminar el exceso de detritos. Las muestras de ensayo se trataron después con el péptido 8DSS durante una hora, enjuagaron, y la mitad de las muestras se remineralizaron usando el Desensibilizador QueII (Pentron Clinical Technologies, LLC ) como se describió en el Ejemplo 5. Todas las muestras
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de NaCl, se resuspendió en el mismo tampón, y fotografió por microscopía de fluorescencia. Parámetros idénticos del microscopio y la cámara se usaron para cada muestra, permitiendo comparaciones cuantitativas entre las muestras. Para cada muestra, se recogieron imágenes de campo claro y fluorescencia de un solo campo. La intensidad de tinción fluorescente de las partículas de fosfato inorgánico en cada muestra se evaluó mediante la medición de la intensidad de píxel usando el GIMP (http://www.gimp.org) como sigue. Usando la imagen de campo claro como una guía, se seleccionaron áreas de la imagen de fluorescencia correspondientes a agregados de la sal fosfato y registraron las intensidades de los píxeles de estas regiones. Estos se compararon con las intensidades registradas en las regiones de fondo (regiones conocidas que no contienen agregados). Estos datos se expresaron después como la relación de la intensidad de la tinción (ITinción) entre la intensidad de fondo (IFondo), multiplicado por el valor absoluto de la diferencia entre la intensidad de la tinción y la intensidad de fondo (para corregir los altos niveles de ruido presentes en las muestras con niveles muy bajos de tinción) usando la ecuación: Fluorescencia Relativa=(ITinción/IFondo) *(ITinción/IFondo). Aunque un pequeño nivel de tinción se observó en agregados de NiHPO4, los mayores niveles de tinción se observaron en agregados de CaHPO4 y el químicamente similar SrHPO4 (Figura 10). Esto demuestra que la unión de los péptidos DSS no es un fenómeno adhesión superficial no-específica con precipitados inorgánicos, sino más bien implica una interacción muy selectiva con los fosfatos de calcio, incluso hasta el punto que pueden distinguir entre los precipitados de calcio y fosfato de estroncio.
Ejemplo 12: Unión de péptidos DSS a oxalato de calcio:
Oxalato de calcio se preparó usando el método descrito previamente (Wang 2006). Los cristales de oxalato de calcio se lavaron con agua desionizada, se resuspendieron después en una solución que contiene 50 mM de HEPES pH 7.0, 10 mM de NaCl, y 12,5 µM del péptido 8DSS marcado con 5(6)-carboxifluoresceína. La suspensión de cristal se incubó a temperatura ambiente durante diez minutos. Los cristales se recogieron después por centrifugación, lavaron dos veces con una solución de 50 mM de HEPES pH 7,0 y 10 mM de NaCl, y se visualizaron por microscopía de fluorescencia como se describió en el Ejemplo 11. La presencia del péptido marcado condujo a tinción significativa de los agregados de oxalato de calcio (Figura 11). Debido a que el oxalato de calcio es el compuesto más común presente en los cálculos renales (nefrolitiasis) (Coe 2005), estos resultados sugieren que los péptidos DSS se pueden usar para focalizar cálculos renales en aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas, y que pueden ser capaces de modular el crecimiento de cálculos renales.
Ejemplo 13: Actividades antimicrobianas de fusiones del compuesto antimicrobiano-péptido DSS:
Para determinar la idoneidad de los péptidos DSS para servir como unidades estructurales dirigidas para suministrar compuestos terapéuticos a superficies mineralizadas, se sintetizaron péptidos que contienen un péptido N-terminal (DSS)4, (DSS)5, o (DSS)β, un enlazador de triglicina (GGG), y un péptido antimicrobiano 2c-4 (sec. con núm. de ident.: 26) (J. He, sin publicar). Las secuencias de las proteínas de fusión se muestran en sec. con núms. de ident.: 27-29, respectivamente. La actividad antimicrobiana de estos péptidos contra bacterias anaerobias planctónica se determinó mediante una modificación de un ensayo descrito anteriormente (Qi 2005). En resumen, las células de Streptococcus mutans cepa UA159 se diluyeron a ~1 x105 ufc/mL en medio de caldo Todd-Hewitt (TH) y mezclaron ya sea con nanocristales de hidroxiapatita en suspensión (Berkeley Advanced Biomaterials, Inc., 0,03% p/v) o, para las muestras control, con un volumen equivalente de agua desionizada. Alícuotas se transfirieron en placas de 96 pocillos (Fisher). Diluciones seriadas de los péptidos se fabricaron después y se añadieron a la bacteria. La concentración inhibitoria mínima (CIM) de cada péptido se determinó mediante la identificación de la concentración del péptido que inhibió completamente el crecimiento bacteriano después de una incubación de aproximadamente 24 horas, según medido por la absorbancia de las suspensiones celulares a una longitud de onda de 600 nm. El péptido 2c-4 muestra una MIC de 2 µM contra S. mutans planctónica en sí. Cuando se conjuga con una unidad estructural (DSS)4 para generar el péptido 4DSS-2c4, su MIC se eleva a 52,5 µM, una pérdida significativa de eficacia que no se afecta por la adición de 0,03% (p/v) de hidroxiapatita. Sin embargo, como se mostró en el Ejemplo 1, la unidad estructural (DSS)4 muestra menor afinidad por la hidroxiapatita que los péptidos con más repeticiones DSS, y la alta carga positiva del péptido 2c-4 puede interactuar con la alta carga negativa de la unidad estructural (DSS)4 para inhibir de cierta forma la actividad. No obstante, alguna actividad antimicrobiana se retiene mediante este péptido.
Alternativamente, la conjugación de una unidad estructural (DSS)6 con el péptido antimicrobiano b-34 (sec. con núm. de ident.: 30) (J. He, sin publicar) para generar el péptido 6DSS-b-34 (sec. con núm. de ident.: 31) conduce a una mejoría en la actividad antimicrobiana por encima del péptido parental (MIC= 3.1 µM para 6DSS-b-34 en función de 5,6 µM para b-34). Aunque la adición de 0,03% de HA reduce de cierta forma la actividad antimicrobiana de 6DSS-b34, la MIC resultante de 12,5 µM representa todavía una actividad considerable contraStreptococcus mutans. Aun en otra alternativa, el péptido PL-135 (sec. con núm. de ident.: 32) (R. Lehrer, sin publicar) muestra una MIC de 21 µM contra S. mutans planctónica, en el medio solo. La conjugación de este péptido con una unidad estructural (DSS)5 para generar el péptido 5DSS-PL135 (sec. con núm. de ident.:33) reduce su actividad antimicrobiana contra S. mutans a >170 µM en medio solo. La adición de 0,03% de suspensión de hidroxiapatita al medio conduce a la recuperación de la mayor parte de esta actividad, reduciendo la MIC a 42.5 µM.
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Esto demuestra que otros compuestos pueden mantener su actividad cuando se conjuga con los péptidos DSS. Además, esto demuestra compuestos que se pueden fácilmente generar sólo tienen una actividad significativa en la presencia de un péptido DSS objetivo, lo que sugiere un medio fácil de desarrollar compuestos que sean sólo activos en superficies calcificadas (hueso, diente, etc.) y sean inertes en otros entornos. Tales compuestos representan un gran paso de avance en la mejoría de la seguridad y eficacia de los enfoques terapéuticos para los trastornos del tejido mineralizado.
Como se indicó anteriormente, lo anterior sólo pretende ilustrar diversas realizaciones de la presente invención. Las modificaciones específicas discutidas anteriormente no se deben interpretar como limitaciones en el alcance de la invención. Será evidente para un experto en la técnica diversos equivalentes, cambios y modificaciones pueden realizarse sin apartarse del alcance de la invención, y se entiende que tales realizaciones equivalentes deben incluirse en la presente. Todas las referencias citadas en la presente se incorporan por referencia como si se expusieran en la presente.
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La invención se resume como sigue:
Ítem 1 se relaciona con una composición que comprende uno o más péptidos de unión a calcio, en donde dichos péptidos de unión a calcio comprenden cada uno la secuencia (XYZ)n, en donde X es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, alanina y glutamina, Y y Z son aminoácidos seleccionados de entre alanina, serina, treonina, fosfoserina y fosfotreonina y n es un número de 1 a 40, y en donde dichos péptidos de unión a calcio unen fosfato de calcio.
Ítem 2 se relaciona con la composición del ítem 1, en donde dichos uno o más péptidos de unión a calcio tienen una longitud de aproximadamente 3 a aproximadamente 100 aminoácidos.
Ítem 3 se relaciona con la composición del ítem 1, en donde n es un número de 2 a 8.
Ítem 4 se relaciona con la composición del ítem 1, en donde X es ácido aspártico.
Ítem 5 se relaciona con la composición del ítem 4, en donde Y y Z son serina.
Ítem 6 se relaciona con la composición del ítem 5, en donde dichos péptidos de unión a calcio tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 12.
Ítem 7 se relaciona con la composición del ítem 5, en donde dichos péptidos de unión a calcio tienen la secuencia de amnioácidos espuesta en la SEQ ID N0:13.
Ítem 8 se relaciona con la composición del ítem 5, en donde dichos péptidos de unión a calcio tienen la secuencia de amnioácidos espuesta en la SEQ ID N0:14.
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