ES2573115T3

ES2573115T3 - Nuevo anticuerpo anti-DR5

Info

Publication number: ES2573115T3
Application number: ES11836421.5T
Authority: ES
Inventors: Toshiaki Ohtsuka; Takeshi Takizawa; Akiko Oguni; Tatsuji Matsuoka; Hiroko Yoshida; Yumi Matsui
Original assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Current assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 2010-10-29
Filing date: 2011-10-27
Publication date: 2016-06-06
Anticipated expiration: 2031-10-27
Also published as: ES2675847T3; RU2644678C1; RU2013124808A; TW201305216A; AU2016203575A1; CN107188963A; KR20140027050A; AU2011321374B2; RU2590711C2; CA2816291A1; AU2016203575B2; CN103282495A; DK2636736T3; IL252154A0; WO2012057288A1; EP2636736A4; PL2636736T3; TWI507417B; IL226023A; NZ610153A

Abstract

Un anticuerpo capaz de unirse a DR5, caracterizado porque: la secuencia de cadena pesada contiene una región variable que tiene CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 82, la CDRH2 comprende cualquiera de una de las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NO: 89 y 83, y la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 84; y la secuencia de cadena ligera contiene una región variable que tiene CDRL1, CDRL2 y CDRL3, y la CDRL1 comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NO: 87, 85, 86, 88, y 79, la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 80, y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 81, o un fragmento funcional del anticuerpo que tiene actividad de unión antigénica.

Description

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glioblastoma humano y D) muestra los resultados de una línea celular de cáncer endometrial humano. [Fig. 6] La Fig. 6 es una vista que muestra una estructura del complejo DR5-cB273 Fab. [Fig. 7] La Fig. 7 es una vista que muestra la interacción entre DR5 y la cadena H o L de cB273 Fab. A) es una vista que ilustra los restos de aminoácidos de la cadena H de cB273 Fab que se sitúa a una distancia de 4 Å o menor de DR5 y viceversa como un modelo de barra. Ile34, Glu36, Asp37, Gly38, Asp56, Leu57, Leu58, Phe59, Leu61 y Arg62 mostrados en el lado izquierdo del dibujo son restos de aminoácidos procedentes de DR5 y los números de restos de aminoácidos respectivos corresponden a los de las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NO: 23 en el Listado de Secuencias. Además, Phe33, Arg50, Asn52, Tyr54, Asn55, Phe59, Tyr101, Tyr102, Phe103 y Asp104 en el lado derecho del dibujo son restos de aminoácidos procedentes de la cadena pesada de cB273, y los números de restos de aminoácidos respectivos se proporcionan usando un resto de ácido glutámico en la posición 20 de la SEQ ID NO: 20 en el Listado de Secuencias como un punto de partida. B) es una vista que ilustra restos de aminoácidos de la cadena L de cB273 Fab que se sitúa a una distancia de 4 Å

o menor de DR5 y viceversa con algunos como un modelo de barra y otros como un modelo de cinta. Gly26, Glu36, Asp37, y Gly38 del lado izquierdo del dibujo son restos de aminoácidos procedentes de DR5, y los números de restos de aminoácidos respectivos corresponden a los de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 23 en el Listado de Secuencias. Además, His31, Asn33, Val99, y Trp101 en el lado derecho del dibujo son restos de aminoácidos procedentes de la cadena ligera de cB273, y los números de restos de aminoácidos respectivos se proporcionan usando un resto de ácido aspártico en la posición 21 de la SEC ID NO: 16 en el Listado de Secuencias como un punto de partida. Los restos de aminoácidos de DR5 que se encuentran a una distancia de 4 Å o menor desde el fragmento Fab de cB273 son un resto de glicina en la posición 26, un resto de isoleucina en la posición 34, un resto de ácido glutámico en la posición 36, un resto de ácido aspártico en la posición 37, un resto de glicina en la posición 38, un resto de ácido aspártico en la posición 56, un resto de leucina en la posición 57, un resto de leucina en la posición 58, un resto de fenil alanina en la posición 59, un resto de leucina en la posición 61 y un resto de arginina en la posición 62 de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 23 en el Listado de secuencias. [Fig. 8-1] La Fig. 8-1 es una figura que muestra la actividad de unión de anticuerpos hB273 con DR5 humano usando Biacore, y muestra gráficos de medición para los anticuerpos respectivos. [Fig. 8-2] La Fig. 8-2 es una tabla que muestra la actividad de unión de anticuerpos hB273 con DR5 humano usando Biacore, y muestra los valores de Kon, Koff, y KD de los anticuerpos respectivos calculados usando análisis de programación informática. Por otro lado, el número dado en cada gráfico en la Fig. 8-1 corresponde al Nº de entrada de la tabla de la Fig. 8-2. [Fig. 9] La Fig. 9 es una figura que muestra la actividad citocida in vitro de anticuerpos hB273 contra células Jurkat, que son una línea celular procedente del linfoma T humano. [Fig. 10-1] La Fig. 10-1 es una figura que muestra la actividad de unión de anticuerpos hB273 con DR5 humano usando Biacore, y muestra gráficos de medición de los anticuerpos respectivos. [Fig. 10-2] La Fig. 10-2 es una tabla que muestra la actividad de unión de anticuerpos hB273 con DR5 humano usando Biacore, y muestra los valores Kon, Koff, y KD de los anticuerpos respectivos calculados usado análisis de programación informática. Por otro lado, el número dado en cada gráfico en la Fig. 10-1 corresponde al Nº de entrada de la tabla de la Fig. 10-2. [Fig. 11] La Fig. 11 es una figura que muestra la actividad citocida in vitro de anticuerpos hB273 contra células Jurkat que son una línea celular procedente de linfoma T humano. [Fig. 12-1] La Fig. 12-1 es una vista que muestra la actividad de unión de anticuerpos hB273 con CDR modificada contra DR5 humano usando Biacore, y muestra gráficos de medición de los anticuerpos respectivos. [Fig. 12-2] La Fig. 12-2 es una tabla que muestra la actividad de unión de anticuerpos hB273 con CDR modificada contra DR5 humano usando Biacore y muestra los valores Kon, Koff y KD de los anticuerpos respectivos calculados usando análisis de programación informática. Por otro lado, el número dado en cada gráfico en la Fig. 12-1 corresponde al Nº de entrada de la tabla de la Figura 12-2. [Fig. 13-1] La Fig. 13-1 es una figura que muestra la evaluación de la estabilidad térmica de anticuerpos hB273 con CDR modifica usando calorimetría diferencial de barrido (DSC, Diferential Scaning Calorimetry) y muestra gráficos de medición de los anticuerpos respectivos. [Fig. 13-2] La Fig. 13-2 es una figura que muestra la evaluación de la estabilidad térmica de anticuerpos hB273 con CDR modificada usando calorimetría diferencial de barrido (DSC) y muestra gráficos de medición de los anticuerpos respectivos. [Fig. 13-3]

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La Fig. 13-3 muestra valores Tm de los anticuerpos respectivos calculados a partir de los gráficos mostrados en las Figs. 13-1 y 13-2. Dicho sea de paso, el número dado en cada gráfico en las Figs. 13-1 y 13-2 corresponde al Nº de entrada de la Figura 13-3. [Fig. 14] La Fig. 14 es una figura que muestra las actividades citocidas in vitro de anticuerpos hB273 con CDR modificada contra células Jurkat que son una línea celular procedente de linfoma T humano. [Fig. 15] La Fig. 15 es una vista que muestra el efecto de activación de caspasa-3/7 en la actividad citocida in vitro de un anticuerpo hB273_H2-1-NE/L1-NK en líneas celulares de cáncer humano. A) muestra los resultados de una línea celular de cáncer de colon humano HCT-15 y B) muestra los resultados de una línea celular de glioblastoma humano U-87MG. [Fig. 16] La Fig. 16 es una figura que muestra la actividad antitumoral in vivo de un anticuerpo cB273 en ratones desnudos con una línea celular de cáncer de colon humano COLO 205 implantada. [Fig. 17] La Fig. 17 es una figura que muestra la actividad antitumoral in vivo de un anticuerpo cB273 en ratones desnudos con una línea celular de cáncer de páncreas humano MIAPaCa-2 implantada. [Fig. 18] La Fig. 18 es una figura que muestra la actividad antitumoral in vivo de un anticuerpo cB273 en ratones desnudos con una línea celular de glioblastoma humano U-87MG implantada. [Fig. 19] La Fig. 19 es una figura que muestra la actividad antitumoral in vivo de un anticuerpo cB273 en ratones desnudos con una línea celular de células de cáncer de pulmón humano NCI-H2122 implantada (en combinación con paclitaxel y carboplatino). [Fig. 20] La Fig. 20 es una figura que muestra la actividad antitumoral in vivo de un anticuerpo cB273 en ratones desnudos con una línea celular de cáncer de pulmón humano NCI-H460 implantada (en combinación con paclitaxel y carboplatino). [Fig. 21] La Fig. 21 es una figura que muestra la actividad antitumoral in vivo de un anticuerpo cB273 en ratones desnudos con una línea celular de cáncer de colon humano DLD-1 implantada (en combinación con CPT-11). [Fig. 22] La Fig. 22 es una figura que muestra la actividad antitumoral in vivo de un anticuerpo cB273 en ratones desnudos con una línea celular de cáncer de colon humano HCT-15 implantada (en combinación con CPT-11). [Fig. 23] La Fig. 23 es una figura que muestra la actividad antitumoral in vivo de un anticuerpo cB273 en ratones desnudos con una línea celular de cáncer de colon humano HCT-116 implantada (en combinación con CPT-11). [Fig. 24] La Fig. 24 es una figura que muestra la actividad antitumoral in vivo de un anticuerpo cB273 en ratones desnudos con una línea celular de melanoma humano A375 implantada (en combinación con vinblastina). [Fig. 25] La Fig. 25 es una figura que muestra una comparación de la actividad antitumoral in vivo en ratones desnudos con una línea celular de cáncer de colon humano HCT-15 implantada entre un anticuerpo cB273 y conatumumab. [Fig. 26] La Fig. 26 es una figura que muestra una comparación de la actividad antitumoral in vivo en ratones desnudos con una línea celular de cáncer de pulmón humano NCI-H1975 implantada entre un anticuerpo cB273 y conatumumab. [Fig. 27] La Fig. 27 es una figura que muestra la actividad antitumoral in vivo de un anticuerpo hB273_H2-1-NE/L1-NK (indicado como “hB273” en el dibujo) en ratones desnudos con una línea celular de cáncer de colon humano COLO 205 implantada. [Fig. 28] La Fig. 28 es una figura que muestra la secuencia de nucleótidos de un ADNc que codifica una cadena pesada del anticuerpo B273 de ratón y la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo B273 de ratón. [Fig. 29] La Fig. 29 es una figura que muestra la secuencia de nucleótidos de un ADNc que codifica una cadena ligera del anticuerpo B273 de ratón y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo B273 de ratón. [Fig. 30] La Fig. 30 es una figura que muestra una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena ligera de tipo quimera de B273 y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo quimera de B273. [Fig. 31] La Fig. 31 es una figura que muestra una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada de tipo quimera de B273 y la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo quimera de B273. [Fig. 32] La Fig. 32 es una figura que muestra una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena ligera de tipo

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[Fig. 53] La Fig. 53 es una figura que muestra la actividad antitumoral in vivo de un anticuerpo hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK (indicado como “hB273” en el dibujo) en combinación con paclitaxel en ratones desnudos con una línea celular de cáncer de pulmón no microcítico humano NCI-H1975 implantada y una comparación de la actividad con conatumumab

[Modo de realizar la invención]

Los términos “cáncer” y “tumor” como se usan en el presente documento se usan con el mismo significado.

El término “gen” como se usa en el presente documento incluye no sólo ADN, sino también ARNm del mismo, ADNc y ARNc del mismo.

El término “polinucleótido” como se usa en el presente documento se usa con el mismo significado que “ácido nucleico” y también incluye ADN, ARN, sondas, oligonucleótidos y cebadores.

Los términos “polipéptido” y “proteína” como se usan en el presente documento se usan sin distinción.

La expresión “fracción de ARN”, como se usa en el presente documento se refiere a una fracción que contiene ARN.

El término “célula” como se usa en el presente documento también incluye células en un individuo animal y células cultivadas.

El término “transformación maligna de células”, como se usa en el presente documento, se refiere a un estado en el que las células muestran proliferación anómala, por ejemplo, células que pierden su sensibilidad al ponerse en contacto con un fenómeno de inhibición, células que muestran proliferación independiente de anclaje, y etcétera, y las células que muestran dicha proliferación anómala se denominan “células cancerosas”.

La expresión “lesión celular”, como se usa en el presente documento, se refiere a un estado en el que se produce un cambio patológico en las células, en una forma de algún tipo y la lesión celular no está limitada a lesión directa, e incluye todos los tipos de daños en la estructura y función de las células, tal como escisión de ADN, formación de bases-dímeros, escisión cromosómica, daño en la máquina de la división celular y una disminución en diversas actividades enzimáticas.

La expresión “actividad citotóxica” como se usa en el presente documento se refiere a una actividad de causa de la lesión celular descrita anteriormente.

La expresión “receptor que contiene un dominio de muerte” (que incluye Fas, TNFRI, DR3, DR4, DR5, y DR6, aunque sin limitarse a los mismos) como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula receptora que tiene una región de transducción de señal apoptótica denominada “dominio de muerte” que muestra homología con el gen suicida reaper (segador) de Drosophila en un dominio intracelular.

La expresión “fragmento funcional de un anticuerpo” como se usa en el presente documento, se refiere a un fragmento parcial de un anticuerpo que tiene actividad de unión antigénica e incluye Fab, F(ab’)2 y scFv. El término también incluye Fab’ que es un fragmento monovalente en una región variable de un anticuerpo obtenida por tratamiento de F(ab’)2 en condiciones reductoras. Sin embargo, la expresión no está limitada a estas moléculas siempre que el fragmento tenga una afinidad de unión por un antígeno. Adicionalmente, estos fragmentos funcionales no solo incluyen un fragmento obtenido por tratamiento de una molécula de longitud completa de una proteína de anticuerpo con una enzima apropiada, sino también una proteína producida en una célula hospedadora apropiada usando un gen de anticuerpo modificado genéticamente.

El término “Fab” como se usa en el presente documento se refiere a un fragmento monovalente en una región variable de un anticuerpo obtenida tratando F(ab’)2 en condiciones reductoras como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, el Fab’ producido usando un gen de anticuerpo modificado genéticamente también se incluye dentro del Fab’ de la invención.

La expresión “anticuerpo de fragmento variable monocatenario” como se usa en el presente documento se usa con el mismo significado que un Fv monocatenario (scFv, single chain Fv).

El término “epítopo” como se usa en el presente documento se refiere a un péptido parcial o a una estructura terciaria parcial de un antígeno al cual se une un anticuerpo específico. El epítopo que es un péptido parcial de un antígeno puede determinarse por métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, tal como un inmunoensayo, y por ejemplo, puede emplearse el siguiente método. En primer lugar, se producen diversas estructuras parciales de un antígeno. En la producción de las estructuras parciales, puede usarse una técnica de síntesis de oligopéptidos conocida. Por ejemplo, se produce una serie de polipéptidos que tienen longitudes apropiadamente reducidas obtenidas acortando secuencialmente el antígeno del extremo C o del extremo N, usando una técnica de recombinación genética conocida por los expertos en la técnica. Después de esto, se examina la reactividad de un anticuerpo contra estos polipéptidos y en líneas generales se determina un sitio de reconocimiento. Después, los péptidos que tienen longitudes más cortas se sintetizan y se examina la reactividad con estos péptidos, mediante lo

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cual el epítopo puede determinarse. Adicionalmente, el epítopo que es una estructura terciaria parcial de una unión antigénica con un anticuerpo específico puede determinarse por especificación de los restos de aminoácidos del antígeno que se sitúa adyacente al anticuerpo mediante análisis estructural de rayos X.

La expresión “anticuerpos que se unen al mismo epítopo” como se usa en el presente documento se refiere a diferentes anticuerpos que se unen a un epítopo común. Si un segundo anticuerpo se une a un péptido parcial o a una estructura terciaria parcial a la cual se une un primer anticuerpo, puede determinarse que el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se unen al mismo epítopo. Además, confirmando que el segundo anticuerpo compite con el primer anticuerpo por la unión con un antígeno (es decir, el segundo anticuerpo inhibe la unión entre el primer anticuerpo y el antígeno), puede determinarse en el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se unen al mismo epítopo incluso si la secuencia o estructura epitópica específica no se ha determinado. Además, cuando el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se unen al mismo epítopo y también el primer anticuerpo tiene un efecto especial tal como una actividad inductora de la apoptosis, puede esperarse que el segundo anticuerpo tenga también la misma actividad.

El término “CDR” como se usa en el presente documento se refiere a una región determinante de la complementariedad (CDR), y se sabe que cada cadena pesada y ligera de una molécula de anticuerpo tiene tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR). La CDR también se denomina dominio hipervariable, y está presente en una región variable de cada cadena pesada y ligera de un anticuerpo. Se trata de un sitio que tiene inusualmente alta variabilidad en su estructura primaria y hay tres CDR distintas en la estructura primaria de cada cadena polipeptídica pesada y ligera. En esta memoria descriptiva, al igual que para las CDR de un anticuerpo, las CDR de la cadena pesada se representan por CDRH1, CDRH2 y CDRH3 desde el lado amino terminal de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada, y las CDR de la cadena ligera se representan por CDRL1, CDRL2 y CDRL3 desde el lado amino terminal de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera. Estos sitios están próximos entre sí en la estructura terciaria y determinan la especificidad por un antígeno al cual se une el anticuerpo.

La expresión “anticuerpo secundario” como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a una molécula de anticuerpo, entrecruzándose de este modo las moléculas de anticuerpo.

La frase “la hibridación se realiza en condiciones rigurosas” como se usa en el presente documento se refiere a un proceso en el la hibridación se realiza en condiciones en las que la identificación puede efectuarse realizando la hibridación a 68 ºC en una solución de hibridación disponible en el comercio, la solución de hibridación ExpressHyb (fabricada por Clontech, Inc.) o realizando la hibridación a 68 ºC en presencia de NaCl de 0,7 a 1,0 M, usando un filtro que tenga ADN inmovilizado en su interior, seguido por un lavado a 68 ºC usando una solución de 0,1 a 2 x SSC (la solución 1 x SSC está compuesta por NaCl 150 mM y citrato de sodio 15 mM) o en condiciones equivalentes a las mismas.

La expresión “varios aminoácidos” en la descripción de “una secuencia de aminoácidos que incluye una sustitución, deleción o adición de uno a varios aminoácidos” como se usa en el presente documento se refiere a un número arbitrario de restos de aminoácidos seleccionados de 2 a 10. Más específicamente, cuando se sustituyen, se delecionan o se añaden 10 o menos aminoácidos, de 5 a 6 o menos aminoácidos, o de 2 a 3 o menos aminoácidos, se usa la descripción de “una secuencia de aminoácidos que incluye una sustitución, deleción o adición de diversos aminoácidos”.

La descripción de, por ejemplo, “una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 141 de la SEQ ID NO: 34” como se usa en el presente documento se usa con el mismo significado que la descripción de “una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende los restos de aminoácidos 20 a 141 de la SEQ ID NO: 34”. Además, la descripción de, por ejemplo, “una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 471 de la SEQ ID NO: 34” se usa con el mismo significado que la descripción de “una secuencia de cadena pesada que comprende los restos de aminoácidos 20 a 471 de la SEQ ID NO: 34”.

1. Relaciones de genes relacionados con la apoptosis

Se requiere un anticuerpo de acuerdo con la invención para unirse a un antígeno específico y exhibir una actividad citotóxica mediante el antígeno. Además, para impedir que las células normales se destruyan, es necesario seleccionar el antígeno específicamente presente en células tumorales. Un ejemplo de dicho grupo antigénico puede incluir grupos receptores de ligando inductor de la apoptosis relacionada con el factor de necrosis tumoral (en lo sucesivo denominado “TNF” en la memoria descriptiva) (en lo sucesivo denominado “TRAIL” en la memoria descriptiva). TRAIL es un miembro de la familia de proteínas de TNF e incluye ligandos Fas y TNF-α (Wiley SR, y col., Immunity 1995 diciembre; 3 (6): 673-82). Estas proteínas son fuertes factores inductores de la apoptosis.

Los receptores de esta familia de proteínas de TNF se caracterizan por secuencias repetidas ricas en cisteína en el dominio extracelular. Entre estos, Fas que es un receptor para ligandos Fas, y el receptor I de TNF (en lo sucesivo, denominado “TNFRI” en la memoria descriptiva) que es un receptor de TNFα, tienen en un dominio intracelular, una región esencial para la transducción de señal apoptótica, denominado “dominio de muerte”, que es una región que muestra homología con el gen suicida reaper de Drosophila (Golstein, P., y col., (1995) Cell. 81, 185-186; y White, K,

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Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. y Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher, Spigfield, Illinois (1964), etc.) en condiciones tales que el índice de supervivencia de las células no esté excesivamente reducido.

Como un procedimiento de este tipo, puede utilizarse, por ejemplo, un procedimiento químico en el que las células productoras de anticuerpos y las células de mieloma se mezclan en una solución que contiene un polímero, tal como polietilenglicol a una alta concentración, un procedimiento físico usando estimulación eléctrica, o similar.

(e) Selección de un grupo de hibridomas

El procedimiento de selección de hibridomas obtenidos a través de la fusión celular descrita anteriormente, no está particularmente limitado. Normalmente, se usa el método de selección con HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina) (Kohler y col., Nature (1975), 256, pág. 495; Milstein y col., Nature (1977), 266, pág. 550).

Este procedimiento es efectivo cuando se obtienen hibridomas usando las células de mieloma de una cepa con déficit de HGPRT que no puede sobrevivir en presencia de aminopterina.

Esto es, cultivando células e hibridomas no fusionados en medio HAT, solo sobreviven y proliferan de un modo selectivo hibridomas resistentes a aminopterina.

(f) División en clones de una sola célula (clonación)

Como un procedimiento de clonación para hibridomas, puede utilizarse un procedimiento conocido tal como un procedimiento con metilcelulosa, un procedimiento con agarosa blanda o un procedimiento de dilución limitante (véase, por ejemplo, Barbara, B. M. y Stanley, M. S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980)). Entre estos procedimientos, particularmente, se prefiere un procedimiento de cultivo tridimensional, tal como un procedimiento con metilcelulosa. Por ejemplo, el grupo de hibridomas producido por fusión celular se suspende en un medio con metilcelulosa, tal como Medio de Selección D de ClonaCell-HY (fabricado por StemCell Technologies, inc., n.º 03804) y se cultiva. Después, las colonias de hibridoma formadas se recogen, obteniéndose de este modo hibridomas monoclonales. Las colonias de hibridoma respectivas recogidas se cultivan, y un hibridoma que se ha confirmado que tiene un título de anticuerpo estable en un sobrenadante de cultivo de hibridoma obtenido se selecciona como una cepa de hibridoma productora de anticuerpos monoclonales DR5.

Los ejemplos de la cepa de hibridoma establecida de este modo incluyen el hibridoma B273 de DR5. Por otro lado, en esta memoria descriptiva, un anticuerpo producido por el hibridoma B273 se denomina “anticuerpo B273” o simplemente “B273”. La cadena pesada del anticuerpo B273 tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 8 en el Listado de Secuencias. Además, la cadena ligera del anticuerpo B273 tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias. Por otro lado, en la secuencia de aminoácidos de cadena pesada representada por SEQ ID NO: 8 en el Listado de Secuencias, una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 1 a 19 es una secuencia señal, una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 141 es una región variable y una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 142 a 465 es una región constante. Además, en la secuencia de aminoácidos de cadena ligera representada por SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias, una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 1 a 19 es una secuencia señal, una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 133 es una región variable y una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 134 a 238 es una región constante.

La secuencia de aminoácidos de cadena pesada representada por SEQ ID NO: 8 en el Listado de Secuencias está codificada por una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 7 en el Listado de Secuencias. En la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 7 en el Listado de Secuencias, una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 1 a 57 codifica la secuencia señal de cadena pesada del anticuerpo, una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 423 codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo y una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 424 a 1395 codifica la región constante de cadena pesada del anticuerpo.

La secuencia de aminoácidos de cadena ligera representada por SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias está codificada por una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 9 en el Listado de Secuencias. En la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 9 en el Listado de Secuencias, una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 1 a 57 codifica la secuencia señal de cadena ligera del anticuerpo, una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 399 codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo y una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 400 a 714 codifica la región constante de cadena ligera del anticuerpo.

(g) Preparación del anticuerpo monoclonal a través de cultivo de hibridoma

Cultivando el hibridoma así seleccionado, puede obtenerse de un modo eficaz un anticuerpo monoclonal. Sin embargo, antes de cultivar, se prefiere realizar la exploración de un hibridoma que produzca un anticuerpo

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cadena pesada del anticuerpo, una secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 58 a 423 codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo y una secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 424 a 1413 codifica la región constante de cadena pesada del anticuerpo.

La secuencia de aminoácidos de cadena ligera representada por SEQ ID NO: 28, 30, 32, 52, 58, 62 o 66 en el listado de secuencias está codificada por una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 27, 29, 31, 51, 57, 61 o 65 en el Listado de Secuencias. En cada una de las secuencias de nucleótidos anteriores, una secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 1 a 60 codifica la secuencia señal de cadena ligera del anticuerpo, una secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 61 a 402 codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo y una secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 403 a 717 codifica la región constante de cadena ligera del anticuerpo.

La homología entre cualquiera de estas secuencias de nucleótidos y una secuencia de nucleótidos de otro anticuerpo también puede determinarse usando el algoritmo Blast

Adicionalmente, el anticuerpo de la invención incluye un anticuerpo humano que se une al mismo epítopo que el anticuerpo B273, en el que el anticuerpo humano se caracteriza por que la secuencia de cadena pesada contiene una región variable que tiene CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 82, la CDRH2 comprende cualquiera de una de las secuencias de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 89 y 83 y la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 84; y la secuencia de cadena ligera contiene una región variable que tiene CDRL1, CDRL2 y CDRL3 y la CDRL1 comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 87, 85, 86, 88 y 79, la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 80 y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 81, o un fragmento funcional del anticuerpo que tiene actividad de unión antigénica. Un anticuerpo anti-DR5 humano se refiere a un anticuerpo humano que solo tiene una secuencia génica de un anticuerpo procedente de un cromosoma humano. Un anticuerpo anti-DR5 humano puede obtenerse mediante un procedimiento usando un ratón productor de anticuerpos humanos que tiene un fragmento cromosómico humano que contiene genes de cadena pesada y ligera de un anticuerpo humano (véase Tomizuka, K. y col., Nature Genetics (1997) 16, págs. 133-143; Kuroiwa, Y. y col., Nucl. Acids Res. (1998) 26, págs. 3447-3448; Yoshida, H. y col., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, págs. 69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. y Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, págs. 722-727, etc.).

Dicho ratón productor de anticuerpos humanos puede crearse específicamente de la siguiente manera. Un animal modificado genéticamente, en el que se ha alterado el locus génico exógeno de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina, y en su lugar, se ha introducido un locus génico de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina humana, mediante un vector de cromosoma artificial de levadura (YAC, del inglés yeast artificial chromosome) o similar, se crea produciendo un animal genosuprimido (knockout) y un animal transgénico y cruzando estos animales.

Adicionalmente, de acuerdo con una técnica de modificación por ingeniería genética, usando los ADNc que codifican dicha una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo humano, respectivamente, y preferentemente un vector que contiene los ADNc, se transforman células eucariotas y se cultiva un transformante que produce un anticuerpo monoclonal humano recombinante, mediante lo cual el anticuerpo también puede obtenerse a partir del sobrenadante de cultivo.

En este caso, como hospedador, pueden usarse, por ejemplo, células eucariotas, preferentemente células de mamífero, tales como células CHO, linfocitos o células de mieloma.

Adicionalmente, también se conoce un procedimiento de obtención de un anticuerpo humano procedente de presentación de fagos identificado de una biblioteca de anticuerpos humanos (véase Wormstone, I. M. y col., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), págs. 2301-2308; Carmen, S. y col., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), págs. 189-203; Siriwardena, D. y col., Ophthalmology (2002) 109 (3), págs. 427-431, etc.).

Por ejemplo, puede usarse un procedimiento de presentación de fagos en el que una región variable de un anticuerpo humano se expresa en la superficie de un fago como un anticuerpo monocatenario (scFv, single chain Fv) y se selecciona un fago que se une a un antígeno (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), págs. 1105-1116) puede usarse.

Analizando al gen del fago seleccionado basándose en la unión con un antígeno, puede determinarse una secuencia de ADN que codifique la región variable de un anticuerpo humano que se une a un antígeno.

Si se determina la secuencia de ADN de un scFv que se une a un antígeno, puede obtenerse un anticuerpo humano preparando un vector de expresión que tenga la secuencia e introduciendo el vector en un hospedador apropiado que lo exprese (documentos WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388, Annu. Rev. Immunol. (1994) 12, págs. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), págs. 1105-1116).

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