BR112012023550B1 - kit e método para detectar hidroxiapatita porosa dental. - Google Patents

Abstract

kit e método para detectar hidroxiapatita porosa dental a presente invenção refere-se a um kit e uma sonda para a detecção de hidroxiapatita porosa dental, que compreende uma proteína capaz de se ligar à hidroxiapatita porosa dental, ou um detector da mesma. a invenção também se refere a um método para a detecção de uma condição que envolve a hidroxiapati ta porosa dental, que compreende a detecção, dentro, ou sobre um dente, ou de uma amostra do dente de um paciente, de uma proteína ligada à hidroxiapatita porosa dental. a invenção também se refere a métodos para a detecção de um defeito de desenvolvimento dental de hipominerali zação, ou a detecção de esmalte de hmi intacto e/ou quebrado, e a um kit, e um método para a remoção de proteínas ligadas à hidroxiapatita porosa dental.

Description

KIT E MÉTODO PARA DETECTAR HIDROXIAPATITA POROSA DENTAL

CAMPO

A invenção refere-se a um kit e uma sonda para a detecção de hidroxiapatita porosa dental e um métoào para a detecção de uma condição que envolve a hidroxiapatita

I porosa dental,. .

ANTECEDENTES i

A resiliência dos dentes depende de uma interação complexa entre componentes minerais (denominados i

hidroxiapatita) e componentes orgânicos (proteínas/ células e tecidos). Sob condições normais, a hidroxiapatita no esmalte e na dentina está organizada em uma estrutura i

extraordinariamente densa que confere a necessária dureza e tenacidade para manutenção da integridade do dente.^;A perda 15 de densidade mineral em esmalte e dentina resulta em hidroxiapatita anormalmente porosa, o que compromete a resiliência física do dente, e pode conduzir a uma falha estrutural. A hidroxiapatita porosa é causada por’ várias condições prevalentes, inclusive cárie dental e defeitos de

I desenvolvimento dental (DDD). ,

A cárie dental (cáries) é uma doença causada por i

bactérias que secretam ácido. O ácido produzido, pelas bactérias cariogênicas pode dissolver hidroxiapatitá em um processo denominado desmineralização. 0 processo inicial de 25 desmineralização (denominado cáries incipientes) conduz a regiões distintas de hidroxiapatita porosa, denominadas lesões de manchas brancas. Com o tempo, uma lesão de 'mancha branca pode progredir para uma cavidade (isto é, perda de material dos dentes), ou pode parar (as chamadas .cáries 30 inativas) e reformar um escudo de hidroxiapatita denso, em i

um processo chamado de remineralização. Antes da formação da cavidade, o processo é reversível (isto é,

2/68 remineralização), no entanto, uma vez que o esmalte é perdido não pode ser regenerado. i

I

A cárie é diagnosticada através de uma combinação de uma inspeção visual, desafio físico (por iexemplo, í raspagem com sonda dental), e radiografia por raios-X (para detectar cáries entre os dentes, ou por baixo da 'linha da l gengiva). De forma preocupante, estas abordagens de diagnóstico perdem aproximadamente metade das¹ cáries iniciais, e até 13% de dentes diagnosticados como cariados, i

com estes métodos, estão de fato, livres de _; cáries. Recentes tentativas de melhorar o diagnóstico iricluem a l utilização de um equipamento que mede a impedância elétrica, fluorescência induzida pela luz quantitativa (QLF), e fluorescência à laser infravermelho (DIAGNGdent®),

Ϊ mas nenhum deles têm encontrado ampla utilização, devido ao custo e tamanho do equipamento, e os problemas^ com a i variação interindividual. Outra abordagem tem |Sido a utilização de corantes para detectar cáries dentais em l

dentina. No entanto, estes corantes não são seletivos para hidroxiapatita porosa: eles se ligam a proteínas (presumese estar associada com bactérias infectantes em dentina), i

ou eles ocupam espaço intersticial, o que reduz a especificidade e sensibilidade . Além disso, estes córantes fazem com que a cavidade oral fique sem cor, ligam-se a dentes saudáveis, ou exigem visualização com um irradiador.

Existem dois principais tratamentos para a icárie, a seleção dos mesmos é determinada pela extensão da doença.

As lesões de manchas brancas aproximações de remineralização podem ser tratadas com i

(por exemplo, terapia de flúor ou fosfato de cálcio amorfo estabilizado com i moléculas bioativas). Cavidades exigem odontologia restauradora convencional (por exemplo, preenchimentos).

3/68

DDDs · são porosa. Elas são, outra causa comum de hidroxiapatita de modo perturbador, prevalentes e i população

I dental,

DDDs mais i

dental (caracterizada por a Hipomineralização Molar/Incisivo onerosas, afligem potencialmente mais de 50% da com incidências múltiplas, desfiguração e risco prevalentes são a opacidades difusas);

(HMI, caracterizada aumentado incluindo dor de cárie. As duas fluorose por causadas por agentes ambientais (ou seja, adquiridos). Outra DDD grave, mas rara, que pode ambas são l

'.defeitos

I 'resultar

I em hidroxiapatita porosa é a doença genética amelogênese

I imperfeita.

A HMI normalmente afeta de 10-20% das crianças, e é um importante fator de risco para ' cáries, um fator de risco para ortodontia, e é cara para a sociedade. Pensa-se que a HMI resulta de um distúrbio multifatorial sistêmico !

das células formadoras de esmalte. No entanto, além de estar dissociada do flúor, e ligada à doença durante a infância, a causa da HMI permanece um mistério. '

I

Atualmente não há produtos disponíveis prqjetados para diagnosticar e reparar HMI ou outra DDD. Um diagnóstico diferencial de cárie e de diversas DDDs pode ser difícil, e é em grande parte dependente da experiência i , , e habilidade de cada profissional de saude odontologica. Procedimentos e/ou produtos atuais desenvolvidos jpara a remineralização de cáries não funcionam bem em HMI. O tratamento restaurador é frequentemente comprometido pelo fato do esmalte da HMI ser macio, poroso e mal delineado, a partir do tecido dental normal. j

Assim, existe uma necessidade de | novas ferramentas para diagnóstico, delineamento e reparapão da hidroxiapatita porosa dental, causada por cáries ei DDDs. Aqui, atende-se a essa necessidade, detalhando as i novas i

• I . * ·_Ι

I

4/68 .

’ ·; I

I i

i ί· i

tecnologias baseadas em recentes descobertas de mecanismos patogênicos, em condições que envolvem hidroxiapatita i porosa. i

RESUMO ¹ í

Um primeiro aspecto fornece um kit,, quando utilizado para a detecção de hidroxiapatita porosa dental, compreendendo: uma proteína capaz de ligação à hidroxiapatita porosa dental; ou um detector que, detecta essa proteína ligada à hidroxiapatita porosa dental¹.

i

Um segundo aspecto fornece uma sonda, que quando usada para a. detecção de hidroxiapatita porosa' dental, compreende: uma proteína capaz de se ligar à hidroxiapatita porosa dental; e um repórter. i

Um terceiro aspecto fornece um método ¹ para a produção da sonda do segundo aspecto, que compreende (i) ligar uma proteína capaz de ligação à hidroxiapatita porosa

I dental e (ii) um repórter. < _t

Um quarto aspecto fornece um método ipara a í detecção de uma condição que envolve a hidroxiapatita i

dental porosa, que compreende a detecção dentro ou sobre um dente, ou de uma amostra do dente de um indivíduo,¹ de uma ' . I proteína ligada à hidroxiapatita porosa dental.

I

Um quinto aspecto fornece um método para a i detecção de uma DDD de hipomineralização compreendendo a detecção de uma proteína, cuja concentração sujeita ao teste da hidroxiapatita de um dente, ou de uma amostra do i dente, é aumentada em relação à sua concentração sujeita ao controle da hidroxiapatita de um dente, ou de _;uma amostra i controle de um dente, e a detecção de amelogenina cuja concentração sujeita ao teste .da hidroxiapatita iesteja próxima à ligação à hidroxiapatita controle. . ¹

Um sexto aspecto fornece um método para a detecção de esmalte da HMI intacto e/ou quebrado

I

5/68 compreendendo a detecção de albumina e hemoglobinal ligada à hidroxiapatita em HMI, em que a detecção de albumina, mas

L não de hemoglobina, é indicativa de esmalte da HMIjintacto, e em que a detecção de hemoglobina é um indicátivo de esmalte da MHI quebrado. ¹

Um sétimo aspecto fornece um kit para al remoção de uma proteína ligada à hidroxiapatita porosa dental {

compreendendo: (a) (i) uma ou mais soluções de'layagem ou (ii) componentes secos para preparar uma ou mais isoluções 10 de lavagem após mistura com água, em que uma 'ou mais í

soluções de lavagem são adaptadas para remover a proteína ligada à hidroxiapatita porosa dental; e (b) um agente de remineralização ou um agente de mineralização corretiva.

Um oitavo aspecto fornece um método ιpara a 15 remoção de uma proteína ligada à hidroxiapatita¹ porosa

I dental, que compreende a lavagem de um dente ou j de uma amostra do dente, com uma ou mais soluções de lavagem.

Um nono aspecto fornece um kit para a remoção de uma proteína ligada à hidroxiapatita porosa 'dental que 20 compreende: uma ou mais soluções de lavagem; ou um bu mais t

componentes secos para preparar uma ou mais soluções de lavagem após mistura com água, em que uma ou mais soluções de lavagem são adaptadas para remover a proteína dehtro ou sobre um dente ou de uma amostra do dente detectado como 25 tendo hidroxiapatita porosa dental, pelo método do ' quarto i

aspecto. ₍

O kit, a sonda, ou os métodos do primeiro ao sexto aspectos permitem a detecção in situ ou diagnóstico

I ex situ . |

0 kit, a sonda, ou os métodos . do primeiro ao sexto aspectos são úteis na detecção de cáries dentais e/ou HMI/DDD, e cáries delineadas e/ou limites de HMI/DÚD, em preparação para a restauração de um . dente. O clínico pode

6/68 então remover especificamente o tecido cariado ou da HMI, assim revelada, garantindo a preparação de bordas¹ limpas e i

a melhora da probabilidade de sucesso de restauração.

kit? do primeiro aspecto, ou a sonda dò segundo aspecto, fornece ferramentas fundamentais, e o rriétodo do quarto aspecto permite um rastreio de rotina para hidroxiapatita porosa dental. Além disso, o kit, ^!a sonda, i

ou os métodos do primeiro ao sexto aspectos podem ser utilizados para a detecção precoce da hidroxiapatita dental ' i exposta. Deste modo, o kit, a sonda, ou os métodos do primeiro ao sexto aspectos podem ser utilizados! para o rastreio de rotina de alteração dental que, sem detecção, i

pode, em última análise, levar à cárie dental (um precursor para cáries), permitindo o direcionamento preciéo e no tempo certo de restauração e/ou remineralização para prevenir a 'progressão da cárie _t e/ou promôver a remineralização. Em algumas modalidades, o kit, a sonda, ou os métodos do primeiro ao sexto aspectos são particularmente adequados para o rastreio de rotina de 20 crianças, após a erupção do primeiro molar permanente.

I

Segue-se que o kit, a sonda, ou os métodos do primeiro ao

I sexto aspectos ·também são adequados para o rastreio de rotina de dentes, para a detecção precoce de hidroxiàpatita porosa. O rastreio de rotina regular fornece uma excelente 25 oportunidade para detectar as mudanças odontológidas nos primeiros momentos, que podem levar à cárie dental. .

Além disso, o kit, as sondas e os métodos do primeiro ao sexto aspectos também permitem o monitoramento

I de qualquer tipo de tratamento, . tal como as terapias de remineralização conhecidas, incluindo fosfato de flúor ou i

de cálcio amorfo, que podem ser estabilizados com moléculas bioativas, que podem ser empreendidas.

'1

I

7/68 . ‘ método do oitavo aspecto e os kits dos sétimo e nono aspectos permitem a remoção suave e/ou especifica de proteínas em excesso, que estão fortemente retidas na hidroxiapatita' porosa, como por exemplo, em lesões de HMI, para serem usados antes ou durante os tratamentos de remineralização. ,

A proteína de qualquer um do- primeiro ao quinto, ou do sétimo ao nono aspectos pode ser selecionada;a partir do grupo: Albumina sérica; Cadeia beta Complemento C3;

Alfa-l-antitripsina; Proteína S100-A9; Lactotransferrina; Inibidor de leucócitos elastase; Antitrombina-III;

Subunidade alfa da hemoglobina; Subunidade beta da hemoglobina; Subunidade delta da hemoglobina; '.Proteína induzida por prolactina; Alfa amilase 1; Região’ SIE de cadeia V-III Ig kappa; Região de cadeia C Ig i alfa-2;

Proteína Descaracterizada c6orf58; e Serpina B3. Alem disso, a proteína de qualquer um do primeiro ao quarto, ou do sétimo ao nono aspectos pode ser Amelogenina. .

Os kits de primeiro, sétimo e nono aspectos, ou a sonda do segundo aspecto, podem estar sob > formas alternativas. Uma forma designa, ou a adequaçãol-para, ou a restrição a, uma utilização específica,. e está indicada

I pela palavra para. Outra forma é restrita a uma única

I utilização específica e está indicada pela expressão quando utilizado para.

I

Os métodos do terceiro ao sexto ou ! oitavo aspectos podem ser apresentados em formas alternativas, por

I exemplo, na forma Européia (agente para utilização), ou na segunda forma de uso médico (Suíça) (a utilização de um agente na fabricação de um medicamento). .. ¹ i

BREVE DESCRIÇÃO . DAS FIGURAS .. i i

A Figura 1 mostra o teor de, proteína do esmalte í

da HMI, que é anormalmente elevado em relação ao dsmalte

I

8/68 ι

I r · normal. As proteínas insolúveis em ácido foram extraídas a . I partir de esmalte normal (normal) e um grupo de lesões graves exibindo desordem pós-eruptiva (amostras 7-11), em seguida quantificadas por análise dot-blot densitométrica. Os valores médios (± SD) são mostrados para os ensaios duplicados, cada um feito com cargas variadas para

I assegurar a linearidade quantitativa (r² > 0.9_t5). Como indicado, todas ' as amostras de HMI diferiram

I significativamente do normal, quando comparadas iformando pares, utilizando Student's t-test (homoscedástica, duas l extremidades). Um padrão de albumina foi usado para obter i os níveis de proteína absolutos a partir desses dados.

A figura 2 ilustra que as lesões de HMI ‘intactas e quebradas têm perfis de proteínas distintos. As proteínas insolúveis em ácido, a partir de lesões, de HMI e de’’ esmalte normal (normal) foram sujeitas a SDS-PAGE e coradas com azul de Coomassie ou imunotransferidas com anticorpos de amelogenina (anti-AMG), como indicado. (A). Comparação de

I lesões de superfície intacta e de superfície quebrada (amostras 1-6 e 7-11, respectivamente), mostrando 'padrões i distintos para as bandas de proteínas maiores. As posições

I de albumina e .· hemoglobina estão indicadas (Alb, Hb) . (B)

Comparação das amostras de HMI com matriz de esmalte em < I fase de secreção, de ratos, que serviu como um controle para amelogeninas predominantemente intactas (AMG). As amostras 7 e 11 são representativas de lesões com

I quantidades baixas ou apreciáveis de fragmentos de amelogenina, respectivamente. Para a quantificação, a

I imunorreatividade cruzada entre amelogeninas de ratos e humanos foi normalizada usando um padrão de amelogenina humana (de Abnova, cidade de Taipei, Taiwan). (C) iPerfis

I para duas lesões intactas, comparando-se o primeiro procedimento com gel, usando extratos frescos, com um

I

9/68 segundo procedimento após armazenamento dos mesmos extratos de SDS durante 16 semanas a -20°C. Observa-se o desaparecimento das bandas principais a 66 kDa (aibuniina) .

A Figura 3 apresenta o$ resultados da análise proteômica de lesões de HMI intactas e quebradas, o que revela inúmeras proteínas de fluidos corporais em esmalte de HMI. As principais bandas de gel indicadas a partir de lesões intactas e quebradas (Fig. 2A, amostras 1-11) foram submetidas à identificação proteômica, conforme documentado 10 mais completamente na Tabela 1. A figura ilustra as proteínas identificadas em cada banda, e as amostras em que tais identificações foram feitas (números de amostras em parênteses) . Pistas de gel para as amostras 6 íe 7 são reproduzidas a·: partir da Fig. 2A para ilustrar Tesões 15 intactas e quebradas, respectivamente. '

A Figura 4 mostra ensaios de mineralização revelando que a integridade da superfície regula a composição da proteína de esmalte da HMI. (A)i Perfil comparativo de esmalte da HMI e fluidos ‘.corporais, 20 mostrando as semelhanças para lesões intactas versus soro, e para lesões quebradas versus saliva e eritrócitbs. (B) Ensaio de ligação à hidroxiapatita (afinidade; HAp) , mostrando que _;um subconjunto de proteínas do fluiçio oral simulado (Fluido-O) foi preferencialmente i retido 25 (comparando com diferenças entre as cargas e 'frações ligadas e não ligadas) . Observa-se uma forte semelhança entre o perfil de ligação e lesão quebrada no painel A. (Amostra 7) . (C) Um ensaio de ligação ao mineral equivalente a B, mas com esmalte de HMI em pó, no lügar de 30 hidroxiapatita. Os perfis mostram esmalte a partir da lesão

I intacta, antes e após a exposição ao fluido oral simulado (+/- Fluido-O). Observa-se a semelhança do perfil ligado à proteína (+) às lesões quebradas, e à hidroxiapatita nos '3 J

10/68 painéis A e B. Este resultado indica que a iperda de estrutura espessa (incluindo a superfície intacta)' conduz a uma alteração marcada na capacidade de ligação à' proteína de lesões intactas. Para legitimar essas comparações, ambas 5 as matrizes de afinidade (hidroxiapatita par^iculada, esmalte da HMI) foram trituradas no gral em consistências iguais (pó grosso) antes do ensaio. >

A Figura 5 representa um ensaio de ligação à hidroxiapatita (SDS-PAGE, corado com Coomassie), mostrando

I que a hemoglobina e a albumina do fluido oral isimulado estão ligadas pela hidroxiapatita. Um procedimento de lavagem de três etapas compreendendo a lavagem, -de modo

I sequencial, em cada um de 5 mM de MgC12, 1 M de MgC12, e

0,4 M de NaH₂PQ4,cada um, durante 5 min. removeu >, 90% da 15 proteína da hidroxiapatita.

A Figura 6 fornece uma sequência de aminoácidos da Albumina Sérica humana (SEQ ID NO: -1; número de_; acesso SwissProt P02768).’

A Figura 7 fornece uma sequência de amirioácidos i

para o Complemento C3 humano (SEQ ID NO: 2; número de acesso SwissProt P01024).i

A Figura 8 fornece uma sequência de aminbácidos para a Alfa-l-antitripsina humana (SEQ ID NO: 3; número de

I acesso SwissProt P01009).,

A Figura 9 fornece uma sequência de aminoácidos para a Proteína Humana S100-A9 (SEQ ID NO: 4; número de acesso SwissProt P06702).,

A Figura 10 fornece uma sequência de aminoácidos para a Lactotransferrina Humana (SEQ ID NO: 5; inúmero de ¹ acesso SwissProt P02788)i

A Figura 11 fornece uma sequência de aminoácidos para o inibidor de leucócitos elastase humana (SEQ ID NO:

I

6; número de acesso SwissProt P30740).

I 1I i

I

11/68

Ά Figura 12 fornece uma sequência de aminoácidos para a Antitrombina-III Humana (SEQ ID NO: 7; número de acesso SwissProt P01008). .

i

A Figura 13 fornece uma sequência de aminoácidos para a subunidade alfa da Hemoglobina Humana (SEQ 'ID NO: 8; número de acesso SwissProt P69905).!

i

A Figura 14 fornece uma sequência de aminoácidos para a subunidade beta da Hemoglobina Humana (SEQ ID NO: 9;

numero de acesso SwissProt P68871) .

i

A Figura 15 fornece uma sequência de aminoácidos para a subunidade delta da Hemoglobina Humana (SEQ ID NO:

10; número de acesso SwissProt P02042).

A Figura 16 fornece uma sequência de aminoácidos para (proteína.induzível por Prolactina Humana SEQ ID NO:

15	11;	número de acesso SwissProt	P12273).
			A Figura 17 fornece	uma	sequência	de	aminoácidos
	para	a	Alfa-amilase 1 Humana	(SEQ ID NO:	12	; número de
	acesso	SwissProt P04745).		-		f
			A Figura 18 fornece	uma	sequência	de	aminoácidos
20	para	a	Região SIE cadeia V-III	ig	kappa Humana	(SEQ ID NO:

13; número de acesso SwissProt P01620).

t

A Figura 19 fornece uma sequência de 'aminoácidos para a Região de cadeia C Ig alfa-2 Huhiana (SEQ ID NO: 14; número de acesso SwissProt P01877) . '

I

A Figura 20 fornece uma sequência de aminoácidos ‘ I para a proteína descaracterizada C6orf58 Humana (SEQ ID NO:

i 15; número de acesso SwissProt Q6P5S2).

A Figura 21 fornece uma sequência de aminoácidos para a Serpin B3 Humana (SEQ ID NO: 16; número de'· acesso 30 SwissProt P29508).

I

A Figura 22 fornece uma sequência de aminoácidos para Amelogenina Humana, isoforma X (SEQ ID NO: ·.· 17; ‘ número de acesso SwissProt Q99217).

I

12/68

A Figura 23 fornece uma sequência de aminoácidos para Amelogenina Humana, isoforma Y (SEQ ID NO: 18; número de acesso SwissProt Q99218).

A Figura 24 fornece uma sequência de aminoácidos para Amelogenina de Rato (SEQ ID NO: 19; número de acesso SwissProt P63277) também correspondente à Amelogenina recombinante dé^: rato.

A Figura 25 fornece uma sequência de aminoácidos para a subunidade alfa da Hemoglobina Bovina (SEQ ID NO: 1Ό 20; número de acesso SwissProt P01966).

A Figura 26 fornece uma sequência de aminoácidos para a subunidade beta da Hemoglobina Bovina (SEQ ID NO: 21; número de acesso SwissProt P02070).

A Figura 27 mostra a reação química para a 15 produção de um repórter colorido ativado por maleimida, através da reação de éster de N-hidroxissuccinimida (SMCC), com negro de amido (amina primária). 0 repórter colorido ativado por maleimida é reativo à sulfidrila, pronto para a conjugação com cisteína-tióis de subunidades de hemoglobina 20 β.

A Figura 28 mostra a reação química para a produção de uma sonda, neste exemplo, uma proteína conjugada de repórter colorido, por meio da reação de um repórter colorido ativado por maleimida, de acordo com a 25 Figura 28, com grupos de cisteína-tiol (SH) de subunidades de hemoglobina; β. Cada tetrâmero de hemoglobina liga duas moléculas repórteres coloridas, e deixa duas subunidades não modificadas, o que provavelmente é importante para preservar a função de ligação à hidroxiapatita da 30 hemoglobina.

A Figura 29 representa a ligação in vitro à hidroxiapatita, de uma sonda produzida de acordo com as Figuras 27 e 28, e no Exemplo 2. A sonda compreende

' !

13/68 ' i ι i

hemoglobina (Hb), um repórter I, e um ligante. Em hidroxiapatita à lavagem em apenas (isto é, de amido) sonda, a resistiu colorido mudou colorido azul escuro (negro minutos para azul água, não ligado a Hb) enquanto • I de aplicação da ^! l escuro.i A sonda * 1 que o ₍ repórter foi remòvido por lavagem com água. A sonda foi removida da hidroxiapatita i

através de um 'procedimento de três etapas de lavagem, que compreendendo ã lavagem sequencialmente de cada ,5 mM de

I

MgC12, 1 M de MgC12, e 0,4 M de NaH₂PO₄, cada um por' 5 min.

I

A Figura 30 mostra os resultados do Exemplo 3,

I que demonstram a ligação específica de uma sonda produzida de acordo com o Exemplo 2, ao esmalte poroso dental'.

A Figura 31 mostra os resultados do Exemplo ,4, que demonstram que uma

Exemplo 2, pode detectar precoce da superfície sonda produzida de acordo com o l especificamente a desmineralização i

do esmalte (modelo de cáries incipientes).

A Figura 32 mostra os resultados do que demonstram que o mecanismo de ação de

I

I

Exemplo 5,

I uma sonda produzida de acordo com o Exemplo 2, tem afinidade à hidroxiapatita. !

. . I

A Figura 33 mostra os resultados do Exemplo 6,

I que demonstram que uma sonda produzida de acòrdo. com o Exemplo 2, marca especificamente esmaltes hipomineralizados e dentina anormal, marcados. Os especificamente e

O esmalte normal e a dentina não foram

I » esmaltes hipomineralizados i foram

I uniformemente marcados, em uma cor violeta intensa. A dentina anormal foi especificamente e uniformemente marcada em uma cor verde profunda.

I

A Figura 34 mostra os resultados do Exemplo 7, que demonstram que uma sonda produzida de acordo ,com o Exemplo 2, pode ser usada para orientar a remoção de esmalte hipomineralizado.

8,

ι i

14/68 i

A Figura 35 mostra os resultados do Exemplo que demonstram que uma sonda produzida de acordo com o I

Exemplo 2, pode ser usada para orientar a remoção da I dentina anormal. ί

J

A Figura 36 mostra os resultados do Exemplo 9, que demonstram que a detecção de dentina anormal de acordo k com o Exemplo 8, pode ser melhorada utilizando uma lavagem com branqueadores. í

A Figura 37 mostra os resultados do Exemplo 10,

I que demonstram que a sonda pode ser radiopaca, o que pode ser alcançado através da substituição do cromóforo azul (negro de amido) do Exemplo 2, para o ácido amino-2,4,6o · triiodoisoftálico (I) . - i

A Figura 38 mostra os resultados do Exemplo 11, que demonstram a eficácia relativa das soluções de ilavagem compreendendo Mg²⁺ ou PO₄ na remoção de proteínas ligadas a

I hidroxiapatita pura. i i

A Figura 39 mostra os resultados do Exemplo 12, l

que demonstram .a eficácia relativa de aplicação separada ou 20 sequencial de soluções de lavagem compreendendo Mg ; ou PO₄ na remoção de proteínas ligadas à hidroxiapatita purá.

A Figura 40 mostra os resultados do Exemplo 13,

I ;

que demonstram a eficácia relativa da aplicação combinada de uma solução de lavagem compreendendo Mg²⁺' e PO₄ na 25 remoção de proteínas ligadas a hidroxiapatita pura.

A Figura 41 mostra os resultados do que demonstram que a compreendendo Mg²⁺ ou aplicação

PO₄ remove hipomineralizado, embora com

Exemplo 14, i de lavagem de esmalte í eficácia reduzida.

Exemplos

I

I de soluções as proteínas em comparação com o modelo de hidroxiapatita dos ao 13.

que demonstram que a eficácia das soluções

Exemplò de lavagem

I

I

15,

15/68 compreendendo Mg²⁺ ou P0₄ na remoção de proteínas do esmalte ·

hipomineralizado, pode ser melhorada em comparação com o Exemplo 14, péla extensão do período de aplicação, de tal modo que as proteínas possam ser 'removidas 5 quantitativamente. ^!

DESCRIÇÃO DETALHADA ,

São aqui descritos kits, sondas e métodds para a i

detecção de uma proteína capaz de se ligar a hidroxiapatita porosa. A hidroxiapatita pode ser constituída no esmalte ou i dentina. Além disso, ao passo que os produtos existentes mancham a dentina (mas não se detecta hidroxiapatitia porosa dental), pela primeira vez, é aqui divulgado um prdduto que detecta defeitos de esmalte, especificamente através da detecção de hidroxiapatita porosa dental.

i

A proteína capaz de se ligar a hidroxiapàtita porosa pode ser uma proteína humana. Por exemplo, a proteína pode ser selecionada a partir do grupo: Albumina sérica (P02768).; Cadeia beta Complemento C3 (P01024); Alfa1-antitripsina (P01009); Proteína' S100-A9 (P06702);

Lactotransferrina (P02788); Inibidor de leucócitos elastase (P30740); Antitrombina-III (P01008); Subunidade alfa da hemoglobina (P69905); Subunidade beta da hemoglobina (P68871); Subunidade delta da hemoglobina (P'02042);

^: i

Proteína induzida por prolactina (P12273); Alfa amilase 1 (P04745); Região SIE de cadeia V-III lg kappa (PÓ1620);

Região de cadeia C lg alfa-2 (P01877); Proteína descaracterizada c6orf58 (Q6P5S2); Serpina B3 (P29508), onde o termo, entre parênteses indica o número, de 'acesso identificador único SwissProt (como listado na Tabpla 1,

SEQ ID NOs: 1 a 16, e as Figuras 6 a 21, respectivamente).

I

Em algumas modalidades, a proteína pode ser uma Amelogenina. A Amelogenina pode ser humana. Por exemplo, a Amelogenina pode ser a isoforma X da Amelogenina Humana,

16/68 (SEQ ID NO: 17, figura 22; número de acesso .SwissProt

Q99217) ou Amelogenina pode ser a isoforma Y da Anielogenina

Humana, (SEQ ID NO: 18, Figura 23; número de acesso t

SwissProt Q99218). Alternativamente, a proteína pode vir de um indivíduo que não seja humano, por exemplo, um animal tal como um primata, um cavalo, vaca, ovelha, cabra, cão ou gato.

Em algumas modalidades, do primeiro ao quarto, e I do sétimo ao nono aspecto, a proteína pode ser a albumina, 10 hemoglobina, ou uma subunidade das mesmas, ou amelogenina.

Em uma modalidade do quarto aspecto, o método compreende a detecção da proteína, que é diferente de amelogenina, e detecção de amelogenina, em que a presença da proteína e ausência de amelogenina é um indicátivo de l

HMI, e a presença de amelogenina é um indicativo de defeitos de hipomaturação, incluindo tipos de** amelogênese imperfeita ou fluorose dental. A proteína que e diferente de amelogenina é qualquer uma selecionada a partir de: Albumina sérica; Cadeia beta Complemento C3; Alfa-120 antitripsina; Proteína S100-A9; Lactotransferrina; Inibidor de leucócitos elastase; Antitrombina-III; Subunidade alfa da hemoglobina; Subunidade beta da hemoglobina; Subunidade delta da hemoglobina;

Alfa amilase 1; Região de cadeia C Ig alfa-2;

Proteína induzida por prolàctina; SIE de cadeia V-III Ig kappa; .Região descaracterizada c6orf58; e

Proteína

Serpina B3.

Como • utilizado aqui, poroso refere-se hidroxiapatita hipomineralizada, ou porosidade se deve à mineral, conduzindo a cristais minerais.

dental desmineralizada que ou ou porosidade é,i

O aumento da redução da extensão da densidade um aumento do espaço _; entre os i

I

17/68 termo hipomineralização, tal como aqui utilizado, refere-se a um desenvolvimento incompleto do i esmalte dental, ó que resulta na diminuição da densidade mineral (aumento da porosidade do esmalte) e resistência 5 mecânica. A hipomineralização é causada por uma ruptura genética (por exemplo, amelogênese imperfeita) ou adquirida (por exemplo, HMI, fluorose) de desenvolvimento dental. A

I hipomineralização é distinta da desmineralização, que ocorre em cáries, por exemplo. Em cáries, o desenvolvimento 10 normal (ou anormal) do esmalte ·/ é posteriormente

I desmineralizado. A desmineralização é distinta da hipomineralização, que se refere ao esmalte que nunca i

alcança um conteúdo mineral normal, devido .ao desenvolvimento interrompido. '

Como usado aqui, a remineralização refere-se ao retorno de minerais para a estrutura molecular do dente. 0 mineral predominante dos dentes é a hidroxiapatita. Em alguns processos de remineralização, ó grupo hidroxila é substituído por um grupo fluoro, para produzir a 20 fluoroapatita, que é mais resistente - ao ácido do· que a hidroxiapatita.

Conforme aqui utilizado, mineralização corretiva refere-se ao uso de terapias de remineralização em DDD (ou seja, hidroxiapatita porosa causada por l

mineralização incompleta). O uso do termo remineralização é inadequado, no contexto de DDD, porque a hidroxiapatita porosa não foi.causada por desmineralização. i

Como usado aqui, cárie ou cáries refere-se à redução ou perda do esmalte dental e da dentina, devido ao l

ácido, em particular, o ácido produzido pela bactéria infectante. A cárie é definida pelo processo de desmineralização, e pode ser corrigida utilizando métodos de remineralização, se forem detectadas precocemente.

18/68

Conforme aqui utilizado, uma condição envolvendo a hidroxiapatita porosa dental inclui a cárie dental, Hipomineralização Molar/Incisivo (HMI), amelogênese imperfeita, fluorose dental e outra DDD, manifeStando-se como esmalte hipomineralizado (isto é, ou demarcadas).

opacidades difusas

I

Como usado aqui,

Molar/Incisivo ou HMI refere-se a uma esmalte incoimpletamente endurecido geralmente no terceiro oclusal molares e incisivos permanentes,

A HMI e fluorose são porosidade da subsuperfície, ao

Hipomineralização ' i

DDD que resulta em (hipomineralizado),

I ou incisai dos primeiros respectivamente. ^!

I ambas caracterizadas pela passo que, cáries ativas podem ter uma superfície porosa (cáries inativas podem formar uma superfície fechada devido à remineralização).

Conforme aqui utilizado, esmalte exposto

I refere-se ao tecido da subsuperfície que tem sido revelado, devido à perda da sua camada superficial de proteção. 0 esmalte exposto pode ser normal ou poroso; hái muitos

I casos de quebra de superfície em dentes que não são afetados por HMI, ou qualquer outracondição para este propósito (por exemplo, de outra maneira os dentes normais podem fraturar, após uma mordida em um objeto rígido).

Como usado aqui, liga-se, ligação ou ligada 25 refere-se a uma interação química entre uma proteína e a hidroxiapatita, que prende a proteína em rela'ção à hidroxiapatita. A interação pode ser iônica, covalente, não-covalente,„polar ou não polar.

Como ..usado aqui, o termo detector referè-se a 30 qualquer substância química, bioquímica ou biológica que interage especificamente com a proteína aqui descrita, e gera um efeito na resposta à interação. Por exemplo, a resposta pode ser a visualização de um repórter colorido e,

19/68

compreender um repórter, ou um anticorpo.

termo detecta ou detecção identificação da resposta do detector. i do primeiro aspecto,'

Em uma modalidade do kit detector compreende segundo aspecto, o modalidade da sonda, colorido.

colorido,

Quando o a detecção um repórter detector é o repórter colorido. Na um repórter.

compreende um sonda do

Em uma _; repórter detector compreende um repórter do repórter colorido envolvería a visualização do repórter colorido e, portanto, a proteína de interesse. Alternativamente, o ' repórter pode ser radioopaco... ¹

ITal como aqui utilizado, o termo sonda,refere15 se a um agente, tal como uma proteína aqui descrita, que pode infiltrar-se no esmalte poroso, e que pode especificamente e firmemente ligar-se à hidroxiapatita, e í

após a ligação, permitir que esta ligação seja detectada. Em outras palavras, a sonda compreende uma molécula de 20 direcionamento', de hidroxiapatita específica. Uma /'sonda

compreende uma proteína, tal	como aqui	descrita,1 e	um
repórter. De acordo com esta	divulgação,	uma sonda	não
pode ser um anticorpo.
Da mesma forma,	o termo	r especifico	ou

especificamente refere-se à ligação onde uma substância se liga a uma determinada segunda substância, sem ligação substancial com qualquer outra substância. Tal ligação é de forma mensuravelmente diferente de uma interação nãoI específica. A. ligação específica pode ser medida, por 30 exemplo, pela determinação da ligação de uma molécula em comparação com a ligação de uma molécula controle, que geralmente é uma molécula de estrutura,, semelhante, que não possui atividade de ligação. Por exemplo, a ligação

20/68 especifica pode ser determinada por uma competiçãò com uma molécula controle, que . é semelhante ao alvo, por, exemplo, um excesso de um alvo não marcado. Neste caso, à ligação especifica é indicada, se a ligação do alvo marcado a uma 5 sonda, é inibida competitivamente pelo excesso de ¹ alvo não marcado. Como usado aqui, a ligação específica ou especificamente ligado pode referir-se (i) à 'proteína ligada especificamente à hidroxiapatita, (ii) ao detector ligado especificamente à proteína, ou (iii) ao ^repórter 10 ligado especificamente ao detector ou à proteína.

Em particular, uma ligação específica refere-se a uma substância com uma K_d de pelo menos 2 vezes a menos do que a de um alvo não-especí f ico, como por exemplo, uma substância que tem uma K_d de pelo menos 4 vezes, 6 vezes, 8 15 vezes, 10 vezes, ou mais do que 10 vezes a menos, do que a de um alvo não-específico. Alternativamente, a ligação específica pode ser expressa como uma molécula tendo uma K_d para o alvo de, no máximo, cerca de 1CF⁴ M, por éxemplo, cerca de 10⁵ M, de cerca de 10⁶ M, cerca de IO⁷ M, cerca 20 de 10⁸ M, cerca de 1CF⁹ M, cerca de 10’¹⁰ M, cerca de 10¹¹

I·

M, cerca de IO¹² M, ou menos.

Em uma modalidade do kit do primeiro aspecto, o detector compreende um repórter.

Quando usado in situ, o detector ou a sonda não é 25 tóxico para o indivíduo.

Como aqui utilizado, um repórter refere-se a qualquer substância química, bioquímica ou biológica que gera um efeito detectável. O repórter pode ligar-se especificamente, ou estar ligado ao detector, ou à 30 proteína. O . repórter pode compreender biotina ou estreptavidina para uso em uma ligação biótinaestreptavidina não-covalente de alta afinidade. O repórter

21/68 afinidade .

Em uma modalidade do kit do primeiro aspecto, ou a sonda do segundo aspecto, o repórter pode ser um repórter outras modalidades do primeiro ou dó segundo pode ser um pigmento/ ou um fluorescentes ou fosforescentes), enzimas, ou colorido. Em aspecto, o luminescente radioativo, molécula de repórter (incluindo substâncias contraste compreende uma molécula exemplo, ser útil de cáries ácido para a existente.

quimioluminescentes, de raios~x. Um de contraste de repórter raios-X que (por

5-amina-2,4, β-triiodoisoftálico; ³I)

Como usado refere-se a qualquer pode inicial métodos clínico aqui, o termo repórter., colorido preferencialmente, de luz visível.

comprimentos de onda,

Assim, quando o repórter é um repórter colorido, o efeito detectável é a visualização de uma cor.

O repórter colorido pode ser qualquer substância colorida que é conjugação à características responsável proteína, como um pela ligação, acoplamento, ou as suas Èm uma embora mantendo colorido.

repórter modalidade do kit do primeiro aspecto, repórter colorido é negro de amido.. Em um ou sonda do segundo aspecto, exemplo, proteína de um repórter sonda compreende a proteína (ou sejia, uma hidroxiapatita) ligada ou acojplada a

Qualquer proteína da Tabela 1 pode

I a um repórter colorido, e funcionada ligação à colorido.

ser ligada ou acoplada para direcionar o repórter colorido à hidroxiapatita porosa. Em um exemplo, a proteína é a hemoglobina. Assim,

22/68 em um exemplo, a sonda compreende hemoglobina ligada ao negro de amido.

Uma sonda que compreende uma proteína tal como aqui divulgada, como por exemplo, hemoglobina, é adsorvida cumulativamente à hidroxiapatita porosa dental. A' sonda vai ligar-se competitivamente à hidroxiapatita, na presença de outras proteínas, porque é capaz de deslocar quaisquer espécies que possuam uma afinidade mais baixa para a hidroxiapatita. Essa de amido ou ³I.

respectiva sonda pode compreender negro repórter colorido pode ser selecionado, com base nas características desejadas que sejam conhecidas pelo especialista, da área, a partir do grupo: Amarelo

Acetil (amarelo rápido); Negro de Ácido 1 (Negro de Amido

10B) ; Azul Ácido 22 (Azul Água I); Azul Ácido 93 (Azul de

Metila); Fucsina Ácida (Fucsina Ácida);

Verde Ácido (Verde

Claro SF Amarelado); Verde Ácido 1 (Verde de Naftol B) ; Verde Ácido 5 (Verde Claro SF Amarelado); Magenta Ácido (Fucsina Ácido); Laranja Ácido 10 (Laranja G) ; Vermelho Ácido 4 (Azo-eosina); Vermelho Ácido 26 (Ponceau Xilidina); Vermelho Ácido 29 (Cromotrope 2R); Vermelho Ácido 44 (Ponceau 6R) ; Vermelho Ácido 51 (Eritrosina B) ; Vermelho Ácido 52 (Lissamina Rodamina B) ; Vermelho Ácido 66 (Escarlate de Biebrich); Vermelho Ácido 73 (Corante para madeira Escarlate); Vermelho Ácido 87 (Eosina Y ws); Vermelho Ácido 91 (Eosina B) ; Vermelho Ácido 92 (Floxina B) ; Vermelho Ácido 94 (Rosa Bengala); Vermelho Ácido 101 (Azocarmina G) ; Vermelho Ácido 103 (Azocarmina B) ; Rosina Ácido (Fucsina Ácido); Rubina Ácido(Fucsina Ácido); Violeta Ácido 19 (Fucsina Ácido); Amarelo Ácido 1 (Amarelo de Naftol S); Amarelo Ácido 7 (Lissamina flavina FF); Amarelo Ácido 9 (Amarelo Rápido); Amarelo Ácido 23 (Tartrazina); . Amarelo Ácido 24 (Amarelo de Martius);

23/68

Amarelo Ácido .36 (Amarelo de Metanila) ; Amarelo Ácido 73 (Fluoresceina); Amarelo Ácido 85 (Amarelo Rápido de Coomassie G); Amarelo Ácido S (Amarelo de Naftol S); Amarelo Ácido T (Tartrazina); Laranja Acridina (Laranja

Acridina); Vermelho Acridina (Vermelho Acridina); Acriflavina (Acriflavina); Azul Alciano (Azul Alciano 8GX); Amarelo Alciano (Amarelo Alciano); Eosina solúvel em álcool (Etileosina); Alizarina (Alizarina); Azul Alizarina (Azul Alizarina); Azul Alizarina 2RC (Azul Antraceno SWR);

Carmina Alizarina (Vermelho Alizarina S); Cianina Alizarina BBS (Cianina Alizarina BBS); Cianina Alizarol R (Cianina Cromoxano R); Vermelho Alizarina S (Vermelho Alizarina S); Purpurina Alizarina (Purpurina); Azul Alcalino 4B, 5B (Azul Alcalino 5B) ; Aluminon (Violeta Cromo CG) ; Negro de Amido

10B (Negro de Amido 10B); Vermelho Amidonaftol (Azofloxina); Amido de Schwarz (Negro de Amido 10B); Azul Anilina WS (Azul Anilina WS); Púrpura Anilina (Mauveina); Azul Antraceno SWR (Azul Antraceno SWR); Azul Antraceno SWX (Cianina Alizarina BBS); Auramina O (Auramina O) ; Azo20 eosina (Azo-eosina); Azocarmina B (Azocarmina B);

Azocarmina G (Azocarmina B) ; Azo-eosina G (Azo-eosina); Diazo Azóico 5 (Vermelo Rápido B) ; Diazo Azóico 48 (Azul Rápido B) ; Azofloxina (Azofloxina); Azul Azovano (Azul de Evans); Azura A (Azura A) ; Azura B (Azura B) ; Azura C (Azura C); Azul Básico 8 (Azul Victoria 4R); Azul Básico 9 (Azul de Metileno) ; Azul Básico 12 (Azul do Nilo A) ; Azul Básico 15 (Azul da Noite); Azul Básico 17 (Azul de Toluidina O); Azul Básico 20 (Verde de Metila); Azul Básico (Azul Victoria B); Marrom Básico 1 (Marrom de Bismarck

Y); Fucsina Básica (Fucsina Básica); Verde Básico 4 (Verde Malaquita); Verde Básico 5 (Verde de Metileno); Laranja Básico 14 (Laranja Acridina); Vermelho Básico 2 (Safranina O) ; Vermelho Básico 5 (Vermelho Neutro); Vermelho Básico 9

24/68

,..

i t

(Pararosanilina); Violeta Básico 2 (Novo Fucsina); Violeta Básico 3 (Violeta Cristal); Violeta Básico 4 (Violeta de Etila); Violeta Básico 10 (Rodamina B) ; Violeta Básico 14 (Rosanilina) ; Amarelo Básico 1 (Tioflavina T)'; Amarelo 5 Básico 2 (Auramina O) ; Escarlate de Biebrich (Escarlate de

Biebrich); Escarlate de Biebrich R (Sudão IV) ; Marrom de Bismarck Y (Marrom de Bismarck Y) ; Blauschwarz (Azul Preto

Naftaleno CS) ; Brazileina (Brazileina); Brazilina (Brazilina); Croceína Brilhante (Corante para madeira

Escarlate); Escarlate Cristal Brilhante 6R (Ponceau 6R) ;

Verde Brilhante (Verde Brilhante); Vermelho Cálcio (Vermelho Rápido Nuclear); Carmina (Carmina); Ácido Carminico (Carmina); Carmosina 6R (Cromotrope ;2R); Azul Celestina B (Azul Celestina B) ; Azul China (Azul Anilina);

Vermelho Rápido Clorantina 5B (Vermelho Sirius 4B) ; Azul

Chicago 4B (Azul Céu Pontamina 5B) ; Amarelo Rápido Cromo 8GL (Amarelo Rápido Cromo 8GL); Amarelo Luxina, Cromo 8G (Amarelo Rápido Cromo 8GL); Violeta Cromo CG (Violeta Cromo

CG); Cromotrope 2R (Cromotrope 2R) ; Cianina Çromoxano'' R (Cianina Çromoxano R); Cochonilha (Carmina); Azul Celestina (Azul Celestina B); Congo Corinto (Congo Corinto); Vermelho Congo (Vermelho Congo); Amarelo Rápido Comassie G (Amarelo Rápido Comassie G); Azul Algodão (Azul de Metila); Vermelho Algodão (Vermelho Congo); Escarlate Croceína (Escarlate de

Biebrich); Escarlate Croceína 3B (Corante para madeira

Escarlate); Escarlate Croceína MOO (Corante de Madeira

Escarlate); Crocina (Açafrão); Cristal Ponceau 6R (Ponceau 6R) ; Escarlate Cristal (Ponceau 6R) ; Violeta Cristal (Violeta Cristal); Dália (Violeta de Hoffman); Verde

Diamante B (Verde Malaquita); Azul Direto 14 . (Azul de t

Tripan); Azul Direto 58 (Azul de Evans); Vermelho Direto (Vermelho Congo); Vermelho Direto . 10 (Congo Corinto);

Vermelho Direto 28 (Vermelho Congo); Vermelho Direto 80

25/68 (Vermelho Sirius F3B); Vermelho Direto 81 (Vermelho Sirius

4B) ; Amarelo Direto 7 (Tioflavina S) ; Amarelo ⁵ Direto 11 (Amarelo Sol); Azul Durazol 4R (Azul Durazol 4R) ; Azul

Durazol 8G (Azul Durazol 8G) ; Eosina B (Eosina jB) ; Eosina

Azulada (Eosina B); Eosina (Eosina Y ws) ; Eosina Y (Eosina

Y ws); Eosina Amarelada (Eosina Y ws); Eosinol (Eosinol);

Granada Erie B (Congo Corinto); Eriocromocianina R (Cromoxano Cianina R) ; Eritrosina B (Eritrosina' B) ; Etil eosina (Etil eosina); Verde de Etila (Verde de Etila);

Violeta de Etila (Violeta de Etila); Azul de Evans (Azul de

Evans); Azul Rápido B (Azul Rápido B) , Verde Rápido FCF (Verde Rápido FCF); Vermelho Rápido B (VermelhojRápido B);

Amarelo Rápido (Amarelo Rápido); Amarelo Rápido adicional (Amarelo Rápido); Amarelo Rápido G (Amarelo Rápido); Preto 15 Rápido HB (Preto Sudão B) ; Fluoresceina (Fluoresceina);

Verde Alimentar 3 (Verde Rápido FCF); Galeina (Galeina); Azul Galamina (Azul Galamina); Galocianina (Galocianina);

Violeta Genciana (Violeta de Metila 2B) ; Verde Guiné (Verde

Guiné B); Haemateina (Hemateina); Haematina (Hemateina);

Haematoxilina (Hematoxilina) ; Rubina Rápido ..Hélio BBL (Vermelho Rápido Nuclear); Azul Helvetia (Azul de Metila); Hemateina (Hemateina); Hematina · (Hemateina); Hematoxilina (Hematoxilina); Violeta de Hoffman (Violeta de Hoffman); Amarelo Hidrazina (Tartrazina); índigo Carmina (índigo

Carmina); Vermelho Imperial (Eosina B) ; Azul ilngraina 1 (Azul de Alciano 8GX); Amarelo Ingraina 1 (Amarelo de Alciano); INT (Iodonitrotetrazolio) Verde Iodo (Verde Iodo); Kermes (Kermes); Ácido Quermésico (Kermes); Kernechtrot (Vermelho Rápido Nuclear); Rodamina Kiton B (Lissamina Rodamina B); Lac (Ácido Lacaico); Ácido Lacaico (Ácido Lacaico), Violeta de Lauth (Tionina); Verde Claro (Verde Claro SF Amarelado); Amarelo Rápido (Amarelo Rápido Lissamina); Flavina Lissamina FF (Flavina Lissamina FF) ;

26/68

Verde Lissamina SF (Verde Claro SF Amarelado); Lissamina

Rodamina B (Lissamina (Amarelo Rápido Cromo

Rodamina B) ;

Amarelo

Puro i Luxine 6G

8GL); Azul Rápido Luxol (Azul Rápido

Luxol MBS) , Magenta 0 (Pararosanilina); Magenta I (Rosanilina); Magenta II (Magenta II); Magenta III (Fucsina

Nova); Verde Malaquita (Verde Malaquita); Marrom iManchester (Marrom de Bismarck Y); Amarelo Martius (Amarelo Martius);' Malva (Mauveina); Mauveina (Mauveina); Merbromina (Mercuriocromo 220); Mercuriocromo (Mercuriocromo 220);

Amarelo de Metanila (Amarelo de Metanila); Azul de Metila (Azul de Metila); Verde de Metila (Verde de Metila);

Violeta de Metila (Violeta de Metila 2B); Violeta de Metila 2B (Violeta de Metila 2B) ; Violeta de Metila 10B (Violeta Cristal); Azura de Metileno A (Azura A) ; Azura de Metileno 15 B (Azura B) ; Azura de Metileno C (Azura C) , Azul de Metileno (Azul de Metileno); Verde de Metileno; (Verde de

Metileno), Amarelo Milling 3G (Amarelo Milling 3G) ;

Azul Mordente 3 (Cianina Cromoxano R) ; Azul Mordente 10 (Galocianina); Azul Mordente 14 (Azul Celestina B) ; Azul 20 Mordente 23 (Cianina Alizarina BBS); Azul Mordente 32 (Azul Antraceno SWR); Azul Mordente 45 (Azul de .Galamina);

Vermelho Mordente 3 (Vermelho de Alizarina S) ; Vermelho Mordente 11 (Alizarina); Violeta Mordente 25 (Galeina);

Violeta Mordente 39 (Violeta Cromo CG); Amarelo Mordente 33 25 (Amarelo Rápido Cromo 8GL); Negro Azulado Naftaleno (Negro

Azulado Naftaleno CS) ; Negro Azulado de Naftol' (Negro de Amido 10B); Verde Naftol B (Verde Naftol B); Amarelo Naftol S (Amarelo Naftol S); Preto Natural 1 (Hemateina); Vermelho Natural (Purpurina); Vermelho Natural 3 (Kermes); Vermelho 30 Natural 4 (Carmina); Vermelho Natural 8 (Èurpurina);

Vermelho Natural 16 (Purpurina) ;. Vermelho Natural :.24 (Brazilina); Vermelho Natural 25 (Ácido Lacaico); Vermelho Natural 28 (Orceina); Amarelo Natural 6 (Açafrão); NBT

(Nitroazul de Tetrazólio); Vermelho Neutro ; (Vermelho Neutro); Fucsina Nova (Fucsina Nova); Azul Niágarã 3B (Azul de Tripan); Azul Noite (Azul Noite); Azul do Nilo (Azul do Nilo Á) ; Azul do Nilo A (Azul do Nilo A) ; Sulfato Azul do Nilo (Azul do Nilo A); Vermelho do Nilo (Vermelho; do Nilo); Nitro BT (Nitroazul de Tetrazólio); Nitroazul de Tetrazólio (Nitroazul de Tetrazólio); Vermelho Rápido Nuclear (Vermelho Rápido Nuclear); Vermelho Óleo O (Vermelho Óleo O); Laranja G (Laranja G) ; Orceina ^!(Orceina) ; Pararosanilina (Pararosanilina); Violeta de Perkin (Mauveina); Floxina B (Floxina B) , Ácido Picrico (Ácido Picrico); Ponceau 2R (Ponceau Xilidina); Ponceau 6R (Ponceau 6R); Ponceau B (Escarlate de Biebrich); Ponceau de Xilidina (Ponceau Xilidina); Ponceau S (Ponceau S); Azul Céu Pontamina ,5B (Azul Céu Pontamina 5B) ; Prímula (Violeta de Hoffman); Primulina (Prímulina); Purpurina (Purpurina);

;·

Pironina B (Pironina B) ; Pironina G (Pironina Y) ; Pironina Y (Pironina Y) ; Rodamina B (Rodamina B) ; Rosanilina (Rosanilina); Rosa Bengala (Rosa Bengala); Açafrão (Açafrão); Safranina O (Safranina O); Escarlate; R (Sudão IV); Vermelho Escarlate (Sudão IV); Escarlatina· R (Sudão IV) ; Goma-laca (Ácido Lacaico); Vermelho Sirius F3B (Vermelho Sirius F3B); Vermelho Sirius 4B (Vermelho Sirius 4B) ; Azul Supra Sirius F3R (Azul Durazol 4R) ; Cianina Solocromo R (Cromoxano Cianina R) ; Azul Solúvel· (Azul de Anilina); Preto Solvente 3 (Negro Sudão B) ; Azul Solvente 38 (Azul Rápido Luxol MBS); Vermelho Solvente 23 (Sudão III) ; Vermelho Solvente 24 (Sudão IV) ; Vermelho ÍSólvente 27 (Vermelho óleo O) ; Vermelho Solvente 45 (Etil Eosina); Amarelo Solvente 94 (Fluoresceína); Eosina Espírito Solúvel (Etil Eosina); Sudão III (Sudão III); Sudão IV (Sudão IV); Negro Sudão B (Negro Sudão B) ; Vermelho Sudão,, BK (Sudão III) ; Amarelo Enxofre S (Amarelo de Naftol S) ; Sulfo-

ν'

Rodamina B (Lissamina Rodamina B) ; Amarelo Sol (Amarelo Sol); Azul Suíço (Azul de Metileno).; Tartrazina (Tartrazina); Tioflavina S (Tioflavina S); Tioflavina T (Tioflavina T) ; Tionina (Tionina); Azul de Toluidina (Azul de Toluidina 0); Vermelho de Toluilina (Vermelho Neutro); Tropaeolina G (Amarelo de Metanila); Tripaflavina (Acriflavina); ' Azul de Tripan (Azul de Tripan); Uranina (Fluoresceína); Azul Victoria 4 (Azul Victoria 4R) ; Azul Victoria B (Azul Victoria B); Azul Victoria R (Azul Victoria R); Verde Victoria B (Verde Malaquita); Azul Água I (Azul Água I) ; Eosina Solúvel em Água (Eosina Y ws) ; Corante para madeira Escarlate (Corante para madeira Escarlate); Vermelho Xileno B (Lissamina Rodamina B); Ponceau Xilidina (Ponceau Xilidina) e eosina amarelada (Eosina Y ws). As características desejadas a serem consideradas pelo destinatário especializado incluem a compatibilidade com uma proteína e/ou um ligante a ser utilizado, de acordo com esta divulgação, sem toxicidade, e a manutenção da proteína ligada à hidroxiapatita porosa dental, por. exemplo.

Em modalidades alternativas do primeiro .ao quinto, ou do sétimo ao nono aspectos, a proteína não está listada nos exemplos da Tabela 1, mas é conhecida pélo destinatário especializado, que a hidroxiapatita', liga-se, por exemplo, a osteocalcina ou decorina. A utilização dos domínios 4-5 ...repetidos, ricos em leucina, a partir de decorina pode fornecer um mecanismo de direcionamento específico para a hidroxiapatita porosa em dentina.

Alternativamente, em modalidades do primeiro ao quinto, ou do sétimo ao nono aspectos, a proteína pode ser um peptídeo, ou um fragmento de proteína, desde que o peptídeo ou fragmento de proteína, mantenha a sua capacidade de se ligar à hidroxiapatita porosa dental.

29/68

Alternativamente, o destinatário especializado estará ciente de que moléculas pequenas (ou .polímeros destas), como por exemplo, a tetraciclina ou bis.fosfonato amino, que pode ligar-se à hidroxiapatita, o que¹ pode ser 5 mais útil em termos de capacidade de penetração de regiões micro-porosas, e em termos de estabilidade (por exemplo, a validade do produto). 0 bisfosfonato amina pode produzir um composto com qualidades adequadas para detectar e delinear a cárie (pequena sonda de alta afinidade, para penetrar na 10 superfície do esmalte poroso e ligár-se fortemente ao esmalte desmine.ralizado) .

Em algumas modalidades do kit do primeiro, aspecto ou da sonda do segundo aspecto, o detector ou a sonda compreende ainda um ligante que liga o repórter e o 15 detector, ou a proteína. O ligante pode ser um agente de reticulação heterobifuncional. Por exemplo, d agente de reticulação heterobifuncional, pode ser éster Nhidroxisuccinimida do ácido succinimidil 4-[Nmaleimidometil]ciclohexanocarboxílico ‘ (SMCC). ¹ Outros exemplos de agentes de ligação que podem ser utilizados de acordo com a presente divulgação incluem hexanoato de succinimidil-6-[β-maleimidopropionamido] (SMPH), ácido Nhidroxisuccinimidil-4-azidossalicilico (NHS-ASA), e N,Ndiciclohexilcarbodiimida (DCC).

Outros tipos de moléculas podem ser utilizados como um ligante. Por exemplo, ligações não-covalentes de alta afinidade-, tais como biotina-estreptavidina são aqui também contempladas.

O destinatário especializado estará ciente de 30 diversos agentes de reticulação que estão disponíveis com vários produtos químicos reativos, e medidores de -braço espaçadores, aumentando ainda a flexibilidade ,desta abordagem.

ϊ-'

Em uma modalidade do kit do primeiro aspecto ou da sonda do segundo aspecto, o repórter e a proteína podem ser fornecidos já ligados. Alternativamente, o repórter e a proteína podem ser fornecidos separadamente, para ligação subsequente. O kit, ou a sonda podem compreender um ligante. A proteína, o repórter, e o ligante do kit·, ou da sonda, podem ser apresentados em qualquer combinação possível. Por exemplo, quando o repórter e a proteína estão ligados através de um ligante, a sonda pode ser pronta para uso, isto é, os três componentes podem estar ligados. Alternativamente, a proteína e o ligante podem ser ligados e fornecidos separadamente ao repórter. Alternativamente, o ligante e o repórter podem ser ligados e fornecidos separadamente . para a proteína. Alternativamente, ... a proteína, o repórter, e o ligante podem ser fornecidos como componentes separados. Em uma modalidade do primeiro aspecto, o kit compreenderá o repórter e o ligante, mas não a proteína.

Em algumas modalidades do kit do primeiro aspecto, o detector compreende um anticorpo que se liga especificamente à proteína. Em outra modalidade, o detector pode compreender biotina ou estreptavidina para uso em uma ligação biotina-estreptavidina não covalente, de alta afinidade. O detector pode explorar outra ligação nãocovalente, de alta afinidade. Por exemplo, o detector pode compreender um anticorpo alternativo, tal como um ligante de proteína baseado em peptídeos. Um ligante de proteína baseado em peptídeos conhecido na área é um synbody.

O termo anticorpo é utilizado no sentido mais amplo e abrange especificamente, por exemplo, policlonais, anticorpos monoclonais (incluindo antagonistas e neutralizantes) , composições de com especificidade poliepitópica, anticorpos anticorpos anticorpos anticorpos de cadeia

31/68 simples, e fragmentos de anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada ou imunológica. 0 anticorpo pode ser um anticorpo conjugado, ou qualquer outro tipo de anticorpo conhecido por um especialista da área..

0 anticorpo pode ser detectado por qualquer método conhecido por especialistas da área. 0 anticorpo primário pode compreender um repórter. Alternativamente, um anticorpo secundário direcionado ao anticorpo primário pode compreender um repórter.

O anticorpo pode ser qualquer anticorpo conhecido pelo destinatário especializado, para se ligar especificamente a uma proteína selecionada a partir do grupo: Albumin.a sérica; Cadeia beta Complemento C3; Alfa-1antitripsina; Proteína S100-A9; Lactotransferrina; Inibidor de leucócitos elastase; Antitrombina-III; Subunidade alfa da hemoglobina; Subunidade beta da hemoglobina; Subunidade delta da hemoglobina; Proteína induzida por prolactina; Alfa amilase 1; Região SIE de cadeia V-III lg kappa; Região de cadeia C lg alfa-2; Proteína Descaracterizada c6orf58; e

Serpina B3. Em uma modalidade, o anticorpo pode ligar-se especificamente a uma amelogenina.

Em uma modalidade do kit do primeiro aspecto, um anticorpo monoclonal de albumina anti-sérica pode ser selecionado a partir do grupo: AL-01; 1.B.731; ÍA9; 6B11;

OCH1E5; 1C8; 1G2; 2B2; 2B3; 2B6; 14E7; 15C7, Albl, e um anticorpo monoclonal IgGi de camundongo com o código de produto sc-70340 (Santa Cruz Biotechnology Inc) . Em uma modalidade, um anticorpo monoclonal de cadeia beta antiComplemento Ç3^; pode ser um clone 755. Em outra modalidade, um anticorpo monoclonal anti-humano C3 que reage de forma cruzada com a cadeia beta de complemento C3 pode ser usado, e pode ser clone 11H9. Em uma modalidade, um anticorpo monoclonal anti-Alfa-l-antitripsina pode ser selecionado a

32/68 partir do grupo: 5B12; 703; 704; 8A0; B9; e Gll. Em uma modalidade, uma anticorpo monoclonal anti-proteína S100-A9 pode ser selecionado a partir do grupo: 0.N.390A; 47-8D3;

NO.134; NO.19; e S32.2. Em uma modalidade, um ianticorpo monoclonal anti-Lactotransf errina pode ser sele'cionado a partir do grupo: 1C6; 2B8; B97; CLB-13.17; e 1A1. Em uma modalidade, um anticorpo monoclonal anti-Antitrombina-III pode ser 4B3 ou BDI205. Em uma modalidade, um anticorpo de subunidade alfa da anti-Hemoglobina pode ser um anticorpo 10 policlonal IgG de cabra com o código de produto sc-70340 (Santa Cruz Biotechnology Inc.). Em uma modalidade, um anticorpo de subunidade beta da anti-Hemoglobina pode ser um anticorpo monoclonal de rato IgG; com o código de produto sc-21757 (Santa Cruz Biotechnology Inc.). Em uma 15 modalidade, um anticorpo monoclonal de região de cadeia C anti-Ig alfa-2, pode ser clone 14AS (também referido como IgA2 anti-humano). Em uma modalidade, um anticorpo X antiAmelogenina pode ser um anticorpo IgG policlonal de coelho com o código de produto sc-32892 (Santa Cruz Biotechnology 20 Inc.). O destinatário especializado irá apreciar que outros anticorpos adequados estão disponíveis. ’

Em uma modalidade do kit, da sonda, ou método do primeiro, segundo ou quarto aspectos, uma primeira proteína é selecionada a partir do grupo: Albumina sérica; Cadeia 25 beta Complemento C3; Alfa-l-antitripsina; Proteína S100-A9; Lactotransferrina; Inibidor de leucócitos elastase;

Antitrombina-III; Subunidade alfa da hemoglobina;

Subunidade beta da hemoglobina; Subunidade delta da hemoglobina; Proteína induzida por prolactina; Alfa amilase 30 1; Região SIE de cadeia V-III Ig kappa; Região de cadeia C

Ig alfa-2; Proteína Descaracterizada c6orf58; e Serpina B3, podem ser detectados, e uma segunda proteína pode ser detectada, em que a segunda proteína ,_té amelogenina. Isto

33/68 resulta em um kit do primeiro aspecto, que pode também compreender um segundo detector, que detecta amelogenina. 0 segundo detector pode ser um anticorpo anti-amelogenina.

Alternativamente, a detecção pode Compreender imunodetecção, cromatografia, eletroforese, espectrometria de massa, ou microscopia. A imunodetecção pode compreender o Ensaio Imunoabsorvente Ligado à Enzima (ELISA)., Western Blot, dot blot, slot blot, ou citometria de fluxo, por exemplo. A microscopia pode compreender laser confocal, 10 microscopia de fluorescência ou de elétrons, por exemplo.

O detector ou sensor pode ser aplicado de diferentes maneiras, como por exemplo, em um líquido, gel, cápsula, comprimido, solução aquosa, suspensão aquosa ou oleosa, pastilha, pílula, pó, grânulo/ emulsão, xarope ou 15 elixir.

Em uma modalidade do kit do primeiro aspecto ou sonda do segundo aspecto, o detector ou a sonda compreende um solvente em que o detector ou sonda é dissolvido, suspenso ou emulsionado. O solvente pode ser de um tipo 20 geralmente usado em medicina, ou na indústria, ou. similar.

Os exemplos incluem água, etanol, n-propanol, álcool 2butílico, álcool isobutílico, álcool n-amílico, álcool isoamílico, etileno glicol, 2-metoxietanol, dietileno glicol, trietileno glicol, tetraetileno glicol, polietileno 25 glicol, propileno glicol, dipropileno glicol, polipropileno glicol, trimetileno glicol, 1,2-butanodiol,.1,3-butanodiol, 2,3-butanodiol, 1,4-butanodiol, 1,5-pentanodiol, éter monometílico de etilenoglicol, acetato de éter monometílico de etilenoglicol, éter monoetílico de etilenoglicol, 30 dietiléter de etilenoglicol, etilenoglicolmonoetileteracetato, éter isopropílico de etileno glicol, éter monobutilico de etileno glicol, éter dibutílico de etileno glicol, monoàcetato de etileno

34/68 glicol, diacetato de etileno glicol, éter monometilico de dietileno glicol, éter monoetilico de dietileno-glicol, acetato de éter monoetilico de dietilenoglicol, éter monobutílico de dietileno glicol, acetato de éter de 5 dietileno glicolmonobutílico, éter dimetílico de dietileno glicol, éter metiletílico de dietilenoglicol, éter dietílico de dietileno glicol, acetato de dietileno glicol, éter monometilico de trietilenoglicol, éter monoetilico de trietilenoglicol, éter monometilico de propilenoglicol, 10 éter monoetilico de propilenoglicol, éter monometilico de dipropileno glicol, éter monoetilico de dipropilénoglicol, éter monometilico de tripropileno glicol, glicerina, tetrahidrofurano, dimetilformamida, dioxano, acetona, e dimetoxietano.

Em algumas modalidades, o..‘solvente compreende água, etanol, glicerina, álcool isobutílico, etileno glicol, dietileno glicol, trietileno glicol, acetona, ou propileno glicol, que são compatíveis com os humanos.

Um solvente pode ser utilizado isoladamente, ou 20 dois ou mais solventes podem ser utilizados em mistura.

O detector pode ser composto com um agente espessante para aumentar a sua viscosidade de cerca de 50 para cerca de 2000 mPa.s, por exemplo, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000, 1250, 1500, ou 1750 mPa.s (a 25°C), formando desta forma um gel. Sob a forma de ^:gel, a aplicação do detector com uma escova de dente permite a limpeza simultânea do dente e a aplicação do detector.

Exemplos de agentes espessantes que podem ser utilizados incluem: aditivos sintéticos tais como, alginato 30 de sódio, alginato de propileno glicol, carboximetilcelulose de sódio, carboximetilcelulose de cálcio, carboximetil amido de sódio, fosfato de amido de sódio, poliacrilato de sódio, metil celulose, hidroxipropil

35/68 celulose, e poíivinilpirrolidona; espessantes naturais tais como goma ciamoposis, goma de feijão de alfarroba, goma de tara, goma de semente de tamarindo, goma arábica, goma de tragacanto, goma karaya, ácido alginico, carragenano, goma 5 xantano, goma gelano, goma curdlana, quitina, quitosana, e quitosamina; e agentes espessantes inorgânicos tais como o carbonato de cálcio, silicato de cálcio, pó de silica, silicato hidratado amorfo, e silica hidrofóbica. ^:

A fim de obter a viscosidade na gama de cerca de 10 50 a cerca de 2000 mPa.s, a quantidade de composição de agente espessante varia, dependendo do tipo de agente espessante. Por exemplo, quando a carboximetilcelulose de sódio possui um grande efeito de espessamento, a quantidade de composição pode ser cerca de 0,5 a 4% em peso, e quando 15 é a celulose de metila, a quantidade de composição pode ser cerca de 10 a 30% em peso.

Além disso, o detector ou sonda pode compreender aditivos tais como adoçantes, aromatizantes, e conservantes. Adoçantes adequados incluem sacarose, lactose, glicose, aspartame ou sacarina. Os agentes aromatizantes adequados incluem óleo de hortelã-pimenta, óleo de gaultéria, aromatizante de cereja, de laranja ou de framboesa. Os conservantes adequados incluem benzoato de sódio, vitamina E, alfa-tocoferol, ácido ascórbico, metil 25 parabeno, propil parabeno, ou bissulfito de sódio. Os lubrificantes adequados incluem estearato de magnésio, ácido esteárico, oleato de sódio, cloreto de sódio ou talco. Os agentes de desintegração adequados incluem o amido de milho, metilcelulose, poíivinilpirrolidona, goma 30 xantana, bentonita, ácido alginico ou ágar. Um comprimido pode conter o detector em mistura com excipientes nãotóxicos farmaceuticamente aceitáveis, que são adequados para a fabricação de comprimidos. í

36/68 > * r

Em outra modalidade, o kit do primeiro aspecto compreende ainda uma ou mais soluções de lavagem.

kit do sétimo ou nono aspecto compreende uma ou mais soluções de lavagem.

Uma solução de lavagem do kit do primeiro, sétimo ou nono aspecto, pode compreender uma solução para remover qualquer proteína não especificamente ligada a hidroxiapatita porosa, isto é, não-dessorvente. Por exemplo, uma solução de lavagem que não dessorve uma 10 proteína ligada à hidroxiapatita pode ser água, solução salina, tampão Tris, ou detergente suave, etc.. Como a cavidade oral contém proteínas abundantes, incluindo muitas das proteínas que se ligam à hidroxiapatita, uma solução de lavagem permite que a proteína não especificamente ligada à 15 hidroxiapatita seja removida do dente ou da amostra do mesmo, antes da aplicação do detector.

Em outras modalidades do kit do primeiro, sétimo ou nono aspecto, a solução de lavagem compreende íons de magnésio (Mg²⁺) , íons de dihidrogenofosfato de (H2PO4^_) , 20 íons de hidrogenofosfato (HPO4^2_) , íons de fosfato (PO4³) (coletivamente PO4), ou pode compreender uma pluralidade de soluções de lavagem, que podem, cada uma compreender os íons de magnésio (Mg²⁺) , os íons de dihidrogenofosfato de (H2PO4^-) , os íons de hidrogenofosfato (HPO4^2_) , ou os íons de 25 fosfato (PO³) , administráveis sequencialmente. Qualquer sal de magnésio solúvel pode ser usado, e qualquer dihidrogenofosfato, íons de hidrogenofosfato (HPO₄ ^2_) , ou sais de fosfato solúveis podem ser utilizados, desde que sejam não tóxicos, se aplicados in situ. Em uma modalidade, 30 a solução de lavagem compreende cloreto dè magnésio, ou dihidrogenofosfato de sódio. 0 destinatário especializado irá apreciar que outras soluções de lavagem capazes de

I

37/68 «* *

dessorção de proteínas, a partir de hidroxiapatita, estão disponíveis.

A solução de lavagem pode compreender o ácido hipocloroso (HOC1), hipoçlorito (NaOCl) ou o hipoclorito de cálcio (Ca(OCl)2) (coletivamente branqueador).

A solução de lavagem pode ser_; fornecida prontamente para uso. Alternativamente, a solução de lavagem pode ser fornecida como um concentrado para preparar a solução de lavagem em diluição com água. Alternativamente, a solução de lavagem pode ser fornecida como um ou mais componentes secos, para preparar a solução de lavagem em mistura com água.

A solução de lavagem pode compreender menos do que 1 mM, cerca de 1 mM, cerca de 2 mM, cerca de 3 mM, cerca de 4 mM, cerca de 5 mM, cerca de 6 mM, cerca de 7 mM, cerca de 8 mM, cerca de 9 mM, cerca de 10 mM ou mais de 10 mM de íons de magnésio. A solução de lavagem pode compreender menos do que 0,1 M, cerca de 0,1 M, cerca de 0,5 M, cerca de 0,6 M, cerca de 0,7 M, cerca de 0,8 M, cerca de 0,9 M, cerca de 1 M, cerca de 1,1 M, cerca de 1,2 M, cerca de 1,3 M, cerca de 1,4M, cerca de 1,5 M, cerca de 2 M, cerca de 10 M ou superior a 10 M de íons de magnésio. A solução de lavagem pode compreender menos do que 0,04 M,

cerca	de 0,04	M,	cerca	de	0, 08	M,	cerca	de	0,09 M,	cerca	de
0,1	M,	cerca	de	0,2 M	z	cerca	de	0,3	M,	cerca de 0,4	M,
cerca	de 0,5	M,	cerca	de	0, 6	M,	cerca	de	0,7 M,	cerca	de
0,8	M,	cerca	de	0, 9 M,	cerca de 1	M, cerca	de 1,5	M, cerca
de	2	M, cerca de	4	M,	ou	mais	do	que	4 M	de

dihidrogenofosfato, hidrogenofosfato ou íons de fosfato.

A solução de lavagem pode compreender cerca de 10% de branqueador (cerca de 0,4% de ”OC1), branqueador puro ou não diluído (cerca de 4% de ’0Cl) , ou pode compreender cerca de 20% (cerca de 0,8% de ’OC1) , cerca de

38/68 ’OC1), cerca de

50% (cerca de 2,0% de cerca de 60% (cerca de 2,4% de ~OC1), cerca de

70% (cerca de 2,8% de

OC1), cerca de

80% (cerca de 3,2% de cerca de 90% (cerca de 3,6% de ”OC1) ou cerca de

95% de branqueador teoria de 3,8% de 001).

Apesar de não desejar estar ligado a qualquer particular, pensa-se que o fornecimento de uma pluralidade de soluções de lavagem, concentração gradual de magnésio e/ou com um gradiente de fosfato, remove mais proteínas do que uma única concentração de solução de magnésio. Pensa-se que o branqueador não especificamente tira as proteínas ligadas partir de hidroxiapatita í

Assim, em uma modalidade do kit do primeiro, sétimo ou nono aspecto, uma única ou mais soluções de pluralidade lavagem, oü a de soluções de lavagem, pode

compreender uma solução de cerca	de 5 mM	de	cloreto	de
magnésio, uma solução de cerca	de 1 M	de	cloreto	de
magnésio, e/ou uma solução	de	cerca	de	0., 4 M	de
dihidrogenofosfato de sódio.
Onde uma ou mais (uma	pluralidade)	de	soluções	de

lavagem é aplicada, elas podem ser aplicadas em qualquer ordem. Alternativamente, onde uma ou mais (uma pluralidade) soluções de lavagem é aplicada, elas podem ser aplicadas, sequencialmente, na ordem de baixa concentração de magnésio (por exemplo, a 5 mM) , alta concentração de magnésio (por exemplo, 1 M) , dihidrogenofosfato (por exemplo, 0,4 M; ou hidrogenofosfato, ou fosfato). Alternativamente, uma solução de lavagem pode compreender, em combinação de magnésio e fosfato, por exemplo, cerca de 1 M de concentração de magnésio, e cerca de 0,4 M de dihidrogenofosfato, hidrogenofosfato ou fosfato.

39/68

Α lavagem pode ocorrer antes da detecção, ou depois da detecção, ou, antes e depois da detecção.

Como usado aqui, remove ou remoção refere-se a uma redução na concentração de proteína ligada à 5 hidroxiapatita.

Como aqui utilizado, uma amostra é uma porção ou parte do dente a ser usado, para a detecção ou diagnóstico de hidroxiapatita porosa. Uma amostra controle é uma porção ou uma parte do dente conhecido como 10 saudável e livre de hidroxiapatita porosa, e é usada para fins de referência, na detecção ou diagnóstico de porosidade na hidroxiapatita teste. A amostra pode ser obtida por enxague, esfrega, raspagem, descamação, perfuração ou semelhante. Um amostrador pode ser adaptado 15 para a obtenção de uma amostra por esfrega, enxague ou qualquer outro método de coleta conhecido pelo destinatário especializado.

Em uma modalidade do método, do quarto ao sexto aspecto, o dente é primeiramente limpo por escovação ou por 20 outros meios. 0 dente pode ser seco.

Em uma modalidade do kit do primeiro aspecto, da sonda do segundo aspecto, ou do método do quarto ao sexto aspecto, o detector é aplicado com um pincel, escova de dente, um esfregão de algodão, uma bola de algodão, ou 25 entornado a partir de um recipiente equipado com,um bico.

Conforme aqui utilizado, aplicado, aplicando ou aplicação tem o seu significado usual de colocar em contato com o detector, ou sonda, ou solução de lavagem, e o dente ou amostra dos mesmos, ou colocar em contato o 30 repórter e o detector ou proteína.

Depois da aplicação do detector ou da sonda, o detector ou sonda é incubado no dente durante um,.período de tempo suficiente para a ligação do detector à. proteína, ou

40/68 para a ligação da sonda à hidroxiapatita. O período de incubação pode ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, .9, 10, 15,

20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 s. Alternativamente, o tempo de incubação pode ser de 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4,

4,5, ou 5 min. Alternativamente, o tempo de incubação pode ser superior a 5 minutos, tal como 10, 15 ou 20 min. Após a incubação, o detector ou a sonda de excesso pode ser expelido, pela boca, com ou sem lavagem com água, ou com uma solução de lavagem.

O método ou utilização pode ser realizado dentro . ou sobre o dente in situ, em um indivíduo.

Alternativamente, o método ou o uso pode ser realizado dentro ou sobre o dente, ou de uma amostra do dente, após remoção a partir de um indivíduo.

O indivíduo inclui um mamífero. O mamífero pode ser um ser humano. O ser humano pode ser de qualquer idade.

O ser humano pode ter cerca dé 12 anos de idade. O ser humano pode ter cerca de 2 a cerca de 12 anos ' de idade, cerca de 4 a cerca de 10 anos de idade, ou cerca de 6 a cerca de 10 anos de idade. Alternativamente, o^: indivíduo pode ter de 12 a 20, 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 50 a 60, 60 a 70, 70 a 80, 80 a 90, ou de 90 a 100 anos de idade.

O indivíduo pode desenvolver hidroxiapatita porosa, depois de hidroxiapatita normal e esmalte normal 25 ter se desenvolvido, ou o indivíduo pode ter hidroxiapatita porosa ao longo do desenvolvimento.

Alternativamente, o indivíduo pode ser um animal doméstico, de zoológico, ou de companhia. Da mesma forma que se observa particularmente, que os métodos e 30 utilizações daqui são adequados aos seres humanos, eles também são aplicáveis aos primatas, animais de companhia, tais como cães e gatos, animais domésticos tais como cavalos, gado, ovelhas e cabras, animais de zoológico, tais

41/68 como felinos, canideos, bovídeos, e ungulados,^L ou animais de laboratório, tais como lagomorfos e roedores. Um indivíduo pode ser atingido, ou não, por um distúrbio dental (ou seja, livre de doença detectável).

0 poder do diagnóstico dos kits óu métodos divulgados aqui é baseado em condições de hidroxiapatita porosa (DDD e cáries) possuindo perfis de proteínas distintas (por exemplo, HMI: proteínas abundantes da Tabela 1, pouca ou nenhuma amelogenina; fluorose madura: vestígios 10 de quantidades de albumina e amelogenina; hipomaturação amelogênese imperfeita: amelogenina abundante). Defeitos diferentes podem requerer procedimentos de lavagem diferentes, antes de reparação . por mineralização, ou métodos de restauração diferentes e materiais (ou influenciar a escolha do mesmo). A concentração de proteínas do esmalte teste de um dente, ou amostra do mesmo, pode ser avaliada por vários meios, e a, condição envolvendo hidroxiapatita porosa pode ser diagnosticada com base na identidade das proteínas de abundância elevada em 20 relação ao controle.

Uma 'aplicação adicional da presente invenção é categorizar o subtipo de lesão de HMI (por exemplo, como .intacta ou quebrada), que pode influenciar o tipo de tratamento desejado (por exemplo, composições de proteínas 25 diferentes podem precisar de procedimentos de lavagem diferentes, antes da mineralização corretiva).

Como usado aqui, intacto tem o seu significado usual de ininterrupto, não lesionado ou inalterado, e é utilizado em relação à superfície do esmalte dos dentes.

Intacto, aqui, refere-se a uma lesão coberta com um escudo de esmalte rígido na superfície do dente, e é referido como uma lesão subsuperficial, indicando uma estrutura estratifiçada.

42/68

Em contraste, quebrado aqui se refere a uma lesão de HMI, cujo escudo de esmalte rígido, ou tornou-se interrompido devido a forças mecânicas, ou não estava presente inicialmente (talvez tenha sido perdido durante a 5 erupção do dente, ou não foi produzido durante o desenvolvimento).

Como usado aqui, superfície permeável se refere ao esmalte intacto ou quebrado, que permite o acesso de fluido oral ou qualquer outra solução (e componentes 10 associados, incluindo proteínas) em regiões da subsuperfície. Por outro lado, uma superfície impermeável refere-se ao esmalte intacto ou quebrado que bloqueia tal acesso.

Lesões de HMI que compreendem esmalte intacto, 15 apesar de compreender hidroxiapatita porosa, podem ou não apresentar hidroxiapatita porosa dental passível de detecção (ou seja, podem ter uma superfície permeável ou impermeável). Portanto, em algumas modalidades do primeiro, do sétimo, ou do nono aspectos, um kit pode compreender um 20 agente de permeabilização, ou um método do quarto ao sexto aspecto (por exemplo, permeabilização mecânica) pode compreender a permeabilização do dente ,ou de uma amostra do dente. Um agente ou método será utilizado no pré-tratamento de uma lesão que tem uma superfície impermeável.

Alternativamente, esse agente pode ser usado para acessar uma lesão previamente sujeita à remineralização ou mineralização corretiva.

Como usado aqui, permeabilizar ou permeabilização refere-se à abertura de poros no esmalte 30 impermeável com dimensão suficiente para permitir que o detector e/ou a solução de lavagem tenha acesso à hidroxiapatita porosa, e/ou permita a remoção de proteínas.

43/68 agente de permeabilização é uma formulação capaz de permeabilizar a camada superficial de esmalte (por exemplo, o mesmo pode compreender um ácido ou algum outro agente conhecido pelo destinatário especializado para 5 permeabilizar o esmalte). 0 agente de permeabilização pode estar sob a forma de uma solução, ou de um gel, por exemplo.

Em algumas modalidades do primeiro, do sétimo ou do nono aspecto, um kit pode compreender um agente de 10 remineralização, ou o método pode compreender a remineralização do dente, ou da amostra do mesmo. Um agente de remineralização pode compreender flúor, fosfato de cálcio solúvel ou fosfato de cálcio amorfo, que podem ser estabilizados com moléculas bioativas.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - A composição da proteína do Esmalte da HMI depende da integridade da superfície

MATERIAIS E MÉTODOS ........' ----1-- _t

Amostras

Amostras humanas e de ratos : da espécie SpragueDawley foram obtidas com as devidas aprovações éticas, e armazenadas a -80°C. A HMI foi diagnosticada de acordo com critérios padrão (Weerheijm, 2003). Depois da extração, os dentes da HMI foram enxaguados com água para remover o sangue visível, e em seguida, secos com papel absorvente e armazenados sob congelamento, imediatamente. ’ A saliva total, estimulada pela mastigação em cera, foi clarificada por centrifugação (20.000 g, 5 min.) antes do armazenamento. O soro e os eritrócitos foram preparados 30 convencionalmente a partir de sangue de ratos com 6 dias de idade. A matriz secretora do esmalte foi isolada a partir de ratos com dentes em desenvolvimento, como do modo

/68

I

anterior (Hubbard, 1996), exceto pelo uso dos primeiros molares de 5 dias de idade. ;

Caracterização das proteínas do esmalte

Lesões de HMI evidentes foram coletadas a partir de amostras recém descongeladas, raspando com um bisturi, tendo o cuidado de evitar cárie no esmalte e na dentina. O esmalte normal foi amostrado utilizando uma broca dental girando lentamente (n° 6) . Imediatamente depois, as amostras de esmalte (2-5 pL de volume concentrado) foram suspensas em 10% de ácido trifluoroacético (10 volumes, 10 min à temperatura ambiente, com vorticidade e sonicação em banho), e depois centrifugadas (20.000 g, 4°C, 5 min.) para sedimentar a proteína insolúvel em ácido. Os péletes foram solubilizados em tampão carregado de gel contendo 2% de SDS e 100 mmol/L de ditiotreitol (Hubbard, 1996), com inibidores de protease adicionais (1 mmol/L de fluoreto de fenilmetilsulfonila, 1 mmol/L de benzamidina, 5 pg/mL de pepestatina, 5 pg/mL de leupeptina), onde indicado. Os extratos de SDS foram quantificados por dot blotting com negro de amido e submetidos a mini SDS-PAGE com coloração com Azul de Coomassie ou immunoblotting (Hubbard, 1995). Um anti soro de amelogenina foi criado convencionalmente em l coelhos, usando amelogenina recombinante de rato (SEQ ID NO: 19), como imunogênio.

Análise proteômica

As bandas de gel foram submetidas a tripsinolisis e espectrometria de massa em tandem, como do modo anterior (Mangum et al., 2006), exceto pelo uso de um instrumento de armadilha de íons, com nanospray baseado em chip (ChipLC/MSD XCT, da Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). As proteínas f.oram identificadas utilizando o mecanismo de pesquisa MASCOT, e o banco de dados humano SwissProt com

45/68 critérios de aceitação estritos (no mínimo, duas etiquetas de sequências (Mangum et al., 2006)).

Ensaios de ligação a Minerais

O fluido oral simulado foi preparado empiricamente por amostras de saliva com soro e eritrócito lisado, de modo que as proteínas mais importantes de todos os três componentes foram similarmente abundantes (Figura 4B). Para o ensaio de ligação à proteína, o fluido oral foi incubado com 0,1 volumes de hidroxiapatita (de Sigma, St.

Louis, MO, EUA), ou esmalte da HMI, durante 60 min. a 20°C, e em seguida, centrifugado (2.000 g, 2 min.). Após lavagem em 3 volumes de 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), o pélete foi extraído com ácido trifluoroacético e SDS, como descrito acima para o esmalte.

RESULTADOS

O esmalte da HMI é enriquecido com, proteínas nãoamelogeninas

A caracterização de proteínas de esmalte forneceu informações úteis para a patogênese da fluorose e 20 amelogênese imperfeita, particularmente, pela ligação dos níveis de amelogenina com propriedades clínicas. Por conseguinte, as amostras de esmalte da HMI não fixadas foram investigadas, utilizando uma abordagem de' SDS-PAGE. Ao contrário do esmalte normal, o esmalte da HMI gerou 25 precipitados visíveis, quando dissolvido em ácido, o que sugere um teor de proteína relativamente elevado. Como mostrado na Figura 1, a quantificação da proteína: insolúvel em ácido, a partir de cinco graves lesões renderam valores de 3-15 vezes maiores do que o normal (0,3-1,5% de proteína 30 em p/p) . Da mesma forma, o SDS-PAGE com coloração com Coomassie revelou numerosas bandas de proteína em esmalte da HMI contrastantes com bandagem dificilmente detectável em esmalte normal (Figura 2A) . Desde que as amelogeninas

I

46/68 • 15 foram não detectadas (Figura 2A, região 20-25kDa), a técnica immunoblotting foi utilizada para uma maior sensibilidade. A anti-amelogenina também falhou em detectar amelogeninas intactas em esmalte de HMI, mas os fragmentos degradativos foram observados em algumas amostras (Figura 2B, amostra 11). As amelogeninas foram indetectáveis em esmalte normal sob estas condições (não mostrado). A comparação quantitativa com a matriz do esmalte em fase de secreção revelou que o esmalte de HMI continha apenas 0,12% ± 0,06% (± SE, n = 6) da quantidade de amelogeninas detectáveis totais (Figura 2B, região 8-25kDa). Concluiu-se que o esmalte de HMI é rico em proteínas, e por razões patogênicas diferentes da retenção de amelogenina.

Proteínas de fluidos corporais predominam em esmalte de HMI

Para identificar os constituintes principais da proteína do esmalte de HMI, as bandas em SDS-PAGE foram submetidas à análise proteômica. Como mostrado na Figura 3, e na Tabela 1, uma grande variedade de proteínas foram identificadas (16 produtos gênicos distintos), 13 dos quais são encontrados na saliva e no fluido creviculár. Os três outros (hemoglobina, albumina e Complemento C3) são os principais componentes do sangue. Por conseguinte, todas as principais proteínas identificadas em esmalte de HMI são normalmente associadas aos fluidos corporais encontrados de forma intra-oral.

Tabela 1. Proteínas identificadas em esmalte de

HMI com superfície intacta (amostras 1 a ,6) e com alterações pós-eruptivas (amostras 7 a 11).

Nome(UniProt acc.)	Localização do fluido corporal	Massa (kDa)	Amostras Identifi- cadas em	Peptideos (n)	Cobertura ' (%)	Con- tagem MASCOT
		Obser- vada	Teó- rica

47/68

·>

Albumina	Soro,	70	69	1	16	21	426
Sérica	saliva, GCF			3	2	4	89
(P02768)				4	15	26	471
				5	10	21	197
				6	9	' 15	389
				10 '	7	14	212
				3	3	8	87
		60		5	7	18	323
				6	12	15	389
				10	14	24	461
		40		10	2	5	47
			10	3	2	50
		32		7	5	8	136
		10
Cadeia beta Complemento C3 (P01024)	soro	70	71	•7	2	1	165
Alfa-1-	soro,	40	44	7	14	33	308
antitripsina	saliva, GCF	25-30	7	3	16	122
(P01009)
Proteína		25-30	13 13	7	3	24	54
S100-A9	Saliva,GCF	13.	7	5	37	212
(P06702)		13	11	6	56	158
Lacto-
transferrina	Saliva, GCF	70	78	11	2	4.	155
(P02788)
Inibidor de leucócitos	Sangue,	40	43	7	4	9	172
elastase (P30740)	saliva
Antitrombina	Soro,
-III	40	53	7	2	4	121
(P01008)	saliva
Subunidade
alfa da	Sangue,	13	15	7	6	38	117
Hemoglobina	saliva	13	11	5	-23	115
(P69905)
Subunidade		13		7	12	63	374
beta da	sangue,	13	16	10	2	12	51
Hemoglobina	saliva, GCF	13	11	11	63	207
(P68871)
Subunidade delta da Hemoglobina (P02042)	Sangue, saliva	13 13	16	7 11	8 6	40 50	190 145
Proteína
induzida por prolactina(P	Saliva	13	17	11	2	15	85
12273)
Alfa-amilase	Saliva	60	57	8			131
2	7
1 (P04745)
Região SIE		25-30		7	2	, 16	130
de cadeia v-	Sangue,	25-30	12	8	2	' 16	67
III Ig kappa	saliva	25-30	11	2	16	91
(P01620)
Região de	Sangue,	60	37	10	3	7	109

48/68

cadeia C Ig alfa-2 (P01877)	saliva
Proteína descaracterizada c6orf58 (Q6P5S2)	Saliva	32	38	10	4	14	68
Serpina B3 (P29508)	Sangue, saliva	27	45	10	2	4	48

Lesões de HMI intactas e quebradas têm perfis distintos de proteínas

Dada a diversidade clinica dé lesões de HMI (cor, consistência, tamanho, superfície, integridade), foi 5 investigado se as apresentações diferentes têm diferentes composições de proteínas. A avaliação dos perfis >de proteína (Figura 2A) conduziu à hipótese de que a integridade da superfície do esmalte apresenta uma importante influência. Notavelmente, quando as lesões foram 10 agrupadas comò intactas e quebradas, os padrões de bandas de proteínas apareceram qualitativamente semelhantes dentro de cada grupo, mas duas diferenças marcantes foram aparentes entre os grupos (Figura 2A, regiões 12-kDa & 66kDa) . A banda de 12 kDa, que estava evidente nas lesões 15 quebradas, mas não nas intactas, habitualmente continha hemoglobina como um componente principal (Figura 3) . Por outro lado, em lesões intactas, a banda de 66 kDa, rotineiramente continha apenas albumina, ao contrário das lesões quebradas, onde a albumina foi encontrada raramente 20 em níveis mais baixos.

A estabilidade dos perfis de proteína também foi questionada, notando-se a evidência da degradação da proteína (Figura 3: albumina, Complemento C3) e o papel essencial da proteólise na maturação do esmalte. De fato, 25 quando as amostras solubilizadas por SDS da Figura 2A foram analisadas novamente após armazenagem congelada, as bandas de albumina haviam desaparecido completamente a partir de amostras intactas (Figura 2C) . As amostras quebradas, no

49/68 entanto, foram amplamente não afetadas, (não mostrado). Os inibidores de das amostras protease tiveram pouco efeito sobre os perfis frescas de HMI quando adicionados durante a etapa inicial de solubilização de SDS (não mostrado). Estes resultados evidenciam o risco de proteólise artefatual e, portanto, apenas a primeira execução das amostras é relatada (Figuras 1

Concluiu-se que as lesões intactas e quebradas consistentemente têm perfis de proteína distintos, apoiando a hipótese de que integridade da superfície influencia a composição de proteína de esmalte de HMI.

A composição de proteína de esmalte de HMI varia conforme a integridade da superfície

Sabe-se que as lesões de

HMI apresentam porosidade subsuperficial, e que a albumina hemoglobina se ligam intensamente à hidroxiapatita.

Com isso, foi postulado que as proteínas do fluido oral permeiam esmalte de

HMI, e se ligam seletivamente aos cristais de hidroxiapatita, sujeitos à ausência .-. de uma camada de superfície intacta. Quando as lesões quebradas foram comparadas com saliva, soro e eritrócitos, semelhanças coletivas nos padrões de bandas de proteína foram encontradas resultaram

Em contraste, as lesões intactas em uma semelhança intrigante ao soro sozinho.

Estes resultados de acordo com proteínas de fluidos orais foram excluídos de lesões intactas, mas não de lesões quebradas. Em seguida, uma lesão quebrada foi modelada pela exposição de hidroxiapatita em pó, ao fluido oral simulado (combinação de saliva, soro, e extrato de eritrócito). A definição do perfil da fração de ligação à hidroxiapatita (Figura 4B) revelou uma semelhança, notável com as ¹ lesões quebradas (Figuras 2A, 4A) . Quando a hidroxiapatita foi substituída com esmalte em pó, feito a partir de uma lesão

50/68 intacta (isto é, à quebra do modelo da camada superficial), o perfil foi novamente semelhante às lesões quebradas (Figura 4C). Estes resultados indicaram que a composição_;de proteína de esmalte de HMI é fortemente influenciada pela integridade da.superfície de esmalte.

Quando o fluido oral simulado, que compreende albumina e hemoglobina foi aplicado à hidroxiapatita, à albumina e à hemoglobina ligada à hidroxiapatita (Figura 5). A lavagem sequencialmente em cada um dos 5 mM de MgCl₂, 1 M de MgCl₂, e 0,4 M de NaH₂PO4 durante 5 min. cada, removeu >90% da proteína de hidroxiapatita (Figura 5). DISCUSSÃO

Dadas as preocupações crescentes sobre HMI pelo mundo, existe uma necessidade urgente para elucidar a composição de proteína de esmalte hipomineralizado. É aqui revelado que o esmalte de

HMI tem um teor de proteínas substancialmente maior do que o normal, mas a um nível próximo do normal de amelogeninas residuais. Esta característica distingue

HMI de defeitos de hipomaturação que contêm amelogeninas imperfeita, fluorose) e, por sua vez, tipifica a HMI como um defeito de hipocalcificação. Em segundo lugar, foi descoberto que o esmalte de

HMI acumulou várias proteínas do fluido oral e sangue, com incorporação diferencial, dependendo da integridade da superfície de esmalte.

Patogenicamente, estes resultados apontam para um distúrbio pré-eruptivo de mineralização envolvendo a albumina e, em casos de alterações pós-eruptivas, a adsorção subsequente de proteína à matriz de hidroxiapatita exposta. Essas percepções para a patogênese e propriedades de esmalte de HMI são importantes para a prevenção, o diagnóstico e o tratamento de HMI.

51/68

Os presentes resultados ajudam a explicar as propriedades clínicas e biofísicas do esmalte de HMI. As elevações observadas de 3-vezes a 15-vezes no conteúdo de proteína é semelhante a relatórios para a amelogênese 5 imperfeita e fluorose (2,5-vezes a 30-vezes), e parece ser suficiente para explicar a fraqueza mecânica característica do esmalte de HMI. 0 baixo teor residual de amelogeninas compara o esmalte de HMI aos tipos hipocalcifiçados de amelogênese imperfeita. 0 esmalte dos últimos distúrbios é 10 descrito clinicamente como acentuadamente mais macio do que o normal, friável ou caseoso, o que coincide com as descrições do esmalte de HMI. Ao nível das proteínas, o esmalte de HMI aparece como distinguível de tipos hipocalcifiçados de amelogênese imperfeita e fluorose, 15 particularmente com base no seu teor excepcionalmente elevado de albumina. No entanto, todas as condições são caracterizadas por hidroxiapatita porosa.

Estes resultados também elucidam a patogênese de HMI, apontando para as etapas pré e pós-eruptivas que são 20 mecanicamente distintas. Na etapa pré-eruptiva, a espessura normal e o baixo teor de amelogenina: no esmalte de HMI (<0,2% do nível da fase de secreção) indicam que as amelogeninas são secretadas e, em seguida, removidas de forma eficaz. Segue-se que a HMI não é, de forma primária, 25 um defeito de maturação. Por analogia à amelogênese imperfeita hipocalcifiçada, o cuidado então volta ao início da mineralização defeituosa. O perfil de proteína indicou que a albumina se acumula no esmalte de HMI, apesar da remoção quase completa de amelogeninas.

Em outras palavras, a hipocalcificação é um subtipo de hipomineralização, sendo o outro subtipo, a hipomaturação. Como mostrado aqui, a HMI e alguns tipos de amelogênese imperfeita, e provavelmente alguns tipos de

52/68

fluorose	também,		destacam-se	como	defeitos	de
hipocalcificação,	já	que	possuem	baixas	quantidades	de
amelogenina.	Isto	é,	o	processo	normal	de remoção	de
amelogenina	(maturação	do	esmalte)	ocorreu,	mas não ocorreu

a calcificação. Nos defeitos de hipomaturação, no entanto, (tipos imaturos de amelogênese imperfeita e fluorose), a remoção de amelogenina (maturação do esmalte) não ocorreu em um grau importante, e é a presença continuada de amelogenina que impede a calcificação.

Os níveis de amelogenina são relativamente baixos em tipos de hipocalcificação de DDD/hipomineralização, mas mais perto de níveis normais em tipos' de hipomaturação de DDD/hipomineralização (como alguns tipos de amelogênese imperfeita e fluorose dental). Portanto, as variações nos níveis de amelogenina e das proteínas restantes aqui reveladas, ligadas à hidroxiapatita dental porosa, podem ser informativa (por exemplo, diagnóstico), individualmente ou em combinação, como por exemplo, como uma taxa.

Pela primeira vez, estes resultados demonstram albumina em excesso sendo acumulada no esmalte humano mal formado. Notavelmente, as lesões intactas foram descobertas contendo albumina, mas não proteínas de fluidos orais numerosas com potencial de ligação à hidroxiapatita demonstrado. A albumina, mas não a hemoglobina foi proeminente, mas está atribuída, ou a um vazamento vascular pequeno de soro em vez de sangue total, ou à estabilidade proteolítica elevada de albumina em relação à hemoglobina e outras proteínas do sangue, durante a maturação do esmalte. Com efeito, ..a albumina é resistente à peptidase 4 relacionada à calicreína, a principal protease implicada na remoção de amelogenina.

Estes resultados implicam também em outra etapa patogênica, seguinte ao distúrbio pós-eruptivo da

53/68 superfície do esmalte. Esta segunda etapa envolve a ligação relativamente confusa de proteínas de fluido oral à matriz de hidroxiapatita exposta.

As proteínas aqui identificadas têm utilidade potencial como biomarcadores para a caracterização clínica das lesões de HMI.

Exemplo 2 - Produção e Teste de uma sonda para hidroxiapatita porosa

MATERIAIS E MÉTODOS

SMCC (éster de N-hidroxisuccinimida do ácido succinimidil 4-[N-maleimidometil]ciclohexanocarboxílico;

CAS#: 64987-85-5) é um agente de reticulação heterobifuncional não clivável, com reatividade de amina e sulfidrila, separado por um braço espaçador de 8,3 Â. Negro 15 de amido (CAS #: 1064-48-8) é um corante comum a,zul/negro aqui utilizado como um repórter colorido que contém um grupo de amina primária. A hemoglobina bovina (CAS#: 900802-0) é um heterotetrâmero que consiste de dois pares de cadeias polipeptídicas (a e β; SEQ ID NOs: 20 e 21, respectivamentè). A cadeia β tem um único resíduo de cisteína contendo sulfidrila e exposto ao solvente, enquanto que a cadeia a não possui cisteínas.

SMCC (75 mM em dimetilsulfóxido) foi adicionado a

9-volumes de negro de amido (37,5 mM em tampão de fosfato 25 salino (PBS, 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KC1, 10 mM de fosfato de sódio dibásico, pH 7,4)) e incubado por 30 minutos a 21°C. O excesso molar de 5 vezes de negro de amido assegurou· uma marcação máxima de SMCC (a criação de um repórter colorido ativado por maleimida, Figura 27) .

Após a conjugação, a solução foi dessecada por centrifugação a vácuo, e armazenada a -80°C.

A hemoglobina (20 mg/mL; 0,65 pmol de cisteínatiol/mL) foi preparada pela dissolução-em PBS que continha

54/68 mM de TCEP (tris (2-carboxietil) fosfina, um agente de redução de não-tiol usado para manter o estado de cistinasulfidrila) e 5 mM de EDTA (ácido etilenodiaminatetraacético, um quelanté de metal usado para 5 reduzir o potencial de catálise do oxidante/radical e subsequente a oxidação de tiol). Após uma incubação de 30 minutos a 21°C, a hemoglobina reduzida foi dialisada contra 1.000 volumes de PBS, durante 2 horas, para esgotar TCEP e EDTA (esta etapa pode ser opcional) . A hemoglobina foi 10 levada à próxima etapa, imediatamente, para minimizar a oxidação de cisteina-tiol.

O negro de amido dessecado ativado por maleimida foi dissolvido em hemoglobina a um negro de amido: razão molar de tiol de 10:1, para assegurar à máxima marcação de 15 hemoglobina. Após incubação durante 2 horas a 21°C, a hemoglobina conjugada por negro de amido foi dialisada extensivamente contra PBS (até o dialisado permanecer incolor, para 1 ml desta, foram necessárias de 24 a 48 horas), para remover o negro de amido de ligação não20 covalente. Após a diálise, a sonda foi preparada para a utilização.

RESULTADOS

Dentro dos 5 minutos de aplicação da sonda, a hidroxiapatita mudou de cor, do branco ao azul escuro 25 (Figura 29). A sonda resistiu à lavagem em água, ao passo que somente o negro de amido (isto é, não ligado a Hb) foi removido por lavagem com água. A sonda foi removida da hidroxiapatita com um procedimento de três etapas de lavagem que compreende a lavagem, de modo sequencial, em 30 cada um dos 5 mM de MgC12, 1M de MgC12, e 0,4 M de NaH₂PC>4 durante 5 minutos (Figura 29).

DISCUSSÃO

55/68

Um requisito chave do projeto foi a preservação da função da hemoglobina de ligação à hidroxiapatita, após a conjugação ao repórter colorido. Císteína-tióis da hemoglobina foram direcionadas porque dois das quatro 5 subunidades da proteína carregam uma cisteína simples (não em interfaces de ligação); as outras duas subunidades de cisteína ausentes. A sonda de tetrâmero resultante, portanto, contém duas subunidades da proteína não modificadas, mantendo assim, pelo menos, metade dos locais 10 nativos ligados à hidroxiapatita por unidade funcional. Um método de 2 etapas foi exemplificado: o primeiro produziu um conjugado SMCC-repórter colorido (Figura 27), o segundo utilizou o conjugado SMCC-repórter colorido para marcar a hemoglobina (Figura 28). Aqui a prova de princípio foi 15 estabelecida para a concepção, produção' e teste de uma nova sonda que detecta hidroxiapatita porosa.

Exemplo 3 - A Sonda Liga-se ao Esmalte Dental

Poroso Especificamente (Figura 30)

MÉTODOS

Para testar se a sonda do Exemplo 2 se liga ao esmalte poroso especificamente, uma lesão cariada complexa foi revestida com a sonda, e em seguida, lavada cuidadosamente.

Um primeiro molar humano que continha uma grande 25 região de cáries (esmalte poroso, região branca opaca) foi fotografado antes e após a aplicação da sonda (Figura 30). A sonda foi aplicada a toda a região da coroa do dente, utilizando uma escova, por um período de um minuto. Após a aplicação da sonda, o dente foi enxaguado com água corrente 30 durante 10 segundos, fotografado, e em. seguida, o dente foi lavado novamente por dois minutos adicionais e fotografado. RESULTADOS esmalte normal não foi marcado.

56/68 f

9,·

Regiões de caries abertas foram marcadas fortemente e especificamente, no entanto, a marcação foi irregular em alguns lugares. As regiões com cáries não marcadas exibiram uma superfície brilhante que era resistente a arranhões, ao passo que as regiões marcadas possuíam uma superfície sem brilho, que podería ser facilmente arranhada. Isto indica que as áreas de cáries irregulares não marcadas podem ser devidas à remineralização da camada de superfície. Deste modo, a sonda é capaz de discriminar entre cáries ativas e inativas.

As regiões de esmalte quebrado durante a extração do dente (marcação por fórceps) também foram marcadas, indicando que a sonda pode detectar regiões de esmalte que possuam superfície violada.

A sonda forneceu um nível estável de marcação, independente do tempo de lavagem com água.

Exemplo 4 - A Sonda Pode Detectar Especificamente a

Desmineralização Precoce da Superfície do Esmalte (Modelo de Cáries Incipientes) (Figura 31)

MÉTODOS

Para testar se a sonda do Exemplo 2 pode detectar especificamente cáries iniciais, lesões artificiais de cáries foram produzidas em esmalte com superfície normal, usando um pouco de ácido forte (antes da aplicação da sonda).

Um primeiro molar humano foi mostrado por fotografia, antes e após a aplicação da sonda, para ser livre de cáries anteriormente ao tratamento com ácido (Figura 31) . Três regiões de esmalte foram, em seguida, expostas ao ácido (0,5 pL 85% de H3PO4) por 1, 3 ou 10 minutos, para introduzir lesões artificiais de cáries antes de serem lavadas com 100 mL de TBS (Tris a 25 mM, pH 7,2,

57/68

160 mM de NaCl) por dois minutos, e em seguida, em água corrente por mais dois minutos. 0 dente foi seco sob ar, e a sonda foi ãplicada a toda a área por três minutos, utilizando uma escova. Após a aplicação, a sonda não ligada foi removida por limpeza, primeiro com papel absorvente e, em seguida, por enxague com água corrente durante 10 segundos. Para remover a sonda ligada, 10% de branqueador (0,4% de NaClO) foi aplicado com uma escova, durante 10 segundos.

RESULTADOS

A sonda não se ligou a quaisquer regiões do esmalte livres de cáries.

O tratamento cauterizado com ácido rendeu três regiões do esmalte ligeiramente opacas/sem brilho, o qual 15 seguiu um perfil de rigor dose-dependente (10>3>l min). As três regiões cauterizadas foram todas detectadas pela sonda, de uma maneira dependente do rigor; o esmalte não cauterizado não foi marcado.

A ligação à sonda resistiu à lavagem em água, embora a intensidade do sinal tenha diminuído ligeiramente. A sonda pode ser quantitativamente removida pela aplicação de branqueador a 10% durante 10 segundos.

Exemplo 5-0 Mecanismo de Ação da Sonda é a Afinidade à Hidroxiapatita (Figura 32)

O esmalte do Exemplo 4 (Figura 31) foi tratado novamente com a sonda do Exemplo 2 para verificar um mecanismo de ligação à hidroxiapatita.

MÉTODOS (A)

Para excluir um mecanismo de coloração de proteínas, a sonda foi aplicada ao esmalte cauterizado que tinha sido tratado com branqueador (isto é, desprovido de proteína).

RESULTADOS (A)

58/68 esmalte clareado foi marcado pela sonda de forma semelhante ao não clareado (Figura 32, comparar os painéis A2 e A4) . Esta descoberta exclui um mecanismo de coloração de proteína para marcação da sonda do esmalte 5 cauterizado.

MÉTODOS (B)

Foi proposto que, se o mecanismo de ação da sonda é a ligação à hidroxiapatita, então o pré-tratamento BSA deve bloquear a ligação à sonda (inibição competitiva).

O esmalte do painel A foi exposto a uma proteína de ligação à hidroxiapatita conhecida (10% de albumina de soro bovino, BSA), ao aplicar com uma escova, durante um minuto, seguido por enxague com água, durante um minuto. Após o tratamento com BSA, a sonda foi aplicada como da 15 forma anterior. A BSA foi retirada pelo tratamento de branqueamento, e a sonda foi re-aplicada.

RESULTADOS (B)

A aplicação de BSA não irá alterar a aparência do esmalte (Figura 32, Painel B2). A BSA bloqueou a ligação da 20 sonda (Figura 32, Painel B3). A ligação da sonda foi restaurada após a decapagem de BSA (Figura 32, Painel B6) . Juntos, esses resultados demonstram que o mecanismo de ação da sonda é a ligação à hidroxiapatita, e não a ligação à proteína. Dada a possibilidade de inibição competitiva, por 25 outras proteínas ligadas à hidroxiapatita, o pré-tratamento para remover as proteínas pode melhorar a sensibilidade da sonda, e assim minimizar os resultados falsos negativos.

Exemplo 6 - A Sonda Marca Especificamente o Esmalte

Hipomineralizado e a Dentina Anormal (Figura 33)

MÉTODOS

Para testar se a sonda do Exemplo 2 podería ser usada para delinear tecidos dentais anormais, uma parte do

59/68 dente que continha esmalte e dentina normal e anormal, foi tratada com a sonda.

Um dente fraturado que exibia uma região de hipomineralização na subsuperfície foi escolhido para 5 simular um caso clinicamente difícil, onde os limites da lesão são obscuros e complexos. Uma breve pré-exposição à sonda levou à demarcação da fronteira esmalte-dentina. A amostra foi em seguida fotografada antes (esquerda) e depois (direita), a sonda foi aplicada com uma escova, 10 durante 30 segundos (figura 33) . Após a aplicação, a sonda não ligada foi removida por enxague com água durante 30 segundos.

RESULTADOS

Antes da aplicação da sonda, várias estruturas 15 podem ser identificadas: (1) esmalte normal, que cobriu (2) o esmalte hipomineralizado (na cor rosa com uma borda vermelha em algumas regiões), (3) a dentina aparentemente normal (rígida) e (4) dentina anormal (macia/resistente). Após a aplicação da sonda, todos os quatro tipos de tecido 20 puderam ser facilmente discernidos.

O esmalte e a dentina normais foram não-marcados. O esmalte hipomineralizado foi uniformemente e, especificamente marcado com uma cor violeta intensa, que apareceu para traçar uma fronteira muito complexa em toda a 25 região da subsuperfície. A dentina anormal (devido potencialmente à cárie e/ou defeitos de desenvolvimento) foi especificamente e uniformemente marcada com uma cor verde profunda, que apareceu para traçar as fronteiras complexas contra a dentina normal. Juntos, esses dados 30 confirmam que a sonda pode especificamente marcar esmalte hipomineralizado e dentina anormal.

Exemplo 7 - A Sonda Pode Ser Usada para Guiar a.Remoção de Esmalte Hipomineralizado (Figura 34)

60/68

MÉTODOS

O esmalte Hipomineralizado do Exemplo 6 (Figura

33) foi removido usando uma lâmina de bisturi e repetidamente re-sondado com a sonda do Exemplo 2, para 5 controlar o progresso. As características físicas do esmalte foram observadas em cada etapa (Figura 34, ver descrição nos painéis abaixo).

RESULTADOS

Os painéis superiores da Figura 34 mostram a 10 amostra após a remoção do esmalte hipomineralizado, enquanto que os painéis inferiores mostram a mesma amostra após a aplicação da sonda.

Os painéis 1 a 3 mostram a remoção gradual de pequenas regiões de esmalte hipomineralizado. Os painéis 4 15 a 6 mostram a tentativa de remoção de toda a região, e as regiões de remoção incompleta (compare, os painéis superior e inferior). Nota-se que, como o esmalte hipomineralizado foi removido, as características físicas alteraram significativamente, em paralelo, com o grau de marcação, ao 20 ponto final em que o esmalte remanescente era fisicamente uniforme e não corado pela sonda (Painel 6).

A dentina anormal não foi destinada neste exemplo.

Exemplo 8 - A Sonda Pode Ser Usada para Guiar a Remoção de 25 Dentina Anormal (Figura 35)

MÉTODOS

A dentina anormal do Exemplo 6 (Figura 33) foi removida com uma lâmina de bisturi e iterativamente resondada com a sonda do Exemplo 2, para monitorar o 30 progresso de remoção. As características físicas da dentina foram anotadas em cada etapa (Figura 35, ver descrição nos painéis abaixo).

RESULTADOS

61/68 ι*

Os painéis superiores da Figura 35 mostram a amostra após a remoção da dentina anormal, enquanto que os painéis inferiores mostram a mesma amostra após a aplicação da sonda. 0 painel 1 mostra uma coloração intensa da 5 dentina anormal, que é reduzida drasticamente com a remoção e re-sondagem (por exemplo, comparar os painéis inferiores 1 e 2) . Os níveis reduzidos de marcação pela sonda se correlacionam com o caráter físico melhorado da dentina (por exemplo, no painel 4, a rigidez da dentina foi 10 uniformemente normal por avaliação física, e em grande parte não corada, após a aplicação da sonda). Nota-se que, mesmo após a remoção completa da dentina anormal, um baixo nível de coloração de fundo é aparente (presumivelmente devido à alta porosidade da dentina com relação ao 15 esmalte).

Exemplo 9 - A Detecção de Dentina Anormal pela Sonda Pode ser Melhorada Por uma Lavagem de Branqueamento (Figura 36) MÉTODOS

Para testar se a especificidade da sonda para a 20 dentina, tal como mostrado no Exemplo 8, pode ser melhorada, uma lavagem de branqueamento foi usada para reduzir a coloração da dentina normal.

Um molar humano, com a dentina normal e anormal expostas, foi exposto à sonda do Exemplo 2 (aplicação com 25 escova por um minuto, seguida de enxague com água, durante um minuto) e, posteriormente, exposto a uma lavagem com branqueador (aplicado com escova, durante 10 segundos, e em seguida enxaguado com água por um minuto). Seguindo a aplicação da sonda/branqueador, as regiões marcadas foram 30 removidas com uma lâmina de bisturi, e em seguida, resondadas/branqueadas para monitorar o progresso (Figura 36) .

RESULTADOS i

62/68

1*

A dentina anormal foi preferencialmente detectada pela sonda, no entanto, a coloração de fundo da dentina normal, diminuiu a confiança na demarcação das fronteiras. A aplicação de 10% de branqueador (0,4% de NaOÇl) durante 5 10 segundos, melhorou a resolução através da redução de marcação na dentina normal, mas não na anormal. A aplicação de branqueador puro (4% de NaOCl) durante 10 segundos removeu completamente a marcação da dentina normal, sem afetar a marcação da dentina anormal, resultando na 10 delineação muito mais clara de dentina anormal.

Após o branqueador puro, a dentina anormal foi removida (Painel 4), e em seguida, re-sondada/branqueada (Painel 5), mostrando que a maioria, mas não toda a dentina anormal foi removida. Outra etapa de , remoção/re15 sondagem/branqueamento mostrou que a dentina anormal foi completamente removida. A dentina remanescente foi fisicamente indistinguível da dentina normal.

Em conjunto, estes resultados sugerem que a etapa de extração da. proteína, após a aplicação da sonda pode 20 ajudar a reduzir a marcação de fundo da dentina normal, reduzindo leituras de falsos positivos potenciais.

Exemplo 10 - A Sonda Pode ser Opaca aos Raios-X (Figura 37) MÉTODOS

A sonda se tornou radiopaca pela substituição do 25 cromóforo azul (negro de amido) do Exemplo 2 para o ácido 5-amino-2,4,6-triiodoisoftálico (³I), um composto precursor utilizado na radiografia médica (por exemplo, para angiografia cerebral). Este composto foi escolhido devido à disponibilidade de uma amina primária única que pudesse ser 30 usada para o acoplamento com o mesmo agente de reticulação usado na sonda azul.

Para acoplar ³I à hemoglobina, o seguinte procedimento foi utilizado:

63/68

1. 1,25 mg de SMCC (agente de reticulação) foi dissolvido em 50 pL de DMSO (75 mM de SMCC).

2. ³I foi preparado como se segue: 30 mg foi dissolvida em 1 mL de 0,1 M de NaOH (50 mM de ³I), 250 pL

5 de	0,1 M de HEPES a	pH 7	,0	foi adicionado,	em	seguida, o pH
foi	ajustado para 7	com	1 pL de adições	de	5 M de NaOH; tal
que 7	a solução final	foi	de	40 mM de	3I,	20	mM	de HEPES a pH
/ ·	3. 400 pL	de	uma	solução	de	3I	foi	adicionado a
10 50	pL de 7 5mM de	SMCC	em	DMSO e	incubado	à temperatura

ambiente durante 30 minutos para gerar SMCC ativado por³I.

4. O ³I-SMCC foi em seguida liofilizado por centrifugação a. vácuo.

5. O pélete resultante foi retomado em 20 pL de 15 DMSO e 100 pL de 20 mg/mL de hemoglobina foi adicionado, e em seguida, a solução foi incubada à temperatura ambiente durante 60 min para acoplar ³I a tióis de cisteína em hemoglobina.

o

6. O I-Hb resultante foi em seguida centrifugado (20.000 x g durante 5 minutos) antes da diálise (10-kDa

MWCO) durante a noite contra 25 mM de Tris a pH 7,2, 160 mM de NaCI.

7. O dialisado resultante foi recolhido e armazenado a -20°C.

Para avaliar o grau de radiopacidade atribuído à sonda, ela foi submetida à radiografia de raios-X (65 kV, 8 mA, 0,5 segundo de exposição), juntamente com padrões de radiopacidade (1 e 10 mM de ³I) .

RESULTADOS

A sonda de raios-X foi radioopaca a um grau entre e 10 mM de ³I (Figura 37). A análise da densidade de radiopacidade sugerida foi equivalente a uma solução 1,564/68

V 3

2,5 mM de ³I. Estes resultados confirmam que a sonda pode se tornar opaca aos raios-X.

Exemplo 11 - Análise de Soluções de Lavagem Usando

Hidroxiapatita Pura (Figura 38)

MÉTODOS

Para examinar a eficácia relativa de cada uma das soluções de lavagem, elas foram individualmente testadas usando um sistema de modelo in vitro (Figura 38).

A hidroxiapatita pura (5 mg) foi carregada com as proteínas a partir de sangue de rato (100 pL de Tris a 10 mM a pH 7,2, que continha 10 pL de extrato de Hb e 2 pL de soro puro) durante 10 minutos à temperatura ambiente, com agitação constante. A hidroxiapatita carregada com proteína foi sedimentada por centrifugação a 2.000 x g durante 30 segundos, o sobrenadante foi descartado, em seguida o pélete foi lavado com 300 pL de Tris a 10 mM a pH 7,2, durante 30 segundos, para remover os componentes intersticiais não ligados.

A hidroxiapatita-proteina foi em seguida exposta a 100 pL de diferentes componentes de lavagem (água, 5 mM de MgC12, 1 M de MgC12 ou 0,4 M de NaH2PO₄) durante 2 minutos à temperatura ambiente com mistura, antes da centrifugação. As lavagens foram recolhidas e a hidroxiapatita-proteina foi lavada mais duas vezes com a mesma solução de lavagem. Depois de três etapas de lavagem, a hidroxiapatita-proteina foi dissolvida em 100 pL de 10% de ácido trifluoroacético (TFA), e as proteínas precipitadas foram coletadas por centrifugação (2.000 x g durante 2 minutos), e os péletes foram dissolvidos em 100 pL de 2X SoB (0,125 M de Tris-HCl a pH 6,8, SDS a 4%, glicerol a 20%). O teor de proteína em todas as frações foi avaliado por densitometria de dot-blot, corado com negro de amido.

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RESULTADOS

As capacidades relativas das soluções de lavagem para remover a proteína da hidroxiapatita foram:

0,4 M de PO₄ > 1M de Mg²⁺ > 5 mM de Mg²⁺ (não mais 5 eficaz do que a água).

Embora PO4 tenha demonstrado fornecer uma melhor remoção de proteínas, nota-se que a hidroxiapatita permaneceu com uma cor rosa, mesmo depois de 3 lavagens, ao passo que a hidroxiapatita tratada com 1M de Mg²⁺ tornou-se 10 branca, após uma única lavagem. Sendo este o caso, parece que 1M de MgC12 e 0,4 M de NaH2PO₄ são mais eficazes na remoção de proteínas, e têm atividades complementares (com probabilidade de remover diferentes classes de proteínas).

Exemplo 12 - Análise de Mg²⁺ e PO4 Separadamente ou

Sequencialmente Usando Hidroxiapatita Pura (Figura 39)

MÉTODOS

A hidroxiapatita pura foi carregada com proteínas, e em seguida, submetida a 100 pL de vários componentes de lavagem (água, 1 M de MgC12 ou 0,4 M de 20 NaH₂PO₄) como para o Exemplo 11, com exceção de duas lavagens (em vez de três) e 5 mM de MgC12 foi omitido. Um tubo recebeu 1M de Mg²⁺, seguido de 0,4 M de PO₄. Após as lavagens, os péletes de hidroxiapatita foram fotografados para gravar a cor (ver detalhe) , e o teor de proteína, em 25 seguida, foi avaliado da mesma forma que o Exemplo 11.

RESULTADOS

Todas as três soluções de lavagem realizadas de forma semelhante removeram a maior parte das proteínas após duas lavagens, ao contrário da água (Figura 39).

A lavagem sequencial com Mg⁺², em seguida PO₄, produziu o melhor resultado avaliado pela remoção de proteínas e remoção de cor (no detalhe: as setas indicam péletes de hidroxiapatita após a lavagem). Pode concluir-se

66/68 que a lavagem sequencial com Mg ²⁺ e ΡΟ4 fornece uma remoção excelente de proteína, neste modelo de hidroxiapatita.

Exemplo 13 - Análise de Mg²⁺ Combinado Mais Lavagem de PO4 Usando hidroxiapatita Pura (Figura 40)

MÉTODOS

A hidroxiapatita pura foi carregada com proteína, e em seguida, submetida a 100 pL de lavagem combinada (1M de MgC12, 0,4 M de NaH₂PO₄) por três vezes, como.no Exemplo 11. 0 teor de proteína foi avaliado como no Exemplo 11.

Nota-se que os resultados do Exemplo 13 (Figura 40) são estabelecidos ao lado de dados do Exemplo 12, para comparação.

RESULTADOS

A combinação de lavagem foi realizada de forma 15 semelhante ao PO4 sozinho, no entanto, a hidroxiapatita ficou branca após a primeira lavagem (semelhante a 1M de Mg²⁺ sozinho), indicando a atividade de cada componente de lavagem foi mantida. Pode-se concluir que uma lavagem combinada pode ser mais eficaz, no que diz respeito ao 20 tempo necessário para atingir a remoção de proteínas.

Exemplo 14 - Soluções de Lavagem Funcionam em Esmalte

Hipomineralizado, Embora com uma Eficácia Reduzida, Comparado Com o Modelo de Hidroxiapatita (Figura 41)

MÉTODOS

0 esmalte hipomineralizado de lesões intactas e quebradas foi recolhido separadamente de tal modo que 3 tubos de 5 mg de pó estavam disponíveis para cada tipo de lesão. 0 esmalte foi exposto a 100 pL de 5 mM de Mg²⁺, „1M de Mg²⁺ e, em seguida 0,4 M de P0₄, cada um, durante 5 30 minutos. As amostras foram em seguida tratadas dá mesma forma que a hidroxiapatita pura dos Exemplos 11 a 13.

RESULTADOS

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O tratamento do esmalte hipomineralizado com soluções de lavagem removeu uma quantidade substancial de proteína (~1/4 - 1/3), enquanto que a água era pouco eficaz (Figura 41). A quantidade de proteína removida foi menor do que a observada para o modelo de hidroxiapatita, possivelmente devido a uma lenta taxa de dissociação.

Exemplo 15 — A Lavagem de Soluções Pode Remover Quantitativamente As Proteínas do Esmalte Hipomineralizado (Figura 42)

MÉTODOS

O esmalte Hipomineralizado de uma lesão intacta foi recolhido do mesmo modo que os 3 tubos, com 5 mg que estavam disponíveis. 0 esmalte foi exposto a 1 mL de 1M de Mg²⁺, durante 7 horas, em seguida, 1 mL de 0,4 M de PO₄ por mais 16 horas. As amostras foram em seguida tratadas do mesmo modo que a hidroxiapatita pura dos Exemplos 11 a 13. RESULTADOS

As proteínas foram quantitativamente removidas do esmalte hipomineralizado após duas lavagens extensas com soluções de lavagem (Figura 42B), enquanto que o tratamento de água durante o mesmo período de tempo teve pouco efeito.

A lavagem de PO₄ devido ao perfil (predominantemente período de tempo possa teve um impacto maior, provavelmente particular Embora o da proteína albumina, desta lesão

Figura

42A) .

longo do as soluções de lavagem são capazes de ser mais que o desejável, remover todas as proteínas de amostras clínicas. REFERÊNCIAS

Hubbard MJ (1995). Calbindin 28kDa and calmodulin are hyperabundant in rat dental enamel cells. Identification of the protein phosphatase calcineurin as a principal calmodulin target and of a secretion-related role for calbindin28kDa. Eur J Biochem 230:68-79.

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Hubbard MJ (1996). Abundant calcium homeostasis machinery in rat dental enamel cells. Up-regulation of calcium store proteins during enamel mineralisation implicates the endoplasmic reticulum in calcium 5 transcytosis. Eur J Biochem 239:611 -623.

Mangum JE, Veith PD, Reynolds EC, Hubbard MJ (2006). Towards second-generation proteome analysis of murine enamel-f orming cells. Eur J Oral Sei 114 Suppl 1:259-265.

Weerheijm KL (2003). Molar incisor hypomineralisation (MIH). Eur J Paediatr Dent 4:114-120.

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Sonda para uso em um método caracterizada pelo fato de que o método compreende a detecção de uma condição envolvendo hidroxiapatita porosa dental, a sonda compreendendo: um repórter colorido conjugado a uma proteína selecionada a partir do grupo: albumina sérica; cadeia beta do complemento C3; alfa-l-antitripsina; proteína S100-A9; lactotransferrina; inibidor de elastase de leucócito; antitrombina-III; subunidade alfa da hemoglobina; subunidade beta da hemoglobina; subunidade delta da hemoglobina; proteína induzível por prolactina; alfa amilase 1; região SIE de cadeia V-III Ig kappa; região de cadeia C Ig alfa-2; proteína descaracterizada c6orf58; serpina B3 e amelogenina, em que a proteína se liga especificamente à hidroxiapatita porosa dental.
2. 2. Sonda para uso em um método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sonda compreende adicionalmente um ligante para ligar o repórter à proteína, opcionalmente em que o ligante é um agente de reticulação, opcionalmente em que o agente de reticulação é um agente de reticulação heterobifuncional.
3. 3. Sonda para uso em um método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o agente de reticulação heterobifuncional é N-hidroxisuccinimido éster do ácido succinimidil 4-[Nmaleimidometil]ciclohexanocarboxílico (SMCC) ou hexanoato de succinimidil-6-[β-maleimidopropionamido] (SMPH).
4. 4. Sonda para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o repórter colorido é selecionado a partir do grupo que consiste em negro de amido, negro azul de naftaleno, preto de Sudão B, azul ácido 22, azul ácido 93, azul de alcian, azul alizarina, alizarol cianina R, azul

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   2/4 alcalino 4B, azul alcalino 5B, azul anilina WS, azul antracina SWR, azure A, azure B, azure C, azul básico B, azul básico 9, azul básico 12, azul básico 15, azul básico 17, azul básico 20, azul básico 26, azul celeste B, azul Chicago 4B, cromoxano cianina R, azul direto 14, azul direto 58, azul Durazol 4R, azul Durazol 8G, azul rápido B, azul rápido Luxol, azul galamina, hemateína, hematoxilina, índigo carmim, mauveína, azul de metileno, nitro-azul de tetrazólio, azul de toluidina, azul de tripano, azul noite, azul de nilo, azul de nilo A, pontamina azul céu 5B, azul Victoria 4R, azul Victoria B, azul Victoria R, azul água I, verde ácido, verde ácido 1, verde ácido 5, verde básico 4, verde básico 5, verde brilhante, verde de metila, verde de etila, verde rápido FCP, galeína, verde guiné, verde iodo, verde malaquita, verde naftol B, magenta 0, magenta I, magenta II, magenta III, fucsina ácida, nova fucsina, fucsina básica, violeta ácido 19, roxo anilina, violeta cromo CG, violeta de etila, violeta de metila, violeta de metila 2B, violeta de metila 10B, violeta de Hoffman, violeta de Lauth e primulina.
5. 5. Sonda para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a proteína está covalentemente ligada ao repórter colorido através de um tiol de cisteína.
6. 6. Sonda para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a proteína é subunidade alfa da hemoglobina, subunidade beta da hemoglobina ou subunidade delta da hemoglobina, o repórter colorido é negro de amido e a proteína e o repórter colorido estão covalentemente ligados por SMCC.
7. 7. Kit para uso em um método caracterizado pelo fato de que o método compreende a detecção de uma condição

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   3/4 que envolve hidroxiapatita porosa dental, o kit compreendendo a sonda conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
8. 8. Kit para uso em um método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o kit adicionalmente compreende: um agente permeabilizante, uma ou mais soluções de lavagem, um ou mais componentes secos para preparar uma ou mais soluções de lavagem quando da mistura com água ou um agente de remineralização.
9. 9. Kit para uso em um método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais soluções de lavagem compreendem ions dihidrogenofosfato, ions hidrogenofosfato, ions fosfato ou alvej ante.
10. 10. Kit para uso em um método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais soluções de lavagem compreendem ions magnésio e/ou ions dihidrogenofosfato.
11. 11. Kit para uso em um método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais soluções de lavagem compreendem cloreto de magnésio e/ou dihidrogenofosfato de sódio, opcionalmente em que a uma ou mais soluções de lavagem compreendem cerca de 1M de cloreto de magnésio e/ou cerca de 0,4 M de dihidrogenofosfato de sódio.
12. 12. Kit para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que o agente de remineralização compreende fluoreto, fosfato de cálcio solúvel ou fosfato de cálcio amorfo.
13. 13. Sonda para uso em um método, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou kit para uso em um método, conforme definido em qualquer uma

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    4/4 das reivindicações 7 a 12, caracterizado pelo fato de que o referido método de detecção compreende inspeção visual.
14. 14. Sonda para uso em um método, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou kit

    5 para uso em um método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 13, caracterizado pelo fato de que a referida condição envolvendo hidroxiapatita porosa dental é uma condição selecionada a partir de cárie dentária, cárie dentária incipiente, hipormineralização molar/incisiva 10 (MIH), amelogênese imperfeita, fluorose dentária ou outro defeito dentário de desenvolvimento (DDD).
15. 15. Sonda para uso em um método, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, 13 ou

    14, ou kit para uso em um método, conforme definido em

    15 qualquer uma das reivindicações 7 a 14, caracterizado pelo fato de que o referido método de detecção compreende a detecção de uma condição in vivo.