CN103096866B - 多孔牙齿羟基磷灰石的检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测多孔牙齿羟基磷灰石的试剂盒和探针,包括可以与多孔牙齿羟基磷灰石结合的蛋白质或其检测物。本发明还涉及一种用于检测涉及多孔牙齿羟基磷灰石的状况的方法,包括在受体的牙齿或牙齿试样的内部或表面,检测与多孔牙齿羟基磷灰石结合的蛋白质。本发明还涉及一种检测低矿化发育性牙齿缺陷(DDD)或检测完整的和/或受损MIH牙釉质的方法,并且涉及一种去除与多孔牙齿羟基磷灰石结合的蛋白质的试剂盒和方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测牙齿多孔羟基磷灰石的试剂盒及探针,以及一种用于检测涉及牙齿多孔羟基磷灰石的状况的方法。
背景技术
牙齿的弹性取决于矿物质(称为羟基磷灰石)与有机成分(蛋白质、细胞和组织)之间的复杂的相互作用。在正常情况下,牙釉质和牙本质中的羟基磷灰石构成极其致密的结构,这种结构提供了维持牙齿完整性所需的硬度和韧性。牙釉质和牙本质中矿物质密度的流失导致异常的多孔羟基磷灰石,进而导致牙齿物理弹性的下降及结构破损。多孔羟基磷灰石是由几种普遍的情况所引起的,包括龋齿和发育性牙齿缺陷(DDD)。
龋齿(蛀牙)是一种由分泌酸的细菌引起的疾病。由致龋细菌产生的酸能在一种称为脱矿化作用的过程中溶解羟基磷灰石。脱矿化作用的初始过程(称为初期龋病)会导致羟基磷灰石的不连续区域,称为白斑病变。随着时间的流逝,白斑病变会发展成为洞(即牙齿材料的流失),或者其有可能停止发展(称为不活跃龋病)并在一种称为重矿化作用的过程中重新形成致密的羟基磷灰石壳。在洞的形式之前,该过程是可逆的(即,重矿化作用),但是一旦牙釉质流失,其将不会再生。
龋病通过外观检查,物理检查(即使用牙用探针划痕)和X射线照相(用以检测牙齿之间或牙龈线以下的龋齿)的结合来诊断。令人担忧的是,这些诊断途径会错失大约一半的早期龋病,而使用这些方法诊断为龋病的牙齿诊断中高达13%事实上并不是龋病。改善诊断的最新尝试包括使用测量电阻的设备、定量光导荧光技术(QLF)和红外激光荧光技术(),但是由于装置的成本和尺寸以及个体之间的差异,没有一个能获得广泛的应用。另一种途径是使用了染料来检测牙本质中的龋病。然而,这些染料对多孔羟基磷灰石是非选择性的:它们与蛋白质结合(推测为与牙本质中感染细菌有关的蛋白质),或者它们占据胞间隙,这降低了特异性与敏感性。此外,这些染料会引起口腔变色、附着于健康的牙齿或需要辐照器才能被观测到。
龋病有两种主要的治疗方法,它们的选择是以疾病的程度来决定的。白斑病变可以通过重矿化的途径治疗(如,氟化物疗法或对生物活性分子稳定的无定形磷酸钙)。牙洞需要常规的修复牙医学手段治疗(即,填充)。
DDD是另一种引起多孔羟基磷灰石的普遍原因。它们令人不安的流行并潜在影响超过50%的具有包括牙痛,外形损伤和增加的龋病风险多重负担的人群。两种最普遍的DDD是牙齿氟中毒(以扩散的浊斑为特征)和臼齿/门齿的低矿化(Hypomineralisation)(MIH,以界限清楚的浊斑为特征);它们都是由环境因素引起的(即后天缺陷)。另一种严重但是不常见的可以导致多孔羟基磷灰石的DDD是遗传性的牙釉质发生不全疾病。
MIH典型地影响10-20%的儿童并且是龋齿的一个主要风险因素,畸齿矫正的一个风险因素,对社会来讲代价昂贵。MIH被认为是起因于牙釉质形成细胞的多因子系统性紊乱。然而,MIH的起因除了与排除氟化物和与幼年时期的疾病相关之外,仍然是个迷。
目前没有可用的用于诊断和修复MIH或其他DDD的产品,龋齿和不同类型的DDD的鉴别诊断是困难的,并且在很大程度上依赖于每个牙科专业人士的经验和技能。目前为龋齿重矿化而开发的程序和/或产品对MIH效果不好。恢复性治疗经常受阻,这是因为MIH的釉质是软的,多孔的并且与正常的牙组织分界不清。
因此,需要一种用于诊断、划界和修复由龋齿和DDD引起的多孔性性牙齿羟基磷灰石的新工具。这里我们通过对新技术的详述来对这种需求进行说明,这种新技术是基于我们在涉及多孔羟基磷灰石的状况的致病机理的最新发现。
发明内容
本发明的第一方面是提供一种试剂盒,当用于检测多孔牙齿羟基磷灰石时,包括:能与多孔牙齿羟基磷灰石结合的蛋白质;或者能检测结合到所述多孔牙齿羟基磷灰石的所述蛋白质的检测物(detector)。
本发明的第二方面提供一种探针,当用于检测多孔牙齿羟基磷灰石时,包括:能与多孔牙齿羟基磷灰石结合的蛋白质;和报告物(reporter)。
本发明的第三方面提供一种制备第二方面中的探针的方法,包括连接(i)能与多孔牙齿羟基磷灰石结合的蛋白质和(ii)报告物。
本发明的第四方面提供一种用于检测涉及多孔牙齿羟基磷灰石的状况的方法,包括在受体的牙齿或该牙齿试样的内部或表面,检测与多孔牙齿羟基磷灰石结合的蛋白质。
本发明的第五方面提供一种用于检测低矿化DDD的方法,包括检测蛋白质,其与牙齿或该牙齿试样的测试羟基磷灰石结合的浓度相比于其与对照牙齿样本或对照牙齿的对照羟基磷灰石结合的浓度提高了,并且检测牙釉蛋白,其与所述测试羟基磷灰石结合的浓度接近于其与对照羟基磷灰石结合的浓度。
本发明的第六方面提供一种用于检测完整的和/或受损MIH釉质的方法,包括检测与MIH羟基磷灰石结合的白蛋白和血红蛋白,其中只检测到白蛋白而未检测到血红蛋白表示完整的MIH釉质,而检测到血红蛋白表示受损的MIH釉质。
本发明的第七方面提供一种用于去除与多孔牙齿羟基磷灰石结合的蛋白质的试剂盒,包括:(a)(i)一种或多种冲洗液或(ii)干组分,用于与水混合以制备一种或多种冲洗液,其中所述一种或多种冲洗液适用于去除与多孔牙齿羟基磷灰石结合的蛋白质;和(b)一种重矿化剂或矫正矿化剂。
本发明的第八方面提供一种用于去除与多孔牙齿羟基磷灰石结合的蛋白质的方法,包括使用一种或多种冲洗液清洗牙齿或该牙齿试样。
本发明的第九方面提供一种用于去除与多孔牙齿羟基磷灰石结合的蛋白质的试剂盒,包括:一种或多种冲洗液;一种或多种干组分,用于与水混合制备一种或多种冲洗液,其中所述一种或多种冲洗液适用于去除牙齿或该牙齿试样的内部或表面的蛋白质,所述牙齿或牙齿试样通过第四方面中的方法检测为具有多孔羟基磷灰石的牙齿或牙齿试样。
第一至第六方面中的试剂盒、探针或方法允许原位检测或非原位诊断。
第一至第六方面中的试剂盒、探针或方法,其可用于检测龋的和/或MIH/DDD以及划分龋的和/或MIH/DDD的边界,以为牙齿的恢复做准备。而后临床医生可以明确地去除由此而显示的龋的或MIH组织,确保了清晰边界的制备并且提高了恢复成功的可能性。
第一方面中的试剂盒或第二方面中的探针提供了关键的工具,第四方面中的方法可用于多孔牙齿羟基磷灰石的例行筛查。此外,第一至第六方面中的试剂盒、探针或方法可以用于暴露的牙齿羟基磷灰石的早期检测。以这样的方式,第一至第六方面中的试剂盒、探针或方法可以用于牙齿变化的例行筛查,这种牙齿变化若未检测到,可能最终导至龋齿(龋病的前兆)。因此,可以精确并及时地确定目标进行恢复和/或重矿化,以阻止龋病的发展和/或促进重矿化。在一些实施例中,第一至第六方面中的试剂盒、探针或方法尤其适用于儿童第一永久大臼齿长出之后的例行筛查。由此,第一至第六方面中的试剂盒、探针或方法也适用于早期检测多孔羟基磷灰石的牙齿例行筛查。定期的例行筛查提供了在可行的最早时间检测到可能导致龋齿的牙齿变化的极好机会。
而且,第一至第六方面中的试剂盒、探针和方法可对任何治疗进行监控,例如已知的重矿化治疗法,其包括被生物活性分子稳定的氟化物或磷酸钙。
第八方面中的方法以及第七和第九方面中的试剂盒能够温和地和/或特异性地去除过量的强力留存在多孔羟基磷灰石上的蛋白质,例如在MIH病变中,在重矿化治疗之前或期间使用。
第一至第五或第七至第九方面中的蛋白质可以选自于以下群组:血清白蛋白,补体C3β链(ComplementC3betachain)、α-1-抗胰蛋白酶、蛋白S100-A9、乳运铁蛋白、白细胞弹性蛋白酶抑制剂、抗凝血酶-III、血红蛋白α亚基(Hemoglobinsubunitalpha)、血红蛋白β亚基(Hemoglobinsubunitbeta)、血红蛋白δ亚基(Hemoglobinsubunitdelta)、催乳素诱导蛋白、α-淀粉酶1、Igκ链V-III区SIE;Igα-2链C区;非典型蛋白c6或f58和丝氨酸蛋白酶抑制剂B3。此外,第一至第四或第七至第九方面任一项中的蛋白质可以为牙釉蛋白。
第一、第七和第九方面中的试剂盒,或第二方面中的探针可以为替代的形式。一种形式限定为适合于或限于一种特定用途并以词语“用于”来表明。另一种形式为只限于一种特定用途并以短语“当用于”来表明。
第三至第六或第八方面可以以替代的形式来体现,例如在欧洲形式(供使用的试剂)或第二医学用途(Swiss)形式(“一种试剂在药物生产中的用途”)。
附图说明
图1描绘了MIH牙釉质的蛋白质含量,其含量相对于正常牙釉质异常高。从正常牙釉质(正常)和表现为长牙后分解的严重病变组(试样7-11)中提取不能溶于酸的蛋白质,然后用密度斑点印记分析定量。显示了重复实验平均值(±SD),每一实验在不同的载荷下进行以确保定量的线性度(r2>0.95)。如图所示,当使用StudentT检验(Student'st-test,同方差的,双侧检验)成对的比较时,所有的MIH试样与正常样品显著不同。使用白蛋白标准从这些数据中得出绝对蛋白水平。
图2说明了完整的和受损的MIH病变具有区别的蛋白质谱(proteinprofiles)。如图所示,来自MIH病变和正常釉质(正常)中的不能溶于酸的蛋白质经过了十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯亮蓝染色或与牙釉蛋白抗体(抗-AMG)免疫印迹。(A)为完整表面和破损表面病变(分别为试样1-6和7-11)的对比,显示了不同形式的主要蛋白质条带。并且显示了白蛋白和血红蛋白的位置(Alb,Hb)。(B)为来自于大鼠的分泌阶段的牙釉质基质与MIH试样的对比,其中来自于大鼠的分泌阶段的牙釉质基质用作大部分完整的牙釉蛋白(AMG)的对照。试样7和11分别代表带有低的或相当大量的牙釉蛋白片段的病变。为了定量,大鼠和人类牙釉蛋白的交叉免疫反应性使用人类的牙釉蛋白进行标准化(来自于Abnova,台北市,台湾)。(C)为两个完全病变的蛋白质谱,对比使用新鲜的提取物的第一轮跑胶与使用在-20℃下保存16周后的SDS-提取物的第二轮跑胶,注意到主要条带在66kDa处(白蛋白)消失。
图3列出了完整和受损MIH病变的蛋白质组学分析的结果,显示了在MIH釉质中多种体液蛋白。所显示的来自于完整和受损病变的主要凝胶带(图2A,试样1–11)经过了蛋白质组学鉴定,详见表1。图3描述了每一条带中经鉴定的蛋白质,以及在其中进行鉴定的试样(括号中的试样序号)。试样6和7的凝胶带由图2A重现以分别说明完整的和受损的病变的凝胶带。
图4描述了矿化试验,其揭示了表面完整性调节MIH牙釉质蛋白质的组成。(A)为MIH牙釉质和体液的对比谱图,显示了相对于血清的完全病变和相对于唾液和红细胞的破损病变的相似性。(B)为羟基磷灰石结合(HAp-亲和性)试验,显示来自模拟口腔液体(O-液体)的蛋白质亚基优先保留下来(参见载荷,结合和未结合分数的不同)。注意到标记结合谱和受损病变在板A(试样7)非常相似。(C)为B的等价矿物质结合试验,但是以粉末化的MIH牙釉质代替羟基磷灰石。谱图显示了来自于完全病变的釉质,其为在暴露于模拟口腔液体之前或之后(+/-O-液体)。注意到在板A和板B标记那些受损病变和羟基磷灰石的蛋白结合谱(+)相似。这一结果表明总体结构(包括完整表面)的损失导致完全病变的蛋白质结合能力显著变化。为了使这些相似性合理化,亲和基质(粒状的羟基磷灰石,MIH釉质)在试验前被研磨成均一粒径(粗粉)。
图5描述了羟基磷灰石结合试验(考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE)显示来自于模拟口腔液体的血红蛋白和白蛋白与羟基磷灰石结合。三步冲洗程序可以从羟基磷灰石中去除>90%的蛋白质,所述三步冲洗程序包括相继使用5mMMgCl2,1MMgCl2,和0.4MNaH2PO4进行冲洗,其中每一步冲洗5分钟。
图6提供了人类血清白蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:1;SwissProt登记号P02768)。
图7提供了人类补体C3的氨基酸序列(SEQIDNO:2;SwissProt登记号P01024)。
图8提供了人类α-1-抗胰蛋白酶的氨基酸序列(SEQIDNO:3;SwissProt登记号P01009)。
图9提供了人类蛋白S100-A9的氨基酸序列(SEQIDNO:4;SwissProt登记号P06702)。
图10提供了人类乳运铁蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:5;SwissProt登记号P02788)。
图11提供了人类白细胞弹性蛋白酶抑制剂的氨基酸序列(SEQIDNO:6;SwissProt登记号P30740)。
图12提供了人类抗凝血酶-III的氨基酸序列(SEQIDNO:7;SwissProt登记号P01008)。
图13提供了人类血红蛋白α亚基的氨基酸序列(SEQIDNO:8;SwissProt登记号P69905)。
图14提供了人类血红蛋白β亚基的氨基酸序列(SEQIDNO:9;SwissProt登记号P68871)。
图15提供了人类血红蛋白δ亚基的氨基酸序列(SEQIDNO:10;SwissProt登记号P02042)。
图16提供了(人类催乳素诱导蛋白的氨基酸序列SEQIDNO:11;SwissProt登记号P12273)。
图17提供了人类α-淀粉酶1的氨基酸序列(SEQIDNO:12;SwissProt登记号P04745)。
图18提供了人类Igκ链V-III区SIE的氨基酸序列(SEQIDNO:13;SwissProt登记号P01620)。
图19提供了人类Igα-2链C区的氨基酸序列(SEQIDNO:14;SwissProt登记号P01877)。
图20提供了人类非典型蛋白c6或f58的氨基酸序列(SEQIDNO:15;SwissProt登记号Q6P5S2)。
图21提供了人类丝氨酸蛋白酶抑制剂B3的氨基酸序列(SEQIDNO:16;SwissProt登记号P29508)。
图22提供了人类牙釉蛋白X型异构体的氨基酸序列(SEQIDNO:17;SwissProt登记号Q99217)。
图23提供了人类牙釉蛋白Y型异构体的氨基酸序列(SEQIDNO:18;SwissProt登记号Q99218)
图24提供了小鼠牙釉蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:19;SwissProt登记号P63277),其同样对应于重组的小鼠牙釉蛋白。
图25提供了牛的血红蛋白α亚基的氨基酸序列(SEQIDNO:20;SwissProt登记号P01966)。
图26提供了牛的血红蛋白β亚基的氨基酸序列(SEQIDNO:21;SwissProt登记号P02070)。
图27描述了通过N-羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)与氨基黑(伯胺)反应来制备马来酰亚胺激活显色的报告物制备的化学反应。马来酰亚胺激活显色的报告物为有巯基活性的物质,能与血红蛋白β亚基中的半胱氨酸-硫醇结合。
图28描述了制备探针(在此实施例中为与显色报告物结合的蛋白质)的化学反应,其是通过将如图28的马来酰亚胺激活显色报告物与血红蛋白β亚基中的半胱氨酸硫醇基(SH)反应制得。每个血红蛋白四聚体结合两分子显色的报告物,并且保留两个亚基未经修饰,这对与保持血红蛋白的羟基磷灰石结合功能是重要的。
图29描述了根据图27和图28和实施例2制备的探针与羟基磷灰石的体外结合。探针包括血红蛋白(Hb),黑-蓝显色的报告物(氨基黑)和连接物(linker)。在应用探针的5分钟内,羟基磷灰石变成深蓝色。探针可以经受水洗,但只有显色的报告物(即未与Hb连接的)在水中冲洗时被去除。通过三步冲洗程序从羟基磷灰石去除探针,所述三步冲洗程序包括依次使用5mMMgCl2,1MMgCl2,和0.4MNaH2PO4进行冲洗,其中每一步冲洗5分钟。
图30描述了实施例3的结果,实施例3说明了根据实施例2制备的探针特异性结合到多孔牙釉质特异性结合。
图31描述了实施例4的结果,实施例4说明了根据实施例2制备的探针可以特异性检测牙釉质表面的早期脱矿化(初期龋病模型)。
图32描述了实施例5的结果,实施例5说明了根据实施例2制备的探针的反应机理为羟基磷灰石亲和性。
图33描述了实施例6的结果,实施例6说明了根据实施例2制备的探针特异性标记了低矿化牙釉质和异常的牙本质。而正常的牙釉质和牙本质不标记。低矿化牙釉质特异性地并且均匀地被标记为深紫色。异常的牙本质被特异性地并且均匀地标记为深绿色。
图34描述了实施例7的结果,实施例7说明了根据实施例2制备的探针可以用于引导低矿化牙釉质的移除。
图35描述了实施例8的结果,实施例8说明了根据实施例2制备的探针可以用于引导异常牙本质的移除。
图36描述了实施例9的结果,实施例9说明了根据实施例8的异常牙本质检测可以通过漂洗而改进。
图37描述了实施例10的结果,实施例10说明了探针可以为射线透不过的,这可以通过用氨基-2,4,6-三吲哚间苯二甲酸(3I)取代实施例2中的蓝色发色团(氨基黑)。
图38描述了实施例11的结果,实施例11说明了在去除与纯羟基磷灰石结合的蛋白质时,包含Mg2+或PO4的冲洗液的相对效果。
图39描述了实施例12的结果,实施例12说明了在去除与纯羟基磷灰石结合的蛋白质时,包含Mg2+或PO4的冲洗液单独或相继应用时的相对效果。
图40描述了实施例13的结果,实施例13说明了在去除与纯羟基磷灰石结合的蛋白质时,包含Mg2+或PO4的冲洗液联合应用时的相对效果。
图41描述了实施例14的结果,实施例14说明了包含Mg2+或PO4的冲洗液从低矿化牙釉质中去除蛋白质的应用,尽管其相对于实施例11至13中羟基磷灰石的模型效果有所降低。
图42描述了实施例15的结果,实施例15说明了包含Mg2+或PO4的冲洗液从低矿化牙釉质中去除蛋白质的效果相比于实施例14可以有所增加,这种效果的增加是通过延长施用周期以使蛋白质可以被定量去除。
具体实施方式
此处揭示用于检测可以与多孔羟基磷灰石结合的蛋白质的试剂盒、探针和方法。羟基磷灰石可以包括在牙釉质或牙本质中。而且,此处第一次揭示了一种产品可检测牙釉质中的缺陷,尤其通过检测多孔牙齿羟基磷灰石,而现有产品染色牙本质(但并不检测多孔牙齿羟基磷灰石)。
可以与多孔牙齿羟基磷灰石结合的蛋白质可以为人类蛋白质。例如,蛋白质可选自以下群组:血清白蛋白(P02768);补体C3β链(P01024);α-1-抗胰蛋白酶(P01009);蛋白质S100-A9(P06702);乳运铁蛋白(P02788);白细胞弹性蛋白酶抑制剂(P30740);抗凝血酶-III(P01008);血红蛋白α亚基(P69905);血红蛋白β亚基、(P68871);血红蛋白δ亚基(P02042催乳素诱导蛋白(P12273);α-淀粉酶1(P04745);Igκ链V-III区SIE(P01620);Igα-2链C区(P01877);非典型蛋白c6或f58(Q6P5S2);丝氨酸蛋白酶抑制剂B3(P29508),其中括号内的术语表示SwissProt数据库的唯一登记标识(如表1所分别列出的,SEQIDNO:1至16和图6至21)。在一些实施例中,蛋白质可以为牙釉蛋白。牙釉蛋白可以为人类的。例如,牙釉蛋白可以为人类牙釉蛋白的X型异构体,(SEQIDNO:17,图22;SwissProt登记号Q99217)或者可以为人类牙釉蛋白的Y型异构体,(SEQIDNO:18,图23;SwissProt登记号Q99218)。可替代的,所述蛋白质可以来自于非人类的受体,例如,动物如灵长类、马、母牛、绵羊、山羊狗或猫。
在第一至第四和第七至第九方面的一些实施例中,所述蛋白质可以为白蛋白、血红蛋白或其亚基、或者为牙釉蛋白。
在第四方面的一些实施例中,该方法包括检测牙釉蛋白以外的蛋白质和检测牙釉蛋白,其中蛋白质的存在和牙釉蛋白的缺乏是MIH的表征,而牙釉蛋白的存在是低成熟度缺陷的表现,包括**釉质发育不全或牙齿氟中毒。“牙釉蛋白以外的”蛋白质选自以下任一个:血清白蛋白,补体C3β链、α-1-抗胰蛋白酶、蛋白S100-A9、乳运铁蛋白、白细胞弹性蛋白酶抑制剂、抗凝血酶-III、血红蛋白α亚基、血红蛋白β亚基、血红蛋白δ亚基、催乳素诱导蛋白、α-淀粉酶1、Igκ链V-III区SIE;Igα-2链C区;非典型蛋白c6或f58、和丝氨酸蛋白酶抑制剂B3。
此处使用的“多孔的”或“多孔性”指低矿化或脱矿化的牙齿羟基磷灰石。增加的“多孔性”是由于矿物质密度的降低,这导致矿物质晶体之间的空间增大。
此处使用的“低矿化”指牙釉质的不完全发育,其导致矿物质密度的降低(牙釉质孔隙度增加)和机械强度的降低。“低矿化”是由遗传性的(即釉质发育不全)或后天的(即MIH,氟中毒)牙齿发育的破坏引起的。“低矿化”与“脱矿化”不同,例如“脱矿化”发生在龋齿中。在龋齿中,发育正常(或不正常)的牙釉质随后会脱矿化。“脱矿化”与“低矿化”不同,“低矿化”指由于被破坏的发育而从未达到正常矿物质含量的牙釉质。
此处使用的“重矿化”指矿物质重返到牙齿分子结构中。牙齿的主要矿物质为羟基磷灰石。在一些重矿化过程中,羟基基团被氟基团所取代以产生氟磷灰石,其比羟基磷灰石更加抗酸。
此处使用的“矫正矿化”指对DDD(即由不完全矿化引起的多孔羟基磷灰石)使用重矿化治疗法。在DDD情况下使用术语“重矿化”是不合适的,这是由于这种多孔羟基磷灰石不是由脱矿化引起的。
此处使用的“龋病”或“蛀牙”指由酸引起的牙釉质和牙本质的减少或损失,尤其指感染细菌产生的酸。“龋病”是由脱矿化过程来界定的,而且如果发现较早,可以通过使用重矿化方法来矫正。
此处使用的“涉及多孔牙齿羟基磷灰石的状况”包括龋齿,臼齿/门齿的低矿化(MIH),釉质发育不全,牙齿氟中毒或其他表现为低矿化釉质的DDD(即扩散的或界限清楚的浊斑)。
此处使用的“臼齿/门齿的低矿化”或“MIH”指导致不完全坚硬(低矿化)牙釉质的DDD,通常分别为为第一永久大臼齿和门齿分别咬合的或相切的三分之一处。
MIH和氟中毒均表现为表层以下的孔隙,其中活跃的龋齿可以具有多孔表面(不活跃龋齿可以由于重矿化作用而形成密封的表面)。
此处使用的“暴露的”牙釉质指次表面组织,因防护表层的流失而被暴露。“暴露的”牙釉质可以为正常的或多孔的;也就是说,有很多牙齿表面的崩解实例并不是受MIH或其他情况的影响(如正常牙齿可能在咬坚硬物体时断裂)。
此处使用的“结合”,“结合的”或“结合地”指蛋白质和羟基磷灰石之间的化学相互作用,使蛋白质保留在羟基磷灰石内。这种相互作用可以为离子的、共价的、非共价的,极性的或非极性的作用。
此处使用的术语“检测物”指任何化学的,生物化学的或生物的物质,其可以特定地与此处揭示的蛋白质相互作用,并产生与这种相互作用响应的效果。例如,这种响应可以为显色报告物的可目测效果,以及由此得出的蛋白质的可目测效果。“检测物”可以包括“报告物”或抗体。
术语“检测”或“进行检测”指识别来自检测物的响应。
在第一方面中的试剂盒的一个实施例中,检测物包含显色报告物。在第二方面的探针中,检测物为报告物。在探针的一个实施例中,报告物包含显色报告物。当检测物包含显色报告物时,检测显色报告物则包含显示显色报告物以及由此显示目标蛋白质。可替代的,报告物可以为射线透不过的。
此处使用的术语“探针”指一种试剂,如此处揭示的蛋白质,其可以渗透进多孔釉质并可以特异性地和紧密地与羟基磷灰石结合,且发生结合后这种结合可以被检测到。换句话说,该探针包括特定的“羟基磷灰石靶向的”分子。“探针”包括此处揭示的蛋白质和报告物。根据本发明,“探针”可以不是抗体。
相似的,术语“特异性的”或“特异性地”指一种物质特定地与第二种物质结合而基本上不与其他任何一种物质结合。这种结合与非特异性相互作用具有可测定程度的不同。特异性结合可以被测定,例如,通过与一种分子的结合相比于与对照分子的结合来测定,其中对照分子通常为不具有结合活性的具有相似结构的分子。例如,特异性结合可以由与靶向分子类似的对照分子竞争来确定,例如,无标记的靶向分子过量。在这种情况下,如果靶向分子与探针的结合被过量的无标记的靶向分子在竞争中抑制,则表明为特异性结合。此处的“特异性的”或“特异性地”结合可以指(i)特定地与羟基磷灰石结合的蛋白质,(ii)特定地与蛋白质结合的检测物,或(iii)特定地与蛋白质或检测物结合的报告物。
特别的,特异性结合指具有比非特异性靶向分子至少少2倍的Kd的物质,例如,具有比非特异性靶向分子至少少4倍、6倍、8倍、10倍、或10倍以上的Kd的物质。可选的,特异性结合可以表达为一种对于靶向分子的Kd最多为约10-4M的分子,例如,约10-5M,约10-6M,约10-7M,约10-8M,约10-9M,约10-10M,约10-11M,约10-12M,或者更低。
在第一方面的试剂盒的一个实施例中,检测物包含报告物。
当原位使用时,检测物或探针对于受体无毒。
此处使用的“报告物”指任何化学的,生物化学的或生物的可以产生检测效果的物质。“报告物”可以特异性结合或连接到检测物或蛋白质上。在用于高亲和性、非共价生物素-链霉亲和素结合时,报告物可以包括生物素或链霉亲和素。报告物会产生另一种高亲和性、非共价键。
在第一方面的试剂盒或第二方面的探针的一个具体实施方式中,报告物可以为显色报告物。在第一或第二方面的其他具体实施方式中,报告物可以为一种颜料,或一种冷光的(包括荧光的或磷光的)、放射性的、化学发光的物质,酶或X射线对比分子(X-raycontrastmolecule)。报告物包含一种X射线对比分子(例如,5-氨基-2,4,6-三吲哚间苯二甲酸;3I),其可以用于使用现有的临床放射影像设备灵敏的检测早期阶段的牙邻面龋病(现有技术的一个主要问题)。
此处的术语“显色报告物”指任何显色的物质,优先吸收可见光的某些波长的物质。
因此,当报告物为显色报告物时,检测效果是一种颜色的可目测效果。
显色报告物可以为任何显色的可以连接、偶联或结合到蛋白质的物质,同时维持其显色报告物的特性。在第一方面的试剂盒或第二方面的探针的一个实施例中,显色报告物为氨基黑。在一个实施例中,探针包含与显色报告物连接或偶联的蛋白质(即与羟基磷灰石结合的蛋白质)。表1中的任何蛋白质可以与显色报告物连接或偶联,功能是将显色报告物靶向到多孔羟基磷灰石。在一个实施例中,蛋白质为血红蛋白。因此,在一个实施例中,探针包含连接到氨基黑的血红蛋白。
此处揭示的探针包括蛋白质,即血红蛋白,累积地被多孔牙齿羟基磷灰石吸收。在其他蛋白质的存在下,探针会竞争结合到羟基磷灰石上,这是由于探针能够取代对羟基磷灰石有较低亲和性的其他物质。这种探针可以包含氨基黑或3I。
显色报告物可以基于本领域技术人员熟知的所需特性选自于以下群组:乙酰基黄(坚牢黄);酸性黑1(氨基黑10B);酸性蓝22(水溶蓝I);酸性蓝93(甲基蓝);酸性品红(酸性品红);酸性绿(亮绿SF淡黄);酸性绿1(萘酚绿B);酸性绿5(亮绿SF淡黄);酸性洋红(酸性品红);酸性橙10(橙黄G);酸性红4(偶氮曙红);酸性红26(二甲代苯胺朱红);酸性红29(铬变素2R);酸性红44(朱红6R);酸性红51(赤藓红B);酸性红52(丽丝胺若丹明B);酸性红66(比布列西猩红);酸性红73(Woodstain猩红);酸性红87(曙红Yws);酸性红91(曙红B);酸性红92(荧光桃红B);酸性红94(玫瑰红);酸性红101(偶氮胭脂红G);酸性红103(偶氮胭脂红B);酸性品红(Acidroseine)(酸性品红(Acidfuchsin));酸性玉红(酸性品红);酸性紫19(酸性品红);酸性黄1(萘酚黄S);酸性黄7(丽丝胺黄素FF);酸性黄9(坚牢黄);酸性黄23(酒石黄);酸性黄24(马休黄);酸性黄36(间胺黄);酸性黄73(荧光黄);酸性黄85(考马斯坚牢黄G);酸性黄S(萘酚黄S);酸性黄T(酒石黄);吖啶橙(吖啶橙);吖啶红(吖啶红);吖啶黄(吖啶黄);阿尔新蓝(阿尔新蓝8GX);阿尔新黄(阿尔新黄);醇溶曙红(乙基曙红);茜素(茜草素);茜素蓝(茜素蓝);茜素蓝2RC(蒽蓝SWR);茜素洋红(茜素红S);茜素花青BBS(茜素花青BBS);茜酚花青R(铬花青R);茜素红S(茜素红S);茜草红紫素(红紫素);碱性蓝4B,5B(碱性蓝5B);黄金色素三甲酸(铬紫CG);氨基黑10B(氨基黑10B);氨基萘酚红(偶氮荧光桃红);氨基黑(氨基黑10B);苯胺蓝WS(苯胺蓝WS);苯胺紫(苯胺紫);蒽蓝SWR(蒽蓝SWR);蒽蓝SWX(茜草花青BBS);金胺O(金胺O);偶氮曙红(偶氮曙红);偶氮胭脂红B(偶氮胭脂红B);偶氮胭脂红G(偶氮胭脂红B);偶氮曙红G(偶氮曙红);色基5(坚牢红B);色基48(耐晒蓝B);偶氮荧光桃红(偶氮荧光桃红);伊文思蓝(伊文思蓝);天蓝A(天蓝A);天蓝B(天蓝B);天蓝C(天蓝C);碱性蓝8(维多利亚蓝4R);碱性蓝9(亚甲基蓝);碱性蓝12(尼罗蓝A);碱性蓝15(夜蓝);碱性蓝17(甲苯胺蓝O);碱性蓝20(甲基绿);碱性蓝26(维多利亚蓝B);碱性棕1(俾斯麦棕Y);碱性品红(碱性品红);碱性绿4(孔雀绿);碱性绿5(亚甲基绿);碱性橙14(吖啶橙);碱性红2(番红O);碱性红5(中性红);碱性红9(副品红);碱性紫2(新品红);碱性紫3(结晶紫);碱性紫4(乙基紫);碱性紫10(若丹明B);碱性紫14(品红);碱性黄1(硫磺素T);碱性黄2(金胺O);比布列西猩红(比布列西猩红);比布列西猩红R(苏丹IV);俾斯麦棕Y(俾斯麦棕Y);布劳施瓦兹(萘酚蓝黑CS);氧化巴西木素(氧化巴西木素);巴西木素(巴西木素);亮藏花(Woodstain猩红);亮结晶猩红6R(朱红6R);亮绿(亮绿);钙红(核固红);胭脂红(胭脂红);胭脂红酸(胭脂红);酸性红6R(铬变素2R);天青石蓝B(天青石蓝B);中国蓝(苯胺蓝);氯冉亭坚牢绿5B(天狼星红4B);芝加哥蓝4B(滂胺天蓝5B);铬坚牢黄8GL(铬坚牢黄8GL);铬坚牢黄8G(铬坚牢黄8GL);铬紫CG(铬紫CG);铬变素2R(铬变素2R);铬花青R(铬花青R);胭脂虫红(胭脂红);小行星蓝(天青石蓝B);刚果科林斯(刚果科林斯);刚果红(刚果红);考马斯坚牢黄G(考马斯坚牢黄G);棉蓝(甲基蓝);棉红(刚果红);藏花猩红(比布里希猩红);藏花猩红3B(Woodstain猩红);藏花猩红MOO(Woodstain猩红);藏花(藏红花);结晶朱红6R(朱红6R);结晶猩红(朱红6R);结晶紫(结晶紫);大丽花(霍夫曼紫);钻石绿B(孔雀绿);直接蓝14(锥虫蓝);直接蓝58(伊文思蓝);直接红(刚果红);直接红10(刚果科林斯);直接红28(刚果红);直接红80(天狼星红F3B);直接红81(天狼星红4B);直接黄7(硫磺素S);直接黄11(日光黄);直接耐晒蓝4R(直接耐晒蓝4R);直接耐晒蓝8G(直接耐晒蓝8G);曙红B(曙红B);曙红黛青(曙红B);曙红(曙红Yws);曙红Y(曙红Yws);曙红淡黄(曙红Yws);曙红醇溶液(曙红醇溶液);伊利石榴石B(刚果科林斯);羊毛铬花青R(羊毛铬花青R);赤藓红B(赤藓红B);乙基曙红(乙基曙红);乙基绿(乙基绿);乙基紫(乙基紫);伊文思蓝(伊文思蓝);坚牢蓝B(坚牢蓝B);坚牢绿FCF(坚牢绿FCF);坚牢红B(坚牢红B);坚牢黄(坚牢黄);特异性坚牢黄(坚牢黄);坚牢黄G(坚牢黄);脂肪黑HB(苏丹黑B);荧光黄(荧光黄);食物绿3(坚牢绿FCF);棓因(棓因);加拉明蓝(加拉明蓝);棓花青(棓花青);龙胆紫(甲基紫2B);几内亚绿(几内亚绿B);苏木红(苏木红);羟高铁血红素(羟高铁血红素);苏木紫(苏木紫);日光坚牢品红BBL(核固红);甲蓝(甲基蓝);氧化苏木精(氧化苏木精);苏木精(氧化苏木精);苏木紫(苏木紫);霍夫曼紫(霍夫曼紫);肼黄(酒石黄);靛蓝胭脂红(靛蓝胭脂红);印度红(曙红B);固有蓝1(阿尔新蓝8GX);固有黄1(阿尔新黄);INT(碘硝基氯化四氮唑蓝);碘绿(碘绿);胭脂虫粉(胭脂虫粉);胭脂酮酸(胭脂虫粉);核固红(核固红);基通若丹明B(丽思胺若丹明B);虫胶(虫胶酸);虫胶酸(虫胶酸);劳特紫(硫堇);亮绿(亮绿SF淡黄);丽思胺坚牢黄(丽思胺坚牢黄);丽思胺核黄素FF(丽思胺核黄素FF);丽思胺绿SF(亮绿SF淡黄);丽思胺若丹明B(丽思胺若丹明B);卢卡斯纯黄6G(铬坚牢黄8GL);卢卡斯坚牢蓝(卢卡斯坚牢蓝MBS);洋红0(副品红);洋红I(品红);洋红II(洋红II);洋红III(新品红);孔雀绿(孔雀绿);曼彻斯特棕(俾斯麦棕Y);马休黄(马休黄);苯胺紫(苯胺紫);苯胺紫(苯胺紫);红汞(红汞220);红汞(红汞220);间胺黄(间胺黄);甲基蓝(甲基蓝);甲基绿(甲基绿);甲基紫(甲基紫2B);甲基紫2B(甲基紫2B);甲基紫10B(结晶紫);亚甲基天蓝A(天蓝A);亚甲基天蓝B(天蓝B);亚甲基天蓝C(天蓝C);亚甲基蓝(亚甲基蓝);亚甲基绿(亚甲基绿);铣黄3G(铣黄3G);媒染蓝3(羊毛铬花青R);媒染蓝10(棓花青);媒染蓝14(天青石蓝B);天青石蓝23(茜草素花青BBS);媒染蓝32(蒽蓝SWR);媒染蓝45(加拉明蓝);媒染红3(茜草素红S);媒染红11(茜草素);媒染紫25(棓因);媒染紫39(铬紫CG);媒染黄33(铬坚牢黄8GL);精萘蓝黑(萘蓝黑CS);萘酚蓝黑(氨基黑10B);萘酚绿B(萘酚绿B);萘酚黄S(萘酚黄S);自然黑1(氧化苏木精);自然红(红紫素);自然红3(胭脂虫);自然红4(胭脂红);自然红8(红紫素);自然红16(红紫素);自然红24(巴西木素);自然红25(虫胶酸);自然红28(苔红素);自然黄6(藏红花);NBT(四唑氮蓝);自然红(自然红);新品红(新品红);尼亚加拉蓝3B(锥虫蓝);夜蓝(夜蓝);尼罗蓝(尼罗蓝A);尼罗蓝A(尼罗蓝A);尼罗蓝硫酸盐(尼罗蓝A);尼罗红(尼罗红);硝基BT(四唑氮蓝);四唑氮蓝(四唑氮蓝);核固红(核固红);油红O(油红O);橙色G(橙色G);苔红素(苔红素);副品红(副品红);珀金紫(苯胺紫);荧光桃红B(荧光桃红B);苦味酸(苦味酸);朱红2R(二甲代苯胺朱红);朱红6R(朱红6R);朱红B(比布列西猩红);二甲代苯胺朱红(二甲代苯胺朱红);朱红S(朱红S);滂胺天蓝5B(滂胺天蓝5B);樱草植物(霍夫曼紫);樱草灵(樱草灵);红紫素(红紫素);派洛宁B(派洛宁B);派洛宁G(派洛宁Y);派洛宁Y(派洛宁Y);若丹明B(若丹明B);品红(品红);孟加拉玫瑰红(孟加拉玫瑰红);藏红花(藏红花);番红O(番红O);猩红R(苏丹IV);猩红(苏丹IV);猩红R(苏丹IV);虫胶(虫胶酸);天狼星红F3B(天狼星红F3B);天狼星红4B(天狼星红4B);天狼星超级蓝F3R(直接耐晒蓝4R);独铬花青R(茜酚花青R);可溶蓝(苯胺蓝);溶剂黑3(苏丹黑B);溶剂蓝38(卢卡斯坚牢蓝MBS);溶剂红23(苏丹III);溶剂红24(苏丹IV);溶剂红27(油红O);溶剂红45(乙基曙红);溶剂黄94(荧光黄);醇溶曙红(乙基曙红);苏丹III(苏丹III);苏丹IV(苏丹IV);苏丹黑B(苏丹黑B);苏丹红BK(苏丹III);硫磺黄S(萘酚黄S);磺基若丹明B(丽思胺若丹明B);日光黄(日光黄);瑞士蓝(亚甲基蓝);酒石黄(酒石黄);硫磺素S(硫磺素S);硫磺素T(硫磺素T);硫堇(硫堇);甲苯胺蓝(甲苯胺蓝O);Toluylinered(自然红);苯胺黄G(间胺黄);吖啶黄(吖啶黄);锥虫蓝(锥虫蓝);萤光素钠(荧光黄);维多利亚蓝4R(维多利亚蓝4R);维多利亚蓝B(维多利亚蓝B);维多利亚蓝R(维多利亚蓝R);维多利亚绿B(孔雀绿);水溶蓝I(水溶蓝I);水溶曙红(黄色曙红ws);Woodstain猩红(Woodstain猩红);二甲苯红B(丽丝胺若丹明B);二甲代苯胺朱红(二甲代苯胺朱红);和淡黄曙红(黄色曙红ws)。本领域技术人员要考虑的所需特性包括,例如与蛋白质和/或根据本发明使用的连接物的相容性、无毒性、和维持与多孔牙齿羟基磷灰石结合。
在第一至第五或第七至第九方面的可替代实施例中,与羟基磷灰石结合的蛋白质在表1的实施例中未被列出,但是本领域技术人员可以知道其能结合到多孔羟基磷灰石,例如骨钙蛋白或饰胶蛋白聚糖。来自于饰胶蛋白聚糖的4-5个富亮氨酸的重复域能为牙本质中的多孔羟基磷灰石提供特定靶向机制。
可替代的,在第一至第五或第七至第九方面的实施例中,蛋白质可以为多肽或蛋白质片段,并且所述多肽或蛋白质片段维持其与多孔牙齿羟基磷灰石结合的能力。
可替代的,本领域技术人员可以知道,可以与羟基磷灰石结合的小分子(或其聚合物),例如四环素或氨基二磷酸盐,其依据渗透到羟基磷灰石微孔区域的能力和依据稳定性(即产品保质期)可以被更多的使用。氨基二磷酸盐可以制备一种适于检测和划界龋齿的化合物(用于渗透多孔牙釉质表面和与脱矿化牙釉质强力结合的小的,高亲和性的探针)。
在第一方面中的试剂盒或第二方面中的探针的一些具体实施方式中,检测物或探针还包括将报告物与检测物或蛋白质连接的连接物。连接物可以为异型双功能的交联剂。例如,异型双功能连接物可以为琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)。依据本发明可以使用的连接物的其他例子包括:琥珀酰亚胺基-6-[β-马来酰亚胺基丙酰胺基]己酸(SMPH),N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮水杨酸(NHS-ASA),和N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)。
其他类型的分子可以作为连接物。例如,此处可为如生物素-链霉亲和素这样的高亲和性、非共价键。
本领域技术人员可以知道可具有多种化学反应和间隔臂长度的多种交联剂进一步增加了本方法的灵活性。
在第一方面中的试剂盒或第二方面中的探针的一些实施例中,报告物和蛋白质可以以已连接的方式提供。可替代的,报告物和蛋白质可以单独提供用于后续结合。试剂盒和探针可以包括连接物。试剂盒或探针中的蛋白质,报告物或连接物可以以任意可能的组合出现。例如,当报告物和蛋白质通过连接物连接时,探针为“随时可用的”,即三种组分连接。可替代的,蛋白质和连接物可以是连接的并单独提供给报告物。可替代的,连接物和报告物可以是连接并单独提供给蛋白质。可替代的,蛋白质,报告物和连接物作为单独的组分提供。在第一方面的一个实施例中,试剂盒包括报告物和连接物,但不包括蛋白质。
在第一方面中的试剂盒的一些具体实施方式中,检测物包括与蛋白质特异性结合的抗体。在另一个实施例中,在用于高亲和性、非共价生物素-链霉亲和素键时,检测物可包括生物素或链霉亲和素。检测物会产生另一种高亲和性、非共价键。例如,检测物可包括抗体替代物,诸如肽基的蛋白配体。本领域熟知的肽基蛋白配体为synbody。
术语“抗体”为广义的含义,并且尤其涵盖了表现出所需的生物学特性或免疫学活性的抗体,例如多克隆抗体、单克隆抗体(包括拮抗物和中和抗体)、具有多表位特异性的抗体组分、单链抗体和抗体片段。抗体可以为共轭抗体或本领域技术人员熟知的其他任何类型的抗体。
本领域技术人员可以使用熟知的任何方法来检测抗体。一级抗体可以包括报告物。可替代的,靶向一级抗体的二级抗体可以包含报告物。
抗体可以为本领域技术人员所熟知的任何抗体,其与选自以下群组的蛋白质特异性结合:血清白蛋白、补体C3β链、α-1-抗胰蛋白酶、蛋白S100-A9、乳运铁蛋白、白细胞弹性蛋白酶抑制剂、抗凝血酶-III、血红蛋白α亚基、血红蛋白β亚基、血红蛋白δ亚基、催乳素诱导蛋白、α-淀粉酶1、Igκ链V-III区SIE;Igα-2链C区;非典型蛋白c6或f58、和丝氨酸蛋白酶抑制剂B3。在一个实施例中,抗体与牙釉蛋白特异性结合。
在第一方面中的试剂盒的一个实施例中,抗血清白蛋白单克隆抗体可以选自以下群组:AL-01;1.B.731;1A9;6B11;OCH1E5;1C8;1G2;2B2;2B3;2B6;14E7;15C7;Alb1;和产品编号为sc-70340的小鼠单克隆IgG1抗体(SantaCruzBiotechnologyInc,圣克鲁兹生物技术股份有限公司)。在一个实施例中,抗补体C3β链单克隆抗体可以为克隆755。在另一实施例中,可以使用与补体C3β链交叉反应的抗人体C3单克隆抗体,其中抗人体C3单克隆抗体为克隆11H9。在一个实施例中,α-1-抗胰蛋白酶单克隆抗体可以选自以下群组:5B12;703;704;8A0;B9;和G11。在一个实施例中,蛋白S100-A9单克隆抗体可以选自以下群组:0.N.390A;47-8D3;NO.134;NO.19;和S32.2。在一个实施例中,抗乳运铁蛋白单克隆抗体可以选自以下群组:1C6;2B8;B97;CLB-13.17;和1A1。在一个实施例中抗凝血酶-III单克隆抗体可以是4B3或BDI205。在一个实施例中,血红蛋白α亚基抗体山羊多克隆IgG抗体,产品编号为sc-70340(SantaCruzBiotechnologyInc,圣克鲁兹生物技术股份有限公司)。在一个实施例中,血红蛋白β亚基抗体可以为产品编号为sc-21757的小鼠单克隆IgG1抗体(SantaCruzBiotechnologyInc,圣克鲁兹生物技术股份有限公司)。在一个实施例中,抗-Igα-2链C区单克隆抗体可以为克隆14AS(也称作抗人类IgA2)。在一个实施例中,抗牙釉蛋白X型抗体可以为兔的IgG多克隆抗体,产品编号为sc-32892(SantaCruzBiotechnologyInc,圣克鲁兹生物技术股份有限公司)。本领域技术人员应当理解其他适合的抗体也适用。
在第一、第二或第四方面中的试剂盒、探针或方法的一个实施例中,第一蛋白质选自以下群组:可检测到的血清白蛋白、补体C3β链、α-1-抗胰蛋白酶、蛋白S100-A9、乳运铁蛋白、白细胞弹性蛋白酶抑制剂、抗凝血酶-III、血红蛋白α亚基、血红蛋白β亚基、血红蛋白δ亚基、催乳素诱导蛋白、α-淀粉酶1、Igκ链V-III区SIE;Igα-2链C区;非典型蛋白c6或f58、和丝氨酸蛋白酶抑制剂B3,和可检测到的第二蛋白质,其中所述第二蛋白质为牙釉蛋白。由此,第一方面中的试剂盒也可以包括检测牙釉蛋白的第二检测物。第二检测物可以为抗牙釉蛋白抗体。
可替代的,检测可以包括免疫检测、色谱分析、电泳、质谱分析法和显微镜。免疫检测可以包括例如酶联免疫吸附实验(ELISA)、蛋白质印迹(WesternBlot)、斑点印记、槽印记(slotblot)或流式细胞术。显微镜可以包括例如共聚焦激光,荧光或电子显微镜。
检测物或探针可以以不同方式应用,例如以液态、凝胶、胶囊、片剂、水溶液、水相或油相悬浮液、锭剂、片剂、粉末、颗粒、乳剂、糖浆或酏剂。
在第一方面的试剂盒或第二方面的探针的一个实施例中,检测物或探针包含溶剂,检测物或探针被溶解、悬浮或乳化于其中。所述溶剂可以是一种通常用在药学或工业或其类似的溶剂。例如包括水、乙醇、正丙醇、2-丁醇、异丁醇、正戊醇、异戊醇、乙二醇、2-甲氧基乙醇、二甘醇、三甘醇、四甘醇、聚乙二醇、丙二醇(propyleneglycol)、二丙二醇(dipropyleneglycol)、聚丙二醇、丙二醇、(trimethyleneglycol)、1,2-丁二醇,1,3-丁二醇,2,3-丁二醇,1,4-丁二醇,1,5-戊二醇,乙二醇单甲醚,乙二醇单甲醚乙酸酯,乙二醇单乙醚,乙二醇二乙醚,乙二醇单乙醚乙酸酯,乙二醇异丙醚,乙二醇单丁醚,乙二醇二丁醚,乙二醇单醋酸酯,乙二醇二醋酸酯,二乙二醇单甲醚,二乙二醇单甲醚,二乙二醇乙醚醋酸酯,二乙二醇单丁醚,二乙二醇单丁醚乙酸酯,二乙二醇二甲醚,二乙二醇甲乙醚,二乙二醇二乙醚,二乙二醇酯,三乙二醇甲醚,三乙二醇单乙醚,丙二醇单甲醚,丙二醇单乙醚,二丙二醇单甲醚,二丙二醇单乙醚,ee三乙二醇单甲醚,甘油,四氢呋喃,二甲基甲酰胺,二氧六环,丙酮,和二甲氧基乙烷。
在一些实施例中,溶剂为与人类相容(compatible)的溶剂,包括水、乙醇,甘油,异丁醇,乙二醇,二乙二醇,三甘醇,丙酮,或丙二醇。
可以单独使用一种溶剂或混合使用两种或多种溶剂。
检测物可以与增稠剂复合以使得其粘度从约50增加至约2000mPa·s,例如100,200,300,400,500,750,1000,1250,1500,或1750mPas(在25℃下),从而形成凝胶。用牙刷应用凝胶形式的检测物,使得清洁牙齿的同时应用检测物。
可以使用的增稠剂的例子包括:合成添加剂例如海藻酸钠,海藻丙二醇酯,羧甲基纤维素钠,羧甲基纤维素钙,羧甲基淀粉钠,淀粉磷酸酯钠,聚丙烯酸钠,甲基纤维素,羟丙基纤维素,和聚乙烯吡咯烷酮;自然增稠剂例如瓜尔豆胶,角豆胶,塔拉胶,罗望子胶,阿拉伯树胶,黄蓍胶,刺梧桐树胶,海藻酸,角叉菜胶,黄原胶,结冷胶,凝胶多糖,甲壳素,壳聚糖,和壳糖胺;和无机增稠剂例如碳酸钙,硅酸钙,硅粉,无定形水和硅酸盐,和疏水性二氧化硅。
为了获得约50至约2000mPa·s的粘度,增稠剂的结合量依据增稠剂种类而不同。例如,当羧甲基纤维素钠具有明显的增稠效果时,结合量可以为约0.5至4%重量,而当使用甲基纤维素时,结合量为约10至30%重量。
此外,检测物或探针可以包括添加剂例如甜味剂、香味剂和防腐剂。适合的甜味剂包括蔗糖,乳糖,葡萄糖,阿斯巴甜或糖精。适合的香味剂包括薄荷油,冬青油,樱桃,桔子或树莓调味。适合的防腐剂包括苯甲酸钠,维他命E,α-生育酚,抗坏血酸,苯甲酸甲脂防腐剂,对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。适合的润滑剂包括硬脂酸镁,硬脂酸,油酸钠,氯化钠或云母。适合的分解剂包括玉米淀粉,甲基纤维素,聚乙烯吡咯烷酮,黄原胶,膨润土,藻酸或琼脂。片剂可以包括与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的检测物,所述赋形剂适用于片剂的生产。
在其他的实施例中,第一方面中的试剂盒还包括一种或多种冲洗液。
第七或第九方面的试剂盒包括一种或多种冲洗液。
第一、第七或第九方面的试剂盒中的冲洗液可以包含一种溶液,以去除任何非特异性结合到羟基磷灰石的蛋白质,即非解吸。例如,不会使与羟基磷灰石结合的蛋白质解吸的冲洗液,可以为水、生理盐水、氨丁三醇缓冲液或者温和的清洗剂等。由于口腔中含有丰富的蛋白质,其中包含多种与羟基磷灰石结合的蛋白质,在应用检测物到牙齿或试样上之前,冲洗液使不与羟基磷灰石特异性结合的蛋白质从牙齿或试样上被去除。
在第一、第七或第九方面的试剂盒的其他实施例中,冲洗液包含镁离子(Mg2+),磷酸二氢根离子(H2PO4 -),磷酸一氢根离子(HPO4 2-),或磷酸根离子(PO4 3-)(合称“PO4”),或可以包含多种顺序施用的冲洗液,其中的每一种可包含镁离子(Mg2+),磷酸二氢根离子(H2PO4 -),磷酸一氢根离子(HPO4 2-),或磷酸根离子(PO4 3-)。在原位使用无毒的条件下,可以使用任何可溶的镁盐、磷酸二氢根、磷酸一氢根离子(HPO4 2-)或磷酸盐。在一个实施例中,冲洗液包含氯化镁或磷酸二氢钠。本领域技术人员可以理解其他能够使蛋白质从羟基磷灰石解吸的冲洗液也适用。
冲洗液可以包括次氯酸(HOCl),次氯酸盐(NaOCl)或次氯酸钙(Ca(OCl)2)(合称“漂白剂”)。
冲洗液可以为随时可用。可替代的,冲洗液可以以浓缩液形式提供,基于其与水的稀释液制备成冲洗液。可替代的,冲洗液可以以一种或多种干组分的形式提供,基于其与水的混合物制备成冲洗液。
冲洗液可以包含镁离子少于1mM,约1mM,约2mM,约3mM,约4mM,约5mM,约6mM,约7mM,约8mM,约9mM,约10mM或多于10mM。冲洗液可以包含镁离子少于0.1M,约0.1M,约0.5M,约0.6M,约0.7M,约0.8M,约0.9M,约1M,约1.1M,约1.2M,约1.3M,约1.4M,约1.5M,约2M,约10M或多于10M。冲洗液可以包含磷酸二氢根、磷酸一氢根或磷酸根离子少于0.04M,约0.04M,约0.08M,约0.09M,约0.1M,约0.2M,约0.3M,约0.4M,约0.5M,约0.6M,约0.7M,约0.8M,约0.9M,约1M,约1.5M,约2M,约4M,或多于4M。
冲洗液可以包括约10%的漂白剂(约0.4%-OCl),未掺水或稀释的漂白剂(约4%-OCl),或可以包括约20%(约0.8%-OCl),约30%(约1.2%-OCl),约40%(约1.6%-OCl),约50%(约2.0%-OCl),约60%(约2.4%-OCl),约70%(约2.8%-OCl),约80%(约3.2%-OCl),约90%(约3.6%-OCl)或约95%的漂白剂(约3.8%-OCl)。
然而,不愿束缚于任何特定的理论,认为具有步进式浓度梯度的镁和/或磷酸盐的复合冲洗液相比于单一浓度的镁溶液可以去除更多的蛋白质。认为漂白剂(-OCl)非特异性地从羟基磷灰石剥离蛋白质。
因此,在第一、第七或第九方面的试剂盒的一个实施例中,一种或多种冲洗液或复合冲洗液可以包含约5mM氯化镁的溶液,约1M氯化镁的溶液,和/或约0.4M的磷酸二氢钠的溶液。
在使用一种或多种(复合)冲洗液时,冲洗液可以以任何顺序应用。可替代的,在使用一种或多种(复合)冲洗液时,冲洗液可以以下顺序相继使用,低镁浓度(即5mM),高镁浓度(即1M),磷酸二氢盐(即0.4M;或磷酸一氢盐或磷酸盐)。可替代的,冲洗液可以包括镁盐和磷酸盐的组合,例如,约1M的镁浓度和约0.4M磷酸二氢盐、磷酸一氢盐或磷酸盐浓度。
冲洗可以实施于检测前、检测后、或检测前和检测后。
此处使用的“去除”或“去除的”指与羟基磷灰石结合的蛋白质浓度的降低。
此处使用的“试样”为牙齿的一部分,用于检测或诊断多孔羟基磷灰石。“对照试样”为已知是健康的并且无多孔羟基磷灰石牙齿的一部分,用于当检测或诊断待测羟基磷灰石的孔隙度时的参考。“试样”可以通过擦、刷、刮、削片、钻孔或类似方法取得。可以使用采样器通过刷、擦或其他本领域技术人员所熟知的任何采集方式获得试样。
在第四至第六方面中的方法中的一个实施例中,牙齿首先通过刷或其他方式进行清洁,并干燥。
在第一方面中的试剂盒、第二方面中的探针或第四至第六方面中的方法的一个实施例中,通过使用刷子、牙刷、棉签、棉球或通过从具有喷嘴的容器中喷出来应用检测物。
此处使用的“被应用”,“进行应用”或“应用”为其本身的含义,即将检测物或探针或冲洗液与牙齿或其试样接触,或将报告物与检测物或蛋白质接触。
在应用检测物或探针后,检测物或探针在牙齿上培养一段时间,以使检测物与蛋白质充分结合,或者使探针与羟基磷灰石充分结合。培养阶段可以为1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55或60s。可替代的,培养时间可以为1,1.5,2,2.5,3,3.5,4,4.5,或5分钟。可替代的,培养时间可以为多于5分钟,例如10,15或20分钟。培养之后,过量的检测物或探针可以从口腔中吐出,可以或可以不使用水或冲洗液来清洗。
这种方法或用途可以在受体的牙齿内部或表面原位实施。可替代的,这种方法或用途可以在从受体移除后,在牙齿或试样的内部或表面实施。
受体包括哺乳动物。哺乳动物可以为人类。人类可以为任何年龄。人类可以为约12岁以下。人类可以为约2至约12岁,约4至约10岁,或约6至约10岁。可替代的,受体可以为12至20,20至30,30至40,40至50,50至60,60至70,70至80,80至90,或90至100岁。
受体可以在正常羟基磷灰石或正常的釉质发育后发展为多孔羟基磷灰石,或者受体在整个发育过程中都有多孔羟基磷灰石。
可替代的,受体可以为驯养的,动物园的或宠物动物。特别的,此处的方法或用途适用于人类,也适用于灵长类,宠物如狗和猫,驯养动物如马、牛、绵羊和山羊,动物园动物如猫科动物、犬科动物、牛科动物和有蹄动物,或者实验动物如兔类和啮齿类动物。受体可以受试有牙科疾病,或可以不患有牙科疾病(即无可检测到的疾病)。
此处揭示的试剂盒或方法的诊断力,基于具有区别的蛋白质谱的多孔羟基磷灰石的情况(DDD和龋齿)(例如MIH:富含表1中的蛋白质,很少或没有牙釉蛋白;成年的氟中毒:痕量白蛋白和牙釉蛋白;不成熟釉质发育不全:大量的牙釉蛋白)。不同的缺陷要求不同的在矫正矿化作用之前的冲洗程序,或不同的恢复方法和材料(或影响其选择)。牙齿或其试样的待测釉质中的蛋白质浓度可以以多种方法来评估,而涉及多孔羟基磷灰石的情况可基于识别蛋白质相对于对照组提高的量来诊断。
本发明还可以应用于MIH病变的亚型(例如完整的或受损的),该亚型影响所需治疗的类型(例如在矫正矿化前,不同的蛋白质组成可能需要不同的冲洗程序)。
此处使用的“完整的”为其本身的含义未破坏的,未受损伤的或未改变的,其在涉及牙釉质表面时使用。此处“完整的”指牙齿表面覆盖有硬的釉质壳的病变,并且称为表面病变,表示一种分层结构。
相反地,“受损的”此处指MIH病变,其硬的牙釉质壳由于机械力被破坏,或最初不存在(可能在长牙过程损失,或在发育期间未产生)。
此处的“可渗透表面”指完整或受损的牙釉质,其允许口腔液体或任何其他溶液(和包括蛋白质的相关成分)进入次表面区域。相反地,“不渗透表面”指阻止这种进入的完整或受损釉质。
MIH病变包括完整的牙釉质,无论是多孔羟基磷灰石,可以存在或不存在可检测的多孔牙齿羟基磷灰石(即具有可渗透的或不可渗透的表面)。因此,在第一、第七或第九方面的一些实施例中,试剂盒可以包含渗透剂,或第四至第六方面中的方法(即机械渗透)可以包括渗透牙齿或牙齿试样。这种试剂或方法在预处理具有不可渗透表面的病变中使用。可替代的,这种试剂用于进入实施重矿化或矫正矿化作用前的病变。
此处使用的“可渗透”或“可渗透的”指在不可渗透的牙釉质中开放的孔,其有充足的尺寸使得检测物和/或冲洗液进入多孔羟基磷灰石,和/或能够去除蛋白质。
渗透剂是一种能够渗透进牙釉质表面基质的剂型(例如可以包括酸或一些其他本领域技术人员所熟知的试剂用于渗透牙釉质)。渗透剂可以为例如溶液或凝胶的形式。
在第一、第七或第九方面的一些实施例中,试剂盒可以包含重矿化试剂,或方法可以包括重矿化牙齿或牙齿试样。重矿化剂可以包含氟化物,可溶性磷酸钙或无定形磷酸钙,其可以与生物活性分子稳定共存。
实施例实施例1-与表面完整性有关的MIH牙釉质中的蛋白质组成
材料和方法
试样
人类和SD(Sprague-Dawley)大鼠试样通过适当的伦理途径获得,并储存于-80℃。MIH根据标准条件(Weerheijm,2003)诊断。MIH牙齿在提取后用水冲洗以去除可见的血迹,然后涂抹干燥并立即冷冻储存。将通过嚼蜡状物刺激产生的所有唾液在储存前通过离心(20,000g,5分钟)澄清。血清和红细胞从来自6天大的大鼠血液以常规方法制备。除了使用5天大的第一臼齿外,通过如之前的方法(Hubbard,1996)将分泌性的牙釉质基质从显影的(developing)大鼠牙齿上分离。
牙釉质蛋白的谱图
通过使用解剖刀刮削,从新鲜的解冻的试样上收集明显的MIH病变,注意避免刮到龋的牙釉质和牙本质。使用缓慢旋转的牙科钻头(No.6)采集正常釉质试样。随即,将牙釉质试样(2–5μl包装体积)悬浮于10%三氟乙酸(10体积,在室温下涡流和超声处理10分钟),然后离心(20,000g,4℃,5分钟)以使不溶于酸的蛋白质沉淀。将蛋白沉淀溶解于含有2%SDS和100mmol/L二硫苏糖醇的凝胶上样缓冲液(Hubbard,1996)和额外的蛋白酶抑制剂(如需要)(1mmol/L苯甲基磺酰氟,1mmol/L苯甲脒,5μg/mL胃蛋白酶抑制剂,5μg/mL亮抑肽酶)。SDS提取物通过使用氨基黑的斑点印记进行定量,并进行小型的SDS-PAGE联合考马斯亮蓝染色或免疫印迹法(Hubbard,1995)。使用重组小鼠牙釉蛋白(SEQIDNO:19)作为免疫原在兔子体内培养牙釉蛋白抗血清。
蛋白质组学分析
凝胶带用胰蛋白酶水解,并且除使用基于芯片的纳米喷雾的离子阱设备(Chip-LC/MSDXCT,产自AgilentTechnologies,SantaClara,CA,USA)以外,使用如之前(Mangumetal.,2006)的串联质谱法检测。使用具有严格的验收标准(最低两个序列标签(Mangum等人,2006))的MASCOT搜索引擎和SwissProt人类数据库来识别蛋白质。
矿物质结合实验
模拟口腔液体通过用血清和红细胞裂解物来强化(empiricallyspiking)唾液制得,这样可以使得所有三种组分有同样丰富的量的主要蛋白(图4B)。为鉴定蛋白质的结合,在20℃下,口腔液体与0.1体积羟基磷灰石(产自Sigma,StLouis,MO,USA)或MIH釉质培养60分钟,然后离心分离(2,000g,2分钟)。在使用3体积20mM的三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液(Tris-HCl)(pH8.0)冲洗后,使用三氟乙酸和SDS对沉淀进行抽提,如在牙釉质中所述。
结果
MIH牙釉质富含非牙釉蛋白
牙釉蛋白谱图为氟中毒和釉质发育不全的发病机理提供了有用的见解,尤其是通过将牙釉蛋白水平与临床性能联系起来。相应地,未固定的MIH釉质试样通过SDS-PAGE方法进行研究。与正常釉质不同,MIH釉质在溶于酸时,有可见的沉淀,这表明有相对较高的蛋白质含量。图1所示为不溶于酸的来自于五个严重病变的蛋白质的定量,比正常蛋白质高3-15倍(0.3-1.5%蛋白质w/w)。相似的,考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE显示在MIH牙釉质中有多条蛋白质条带在正常釉质中几乎检测不到(图2A)。由于牙釉蛋白未检测到(图2A,20–25kDa区域),为获得更高的灵敏度,使用免疫印迹法。抗牙釉蛋白也没有检测到MIH釉质中完整的牙釉蛋白,但是在一些试样中检测到了降解的片段(图2B,试样11)。在这些条件下,在正常牙釉质中的牙釉蛋白是不可检测的(未图示)。与分泌物相基质定量对比显示,MIH牙釉质仅包含可检测的牙釉蛋白总量的0.12%±0.06%(±SE,n=6)的蛋白(图2B,8-kDa至25-kDa区域)。结论为MIH釉质富含蛋白质,而致病原因不是牙釉蛋白的保留。
在MIH釉质中体液蛋白占主导
为了鉴定MIH釉质中主要的蛋白质组成,将SDS-PAGE条带进行蛋白质组学分析。如图3和表1所示,鉴定了不同种类的蛋白质(16个不同基因产物),其中13个在唾液和龈沟液中被发现。其余3个(血红蛋白,白蛋白,补体C3)为血液中的主要成分。因此,在MIH牙釉质中鉴定的所有主要蛋白质均通常与口腔内发现的体液相关。
表1在具有完整表面的MIH牙釉质(试样1至6)和具有长牙后受损表面的MIH牙釉质(试样7至11)中鉴别的蛋白质
完整的和受损的MIH病变具有区别的蛋白质谱图
考虑到MIH病变的临床多样性(颜色,稠度(consistency),尺寸,表面完整性),研究了不同表征是否具有区别的蛋白质组成。蛋白质谱图的评价(图2A)得出牙釉质表面的完整性对其有主要影响的假设。特别的,当病变以“完整的”和“受损的”来分组时,蛋白质带型在每一组中表现出定性(qualitatively)的相似,但在不同组之间表现出两个显著地不同之处(图2A,12-kDa和66-kDa区域)。明显受损但不是完全病变的12-kDa带,通常含有血红蛋白作为主要成分(图3)。相反地,在完全病变的66-kDa带中,通常只含有白蛋白,这与受损病变中极少地低水平地发现白蛋白不同。
蛋白质谱的稳定性也被质疑,提示蛋白质的降解的证据(图3:白蛋白,补体C3),以及蛋白质水解在牙釉质成熟中的关键作用。事实上,当在冷冻储存后重新分析图2A中SDS可溶的试样时,白蛋白带从完整试样中完全消失(图2C)。然而受损试样则大部分不受影响(未图示)。当在初始的SDS-溶液化步骤添加的蛋白酶抑制剂时,对新鲜的MIH试样的蛋白质谱几乎没有影响(未图示)。这些结果强调了人为的蛋白质水解的风险,因此仅报道了首轮实验试样(图1-3)。结论为完整和受损病变始终具有区别的蛋白质谱,这支持了表面完整性会影响MIH釉质中的蛋白质组分的假设。随表面完整性的不同MIH釉质中的蛋白质成分不同
已知MIH病变表现为表面下多孔性,并且白蛋白和血红蛋白易于与羟基磷灰石结合。因此,假设口腔液体蛋白质渗透进MIH釉质并选择性的与羟基磷灰石晶体结合,并缺少完整表面层。当受损病变与唾液、血清和红细胞相比较时,可以发现蛋白质带型有共同的相似之处(图4A)。相反的,完全病变仅与血清有相似性。这些结果符合体液蛋白被完全病变排除,但不被受损病变排除。接着,受损病变被模拟通过暴露羟基磷灰石粉末到口腔液体(唾液、血清和红细胞提取物的组合)。与羟基磷灰石结合部分的蛋白质谱(图4B)显示出与受损病变显著的相似性(图2A,4A)。当羟基磷灰石被来自完全病变的牙釉质粉代替时(即为了模拟表面层的损伤),蛋白质谱再一次与受损病变相似(图4C)。这些结果表明MIH釉质中的蛋白质组成受到釉质表面完整性的强烈的影响。
当将包含的白蛋白和血红蛋白的模拟口腔液体应用于羟基磷灰石时,白蛋白和血红蛋白结合到羟基磷灰石(图5)。使用5mMMgCl2,1MMgCl2,和0.4MNaH2PO4相继的进行冲洗,每一步5分钟,以从羟基磷灰石上去除>90%的蛋白质(图5)。
讨论
考虑到世界范围内对MIH不断增长的关注,存在阐明低矿化牙釉质的蛋白质组成的迫切需要。本文揭示了MIH牙釉质具有比正常釉质明显较高的蛋白质含量,但是残留的牙釉蛋白与正常水平相近。这一特征使MIH区别于具有高牙釉蛋白残留量的低成熟缺陷(釉质发育不全,氟中毒),因而将MIH划分为一种低钙化缺陷。其次,发现MIH牙釉质累计多种来自口腔液体和血液的蛋白质,并基于釉质表面的完整性的不同而具有不同的组合。从病理学来讲,这些结果表明长牙前的损伤涉及白蛋白矿化紊乱,并且,对于长牙后的损伤的情况,随后的蛋白质吸收至暴露的羟基磷灰石基质上。这些对于MIH牙釉质的发病机理和性质的观点对预防、诊断和治疗MIH具有重要意义。
这些结果帮助说明了MIH釉质的临床性质和生物物理性质。测定的3倍至15倍的蛋白质含量的升高与釉质发育不全和氟中毒(2.5倍至30倍)类似,并显示出足以解释MIH牙釉质的典型性机械弱点。残留的牙釉蛋白的低含量与MIH釉质相比为釉质发育不全的低钙化类型。后一疾病的牙釉质临床上描述为显著地比正常更软,而且易碎或劣质的,这与MIH釉质的描述相符。在蛋白质水平上,MIH釉质显示为不同于釉质发育不全和氟中毒的低钙化类型,尤其是基于其独特的白蛋白的高浓度。然而,所有的情况表征为多孔羟基磷灰石。
这些结果也阐明了MIH的发病机理,表明长牙阶段之前和之后在机理上是有区别的。长牙前,MIH釉质正常的厚度和低牙釉蛋白含量(<0.2%分泌相水平)表明牙釉蛋白分泌而随后被有效去除。因此,MIH主要不是成熟缺陷。类似的,对于低钙化的釉质发育不全的注意力转向矿化作用有缺陷的初期阶段。蛋白质谱表明尽管几乎完全去除了血红蛋白,白蛋白在MIH釉质中积累。
也就是说,低钙化是低矿化的一种亚型,另一种亚型为低成熟。如此处所述,MIH和一些牙釉质发育不全的类型,可能还有一些氟中毒的类型由于具有低含量的牙釉蛋白,它们以低钙化缺陷来识别。也就是,进行了去除牙釉蛋白的正常过程(釉质成熟),而未进行钙化过程。然而在低成熟缺陷中(釉质发育不全的不成熟类型和氟中毒),去除牙釉蛋白(釉质成熟)并未进行至成年人的水平,并随后产生了阻碍钙化的牙釉蛋白。
在DDD/低矿化中的低钙化类型中,牙釉蛋白水平相对较低,但与在DDD/低矿化中的低成熟类型(例如釉质发育不全的一些类型和牙齿氟中毒)的正常水平接近。因此,此处与多孔牙齿羟基磷灰石结合的牙釉蛋白和残留蛋白质水平的不同可以分别或组合起来进行说明(例如诊断),例如以比例的形式。
这些结果第一次证明了渗出的白蛋白在畸形的人类釉质中积累。特别的,发现完全病变包含白蛋白但不包含大量的口腔液体蛋白质,这些蛋白质是已证明能与羟基磷灰石结合的蛋白质。上述白蛋白而不是血红蛋白主要是归因于血清的小血管渗漏而不是全血的小血管渗漏,或归因于在牙釉质成熟过程中,相对于血红蛋白和其他血液蛋白质高的白蛋白的蛋白水解稳定性。事实上,白蛋白抵抗激肽释放酶有关的肽酶4,其是涉及牙釉蛋白的去除的主要的蛋白酶。
这些结果也意味着长牙后牙釉质表面的损伤之后的另一个致病步骤。该第二步骤包括口腔液体蛋白质和暴露的羟基磷灰石基质相对混杂的结合。
此处鉴定的蛋白质具有作为生物标记的潜在实用性,其可用于临床上表征MIH病变。
实施例2-用于多孔羟基磷灰石探针的制备与测试
材料与方法
SMCC(琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯;CAS#:64987-85-5)是一种不可分裂的异型双功能交联剂,具有被间隔臂反应性地分开的胺和巯基。氨基黑(CAS#:1064-48-8)是一种通用的蓝/黑染料,此处作为包含伯胺基团的显色报告物。来自母牛的血红蛋白(CAS#:9008-02-0)包括2对多肽链(α和β;分别为:SEQIDNO20和SEQIDNO21)的异四聚体。β链具有单一溶剂暴露的包含巯基的半胱氨酸残基,而α链没有半胱氨酸。
SMCC(在二甲基亚砜中75mM)加入到9体积的氨基黑中(在磷酸盐缓冲盐水(PBS,137mMNaCl,2.7mMKCl,10mM磷酸氢二钠,pH7.4)中37.5mM))并在21℃下培养30分钟。5倍臼齿过量的氨基黑确保SMCC的最大标记量(制备马来酰亚胺显色激活显色报告物,图27)。结合之后,溶剂真空离心干燥,并在-80℃储存。
制备血红蛋白(20mg/ml;0.65μmole半胱氨酸-硫醇/ml),通过将其溶于PBS,其中PBS含有10mMTCEP(三(2-羧乙基)磷酸酯,一种非硫醇还原剂用于维持胱氨酸-巯基状态)和5mMEDTA(乙二胺四乙酸,一种金属螯合剂用于降低氧化/自由基催化作用以及随后的硫醇氧化的可能性)。在21℃下培养30分钟后,还原的血红蛋白从1000体积的PBS中透析2小时,以使TCEP和EDTA消耗尽(这一步骤是可选的)。血红蛋白立即进入下一步骤以使半胱氨酸-硫醇氧化作用最小化。
将干燥的马来酰亚胺激活氨基黑溶于血红蛋白,以氨基黑:硫醇摩尔比为10:1的比例,以确保血红蛋白的最大标记量。在21℃下培养2小时后,结合了氨基黑的血红蛋白从PBS彻底透析(直到透析液保持无色对于1ml透析液需要24至48小时),以去除非共价结合的氨基黑。透析之后,准备使用探针。
结果
应用探针5分钟内,羟基磷灰石的颜色从白色变化到深蓝色(图29)。探针能承受水冲洗,但只有氨基黑(即未与Hb相连的)被水冲洗去除。通过三步冲洗程序从羟基磷灰石去除探针,所述三步冲洗程序包括相继使用5mMMgCl2,1MMgCl2,和0.4MNaH2PO4进行冲洗,其中每一步冲洗5分钟(图29)。
讨论
一个关键的设计需求为在与显色报告物结合之后,保留血红蛋白与羟基磷灰石结合能力。血红蛋白的半胱氨酸-硫醇被靶向是由于四个蛋白质亚基中的两个具有一个半胱氨酸(不是结合界面);另外两个亚基缺少半胱氨酸。因此最后的四聚物探针包括两个未修饰的蛋白质亚基,从而维持了每一功能单元中至少一半原有的羟基磷灰石结合部位。举例说明二步法:首先制备显色报告物-SMCC结合物(conjugate)(图27),其次使用显色报告物-SMCC结合物来标记血红蛋白(图28)。此处建立的原理是为了用于检测多孔羟基磷灰石的新型探针的设计、生产和测试。
实施例3-特异性地与多孔牙釉质结合的探针(图30)
方法
为了测试实施例2中的探针是否特异性与多孔牙釉质结合,将一种复杂(complex)的龋齿病变覆盖上探针,然后彻底冲洗。
在应用探针之前和之后,对具有大片龋病(多孔釉质,白色不透明区域)的人类第一臼齿进行拍摄(图30)。使用刷子将探针应用与整个牙冠区域时长1分钟。应用探针后,牙齿在流动水下冲洗10秒,拍照,然后再次冲洗牙齿2分钟,并拍照。
结果
正常牙釉质不被标记。
明显的龋病区域被特异性地和明显地标记,但标记是在一些地方没有(patchy)的。未标记的龋病区域显示出抵抗划伤的亮的表面,而标记区域具有容易被划伤的暗表面。这说明这些未标记龋病区域可能是由于表面层的重矿化作用。因此,探针能够区分活跃和不活跃龋病。
在牙齿抽提过程的牙釉质受损区域(钳子的痕迹)也被标记,这说明探针能够检测具有破坏表面的牙釉质区域。
探针提供稳定水平的标记,其与水冲洗时间无关。
实施例4-探针能够特异性地检测牙釉质表面的早期脱矿化(初期龋病模型)(图31)
方法
为了测试实施例2中的探针是否能够特异性地检测早期龋病,使用强酸斑点在正常牙釉质表面制造了人工龋病病变(在应用探针之前)。
在应用探针之前和之后,拍摄人类第一臼齿,其在酸处理之前无龋病(图31)。之后3个牙釉质区域暴露于酸(0.5μl85%H3PO4)1、3或10分钟以引入人工龋病病变,之后在100mlTBS中(25mM三羟甲基氨基甲烷pH7.2,160mMNaCl)冲洗两分钟,然后在流水下另外冲洗2分钟。将牙齿空气干燥,并用刷子将探针应用于整个区域3分钟。应用之后,未结合的探针首先用吸水纸擦拭去除,然后在流水下冲洗10秒。为了去除结合的探针,用刷子应用10%漂白剂(0.4%NaClO)10秒。
结果
探针未与无龋病的任何牙釉质区域结合。
酸蚀刻处理生产出3个轻微不反光/暗的牙釉质区域,这导致一个剂量依赖严重的蛋白质谱(10>3>1分钟)。上述3个蚀刻区域均被探针检测到,以一种严重依赖的方式;未蚀刻牙釉质区域不被标记。
尽管信号强度轻微减弱,探针的结合能够抵抗水冲。通过应用10%漂白剂10秒,探针可以被定量去除。
实施例5-探针的作用机理为羟基磷灰石亲和性。(图32)
实施例4中的牙釉质(图31)使用实施例2中的探针再处理,用以证实羟基磷灰石结合机理。
方法(A)
为了排除蛋白质染色机理的可能性,将探针应用于漂白剂处理过的蚀刻的牙釉质(即脱蛋白质的)。
结果(A)
类似于未漂白牙釉质,漂白牙釉质用探针标记(图32,对照板A2和A4)。这一发现针对蚀刻牙釉质的探针标记排除了蛋白质染色机理。
方法(B)
提出如果探针的反应机理为羟基磷灰石结合,那么BSA预处理应该阻止探针的结合(竞争性抑制作用)。
通过应用刷子1分钟将来自板A的牙釉质暴露于已知的羟基磷灰石结合蛋白质下(10%牛血清白蛋白(bovineserumalbu分钟),BSA),再用水冲洗1分钟。在BSA处理之后,探针像之前那样应用。BSA通过漂白剂处理脱除,然后再应用探针。
结果(B)
BSA的应用没有改变牙釉质的外观(图32,板B2)。BSA阻止探针的结合(图32,板B3)。探针的结合在脱除BSA后被修复(图32,板B6)。这些结果共同说明了探针的作用机理是羟基磷灰石结合,而不是蛋白质结合。考虑到其他羟基磷灰石结合蛋白质的竞争性抑制的可能性,脱除蛋白质的预处理能够提高探针的敏感性,并使假阴性结果最小化。
实施例6-特异性地标记低矿化釉质和异常牙本质的探针(图33)
方法
为了测试实施例2中的探针是否能用于划界异常牙本质组织,使用探针处理含有正常和异常牙釉质和牙本质的牙齿部分。
选择表现出表面下低矿化区域的破损的牙齿来模拟临床上的疑难案件,其病变界限是模糊的和复杂的。短暂的预曝光于探针使得牙釉质-牙本质界限划分。然后在使用刷子应用探针30秒之前(左)和之后(右),对试样进行拍照(图33)。应用之后,未结合的探针通过在水中冲洗30秒被去除。
结果
在应用探针之前,可识别下述结构:(1)覆盖的正常釉质(2)低矿化釉质(在一些区域是具有红色边界的粉红色),(3)表面上正常的牙本质(硬的)和(4)异常牙本质(软的/韧的(leathery))。在应用探针之后,所有四种组织能被容易的识别。
正常牙釉质和牙本质未被标记。低矿化釉质被均匀地且特异性地标记为强烈的紫色,其似乎描绘出了贯穿表面下区域的非常的复杂的边界。异常牙本质(可能由于龋病和/或发育的缺陷)被特异性地且均匀地标记为深绿色,其描绘出相对于正常牙本质的复杂边界。这些数据共同证实了探针能够特异性地标记低矿化牙釉质和异常牙本质。
实施例7-探针能够用于引导低矿化釉质的去除(图34)
方法
使用解剖刀去除实施例6中的低矿化牙釉质(图33),并用实施例2中的探针反复标记来监控进程。记录每一步骤中的牙釉质的物理性质(图34,参见板(panel)下方的描述)。
结果
图34中的上板显示去除了低矿化牙釉质之后的试样,而下板显示应用探针后的同一试样。板1-3显示小块区域的低矿化牙釉质的逐渐去除。板4-6显示整个区域的去除未遂(attemptedremoval),和未完成去除的区域(上图和下图比较)。应注意,随着低矿化牙釉质被去除,物理性质与标记程度同时明显变化,直到终点,残留的牙釉质物理上均一,并没有被探针显色(板6)。
本实施例中未处理异常牙本质。
实施例8-探针能够用于引导异常牙本质的去除(图35)
方法
使用解剖刀去除实施例6中的异常牙本质(图33),并用实施例2中的探针反复标记来监控去除进程。记录每一步骤中的牙本质的物理性质(图35,参见板下方的描述)。
结果
图35中的上板显示去除了异常牙本质之后的试样,而下图显示应用探针后的同一试样。板1显示随着去除和重新探针检测,异常牙本质的强烈染色急剧减少(例如下面的板1和2对比)。探针标记的减少水平与牙本质提高的物理特性有关(例如在板4中牙本质硬度通过物理测试为一致的正常,并且在应用探针后大部分未被染色)。即使异常牙本质完全去除之后也做记录,低水平的背景显色是明显的(假定是由于相对于釉质,牙本质有更高的孔隙度)。
实施例9-通过探针检测异常牙本质能够通过使用漂白剂冲洗而改进(图36)
方法
为了测试探针对于牙本质的特异性,如实施例8所示,是否能改进,使用漂白剂来减少正常牙本质的染色。
将具有暴露的正常和异常牙本质的人类臼齿暴露于实施例2中的探针中(应用刷子1分钟后水冲洗1分钟)并继而暴露于漂白剂冲洗(使用刷子10秒,然后水冲1分钟)。接着应用探针/漂白剂,使用解剖刀去除标记区域然后再次应用探针/漂白剂用以监测进程(图36)。
结果
通过探针,优先检测到异常牙本质,然而正常牙本质的背景染色随边界的划分而减退。应用10%漂白剂(0.4%NaOCl)10秒,通过减少正常牙本质的标记而不减少异常牙本质的标记的方式,提高分辨率。应用10%未掺水的漂白剂(0.4%NaOCl)10秒,从正常牙本质中完全去除标记,而不影响异常牙本质的标记,这使得异常牙本质的划界更加清晰。
在未掺水的漂白剂之后,异常牙本质被去除(板4),然后再次应用探针/漂白剂(板5),显示大部分但非全部的异常牙本质被去除。再次的去除/再次使用探针/漂白步骤显示异常牙本质全部去除。残留的牙本质在物理上与正常牙本质不能区别。
这些结果共同说明应用探针后的蛋白质脱除步骤能有助于减少正常牙本质的背景标记,这减少了可能的假阳性读数。
实施例10-探针是X射线不透过(图37)
方法
通过用5-氨基-2,4,6-三吲哚间苯二甲酸(3I)取代实施例2中的蓝色发色团(氨基黑),将探针制备成射线不透过的,3I为一种用于医学X射线摄影术的前体化合物(例如用于脑血管造影术)。选择这种化合物是由于单一伯胺的可用性,其可以与蓝色探针中使用的相同的交联剂偶联。
为了将3I与血红蛋白偶联,使用以下过程:
1、将1.25mgSMCC(交联剂)溶于50μlDMSO(75mMSMCC)。
2、3I按如下方法制备:30mg溶于1ml0.1MNaOH(50mM3I),加入250μl0.1MHEPESpH7.0,然后用1μl5MNaOH添加剂调整pH至7;以使最终的溶液为40mM3I,20mMHEPESpH7。
3、400μl3I被加入到50μl75mMSMCC在DMSO中,并在室温下培养30分钟以生成3I-活性的SMCC。
4、然后将3I-SMCC通过真空离心冻干。
5、将最终的沉淀从20μlDMSO中收起,并加入100μl20mg/ml血红蛋白,然后溶液中在室温下培养60分钟,使3I与血红蛋白中的半胱氨酸硫醇偶联。
6、然后将生成物3I-Hb离心(20,000xg,5分钟),然后用25mM三羟甲基氨基甲烷pH7.2,160mMNaCl,过夜透析(10-kDaMWCO)。
7、收集生成的透析液并在-20℃下储存。
为了评价赋予探针的射线不透过性的程度,将探针用X射线照射(65kV,8mA,0.5秒曝光)依照射线不透过标准(1和10mM3I)。
结果
X射线探针射线不透过的程度在1和10mM3I之间(图37)。密度分析说明射线不透过性相当于与1.5–2.5mM的3I溶液。这些结果证实了探针能够制成对X射线不透过的。
实施例11-使用纯羟基磷灰石的冲洗液的分析(图38)
方法
为了检验每种冲洗液的相对效果,使用体外模型体系对它们进行分别检测(图38)。
在室温伴随持续震荡情况下在纯羟基磷灰石(5mg)上装载来自大鼠血液的蛋白质(100μl的10mMTris,pH7.2,其含有10μlHb提取物和2μl未掺水血清)10分钟。通过在2,000xg下离心30分钟,将装载蛋白质的羟基磷灰石进行沉淀,舍弃上清液,沉淀用300μl10mMTrispH7.2冲洗30秒,以去除未未结合的填隙(interstitial)成分。
然后在室温下,将蛋白质-羟基磷灰石暴露于100μl不同冲洗成分(水,5mMMgCl2,1MMgCl2或0.4MNaH2PO4)2分钟,混合后离心。收集洗涤废水,并且用同样的冲洗液再冲洗蛋白质-羟基磷灰石两次。在3个冲洗步骤之后,将蛋白质-羟基磷灰石溶于100μl10%三氟乙酸(TFA)中,然后通过离心(2,000xg,2分钟)收集沉淀的蛋白质,并将离心沉淀溶于100μl的2XSoB(0.125M三羟甲基氨基甲烷-HCl(Tris-HCl)pH6.8,4%SDS,20%甘油)。通过使用氨基黑染色的斑点印记密度测定法,对所有片段的蛋白质含量进行评测。
结果
冲洗液从羟基磷灰石中去除蛋白质的相对能力为:
0.4MPO4>1MMg2+>5mMMg2+(没有比水更有效的)。
尽管PO4表面上提供了最好的蛋白质去除效果,应注意甚至在冲洗3次后,羟基磷灰石仍然为粉红色,而1MMg2+-处理的羟基磷灰石在冲洗一次后变成白色。鉴于此,看起来1MMgCl2和0.4MNaH2PO4在去除蛋白质上是最有效的,并且它们具有互补的活性(可能为去除不同种类的蛋白质)。
实施例12-使用纯羟基磷灰石单独或相继分析Mg2+和PO4(图39)
方法
将蛋白质装载至纯羟基磷灰石,然后进行100μl的不同冲洗成分的冲洗(水,1MMgCl2或0.4MNaH2PO4),除了两步冲洗(不是三步)和省略了5mMMgCl2冲洗之外,如实施例11那样冲洗。用一个管接收1MMg2+,随后是0.4MPO4。冲洗之后,羟基磷灰石沉淀被拍照用以记录颜色(参见插图(inset)),然后如实施例11那样对蛋白质含量进行评测。
结果
所有3种冲洗溶液作为相似,与水不同,在两步冲洗之后可以去除大部分的蛋白质(图39)。
基于蛋白质去除和颜色去除评测,使用Mg2+而后PO4相继冲洗产生最好的结果(插图:箭头表示冲洗后的羟基磷灰石沉淀)。可以得出结论,在此羟基磷灰石模型中,Mg2+和PO4相继冲洗提供了最优的蛋白质去除效果。
实施例13-使用纯羟基磷灰石结合的分析Mg2+加PO4冲洗(图40)
方法
将蛋白质装载到纯羟基磷灰石,然后进行100μl的组合冲洗(1MMgCl2,0.4MNaH2PO4),如实施例11那样冲洗3次。如实施例11那样评测蛋白质含量。将实施例13的结果的记录(图40)进行绘图,实施例12数据列在一侧作为对照。
结果
组合冲洗与PO4单独使用作用类似,而羟基磷灰石在第一次冲洗(与1MMg2+单独使用类似)后变成白色,这说明每一种冲洗成分的活性都被保留。可以得出结论,在达到蛋白质去除目的所需时间方面,组合冲洗更有效。
实施例14-冲洗液对低矿化釉质起作用,尽管相对于羟基磷灰石模型效果降低(图41)
方法
分别收集来自完整和受损病变的低矿化釉质,以使对于每一病变类型的3管5mg粉末可用。牙釉质暴露于100μl的5mMMg2+,1MMg2+,5分钟,然后暴露于0.4MPO45分钟。然后如实施例11至13中处理纯羟基磷灰石那样处理试样。
结果
使用冲洗液对低矿化釉质的处理去除了大量的蛋白质(~1/4–1/3),而水几乎无效(图41)。去除的蛋白质的量少于羟基磷灰石模型可见的量,这可能是由于较慢的解离速率。
实施例15-冲洗液能从低矿化釉质中定量去除蛋白质(图42)
方法
收集来自完全病变的低矿化牙釉质,以使以使3管5mg可用。釉质暴露于1ml的1MMg2+下7小时,然后再暴露于1ml0.4MPO4下16小时。然后如实施例11至13中处理纯羟基磷灰石那样处理试样。
结果
在使用冲洗液冲洗另外2次后,蛋白质从低矿化牙釉质中定量去除(图42B)。而经过相同时间段(timeframe)的水处理几乎没有效果。PO4冲洗具有最优效果,可能是由于这中特殊病变的蛋白质谱(主要为白蛋白,图42A)。虽然这一时间段可能比合适的更长,但冲洗液能够从临床试样上去除所有的蛋白质。
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Claims (23)
1.一种用于检测多孔牙齿羟基磷灰石的探针,包括:(a)与多孔牙齿羟基磷灰石特异性结合的蛋白质,所述蛋白质选自以下群组:血清白蛋白、补体C3β链、α-1-抗胰蛋白酶、蛋白S100-A9、乳运铁蛋白、白细胞弹性蛋白酶抑制剂、抗凝血酶-III、血红蛋白α亚基、血红蛋白β亚基、血红蛋白δ亚基、催乳素诱导蛋白、α-淀粉酶1、Igκ链V-III区SIE、Igα-2链C区、非典型蛋白c6或f58、丝氨酸蛋白酶抑制剂B3、和牙釉蛋白;以及(b)特异性结合到或连接到所述蛋白质并且目测可见的显色报告物。
2.根据权利要求1所述的探针,其中所述蛋白质为血红蛋白α亚基、血红蛋白β亚基、血红蛋白δ亚基。
3.根据权利要求1所述的探针,其中所述显色报告物为氨基黑。
4.根据权利要求1所述的探针,还包括连接物,所述连接物用于将所述报告物连接到所述蛋白质。
5.根据权利要求4所述的探针,其中所述连接物为交联剂。
6.根据权利要求4所述的探针,其中所述连接物为异型双功能交联剂。
7.根据权利要求6所述的探针,其中所述异型双功能交联剂为琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)。
8.一种用于检测多孔牙齿羟基磷灰石的试剂盒,包括权利要求1所述的探针。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,还包括(a)一种或多种冲洗液或(b)一种或多种干组分,其与水混合用于制备一种或多种冲洗液,其中所述一种或多种冲洗液适用于去除与多孔牙齿羟基磷灰石特异性结合的蛋白质。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其中所述一种或多种冲洗液含有镁离子,磷酸二氢根离子,磷酸一氢根离子,磷酸根离子,次氯酸根离子或其混合物。
11.根据权利要求9所述的试剂盒,其中所述一种或多种冲洗液含有氯化镁和/或磷酸二氢钠。
12.根据权利要求9所述的试剂盒,其中所述一种或多种冲洗液含有1M氯化镁和/或0.4M磷酸二氢钠。
13.根据权利要求8所述的试剂盒,还包括重矿化剂或矫正矿化剂。
14.根据权利要求13所述的试剂盒,其中所述重矿化剂或矫正矿化剂包括氟化物、可溶性磷酸钙、或无定形磷酸钙。
15.根据权利要求9所述的试剂盒,其中所去除的蛋白质选自以下群组:血清白蛋白、补体C3β链、α-1-抗胰蛋白酶、蛋白S100-A9、乳运铁蛋白、白细胞弹性蛋白酶抑制剂、抗凝血酶-III、血红蛋白α亚基、血红蛋白β亚基、血红蛋白δ亚基、催乳素诱导蛋白、α-淀粉酶1、Igκ链V-III区SIE、Igα-2链C区、非典型蛋白c6或f58、丝氨酸蛋白酶抑制剂B3、和牙釉蛋白。
16.根据权利要求8所述的试剂盒,还包括渗透剂。
17.(a)与多孔牙齿羟基磷灰石特异性结合的蛋白质,所述蛋白质选自以下群组:血清白蛋白、补体C3β链、α-1-抗胰蛋白酶、蛋白S100-A9、乳运铁蛋白、白细胞弹性蛋白酶抑制剂、抗凝血酶-III、血红蛋白α亚基、血红蛋白β亚基、血红蛋白δ亚基、催乳素诱导蛋白、α-淀粉酶1、Igκ链V-III区SIE、Igα-2链C区、非典型蛋白c6或f58、丝氨酸蛋白酶抑制剂B3、和牙釉蛋白,和(b)特异性结合到或连接到所述蛋白质并且目测可见的显色报告物,在制备用于检测多孔牙齿羟基磷灰石的探针中的应用。
18.根据权利要求17所述的应用,其中所述蛋白质为血红蛋白α亚基、血红蛋白β亚基、血红蛋白δ亚基。
19.根据权利要求17所述的应用,其中所述显色报告物为氨基黑。
20.根据权利要求17所述的应用,所述蛋白质与所述报告物通过连接物连接。
21.根据权利要求20所述的应用,其中所述连接物为交联剂。
22.根据权利要求20所述的应用,其中所述连接物为异型双功能交联剂。
23.根据权利要求22所述的应用,其中所述异型双功能交联剂为琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)。
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