CN105181422B - 一种口腔粘膜的良性病损排查与恶性病变检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
一种口腔粘膜的良性病损排查与恶性病变检测试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种口腔粘膜的良性病损排查与恶性病变检测试剂盒及其检测方法，检测方法步骤如下：（1）．口腔检查，记录病变的详细情况；（2）．用洁净水漱口，去除食物残屑；（3）．取预检试剂含漱1~5分钟；（4）．用棉签蘸取检示试剂1涂擦于病变局部，染色2~10分钟；（5）．取检示试剂2含漱1~5分钟；（6）．对比比色板或自体激发荧光检测仪器进行半定量或定量评价染色结果。该试剂盒可用于口腔粘膜的良性病损与恶性病变的辅助鉴别诊断，辅助临床医师早期诊断口腔癌及监测口腔癌前病变恶变过程。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测装置试剂盒，尤其涉及一种口腔粘膜的良性病损排查与恶性病变检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
口腔癌是指发生于口腔的恶性肿瘤，包括唇癌、牙龈癌，舌癌，软硬腭癌、颌骨癌，口底癌、口咽癌、涎腺癌和上颌窦癌以及发生于颜面部皮肤粘膜的癌症等，口腔癌是头颈部较常见的恶性肿瘤之一目前用于口腔癌和癌前病变的诊断技术有二类：
1、创伤性技术：即组织病理方法，需切除患者病变组织，然后切片在显微镜下观察组织病变情况。该方法直接，准确，但因具创伤性，有促进转移的可能性，且口腔病损组织小，取样和切片时可能因部位偏差出现假阴性，故此法不易为病人早期介绍，而影响早期诊断。
2、非创伤性技术：
脱落细胞检查法：优点为非创伤性技术，易被患者接受，但此法假阳性结果可达37％。
发明内容
本发明针对背景技术中存在的问题提供了一种口腔粘膜的良性病损排查与恶性病变检测试剂盒。
其具体技术方案如下：
一种口腔粘膜的良性病损排查与恶性病变检测试剂盒，其特征在于：本试剂盒包括以下组分：
(1)预检试剂：包括以下原料：摩尔浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液和以下质量百分比浓度的原料：山梨酸钾0.1～1％，牛血清白蛋白0.01～0.5％，余量为水；
(2)检示试剂1:包括以下原料：摩尔浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液和以下质量百分比浓度的原料：碳酸氢钠1～5％、山梨酸钾0.1～1％、牛血清白蛋白0.01～0.5％、孟加拉红0.1％～5％、十二烷基硫酸钠0.01～0.5％及5-氨基酮戊酸0.01～0.5％，余量为水；
(3)检示试剂2：包括以下质量百分比浓度的原料：碳酸氢钠1～5％、山梨酸钾0.1～1％，余量为水。
所述磷酸盐缓冲液为0.01M，配制方法如下：
称7.9g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4和1.8g K2HPO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加去离子水定容至1L，保存于4℃冰箱中备用。
所述预检试剂的配制方法为：在温度为0～4℃条件下配制磷酸盐缓冲液，再向配制完成的磷酸盐缓冲液中依次加入山梨酸钾、牛血清白蛋白，最后用去离子水定容，在摇床上充分混匀2～12小时即可。
所述检示试剂1的配制方法为：在温度为0～4℃条件下配制磷酸盐缓冲液，再依次加入山梨酸钾、碳酸氢钠、牛血清白蛋白、孟加拉红、十二烷基硫酸钠及5-氨基酮戊酸，最后用去离子水定容，在摇床上充分混匀2～12小时即可。
所述检示试剂2的配制方法为：先配制1～5％碳酸氢钠溶液，再依次加入山梨酸钾，最后用去离子水定容，在摇床上充分混匀2～12小时即可。
上述预检试剂1和预检试剂2中磷酸盐缓冲液分别作为预检试剂溶剂和检示试剂溶剂，山梨酸钾用于试剂防腐，十二烷基硫酸钠用于增强试剂荧光效应，5-氨基酮戊酸为光敏剂，用于增加试剂渗透性，牛血清白蛋白为酶稳定剂，用于防止试剂成分被生物酶降解，碳酸氢钠用于调节试剂溶液PH值。
本发明试剂盒需避光，且在-18摄氏度～室温条件下保存。
本发明还提供一种利用上述试剂盒检测口腔粘膜的良性病损与恶性病变的方法，步骤如下：
(1).口腔检查，记录病变的详细情况；
(2).用洁净水漱口，去除食物残屑；
(3).取预检试剂含漱1～5分钟；
(4).用棉签蘸取检示试剂1涂擦于病变局部，染色2～10分钟；
(5).取检示试剂2含漱1～5分钟；
(6).对比比色板或自体激发荧光检测仪器进行半定量或定量评价染色结果。
所述对比比色板上由浅至深设置有a、b、c、d四个色相，其制备方法如下：分别配置a1、b1、c1、d1四种溶液，然后a1、b1、c1、d1四种溶液中分别浸泡滤纸，待滤纸染色完全后，拿出晾干，置于同一载体上即得。
所述a1、b1、c1、d1四种溶液的成分与检示试剂1的成分一致，其中a1中各溶质的浓度为检示试剂1的十分之一，b1中各溶质的浓度为检示试剂1的四分之一，c1中各溶质的浓度为检示试剂1的二分之一，d1中各溶质的浓度为检示试剂1的四分之三。
该试剂盒可用于口腔粘膜的良性病损与恶性病变的辅助鉴别诊断，辅助临床医师早期诊断口腔癌及监测口腔癌前病变恶变。
本试剂盒RB试剂为独有配方，历经多年的研究与改进，配伍合理，特异性高，因为孟加拉红直接与肿瘤细胞的DNA多聚酶特异性结合，敏感性强，对比比色板或自体激发荧光检测仪器通过定量和半定量评价染色结果，使结果更精准，精确度更高，在临床使用中发现，使口腔病损区域着色迅速且不易脱落，与周围正常组织着色程度差异明显。同时，本试剂盒还增置了对比比色板或自体激发荧光检测仪器进行半定量或定量评价染色结果，使着色结果的评判更加客观。
附图说明
图1为利用本试剂盒进行口腔检测的案例图。
图2为检测本发明染色结果的荧光光谱诊断系统示意图；
图3为检测组织的自发荧光和利用本发明染色的荧光强度光谱图。
具体实施方式
实施例1
(1).口腔检查，记录病变的详细情况；
(2).用洁净水漱口，去除食物残屑；
(3).取预检试剂含漱1～5分钟；
(4).用棉签蘸取检示试剂1涂擦于病变局部，染色2～10分钟；
(5).取检示试剂2含漱1～5分钟；
(6).对比比色板或自体激发荧光检测仪器进行半定量或定量评价染色结果。
上述所述磷酸盐缓冲液为0.01M，配制方法如下：
在温度为0～4℃条件下，称7.9g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4和1.8g K2HPO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加去离子水定容至1L，保存于4℃冰箱中备用。
上述预检试剂的配制方法为：在温度为0～4℃条件下配制磷酸盐缓冲液，再向配制完成的磷酸盐缓冲液中依次加入山梨酸钾、牛血清白蛋白，最后用去离子水定容，在摇床上充分混匀2～12小时即可；其中0.01M的磷酸盐缓冲液中含有以下质量百分比浓度的山梨酸钾0.1％、牛血清白蛋白0.01％；
上述检示试剂1的配制方法为：在温度为0～4℃条件下配制磷酸盐缓冲液，再依次加入山梨酸钾、碳酸氢钠、牛血清白蛋白、孟加拉红、十二烷基硫酸钠及5-氨基酮戊酸，最后用去离子水定容，在摇床上充分混匀2～12小时即可，其中0.01M的磷酸盐缓冲液含有以下质量百分比浓度的碳酸氢钠0.1％、山梨酸钾0.1％、牛血清白蛋白0.01％、孟加拉红0.1％、十二烷基硫酸钠0.01％及5-氨基酮戊酸0.01％；上述检示试剂2的配制方法为：先配制1～5％碳酸氢钠溶液，再依次加入山梨酸钾，最后用去离子水定容，在摇床上充分混匀2～12小时即可，其中碳酸氢钠1％、山梨酸钾0.1％。
实施例2
(1).口腔检查，记录病变的详细情况；
(2).用洁净水漱口，去除食物残屑；
(3).取预检试剂含漱1～5分钟；
(4).用棉签蘸取检示试剂1涂擦于病变局部，染色2～10分钟；
(5).取检示试剂2含漱1～5分钟；
(6).对比比色板或自体激发荧光检测仪器进行半定量或定量评价染色结果。
上述所述磷酸盐缓冲液为0.01M，配制方法如下：
在温度为0～4℃条件下，称7.9g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4和1.8g K2HPO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加去离子水定容至1L，保存于4℃冰箱中备用；
上述预检试剂的配制方法为：在温度为0～4℃条件下配制磷酸盐缓冲液，再向配制完成的磷酸盐缓冲液中依次加入山梨酸钾、牛血清白蛋白，最后用去离子水定容，在摇床上充分混匀2～12小时即可；其中0.01M的磷酸盐缓冲液中含有以下质量百分比浓度的山梨酸钾1％、牛血清白蛋白0.5％；
上述检示试剂1的配制方法为：在温度为0～4℃条件下配制磷酸盐缓冲液，再依次加入山梨酸钾、碳酸氢钠、牛血清白蛋白、孟加拉红、十二烷基硫酸钠及5-氨基酮戊酸，最后用去离子水定容，在摇床上充分混匀2～12小时即可，其中0.01M的磷酸盐缓冲液含有以下质量百分比浓度的碳酸氢钠5％、山梨酸钾1％、牛血清白蛋白0.5％、孟加拉红5％、十二烷基硫酸钠0.5％及5-氨基酮戊酸0.5％；
上述检示试剂2的配制方法为：先配制1～5％碳酸氢钠溶液，再依次加入山梨酸钾，最后用去离子水定容，在摇床上充分混匀2～12小时即可，其中碳酸氢钠5％、山梨酸钾1％。
上述实施例中所述对比比色板上由浅至深设置有a、b、c、d四个色相，其制备方法如下：分别配置a1、b1、c1、d1四种溶液，然后a1、b1、c1、d1四种溶液中分别浸泡滤纸，待滤纸染色完全后，拿出晾干，置于同一载体上即得。
所述a1、b1、c1、d1四种溶液的成分与检示试剂1的成分一致，其中a1中各溶质的浓度为检示试剂1的十分之一，b1中各溶质的浓度为检示试剂1的四分之一，c1中各溶质的浓度为检示试剂1的二分之一，d1中各溶质的浓度为检示试剂1的四分之三。
实际操作中可以将配置好的检示试剂1拿出一部分，分为四分，分别加水稀释10倍、7.5倍、5倍、2.5倍，即可得到a1、b1、c1、d1四种溶液。
使用本试剂盒检测口腔疾病的案例的分析结果如下表：
表1－128病例基本情况
*16例中有1例为阳性对照病例
**18例中有3例为阳性对照病例
***2+2＝4例均为阴性对照病例
表2－128病例染色结果及病理诊断结果情况
*128例中共有28例口腔癌
**128例中共有5例轻度异常增生
表3－RB染色方法与临床视诊方法准确性4格表检验
表4－比色板色差情况
图2所示为荧光光谱诊断系统
基于蓝光诱导的高敏感荧光光谱检测系统用于口腔损害的诊断。该系统以405nm波长的二极管激光作为光源，并通过透镜将光束会聚成1.5～2.0mm的光斑。分色镜安放在反射光路径上用于反射405nm的蓝光，并允许其他波长的光通过。距离样本表面12mm的装置用于荧光光谱的获取。组织和荧光剂的荧光信号通过光纤被接收并通过电脑转化为光谱图显示于电脑上。
图3中Iauto：自发荧光；Istain：RB染色荧光光谱；Irb:组织RB荧光光谱，从(Istain－Iauto)中得出；Irbs:RB溶液光谱；
该系统诊断原理为，不同口腔病损口腔黏膜对RB具有不同的亲和力，从而使得其经405nm蓝光激发后，显示出不同的RB荧光光谱强度，并用RB因荧光光谱诊断参数k来表示。该诊断系统可以高敏感性地检测到这种不同口腔病损RB荧光光谱强度的特异性差异，从而实现对口腔病损的特异性诊断。
采用参数k用于量化结果，k表示为Irb/Iauto。Irb表示为RB荧光光谱大约580nm波峰处光谱曲线下的整体面积，它是标准化后RB染色荧光光谱与自发荧光光谱的差值。Iauto是自发荧光光谱580nm处整体荧光强度。荧光光谱特殊波峰的荧光强度的检测可以用于探测口腔癌生成阶段的生化改变。
该系统检测了RB染色光谱，它由两部分组成：自发荧光光谱和RB荧光光谱。染色后荧光强度反映了这两部分荧光的叠加，分别表现为520nm和580nm波峰处，通过从RB染色荧光中减去自发荧光，可以得到组织中580nm波峰处真实的RB染色荧光。通过荧光比值的方法，可以有效避免环境中的许多影响，比如光源的强度波动。基于这点，比值k(Irb/Iauto)有利于量化RB荧光诊断，且不同病理条件下，每个独立的检测点有不同的荧光光谱，因此具有独特的k值。因此，该系统可以在没有外界干扰的条件下，有效的量化区别受影响组织和正常组织之间RB的差异。
结果显示RB染色光谱在不同癌前阶段具有不同的荧光强度，并且4个癌前阶段的平均k值具有统计学差异。
因此，经本发明试剂盒染色的组织其荧光强度和敏感性明显提高，医护人员可通过RB荧光光谱用于区分癌前病损的不同阶段。
Claims (9)
1.一种口腔粘膜的良性病损排查与恶性病变检测试剂盒，其特征在于：本试剂盒包括以下组分：
（1）预检试剂：包括以下原料：摩尔浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液和以下质量百分比浓度的原料：山梨酸钾0.1~1%，牛血清白蛋白0.01~0.5%，余量为水；
（2）检示试剂1: 包括以下原料：摩尔浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液和以下质量百分比浓度的原料：碳酸氢钠1~5%、山梨酸钾0.1~1%、牛血清白蛋白0.01~0.5%、孟加拉红0.1%~5%、十二烷基硫酸钠0.01~0.5%及5-氨基酮戊酸0.01~0.5%，余量为水；
（3）检示试剂2：包括以下质量百分比浓度的原料：碳酸氢钠1~5%、山梨酸钾0.1~1%，余量为水。
2.如权利要求1所述的口腔粘膜的良性病损与恶性病变检测试剂盒，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液为0.01M，配制方法如下：
称7.9g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4和1.8g K2HPO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加去离子水定容至1L，保存于4℃冰箱中备用。
3.如权利要求1所述的口腔粘膜的良性病损与恶性病变检测试剂盒，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液为0.01M，配制方法如下：
称7.9g NaCl，0.2g KCl， 1.44g Na2HPO4和1.8g K2HPO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加去离子水定容至1L，保存于4℃冰箱中备用。
4.如权利要求1所述的口腔粘膜的良性病损与恶性病变检测试剂盒，其特征在于：所述预检试剂的配制方法为：在温度为0~4℃条件下配制磷酸盐缓冲液，再向配制完成的磷酸盐缓冲液中依次加入山梨酸钾、牛血清白蛋白，最后用去离子水定容，在摇床上充分混匀2~12小时即可。
5.如权利要求1所述的口腔粘膜的良性病损与恶性病变检测试剂盒，其特征在于：所述检示试剂1的配制方法为：在温度为0~4℃条件下配制磷酸盐缓冲液，再依次加入山梨酸钾、碳酸氢钠、牛血清白蛋白、孟加拉红、十二烷基硫酸钠及5-氨基酮戊酸，最后用去离子水定容，在摇床上充分混匀2~12小时即可。
6.如权利要求1所述的口腔粘膜的良性病损与恶性病变检测试剂盒，其特征在于：所述检示试剂2的配制方法为：先配制1~5%碳酸氢钠溶液，再依次加入山梨酸钾，最后用去离子水定容，在摇床上充分混匀2~12小时即可。
7.一种利用权利要求1所述试剂盒检测口腔粘膜的良性病损与恶性病变的方法，其特征在于：步骤如下：
（1）．口腔检查，记录病变的详细情况；
（2）．用洁净水漱口，去除食物残屑；
（3）．取预检试剂含漱1~5分钟；
（4）．用棉签蘸取检示试剂1涂擦于病变局部，染色2~10分钟；
（5）．取检示试剂2含漱1~5分钟；
（6）．对比比色板或自体激发荧光检测仪器进行半定量或定量评价染色结果。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述对比比色板上由浅至深设置有a、b、c、d四个色相，其制备方法如下：分别配置a1、b1、c1、d1四种溶液，然后a1、b1、c1、d1四种溶液中分别浸泡滤纸，待滤纸染色完全后，拿出晾干，置于同一载体上即得。
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述a1、b1、c1、d1四种溶液的成分与检示试剂1的成分一致，其中a1中各溶质的浓度为检示试剂1的十分之一，b1中各溶质的浓度为检示试剂1的四分之一，c1中各溶质的浓度为检示试剂1的二分之一，d1中各溶质的浓度为检示试剂1的四分之三。
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