KR20140027050A

KR20140027050A - 신규 항 dr5 항체

Info

Publication number: KR20140027050A
Application number: KR1020137010556A
Authority: KR
Inventors: 도시아키 오츠카; 다케시 다키자와; 아키코 오구니; 다츠지 마츠오카; 히로코 요시다; 유미 마츠이
Original assignee: 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Priority date: 2010-10-29
Filing date: 2011-10-27
Publication date: 2014-03-06
Also published as: CA2816291C; US20140004120A1; TW201305216A; JPWO2012057288A1; NZ610153A; JP6124377B2; BR112013010574A2; HRP20160584T1; CA2937979A1; PL2636736T3; ES2573115T3; MX344200B; EP3020812A1; CO6700893A2; EP2636736B1; HK1189622A1; CA2816291A1; US9856321B2; AU2011321374A1; CN103282495A

Abstract

본 발명은 암, 자기 면역 질환 또는 염증성 질환에 대하여 치료 효과를 갖는 항체에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 데스 도메인 함유 수용체 발현 세포에 대하여 아포토시스를 통한 세포 상해 활성을 나타내는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 과제는 암에 대하여 치료 효과를 갖는 의약품을 제공하는 것이다. 세포에 아포토시스를 유도할 수 있는 신규 항 DR5 항체가 기존의 항 DR5 항체에 비해, 현저한 세포 상해 활성을 갖는 것을 나타낸다.

Description

신규 항 DR5 항체 {NOVEL ANTI-DR5 ANTIBODY}

본 발명은 종양의 치료 및/또는 예방제로서 유용한, 아포토시스 유도에 관여하는 세포 표면 수용체에 결합하는 항체, 그리고 그 항체를 사용한 암, 자기 면역 질환 혹은 염증성 질환의 치료 및/또는 예방법에 관한 것이다.

아포토시스는 생체 내에 있어서 불필요한 세포나 데미지를 받은 세포를 배제하여 정상적인 세포 수를 유지한다고 하는 생리학적인 프로세스에 필수적인 현상이다. 이 아포토시스 조절 기구가 암·면역 질환에 있어서 자주 손상되는 것, 및 아포토시스 조절 경로가 이해되어 감으로써, 암·면역 질환 치료에 이용 가능한 신규 아포토시스 유도제의 개발이 진행되고 있다. 특히, 데스 리셉터로 대표되는 아포토시스 유도에 관여하는 세포 표면 수용체에 대한 리간드나 수용체에 결합능을 갖는 항체에는 이들 질환에 대한 치료 작용이 기대되고 있다 (예를 들어 비특허문헌 1 을 참조). 데스 리셉터의 일종인 Death Receptor 5 (DR5) 는 KILLER, TRICK2A, TRAIL-R2, TRICKB, 또는 CD262 라고도 불리는 경우가 있으며, 세포에 아포토시스를 유도하는 아고니스트 항체가 복수 알려져 있다 (예를 들어, 비특허문헌 2 혹은 3, 또는 특허문헌 1 내지 6 을 참조). 몇 개의 항체는 현재 치료약 후보로서 임상에서의 개발 단계에 있고, 당해 수용체를 발현하고 있는 세포 (암 세포·면역 질환 관련 세포) 특이적으로, 아고니스트적으로 작용하여, 이것을 사멸시키는 치료 효과가 기대되고 있다. 항체에 의한 항종양 작용에는 DR5 의 발현이 필수적이지만, 작용과 발현 레벨의 상관성은 없는 것이 전(前) 임상 시험으로 분명해져 있다 (비특허문헌 4). 이 점에 관해서는, 아포토시스 경로에 관련되는 caspase-8 이나 Bcl-2 등의 세포 내 시그널 분자의 발현량 등의 다종류의 요인에 의해 세포 응답이 규정되기 때문인 것으로 생각되고 있다 (비특허문헌 5).

국제 공개 제WO98/51793호 팜플렛 국제 공개 제WO2001/83560호 팜플렛 국제 공개 제WO2002/94880호 팜플렛 국제 공개 제WO2003/54216호 팜플렛 국제 공개 제WO2006/83971호 팜플렛 국제 공개 제WO2007/22157호 팜플렛

Cell Death and Differentiation, 10 : 66 - 75 (2003) Journal of I㎜unology, 162 : 2597 - 2605 (1999) Nature Medicine, 7(8) : 954 - 960 (2001) Cell Death and Differentiation, 10 : 66 - 75 (2003) Journal of Clinical Oncology, 26 : 3621 - 3630 (2008)

본 발명의 과제는 암에 대하여 치료 효과를 갖는 의약품이 되는 항체, 그 항체의 기능성 단편, 그리고 그 항체 또는 그 항체의 기능성 단편을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토를 실시한 결과, 세포에 현저한 아포토시스 유도능을 나타내는 항체를 찾아내어, 본 발명을 완성시켰다. 이로써, 기존의 항체로는 충분한 치료 효과가 얻어지지 않은 환자에 있어서도 유효한 치료 효과를 가져 온다.

즉, 본 발명은 이하의 발명을 포함한다.

(1) 중사슬 배열이 CDRH1, CDRH2, CDRH3 을 갖는 가변 영역을 포함하며, 상기 CDRH1 은 배열 번호 82 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH2 는 배열 번호 83 또는 89 에 나타내는 어느 하나의 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH3 은 배열 번호 84 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ; 및

경사슬 배열이 CDRL1, CDRL2, CDRL3 을 갖는 가변 영역을 포함하며, 상기 CDRL1 은 배열 번호 79, 85, 86, 87 또는 88 에 나타내는 어느 하나의 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL2 는 배열 번호 80 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL3 은 배열 번호 81 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ;

을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(2) 배열 번호 20 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 16 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (1) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(3) 키메라 항체인 것을 특징으로 하는 (1) 또는 (2) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(4) 배열 번호 20 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 16 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 (3) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(5) 인간화되어 있는 것을 특징으로 하는 (1) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(6) 항체 또는 그 항체의 기능성 단편으로서,

(a) 이하의 아미노산 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬 가변 영역 배열 :

a1) 배열 번호 42 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;

a2) 배열 번호 70 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;

a3) a1) 또는 a2) 에서 선택되는 아미노산 배열과 적어도 95 ％ 의 상동성을 갖는 아미노산 배열 ;

a4) a1) 또는 a2) 에서 선택되는 아미노산 배열과 적어도 99 ％ 의 상동성을 갖는 아미노산 배열 ;

a5) a1) 내지 a2) 에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 배열에 1 내지 수 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 배열 ; 및

(b) 이하의 아미노산 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 경사슬 가변 영역 배열 :

b1) 배열 번호 28 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;

b2) 배열 번호 52 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;

b3) 배열 번호 58 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;

b4) 배열 번호 62 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;

b5) 배열 번호 66 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;

b6) b1) 내지 b5) 에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 배열과 적어도 95 ％ 의 상동성을 갖는 아미노산 배열 ;

b7) b1) 내지 b5) 에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 배열과 적어도 99 ％ 의 상동성을 갖는 아미노산 배열 ;

b8) b1) 내지 b5) 에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 배열에 1 내지 수 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 배열 ;

을 포함하는 것을 특징으로 하는, (5) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(7) 배열 번호 42 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 28 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (6) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(8) 배열 번호 70 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 52 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (6) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(9) 배열 번호 70 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 58 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (6) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(10) 배열 번호 70 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 62 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (6) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(11) 배열 번호 70 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 66 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 134 번째의 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (6) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(12) 배열 번호 42 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 28 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 (6) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(13) 배열 번호 70 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 52 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 (6) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(14) 배열 번호 70 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 58 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 (6) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(15) 배열 번호 70 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 62 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 (6) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(16) 배열 번호 70 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 66 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 (6) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(17) Fab, F(ab')₂, Fab' 및 Fv 로 이루어지는 군에서 선택되는, (1) 내지 (16) 중 어느 하나에 기재된 항체의 기능성 단편.

(18) (1) 내지 (17) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 중 적어도 어느 하나를 함유하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.

(19) 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물인 것을 특징으로 하는 (18) 에 기재된 의약 조성물.

(20) (1) 내지 (17) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 중 적어도 어느 하나, 그리고, paclitaxel, carboplatin, CPT-11, 또는 vinblastin 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나를 함유하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.

(21) 암이 폐암, 전립선암, 갑상선암, 위암, 간암, 난소암, 대장암, 유방암, 췌장암, 신장암, 자궁암, 멜라노머, 섬유 육종, 신경 교아종 및 혈구암으로 이루어지는 군에서 선택되는 (19) 또는 (20) 에 기재된 의약 조성물.

(22) (1) 내지 (17) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 중 적어도 어느 하나를 투여하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방 방법.

(23) (1) 내지 (17) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 중 적어도 어느 하나, 그리고, paclitaxel, carboplatin, CPT-11, vinblastin 및 5-FU 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나를 동시 또는 연속하여 투여하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방 방법.

(24) 암이 폐암, 전립선암, 갑상선암, 위암, 간암, 난소암, 대장암, 유방암, 췌장암, 자궁암, 멜라노머, 신경 교아종 및 혈구암으로 이루어지는 군에서 선택되는 (22) 또는 (23) 에 기재된 치료 및/또는 예방 방법.

(25) (2), (4) 또는 (6) 내지 (16) 중 어느 하나에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드.

(26) (25) 에 기재된 폴리뉴클레오티드로서, 배열 번호 19 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 423 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 15 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 402 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.

(27) (25) 에 기재된 폴리뉴클레오티드로서, 배열 번호 19 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1413 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 15 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 717 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.

(28) (25) 에 기재된 폴리뉴클레오티드로서,

(a) 이하의 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 :

a1) 배열 번호 41 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 423 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;

a2) 배열 번호 69 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 423 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;

a3) a1) 또는 a2) 에서 선택되는 뉴클레오티드 배열과 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드가 보유하는 뉴클레오티드 배열 ;

a4) a1) 또는 a2) 에서 선택되는 뉴클레오티드 배열에 1 내지 수 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 뉴클레오티드 배열 ; 및

(b) 이하의 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 :

b1) 배열 번호 27 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 402 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;

b2) 배열 번호 51 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 402 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;

b3) 배열 번호 57 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 402 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;

b4) 배열 번호 61 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 402 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;

b5) 배열 번호 65 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 402 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;

b6) b1) 내지 b5) 에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열과 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드가 보유하는 뉴클레오티드 배열 ;

b7) b1) 내지 b5) 에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열에 1 내지 수 개의 뉴클레오티드가 치환, 결실 또는 부가된 뉴클레오티드 배열 ;

을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.

(29) 배열 번호 41 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 423 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 27 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 402 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (28) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(30) 배열 번호 69 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 423 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 51 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 402 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (28) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(31) 배열 번호 69 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 423 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 57 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 402 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (28) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(32) 배열 번호 69 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 423 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 61 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 402 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (28) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(33) 배열 번호 69 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 423 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 65 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 402 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (28) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(34) 배열 번호 41 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1413 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 27 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 717 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (28) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(35) 배열 번호 69 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1413 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 51 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 717 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (28) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(36) 배열 번호 69 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1413 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 57 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 717 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (28) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(37) 배열 번호 69 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1413 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 61 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 717 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (28) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(38) 배열 번호 69 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1413 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 65 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 717 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (28) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(39) (25) 내지 (38) 에 기재된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.

(40) (25) 내지 (38) 에 기재된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질 전환 숙주 세포.

(41) (39) 에 기재된 벡터를 포함하는 형질 전환 숙주 세포.

(42) (40) 또는 (41) 에 기재된 숙주 세포를 배양하고, 배양 산물로부터 항체를 정제하는 공정을 포함하는 (2), (4) 또는 (6) 내지 (16) 에 기재된 항체의 생산 방법.

(43) 배열 번호 20 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 16 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(44) 배열 번호 20 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 16 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 항체와 경합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(45) Papain 소화에 의해 조제된 Fab 프래그먼트가 배열 번호 23 에 기재된 재조합 단백질의 26 번째의 글리신 잔기, 34 번째의 이소류신 잔기, 36 번째의 글루탐산 잔기, 37 번째의 아스파르트산 잔기, 38 번째의 글리신 잔기, 56 번째의 아스파르트산 잔기, 57 번째의 류신 잔기, 58 번째의 류신 잔기, 59 번째의 페닐알라닌 잔기, 61 번째의 류신 잔기 및 62 번째의 아르기닌 잔기와 4 Å 이내의 거리로 인접하고 있는 것을 특징으로 하는 (43) 또는 (44) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(46) 배열 번호 23 에 기재된 재조합 단백질을 구성하는 각 아미노산 잔기와 Fab 프래그먼트 사이의 거리를, X 선 회절 데이터를 사용한 복합체 구조 해석에 의해 결정하는 것을 특징으로 하는 (45) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

본 발명에 의하면 세포에 대한 아포토시스 유도를 주된 작용 기전으로 하는 암의 치료제를 얻을 수 있다.

도 1 은 마우스 B273 항체의 살세포 작용을 나타낸 도면이다.
도 2 는 cB273 항체 및 sTRAIL 의 DR5 세포 외 영역 단백질에 대한 결합 활성을 나타낸 도면이다.
도 3 은 Biacore 에 의한 cB273 항체의 인간 DR5 에 대한 결합 활성을 나타낸 도면이다. 상단은 측정 차트를 나타내고 있고, 세로축은 공명 단위 (RU : Resonance Unit), 가로축은 시간 (초) 을 나타내고 있다. 하단에 분석 소프트에 의해 산출된 cB273 항체의 Kon, Koff 및 KD 값을 나타내고 있다.
도 4 는 cB273 항체의 인간 암 세포주에 대한 in vitro 살세포 작용을 나타낸 도면이다. A) 는 인간 난소암주, B) 는 인간 대장암주, C) 는 인간 폐암주, D) 는 인간 유방암주에 대한 결과이다.
도 5 는 cB273 항체의 인간 암 세포주에 대한 in vitro 살세포 작용을 나타낸 도면이다. A) 는 인간 췌장암주, B) 는 인간 멜라노머암주, C) 는 인간 신경 교아종 세포주, D) 는 인간 자궁 내막암주에 대한 결과이다.
도 6 은 DR5 와 cB273 Fab 의 복합체 구조를 나타낸 도면이다.
도 7 은 DR5 와 cB273 Fab 의 H 사슬, L 사슬의 상호 작용을 나타낸 도면이다. A) 는 cB273 Fab H 사슬과 DR5 에 대하여, 서로 4 Å 이내의 거리에 있는 아미노산 잔기를 스틱 모델로 표시한 도면이다. 도면 중 좌측의 Ile34, Glu36, Asp37, Gly38, Asp56, Leu57, Leu58, Phe59, Leu61, Arg62 는 DR5 유래의 아미노산 잔기이며, 각 아미노산 잔기 번호는 배열표의 배열 번호 23 에 나타내는 아미노산 배열에 대응하고 있다. 또한, 도면 중 우측의 Phe33, Arg50, Asn52, Tyr54, Asn55, Phe59, Tyr101, Tyr102, Phe103, Asp104 는 cB273 의 중사슬 유래의 아미노산 잔기이며, 각 아미노산 잔기 번호는 배열표의 배열 번호 20 의 20 번째의 글루탐산 잔기를 기점으로 하여 부여되어 있다. B) 는 cB273 Fab L 사슬과 DR5 에 대하여, 서로 4 Å 이내의 거리에 있는 아미노산 잔기를 스틱 모델로, 그 이외를 리본 모델로 표시한 도면이다. 도면 중 좌측의 Gly26, Glu36, Asp37, Gly38 은 DR5 유래의 아미노산 잔기이며, 각 아미노산 잔기 번호는 배열표의 배열 번호 23 에 나타내는 아미노산 배열에 대응하고 있다. 또한, 도면 중 우측의 His33, Asn33, Val99, Trp101 은 cB273 의 경사슬 유래의 아미노산 잔기이며, 각 아미노산 잔기 번호는 배열표의 배열 번호 16 의 21 번째의 아스파르트산 잔기를 기점으로 하여 부여되어 있다. cB273 의 Fab 프래그먼트로부터 4 Å 이내의 거리에 있는 DR5 의 아미노산 잔기는 배열표의 배열 번호 23 에 기재된 아미노산 배열의 26 번째의 글리신 잔기, 34 번째의 이소류신 잔기, 36 번째의 글루탐산 잔기, 37 번째의 아스파르트산 잔기, 38 번째의 글리신 잔기, 56 번째의 아스파르트산 잔기, 57 번째의 류신 잔기, 58 번째의 류신 잔기, 59 번째의 페닐알라닌 잔기, 61 번째의 류신 잔기 및 62 번째의 아르기닌 잔기였다.
도 8a 는 Biacore 에 의한 hB273 항체의 인간 DR5 에 대한 결합 활성을 나타낸 도면으로, 각 항체에 있어서의 측정 차트를 나타내고 있다.
도 8b 는 Biacore 에 의한 hB273 항체의 인간 DR5 에 대한 결합 활성을 나타낸 표로, 분석 소프트에 의해 산출된 각 항체의 Kon, Koff 및 KD 값을 나타내고 있다. 또한, 도 8a 의 각 차트에 부여된 번호는 도 8b 의 표의 Entry No 에 대응하고 있다.
도 9 는 hB273 항체의 인간 T 임파종 유래 세포주인 Jurkat 세포에 대한 in vitro 살세포 활성을 나타낸 도면이다.
도 10a 는 Biacore 에 의한 hB273 항체의 인간 DR5 에 대한 결합 활성을 나타낸 도면으로, 각 항체에 있어서의 측정 차트를 나타내고 있다.
도 10b 는 Biacore 에 의한 hB273 항체의 인간 DR5 에 대한 결합 활성을 나타낸 표로, 분석 소프트에 의해 산출된 각 항체의 Kon, Koff 및 KD 값을 나타내고 있다. 또한, 도 10a 의 각 차트에 부여된 번호는 도 10b 의 표의 Entry No 에 대응하고 있다.
도 11 은 hB273 항체의 인간 T 임파종 유래 세포주인 Jurkat 세포에 대한 in vitro 살세포 활성을 나타낸 도면이다.
도 12a 는 Biacore 에 의한 hB273 항체 CDR 개변체의 인간 DR5 에 대한 결합 활성을 나타낸 도면으로, 각 항체에 있어서의 측정 차트를 나타내고 있다.
도 12b 는 Biacore 에 의한 hB273 항체 CDR 개변체의 인간 DR5 에 대한 결합 활성을 나타낸 표로, 분석 소프트에 의해 산출된 각 항체의 Kon, Koff 및 KD 값을 나타내고 있다. 또한, 도 12a 의 각 차트에 부여된 번호는 도 12b 의 표의 Entry No 에 대응하고 있다.
도 13a 는 시차 주사 칼로리메트리 (DSC) 를 사용한 hB273 항체 CDR 개변체의 열안정성 평가를 나타낸 도면으로, 각 항체에 있어서의 측정 차트를 나타내고 있다.
도 13b 는 시차 주사 칼로리메트리 (DSC) 를 사용한 hB273 항체 CDR 개변체의 열안정성 평가를 나타낸 도면으로, 각 항체에 있어서의 측정 차트를 나타내고 있다.
도 13c 는 도 13a 및 도 13b 의 차트로부터 산출된 각 항체의 Tm 값을 나타내고 있다. 또한, 도 13a 및 도 13b 의 각 차트에 부여된 번호는 도 13c 의 Entry No 에 대응하고 있다.
도 14 는 hB273 항체 CDR 개변체의 인간 T 임파종 유래 세포주인 Jurkat 세포에 대한 in vitro 살세포 활성을 나타낸 도면이다.
도 15 는 hB273_H2-1-NE/L1-NK 항체의 인간 암 세포주에 대한 caspase-3/7 활성화 작용 및 in vitro 살세포 활성을 나타낸 도면이다. A) 는 인간 대장암주 HCT-15, B) 는 인간 신경 교아종 세포주 U-87MG 에 대한 결과이다.
도 16 은 cB273 항체의 인간 대장암주 COLO 205 이식 누드 마우스에 있어서의 in vivo 항종양 활성을 나타낸 도면이다.
도 17 은 cB273 항체의 인간 췌장암주 MIAPaCa-2 이식 누드 마우스에 있어서의 in vivo 항종양 활성을 나타낸 도면이다.
도 18 은 cB273 항체의 인간 신경 교아종 세포주 U-87MG 이식 누드 마우스에 있어서의 in vivo 항종양 활성을 나타낸 도면이다.
도 19 는 cB273 항체의 인간 폐암주 NCI-H2122 이식 누드 마우스에 있어서의 in vivo 항종양 활성 (파클리탁셀＋카르보플라틴 병용) 을 나타낸 도면이다.
도 20 은 cB273 항체의 인간 폐암주 NCI-H460 이식 누드 마우스에 있어서의 in vivo 항종양 활성 (파클리탁셀＋카르보플라틴 병용) 을 나타낸 도면이다.
도 21 은 cB273 항체의 인간 대장암주 DLD-1 이식 누드 마우스에 있어서의 in vivo 항종양 활성 (CPT-11 병용) 을 나타낸 도면이다.
도 22 는 cB273 항체의 인간 대장암주 HCT-15 이식 누드 마우스에 있어서의 in vivo 항종양 활성 (CPT-11 병용) 을 나타낸 도면이다.
도 23 은 cB273 항체의 인간 대장암주 HCT-116 이식 누드 마우스에 있어서의 in vivo 항종양 활성 (CPT-11 병용) 을 나타낸 도면이다.
도 24 는 cB273 항체의 인간 멜라노머주 A375 이식 누드 마우스에 있어서의 in vivo 항종양 활성 (빈블라스틴 병용) 을 나타낸 도면이다.
도 25 는 인간 대장암주 HCT-15 이식 누드 마우스에 있어서의 cB273 항체 및 Conatumumab 의 in vivo 항종양 활성을 비교한 도면이다.
도 26 은 인간 폐암주 NCI-H1975 이식 누드 마우스에 있어서의 cB273 항체 및 Conatumumab 의 in vivo 항종양 활성을 비교한 도면이다.
도 27 은 hB273_H2-1-NE/L1-NK 항체 (도면 중에서는 hB273 이라고 표기하고 있다) 의 인간 대장암주 COLO 205 이식 누드 마우스에 있어서의 in vivo 항종양 활성을 나타낸 도면이다.
도 28 은 마우스 항체 B273 의 중사슬을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 배열 및 마우스 항체 B273 의 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 29 는 마우스 항체 B273 의 경사슬을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 배열 및 마우스 항체 B273 의 경사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 30 은 B273 키메라 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 B273 키메라 타입 경사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 31 은 B273 키메라 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 B273 키메라 타입 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 32 는 hB273_L1 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 hB273_L1 타입 경사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 33 은 hB273_L2 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 hB273_L2 타입 경사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 34 는 hB273_L3 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 hB273_L3 타입 경사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 35 는 hB273_H1 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 hB273_H1 타입 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 36 은 hB273_H2 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 hB273_H2 타입 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 37 은 hB273_H3 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 hB273_H3 타입 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 38 은 hB273_H1-1 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 hB273_H1-1 타입 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 39 는 hB273_H2-1 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 hB273_H2-1 타입 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 40 은 hB273_H2-2 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 hB273_H2-2 타입 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 41 은 hB273_H2-3 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 hB273_H2-3 타입 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 42 는 hB273_H2-4 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 hB273_H2-4 타입 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 43 은 hB273_H2-5 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 hB273_H2-5 타입 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 44 는 hB273_L1-NE 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 hB273_L1-NE 타입 경사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 45 는 hB273_L1-NF 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 hB273_L1-NF 타입 경사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 46 은 hB273_L1-NK 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 hB273_L1-NK 타입 경사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 47 은 hB273_L1-NL 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 hB273_L1-NL 타입 경사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 48 은 hB273_H2-1-NE 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 hB273_H2-1-NE 타입 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 49 는 Conatumumab 의 경사슬을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 배열 및 Conatumumab 의 경사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 50 은 Conatumumab 의 중사슬을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 배열 및 Conatumumab 의 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 51 은 hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK 항체의 인간 암 세포주에 대한 in vitro 살세포 활성을 나타낸 도면이다. A) 는 인간 위암주, B) 는 인간 신장암주, C) 는 인간 간암주, D) 는 인간 섬유 육종주에 대한 결과이다.
도 52 는 hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK 항체 (도면 중에서는 hB273 이라고 표기하고 있다) 와 5-FU 의 병용에 따른 인간 대장암주 HCT-15 이식 누드 마우스에 있어서의 in vivo 항종양 활성, 및 Conatumumab 과의 활성 비교를 나타낸 도면이다.
도 53 은 hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK 항체 (도면 중에서는 hB273 이라고 표기하고 있다) 와 파클리탁셀의 병용에 따른 인간 비소세포 폐암주 NCI-H1975 이식 누드 마우스에 있어서의 in vivo 항종양 활성 및 Conatumumab 과의 활성 비교를 나타낸 도면이다.

또한, 본 명세서 중에 있어서는 「암」 과 「종양」 은 동일한 의미로 이용하고 있다.

본 명세서 중에 있어서, 「유전자」 라는 용어에는 DNA 뿐만 아니라 그 mRNA, cDNA 및 그 cRNA 도 포함되는 것으로 한다.

본 명세서 중에 있어서, 「폴리뉴클레오티드」 라는 용어는 핵산과 동일한 의미로 이용하고 있으며, DNA, RNA, 프로브, 올리고 뉴클레오티드, 및 프라이머도 포함되어 있다.

본 명세서 중에서는, 「폴리펩티드」 와「단백질」 은 구별하지 않고 사용하고 있다.

본 명세서 중에 있어서 「RNA 획분」 이란, RNA 를 포함하고 있는 획분을 말한다.

본 명세서 중에 있어서, 「세포」 에는 동물 개체 내의 세포, 배양 세포도 포함하고 있다.

본 명세서 중에 있어서 「세포의 암화」 란, 세포가 접촉 저지 현상에 대한 감수성을 상실하는 것이나, 부착 비의존성 증식을 나타내는 것 등, 세포가 비정상적인 증식을 나타내는 것을 말하며, 이와 같은 비정상적인 증식을 나타내는 세포를 「암 세포」 라고 한다.

본 명세서 중에 있어서의 「세포 상해」란, 어떠한 형태로 세포에 병리적인 변화를 가져오는 것을 말하며, 직접적인 외상에 머무르지 않고, DNA 의 절단이나 염기의 2 량체의 형성, 염색체의 절단, 세포 분열 장치의 손상, 각종 효소 활성의 저하 등 모든 세포의 구조나 기능상의 손상을 말한다.

본 명세서 중에 있어서의 「세포 상해 활성」이란 상기 세포 상해를 일으키는 것을 말한다.

본 명세서 중에 있어서의 「데스 도메인 함유 수용체」란, 초파리의 자살 유전자 reaper 와 상동성을 나타내는 「데스 도메인」 이라고 불리는 아포토시스 시그널 전달 영역을 세포 내 도메인에 갖는 수용체 분자 (Fas, TNFRI, DR3, DR4, DR5 및 DR6 을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다) 를 말한다.

본 명세서 중에 있어서의 「항체의 기능성 단편」 이란, 항원과의 결합 활성을 갖는 항체의 부분 단편을 의미하고 있으며, Fab, F(ab')₂, scFv 등을 포함한다. 또한, F(ab')₂ 를 환원 조건하에서 처리한 항체의 가변 영역의 1 가의 단편인 Fab' 도 항체의 기능성 단편에 포함된다. 단, 항원과의 결합능을 갖고 있는 한 이들 분자에 한정되지 않는다. 또한, 이들 기능성 단편에는, 항체 단백질의 전체 길이 분자를 적당한 효소로 처리한 것뿐만 아니라, 유전자 공학적으로 개변된 항체 유전자를 이용하여 적당한 숙주 세포에 있어서 산생된 단백질도 포함된다.

본 명세서에 있어서의 「Fab'」 란, 상기와 같이 F(ab')₂ 를 환원 조건하에서 처리한 항체의 가변 영역의 1 가의 단편이다. 단, 유전자 공학적으로 개변된 항체 유전자를 이용하여 산생되는 Fab' 도 본 발명에 있어서의 Fab' 에 포함된다.

본 명세서 중에 있어서의 「단사슬 가변 부위 항체」 는 싱글 체인 Fv (scFv) 와 동일한 의미로 사용되고 있다.

본 명세서에 있어서의 「에피토프」 란, 특정한 항체가 결합하는 항원의 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조를 의미한다. 상기 항원의 부분 펩티드인 에피토프는 면역 어세이법 등 당업자에게 잘 알려져 있는 방법, 예를 들어 이하의 방법에 의해 실시할 수 있다. 먼저, 항원의 다양한 부분 구조를 제조한다. 부분 구조의 제조에 있어서는, 공지된 올리고 펩티드 합성 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, 항원의 C 말단 혹은 N 말단으로부터 적당한 길이로 순차적으로 짧게 한 일련의 폴리펩티드를 당업자에게 주지의 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조한 후, 그것들에 대한 항체의 반응성을 검토하고, 대충의 인식 부위를 결정한 후에, 더욱 짧은 펩티드를 합성하여 그들 펩티드와의 반응성을 검토함으로써, 에피토프를 결정할 수 있다. 또한, 특정한 항체가 결합하는 항원의 부분 입체 구조인 에피토프는 X 선 구조 해석에 의해 상기의 항체와 인접하는 항원의 아미노산 잔기를 특정함으로써 결정할 수 있다.

본 명세서에 있어서의 「동일한 에피토프에 결합하는 항체」 란, 공통의 에피토프에 결합하는 상이한 항체를 의미하고 있다. 제 1 항체가 결합하는 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조에 제 2 항체가 결합하면, 제 1 항체와 제 2 항체가 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 또한, 제 1 항체의 항원에 대한 결합에 대하여 제 2 항체가 경합하는 (즉, 제 2 항체가 제 1 항체와 항원의 결합을 방해하는) 것을 확인함으로써, 구체적인 에피토프의 배열 또는 구조가 결정되어 있지 않아도, 제 1 항체와 제 2 항체가 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 나아가 제 1 항체와 제 2 항체가 동일한 에피토프에 결합하고, 또한 제 1 항체가 아포토시스 유도 활성 등의 특수한 효과를 갖는 경우, 제 2 항체도 동일한 활성을 가질 것을 기대할 수 있다.

본 명세서에 있어서의 「CDR」 이란, 상보성 결정 영역 (CDR : Complemetarity deterring region) 을 의미한다. 항체 분자의 중사슬 및 경사슬에는 각각 3 지점의 CDR 이 있는 것이 알려져 있다. CDR 은 초가변 영역 (hypervariable domain) 이라고도 불리며, 항체의 중사슬 및 경사슬의 가변 영역 내에 있고, 1 차 구조의 변이성이 특히 높은 부위이며, 중사슬 및 경사슬의 폴리펩티드 사슬의 1 차 구조상에 있어서, 각각 3 개 지점에 분리되어 있다. 본 명세서 중에 있어서는, 항체의 CDR 에 대하여, 중사슬의 CDR 을 중사슬 아미노산 배열의 아미노 말단측부터 CDRH1, CDRH2, CDRH3 이라고 표기하고, 경사슬의 CDR 을 경사슬 아미노산 배열의 아미노 말단측부터 CDRL1, CDRL2, CDRL3 이라고 표기한다. 이들 부위는 입체 구조 상에서 서로 근접하여, 결합하는 항원에 대한 특이성을 결정하고 있다.

본 명세서 중에 있어서의 「2 차 항체」 란, 항체 분자에 특이적으로 결합하여, 그 항체 분자끼리를 가교하는 항체를 말한다.

본 명세서에 있어서 「스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈한다」 란, 시판되는 하이브리다이제이션 용액 ExpressHyb Hybridization Solution (클론텍사 제조) 중, 68 ℃ 에서 하이브리다이즈하는 것, 또는, DNA 를 고정시킨 필터를 이용하여 0.7 - 1.0 M 의 NaCl 존재하 68 ℃ 에서 하이브리다이제이션을 실시한 후, 0.1 - 2 배 농도의 SSC 용액 (1 배 농도 SSC 란 150 mM NaCl, 15 mM 시트르산나트륨으로 이루어진다) 을 이용하여, 68 ℃ 에서 세정함으로써 동정할 수 있는 조건 또는 그것과 동등한 조건으로 하이브리다이즈하는 것을 말한다.

본 명세서에 있어서, 「1 혹은 수 개의 아미노산이 치환, 결실 혹은 부가된 아미노산 배열」 이라는 기재가 있는 경우의 「수 개」 란, 2 내지 10 개의 임의의 수의 아미노산 잔기를 나타내고 있다. 보다 구체적으로는, 10 개 이하, 5 내지 6 개 이하, 또는 2 내지 3 개 이하의 아미노산이 치환, 결실 혹은 부가된 경우에 「수 개의 아미노산이 치환, 결실 혹은 부가되었다」 라고 하는 기재가 사용된다.

본 명세서에 있어서, 예를 들어 「배열 번호 34 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역」 이라는 기재는 「배열 번호 34 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열」과 동일한 의미로 사용된다. 또한, 예를 들어 「배열 번호 34 의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬」 이라는 기재는 「배열 번호 34 의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열」 과 동일한 의미로 사용된다.

1. 아포토시스 관련 유전자에 대하여

본 발명에 있어서의 항체에 대해서는, 그 항체가 특정한 항원에 대하여 결합하고, 또한 그 항원을 통하여 세포 상해 활성을 나타낼 것이 요구된다. 또한, 정상 세포가 살상되는 것을 방지하기 위해서, 종양 세포 특이적으로 존재하는 항원을 선택할 필요가 있다. 이와 같은 항원군의 일례로서, 종양 세포 괴사 인자 (본 명세서에 있어서 이하 「TNF」 라고 한다) 관련 아포토시스 유도 리간드 (본 명세서에 있어서 이하 「TRAIL」 이라고 한다) 수용체군을 들 수 있다. TRAIL 은 TNF 패밀리 단백질의 멤버로, 이것은 Fas 리간드 및 TNF-α 를 포함한다 (Wiley SR, et al. I㎜unity 1995 Dec ; 3(6) : 673-82). 이들 단백질은 아포토시스의 강력한 유도 인자이다.

이들 TNF 패밀리 단백질의 수용체는, 세포 외 도메인의 시스테인 리치 반복 배열에 의해 특징지을 수 있지만, 그 중에서도 Fas 리간드의 수용체인 Fas 및 TNFα 의 수용체인 TNF 수용체 I (본 명세서에 있어서 이하 「TNFRI」 라고 한다) 는 초파리의 자살 유전자 reaper (Golstein, P., et al. (1995) Cell. 81, 185 - 186, White, K, et al. (1994) Science 264, 677 - 683) 와 상동성을 나타내는 영역인 「데스 도메인」 이라고 불리는 아포토시스의 시그널 전달에 필수적인 영역을 세포 내 도메인에 가지며, 데스 도메인 함유 수용체라고 총칭된다.

TRAIL 에 대해서는 5 종의 수용체가 동정되어 있고, 이들 중 2 종 (DR4 (TRAIL-R1) 및 DR5 (TRAIL-R2)) 은 아포토시스 시그널을 전달하는 것이 가능하고, 다른 3 종 (DcR1 (TRAIL-R3), DcR2 (TRAIL-R4) 및 오스테오프로테게린 (osteoprotegerin : OPG) 은 아포토시스 시그널을 전달하지 않는다. Fas 및 TNFRI 와 마찬가지로, DR4 및 DR5 양자의 세포 내 세그먼트는 데스 도메인을 포함하며, 그리고 Fas 관련 데스 도메인 단백질 (본 명세서에 있어서 이하 「FADD」 라고 한다) 및 카스파아제 8 을 포함하는 경로를 통하여 아포토시스 시그널을 전달한다 (Chaudhary PM, et al. I㎜unity 1997 Dec ; 7(6) : 813-20 ; Schneider P, et al. I㎜unity 1997 Dec ; 7(6) : 821-30).

상기의 Fas, TNFRI, DR4, DR5 에 대해서는, 그 분자에 결합하여 아고니스트로서 작용하는 항체가, 그 분자를 세포 표면에 보유하는 세포에 대하여, 아포토시스 유도능을 나타내는 것이 알려져 있다 (Journal of Cellular Physiology, 209 : 1221 - 1028 (2006) ; Leukemis, Apl ; 21(4) : 805 - 812 (2007) ; Blood, 99 : 1666 - 1675 (2002) ; Cellular I㎜unology, Jan ; 153(1) : 184 - 193 (1994)). 상기의 아고니스트 항체의 약효는 2 차 항체 또는 이펙터 세포에 의한 가교에 의해 증강된다 (Journal of I㎜unology, 149 : 3166 - 3173 (1992) ; Eouropian Journal of I㎜unology, Oct ; 23(10) : 2676 - 2681 (1993)).

인간 DR5 (death receptor 5) 유전자의 뉴클레오티드 배열 및 아미노산 배열은 GenBank 에 GI : 22547118 (액세션 번호 : NM_147187) 로서 등록되어 있다. 또한, DR5 의 아미노산 배열에 있어서, 1 혹은 수 개의 아미노산이 치환, 결실 혹은 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, DR5 와 동등한 생물 활성을 갖는 단백질을 코드하는 뉴클레오티드 배열도 DR5 유전자의 뉴클레오티드 배열에 포함된다. 또한, DR5 의 아미노산 배열에 있어서, 1 혹은 수 개의 아미노산이 치환, 결실 혹은 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, DR5 와 동등한 생물 활성을 갖는 단백질도 DR5 에 포함된다.

2. 항 DR5 항체의 제조

본 발명의 DR5 에 대한 항체는, 통상적인 방법을 이용하여, DR5 또는 DR5 의 아미노산 배열에서 선택되는 임의의 폴리펩티드를 동물에 면역시키고, 생체 내에 산생되는 항체를 채취, 정제함으로써 얻을 수 있다. 항원이 되는 DR5 의 생물 종은 인간에 한정되지 않고, 마우스, 래트 등의 인간 이외의 동물에서 유래하는 DR5 를 동물에 면역시킬 수도 있다. 이 경우에는 취득된 이종 DR5 에 결합하는 항체와 인간 DR5 의 교차성을 시험함으로써, 인간의 질환에 적용 가능한 항체를 선별할 수 있다.

또한, 공지된 방법 (예를 들어, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p.495 - 497, Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p.365 - 367, Plenum Press, N. Y. (1980)) 에 따라, DR5 에 대한 항체를 산생하는 항체 산생 세포와 미엘로머 세포를 융합시킴으로써 하이브리도마를 수립하여, 모노클로날 항체를 얻을 수도 있다.

또한, 항원이 되는 DR5 는 DR5 유전자를 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 산생시킴으로써 얻을 수 있다.

구체적으로는, DR5 유전자를 발현할 수 있는 벡터를 제조하고, 이것을 숙주 세포에 도입하여 그 유전자를 발현시키고, 발현된 DR5 를 정제하면 된다. 이하, 구체적으로 DR5 에 대한 항체의 취득 방법을 설명한다.

(1) 항원의 조제

항 DR5 항체를 제조하기 위한 항원으로는, DR5 또는 그 적어도 6 개의 연속된 부분 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드, 혹은 이들에 임의의 아미노산 배열이나 담체가 부가된 유도체를 들 수 있다.

DR5 는 인간의 종양 조직 혹은 종양 세포로부터 직접 정제하여 사용할 수 있고, 또한 DR5 를 in vitro 에 의해 합성하거나, 혹은 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 산생시킴으로써 얻을 수 있다.

유전자 조작에서는, 구체적으로는 DR5 의 cDNA 를 발현할 수 있는 벡터에 장착한 후, 전사와 번역에 필요한 효소, 기질 및 에너지 물질을 함유하는 용액 중에서 합성하거나, 혹은 다른 원핵 생물 또는 진핵 생물의 숙주 세포를 형질 전환시켜 DR5 를 발현시킴으로써, 항원을 얻을 수 있다.

또한, 막단백질인 DR5 의 세포 외 영역과 항체의 정상 영역을 연결한 융합 단백질을 적절한 숙주·벡터계에서 발현시킴으로써, 분비 단백질로서 항원을 얻는 것도 가능하다.

DR5 의 cDNA 는 예를 들어 DR5 의 cDNA 를 발현하고 있는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, DR5 cDNA 를 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 이용하여 폴리머라아제 연쇄 반응 (이하 「PCR」 이라고 한다) (Saiki, R. K., et al. Science (1988) 239, p.487 - 489 참조) 을 실시하는, 이른바 PCR 법에 의해 취득할 수 있다.

폴리펩티드의 인·비트로 (in vitro) 합성으로는, 예를 들어 로슈·다이아그노스틱스사 제조의 래피드 트랜슬레이션 시스템 (RTS) 을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다.

원핵 세포의 숙주로는, 예를 들어 대장균 (Escherichia coli) 이나 고초균 (Bacillus subtilis) 등을 들 수 있다. 목적의 유전자를 이들 숙주 세포 내에서 형질 전환시키는 데에 있어서는, 숙주로 적합할 수 있는 종 유래의 레플리콘 즉 복제 기점과, 조절 배열을 포함하고 있는 플라스미드 벡터로 숙주 세포를 형질 전환시킨다. 또한, 벡터로는 형질 전환 세포에 표현 형질 (표현형) 의 선택성을 부여할 수 있는 배열을 갖는 것이 바람직하다.

진핵 세포의 숙주 세포에는 척추 동물, 곤충, 효모 등의 세포가 포함되고, 척추 동물 세포로는, 예를 들어 원숭이의 세포인 COS 세포 (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p.175 - 182, ATCC CRL-1650), 마우스 선유아세포 NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658) 나 차이니즈·햄스터 난소 세포 (CHO 세포, ATCC CCL-61) 의 디하이드로엽산 환원 효소 결손주 (Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, p.4126 - 4220) 등이 잘 이용되고 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

상기와 같이 하여 얻어지는 형질 전환체는 통상적인 방법에 따라 배양할 수 있고, 그 배양에 의해 세포 내, 또는 세포 외에 목적으로 하는 폴리펩티드가 산생된다.

그 배양에 사용되는 배지로는, 채용한 숙주 세포에 따라 관용되는 각종의 것을 적절히 선택할 수 있고, 대장균이면, 예를 들어 LB 배지에 필요에 따라, 암피실린 등의 항생 물질이나 IPMG 를 첨가하여 사용할 수 있다.

상기 배양에 의해, 형질 전환체의 세포 내 또는 세포 외에 산생되는 재조합 단백질은 그 단백질의 물리적 성질이나 화학적 성질 등을 이용한 각종 공지된 분리 조작법에 의해 분리·정제할 수 있다.

그 방법으로는, 구체적으로는 예를 들어, 통상적인 단백질 침전제에 의한 처리, 한외 여과, 분자체 크로마토그래피 (겔 여과), 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등의 각종 액체 크로마토그래피, 투석법, 이들의 조합 등을 예시할 수 있다.

또한, 발현시키는 재조합 단백질에 6 잔기로 이루어지는 히스티딘 태그를 연결함으로써, 니켈 어피니티 칼럼으로 효율적으로 정제할 수 있다. 혹은, 발현시키는 재조합 단백질에 IgG 의 Fc 영역을 연결함으로써, 프로테인 A 칼럼으로 효율적으로 정제할 수 있다.

상기 방법을 조합함으로써 용이하게 고수율, 고순도로 목적으로 하는 폴리펩티드를 대량으로 제조할 수 있다.

(2) 항 DR5 모노클로날 항체의 제조

DR5 와 특이적으로 결합하는 항체의 예로서 DR5 와 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 들 수 있는데, 그 취득 방법은 이하에 기재하는 바와 같다.

모노클로날 항체의 제조에 있어서는, 일반적으로 하기와 같은 작업 공정이 필요하다.

즉,

(a) 항원으로서 사용하는 생체 고분자의 정제,

(b) 항원을 동물에 주사함으로써 면역시킨 후, 혈액을 채취하여 그 항체값을 검정하여 비장 적출의 시기를 결정하고 나서, 항체 산생 세포를 조제하는 공정,

(c) 골수종 세포 (이하 「미엘로머」 라고 한다) 의 조제,

(d) 항체 산생 세포와 미엘로머의 세포 융합,

(e) 목적으로 하는 항체를 산생하는 하이브리도마군의 선별,

(f) 단일 세포 클론으로의 분할 (클로닝),

(g) 경우에 따라서는, 모노클로날 항체를 대량으로 제조하기 위한 하이브리도마의 배양, 또는 하이브리도마를 이식한 동물의 사육,

(h) 이와 같이 하여 제조된 모노클로날 항체의 생리 활성, 및 그 결합 특이성의 검토, 혹은 표지 시약으로서의 특성의 검정 등이다.

이하, 모노클로날 항체의 제조법을 상기 공정에 따라 상세히 서술하지만, 그 항체의 제조법은 이것에 제한되지 않고, 예를 들어 비장 세포 이외의 항체 산생 세포 및 미엘로머를 사용할 수도 있다.

(a) 항원의 정제

항원으로는 상기한 바와 같은 방법으로 조제한 DR5 또는 그 일부를 사용할 수 있다.

또한, DR5 발현 재조합 체세포에 의해 조제한 막 획분, 또는 DR5 발현 재조합 체세포 자신, 나아가 당업자에게 주지의 방법을 이용하여, 화학 합성한 본 발명의 단백질의 부분 펩티드를 항원으로서 사용할 수도 있다.

(b) 항체 산생 세포의 조제

공정 (a) 에서 얻어진 항원과 프로인트의 완전 또는 불완전 아쥬반트, 또는 칼리 명반과 같은 보조제를 혼합하고, 면역원으로서 실험 동물에게 면역시킨다. 실험 동물은 공지된 하이브리도마 제조법에 사용되는 동물을 지장없이 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 마우스, 래트, 염소, 양, 소, 말 등을 사용할 수 있다. 단, 적출한 항체 산생 세포와 융합시키는 미엘로머 세포의 입수 용이성 등의 관점에서, 마우스 또는 래트를 피면역 동물로 하는 것이 바람직하다.

또한, 실제로 사용하는 마우스 및 래트의 계통에는 특별히 제한은 없고, 마우스의 경우에는, 예를 들어 각 계통 A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB, 129 등이, 또한 래트의 경우에는, 예를 들어, Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer 등을 사용할 수 있다.

이 중, 후술하는 미엘로머 세포와의 융합 적합성을 감안하면, 마우스에서는 BALB/c 계통이, 래트에서는 Wistar 및 Low 계통이 피면역 동물로서 특히 바람직하다.

또한, 항원의 인간과 마우스에서의 상동성을 고려하여, 자기 항체를 제거하는 생체 기구를 저하시킨 마우스, 즉 자기 면역 질환 마우스를 사용하는 것도 바람직하다.

또한, 이들 마우스 또는 래트의 면역시의 주령은 바람직하게는 5 ∼ 12 주령, 더욱 바람직하게는 6 ∼ 8 주령이다.

DR5 또는 이 재조합체에 의해 동물을 면역시키는 데에 있어서는, 예를 들어, Weir, D. M., Handbook of Experimental I㎜unology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental I㎜unochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964) 등에 상세하게 기재되어 있는 공지된 방법을 사용할 수 있다.

피면역 동물로부터 항체 산생 세포를 포함하는 비장 세포 또는 임파구를 무균적으로 취출한다. 그 때에 항체값을 측정하여, 항체값이 충분히 높아진 동물을 항체 산생 세포의 공급원으로서 이용하면, 이후의 조작 효율을 높일 수 있다.

여기서 사용되는 항체값의 측정법으로는, 예를 들어 RIA 법 또는 ELISA 법을 들 수 있지만 이들 방법에 제한되지 않는다.

피면역 동물의 비장 세포 또는 임파구로부터의 항체 산생 세포의 분리는 공지된 방법 (예를 들어, Kohler et al., Nature (1975) 256, p.495, ; Kohler et al., Eur. J. I㎜unol. (1977) 6, p.511, ; Milstein et al., Nature (1977), 266, p.550, ; Walsh, Nature, (1977) 266, p.495) 에 따라 실시할 수 있다.

(c) 골수종 세포 (이하, 「미엘로머」 라고 한다)

세포 융합에 사용하는 미엘로머 세포에는 특별한 제한은 없고, 공지된 세포주로부터 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 단, 융합 세포로부터 하이브리도마를 선택할 때의 편리성을 고려하여, 그 선택 수속이 확립되어 있는 HGPRT (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase) 결손주를 사용하는 것이 바람직하다.

즉, 마우스 유래의 X63-Ag8 (X63), NS1-ANS/1 (NS1), P3X63-Ag8.U1 (P3U1), X63-Ag8.653 (X63.653), SP2/0-Ag14 (SP2/0), MPC11-45.6TG1.7 (45.6 TG), FO, S149/5XXO, BU.1 등, 래트 유래의 210.RSY3.Ag.1.2.3 (Y3) 등, 인간 유래의 U266AR (SKO-007), GM1500·GTG-A12 (GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2 (HMy2), 8226AR/NIP4-1 (NP41) 등이다.

(d) 세포 융합

항체 산생 세포와 미엘로머 세포의 융합은 공지된 방법 (Weir, D. M., Handbook of Experimental I㎜unology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental I㎜unochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964) 등) 에 따라, 세포의 생존률을 극도로 저하시키지 않을 정도의 조건하에서 적절히 실시할 수 있다.

그러한 방법은, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 등의 고농도 폴리머 용액 중에서 항체 산생 세포와 미엘로머 세포를 혼합하는 화학적 방법, 전기적 자극을 이용하는 물리적 방법 등을 사용할 수 있다.

(e) 하이브리도마군의 선택

상기 세포 융합에 의해 얻어지는 하이브리도마의 선택 방법은 특별히 제한은 없지만, 통상 HAT (하이포크산틴·아미노프테린·티미딘) 선택법 (Kohler et al., Nature (1975) 256, p.495 ; Milstein et al., Nature (1977) 266, p.550) 이 사용된다.

이 방법은 아미노프테린에서 생존할 수 없는 HGPRT 결손주의 미엘로머 세포를 이용하여 하이브리도마를 얻는 경우에 유효하다.

즉, 미융합 세포 및 하이브리도마를 HAT 배지에서 배양함으로써, 아미노프테린에 대한 내성을 가진 하이브리도마만을 선택적으로 잔존시키고, 또한 증식시킬 수 있다.

(f) 단일 세포 클론으로의 분할 (클로닝)

하이브리도마의 클로닝법으로는, 예를 들어 메틸셀룰로오스법, 연 (軟) 아가로스법, 한계 희석법 등의 공지된 방법을 사용할 수 있다 (예를 들어 Barbara, B. M. and Stanley, M. S. : Selected Methods in Cellular I㎜unology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980) 참조). 이들 방법 중, 특히 메틸셀룰로오스법 등의 삼차원 배양법이 바람직하다. 예를 들어, 세포 융합에 의해 형성된 하이브리도마군을 ClonaCell-HY Selection Medium D (StemCell Technologies 사 제조 ＃03804) 등의 메틸셀룰로오스 배지에 현탁하여 배양하고, 형성된 하이브리도마 콜로니를 회수함으로써 모노클론 하이브리도마의 취득이 가능하다. 회수된 각 하이브리도마 콜로니를 배양하고, 얻어진 하이브리도마 배양 상청 중에 안정적으로 항체가가 확인된 것을 DR5 모노클로날 항체 산생하이브리도마주로서 선택한다.

이와 같이 하여 수립된 하이브리도마주의 예로는, DR5 하이브리도마 B273 을 들 수 있다. 또한, 본 명세서 중에 있어서는, 하이브리도마 B273 이 산생하는 항체를, 「B273 항체」 또는 간단히 「B273」 이라고 기재한다. B273 항체의 중사슬은 배열표의 배열 번호 8 에 나타내는 아미노산 배열을 갖는다. 또한, B273 항체의 경사슬은 배열표의 배열 번호 10 에 나타내는 아미노산 배열을 갖는다. 또한, 배열표의 배열 번호 8 에 나타내는 중사슬 아미노산 배열 중에서, 1 내지 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 시그널 배열이며, 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 가변 영역이며, 142 내지 465 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 정상 영역이다. 또한, 배열표의 배열 번호 10 에 나타내는 경사슬 아미노산 배열 중에서, 1 내지 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 시그널 배열이며, 20 내지 133 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 가변 영역이며, 134 내지 238 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 정상 영역이다.

배열표의 배열 번호 8 에 나타내는 중사슬 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 7 에 나타내는 뉴클레오티드 배열에 의해 코드되어 있다. 배열표의 배열 번호 7 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 항체의 중사슬 시그널 배열을 코드하고 있고, 58 내지 423 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 항체의 중사슬 가변 영역을 코드하고 있고, 그리고 424 내지 1395 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 항체의 중사슬 정상 영역을 코드하고 있다.

배열표의 배열 번호 10 에 나타내는 경사슬 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 9 에 나타내는 뉴클레오티드 배열에 의해 코드되어 있다. 배열표의 배열 번호 9 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 항체의 경사슬 시그널 배열을 코드하고 있고, 58 내지 399 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 항체의 경사슬 가변 영역을 코드하고 있고, 그리고 400 내지 714 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 항체의 경사슬 정상 영역을 코드하고 있다.

(g) 하이브리도마의 배양에 의한 모노클로날 항체의 조제

이와 같이 하여 선택된 하이브리도마는 이것을 배양함으로써 모노클로날 항체를 효율적으로 얻을 수 있지만, 배양에 앞서, 목적으로 하는 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마를 스크리닝하는 것이 바람직하다.

이 스크리닝에는 그 자체가 이미 알려진 방법을 채용할 수 있다.

본 발명에 있어서의 항체값의 측정은 예를 들어 상기 (b) 의 항목에서 설명한 ELISA 법에 의해 실시할 수 있다.

이상의 방법에 의해 얻은 하이브리도마는 액체 질소 중 또는 -80 ℃ 이하의 냉동고 안에 동결 상태로 보존할 수 있다.

클로닝을 완료한 하이브리도마는 배지를 HT 배지에서 정상 배지로 바꾸어 배양된다.

대량 배양은 대형 배양병을 사용한 회전 배양, 혹은 스피너 배양으로 실시된다. 이 대량 배양에 있어서의 상청으로부터, 겔 여과 등, 당업자에게 주지의 방법을 이용하여 정제함으로써, 본 발명의 단백질에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 얻을 수 있다.

또한, 동 계통의 마우스 (예를 들어, 상기의 BALB/c), 혹은 Nu/Nu 마우스의 복강 내에 하이브리도마를 주사하여, 그 하이브리도마를 증식시킴으로써, 본 발명의 모노클로날 항체를 대량으로 포함하는 복수를 얻을 수 있다.

복강 내에 투여하는 경우에는, 사전 (3 ∼ 7 일 전) 에 2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸 (2,6,10,14-tetramethyl pentadecane) (프리스탄) 등의 광물유를 투여하면, 보다 다량의 복수가 얻어진다.

예를 들어, 하이브리도마와 동 계통의 마우스의 복강 내에 미리 면역 억제제를 주사하여, T 세포를 불활성화시킨 후, 20 일 후에 10⁶ ∼ 10⁷ 개의 하이브리도마·클론 세포를, 혈청을 포함하지 않는 배지 중에 부유 (0.5 ㎖) 시켜 복강 내에 투여하고, 통상적으로 복부가 팽만하여, 복수가 고인 시점에서 마우스로부터 복수를 채취한다. 이 방법에 의해, 배양액 중에 비해 약 100 배 이상의 농도의 모노클로날 항체가 얻어진다.

상기 방법에 의해 얻은 모노클로날 항체는, 예를 들어, Weir, D. M. : Handbook of Experimental I㎜unology, Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978) 에 기재되어 있는 방법으로 정제할 수 있다.

이렇게 하여 얻어지는 모노클로날 항체는 DR5 에 대하여 높은 항원 특이성을 갖는다.

(h) 모노클로날 항체의 검정

이렇게 하여 얻어진 모노클로날 항체의 아이소 타입 및 서브 클래스의 결정은 이하와 같이 실시할 수 있다.

먼저, 동정법으로는 오크테를로니 (Ouchterlony) 법, ELISA 법, 또는 RIA 법을 들 수 있다.

오크테를로니법은 간편하기는 하지만, 모노클로날 항체의 농도가 낮은 경우에는 농축 조작이 필요하다.

한편, ELISA 법 또는 RIA 법을 사용한 경우에는, 배양 상청을 그대로 항원 흡착 고상과 반응시키고, 나아가 제２차 항체로서 각종 임뮤노글로블린 아이소 타입, 서브 클래스에 대응하는 항체를 사용함으로써, 모노클로날 항체의 아이소 타입, 서브 클래스를 동정하는 것이 가능하다.

또한, 더욱 간편한 방법으로, 시판되는 동정용 키트 (예를 들어, 마우스 타이퍼 키트 ; 바이오래드사 제조) 등을 이용할 수도 있다.

또한 단백질의 정량은 폴린로리법 및 280 ㎚ 에 있어서의 흡광도 [1.4 (OD280) = 임뮤노글로블린 1 ㎎/㎖] 로부터 산출하는 방법에 의해 실시할 수 있다.

또한, (2) 의 (a) 내지 (h) 의 공정을 재차 실시하여 별도로 독립적으로 모노클로날 항체를 취득한 경우에 있어서도, B273 과 동등한 세포 상해 활성을 갖는 항체를 취득하는 것이 가능하다. 이와 같은 항체의 일례로서 B273 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 들 수 있다. 새롭게 제조된 모노클로날 항체가, B273 항체가 결합하는 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조에 결합하면, 그 모노클로날 항체가 B273 항체와 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 또한, B273 항체의 DR5 에 대한 결합에 대하여 그 모노클로날 항체가 경합하는 (즉, 그 모노클로날 항체가 B273 항체와 DR5 의 결합을 방해하는) 것을 확인함으로써, 구체적인 에피토프의 배열 또는 구조가 결정되어 있지 않아도, 그 모노클로날 항체가 B273 항체와 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 에피토프가 동일하다는 것이 확인된 경우, 그 모노클로날 항체가 B273 과 동등한 세포 상해 활성을 갖고 있을 것이 크게 기대된다.

또한, 실시예 4 에 나타내는 바와 같이, 항체의 Fab 프래그먼트와 DR5 의 복합체의 X 선 회절 데이터로부터, Fab 프래그먼트에 근접한 DR5 측의 아미노산 잔기를 특정하는 것이 가능하다. 구체적으로는, 임의의 항체에서 유래하는 Fab 프래그먼트가 배열표의 배열 번호 23 에 기재된 아미노산 배열의 26 번째의 글리신 잔기, 34 번째의 이소류신 잔기, 36 번째의 글루탐산 잔기, 37 번째의 아스파르트산 잔기, 38 번째의 글리신 잔기, 56 번째의 아스파르트산 잔기, 57 번째의 류신 잔기, 58 번째의 류신 잔기, 59 번째의 페닐알라닌 잔기, 61 번째의 류신 잔기 및 62 번째의 아르기닌 잔기와 4 Å 이내의 거리에서 인접하고 있는 경우에, 그 항체는 B273 과 동일한 에피토프 특이성을 갖는 것으로 판단할 수 있다.

(3) 그 밖의 항체

본 발명의 항체에는, 상기 DR5 에 대한 모노클로날 항체에 더하여, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들어, 키메라 (Chimeric) 항체, 인간화 (Humanized) 항체, 인간 항체 등도 포함된다. 이들 항체는 이미 알려진 방법을 이용하여 제조할 수 있다.

키메라 항체로는, 항체의 가변 영역과 정상 영역이 서로 이종인 항체, 예를 들어 마우스 또는 래트 유래 항체의 가변 영역을 인간 유래의 정상 영역에 접합한 키메라 항체를 들 수 있다 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851 - 6855, (1984) 참조). 마우스 항인간 DR5 항체 B273 유래의 키메라 항체는 배열 번호 20 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 배열 번호 16 의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬로 이루어지는 항체이며, 임의의 정상 영역을 갖고 있어도 된다. 이와 같은 키메라 항체의 일례로서 배열표의 배열 번호 20 의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중사슬, 및 배열 번호 16 의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다. 또한, 배열표의 배열 번호 20 에 나타내는 중사슬 배열 중에서, 1 내지 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 시그널 배열이며, 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 가변 영역이며, 142 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 정상 영역이다. 또한, 배열표의 배열 번호 16 에 나타내는 경사슬 배열 중에서, 1 내지 20 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 시그널 배열이며, 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 가변 영역이며, 135 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 정상 영역이다.

배열표의 배열 번호 20 에 나타내는 중사슬 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 19 에 나타내는 뉴클레오티드 배열에 의해 코드되어 있다. 배열표의 배열 번호 19 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 항체의 중사슬 시그널 배열을 코드하고 있고, 58 내지 423 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 항체의 중사슬 가변 영역을 코드하고 있고, 그리고 424 내지 1413 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 항체의 중사슬 정상 영역을 코드하고 있다.

배열표의 배열 번호 16 에 나타내는 경사슬 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 15 에 나타내는 뉴클레오티드 배열에 의해 코드되어 있다. 배열표의 배열 번호 15 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 1 내지 60 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 항체의 경사슬 시그널 배열을 코드하고 있고, 61 내지 402 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 항체의 경사슬 가변 영역을 코드하고 있고, 그리고 403 내지 717 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 항체의 경사슬 정상 영역을 코드하고 있다.

인간화 항체로는, 상보성 결정 영역 (CDR ; complementarity determining region) 만을 인간 유래의 항체에 장착한 항체 (Nature (1986) 321, p.522 - 525 참조), CDR 이식법에 의해 CDR 의 배열에 더하여 일부의 프레임 워크의 아미노산 잔기도 인간 항체에 이식한 항체 (국제 공개 팜플렛 WO 90/07861) 를 들 수 있다.

단, B273 항체 유래의 인간화 항체로는, B273 의 6 종 모두의 CDR 배열을 유지하고, 세포에 아포토시스를 유도하는 활성을 갖는 한, 특정한 인간화 항체에 한정되지 않는다. 또한, B273 항체의 중사슬 가변 영역은 배열표의 배열 번호 82 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1 (GYFMN), 배열 번호 83 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2 (RFNPYNGDTFYNQKFKG), 및 배열 번호 84 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 (SAYYFDSGGYFDY) 을 보유하고 있다. 또한, B273 항체의 경사슬 가변 영역은 배열표의 배열 번호 79 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1 (RSSQSLVHSNGNTYLH), 배열 번호 80 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2 (KVSNRFS), 및 배열 번호 81 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3 (SQSTHVPWT) 을 보유하고 있다.

또한 상기 CDR 에 1 개 내지 수 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 배열을, B273 항체에서 유래하는 CDR 개변 항체가 갖는 CDR 배열로서 사용할 수 있다. CDRL1 의 1 아미노산 잔기 치환체의 예로서 배열표의 배열 번호 85 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 배열 (RSSQSLVHSNENTYLH), 배열 번호 86 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 배열 (RSSQSLVHSNFNTYLH), 배열 번호 87 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 배열 (RSSQSLVHSNKNTYLH), 또는 배열 번호 88 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 배열 (RSSQSLVHSNLNTYLH) 을 들 수 있다. 또한, CDRH2 의 1 아미노산 잔기 치환체의 예로서 배열 번호 89 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 배열 (RFNPYNEDTFYNQKFKG) 을 들 수 있다.

일반적으로 단백질의 아스파라긴 탈아미드화는, C 말단측에 인접하는 아미노산 사이에서, 고리형 숙신산이미드 천이 상태를 형성하여 진행된다 (Geiger, T. and Clarke, S. (1987) Deamidation, Isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation. J. Biol. Chem. 262, 785 - 794). 고리형 숙신산이미드 천이 상태 형성에 율속이 되는 것은 인접 아미노산의 측사슬의 크기이며, 따라서, 가장 탈아미드화가 빠른 것은 측사슬이 가장 작은 글리신이다. 반대로 C 말단측 인접기를 큰 측사슬을 갖는 아미노산으로 치환함으로써, 탈아미드화 속도를 억제하는 것이 가능하다. B273 항체는 CDRL1 및 CDRH2 로 탈아미드화되기 쉬운 -N-G-(아스파라긴-글리신) 배열을 갖고 있다. 그래서, 본 발명자들은 인접기를, 글리신에서, 보다 큰 측사슬을 갖는 리신, 페닐알라닌, 류신, 글루탐산으로 변경한 점 변이체를 제조하였다. 즉, CDRH2 에 대해서는 -N-G-(아스파라긴-글리신) 배열을 -N-E-(아스파라긴-글루탐산) 배열로 변이시키고, CDRL1 에 대해서는 -N-G-(아스파라긴-글리신) 배열을 -N-L-(아스파라긴-류신) 배열, -N-F-(아스파라긴-페닐알라닌) 배열, -N-K-(아스파라긴-리신) 배열, -N-E-(아스파라긴-글루탐산) 배열로 각각 변이시킴으로써, 항체의 탈아미드화가 억제된다.

상기의 CDR 을 포함하는 항체의 실례로서 배열표의 배열 번호 82 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1, 배열 번호 83 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2, 및 배열 번호 84 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬 가변 영역, 그리고 배열표의 배열 번호 79 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1, 배열 번호 80 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2, 및 배열 번호 81 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것으로 이루어지는 항체, 배열표의 배열 번호 82 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1, 배열 번호 89 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2, 및 배열 번호 84 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬 가변 영역, 그리고 배열표의 배열 번호 85 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1, 배열 번호 80 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2, 및 배열 번호 81 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것으로 이루어지는 항체, 배열표의 배열 번호 82 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1, 배열 번호 89 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2, 및 배열 번호 84 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬 가변 영역, 그리고 배열표의 배열 번호 86 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1, 배열 번호 80 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2, 및 배열 번호 81 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것으로 이루어지는 항체, 배열표의 배열 번호 82 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1, 배열 번호 89 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2, 및 배열 번호 84 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬 가변 영역, 그리고 배열표의 배열 번호 87 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1, 배열 번호 80 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2, 및 배열 번호 81 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것으로 이루어지는 항체, 또는 배열표의 배열 번호 82 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1, 배열 번호 89 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2, 및 배열 번호 84 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬 가변 영역, 그리고 배열표의 배열 번호 88 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1, 배열 번호 80 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2, 및 배열 번호 81 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것으로 이루어지는 항체를 들 수 있다.

마우스 항체 B273 의 인간화 항체 (CDR 개변 항체를 포함한다) 의 실례로는, 배열표의 배열 번호 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 또는 70 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 중 어느 하나로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬, 및 배열 번호 28, 30, 32, 52, 58, 62 또는 66 의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 중 어느 하나로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬의 임의의 조합을 들 수 있다.

바람직한 조합으로는, 배열 번호 34 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 28 의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 배열 번호 34 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 30 의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 배열 번호 34 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 32 의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 배열 번호 36 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 28 의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 배열 번호 36 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 30 의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 배열 번호 36 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 32 의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 배열 번호 38 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 28 의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 배열 번호 38 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 30 의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 배열 번호 38 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 32 의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 배열 번호 40 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 28 의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 배열 번호 42 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 28 의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 배열 번호 44 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 28 의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 배열 번호 46 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 28 의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 배열 번호 48 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 28 의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 배열 번호 50 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 28 의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 배열 번호 70 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 52 의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 배열 번호 70 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 58 의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 배열 번호 70 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 62 의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 또는 배열 번호 70 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 66 의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체를 들 수 있다.

더욱 바람직한 조합으로는, 배열 번호 34 의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 28 의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 34 의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 30 의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 34 의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 32 의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 36 의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 28 의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 36 의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 30 의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 36 의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 32 의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 38 의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 28 의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 38 의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 30 의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 38 의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 32 의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 40 의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 28 의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 42 의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 28 의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 44 의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 28 의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 46 의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 28 의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 48 의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 28 의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 50 의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 28 의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 70 의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 52 의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 70 의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 58 의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 70 의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 62 의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬로 이루어지는 항체, 또는 배열 번호 70 의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 66 의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다.

보다 바람직한 조합으로는, 배열 번호 42 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 28 의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 배열 번호 70 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 52 의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 배열 번호 70 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 58 의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 배열 번호 70 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 62 의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 또는 배열 번호 70 의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 66 의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체를 들 수 있다.

가장 바람직한 조합으로는, 배열 번호 42 의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 28 의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 70 의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 52 의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 70 의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 58 의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 70 의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 62 의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬로 이루어지는 항체, 또는 배열 번호 70 의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 66 의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다.

상기의 중사슬 아미노산 배열 및 경사슬 아미노산 배열과 높은 상동성을 나타내는 배열을 조합함으로써, 상기의 각 항체와 동등한 세포 상해성 활성을 갖는 항체를 선택하는 것이 가능하다. 이와 같은 상동성은 일반적으로는 80 ％ 이상의 상동성이며, 바람직하게는 90 ％ 이상의 상동성이며, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상의 상동성이며, 가장 바람직하게는 99 ％ 이상의 상동성이다. 또한, 중사슬 또는 경사슬의 아미노산 배열에 1 내지 수 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 배열을 조합하는 것에 의해서도, 상기의 각 항체와 동등한 세포 상해성 활성을 갖는 항체를 선택하는 것이 가능하다. 치환, 결실 또는 부가되는 아미노산 잔기 수는 일반적으로는 10 아미노산 잔기 이하이며, 바람직하게는 5 내지 6 아미노산 잔기 이하이며, 보다 바람직하게는 2 내지 3 아미노산 잔기 이하이며, 가장 바람직하게는 1 아미노산 잔기이다.

2 종류의 아미노산 배열 사이의 상동성은 Blast algorithm version 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), 「Gapped BLAST and PSI-BLAST : a new generation of protein database search programs」, Nucleic Acids Res. 25 : 3389 - 3402) 의 디폴트 파라미터를 사용함으로써 결정할 수 있다. Blast algorithm 은 인터넷에서 www.ncbi.nlm.nih.gov/blast 에 액세스하는 것에 의해서도 사용할 수 있다. 또한, 상기의 Blast algorithm 에 의해 Identity (또는 Identities) 및 Positivity (또는 Positivities) 의 2 종류의 퍼센티지의 값이 계산된다. 전자는 상동성을 구해야 할 2 종류의 아미노산 배열 사이에서 아미노산 잔기가 일치한 경우의 값이며, 후자는 화학 구조가 유사한 아미노산 잔기도 고려한 수치이다. 본 명세서에 있어서는, 아미노산 잔기가 일치하고 있는 경우의 Identity (동일성) 의 값을 상동성의 값으로 한다.

또한, 배열표의 배열 번호 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 또는 70 에 나타내는 중사슬 아미노산 배열 중에서, 1 내지 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 시그널 배열이며, 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 가변 영역이며, 142 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 정상 영역이다. 또한, 배열표의 배열 번호 28, 30, 32, 52, 58, 62, 또는 66 에 나타내는 경사슬 아미노산 배열 중에서, 1 내지 20 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 시그널 배열이며, 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 가변 영역이며, 135 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 정상 영역이다.

배열표의 배열 번호 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 또는 70 에 나타내는 중사슬 아미노산 배열은 각각 배열표의 배열 번호 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 또는 69 에 나타내는 뉴클레오티드 배열에 의해 코드되어 있다. 각 뉴클레오티드 배열의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 항체의 중사슬 시그널 배열을 코드하고 있고, 58 내지 423 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 항체의 중사슬 가변 영역을 코드하고 있고, 그리고 424 내지 1413 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 항체의 중사슬 정상 영역을 코드하고 있다.

배열표의 배열 번호 28, 30, 32, 52, 58, 62, 또는 66 에 나타내는 경사슬 아미노산 배열은 각각 배열표의 배열 번호 27, 29, 31, 51, 57, 61, 또는 65 에 나타내는 뉴클레오티드 배열에 의해 코드되어 있다. 각 뉴클레오티드 배열의 1 내지 60 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 항체의 경사슬 시그널 배열을 코드하고 있고, 61 내지 402 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 항체의 경사슬 가변 영역을 코드하고 있고, 그리고 403 내지 717 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 항체의 경사슬 정상 영역을 코드하고 있다.

이들 뉴클레오티드 배열과 다른 항체의 뉴클레오티드 배열 사이의 상동성에 대해서도 Blast algorithm 에 의해 결정할 수 있다.

본 발명의 항체로는, 또한 B273 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 인간 항체를 들 수 있다. 항 DR5 인간 항체란, 인간 염색체 유래 항체의 유전자 배열만을 갖는 인간 항체를 의미한다. 항 DR5 인간 항체는 인간 항체의 중사슬과 경사슬의 유전자를 포함하는 인간 염색체 단편을 갖는 인간 항체 산생 마우스를 사용한 방법 (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p.133 - 143, ; Kuroiwa, Y. et. al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, p.3447 - 3448 ; Yoshida, H. et. al., Animal Cell Technology : Basic and Applied Aspects vol.10, p.69 - 73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999. ; Tomizuka, K. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p.722 - 727 등을 참조) 에 의해 취득할 수 있다.

이와 같은 인간 항체 산생 마우스는, 구체적으로는 내재성 면역 글로블린 중사슬 및 경사슬의 유전자좌가 파괴되고, 대신에 효모 인공 염색체 (Yeast artificial chromosome, YAC) 벡터 등을 개재하여 인간 면역 글로블린 중사슬 및 경사슬의 유전자좌가 도입된 유전자 재조합 동물을, 넉아웃 동물 및 트랜스제닉 동물의 제조, 및 이들 동물끼리를 교배시킴으로써 만들어 낼 수 있다.

또한, 유전자 재조합 기술에 의해, 그러한 인간 항체의 중사슬 및 경사슬의 각각을 코드하는 cDNA, 바람직하게는 그 cDNA 를 포함하는 벡터에 의해 진핵 세포를 형질 전환하고, 유전자 재조합 인간 모노클로날 항체를 산생하는 형질 전환 세포를 배양함으로써, 이 항체를 배양 상청 중에서 얻을 수도 있다.

여기서, 숙주로는 예를 들어 진핵 세포, 바람직하게는 CHO 세포, 임파구나 미엘로머 등의 포유 동물 세포를 사용할 수 있다.

또한, 인간 항체 라이브러리에서 선별한 파지 디스플레이 유래의 인간 항체를 취득하는 방법 (Wormstone, I. M. et. al, Investigative Ophthalmology ＆ Visual Science. (2002) 43(7), p.2301 - 2308 ; Carmen, S. et. al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1(2), p.189 - 203 ; Siriwardena, D. et. al., Ophthalmology (2002) 109(3), p.427 - 431 등 참조.) 도 알려져 있다.

예를 들어, 인간 항체의 가변 영역을 1 개 사슬 항체 (scFv) 로서 파지 표면에 발현시키고, 항원에 결합하는 파지를 선택하는 파지 디스플레이법 (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p.1105 - 1116) 을 사용할 수 있다.

항원에 결합함으로써 선택된 파지의 유전자를 해석하여, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변 영역을 코드하는 DNA 배열을 결정할 수 있다.

항원에 결합하는 scFv 의 DNA 배열이 밝혀지면, 당해 배열을 갖는 발현 벡터를 제조하고, 적당한 숙주에 도입하여 발현시킴으로써 인간 항체를 취득할 수 있다 (WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388, Annu. Rev. I㎜unol (1994) 12, p.433 - 455, Nature Biotechnology (2005) 23(9), p.1105 - 1116).

새롭게 제조된 인간 항체가, B273 항체가 결합하는 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조에 결합하면, 그 인간 항체가 B273 항체와 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 또한, B273 항체의 DR5 에 대한 결합에 대하여 그 인간 항체가 경합하는 (즉, 그 인간 항체가 B273 항체와 DR5 의 결합을 방해하는) 것을 확인함으로써, 구체적인 에피토프의 배열 또는 구조가 결정되어 있지 않아도, 그 인간 항체가 B273 항체와 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 에피토프가 동일하다는 것이 확인된 경우, 그 인간 항체가 B273 과 동등한 세포 상해 활성을 갖고 있을 것이 크게 기대된다.

또한, 실시예 4 에 나타내는 바와 같이, 항체의 Fab 프래그먼트와 DR5 의 복합체의 X 선 회절 데이터로부터, Fab 프래그먼트에 근접한 DR5 측의 아미노산 잔기를 특정하는 것이 가능하다. 구체적으로는, 임의의 항체에서 유래하는 Fab 프래그먼트가 배열표의 배열 번호 23 에 기재된 아미노산 배열의 26 번째의 글리신 잔기, 34 번째의 이소류신 잔기, 36 번째의 글루탐산 잔기, 37 번째의 아스파르트산 잔기, 38 번째의 글리신 잔기, 56 번째의 아스파르트산 잔기, 57 번째의 류신 잔기, 58 번째의 류신 잔기, 59 번째의 페닐알라닌 잔기, 61 번째의 류신 잔기 및 62 번째의 아르기닌 잔기와 4 Å 이내의 거리에서 인접하고 있는 경우에, 그 항체는 B273 과 동일한 에피토프에 결합한다고 판단할 수 있다.

이상의 방법에 의해 얻어진 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체는 실시예 3 에 나타낸 방법 등에 의해 항원에 대한 결합성을 평가하고, 바람직한 항체를 선발할 수 있다. 항체의 성질을 비교할 때의 다른 지표의 일례로는, 항체의 안정성을 들 수 있다. 실시예 10 에서 나타낸 시차 주사 칼로리메트리 (DSC) 는 단백의 상대적 구조 안정성의 좋은 지표가 되는 열변성 중점 (Tm) 을 빠르게, 또한 정확하게 측정할 수 있는 장치이다. DSC 를 이용하여 Tm 값을 측정하고, 그 값을 비교함으로써, 열 안정성의 차이를 비교할 수 있다. 항체의 보존 안정성은 항체의 열 안정성과 어느 정도의 상관을 나타내는 것이 알려져 있고 (Lori Burton, et. al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, p.265 - 273), 열안정성을 지표로, 바람직한 항체를 선발할 수 있다. 항체를 선발하기 위한 다른 지표로는, 적절한 숙주 세포에 있어서의 수량이 높은 것, 및 수용액 중에서의 응집성이 낮은 것을 들 수 있다. 예를 들어 수량이 가장 높은 항체가 가장 높은 열 안정성을 나타낸다고는 할 수 없기 때문에, 이상에 서술한 지표에 기초하여 종합적으로 판단하여, 인간에 대한 투여에 가장 적합한 항체를 선발할 필요가 있다.

또한, 항체의 중사슬 및 경사슬의 전체 길이 배열을 적절한 링커를 이용하여 연결하고, 1 개 사슬 임뮤노글로블린 (single chain i㎜unoglobulin) 을 취득하는 방법도 알려져 있다 (Lee, H-S, et. al., Molecular I㎜unology (1999) 36, p.61 - 71 ; Shirrmann, T. et. al., mAbs (2010), 2, (1) p.1 - 4). 이와 같은 1 개 사슬 임뮤노글로블린은 2 량체화함으로써, 본래는 4 량체인 항체와 유사한 구조와 활성을 유지하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 항체는 단일의 중사슬 가변 영역을 가지며, 경사슬 배열을 갖지 않는 항체이어도 된다. 이와 같은 항체는 단일 도메인 항체 (single domain antibody : sdAb) 또는 나노 보디 (nanobody) 로 불리고 있으며, 실제로 낙타 또는 라마에서 관찰되고, 항원 결합능이 유지되고 있는 것이 보고되어 있다 (Muyldemans S. et. al., Protein Eng. (1994) 7(9), 1129-35, Hamers-Casterman C. et. al., Nature (1993) 363 (6428) 446-8). 상기 항체는 본 발명에 있어서의 항체에 포함된다.

또한, 본 발명의 항체에 결합되어 있는 당 사슬 수식을 조절함으로써, 항체 의존성 세포 상해 활성을 증강하는 것이 가능하다. 항체의 당 사슬 수식의 조절 기술로는 WO 99/54342, WO 00/61739, WO 02/31140 등이 알려져 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

항체 유전자를 일단 단리한 후, 적당한 숙주에 도입하여 항체를 제조하는 경우에는, 적당한 숙주와 발현 벡터의 조합을 사용할 수 있다. 항체 유전자의 구체예로는, 본 명세서에 기재된 항체의 중사슬 배열을 코드하는 유전자, 및 경사슬 배열을 코드하는 유전자를 조합한 것을 들 수 있다. 숙주 세포를 형질 전환할 때에는, 중사슬 배열 유전자와 경사슬 배열 유전자는 동일한 발현 벡터에 삽입되어 있는 것이 가능하고, 또한 다른 발현 벡터에 삽입되어 있는 것도 가능하다. 진핵 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 동물 세포, 식물 세포, 진핵 미생물을 사용할 수 있다. 동물 세포로는 (1) 포유류 세포, 예를 들어 원숭이의 세포인 COS 세포 (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p.175 - 182, ATCC CRL-1650), 마우스 선유아세포 NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658) 이나 차이니즈·햄스터 난소 세포 (CHO 세포, ATCC CCL-61) 의 디하이드로엽산 환원 효소 결손주 (Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1980) 77, p.4126 - 4220) 를 들 수 있다. 또한, 원핵 세포를 사용하는 경우에는, 예를 들어 대장균, 고초균을 들 수 있다. 이들 세포에 목적으로 하는 항체 유전자를 형질 전환에 의해 도입하고, 형질 전환된 세포를 in vitro 로 배양함으로써 항체가 얻어진다. 이상의 배양법에 있어서는 항체의 배열에 의해 수량이 상이한 경우가 있고, 동등한 결합 활성을 갖는 항체 중에서 수량을 지표로 의약으로서의 생산이 용이한 것을 선별하는 것이 가능하다.

본 발명의 항체의 아이소 타입으로서의 제한은 없고, 예를 들어 IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (IgA1, IgA2), IgD 혹은 IgE 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 IgG 또는 IgM, 더욱 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2 를 들 수 있다.

또한 본 발명의 항체는 항체의 항원 결합부를 갖는 항체의 기능성 단편 또는 그 수식물이어도 된다. 항체를 파파인, 펩신 등의 단백질 분해 효소로 처리하거나, 혹은 항체 유전자를 유전자 공학적 수법에 의해 개변하여 적당한 배양 세포에서 발현시킴으로써, 그 항체의 단편을 얻을 수 있다. 이와 같은 항체 단편 중에서, 항체 전체 길이 분자가 갖는 기능의 모두 또는 일부를 유지하고 있는 단편을 항체의 기능성 단편이라고 부를 수 있다. 항체의 기능으로는, 일반적으로는 항원 결합 활성, 항원의 활성을 중화하는 활성, 항원의 활성을 증강하는 활성, 항체 의존성 세포 상해 활성, 보체 의존성 세포 상해 활성 및 보체 의존성 세포성 세포 상해 활성을 들 수 있다. 본 발명에 있어서의 항체의 기능성 단편이 유지하는 기능은 DR5 에 대한 결합 활성이며, 바람직하게는 세포에 아포토시스를 유도하는 활성이며, 보다 바람직하게는 암 세포에 대한 아포토시스의 유도를 통한 세포 상해 활성이다. 단, 본 발명의 항체는, 세포에 아포토시스를 유도하는 활성에 더하여, 항체 의존성 세포 상해 활성, 보체 의존성 세포 상해 활성 및/또는 보체 의존성 세포성 세포 상해 활성을 겸비하고 있어도 된다.

예를 들어, 항체의 단편으로는, Fab, F(ab')₂, Fv, 또는 중사슬 및 경사슬의 Fv 를 적당한 링커로 연결시킨 싱글 체인 Fv (scFv), diabody (diabodies), 선상 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다특이성 항체 등을 들 수 있다. 또한, F(ab')₂ 를 환원 조건하에서 처리한 항체의 가변 영역의 1 가의 단편인 Fab' 도 항체의 단편에 포함된다.

또한 본 발명의 항체는 적어도 2 종류의 상이한 항원에 대하여 특이성을 갖는 다특이성 항체이어도 된다. 통상적으로 이와 같은 분자는 2 종류의 항원에 결합하는 것이지만 (즉, 이중 특이성 항체 (bispecific antibody)), 본 발명에 있어서의 「다특이성 항체」 는 그 이상 (예를 들어, 3 종류) 의 항원에 대하여 특이성을 갖는 항체를 포함하는 것이다.

본 발명의 다특이성 항체는 전체 길이로 이루어지는 항체, 또는 그러한 항체의 단편 (예를 들어, F(ab')₂ 이중 특이성 항체) 이어도 된다. 이중 특이성 항체는 2 종류의 항체의 중사슬과 경사슬 (HL 쌍) 을 결합시켜 제조할 수도 있고, 상이한 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마를 융합시켜, 이중 특이성 항체 산생 융합 세포를 제조하는 것에 의해서도, 제조할 수 있다 (Millstein et al., Nature (1983) 305, p.537 - 539).

본 발명의 항체는 1 개 사슬 항체 (scFv 라고도 기재한다) 이어도 된다. 1 개 사슬 항체는 항체의 중사슬 가변 영역과 경사슬 가변 영역을 폴리펩티드의 링커로 연결함으로써 얻어지는 (Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 (Rosenberg 및 Moore 편, Springer Verlag, New York, p.269 - 315 (1994), Nature Biotechnology (2005), 23, p.1126 - 1136). 또한, 2 개의 scFv 를 폴리펩티드 링커로 결합시켜 제조되는 BiscFv 단편을 이중 특이성 항체로서 사용할 수도 있다.

1 개 사슬 항체를 제조하는 방법은 당 기술 분야에 있어서 주지이다 (예를 들어, 미국 특허 제4,946,778호, 미국 특허 제5,260,203호, 미국 특허 제5,091,513호, 미국 특허 제5,455,030호 등을 참조). 이 scFv 에 있어서, 중사슬 가변 영역과 경사슬 가변 영역은 컨주게이트를 만들지 않는 링커, 바람직하게는 폴리펩티드 링커를 통하여 연결된다 (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988), 85, p.5879 - 5883). scFv 에 있어서의 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역은 동일한 항체에서 유래해도 되고, 다른 항체에서 유래해도 된다.

가변 영역을 연결하는 폴리펩티드 링커로는, 예를 들어 12 ∼ 19 잔기로 이루어지는 임의의 1 개 사슬 펩티드가 사용된다.

scFv 를 코드하는 DNA 는, 상기 항체의 중사슬 또는 중사슬 가변 영역을 코드하는 DNA, 및 경사슬 또는 경사슬 가변 영역을 코드하는 DNA 중, 그들의 배열 중 전부 또는 원하는 아미노산 배열을 코드하는 DNA 부분을 주형으로 하고, 그 양단을 규정하는 프라이머쌍을 이용하여 PCR 법에 의해 증폭하고, 이어서, 추가로 폴리펩티드 링커 부분을 코드하는 DNA, 및 그 양단이 각각 중사슬, 경사슬과 연결되도록 규정하는 프라이머쌍을 조합하여 증폭함으로써 얻어진다.

또한, 일단 scFv 를 코드하는 DNA 가 제조되면, 그것들을 함유하는 발현 벡터 및 그 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주를 통상적인 방법에 따라 얻을 수 있고, 또한 그 숙주를 사용함으로써, 통상적인 방법에 따라 scFv 를 얻을 수 있다. 이들 항체 단편은 상기와 동일하게 하여 유전자를 취득하고 발현시켜, 숙주에 의해 산생시킬 수 있다.

본 발명의 항체는 다량화하여 항원에 대한 친화성을 높인 것이어도 된다. 다량화하는 항체로는, 1 종류의 항체이어도 되고, 동일한 항원의 복수의 에피토프를 인식하는 복수의 항체이어도 된다. 항체를 다량화하는 방법으로는, IgG CH3 도메인과 2 개의 scFv 의 결합, 스트렙토아비딘과의 결합, 헬릭스-턴-헬릭스 모티프의 도입 등을 들 수 있다.

본 발명의 항체는 아미노산 배열이 상이한 복수 종류의 항 DR5 항체의 혼합물인 폴리클로날 항체이어도 된다. 폴리클로날 항체의 일례로는, CDR 이 상이한 복수 종류의 항체의 혼합물을 들 수 있다. 그러한 폴리클로날 항체로는, 상이한 항체를 산생하는 세포의 혼합물을 배양하고, 그 배양물로부터 정제된 항체를 사용할 수 있다 (WO 2004/061104호 참조).

항체의 수식물로서 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 등의 각종 분자와 결합한 항체를 사용할 수도 있다.

본 발명의 항체는 또한 이들 항체와 다른 약제가 컨주게이트를 형성하고 있는 것 (I㎜unoconjugate) 이어도 된다. 이와 같은 항체의 예로는, 그 항체가 방사성 물질이나 약리 작용을 갖는 화합물과 결합하고 있는 것을 들 수 있다 (Nature Biotechnology (2005) 23, p.1137 - 1146).

얻어진 항체는 균일하게까지 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는 통상적인 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 사용하면 된다. 예를 들어 칼럼 크로마토그래피, 필터 여과, 한외 여과, 염석, 투석, 조제용 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동, 등전점 전기 영동 등을 적절히 선택, 조합하면, 항체를 분리, 정제할 수 있으나 (Strategies for Protein Purification and Characterization : A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996) ; Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), 이들에 한정되는 것은 아니다.

크로마토그래피로는, 어피니티 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다.

이들 크로마토그래피는 HPLC 나 FPLC 등의 액체 크로마토그래피를 이용하여 실시할 수 있다.

어피니티 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로는, 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다.

예를 들어 프로테인 A 칼럼을 사용한 칼럼으로서 Hyper D, POROS, Sepharose F.F. (파르마시아) 등을 들 수 있다.

또한 항원을 고정화한 담체를 이용하여, 항원에 대한 결합성을 이용하여 항체를 정제하는 것도 가능하다.

(4) 그 밖의 항 DR5 항체의 구체예

예를 들어, 국제 공개 팜플렛, WO 98/51793, WO 2001/83560, WO 2002/94880, WO 2003/54216, WO 2006/83971, WO 2007/22157 에 DR5 발현 세포에 아포토시스를 유도하는 항 DR5 항체가 기재되어 있다. 또한, Tigatuzumab (CS-1008), Lexatumumab (HGS-ETR2), HGS-TR2J, Drozitumab (APOMAB), Conatumumab (A㎎-655), LBY135 라고 불리는 항 DR5 항체에 대하여, 임상 시험이 계속 중이거나, 혹은 과거에 임상 시험이 실시되었다. 본 출원의 출원일 당시에도 임상 시험이 계속 중인 것은 Tigatuzumab, Lexatumumab, Conatumumab 이다. 본 명세서에 기재된 신규 항 DR5 항체는, 상기의 Tigatuzumab, Lexatumumab, Conatumumab 및 Drozitumab 과 비교한 경우에, 보다 우수한 in vitro 및/또는 in vivo 에 있어서의 항종양 활성을 갖고 있다.

3. 항 DR5 항체를 함유하는 의약

상기 서술한 「2. 항 DR5 항체의 제조」 의 항에 기재된 방법으로 얻어지는 항체는, 생체 내에서의 DR5 의 아포토시스 관련 수용체에 대하여 아고니스트로서 작용하고, 수용체를 통하여 암 세포에 대하여 아포토시스를 유도하고 세포 상해 활성을 나타내는 점에서, 의약으로서, 특히 암에 대한 치료제 및/또는 예방제로서 사용할 수 있다.

in vitro 에 있어서의 항체에 의한 살세포 활성은 아포토시스 관련 수용체를 과잉 발현하고 있는 세포에 있어서의 세포의 증식의 억제 활성으로 측정할 수 있다.

예를 들어, DR5 를 과잉 발현하고 있는 암 세포주를 배양하고, 배양계에 다양한 농도로 항체를 첨가하여, 포커스 형성, 콜로니 형성 및 스페로이드 증식에 대한 억제 활성을 측정할 수 있다.

in vivo 에 있어서의 실험 동물을 이용한 항체의 암에 대한 치료 효과는, 예를 들어, DR5 를 고발현하고 있는 종양 세포주를 이식한 누드 마우스에 항체를 투여하고, 암 세포의 변화를 측정할 수 있다.

암의 종류로는, 폐암, 전립선암, 갑상선암, 위암, 간암, 난소암, 대장암, 유방암, 췌장암, 신장암, 자궁 내막암을 포함하는 자궁암, 멜라노머를 포함하는 흑색종, 섬유 육종, 신경 교아종, 혈구암 (백혈병, 임파종 등) 등을 들 수 있지만, 치료 대상이 되는 암 세포가 DR5 를 발현하고 있는 한 이들에 한정되지 않는다.

또한, DR5 에 대한 항체는 염증성 세포에 대하여 아포토시스를 유도하는 것이 알려져 있다 (J. Clin. Invest. 1996, 98(2), 271 - 278 ; Int. I㎜unol. 1996, 8(10), 1595 - 1602). 따라서, 본 발명의 항체는 자기 면역 질환 또는 염증성 질환의 치료제로서 사용하는 것도 가능하다. 이 자기 면역 또는 염증성 질환으로는, 예로서 전신성 홍반성 낭창, 하시모토병, 관절 류머티즘, 숙주이식편병, 쉐그렌 증후군, 악성 빈혈, 에디슨병, 경피증, 구드파스튜어 증후군, 크론병, 자기 면역 용혈성 빈혈, 생식 불능증, 중증 근무력증, 다발성 경화증, 바세도우병, 혈전 부족 자반병, 인슐린 의존 당뇨병, 알레르기, 천식, 아토피 질환, 동맥 경화증, 심근염, 심근증, 사구체 신염, 재생 불량성 빈혈, 장기 이식 후의 거절 반응을 들 수 있다.

본 발명의 의약 조성물에 있어서 허용되는 제제에 사용하는 물질로는 투여량이나 투여 농도에 있어서, 의약 조성물이 투여되는 자에 대하여 비독성인 것이 바람직하다.

본 발명의 의약 조성물은 pH, 삼투압, 점도, 투명도, 색, 등장성, 무균성, 안정성, 용해율, 서방률, 흡수율, 침투율을 바꾸거나, 유지하거나 하기 위한 제제용 물질을 함유할 수 있다. 제제용 물질로서 이하의 것을 들 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다 : 글리신, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신 등의 아미노산류, 항균제, 아스코르브산, 황산나트륨 또는 아황산수소나트륨 등의 항산화제, 인산, 시트르산, 붕산 버퍼, 탄산수소나트륨, 트리스-염산 (Tris-HCl) 용액 등의 완충제, 만니톨이나 글리신 등의 충전제, 에틸렌디아민사아세트산 (EDTA) 등의 킬레이트제, 카페인, 폴리비닐피롤리딘, β-시클로덱스트린이나 하이드록시프로필-β-시클로덱스트린 등의 착화제, 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린 등의 증량제, 단당류, 이당류 등의 다른 탄수화물, 착색제, 향미제, 희석제, 유화제나 폴리비닐피롤리딘 등의 친수 폴리머, 저분자량 폴리펩티드, 염 형성 카운터 이온, 염화벤즈아르코늄, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로렉시딘, 소르브산 또는 과산화수소 등의 방부제, 글리세린, 프로필렌·글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜 등의 용매, 만니톨 또는 소르비톨 등의 당 알코올, 현탁제, 소르비탄에스테르, 폴리소르베이트 20 이나 폴리소르베이트 80 등의 폴리소르베이트, 트리톤 (triton), 트로메타민 (tromethamine), 레시틴 또는 콜레스테롤 등의 계면 활성제, 수크로오스나 소르비톨 등의 안정화 증강제, 염화나트륨, 염화칼륨이나 만니톨·소르비톨 등의 탄성 증강제, 수송제, 부형제 및/또는 약학상의 보조제. 이들 제제용 물질의 첨가량은, 항 DR5 항체의 중량에 대하여 0.01 ∼ 100 배, 특히 0.1 ∼ 10 배 첨가하는 것이 바람직하다. 제제 중의 바람직한 의약 조성물의 조성은 당업자에 의해, 적용 질환, 적용 투여 경로 등에 따라 적절히 결정할 수 있다.

의약 조성물 중의 부형제나 담체는 액체이어도 되고 고체이어도 된다. 적당한 부형제나 담체는 주사용 물이나 생리 식염수, 인공 뇌척수액이나 비경구 투여에 통상적으로 이용되고 있는 다른 물질이어도 된다. 중성의 생리 식염수나 혈청 알부민을 함유하는 생리 식염수를 담체에 사용할 수도 있다. 의약 조성물에는 pH 7.0 - 8.5 의 Tris 버퍼, pH 4.0 - 5.5 의 아세트산 버퍼, pH 3.0 - 6.2 의 시트르산 버퍼를 포함할 수 있다. 또한, 이들 버퍼에 소르비톨이나 다른 화합물을 함유할 수도 있다.

본 발명의 의약 조성물에는 항 DR5 항체를 함유하는 의약 조성물 그리고, 항 DR5 항체 및 적어도 하나의 암 치료제를 함유하는 의약 조성물을 들 수 있고, 본 발명의 의약 조성물은 선택된 조성과 필요한 순도를 갖는 약제로서, 동결 건조품 혹은 액체로서 준비된다. 항 DR5 항체를 함유하는 의약 조성물 그리고, 항 DR5 항체 및 적어도 하나의 암 치료약제를 함유하는 의약 조성물은 수크로오스와 같은 적당한 부형제를 사용한 동결 건조품으로서 성형될 수도 있다.

상기의 의약 조성물에 있어서, 항 DR5 항체와 함께 함유되는 암 치료제는 항 DR5 항체와 동시에, 따로따로, 혹은 연속하여 투여되어도 되고, 각각의 투여 간격을 바꾸어 투여해도 된다. 이와 같은 암 치료제로서 abraxane, carboplatin, cisplatin, gemcitabine, irinotecan (CPT-11), paclitaxel, pemetrexed, sorafenib, vinblastin, 5-FU 또는 국제 공개 제WO 2003/038043호 팜플렛에 기재된 약제 등을 들 수 있지만, 항종양 활성을 갖는 약제이면, 상기 약제에 한정되지 않는다.

본 발명의 의약 조성물은 비경구 투여용으로 조제할 수도 있고, 경구에 의한 소화관 흡수용으로 조제할 수도 있다. 제제의 조성 및 농도는 투여 방법에 따라 결정할 수 있고, 본 발명의 의약 조성물에 함유되는, 항 DR5 항체의 DR5 에 대한 친화성, 즉 DR5 에 대한 해리 상수 (KD 값) 에 대하여, 친화성이 높을 (KD 값이 낮을) 수록, 인간에 대한 투여량을 적게 해도 약효를 발휘할 수 있기 때문에, 이 결과에 기초하여 본 발명의 의약 조성물의 인간에 대한 투여량을 결정할 수도 있다. 투여량은 인간형 항 DR5 항체를 인간에 대하여 투여할 때에는, 약 0.1 ∼ 100 ㎎/㎏ 을 1 ∼ 180 일 사이에 1 회 투여하면 된다.

본 발명의 의약 조성물의 형태로는, 링겔을 포함하는 주사제, 좌제, 경비제, 설하제, 경피 흡수제 등을 들 수 있다.

이하, 실시예를 나타내어 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 또한, 하기 실시예에 있어서 유전자 조작에 관한 각 조작은 특별히 명시가 없는 한, 「몰레큘러 클로닝 (Molecular Cloning)」(Sambrook, J., Fritsch, E. F. 및 Maniatis, T. 저, Cold Spring Harbor Laboratory Press 에서 1989 년에 발간) 에 기재된 방법에 의해 실시하거나, 또는 시판되는 시약이나 키트를 사용하는 경우에는 시판품의 지시서에 따라 사용하였다.

실시예 1

마우스 항체 B273 의 제조

1)-1 인간 DR5 단백질 (인간 DR5 세포 외 영역 인간 Fc 융합체) 의 제조

1)-1-1 인간 DR5 세포 외 영역 발현 벡터의 제조

인간 DR5 단백질 (아이소폼 2 : NP_671716) 을 발현시키는 벡터는 CMV 프로모터의 하류에 인간 DR5 세포 외 영역과 인간 IgG1/Fc 영역을 융합시킨 유전자를 배치함으로써 구축하였다.

1)-1-2 인간 DR5 단백질의 제조

293FreeStyle 세포에 대한 발현 벡터의 도입 및 배양 상청의 회수는 인비트로젠사 (현 라이프 테크놀로지스 재팬 주식회사) 에서 실시하였다.

1)-1-3 인간 DR5 단백질의 정제

상기 b) 에서 얻어진 배양 상청을 ProteinA 어피니티 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 배양 상청 5 ℓ 분을 PBS 로 평형화한 「Hitrap ProteinAFF」 (GE 헬스케어 재팬 주식회사 Cat. no. 17-5079-01) 에 어플라이하여, PBS 로 세정하였다. 다음으로 2 M 아르기닌 용액 (pH 4.0) 을 첨가하고, 인간 DR5 단백질이 함유되는 획분을 모았다. 그 획분을 Centrifugal Filter Device (AmiconUltra4, 분획 분자량 10K, 밀리포아사) 에 첨가하고, PBS 에 대한 액 치환 및 농축을 실시하였다. 최종적인 용량을 6 ㎖ 로 하여, 정제 샘플 (rDR5-hFc) 로 하였다. 정제품의 단백 정량은 「Micro BCA Protein Assay Kit」 (PIERCE ＃23235) 를 이용하여 정량하였다. 표준품은 키트에 포함되는 「Albumin Standard」 를 사용하였다.

1)-2 면역

5 ∼ 6 주령의 BALB/cAJcl 마우스 (일본 클레아사) 를 사용하였다. 0 일째에 1)-1-3 에서 조제한 50 ㎍ 의 rDR5-hFc 와 Freund Complete Ajuvant (와코 준야쿠사 제조) 를 혼합 (체적비로 1 : 1) 한 것을 마우스 목덜미 부근에 피하 투여하였다. 14 일째와 28 일째에 50 ㎍ 의 rDR5-hFc 와 Freund Incomplete Ajuvant (와코 준야쿠사 제조) 를 혼합 (체적비로 1 : 1) 한 것을 마우스 등부에 피하 투여하였다. 42 일째에 50 ㎍ 의 rDR5-hFc 를 마우스 복강 내에 투여하고, 45 일째에 마우스 비장을 채취하여 하이브리도마 제조에 사용하였다.

1)-3 하이브리도마의 제조

비장 세포와 마우스 미엘로머 P3X63Ag8U.1 세포를 PEG4000 (면역 생물 연구소사 제조) 을 이용하여 세포 융합하고, ClonaCell-HY Selection Medium D (StemCell Technologies 사 제조 ＃03804) 에 희석하여 배양하였다. 출현한 하이브리도마 콜로니를 회수함으로써 모노클론 하이브리도마를 제조하였다. 회수된 각 하이브리도마 콜로니를 배양하고, 얻어진 하이브리도마 배양 상청을 이용하여 항 DR5 항체 산생 하이브리도마의 스크리닝을 실시하였다.

1)-4 Cell-ELISA 법에 의한 항체 스크리닝

1)-4-1 인간 DR5 변이체 발현 벡터 (pcDNA3.1-DR5M) 의 구축

인간 DR5 단백질 (아이소폼 2 : NP_671716) 을 코드하는 cDNA 를 pcDNA3.1 (＋) 벡터에 클로닝하고, 데스 도메인 내에 있는 334 번째의 아미노산인 L 을 D 로 치환하여 발현하도록 디자인한 데스 도메인 개변 발현 벡터 pcDNA3.1-DR5M 을 구축하였다.

1)-4-2 항원 유전자 발현 세포의 조제

HEK293 세포를 10 ％ FBS 함유 DMEM 배지 중 7.5×10⁵ 세포/㎖ 가 되도록 조제하였다. 그에 대하여, Lipofectamine 2000 (라이프 테크놀로지스 재팬사 제조) 을 이용하여, 데스 도메인 개변 DR5 발현 벡터 pcDNA3.1-DR5M 혹은 컨트롤로서 pcDNA3.1-mock 을 도입하고, 96 웰 하프 에리어 마이크로 플레이트 (코닝사 제조) 에 50 ㎕ 씩 분주하고, 10 ％ FBS 함유 DMEM 배지 중에서 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 얻어진 도입 세포를 접착 상태인 채로, Cell-ELISA 에 사용하였다.

1)-4-3 Cell-ELISA

1)-4-2 에서 조제한 발현 벡터 도입 HEK293 세포의 상청을 제거 후, pcDNA3.1-DR5M 과 pcDNA3.1-mock 도입 HEK293 세포의 각각에 대하여 하이브리도마 배양 상청을 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 웰 중의 세포를 5 ％ FBS 함유 PBS 로 1 회 세정 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 500 배로 희석한 Goat anti-Mouse IgG, Peroxidase Conjugated (Chemicon 사 제조 ＃AP181P) 를 첨가하여, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 웰 중의 세포를 5 ％ FBS 함유 PBS 로 5 회 세정한 후, OPD 발색액 (OPD 용해액 (0.05 M 시트르산삼나트륨, 0.1 M 인산수소이나트륨·12 물 pH 4.5) 에 o-페닐렌디아민이염산염 (와코 준야쿠사 제조), H₂O₂ 를 각각 0.4 ㎎/㎖, 0.6 ％ (v/v) 가 되도록 용해) 을 25 ㎕/웰로 첨가하였다. 가끔 교반하면서 발색 반응을 실시하고, 1 M HCl 을 25 ㎕/웰을 첨가하여 발색 반응을 정지시킨 후, 플레이트 리더 (ARVO : PerkinElmer 사) 로 490 ㎚ 의 흡광도를 측정하였다. 세포막 표면 상에 발현하는 DR5 에 특이적으로 결합하는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선택하기 위해, pcDNA3.1-mock 도입 HEK293 세포 (컨트롤) 와 비교하여, pcDNA3.1-DR5M 발현 벡터 도입 HEK293 세포 쪽에서 보다 높은 흡광도를 나타내는 배양 상청을 산생하는 하이브리도마를 항 DR5 항체 산생 양성으로서 선택하였다.

1)-5 플로우 사이토메트리법에 의한 항체 스크리닝

1)-5-1 항원 유전자 발현 세포의 조제

293T 세포를 5×10⁴ 세포/㎠ 가 되도록 225 제곱 cm 플라스크 (스미토모 베이크라이트사 제조) 에 파종하고, 10 ％ FBS 함유 DMEM 배지 중에서 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, pcDNA3.1-DR5M 과 컨트롤로서 pcDNA3.1-mock 을 각각 293T 세포에 Lipofectamine 2000 을 이용하여 도입하고, 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 조건하에서 추가로 하룻밤 배양하였다. 다음날, 발현 벡터 도입 293T 세포를 TrypLE Express (라이프 테크놀로지스 재팬사 제조) 로 처리하고, 10 ％ FBS 함유 DMEM 으로 세포를 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 에 현탁하였다. 얻어진 세포 현탁액을 플로우 사이토메트리 해석에 사용하였다.

1)-5-2 플로우 사이토메트리 해석

1)-5-1 에서 조제한 293T 세포 현탁액을 원심하고, 상청을 제거한 후, pcDNA3.1-DR5M 도입 293T 세포와 pcDNA3.1-mock 도입 293T 세포의 각각에 대하여 하이브리도마 배양 상청을 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 1000 배로 희석한 Fluorescein-conjugated goat IgG fraction to mouse IgG (Whole Molecule) (Cappel 사 제조 ＃55493) 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 3 회 세정한 후, 2 ㎍/㎖ 7-aminoactinomycin D (Invitrogen (Molecular Probes) 사 제조) 를 함유하는 5 ％ FBS 함유 PBS 에 재현탁하여, 플로우 사이토 미터 (FC500 : BeckmanCoulter 사) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 Flowjo (TreeStar 사) 로 실시하였다. 7-aminoactinomycin D 양성의 사(死)세포를 게이트에서 제외한 후, 생세포의 FITC 형광 강도의 히스토그램을 작성하였다. 컨트롤인 pcDNA3.1-mock 도입 293T 세포의 형광 강도 히스토그램에 대하여 pcDNA3.1-DR5M 도입 293T 세포의 히스토그램이 강 (强) 형광 강도측에 시프트되어 있는 샘플을 산생하는 하이브리도마를 항 DR5 항체 산생 양성으로서 선택하였다.

1)-6 살세포 작용 스크리닝

1)-5 및 1)-6 에서 항 DR5 항체 산생 양성으로서 선택한 하이브리도마 배양 상청을 이용하여, 인간 T 임파종 유래 세포주 Jurkat 에 대한 세포사 유도 작용을 확인하였다. 50 mM Tris-HCL (pH 8.5) 로 50 ㎍/㎖ 로 조제한 AfiniPure Goat anti-mouse IgG Fc specific (Jackson 사 제조 ＃115-005-071) 을 96 웰 하프 에리어 마이크로 플레이트 (코닝사 제조) 에 25 ㎕ 씩 분주하고 4 ℃ 에서 하룻밤 가만히 정지시켰다. 웰 중을 PBS 로 2 회 세정한 후, 하이브리도마 배양 상청을 첨가하여, 4 ℃ 에서 하룻밤 가만히 정지시켰다. 각 웰을 PBS 로 2 회 세정한 후, 10 ％ FBS 함유 RPMI1640 배지 중 4.0×10⁴ 세포/㎖ 가 되도록 조제한 Jurkat 세포를 25 ㎕/웰로 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 조건하에서 20 시간 배양하였다. CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay kit (Promega 사 제조 ＃ G7571) 를 이용하여 생세포 유래의 ATP 량을 정량함으로써 하이브리도마 배양 상청 중에 존재하는 항 DR5 모노클로날 항체의 살세포 작용을 평가하였다. 그 결과, 하이브리도마 배양용 배지 첨가와 비교하여, 8 할 이상의 ATP 량 감소를 나타내는 5 종류의 모노클로날 항체 (B086, B139, B192, B273, B467) 를 산생하는 하이브리도마를 수립하였다.

1)-7 모노클로날 항체의 아이소 타입 결정

모노클로날 항체의 아이소 타입은 Mouse monoclonal isotyping kit (Serotec 사 제조) 에 의해 결정되었다. 그 결과, B086, B139, B192, B273, B467 의 아이소 타입은 IgG1, κ 사슬인 것이 확인되었다.

1)-8 모노클로날 항체의 조제

모노클로날 항체는 하이브리도마 이식 마우스의 복수 (이하 「항체 정제 원료」 라고 한다) 로부터 정제하였다.

마우스 복수는 이하와 같이 조제하였다. 먼저, 7 - 8 주령의 BALB/cAJcl-nu/nu (니혼 에스엘씨) 를 프리스탄 (Sigma 사 제조) 처리하고, 약 3 주일 후에 생리 식염수로 세정한 하이브리도마를 마우스 1 마리당 1×10⁷ 세포로 복강 내에 이식하였다. 1 - 2 주일 후에 복강 내에 저류된 복수를 채취하여 0.22 ㎛ 의 필터를 통하여 멸균하고 항체 정제 원료로서 사용하였다.

항체는 Hitrap MabSelect SuRe (GE Healthcare Bio-Sciences 사 제조) 로 정제되었다. 즉 항체 정제 원료를 칼럼에 첨가하고 PBS 로 세정 후, 2 M Arginine-HCl pH 4.0 으로 용출하였다. 용출된 항체 용액은 중화 후, PBS 로 버퍼 치환되었다. 항체의 농도는 POROS G 20 ㎛ Column PEEK, 4.6 ㎜×50 ㎜, 0.83 ㎖ (Applied Biosystems) 에 결합시킨 항체를 용출하고, 용출액의 흡광도 (O.D. 280 ㎚) 를 측정함으로써 구하였다. 구체적으로는, 평형화 버퍼 (30.6 mM 인산 2 수소나트륨·12 물, 19.5 mM 인산 1 칼륨, 0.15 M NaCl, pH 7.0) 로 평형화한 POROS G 20 ㎛ 에 PBS 로 희석한 항체 샘플을 첨가하고, 평형화 버퍼로 칼럼을 세정 후, 칼럼에 결합한 항체를 용리액 (0.1 ％ (v/v) HCl, 0.15 M NaCl) 으로 용출하였다. 용출액의 흡광도 (O.D. 280 ㎚) 의 피크 면적을 측정하고, 다음 식으로 농도를 산출하였다. 항체 샘플 농도 (㎎/㎖) = (항체 샘플의 피크 면적)/(표준품 (인간 IgG1) 의 피크 면적)×표준품의 농도 (㎎/㎖)×샘플의 희석 배율. 또한, 얻어진 항체에 함유되는 엔도톡신 농도를 리물루스 ES-II 싱글 테스트 와코 (와코 준야쿠 공업 295-51030 컨트롤 스탠다드 엔도톡신을 포함한다) 와 톡시노미터 (와코 준야쿠 공업 ET-301, 또는 ET-5000) 를 이용하여 측정하여, 1 EU/㎎ 이하인 것을 확인하고 이하의 실험에 사용하였다.

1)-9 마우스 항체 B273 의 인간 암 세포주에 대한 in vitro 살세포 활성

인간 T 임파종 유래 세포주 Jurkat 또는 인간 신경 교아종 세포주 U-87MG 를 각각 10 ％ FBS 함유 RPMI1640 배지 또는 10 ％ FBS 함유 MEM (Minimum Essential Medium) 배지에서 4.4×10⁴ 세포/㎖ 가 되도록 조제하고, 백색 투명 바닥 96 웰 마이크로 플레이트 (코닝사 제조) 에 45 ㎕/웰로 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 마우스 B273 항체 또는 마우스 IgG1 항체 (R＆D 사 제조) 를 AfiniPure Goat anti-mouse IgG Fc specific (Jackson 사 제조 ＃115-005-071) 과 등농도로 혼합 후, 마우스 B273 항체 또는 마우스 IgG1 항체의 최종농도가 10,000 ∼ 0.01 ng/㎖ 가 되도록 5 ㎕/웰로 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 조건하에서 24 시간 배양하였다. 각 웰 중의 생세포 유래의 ATP 량을 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay kit (Promega 사 제조 ＃G7571) 를 이용하여 첨부한 프로토콜에 따라 루미노미터 (퍼킨엘머사 제조) 로 측정하고, 항체액 대신에 배지를 첨가한 웰의 값을 100 ％ 로 하여 살세포 활성을 평가하였다 (도 1). 각 그래프는 세포 생존률을 평균값±표준 편차 (n = 3) 로 나타내고 있다. 그 결과, 마우스 B273 항체는 양 세포주에 대하여 농도 의존적으로 살세포 작용을 나타내는 것이 분명해졌다.

실시예 2

마우스 항체 B273 유전자의 클로닝과 인간 키메라 항체 유전자의 제조

2)-1 마우스 항체 B273 의 cDNA 의 클로닝과 배열의 결정

2)-1-1 마우스 항체 B273 의 중사슬 및 경사슬의 N 말단 아미노산 배열의 결정

마우스 항체 B273 의 중사슬 및 경사슬의 N 말단 아미노산 배열을 결정하기 위해서, 실시예 1-8 에서 정제한 마우스 항체 B273 을 SDS-PAGE 로 분리하였다. 분리 후의 겔로부터 PVDF 막 (포아 사이즈 0.45 ㎛ ; Invitrogen 사 제조) 에 겔 중의 단백질을 전사하고, 세정 버퍼 (25 mM NaCl, 10 mM 붕산나트륨 버퍼 pH 8.0) 로 세정한 후, 염색액 (50 ％ 메탄올, 20 ％ 아세트산, 0.05 ％ 쿠마시브릴리언트블루) 에 5 분간 담가서 염색하고 나서, 90 ％ 메탄올로 탈색하였다. PVDF 막 상에서 가시화된 중사슬 (이동도가 작은 쪽의 밴드) 및 경사슬 (이동도가 큰 쪽의 밴드) 에 상당하는 밴드 부분을 절취하여, Procise (등록 상표) cLC 프로테인 시퀀서 Model 492cLC (Applied Biosystems) 를 이용하여, 자동 에드먼법 (Edman et al. (1967) Eur. J. Biochem. 1, 80 참조) 에 의해 각각의 N 말단 아미노산 배열의 동정을 시도하였다. 그 결과, 마우스 항체 B273 의 중사슬에 상당하는 밴드의 N 말단의 아미노산 배열은 EVQLQQSGPELVKPG (배열표의 배열 번호 1) 이며, 경사슬에 상당하는 밴드의 N 말단 아미노산 배열은 DVVMTQTPLSLPVSLGDQAS (배열표의 배열 번호 2) 였다.

2)-1-2 마우스 항체 B273 산생 하이브리도마로부터의 mRNA 의 조제

마우스 항체 B273 의 중사슬 및 경사슬을 코드하는 cDNA 를 클로닝하기 위해, 마우스 항체 B273 산생 하이브리도마로부터 Quick Prep mRNA Purification Kit (GE Healthcare 사) 를 이용하여 mRNA 를 조제하였다.

2)-1-3 마우스 항체 B273 의 cDNA 의 클로닝과 배열의 결정

실시예 1-7 에서, 마우스 항체 B273 의 중사슬 및 경사슬의 아이소 타입이 γ1 과 κ 인 것, 상기 2)-1-1 에서 결정한 중사슬 및 경사슬의 N 말단 아미노산 배열 및 카바트 등에 의해 작성된 항체의 아미노산 배열 데이터 베이스 (Kabat, E. A. et al., (1991) in Sequences of Proteins of I㎜unological Interest Vol. I 및 II, U.S. Department of Health and Human Services 참조) 를 참고로 하여, 항체 유전자 번역 영역의 5' 말단측과 종지 코돈을 포함하는 3' 말단 부분에 각각 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 몇 개 합성하고, 2)-1-2 에서 조제한 mRNA 와 TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV) (타카라 바이오사) 를 이용하여 중사슬 및 경사슬을 코드하는 cDNA 를 증폭한 결과, 하기의 프라이머 세트로 항체의 중사슬 및 경사슬을 코드하는 cDNA 를 증폭할 수 있었다.

중사슬용 프라이머 세트

경사슬용 프라이머 세트

PCR 로 증폭된 중사슬 및 경사슬의 cDNA 를 각각 pEF6/V5-His TOPO TA Expression Kit (Invitrogen 사) 를 이용하여 클로닝하고, 클로닝된 중사슬, 경사슬의 각 뉴클레오티드 배열을 유전자 배열 해석 장치 (「ABI PRISM 3700 DNA Analyzer ; Applied Biosystems」 혹은 「Applied Biosystems 3730×1 Analyzer ; Applied Biosystems」) 를 이용하여 결정하였다. 시퀀스의 반응은 GeneAmp 9700 (Applied Biosystems 사) 을 사용하였다.

결정된 마우스 항체 B273 의 중사슬을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 7 에 나타내고, 아미노산 배열을 배열 번호 8 에 나타냈다. 마우스 항체 B273 의 경사슬을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 9 에 나타내고, 아미노산 배열을 배열표의 배열 번호 10 에 나타냈다. 배열 번호 7 및 8 의 배열은 도 28 에, 배열 번호 9 및 10 의 배열은 도 29 에 각각 기재되어 있다.

또한, 중사슬 및 경사슬의 아미노산 배열을, 항체의 아미노산 배열의 데이터 베이스인 KabatMan (PROTEINS : Structure, Function and Genetics, 25 (1996), 130 - 133. 참조) 을 이용하여 비교 검토한 결과, 마우스 항체 B273 의 중사슬에 대해서는, 배열표의 배열 번호 8 의 아미노산 번호 20 내지 141 에 나타내는 아미노산 배열이 가변 영역인 것이 분명해졌다. 또한 마우스 항체 B273 의 경사슬에 대해서는, 배열표의 배열 번호 10 의 아미노산 번호 20 내지 133 에 나타내는 아미노산 배열이 가변 영역인 것이 분명해졌다.

2)-2 키메라 항체 B273 발현 벡터의 제조

2)-2-1 범용 발현 벡터 pEF6KCL 및 pEF1FCCU 의 제조

2)-2-1-1 키메라 및 인간화 경사슬 발현 벡터 pEF6KCL 의 구축

플라스미드 pEF6/V5-HisB (Invitrogen 사) 를 주형으로 하여 하기 프라이머를 이용하여 PCR 을 실시함으로써, BGHpA 의 직후 (Sequence Position 2174) 부터, Sma I (Sequence Position 2958) 까지의 DNA 단편 (f1 origin of replication 및 SV40 promotor and origin 을 포함하는 DNA 프래그먼트, 이하 「프래그먼트 A」 라고 한다) 을 취득하였다.

얻어진 프래그먼트 A 와, 인간 κ 사슬 분비 시그널 및 인간 κ 사슬 정상 영역 및 인간 polyA 부가 시그널을 코드하는 DNA 배열을 포함하는 DNA 프래그먼트 (배열 번호 13 이하, 「프래그먼트 B」 라고 한다) 를 Overlap Extension PCR 에 의해 결합하였다. 얻어진 프래그먼트 A 와 프래그먼트 B 가 결합한 DNA 단편을 제한 효소 KpnI 및 SmaI 로 소화하고, 제한 효소 KpnI 및 SmaI 로 소화한 플라스미드 pEF6/V5-HisB (Invitrogen 사) 와 라이게이션하여, EF1 프로모터의 하류에 시그널 배열, 클로닝 사이트, 인간 κ 사슬 정상 영역, 및 인간 polyA 부가 시그널 배열을 갖는, 키메라 및 인간화 경사슬 발현 벡터 pEF6KCL 를 구축하였다.

2)-2-1-2 pEF1/KCL 의 구축

상기 방법에서 얻어진 pEF6KCL 로부터 제한 효소 KpnI 및 SmaI 로 잘라낸 DNA 단편을, KpnI 및 SmaI 로 소화한 pEF1/myc-HisB (Invitrogen 사) 와 라이게이션하여, 플라스미드 pEF1KCL 을 구축하였다.

2)-2-1-3 키메라 및 인간화 중사슬 발현 벡터 pEF1FCCU 의 구축

인간 IgG1 시그널 배열 및 정상 영역의 아미노산을 코드하는 DNA 배열을 포함하는 DNA 단편 (배열 번호 14) 을 제한 효소 NheI 및 PmeI 로 소화하고, NheI 및 PmeI 로 소화한 플라스미드 pEF1KCL 과 결합하고, EF1 프로모터의 하류에 시그널 배열, 클로닝 사이트, 인간 중사슬 정상 영역, 및 인간 polyA 부가 시그널 배열을 갖는 키메라 및 인간화 중사슬 발현 벡터 pEF1FCCU 를 구축하였다.

2)-2-2 B273 키메라 타입 경사슬 발현 벡터의 구축

마우스 항체 B273 의 경사슬을 코드하는 cDNA 를 템플레이트로 하여, KOD-Plus- (TOYOBO 사) 와 하기의 프라이머 세트로 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 포함하는 부분을 증폭하고, 제한 효소 NdeI 및 BsiWI 로 잘라낸 DNA 단편을, 키메라 및 인간화 항체 경사슬 발현 범용 벡터 (pEF6KCL) 를 제한 효소 NdeI 및 BsiWI 로 절단한 지점에 삽입함으로써, B273 키메라 타입 경사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pEF6KCL/B273L」 이라고 명명하였다. B273 키메라 타입 경사슬의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 15 에 나타내고, 아미노산 배열을 배열 번호 16 에 나타냈다. 배열 번호 15 및 16 의 배열은 도 30 에 기재되어 있다. 또한, 배열표의 배열 번호 16 에 기재된 키메라 타입 경사슬 아미노산 배열의 134 번째의 아미노산 잔기는 경사슬 가변 영역의 카르보키실 말단이며, 배열표의 배열 번호 10 에 기재된 마우스 항체 B273 의 경사슬 아미노산 배열의 133 번째의 알라닌 잔기에 대응하지만, 배열 번호 16 에 기재된 아미노산 배열에 있어서는 이미 인간 항체 경사슬 유래의 트레오닌 잔기로 치환되어 있다.

경사슬용 프라이머 세트

2)-2-3 B273 키메라 타입 중사슬 발현 벡터의 구축

마우스 항체 B273 의 중사슬을 코드하는 cDNA 를 템플레이트로 하여, KOD-Plus- (TOYOBO 사) 와 하기의 프라이머 세트로 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 포함하는 부분을 증폭하고, 제한 효소 BlpI 로 잘리는 DNA 단편을, 키메라 및 인간화 항체 중사슬 발현 범용 벡터 (pEF1FCCU) 를 제한 효소 BlpI 로 절단한 지점에 삽입함으로써, B273 키메라 타입 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 각각 「pEF1FCCU/B273H」 라고 명명하였다. B273 키메라 타입 중사슬의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 19 에 나타내고, 아미노산 배열을 배열 번호 20 에 나타냈다. 배열 번호 19 및 20 의 배열은 도 31 에 기재되어 있다.

중사슬용 프라이머 세트

2)-3 키메라 항체 B273 의 조제

2)-3-1 키메라 항체 B273 의 생산

1.2×10⁹ 개의 대수 증식기의 FreeStyle 293F 세포 (Invitrogen 사) 를 신선한 1.2 ℓ 의 FreeStyle 293 expression medium (Invitrogen 사) 에 파종하고, 37 ℃, 8 ％ CO₂ 인큐베이터 내에서 90 rpm 에서 1 시간 진탕 배양하였다. Polyethyleneimine (Polyscience ＃24765) 3.6 ㎎ 을 Opti-Pro SFM 배지 (Invitrogen 사) 20 ㎖ 에 용해시키고, 다음으로 PureLink HiPure Plasmid 키트 (Invitrogen 사) 를 이용하여 조제한 pEF1FCCU/B273H (0.4 ㎎) 및 pEF6KCL/B273L (0.8 ㎎) 을 20 ㎖ 의 Opti-Pro SFM 배지에 현탁하였다. Polyethyleneimine/Opti-Pro SFM 혼합액 20 ㎖ 에, 발현 벡터/Opti-Pro SFM 혼합액 20 ㎖ 를 첨가하여 조심스럽게 교반하고, 추가로 5 분간 방치한 후에 FreeStyle 293F 세포에 첨가하였다. 37 ℃, 8 ％ CO₂ 인큐베이터에서 7 일간, 90 rpm 에서 진탕 배양하여 얻어진 배양 상청을 Disposable Capsule Filter (Advantec ＃CCS-045-E1H) 로 여과하였다.

pEF1FCCU/B273H 와 pEF6KCL/B273L 의 조합에 의해 취득된 키메라 항체 B273 을 「cB273」 이라고 명명하였다.

2)-3-2 cB273 의 정제

상기 2)-3-1 에서 얻어진 배양 상청을, rProteinA 어피니티 크로마토그래피 (4 - 6 ℃ 하) 와 세라믹하이드록실아파타이트 (실온하) 의 2 단계 공정으로 정제하였다. rProteinA 어피니티 크로마토그래피 정제 후와 세라믹하이드록실아파타이트 정제 후의 버퍼 치환 공정은 실온하에서 실시하였다. 먼저, 배양 상청 1100 - 1200 ㎖ 를 PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe (GE Healthcare Bioscience 사 제조, HiTrap 칼럼 : 용적 1 ㎖×2 연결) 에 어플라이하였다. 배양액이 칼럼에 모두 들어간 후, PBS 15 - 30 ㎖ 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2 M 아르기닌염산염 용액 (pH 4.0) 으로 용출하여, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 탈염 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사 제조, HiTrap Desalting 칼럼 : 용적 5 ㎖×2 연결) 으로 5 mM 인산나트륨/50 mM MES/20 mM NaCl/pH 6.5 의 버퍼로 치환을 실시하였다. 또한 그 치환된 항체 용액을, 5 mM NaPi/50 mM MES/20 mM NaCl/pH 6.5 의 버퍼로 평형화된 세라믹하이드록실아파타이트 칼럼 (니혼 바이오래드, Bio-Scale CHT2-1 Hydroxyapatite Column : 용적 2 ㎖) 에 어플라이하였다. 염화나트륨에 의한 직선적 농도 구배 용출을 실시하고, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 탈염 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사 제조, HiTrap Desalting 칼럼 : 용적 5 ㎖×2 연결) 으로 CBS (10 mM 시트르산 완충액/140 mM 염화나트륨, pH 6.0) 에 대한 액 치환을 실시하였다. 마지막으로 Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 30K, Sartorius 사, 4 ℃ 하) 으로 농축하고, IgG 농도를 1.0 ㎎/㎖ 이상으로 조제하여 정제 샘플로 하였다.

실시예 3

인간 키메라 B273 (cB273) 항체의 활성 측정 (in vitro)

3)-1 cB273 항체의 인간 DR5 세포 외 영역 선택적 결합성의 검토

인간 TRAIL R1 ∼ R4 및 마우스 TRAIL R2 세포 외 영역 단백질 (R＆D Systems 사 제조) 에 대한 cB273 의 결합성을 이하에 나타내는 다이렉트 ELISA 법에 의해 검토하였다. 먼저, TRAIL Rs 의 세포 외 영역 단백질을 PBS 로 1 ㎍/㎖ 에 희석한 용액을, 임뮤노 플레이트 (Nunc 사 제조 ＃442404) 에 50 ㎕/웰로 분주하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 가만히 정지시킴으로써 플레이트에 단백질을 흡착시켰다. 다음날, 웰 중의 액을 제거하고, PBS 로 1 회 세정한 후, 비특이적인 단백질의 흡착을 억제하기 위해서, 3 ％ 소 태아 혈청을 포함하는 PBS 를 200 ㎕/웰로 분주하고, 실온에서 1.5 시간 가만히 정지시켰다. 웰 중의 액을 제거하고, 3 ％ 소 태아 혈청을 포함하는 PBS 로 희석한 cB273 또는 가용성 인간 TRAIL (ALEXIS 사 제조 ＃ALX-522-003) 을 50 ㎕/웰로 첨가하였다. 실온에서 1.5 시간 가만히 정지시킨 후, PBS 를 첨가하고 나서 웰 중의 액을 제거하고, PBS 로 2 회 웰을 세정하였다. cB273 항체 첨가 웰에는 3 ％ 소 태아 혈청을 포함하는 PBS 로 2500 배로 희석한 Goat anti-Human IgG, F(ab')₂ fragment specific, Peroxidase Conjugated (Jackson 사 제조 ＃109-035-097) 를 50 ㎕/웰, 가용성 TRAIL 첨가 웰에는 2000 배로 희석한 Anti-FLAG M2 monoclonal antibody-Peroxidase conjugate 를 50 ㎕/웰로 첨가하고, 실온에서 1 시간 가만히 정지시켰다. PBS 를 첨가하고 나서 웰 중의 액을 제거하고, PBS 로 2 회 웰을 세정한 후, OPD 발색액을 100 ㎕/웰로 첨가하여 발색시키고, 1 M HCl 을 100 ㎕/웰로 첨가하여 발색 반응을 멈추고, 플레이트 리더로 492 ㎚ 의 흡광도를 측정하였다. 도 2A) 는 cB273, 도 2B) 는 가용성 TRAIL 의 결과를 나타내고, 그래프는 평균값±표준 편차 (n = 3) 로 나타냈다. 그 결과, cB273 은 인간 TRAIL R2 세포 외 영역에 선택적으로 결합하는 것이 나타났다.

3)-2 cB273 항체의 Biacore 에 의한 결합 활성 평가

3)-2-1 인간 DR5 세포 외 영역 단백질의 조제

3)-2-1-1 DR5 세포 외 영역 단백질 발현 벡터의 제조

배열표의 배열 번호 23 에 나타내는 인간 DR5 의 아미노산 번호 1-130 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 영역 (이하 「sDR5」 라고 적는다) 을 발현하는 벡터를 구축하기 위해서, sDR5 증폭용 프라이머 세트 :

의 프라이머 세트를 이용하여 인간 DR5 세포 외 영역을 코드하는 cDNA 를 주형으로 하여 PCR 반응을 실시하였다. 얻어진 PCR 산물을 NdeI 및 XhoI 로 절단하고, pET21b(＋) (Novagen 사 제조) 의 NdeI/XhoI 사이트에 클로닝하였다 (이하 「pET21b(＋)-sDR5」 라고 약기한다. 또한, 이하 및 도면 중에서 「pET21b(＋)-sDR5」 에 의해 발현하는 재조합 단백질을 rsDR5 라고 적는다 (배열표의 배열 번호 26)).

3)-2-1-2 DR5 세포 외 영역 단백질 (rsDR5) 의 제조

발현 플라스미드 pET21b(＋)-sDR5 로 대장균 OrigamiB (DE3) (Novagen 사 제조) 를 형질 전환하고, 100 ㎍/㎖ 의 암피실린 (Sigma 사 제조), 15 ㎍/㎖ 의 카나마이신 (Wako 사 제조) 을 첨가한 2-YT 배지에서 배양을 실시하고, 0.5 mM IPTG 첨가로 DR5 부분 단백질의 발현 유도를 실시하였다. 6000 rpm, 20 분간 원심하여 집균하고, 결합 버퍼 (50 mM Tris HCl pH 7.5, 300 mM NaCl) 로 현탁한 후, 빙상에서 초음파 파쇄를 실시하였다. 25000 rpm, 20 분간 원심하여, 상청을 회수하고, Ni-NTA (Invitrogen 사 제조) 에 공여하였다. 결합 버퍼로 세정한 후에, 용출 버퍼 (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 300 mM Imidazole) 로 용출하였다. 용출 샘플은, 투석 버퍼 (50 mM Tris HCl pH 8.0, 20 mM NaCl) 로 투석한 후, MONO Q 에 공여하고, 용출 버퍼 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M NaCl) 로 그래디언트 용출시켰다. 용출 샘플은 PBS 를 용매로 한 겔 여과 칼럼 크로마토그래피 (Superdex 75 16/60 : GE Healthcare Bio-Sciences 사 제조) 로 추가로 정제하였다. 얻어진 재조합 단백질의 농도는 UV280 (몰 흡광도 상수 ; 14855) 으로 측정하였다.

3)-2-2 Biacore 에 의한 결합 활성 측정

cB273 항체와 rsDR5 의 해리 상수 측정은 Biacore 3000 (GE 헬스케어 바이오 사이언스 (주)) 를 사용하고, 고정화된 항인간 IgG(Fc) 항체에 항체를 포착 (캡쳐) 하고, 항원을 애널라이트로 하여 측정하는 캡쳐법에 의해 실시하였다. 항인간 IgG(Fc) 항체 (Human antibody capture kit, GE 헬스케어 바이오 사이언스 (주)) 는 센서 칩 CM5 (BIAcore, Inc.) 에 아민 커플링법으로 약 8,000 RU 공유 결합시켰다. 레퍼런스 셀에도 동일하게 고정화하였다. 런닝 버퍼로서 HBS-EP (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05 ％ Surfactant P20) 를 사용하였다. 항인간 IgG(Fc) 항체를 고정화한 칩 상에, 50 nM 의 cB273 항체 용액을 유속 10 ㎕/분으로 60 초간 첨가한 후, rsDR5 의 희석 계열 용액 (0.63 - 20 nM) 을 유속 30 ㎕/분으로 60 초간 첨가하고, 계속해서 300 초간의 해리상을 모니터하였다. 재생 용액으로서 3 M 염화마그네슘을 유속 10 ㎕/분으로 30 초간 첨가하였다. 데이터의 해석에는, 분석 소프트웨어 (BIAevaluation software, version 3.1) 의 1 대 1 결합 모델을 이용하여, 결합 속도 상수 kon, 해리 속도 상수 koff 및 해리 상수 (KD ; KD = koff/kon) 를 산출하였다. cB273 항체의 Biacore 측정 결과를 도 3 에 나타낸다.

3)-3 cB273 항체의 인간 암 세포주에 대한 in vitro 살세포 작용

cB273 항체의 다양한 암 세포주에 대한 살세포 작용을 이하의 방법으로 검토하였다. A2780, SK-OV-3, SK-CO-1, Caov-3, NIH : OVCAR-5 (이상, 인간 난소암주), HCT-15, COLO205, HT29, SW480, SW620, DLD-1, COLO201, WiDr (이상, 인간 대장암주), NCI-H1975, NCI-H292, NCI-H460, NCI-H358 (이상, 인간 폐암주), MDA-MB-231, ZR-75-1 (이상, 인간 유방암주) 을 American Type Culture Collection : ATCC 로부터 구입하였다. 이들 세포주를 10 ％ 소 태아 혈청 (하이클론사 제조) 을 포함하는 배지 (이하 배지) 에서 1×10⁵ cells/㎖ 로 조제하여 백색 투명 바닥 96 웰 마이크로 플레이트 (코닝사 제조) 에 50 ㎕/웰씩 파종하였다. cB273 항체를 1 ㎍/㎖ 의 2 차 항체 용액 (Goat anti-human IgG Fc : MP Biomedicals, LLC. 사 제조) 으로 20000 ng/㎖ 로 조제 후, 배지를 이용하여 2000, 200, 20, 2 ng/㎖ 의 용액을 조제하고, 50 ㎕ 씩 첨가하였다 (항체 최종 농도 10000, 1000, 100, 10, 1 ng/㎖). 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 조건하에서 플레이트를 72 시간 배양 후, 각 웰 중의 생세포 유래의 ATP 량을 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay kit (Promega 사 제조 ＃G7571) 를 이용하여 첨부한 프로토콜에 따라 루미노미터 (베르톨드사 제조) 로 측정하였다. 배지와 세포 현탁액을 첨가한 웰을 음성 컨트롤 웰로 하고, 배지만을 첨가한 웰을 백그라운드 웰로 하여, 피험 웰의 세포 생존률을 산출하였다. 도 4 에 cB273 항체 처리에 의한 유래 암종별 세포 생존률의 평균값±표준 오차 (n = 3) 를 나타냈다. cB273 항체는 SK-CO-1 을 제외한 세포주에 대하여 살세포 활성을 나타냈다.

다양한 암 세포주에 대한 in vitro 살세포 작용에 대하여, BxPC-3, MIA PaCa-2 (이상, 인간 췌장암주), A2058, A375 (이상, 인간 멜라노머주), U-87MG (인간 신경 교아종 세포주), AN3CA (인간 자궁 내막암주) 를 대상으로 검토하였다. 각 세포주를 10 ％ FBS 함유 배지에서 4.4×10⁴ 세포/㎖ 가 되도록 조제하고, 백색 투명 바닥 96 웰 마이크로 플레이트 (코닝사 제조) 에 45 ㎕/웰로 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. cB273 항체를 Goat anti-human IgG Fc (MP Biomedicals, LLC. 사 제조) 와 등농도로 혼합 후, cB273 항체의 최종농도가 10,000 ∼ 1 ng/㎖ 가 되도록 5 ㎕/웰로 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 조건하에서 24 시간 배양하였다. 각 웰 중의 생세포 유래의 ATP 량을 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay kit (Promega 사 제조 ＃G7571) 를 이용하여 첨부한 프로토콜에 따라 루미노미터 (퍼킨엘머사 제조) 로 측정하였다. 각 그래프는 세포 생존률을 평균값±표준 편차 (n = 3) 로 나타내고 있다. 그 결과, cB273 항체는 조사한 모든 암 세포주에 대하여 살세포 작용을 나타냈다 (도 5).

실시예 4

cB273 항체의 에피토프의 동정

4)-1 cB273 Fab 프래그먼트의 제조

cB273 은 PBS에 투석한 후, PBS 로 2 ㎎/㎖ 에 희석하여, 17 ㎖ 조제하였다. PBS 로 0.1 mM 로 조제한, Cysteine (Sigma 사 제조) 을 1.7 ㎖ 와 PBS 로 0.1 ㎎/㎖ 에 희석한 papain (Sigma 사 제조) 를 2.04 ㎖ 첨가하고, 37 ℃, 5 시간 반응시켰다. 5 시간 후, PBS 로 120 mM 로 용해시킨 N-ethylmaleimide (토쿄 화성 제조) 를 6.33 ㎖ 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응액은 50 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl 로 평형화시킨 Superdex200 26/60 (GE 헬스케어사 제조) 에 첨가하고, Fab 프래그먼트에 상당하는 프랙션 14 ㎖ 를 회수하였다.

4)-2 cB273 Fab 프래그먼트, rsDR5 복합체 시료의 조제

cB273 Fab 프래그먼트를 AmiconUltra15 MWCO 10K (밀리포아사 제조) 로 9.46 ㎎/㎖ 로 농축하고, AmiconUltra15 MWCO 3K 로 5.6 ㎎/㎖ 로 농축한 rsDR5 를 2 ㎖ 씩 혼합하고, 20 mM Tris HCl, 50 mM NaCl 로 평형화한 Superdex200 16/60 에 첨가하였다.

복합체에 상당하는 프랙션 8 ㎖ 를 회수하였다.

4)-3 cB273 Fab 프래그먼트와 rsDR5 복합체의 결정화와 구조 해석

얻어진 rsDR5 와 cB273 Fab 의 복합체를 25 ㎎/㎖ 로 농축하고, 결정화에 사용하였다. 결정화에는 증기 확산법을 사용하였다. 단백질 용액 0.45 ∼ 1.0 ㎕ 에 침전제 용액 (6 ∼ 8 ％ (w/v) polyethylene glycol 4000, 20 ％ (v/v) isopropanol, 0.1 M lithium chloride, 0.1 M citrate buffer (pH 5.6)) 을 등량 첨가한 용액을, 0.45 ㎖ 의 침전제 용액을 넣은 밀폐 용기에 양 용액이 접촉하지 않도록 담고, 22 ℃ 에서 가만히 정지시켰다. 3 일 후에 0.4 ㎜×0.3 ㎜×0.03 ㎜ 의 판상정이 얻어졌다.

얻어진 결정을 30 ％ (v/v) glycerol 을 첨가한 침전제 용액에 담그고, 계속해서 -180 ℃ 의 질소 기류하에서 동결시켰다. 고에너지 가속기 연구 기구 방사광 과학 연구 시설의 BL17A 로 95K 질소 기류하에서 X 선 회절 데이터를 수집하였다. 얻어진 회절 이미지로부터 소프트웨어 HKL2000 (HKL 사 제조) 를 이용하여 회절 강도를 수치화하고, 결정 구조 인자를 구하였다. 결정은 단사정계이고 공간군은 C2, 결정의 단위 격자는 a = 152.0 Å, b = 75.5 Å, c = 116.3 Å, β = 110.2˚였다.

얻어진 구조 인자와 DR5 (PDB 코드 : 2H9G) 및 Herceptin 의 Fab (PDB 코드 : 1N8Z) 의 삼차원 구조 좌표를 이용하여 분자 치환법을 실시하여, 위상을 결정하였다. 계산에는 소프트웨어 phaser (CCP4 : Collaborative Computational Project No. 4) 를 사용하였다. 결정은 비대칭 단위에 2 복합체를 포함하고 있었다.

소프트웨어 CNX (Accerlys Inc.) 를 이용하여 구조의 정밀화를 실시하고, 소프트웨어 coot 를 이용하여 모델의 수정을 실시하였다. 이 조작을 반복하여 실시하여, 2.1 Å 분해능으로 최종의 R 값 25.0 ％, free R 값 28.7 ％ 를 얻었다. 최종 모델은 2 복합체로 이루어지고, cB273 Fab 의 L 사슬 아미노산 잔기 (2 분자 모두) 1-218, H 사슬 아미노산 잔기 (2 분자 모두) 1-222, DR5 의 2 분자 중 1 분자는 아미노산 잔기 18 - 92 및 98 - 127 다른 1 분자는 아미노산 잔기 21 - 92 및 98 - 127, 및 324 개의 물 분자를 포함한다. DR5 의 아미노산 잔기 93 - 97, N 말의 17 혹은 20 잔기, C 말의 6 잔기와 His 태그, 및 cB273 Fab L 사슬의 C 말 1 잔기, H 사슬의 C 말 5 잔기는 각각 전자 밀도가 명료하지 않았기 때문에 모델 구축하고 있지 않다. 라마찬드란·플롯으로 확인한 결과, 허용되지 않는 영역에 있는 아미노산은 L 사슬의 Val56 뿐이며, 이 Val56 은 CDR 의 L2 에서 특징적으로 볼 수 있는 구조를 취하고 있다.

결정된 DR5 와 cB273 Fab 의 상호 작용은 비대칭 단위 중의 2 분자에서 거의 동등하였다. cB273 Fab 로부터 4 Å 이내에 있는 DR5 의 아미노산 잔기 (각 아미노산 잔기의 위치는 배열 번호 23 에 대응하고 있다) 는 이하와 같다 : Gly26, Ile34, Glu36, Asp37, Gly38, Asp56, Leu57, Leu58, Phe59, Leu61, Arg62. 도 6 에 복합체 전체의 리본 모델과 표면을, 또한 도 7 에 DR5 와 cB273 Fab 의 H 사슬, L 사슬의 상호 작용을 각각 나타냈다.

실시예 5

cB273 항체의 인간화 (그 1)

5)-1 B273 의 인간화 버전 (hB273) 의 설계

5)-1-1 B273 의 가변 영역의 분자 모델링

B273 의 가변 영역의 분자 모델링은 상동성 모델링으로서 일반적으로 공지된 방법 (Methods in Enzymology, 203, 121 - 153, (1991)) 에 의해 실행되었다. ProteinDataBank (Nuc. Acid Res. 28, 235 - 242 (2000)) 에 등록된 인간 면역 글로블린의 가변 영역의 1 차 배열 (X 선 결정 구조로부터 유도되는 삼차원 구조가 입수 가능하다) 을, 위에서 결정된 B273 의 가변 영역과 비교하였다. 결과적으로, 1T66 이 B273 의 경사슬의 가변 영역에 대하여 가장 높은 배열 상동성을 갖는 것으로서 선택되었다. 또한, 1XIW 가 B273 의 중사슬의 가변 영역에 대하여 가장 높은 배열 상동성을 갖는 것으로서 선택되었다. 프레임 워크 영역의 삼차원 구조는, B273 의 경사슬 및 중사슬에 대응하는 1T66 및 1 XIW 의 좌표를 조합하여, 「프레임 워크 모델」 을 얻음으로써 제조되었다. B273 의 CDR 은 Thornton et al. (J. Mol. Biol., 263, 800 - 815, (1996)) 의 분류에 따라, CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1 및 CDRH2 는 각각 클러스터 16A, 7A, 9A, 10A, 10A 에 할당되었다. CDRH3 은, H3 룰 (FEBSletter 399, 1 - 8 (1996)) 을 사용하여, k(11)- 로 분류되었다. 이어서, 각각의 CDR 에 대한 대표적인 컨포메이션이 프레임 워크 모델에 장착되었다.

마지막으로, 에너지의 관점에서 B273 의 가변 영역의 가능성이 있는 분자 모델을 얻기 위해서, 불리한 원자간 접촉을 제거하기 위한 에너지 계산을 실시하였다. 상기 순서를, 시판되는 단백질 입체 구조 예측 프로그램 Prime 및 배좌 탐색 프로그램 MacroModel (Schrodinger, LLC) 을 사용하여 실시하였다.

5)-1-2 인간화 B273 에 대한 아미노산 배열의 설계

인간화 B273 항체의 구축을, CDR 그래프팅 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029 - 10033 (1989)) 으로서 일반적으로 공지된 방법에 의해 실시하였다. 억셉터 항체는 프레임 워크 영역 내의 아미노산 상동성에 기초하여 선택되었다.

B273 의 프레임 워크 영역의 배열을, 항체의 아미노산 배열의 Kabat 데이터 베이스 (Nuc. Acid Res. 29, 205 - 206 (2001)) 의 모든 인간 프레임 워크와 비교하고, 결과로서, HuMc3 항체가 프레임 워크 영역에 대한 76 ％ 의 배열 상동성에서 기인하여, 억셉터로서 선택되었다. HuMc3 에 대한 프레임 워크 영역의 아미노산 잔기를, B273 에 대한 아미노산 잔기와 정렬시키고, 상이한 아미노산이 사용되는 위치를 동정하였다. 이들 잔기의 위치는 위에서 구축된 B273 의 삼차원 모델을 사용하여 분석되고, 그리고 억셉터 상에 그래프팅되어야 할 도너 잔기가 Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029 - 10033 (1989)) 에 의해 부여되는 기준에 의해 선택되었다. 선택된 몇 개의 도너 잔기를 억셉터 항체에 이입함으로써, 인간화 B273 배열을 이하의 실시예에 기재되는 바와 같이 구축하였다.

5)-1-2 B273 경사슬의 인간화

5)-1-2-1 hB273_L1 타입 경사슬 :

배열표의 배열 번호 16 에 나타내는 cB273 경사슬의 아미노산 번호 22 (발린), 27 (트레오닌), 34 (세린), 35 (류신), 37 (아스파르트산), 38 (글루타민), 70 (리신), 108 (류신), 110 (이소류신), 112 (페닐알라닌), 125 (글리신), 129 (류신) 를 각각 이소류신, 세린, 트레오닌, 프롤린, 글루탐산, 프롤린, 글루타민, 발린, 발린, 티로신, 프롤린, 발린으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 B273 경사슬을 「hB273_L1 타입 경사슬」 이라고 명명하였다.

hB273_L1 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 27 에 기재되어 있다. 또한, hB273_L1 타입 경사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 28 에 기재되어 있다. 나아가 배열 번호 27 및 28 의 배열은 도 32 에도 기재되어 있다.

5)-1-2-2 hB273_L2 타입 경사슬 :

배열표의 배열 번호 16 에 나타내는 cB273 경사슬의 아미노산 번호 37 (아스파르트산), 38 (글루타민), 108 (류신), 110 (이소류신), 125 (글리신), 129 (류신) 를 각각 글루탐산, 프롤린, 발린, 발린, 프롤린, 발린으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 B273 경사슬을 「hB273_L2 타입 경사슬」 이라고 명명하였다.

hB273_L2 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 29 에 기재되어 있다. 또한, hB273_L2 타입 경사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 30 에 기재되어 있다. 나아가 배열 번호 29 및 30 의 배열은 도 33 에도 기재되어 있다.

5)-1-2-3 hB273_L3 타입 경사슬 :

배열표의 배열 번호 16 에 나타내는 cB273 경사슬의 아미노산 번호 37 (아스파르트산), 38 (글루타민), 108 (류신), 110 (이소류신), 129 (류신) 를 각각 글루탐산, 프롤린, 발린, 발린, 발린으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 B273 경사슬을 「hB273_L3 타입 경사슬」 이라고 명명하였다.

hB273_L3 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 31 에 기재되어 있다. 또한, hB273_L3 타입 경사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 32 에 기재되어 있다. 나아가 배열 번호 31 및 32 의 배열은 도 34 에도 기재되어 있다.

5)-1-3 B273 중사슬의 인간화

5)-1-3-1 hB273_H1 타입 중사슬 :

배열표의 배열 번호 20 에 나타내는 cB273 중사슬의 아미노산 번호 20 (글루탐산), 24 (글루타민), 28 (프롤린), 30 (류신), 31 (발린), 39 (이소류신), 56 (메티오닌), 57 (리신), 59 (세린), 60 (히스티딘), 62 (리신), 63 (세린), 67 (이소류신), 86 (리신), 87 (알라닌), 95 (세린), 96 (트레오닌), 99 (히스티딘), 103 (류신), 106 (트레오닌), 110 (세린), 114 (페닐알라닌), 116 (글리신), 136 (트레오닌), 137 (류신) 을 각각 글루타민, 발린, 알라닌, 발린, 리신, 발린, 발린, 아르기닌, 알라닌, 프롤린, 메티오닌, 글리신, 메티오닌, 아르기닌, 발린, 트레오닌, 세린, 티로신, 세린, 아르기닌, 트레오닌, 티로신, 알라닌, 류신, 발린으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 B273 중사슬을 「hB273_H1 타입 중사슬」 이라고 명명하였다.

hB273_H1 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 33 에 기재되어 있다. 또한, hB273_H1 타입 중사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 34 에 기재되어 있다. 나아가 배열 번호 33 및 34 의 배열은 도 35 에도 기재되어 있다.

5)-1-3-2 hB273_H2 타입 중사슬 :

배열표의 배열 번호 20 에 나타내는 cB273 중사슬의 아미노산 번호 20 (글루탐산), 24 (글루타민), 28 (프롤린), 30 (류신), 31 (발린), 39 (이소류신), 60 (히스티딘), 62 (리신), 95 (세린), 96 (트레오닌), 99 (히스티딘), 103 (류신), 106 (트레오닌), 110 (세린), 116 (글리신), 136 (트레오닌), 137 (류신) 을 각각 글루타민, 발린, 알라닌, 발린, 리신, 발린, 프롤린, 메티오닌, 트레오닌, 세린, 티로신, 세린, 아르기닌, 트레오닌, 알라닌, 류신, 발린으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 B273 중사슬을 「hB273_H2 타입 중사슬」 이라고 명명하였다.

hB273_H2 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 35 에 기재되어 있다. 또한, hB273_H2 타입 중사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 36 에 기재되어 있다. 나아가 배열 번호 35 및 36 의 배열은 도 36 에도 기재되어 있다.

5)-1-3-3 hB273_H3 타입 중사슬 :

배열표의 배열 번호 20 에 나타내는 cB273 중사슬의 아미노산 번호 24 (글루타민), 28 (프롤린), 30 (류신), 31 (발린), 39 (이소류신), 60 (히스티딘), 95 (세린), 96 (트레오닌), 103 (류신), 106 (트레오닌), 110 (세린), 136 (트레오닌), 137 (류신) 을 각각 발린, 알라닌, 발린, 리신, 발린, 프롤린, 트레오닌, 세린, 세린, 아르기닌, 트레오닌, 류신, 발린으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 B273 중사슬을 「hB273_H3 타입 중사슬」 이라고 명명하였다.

hB273_H3 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 37 에 기재되어 있다. 또한, hB273_H3 타입 중사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 38 에 기재되어 있다. 나아가 배열 번호 37 및 38 의 배열은 도 37 에도 기재되어 있다.

5)-2 hB273_L1, hB273_L2, 및 hB273_L3 타입 경사슬 발현 벡터의 구축

배열 번호 28 의 아미노산 번호 21 내지 134, 배열 번호 30 의 아미노산 번호 21 내지 134, 및 배열 번호 32 의 아미노산 번호 21 내지 134 에 각각 나타내는, hB273_L1, hB273_L2, 및 hB273_L3 타입 경사슬 가변 영역을 코드하는 유전자를 포함하는 DNA 를 합성하고 (GENEART 사, 인공 유전자 합성 서비스), 제한 효소 NdeI 및 BsiWI 로 잘리는 DNA 단편을, 인간화 항체 경사슬 발현 범용 벡터 (pEF6KCL) 를 제한 효소 NdeI 및 BsiWI 로 절단한 지점에 삽입함으로써, hB273_L1, hB273_L2, 및 hB273_L3 타입 경사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 각각 「pEF6KCL/hB273_L1」, 「pEF6KCL/hB273_L2」, 및 「pEF6KCL/hB273_L3」 이라고 명명하였다.

5)-3 hB273_H1, hB273_H2, 및 hB273_H3 타입 중사슬 발현 벡터의 구축

배열표의 배열 번호 34 의 아미노산 번호 20 내지 141, 배열 번호 36 의 아미노산 번호 20 내지 141, 및 배열 번호 38 의 아미노산 번호 20 내지 141 에 각각 나타내는, hB273_H1, hB273_H2, 및 hB273_H3 타입 중사슬 가변 영역을 코드하는 유전자를 포함하는 DNA 를 합성하고 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스), 제한 효소 BlpI 로 잘리는 DNA 단편을, 인간화 항체 중사슬 발현 범용 벡터 (pEF1FCCU) 를 제한 효소 BlpI 로 절단한 지점에 삽입함으로써, hB273_H1, hB273_H2, 및 hB273_H3 타입 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 각각 「pEF1FCCU/hB273_H1」, 「pEF1FCCU/hB273_H2」, 및 「pEF1FCCU/hB273_H3」 이라고 명명하였다.

5)-4 인간화 항체의 조제

5)-4-1 인간화 항체의 생산

1.2×10⁹ 개의 대수 증식기의 FreeStyle 293F 세포 (Invitrogen 사) 를 신선한 1.2 ℓ 의 FreeStyle293 expression medium (Invitrogen 사) 에 파종하고, 37 ℃, 8 ％ CO₂ 인큐베이터 내에서 90 rpm 에서 1 시간 진탕 배양하였다. Polyethyleneimine (Polyscience ＃24765) 3.6 ㎎ 을 Opti-Pro SFM 배지 (Invitrogen 사) 20 ㎖ 에 용해시키고, 다음으로 PureLink HiPure Plasmid 키트 (Invitrogen 사) 를 이용하여 조제한 H 사슬 발현 벡터 (0.4 ㎎) 및 L 사슬 발현 벡터 (0.8 ㎎) 를 20 ㎖ 의 Opti-Pro SFM 배지에 현탁하였다. Polyethyleneimine/Opti-Pro SFM 혼합액 20 ㎖ 에, 발현 벡터/Opti-Pro SFM 혼합액 20 ㎖ 를 첨가하여 조심스럽게 교반하고, 추가로 5 분간 방치한 후에 FreeStyle 293F 세포에 첨가하였다. 3 시간 후에 Z-VAD-FMK (PEPTIDE INSTITUTE 사) 를 10 μM 이 되도록 첨가하고, 37 ℃, 8 ％ CO₂ 인큐베이터에서 7 일간, 90 rpm 에서 진탕 배양하여 얻어진 배양 상청을 Disposable Capsule Filter (Advantec ＃CCS-045-E1H) 로 여과하였다.

pEF1FCCU/hB273_H1 과 pEF6KCL/hB273_L1 의 조합에 의해 취득된 cB273 의 인간화 항체를 「hB273_H1/hB273_L1」, pEF1FCCU/hB273_H1 과 pEF6KCL/hB273_L2 의 조합에 의해 취득된 cB273 의 인간화 항체를 「hB273_H1/hB273_L2」, pEF1FCCU/hB273_H1 과 pEF6KCL/hB273_L3 의 조합에 의해 취득된 cB273 의 인간화 항체를 「hB273_H1/hB273_L3」, pEF1FCCU/hB273_H2 와 pEF6KCL/hB273_L1 의 조합에 의해 취득된 cB273 의 인간화 항체를 「hB273_H2/hB273_L1」, pEF1FCCU/hB273_H2 와 pEF6KCL/hB273_L2 의 조합에 의해 취득된 cB273 의 인간화 항체를 「hB273_H2/hB273_L2」, pEF1FCCU/hB273_H2 와 pEF6KCL/hB273_L3 의 조합에 의해 취득된 cB273 의 인간화 항체를 「hB273_H2/hB273_L3」, pEF1FCCU/hB273_H3 과 pEF6KCL/hB273_L1 의 조합에 의해 취득된 cB273 의 인간화 항체를 「hB273_H3/hB273_L1」, pEF1FCCU/hB273_H3 과 pEF6KCL/hB273_L2 의 조합에 의해 취득된 cB273 의 인간화 항체를 「hB273_H3/hB273_L2」, pEF1FCCU/hB273_H3 과 pEF6KCL/hB273_L3 의 조합에 의해 취득된 cB273 의 인간화 항체를 「hB273_H3/hB273_L3」 이라고 명명하였다.

5)-4-2 인간화 항체의 정제

상기 5)-4-1) 에서 얻어진 배양 상청을, rProteinA 어피니티 크로마토그래피 (4 - 6 ℃ 하) 와 세라믹하이드록실아파타이트 (실온하) 의 2 단계 공정으로 정제하였다. rProteinA 어피니티 크로마토그래피 정제 후와 세라믹하이드록실아파타이트 정제 후의 버퍼 치환 공정은 실온하에서 실시하였다. 먼저, 배양 상청 1100 - 1200 ㎖ 를, PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe (GE Healthcare Bioscience 사 제조, HiTrap 칼럼 : 용적 1 ㎖×2 연결) 에 어플라이하였다. 배양액이 칼럼에 모두 들어간 후, PBS 15 - 30 ㎖ 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2 M 아르기닌염산염 용액 (pH 4.0) 으로 용출하고, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 탈염 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사 제조, HiTrap Desalting 칼럼 : 용적 5 ㎖×2 연결) 으로 5 mM 인산나트륨/50 mM MES/20 mM NaCl/pH 6.5 의 버퍼로 치환을 실시하였다. 또한 그 치환한 항체 용액을, 5 mM NaPi/50 mM MES/20 mM NaCl/pH 6.5 의 버퍼로 평형화된 세라믹하이드록실아파타이트 칼럼 (니혼 바이오래드, Bio-Scale CHT2-1 Hydroxyapatite Column : 용적 2 ㎖) 에 어플라이하였다. 염화나트륨에 의한 직선적 농도 구배 용출을 실시하고, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 탈염 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사 제조, HiTrap Desalting 칼럼 : 용적 5 ㎖×2 연결) 으로 CBS (10 mM 시트르산 완충액/140 mM 염화나트륨, pH 6.0) 에 대한 액 치환을 실시하였다. 마지막에 Centrifugal UF Filter Device VIVA SPIN20 (분획 분자량 30K, Sartorius 사, 4 ℃ 하) 으로 농축하고, IgG 농도를 1.0 ㎎/㎖ 이상으로 조제하여 정제 샘플로 하였다.

실시예 6

인간화 B273 (hB273) 항체의 활성 측정 (그 1)

6)-1 hB273 항체의 Biacore 에 의한 결합 활성 평가

인간화 항 DR5 항체와 rsDR5 의 해리 상수 측정은, Biacore T100 (GE 헬스케어 바이오 사이언스 (주)) 을 사용하고, 고정화된 항인간 IgG(Fc) 항체에 항체를 포착 (캡쳐) 하고, 항원을 애널라이트로 하여 측정하는 캡쳐법에 의해 실시하였다. 항인간 IgG(Fc) 항체 (Human antibody capture kit, GE 헬스케어 바이오 사이언스 (주)) 는 센서 칩 CM5 (BIAcore, Inc.) 에 아민 커플링법으로 ∼ 10,000 RU 공유 결합시켰다. 레퍼런스 셀에도 동일하게 고정화하였다. 런닝 버퍼로서 HBS-EP (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05 ％ Surfactant P20) 를 사용하였다. 항인간 IgG(Fc) 항체를 고정화한 칩 상에, 약 20 nM 의 항체 용액을 유속 10 ㎕/분으로 60 초간 첨가한 후, rsDR5 의 희석 계열 용액 (3.13 - 50 nM) 을 유속 30 ㎕/분으로 120 초간 첨가하고, 계속해서 180 초간의 해리상을 모니터하였다. 재생 용액으로서 3 M 염화마그네슘을 유속 10 ㎕/분으로 30 초간 첨가하였다. 데이터의 해석에는, 분석 소프트웨어 (Biacore T100 Evaluation software, version 2.0.1) 의 1 대 1 결합 모델을 이용하여, 결합 속도 상수 kon, 해리 속도 상수 koff 및 해리 상수 (KD ; KD = koff/kon) 를 산출하였다. 9 종류의 인간화 DR5 항체의 Biacore 측정 결과를 도 8 에 나타낸다.

6)-2 hB273 항체의 인간 암 세포주에 대한 in vitro 살세포 활성

50 mM Tris-HCL (pH 8.5) 로 50 ㎍/㎖ 로 조제한 AfiniPure F(ab')₂ fragment Goat anti-Human IgG Fc fragment specific (Jackson 사 제조 ＃109-006-098) 을 96 웰 마이크로 플레이트 (코닝사 제조) 에 45 ㎕ 씩 분주하고 4 ℃ 에서 하룻밤 가만히 정지시켰다. 웰 내를 PBS 로 2 회 세정한 후, 5)-4-1 에서 항체를 생산시킨 293F 배양 상청, 정제한 cB273 항체 (실시예 2-3-2), 또는 시판되는 인간 IgG (Jackson 사 제조 ＃009-000-003) 를 150 ∼ 1.5 ng/㎖ 가 되도록 50 ㎕/웰로 첨가하여, 4 ℃ 에서 하룻밤 가만히 정지시켰다. 각 웰을 PBS 로 2 회 세정한 후, 10 ％ FBS 함유 RPMI1640 배지 중 4.0×10⁴ 세포/㎖ 가 되도록 조제한 Jurkat 세포를 50 ㎕/웰로 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 조건하에서 23 시간 배양하였다. CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay kit (Promega 사 제조 ＃G7571) 를 이용하여 생세포 유래의 ATP 량을 정량하고, 항체액 대신에 배지를 첨가한 웰의 값을 100 ％ 로 하여 hB273 항체의 살세포 작용을 평가하였다. 그 결과, 도 9 에 나타내는 바와 같이, B273 중사슬 인간화에 관해서는, H1 시리즈의 항체는 H2 나 H3 보다 살세포 작용이 약간 약한 경향이 관찰되었다. 한편, B273 경사슬 인간화에 관해서는, 디자인한 L1, L2, L3 의 어느 경사슬을 사용한 경우에 있어서도 거의 동일한 정도의 살세포 작용을 나타낼 수 있는 것이 분명해졌다.

실시예 7

cB273 항체의 인간화 (그 2)

7)-1 B273 의 인간화 버전 (hB273) 의 설계

7)-1-1 인간화 B273 에 대한 아미노산 배열의 설계

실시예 5 및 6 에 나타내는 인간화 항체의 설계 (그 1) 의 결과를 기초로, 몇 개의 도너 잔기를 억셉터 항체에 이입함으로써, 인간화 B273 배열을 이하의 실시예에 기재되는 바와 같이 구축하였다.

7)-1-2 인간화 B273 에 대한 아미노산 배열의 설계

7)-1-2-1 hB273_H1-1 타입 중사슬 :

배열표의 배열 번호 20 에 나타내는 cB273 중사슬의 아미노산 번호 20 (글루탐산), 24 (글루타민), 28 (프롤린), 30 (류신), 31 (발린), 39 (이소류신), 57 (리신), 59 (세린), 60 (히스티딘), 62 (리신), 63 (세린), 67 (이소류신), 86 (리신), 87 (알라닌), 95 (세린), 96 (트레오닌), 99 (히스티딘), 103 (류신), 106 (트레오닌), 110 (세린), 136 (트레오닌), 137 (류신) 을 각각 글루타민, 발린, 알라닌, 발린, 리신, 발린, 아르기닌, 알라닌, 프롤린, 메티오닌, 글리신, 메티오닌, 아르기닌, 발린, 트레오닌, 세린, 티로신, 세린, 아르기닌, 트레오닌, 류신, 발린으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 B273 중사슬을 「hB273_H1-1 타입 중사슬」 이라고 명명하였다.

hB273_H1-1 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 39 에 기재되어 있다. 또한, hB273_H1-1 타입 중사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 40 에 기재되어 있다. 나아가 배열 번호 39 및 40 의 배열은 도 38 에도 기재되어 있다.

7)-1-2-2 hB273_H2-1 타입 중사슬 :

배열표의 배열 번호 20 에 나타내는 cB273 중사슬의 아미노산 번호 24 (글루타민), 28 (프롤린), 30 (류신), 31 (발린), 39 (이소류신), 60 (히스티딘), 62 (리신), 95 (세린), 96 (트레오닌), 99 (히스티딘), 103 (류신), 106 (트레오닌), 110 (세린), 116 (글리신), 136 (트레오닌), 137 (류신) 을 각각 발린, 알라닌, 발린, 리신, 발린, 프롤린, 메티오닌, 트레오닌, 세린, 티로신, 세린, 아르기닌, 트레오닌, 알라닌, 류신, 발린으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 B273 중사슬을 「hB273-H2-1 타입 중사슬」 이라고 명명하였다.

hB273_H2-1 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 41 에 기재되어 있다. 또한, hB273_H2-1 타입 중사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 42 에 기재되어 있다. 나아가 배열 번호 41 및 42 의 배열은 도 39 에도 기재되어 있다.

7)-1-2-3 hB273_H2-2 타입 중사슬 :

배열표의 배열 번호 20 에 나타내는 cB273 중사슬의 아미노산 번호 20 (글루탐산), 24 (글루타민), 28 (프롤린), 30 (류신), 31 (발린), 39 (이소류신), 60 (히스티딘), 62 (리신), 95 (세린), 96 (트레오닌), 103 (류신), 106 (트레오닌), 110 (세린), 116 (글리신), 136 (트레오닌), 137 (류신) 을 각각 글루타민, 발린, 알라닌, 발린, 리신, 발린, 프롤린, 메티오닌, 트레오닌, 세린, 세린, 아르기닌, 트레오닌, 알라닌, 류신, 발린으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 B273 중사슬을 「hB273_H2-2 타입 중사슬」 이라고 명명하였다.

hB273_H2-2 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 43 에 기재되어 있다. 또한, hB273_H2-2 타입 중사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 44 에 기재되어 있다. 나아가 배열 번호 43 및 44 의 배열은 도 40 에도 기재되어 있다.

7)-1-2-4 hB273_H2-3 타입 중사슬 :

배열표의 배열 번호 20 에 나타내는 cB273 중사슬의 아미노산 번호 24 (글루타민), 28 (프롤린), 30 (류신), 31 (발린), 39 (이소류신), 60 (히스티딘), 62 (리신), 95 (세린), 96 (트레오닌), 103 (류신), 106 (트레오닌), 110 (세린), 116 (글리신), 136 (트레오닌), 137 (류신) 을 각각 발린, 알라닌, 발린, 리신, 발린, 프롤린, 메티오닌, 트레오닌, 세린, 세린, 아르기닌, 트레오닌, 알라닌, 류신, 발린으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 B273 중사슬을 「hB273_H2-3 타입 중사슬」 이라고 명명하였다.

hB273_H2-3 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 45 에 기재되어 있다. 또한, hB273_H2-3 타입 중사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 46 에 기재되어 있다. 나아가 배열 번호 45 및 46 의 배열은 도 41 에도 기재되어 있다.

7)-1-2-5 hB273_H2-4 타입 중사슬 :

배열표의 배열 번호 20 에 나타내는 cB273 중사슬의 아미노산 번호 20 (글루탐산), 24 (글루타민), 28 (프롤린), 30 (류신), 31 (발린), 39 (이소류신), 60 (히스티딘), 62 (리신), 95 (세린), 96 (트레오닌), 99 (히스티딘), 103 (류신), 106 (트레오닌), 110 (세린), 136 (트레오닌), 137 (류신) 을 각각 글루타민, 발린, 알라닌, 발린, 리신, 발린, 프롤린, 메티오닌, 트레오닌, 세린, 티로신, 세린, 아르기닌, 트레오닌, 류신, 발린으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 B273 중사슬을 「hB273_H2-4 타입 중사슬」 이라고 명명하였다.

hB273_H2-4 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 47 에 기재되어 있다. 또한, hB273_H2-4 타입 중사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 48 에 기재되어 있다. 나아가 배열 번호 47 및 48 의 배열은 도 42 에도 기재되어 있다.

7)-1-2-6 hB273_H2-5 타입 중사슬 :

배열표의 배열 번호 20 에 나타내는 cB273 중사슬의 아미노산 번호 20 (글루탐산), 24 (글루타민), 28 (프롤린), 30 (류신), 31 (발린), 39 (이소류신), 60 (히스티딘), 95 (세린), 96 (트레오닌), 99 (히스티딘), 103 (류신), 106 (트레오닌), 110 (세린), 136 (트레오닌), 137 (류신) 을 각각 글루타민, 발린, 알라닌, 발린, 리신, 발린, 프롤린, 트레오닌, 세린, 티로신, 세린, 아르기닌, 트레오닌, 류신, 발린으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 B273 중사슬을 「hB273_H2-5 타입 중사슬」 이라고 명명하였다.

hB273_H2-5 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 49 에 기재되어 있다. 또한, hB273_H2-5 타입 중사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 50 에 기재되어 있다. 나아가 배열 번호 49 및 50 의 배열은 도 43 에도 기재되어 있다.

7)-2 hB273_H1-1, hB273_H2-1, hB273_H2-2, hB273_H2-3, hB273_H2-4, 및 hB273_H2-5 타입 중사슬 발현 벡터의 구축

배열표의 배열 번호 40 의 아미노산 번호 20 내지 141, 배열 번호 42 의 아미노산 번호 20 내지 141, 배열 번호 44 의 아미노산 번호 20 내지 141, 배열 번호 46 의 아미노산 번호 20 내지 141, 배열 번호 48 의 아미노산 번호 20 내지 141, 및 배열 번호 50 의 아미노산 번호 20 내지 141 에 각각 나타내는, hB273_H1, hB273_H2, 및 hB273_H3 타입 중사슬 가변 영역을 코드하는 유전자를 포함하는 DNA 를 합성하고 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스), 제한 효소 BlpI 로 잘리는 DNA 단편을, 인간화 항체 중사슬 발현 범용 벡터 (pEF1FCCU) 를 제한 효소 BlpI 로 절단한 지점에 삽입함으로써, hB273_H1-1, hB273_H2-1, hB273_H2-2, hB273_H2-3, hB273_H2-4, 및 hB273_H2-5 타입 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 각각 「pEF1FCCU/hB273_H1-1」, 「pEF1FCCU/hB273_H2-1」, 「pEF1FCCU/hB273_H2-2」, 「pEF1FCCU/hB273_H2-3」, 「pEF1FCCU/hB273_H2-4」, 및 「pEF1FCCU/hB273_H2-5」라고 명명하였다.

7)-3 인간화 항체의 조제

7)-3-1 인간화 항체의 생산

pEF1FCCU/hB273_H1-1 과 pEF6KCL/hB273_L1 의 조합에 의해 취득된 cB273 의 인간화 항체를 「hB273_H1-1/hB273_L1」, pEF1FCCU/hB273_H2-1 과 pEF6KCL/hB273_L1 의 조합에 의해 취득된 cB273 의 인간화 항체를 「hB273_H2-1/hB273_L1」, pEF1FCCU/hB273_H2-2 와 pEF6KCL/hB273_L1 의 조합에 의해 취득된 cB273 의 인간화 항체를 「hB273_H2-2/hB273_L1」, pEF1FCCU/hB273_H2-3 과 pEF6KCL/hB273_L1 의 조합에 의해 취득된 cB273 의 인간화 항체를 「hB273_H2-3/hB273_L1」, pEF1FCCU/hB273_H2-4 와 pEF6KCL/hB273_L1 의 조합에 의해 취득된 cB273 의 인간화 항체를 「hB273_H2-4/hB273_L1」, pEF1FCCU/hB273_H2-5 와 pEF6KCL/hB273_L1 의 조합에 의해 취득된 cB273 의 인간화 항체를 「hB273_H2-5/hB273_L1」 이라고 명명하였다.

7)-3-2 인간화 항체의 정제

상기 7)-3-1 에서 얻어진 배양 상청을, rProteinA 어피니티 크로마토그래피 (4 - 6 ℃ 하) 와 세라믹하이드록실아파타이트 (실온하) 의 2 단계 공정으로 정제하였다. rProteinA 어피니티 크로마토그래피 정제 후와 세라믹하이드록실아파타이트 정제 후의 버퍼 치환 공정은 실온하에서 실시하였다. 먼저, 배양 상청 1100 - 1200 ㎖ 를, PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe (GE Healthcare Bioscience 사 제조, HiTrap 칼럼 : 용적 1 ㎖×2 연결) 에 어플라이하였다. 배양액이 칼럼에 모두 들어간 후, PBS 15 - 30 ㎖ 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2 M 아르기닌염산염 용액 (pH 4.0) 으로 용출하여, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 탈염 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사 제조, HiTrap Desalting 칼럼 : 용적 5 ㎖×2 연결) 으로 5 mM 인산나트륨/50 mM MES/20 mM NaCl/pH 6.5 의 버퍼로 치환을 실시하였다. 또한 그 치환한 항체 용액을, 5 mM NaPi/50 mM MES/20 mM NaCl/pH 6.5 의 버퍼로 평형화된 세라믹하이드록실아파타이트 칼럼 (니혼 바이오래드, Bio-Scale CHT2-1 Hydroxyapatite Column : 용적 2 ㎖) 에 어플라이하였다. 염화나트륨에 의한 직선적 농도 구배 용출을 실시하고, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 탈염 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사 제조, HiTrap Desalting 칼럼 : 용적 5 ㎖×2 연결) 으로 CBS (10 mM 시트르산 완충액/140 mM 염화나트륨, pH 6.0) 에 대한 액 치환을 실시하였다. 마지막에 Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 30K, Sartorius 사, 4 ℃ 하) 으로 농축하고, IgG 농도를 1.0 ㎎/㎖ 이상으로 조제하여 정제 샘플로 하였다.

실시예 8

인간화 B273 (hB273) 항체의 활성 측정 (그 2)

8)-1 hB273 항체의 Biacore 에 의한 결합 활성 평가

인간화 항 DR5 항체와 rsDR5 의 해리 상수 측정은 Biacore T100 (GE 헬스케어 바이오 사이언스 (주)) 를 사용하고, 고정화된 항인간 IgG(Fc) 항체에 항체를 포착 (캡쳐) 하고, 항원을 애널라이트로 하여 측정하는 캡쳐법에 의해 실시하였다. 항인간 IgG(Fc) 항체 (Human antibody capture kit, GE 헬스케어 바이오 사이언스 (주)) 는 센서 칩 CM5 (BIAcore, Inc.) 에 아민 커플링법으로 ∼10,000 RU 공유 결합시켰다. 레퍼런스 셀에도 동일하게 고정화하였다. 런닝 버퍼로서 HBS-EP (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05 ％ Surfactant P20) 를 사용하였다. 항인간 IgG(Fc) 항체를 고정화한 칩 상에, 약 20 nM 의 항체 용액을 유속 10 ㎕/분으로 60 초간 첨가한 후, rsDR5 의 희석 계열 용액 (3.13 - 50 nM) 을 유속 30 ㎕/분으로 120 초간 첨가하고, 계속해서 180 초간의 해리상을 모니터하였다. 재생 용액으로서 3 M 염화마그네슘을 유속 10 ㎕/분으로 30 초간 첨가하였다. 데이터의 해석에는, 분석 소프트웨어 (Biacore T100 Evaluation software, version 2.0.1) 의 1 대 1 결합 모델을 이용하여, 결합 속도 상수 kon, 해리 속도 상수 koff 및 해리 상수 (KD ; KD = koff/kon) 를 산출하였다. 6 종류의 인간화 DR5 항체의 Biacore 측정 결과를 도 10 에 나타낸다.

8)-2 hB273 항체의 인간 암 세포주에 대한 in vitro 살세포 활성

50 mM Tris-HCL (pH 8.5) 로 50 ㎍/㎖ 로 조제한 AfiniPure F(ab')₂ fragment Goat anti-Human IgG Fc fragment specific (Jackson 사 제조 ＃109-006-098) 을 96 웰 마이크로 플레이트 (코닝사 제조) 에 45 ㎕ 씩 분주하고 4 ℃ 에서 하룻밤 가만히 정지시켰다. 웰 중을 PBS 로 2 회 세정한 후, 7)-3-1 에서 항체를 생산시킨 293F 배양 상청을 150 ∼ 1.5 ng/㎖ 가 되도록 50 ㎕/웰로 첨가하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 가만히 정지시켰다. 각 웰을 PBS 로 2 회 세정한 후, 10 ％ FBS 함유 RPMI1640 배지 중 4.0×10⁴ 세포/㎖ 가 되도록 조제한 Jurkat 세포를 50 ㎕/웰로 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 조건하에서 23 시간 배양하였다. CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay kit (Promega 사 제조 ＃G7571) 를 이용하여 생세포 유래의 ATP 량을 정량하고, 항체액 대신에 배지를 첨가한 웰의 값을 100 ％ 로 하여 hB273 항체의 살세포 작용을 평가하였다. 그 결과, 도 11 에 나타내는 바와 같이, B273_H1-1/L1 항체는 디자인의 기초가 된 B273_H1/L1 보다 살세포 활성이 강한 경향이 관찰되었다. 한편, B273_H2-1/L1 ∼ B273_H2-5/L1 은 디자인의 기초가 된 B273_H2/L1 과 동일한 정도의 살세포 작용을 나타냈다.

실시예 9

cB273 항체 CDR 로부터의 deamidation site 제거

9)-1 변이체의 설계와 발현 벡터의 구축

9)-1-1 변이체의 설계

일반적으로 단백질의 아스파라긴 탈아미드화는, C 말단측에 인접하는 아미노산과의 사이에서, 고리형 숙신산이미드 천이 상태를 형성하여 진행한다 (Geiger, T. and Clarke, S. (1987) Deamidation, Isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation. J. Biol. Chem. 262, 785 - 794). 고리형 숙신산이미드 천이 상태 형성에 율속이 되는 것은 인접 아미노산의 측사슬의 크기이며, 따라서, 가장 탈아미드화가 빠른 것은 측사슬이 가장 작은 글리신이다. 반대로 C 말단측 인접기를 큰 측사슬을 갖는 아미노산으로 치환함으로써, 탈아미드화 속도를 억제하는 것이 가능하다. B273 항체는 L 사슬 및 H 사슬 양방에 탈아미드화되기 쉬운 -N-G-(아스파라긴-글리신) 배열을 갖고 있다. 그래서, 본 발명자들은, 인접기를, 글리신에서, 보다 큰 측사슬을 갖는, 리신, 페닐알라닌, 류신, 글루탐산으로 변경한 점 변이체를 제조하였다. 즉, H 사슬에 대해서는 -N-G-(아스파라긴-글리신) 배열을 -N-E-(아스파라긴-글루탐산) 배열로 변이시킨 것을 설계하고, L 사슬에 대해서는 -N-G-(아스파라긴-글리신) 배열을 -N-L-(아스파라긴-류신) 배열, -N-F-(아스파라긴-페닐알라닌) 배열, -N-K-(아스파라긴-리신) 배열, -N-E-(아스파라긴-글루탐산) 배열로 각각 변이시킨 것을 설계하였다.

9)-1-2 hB273_L1-NE 타입 경사슬 발현 벡터의 구축

실시예 5 에서 제조된 hB273_L1 타입 경사슬 발현 벡터의 pEF6KCL/hB273_L1 을 템플레이트로 하여, 프라이머 세트 A 를 이용하여 PCR 을 실시함으로써 얻어진 DNA 단편과 프라이머 세트 B 를 이용하여 PCR 을 실시함으로써 얻어진 DNA 단편을 프라이머 세트 C를 이용한 Overlap Extension PCR 에 의해 결합하였다. 얻어진 DNA 단편으로부터 제한 효소 NheI 및 PmeI 로 잘리는 DNA 단편을, 인간화 항체 경사슬 발현 범용 벡터 (pEF6KCL) 를 제한 효소 NheI 및 PmeI 로 절단한 지점에 삽입함으로써, 배열 번호 28 의 아미노산 번호 54 의 글리신을 글루탐산으로 치환한 hB273_L1-NE 타입 경사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pEF6KCL/hB273_L1-NE」 라고 명명하였다.

hB273_L1-NE 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 51 에 기재되어 있다. 또한, hB273_L1-NE 타입 경사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 52 에 기재되어 있다. 나아가 배열 번호 51 및 52 의 배열은 도 44 에도 기재되어 있다.

프라이머 세트 A

프라이머 세트 B

프라이머 세트 C

9)-1-3 hB273_L1-NF 타입 경사슬 발현 벡터의 구축

실시예 5 에서 제조된 hB273_L1 타입 경사슬 발현 벡터의 pEF6KCL/hB273_L1 을 템플레이트로 하여, 프라이머 세트 A 를 이용하여 PCR 을 실시함으로써 얻어진 DNA 단편과 프라이머 세트 B 를 이용하여 PCR 을 실시함으로써 얻어진 DNA 단편을 프라이머 세트 C 를 이용한 Overlap Extension PCR 에 의해 결합하였다. 얻어진 DNA 단편으로부터 제한 효소 NheI 및 PmeI 로 잘리는 DNA 단편을, 인간화 항체 경사슬 발현 범용 벡터 (pEF6KCL) 를 제한 효소 NheI 및 PmeI 로 절단한 지점에 삽입함으로써, 배열 번호 28 의 아미노산 번호 54 의 글리신을 페닐알라닌으로 치환한 hB273_L1-NF 타입 경사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pEF6KCL/hB273_L1-NF」 라고 명명하였다.

hB273_L1-NF 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 57 에 기재되어 있다. 또한, hB273_L1-NF 타입 경사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 58 에 기재되어 있다. 나아가 배열 번호 57 및 58 의 배열은 도 45 에도 기재되어 있다.

프라이머 세트 A

프라이머 세트 B

프라이머 세트 C

9)-1-4 hB273_L1-NK 타입 경사슬 발현 벡터의 구축

실시예 5 에서 제조된 hB273_L1 타입 경사슬 발현 벡터의 pEF6KCL/hB273_L1 을 템플레이트로 하여, 프라이머 세트 A 를 이용하여 PCR 을 실시함으로써 얻어진 DNA 단편과 프라이머 세트 B 를 이용하여 PCR 을 실시함으로써 얻어진 DNA 단편을 프라이머 세트 C 를 이용한 Overlap Extension PCR 에 의해 결합하였다. 얻어진 DNA 단편으로부터 제한 효소 NheI 및 PmeI 로 잘리는 DNA 단편을, 인간화 항체 경사슬 발현 범용 벡터 (pEF6KCL) 를 제한 효소 NheI 및 PmeI 로 절단한 지점에 삽입함으로써, 배열 번호 28 의 아미노산 번호 54 의 글리신을 리신으로 치환한 hB273_L1-NK 타입 경사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pEF6KCL/hB273_L1-NK」 라고 명명하였다.

hB273_L1-NK 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 61 에 기재되어 있다. 또한, hB273_L1-NK 타입 경사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 62 에 기재되어 있다. 나아가 배열 번호 61 및 62 의 배열은 도 46 에도 기재되어 있다.

프라이머 세트 A

프라이머 세트 B

프라이머 세트 C

9)-1-5 hB273_L1-NL 타입 경사슬 발현 벡터의 구축

실시예 5 에서 제조된 hB273_L1 타입 경사슬 발현 벡터의 pEF6KCL/hB273_L1 을 템플레이트로 하여, 프라이머 세트 A 를 이용하여 PCR 을 실시함으로써 얻어진 DNA 단편과 프라이머 세트 B 를 이용하여 PCR 을 실시함으로써 얻어진 DNA 단편을 프라이머 세트 C 를 이용한 Overlap Extension PCR 에 의해 결합하였다. 얻어진 DNA 단편으로부터 제한 효소 NheI 및 PmeI 로 잘리는 DNA 단편을, 인간화 항체 경사슬 발현 범용 벡터 (pEF6KCL) 를 제한 효소 NheI 및 PmeI 로 절단한 지점에 삽입함으로써, 배열 번호 28 의 아미노산 번호 54 의 글리신을 류신으로 치환한 hB273_L1-NL 타입 경사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pEF6KCL/hB273_L1-NL」 이라고 명명하였다.

hB273_L1-NL 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 65 에 기재되어 있다. 또한, hB273_L1-NL 타입 경사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 66 에 기재되어 있다. 나아가 배열 번호 65 및 66 의 배열은 도 47 에도 기재되어 있다.

프라이머 세트 A

프라이머 세트 B

프라이머 세트 C

9)-1-6 hB273_H2-1-NE 타입 중사슬 발현 벡터의 구축

실시예 7 에서 제조된 hB273_H2-1 타입 중사슬 발현 벡터의 pEF1FCCU/hB273_H2-1 을 템플레이트로 하여, 프라이머 세트 A 를 이용하여 PCR 을 실시함으로써 얻어진 DNA 단편과 프라이머 세트 B 를 이용하여 PCR 을 실시함으로써 얻어진 DNA 단편을 프라이머 세트 C 를 이용한 Overlap Extension PCR 에 의해 결합하였다. 얻어진 DNA 단편으로부터 제한 효소 NheI 및 PmeI 로 잘리는 DNA 단편을, 인간화 항체 경사슬 발현 범용 벡터 (pEF1FCCU) 를 제한 효소 NheI 및 PmeI 로 절단한 지점에 삽입함으로써, 배열 번호 42 의 아미노산 번호 75 의 글리신을 글루탐산으로 치환한 hB273_H2-1-NE 타입 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pEF1FCCU/hB273_H2-1-NE」 라고 명명하였다.

hB273_H2-1-NE 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 69 에 기재되어 있다. 또한, hB273_H2-1-NE 타입 중사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 70 에 기재되어 있다. 나아가 배열 번호 69 및 70 의 배열은 도 48 에도 기재되어 있다.

프라이머 세트 A

프라이머 세트 B

프라이머 세트 C

9)-2 hB273 항체 CDR 개변체의 조제

9)-2-1 hB273 항체 CDR 개변체의 생산

pEF1FCCU/hB273_H2-1-NE 와 pEF6KCL/hB273_L1-NE 의 조합에 의해 취득된 cB273 의 인간화 항체를 「hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NE」, pEF1FCCU/hB273_H2-1-NE 와 pEF6KCL/hB273_L1-NF 의 조합에 의해 취득된 cB273 의 인간화 항체를 「hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NF」, pEF1FCCU/hB273_H2-1-NE 와 pEF6KCL/hB273_L1-NK 의 조합에 의해 취득된 cB273 의 인간화 항체를 「hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK」, pEF1FCCU/hB273_H2-1-NE 와 ppEF6KCL/hB273_L1-NL 의 조합에 의해 취득된 cB273 의 인간화 항체를 「hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NL」 이라고 명명하였다.

9)-2-2 hB273 항체 CDR 개변체의 정제

상기 9)-2-1 에서 얻어진 배양 상청을, rProteinA 어피니티 크로마토그래피 (4 - 6 ℃ 하) 와 세라믹하이드록실아파타이트 (실온하) 의 2 단계 공정으로 정제하였다. rProteinA 어피니티 크로마토그래피 정제 후와 세라믹하이드록실아파타이트 정제 후의 버퍼 치환 공정은 실온하에서 실시하였다. 먼저, 배양 상청 1100 - 1200 ㎖ 를, PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe (GE Healthcare Bioscience 사 제조, HiTrap 칼럼 : 용적 1 ㎖×2 연결) 에 어플라이하였다. 배양액이 칼럼에 모두 들어간 후, PBS 15 - 30 ㎖ 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2 M 아르기닌염산염 용액 (pH 4.0) 으로 용출하고, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 탈염 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사 제조, HiTrap Desalting 칼럼 : 용적 5 ㎖×2 연결) 으로 5 mM 인산나트륨/50 mM MES/20 mM NaCl/pH 6.5 의 버퍼로 치환을 실시하였다. 또한 그 치환한 항체 용액을, 5 mM NaPi/50 mM MES/20 mM NaCl/pH 6.5 의 버퍼로 평형화된 세라믹하이드록실아파타이트 칼럼 (니혼 바이오래드, Bio-Scale CHT2-1 Hydroxyapatite Column : 용적 2 ㎖) 에 어플라이하였다. 염화나트륨에 의한 직선적 농도 구배 용출을 실시하고, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 탈염 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사 제조, HiTrap Desalting 칼럼 : 용적 5 ㎖×2 연결) 으로 CBS (10 mM 시트르산 완충액/140 mM 염화나트륨, pH 6.0) 에 대한 액 치환을 실시하였다. 마지막으로 Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 30K, Sartorius 사, 4 ℃ 하) 으로 농축하고, IgG 농도를 1.0 ㎎/㎖ 이상으로 조제하여 정제 샘플로 하였다.

실시예 10

cB273 항체 CDR 개변체의 활성 평가

10)-1 hB273 항체 CDR 개변체의 Biacore 에 의한 결합 활성 평가

인간화 항 DR5 항체와 rsDR5 의 해리 상수 측정은 Biacore T100 (GE 헬스케어 바이오 사이언스 (주)) 을 사용하여, 고정화된 항인간 IgG(Fc) 항체에 항체를 포착 (캡쳐) 하고, 항원을 애널라이트로 하여 측정하는 캡쳐법에 의해 실시하였다. 항인간 IgG(Fc) 항체 (Human antibody capture kit, GE 헬스케어 바이오 사이언스 (주)) 는 센서 칩 CM5 (BIAcore, Inc.) 에 아민 커플링법으로 ∼ 10,000 RU 공유 결합시켰다. 레퍼런스 셀에도 동일하게 고정화하였다. 런닝 버퍼로서 HBS-EP (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05 ％ Surfactant P20) 를 사용하였다. 항인간 IgG(Fc) 항체를 고정화한 칩 상에, 약 20 nM 의 항체 용액을 유속 10 ㎕/분으로 60 초간 첨가한 후, rsDR5 의 희석 계열 용액 (3.13 - 50 nM) 을 유속 30 ㎕/분으로 120 초간 첨가하고, 계속해서 180 초간의 해리상을 모니터하였다. 재생 용액으로서 3 M 염화마그네슘을 유속 10 ㎕/분으로 30 초간 첨가하였다. 데이터의 해석에는, 분석 소프트웨어 (Biacore T100 Evaluation software, version 2.0.1) 의 1 대 1 결합 모델을 이용하여, 결합 속도 상수 kon, 해리 속도 상수 koff 및 해리 상수 (KD ; KD = koff/kon) 를 산출하였다. 4 종류의 인간화 DR5 항체의 Biacore 측정 결과를 도 12 에 나타낸다.

10)-2 시차 주사 칼로리메트리 (DSC) 를 사용한 인간화 항 DR5 항체 및 그 변이 항체의 열 안정성 측정

중시차 주사 칼로리메트리 (DSC) 를 사용한, 열 안정성의 측정을 실시하였다. 샘플은 0.5 ㎎/㎖ 의 농도로 CBS 완충액 (10 mM 시트르산, 140 mM NaCl, pH 6.0 으로 조제) 에 용해시켜, 400 ㎕ 씩 시료 용액으로서 DSC 측정에 사용하였다. DSC 측정 조건은 이하와 같이 설정하였다. 즉, 초기 온도는 20 ℃, 최종 온도를 100 ℃ 로 하고, 승온 속도를 200 ℃／1 시간, 필터 시간 2 초, 피드백 모드를 Low 로 하였다. 참조액은 CBS 를 사용하였다. 모든 DSC 측정 장치로는, 미국 MicroCal 사 (현 GE 헬스케어 바이오 사이언스 (주)) 제조 VP-Capillary DSC Platform 을 사용하였다. 시료 용액에서 얻어진 스캔 곡선으로부터 베이스 라인 (시료 셀에도 참조 용액을 충전하여 얻어진 스캔 곡선) 을 공제하여 베이스 라인 보정을 실시하였다. 서모그램 전체의 피크 탑의 온도값을 Fab 영역의 열 변성 중점 Tm 으로 하였다. 4 종류의 인간화 DR5 항체의 DSC 측정 결과를 도 13 에 나타낸다.

10)-3 hB273 항체 CDR 개변체의 인간 암 세포주에 대한 in vitro 살세포 활성

50 mM Tris-HCL (pH 8.5) 로 50 ㎍/㎖ 로 조제한 AfiniPure F(ab')₂ fragment Goat anti-Human IgG Fc fragment specific (Jackson 사 제조 ＃109-006-098) 을 96 웰 마이크로 플레이트 (코닝사 제조) 에 45 ㎕ 씩 분주하고 4 ℃ 에서 하룻밤 가만히 정지시켰다. 웰 내를 PBS 로 2 회 세정한 후, 9)-2-1 에서 항체를 생산시킨 293F 배양 상청을 150 ∼ 1.5 ng/㎖ 가 되도록 50 ㎕/웰로 첨가하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 가만히 정지시켰다. 각 웰을 PBS 로 2 회 세정한 후, 10 ％ FBS 함유 RPMI1640 배지 중 4.0×10⁴ 세포/㎖ 가 되도록 조제한 Jurkat 세포를 50 ㎕/웰로 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 조건하에서 23 시간 배양하였다. CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay kit (Promega 사 제조 ＃G7571) 를 이용하여 생세포 유래의 ATP 량을 정량하고, 항체액 대신에 배지를 첨가한 웰의 값을 100 ％ 로 하여 hB273 항체의 살세포 작용을 평가하였다. 4 종류의 CDR 개변 항체의 살세포 활성을 도 14 에 나타냈다.

10)-4 hB273_H2-1-NE/L1-NK 항체의 인간 암 세포주에 대한 caspase-3/7 활성화 작용 및 in vitro 살세포 활성

인간 대장암 유래 세포주 HCT-15 또는 인간 신경 교아종 세포주 U-87MG 를 각각 10 ％ FBS 함유 RPMI1640 배지 또는 10 ％ FBS 함유 MEM (Minimum Essential Medium) 배지에서 1.1×10⁵ 세포/㎖ 가 되도록 조제하고, 백색 투명 바닥의 96 웰 마이크로 플레이트 (코닝사 제조) 에 45 ㎕/웰로 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. hB273_H2-1-NE/L1-NK 항체, cB273 항체 또는 인간 IgG (Jackson 사 제조) 를 AfiniPure Goat anti-human IgG Fcγ fragment specific (Jackson 사 제조 ＃109-005-098) 과 등농도로 혼합 후, hB273_H2-1-NE/L1-NK 항체, cB273 항체 또는 인간 IgG 의 최종농도가 10,000 ∼ 0.1 ng/㎖ 가 되도록 5 ㎕/웰로 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 조건하에서 4 시간 배양하였다. 각 웰 중의 Caspase-3/7 활성을 Caspase-Glo 3/7 Assay kit (Promega 사 제조 ＃G8093) 를 이용하여 첨부한 프로토콜에 따라, 실온에서 30 분 인큐베이트와 후에 루미노미터 (퍼킨엘머사 제조) 로 측정하고, 항체액 대신에 배지를 첨가한 웰의 값을 100 ％ 로 하여 caspase-3/7 활성을 평가하였다. 또한, in vitro 살세포 활성은, 실시예 3-3 에 나타내는 방법에 따라, 항체 처리 24 시간 후의 ATP 량을 측정함으로써 평가하였다. 그 결과, hB273_H2-1-NE/L1-NK 항체는 cB273 항체와 동일한 정도의 caspase-3/7 활성화 작용 및 살세포 작용을 갖는 것이 분명해졌다 (도 15).

실시예 11

cB273 항체의 in vivo 항종양 효과

11)-1 cB273 항체의 항종양 활성

11)-1-1 인간 대장암주 COLO 205 이식 누드 마우스에 있어서의 항종양 활성

2×10⁶ cells 의 인간 대장암주 COLO 205 (ATCC 로부터 구입) 를 누드 마우스 (CAnN. Cg-Foxnl^nu/CrlCrlj, 니혼 찰스·리버로부터 구입) 의 액와부 피하에 이식하였다. 이식한 7, 14, 21 일 후에 cB273 항체를 1, 3, 10 ㎎/㎏ 담암 마우스의 꼬리 정맥 내에 투여하였다 (n = 10). 이식 종양의 장경 및 단경을 주 2 회, 전자 디지털 버니어 (주식회사 미츠토요 제조) 를 이용하여 측정하고, 이하에 나타내는 계산식에 의해 종양 체적을 산출하였다.

종양 체적 (㎣) = 1/2×단경² (㎜)×장경² (㎜)

결과를 도 16 에 나타냈다. cB273 항체 투여군은 모든 개체에서 종양의 완전 축퇴가 관찰되었다.

11)-1-2 인간 췌장암주 MIAPaCa-2 이식 누드 마우스에 있어서의 항종양 활성

3×10⁶ cells 의 인간 췌장암주 MIAPaCa-2 (ATCC 로부터 구입) 를 누드 마우스의 액와부 피하에 이식하였다. 이식한 11, 19, 26, 33 일 후에 cB273 항체를 3, 10 ㎎/㎏ 담암 마우스의 꼬리 정맥 내에 투여하였다 (n = 10). 상기와 동일한 방법으로 이식 종양의 장경 및 단경을 측정하여 종양 체적의 산출을 실시하였다.

결과를 도 17 에 나타냈다. 최종 측정일인 이식 39 일 후에 있어서의 종양 증식 억제율은 3 ㎎/㎏ 투여군에서 73.5 ％, 10 ㎎/㎏ 투여군에서 77.4 ％ 였다.

11)-1-3 인간 신경 교아종 세포주 U-87MG 이식 누드 마우스에 있어서의 항종양 활성

5×10⁶ cells 의 인간 신경 교아종 세포주 U-87MG (ATCC 로부터 구입) 를 누드 마우스의 액와부 피하에 이식하였다. 이식한 4, 11, 18, 25 일 후에 cB273 항체를 1, 3, 10 ㎎/㎏ 담암 마우스의 꼬리 정맥 내에 투여하였다 (n = 10). 상기와 동일한 방법으로 이식 종양의 장경 및 단경을 측정하여 종양 체적의 산출을 실시하였다.

결과를 도 18 에 나타냈다. 최종 측정일인 이식 32 일 후에 있어서의 종양 증식 억제율은 1 ㎎/㎏ 투여군에서 99.7 ％, 3 ㎎/㎏ 투여군에서 97.8 ％, 10 ㎎/㎏ 투여군에서 98.0 ％ 이며, 1 ㎎/㎏ 투여군에서 10 마리 중 2 마리, 3 ㎎/㎏ 투여군에서 10 마리 중 5 마리, 10 ㎎/㎏ 투여군에서 10 마리 중 3 마리가 종양의 완전 축퇴를 나타냈다.

11)-1-4 인간 폐암주 NCI-H2122 이식 누드 마우스에 있어서의 항종양 활성 (파클리탁셀＋카르보플라틴 병용)

5×10⁶ cells 의 인간 폐암주 NCI-H2122 (ATCC 로부터 구입) 를 누드 마우스의 액와부 피하에 이식하였다. 이식한 13, 20 일 후에 cB273 항체를 10 ㎎/㎏ 담암 마우스의 꼬리 정맥 내에 투여하였다. 파클리탁셀은 6.25 ㎎/㎏ 이 되도록 이식한 13, 14, 15, 16, 17 일 후에 피하 투여하였다. 카르보플라틴은 100 ㎎/㎏ 이 되도록 이식한 13 일 후에 복강 내 투여하였다. (n = 10). 상기와 동일한 방법으로 이식 종양의 장경 및 단경을 측정하여 종양 체적의 산출을 실시하였다.

결과를 도 19 에 나타냈다. 최종 측정일인 이식 41 일 후에 있어서의 종양 증식 억제율은 cB273 항체 투여군에서 99.6 ％, 파클리탁셀, 카르보플라틴 병용 투여군에서 10.2 ％, cB273 항체, 파클리탁셀, 카르보플라틴 병용 투여군에서 99.7 ％ 였다.

11)-1-5 인간 폐암주 NCI-H460 이식 누드 마우스에 있어서의 항종양 활성 (파클리탁셀＋카르보플라틴 병용)

5×10⁶ cells 의 인간 폐암주 NCI-H460 (ATCC 로부터 구입) 을 누드 마우스의 액와부 피하에 이식하였다. 이식한 6 일 후에 cB273 항체를 10 ㎎/㎏ 담암 마우스의 복강 내에 투여하였다. 파클리탁셀은 6.25 ㎎/㎏ 이 되도록 이식한 6, 7, 8, 9, 10 일 후에 피하 투여하였다. 카르보플라틴은 100 ㎎/㎏ 이 되도록 이식한 6 일 후에 복강 내 투여하였다. (n = 10). 상기와 동일한 방법으로 이식 종양의 장경 및 단경을 측정하여 종양 체적의 산출을 실시하였다.

결과를 도 20 에 나타냈다. 최종 측정일인 이식 16 일 후에 있어서의 종양 증식 억제율은 cB273 항체 투여군에서 43.3 ％, 파클리탁셀, 카르보플라틴 병용 투여군에서 66.4 ％, cB273 항체, 파클리탁셀, 카르보플라틴 병용 투여군에서 79.6 ％ 였다.

11)-1-6 인간 대장암주 DLD-1 이식 누드 마우스에 있어서의 항종양 활성 (CPT-11 병용)

5×10⁶ cells 의 인간 대장암주 DLD-1 (ATCC 로부터 구입) 을 누드 마우스의 액와부 피하에 이식하였다. 이식한 35 일 후에 cB273 항체를 10 ㎎/㎏ 담암 마우스의 복강 내에 투여하였다. CPT-11 은 80 ㎎/㎏ 이 되도록 이식한 35, 40, 43 일 후에 복강 내 투여하였다 (n = 10). 상기와 동일한 방법으로 이식 종양의 장경 및 단경을 측정하여 종양 체적의 산출을 실시하였다.

결과를 도 21 에 나타냈다. 최종 측정일인 이식 55 일 후에 있어서의 종양 증식 억제율은 cB273 항체 투여군에서 25.9 ％, CPT-11 투여군에서 29.5 ％, cB273 항체, CPT-11 병용 투여군에서 72.7 ％ 였다.

11)-1-7 인간 대장암주 HCT-15 이식 누드 마우스에 있어서의 항종양 활성 (CPT-11 병용)

5×10⁶ cells 의 인간 대장암주 HCT-15 (ATCC 로부터 구입) 를 누드 마우스의 액와부 피하에 이식하였다. 이식한 7 일 후에 cB273 항체를 10 ㎎/㎏ 담암 마우스의 꼬리 정맥 내에 투여하였다. CPT-11 은 80 ㎎/㎏ 이 되도록 이식한 7, 10, 14 일 후에 복강 내 투여하였다 (n = 10). 상기와 동일한 방법으로 이식 종양의 장경 및 단경을 측정하여 종양 체적의 산출을 실시하였다.

결과를 도 22 에 나타냈다. 최종 측정일인 이식 31 일 후에 있어서의 종양 증식 억제율은 cB273 항체 투여군에서 52.8 ％, CPT-11 투여군에서 83.5 ％, cB273 항체, CPT-11 병용 투여군에서 97.8 ％ 였다.

11)-1-8 인간 대장암주 HCT-116 이식 누드 마우스에 있어서의 항종양 활성 (CPT-11 병용)

1×10⁷ cells 의 인간 대장암주 HCT-116 (ATCC 로부터 구입) 을 누드 마우스의 액와부 피하에 이식하였다. 이식한 7 일 후에 cB273 항체를 10 ㎎/㎏ 담암 마우스의 꼬리 정맥 내에 투여하였다. CPT-11 은 65 ㎎/㎏ 이 되도록 이식한 7, 10, 14 일 후에 복강 내 투여하였다 (n = 10). 상기와 동일한 방법으로 이식 종양의 장경 및 단경을 측정하여 종양 체적의 산출을 실시하였다.

결과를 도 23 에 나타냈다. 최종 측정일인 이식 28 일 후에 있어서의 종양 증식 억제율은 cB273 항체 투여군에서 13.9 ％, CPT-11 투여군에서 89.8 ％, cB273 항체, CPT-11 병용 투여군에서 99.7 ％ 였다.

11)-1-9 인간 멜라노머주 A375 이식 누드 마우스에 있어서의 항종양 활성 (빈블라스틴 병용)

2×10⁶ cells 의 인간 멜라노머 세포주 A375 (ATCC 로부터 구입) 를 누드 마우스의 액와부 피하에 이식하였다. 이식한 10, 17, 24 일 후에 cB273 항체를 10 ㎎/㎏ 담암 마우스의 꼬리 정맥 내에 투여하였다. 빈블라스틴은 10 ㎎/㎏ 이 되도록 이식한 10 일 후에 꼬리 정맥 투여하였다 (n = 10). 상기와 동일한 방법으로 이식 종양의 장경 및 단경을 측정하여 종양 체적의 산출을 실시하였다.

결과를 도 24 에 나타냈다. 최종 측정일인 이식 46 일 후에 있어서의 종양 증식 억제율은 cB273 항체 투여군에서 53.1 ％, 빈블라스틴 투여군에서 43.6 ％, cB273 항체와 빈블라스틴 병용 투여군에서 100 ％ 이며, cB273 항체와 빈블라스틴 병용 투여군에서 모든 개체가 종양의 완전 축퇴를 나타냈다.

11)-2 cB273 항체와 Conatumumab 의 항종양 활성의 비교

11)-2-1 Conatumumab 의 조제

Conatumumab 은 WHO Drug Information, Vol.22, No.2, 2008, p129 - 130 에 기재되어 있는 경사슬 및 중사슬의 아미노산 배열을 기초로 제조하였다.

11)-2-1-1 Conatumumab 의 경사슬 발현 벡터의 구축

배열 번호 76 의 아미노산 번호 21 내지 130 에 나타내는, Conatumumab 의 경사슬 가변 영역을 코드하는 유전자를 포함하는 DNA 를 합성하고 (GENEART 사, 인공 유전자 합성 서비스), 제한 효소 NdeI 및 BsiWI 로 잘리는 DNA 단편을, 인간화 항체 경사슬 발현 범용 벡터 (pEF6KCL) 를 제한 효소 NdeI 및 BsiWI 로 절단한 지점에 삽입함으로써, Conatumumab 의 경사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pEF6KCL/Conatumumab_L」 이라고 명명하였다.

11)-2-1-2 Conatumumab 의 중사슬 발현 벡터의 구축

배열표의 배열 번호 78 의 아미노산 번호 20 내지 141 에 나타내는, Conatumumab 의 중사슬 가변 영역을 코드하는 유전자를 포함하는 DNA 를 합성하고 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스), 제한 효소 BlpI 로 잘리는 DNA 단편을, 인간화 항체 중사슬 발현 범용 벡터 (pEF1FCCU) 를 제한 효소 BlpI 로 절단한 지점에 삽입함으로써, Conatumumab 의 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pEF1FCCU/Conatumumab_H」 라고 명명하였다.

11)-2-1-3 Conatumumab 의 생산

1.2×10⁹ 개의 대수 증식기의 FreeStyle 293F 세포 (Invitrogen 사) 를 신선한 1.2 ℓ 의 FreeStyle293 expression medium (Invitrogen 사) 에 파종하고, 37 ℃, 8 ％ CO₂ 인큐베이터 내에서 90 rpm 에서 1 시간 진탕 배양하였다. Polyethyleneimine (Polyscience ＃24765) 3.6 ㎎ 을 Opti-Pro SFM 배지 (Invitrogen 사) 20 ㎖ 에 용해시키고, 다음으로 PureLink HiPure Plasmid 키트 (Invitrogen 사) 를 이용하여 조제한 H 사슬 발현 벡터의 pEF1FCCU/Conatumumab_H (0.4 ㎎) 및 L 사슬 발현 벡터의 pEF6KCL/Conatumumab_L (0.8 ㎎) 을 20 ㎖ 의 Opti-Pro SFM 배지에 현탁하였다. Polyethyleneimine/Opti-Pro SFM 혼합액 20 ㎖ 에, 발현 벡터/Opti-Pro SFM 혼합액 20 ㎖ 를 첨가하여 조심스럽게 교반하고, 추가로 5 분간 방치한 후에 FreeStyle 293F 세포에 첨가하였다. 37 ℃, 8 ％ CO₂ 인큐베이터에서 7 일간, 90 rpm 에서 진탕 배양하여 얻어진 배양 상청을 Disposable Capsule Filter (Advantec ＃CCS-045-E1H) 로 여과하였다.

11)-2-1-4 Conatumumab 의 정제

상기 11)-2-1-3 에서 얻어진 배양 상청을, rProteinA 어피니티 크로마토그래피 (4 - 6 ℃ 하) 와 세라믹하이드록실아파타이트 (실온하) 의 2 단계 공정에서 정제하였다. rProteinA 어피니티 크로마토그래피 정제 후와 세라믹하이드록실아파타이트 정제 후의 버퍼 치환 공정은 실온하에서 실시하였다. 먼저, 배양 상청 1100 - 1200 ㎖ 를, PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe (GE Healthcare Bioscience 사 제조, HiTrap 칼럼 : 용적 1 ㎖×2 연결) 에 어플라이하였다. 배양액이 칼럼에 모두 들어간 후, PBS 15 - 30 ㎖ 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2 M 아르기닌염산염 용액 (pH 4.0) 으로 용출하고, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 탈염 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사 제조, HiTrap Desalting 칼럼 : 용적 5 ㎖×2 연결) 으로 5 mM 인산나트륨/50 mM MES/20 mM NaCl/pH 6.5 의 버퍼로 치환을 실시하였다. 또한 그 치환한 항체 용액을, 5 mM NaPi/50 mM MES/20 mM NaCl/pH 6.5 의 버퍼로 평형화된 세라믹하이드록실아파타이트 칼럼 (니혼 바이오래드, Bio-Scale CHT2-1 Hydroxyapatite Column : 용적 2 ㎖) 에 어플라이하였다. 염화나트륨에 의한 직선적 농도 구배 용출을 실시하고, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 탈염 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사 제조, HiTrap Desalting 칼럼 : 용적 5 ㎖×2 연결) 으로 CBS (10 mM 시트르산 완충액/140 mM 염화나트륨, pH 6.0) 에 대한 액 치환을 실시하였다. 마지막으로 Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 30K, Sartorius 사, 4 ℃ 하) 으로 농축하고, IgG 농도를 1.0 ㎎/㎖ 이상으로 조제하여 정제 샘플로 하였다.

11)-2-2 인간 대장암주 HCT-15 이식 누드 마우스에 있어서의 cB273 항체와 Conatumumab 의 항종양 활성의 비교

1×10⁷ cells 의 인간 대장암주 HCT-15 (ATCC 로부터 구입) 를 누드 마우스의 액와부 피하에 이식하였다. 이식한 6, 13, 20 일 후에 cB273 항체 및 Conatumumab 을 3, 10, 30 ㎎/㎏ 담암 마우스의 꼬리 정맥 내에 투여하였다 (n = 10). 상기와 동일한 방법으로 이식 종양의 장경 및 단경을 측정하여 종양 체적의 산출을 실시하였다.

결과를 도 25 에 나타냈다. 최종 측정일인 이식 30 일 후에 있어서의 종양 증식 억제율은 cB273 항체의 3 ㎎/㎏ 투여군에서 57.9 ％, 10 ㎎/㎏ 투여군에서 56.0 ％, 30 ㎎/㎏ 투여군에서 53.6 ％, Conatumumab 의 3 ㎎/㎏ 투여군에서 27.4 ％, 10 ㎎/㎏ 투여군에서 26.9 ％, 30 ㎎/㎏ 투여군에서 20.3 ％ 였다.

11)-2-3 인간 폐암주 NCI-H1975 이식 누드 마우스에 있어서의 cB273 항체와 Conatumumab 의 항종양 활성의 비교

3×10⁶ cells 의 인간 폐암주 NCI-H1975 (ATCC 로부터 구입) 를 누드 마우스의 액와부 피하에 이식하였다. 이식한 12, 19, 26 일 후에 cB273 항체 및 Conatumumab 을 3, 10 ㎎/㎏ 담암 마우스의 꼬리 정맥 내에 투여하였다 (n = 10). 상기와 동일한 방법으로 이식 종양의 장경 및 단경을 측정하여 종양 체적의 산출을 실시하였다.

결과를 도 26 에 나타냈다. 최종 측정일인 이식 32 일 후에 있어서의 종양 증식 억제율은 cB273 항체의 3 ㎎/㎏ 투여군에서 71.5 ％, 10 ㎎/㎏ 투여군에서 73.3 ％, Conatumumab 의 3 ㎎/㎏ 투여군에서 13.5 ％, 10 ㎎/㎏ 투여군에서 12.6 ％ 였다.

실시예 12

hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK 항체의 in vivo 항종양 효과

12)-1 hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK 항체의 인간 대장암주 COLO205 이식 누드 마우스에 있어서의 항종양 활성

2×10⁶ cells 의 인간 대장암주 COLO205 (ATCC 로부터 구입) 를 누드 마우스의 액와부 피하에 이식하였다. 이식한 8, 15, 22 일 후에 hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK 항체 및 cB273 항체를 0.3, 3 ㎎/㎏ 담암 마우스의 꼬리 정맥 내에 투여하였다 (n = 10). 상기와 동일한 방법으로 이식 종양의 장경 및 단경을 측정하여 종양 체적의 산출을 실시하였다.

결과를 도 27 에 나타냈다. hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK 항체의 3 ㎎/㎏ 투여군 및 cB273 항체의 0.3 ㎎/㎏ 투여군은 모든 개체에서 종양의 완전 축퇴가 관찰되었다. hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK 항체 0.3 ㎎/㎏ 투여군의 10 예 중 9 예, 및 cB273 항체 3 ㎎/㎏ 투여군의 10 예 중 8 예에서 종양의 완전 축퇴가 관찰되었다.

실시예 13

hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK 항체의 인간 암 세포주에 대한 in vitro 살세포 활성

NCI-N87, KATOIII, SNU-16 (이상, 인간 위암주), Caki-1, ACHN, 786-O (이상 인간 신장암주), Hep3B, SK-HEP-1, HepG2 (C3A) (이상 인간 간암주), HT-1080 (인간 섬유 육종주) 은 AmericanType Culture Collection : ATCC 로부터 구입하였다. GCIY (인간 위암주) 는 이화학 연구소로부터 구입하였다. HuH-7 (인간 간암주) 은 의약 기반 연구소로부터 구입하였다.

각종 세포주에 대한 in vitro 살세포 활성을 이하의 방법으로 측정하였다. 위암주, 신장암주, 섬유 육종주에 대해서는, 적절히 계대 배양한 세포를 트리판 블루 염색법으로 계수 후, 10 ％ 소 태아 혈청 (하이크론사 제조) 을 포함하는 배지 (이하 배지) 에서 1×10⁵ cells/㎖ 로 조제하였다. 배지에 hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK 항체를 20 ㎍/㎖, 2 차 항체 (염소 항 인간 IgG 항체, 엠피 바이오 메디컬즈사 제조) 를 40 ㎍/㎖ 로 혼합하였다. 또한 배지를 이용하여 희석하고, hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK 항체 농도가 2000, 200, 20, 2 ng/㎖ 가 되는 용액을 조제하였다. 투명 96 웰 마이크로 플레이트 (코닝사 제조) 에 각 농도의 용액을 1 군 3 련으로 50 ㎕ 씩 첨가하고, 세포 현탁액을 50 ㎕ (5×10³ cells) 씩 파종하였다 (hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK 항체 최종 농도 10000, 1000, 100, 10, 1 ng/㎖).

간암주에 대해서는, 적절히 계대 배양한 세포를 트리판 블루 염색법으로 계수 후, 배지에서 4×10⁴ cells/㎖ 로 조제하였다. 배지에 hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK 항체를 2 ㎍/㎖, 2 차 항체를 4 ㎍/㎖ 로 혼합하였다. 또한 배지를 이용하여 200, 20, 2, 0.2, 0.02 ng/㎖ 의 용액을 조제하였다. 흑색 투명 바닥 96 웰 마이크로 플레이트 (코닝사 제조) 에 각 농도의 용액을 1 군 2 련으로 50 ㎕ 씩 첨가하고, 세포 현탁액을 50 ㎕ (2×10³ cells) 씩 파종하였다 (항체 최종 농도 1000, 100, 10, 1, 0.1, 0.01 ng/㎖).

37 ℃, 5 ％ 이산화탄소 존재하에서 플레이트를 72 시간 배양하고, 각 웰의 ATP 량을 측정하였다. ATP 량 측정에는 루시페라아제 발광 시약 (CellTiterGlo, 프로메가사 제조) 을 이용하여 첨부한 프로토콜에 따라 측정을 실시하였다. 즉, 세포 용해 성분과 발광 기질 성분으로 이루어지는 시액을 플레이트의 각 웰에 100 ㎕ 씩 첨가하고, 교반 후, 각 웰의 발광을 루미노미터 (베르톨드사 제조) 로 측정하였다. 위암주, 신장암주, 섬유 육종주에 대해서는, 투명 96 웰 마이크로 플레이트로부터, 백색 96 웰 마이크로 플레이트 (코닝사 제조) 에 100 ㎕ 씩 시액을 옮기고 나서 발광 측정을 실시하였다.

배지와 세포 현탁액을 첨가한 웰을 음성 컨트롤 웰, 배지만을 첨가한 웰을 백그라운드 웰로 하고, 피험 웰의 세포 생존률을 이하의 식에 의해 산출하였다.

세포 생존률 (％) = (피험 웰의 발광 강도 - 백그라운드 웰의 평균 발광 강도)/(음성 컨트롤 웰의 평균 발광 강도 - 백그라운드 웰의 평균 발광 강도)×100

도 51 에 세포주마다의 각 항체 처리 농도에 있어서의 세포 생존률의 평균값을 나타냈다. 위암주, 신장암주, 섬유 육종주에 대해서는 표준 오차를 에러바로 나타냈다. hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK 항체는 786-O 를 제외한 세포주에 대하여 세포 상해 활성을 나타냈다.

실시예 14

hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK 항체와 화학 요법제의 병용에 의한 in vivo 활성 측정

14)-1 hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK 항체와 5-FU 의 병용에 의한 인간 대장암주 HCT-15 이식 누드 마우스에 있어서의 항종양 활성, 및 Conatumumab 과의 활성 비교

1×10⁷ cells 의 인간 대장암주 HCT-15 (ATCC 로부터 구입) 를 누드 마우스 (CAnN.Cg-Foxnl^nu/CrlCrlj, 니혼 찰스·리버로부터 구입) 의 액와부 피하에 이식하였다. 이식한 7, 14, 21 일 후에 hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK 항체 또는 Conatumumab 을 3 ㎎/㎏ 담암 마우스의 꼬리 정맥 내에 투여하였다. 5-FU 는 이식 7 일 후에 160 ㎎/㎏ 꼬리 정맥 내 투여하였다. 실험은 n = 6 으로 실시하였다. 이식 종양의 장경 및 단경을 주 2 회, 전자 디지털 버니어 (주식회사 미츠토요 제조) 를 이용하여 측정하고, 이하에 나타내는 계산식에 의해 종양 체적을 산출하였다.

종양 체적 (㎣) = 1/2×단경² (㎜)×장경² (㎜)

결과를 도 52 에 나타냈다. 최종 측정일인 이식 28 일 후에 있어서의 종양 증식 억제율은 hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK 항체 투여군에서 62 ％, Conatumumab 투여군에서 27 ％, 5-FU 투여군에서 54 ％, hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK 항체와 5-FU 병용군에서 91 ％, Conatumumab 과 5-FU 병용군에서 78 ％ 였다. 즉, hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK 항체와 5-FU 의 병용 효과가 관찰되고, 또한 hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK 항체와 5-FU 병용군은 Conatumumab 과 5-FU 병용군 보다 강한 항종양 활성을 나타냈다.

14)-2 hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK 항체와 파클리탁셀의 병용에 의한 인간 비소세포 폐암주 NCI-H1975 이식 누드 마우스에 있어서의 항종양 활성, 및 Conatumumab 과의 활성 비교

3×10⁶ cells 의 인간 비소세포 폐암주 NCI-H1975 (ATCC 로부터 구입) 를 누드 마우스의 액와부 피하에 이식하였다. 이식한 11, 18, 25 일 후에 hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK 항체 또는 Conatumumab 을 3 ㎎/㎏ 담암 마우스의 꼬리 정맥 내에 투여하였다. 파클리탁셀은 이식 11, 12, 13, 14 일 후에 6.25 ㎎/㎏ 담암 마우스의 꼬리 정맥 내에 투여하였다. 실험은 n = 6 으로 실시하였다. 상기와 동일한 방법으로 이식 종양의 장경 및 단경을 측정하고, 종양 체적의 산출을 실시하였다.

결과를 도 53 에 나타냈다. 최종 측정일인 이식 32 일 후에 있어서의 종양 증식 억제율은 hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK 항체 투여군에서 66 ％, Conatumumab 투여군에서 40 ％, 파클리탁셀 투여군에서 49 ％, hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK 항체와 파클리탁셀 병용군에서 91 ％, Conatumumab 과 파클리탁셀 병용군에서 79 ％ 였다. 즉, hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK 항체와 파클리탁셀의 병용 효과가 관찰되고, 또한 hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK 항체와 파클리탁셀 병용군은 Conatumumab 과 파클리탁셀 병용군 보다 강한 항종양 활성을 나타냈다.

<110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> A new anti-DR5 antibody <130> DSPCT-FP1141 <150> JP 2010-243549 <151> 2010-10-29 <160> 89 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser 20 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer MH258E1F1 <400> 3 aagaattcat gggatggagc tgtatc 26 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer G1EVR1 <400> 4 aagatatctt atttaccagg agagtgggag ag 32 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer MK19EIF1 <400> 5 aagaattcat gaagttgcct gttagg 26 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer KEVR1 <400> 6 aagatatctt aacactcatt cctgttgaag ct 32 <210> 7 <211> 1395 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(1395) <400> 7 atg gga tgg agc tgt atc ttt ctc ttt ctc ctg tca gta act gta ggt 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Val Gly 1 5 10 15 gtg ttc tct gag gtt cag ctg cag cag tct gga cct gag ctg gtg aag 96 Val Phe Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 cct ggg gct tca gtg aag ata tcc tgc aag gct tct ggt tac tca ttt 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 att ggc tac ttt atg aac tgg atg aag cag agc cat gga aag agc ctt 192 Ile Gly Tyr Phe Met Asn Trp Met Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60 gag tgg att gga cgt ttt aat cca tac aat ggt gat act ttc tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Arg Phe Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttc aag ggc aag gcc aca ttg act gta gac aaa tcc tct acc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr 85 90 95 aca gcc cac atg gag ctc ctg agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc 336 Thr Ala His Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 tat ttt tgt gga aga tcg gcg tat tac ttc gat agt ggg ggc tac ttt 384 Tyr Phe Cys Gly Arg Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 gac tac tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tca gcc aaa acg 432 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr 130 135 140 aca ccc cca tct gtc tat cca ctg gcc cct gga tct gct gcc caa act 480 Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr 145 150 155 160 aac tcc atg gtg acc ctg gga tgc ctg gtc aag ggc tat ttc cct gag 528 Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 cca gtg aca gtg acc tgg aac tct gga tcc ctg tcc agc ggt gtg cac 576 Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His 180 185 190 acc ttc cca gct gtc ctg cag tct gac ctc tac act ctg agc agc tca 624 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser 195 200 205 gtg act gtc ccc tcc agc acc tgg ccc agc gag acc gtc acc tgc aac 672 Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn 210 215 220 gtt gcc cac ccg gcc agc agc acc aag gtg gac aag aaa att gtg ccc 720 Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro 225 230 235 240 agg gat tgt ggt tgt aag cct tgc ata tgt aca gtc cca gaa gta tca 768 Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser 245 250 255 tct gtc ttc atc ttc ccc cca aag ccc aag gat gtg ctc acc att act 816 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr 260 265 270 ctg act cct aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac atc agc aag gat gat 864 Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp 275 280 285 ccc gag gtc cag ttc agc tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca 912 Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr 290 295 300 gct cag acg caa ccc cgg gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca 960 Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser 305 310 315 320 gtc agt gaa ctt ccc atc atg cac cag gac tgg ctc aat ggc aag gag 1008 Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 325 330 335 ttc aaa tgc agg gtc aac agt gca gct ttc cct gcc ccc atc gag aaa 1056 Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys 340 345 350 acc atc tcc aaa acc aaa ggc aga ccg aag gct cca cag gtg tac acc 1104 Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr 355 360 365 att cca cct ccc aag gag cag atg gcc aag gat aaa gtc agt ctg acc 1152 Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr 370 375 380 tgc atg ata aca gac ttc ttc cct gaa gac att act gtg gag tgg cag 1200 Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln 385 390 395 400 tgg aat ggg cag cca gcg gag aac tac aag aac act cag ccc atc atg 1248 Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met 405 410 415 gac aca gat ggc tct tac ttc gtc tac agc aag ctc aat gtg cag aag 1296 Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys 420 425 430 agc aac tgg gag gca gga aat act ttc acc tgc tct gtg tta cat gag 1344 Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu 435 440 445 ggc ctg cac aac cac cat act gag aag agc ctc tcc cac tct cct ggt 1392 Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly 450 455 460 aaa 1395 Lys 465 <210> 8 <211> 465 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Met Gly Trp Ser Cys Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Val Gly 1 5 10 15 Val Phe Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Ile Gly Tyr Phe Met Asn Trp Met Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Arg Phe Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr 85 90 95 Thr Ala His Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Gly Arg Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr 130 135 140 Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr 145 150 155 160 Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser 195 200 205 Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn 210 215 220 Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro 225 230 235 240 Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser 245 250 255 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr 260 265 270 Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp 275 280 285 Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr 290 295 300 Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser 305 310 315 320 Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 325 330 335 Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys 340 345 350 Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr 355 360 365 Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr 370 375 380 Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln 385 390 395 400 Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met 405 410 415 Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys 420 425 430 Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu 435 440 445 Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly 450 455 460 Lys 465 <210> 9 <211> 714 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(714) <400> 9 atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct 48 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 tcc agc agt gat gtt gtg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc 96 Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc ctt 144 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 gta cac agt aat gga aac acc tat cta cat tgg tac ctg cag aag cca 192 Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct 240 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca 288 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga att tat ttc tgc 336 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Phe Cys 100 105 110 tct caa agt aca cat gtt ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg 384 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 gaa atc aaa cgg gct gat gct gca cca act gta tcc atc ttc cca cca 432 Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro 130 135 140 tcc agt gag cag tta aca tct gga ggt gcc tca gtc gtg tgc ttc ttg 480 Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu 145 150 155 160 aac aac ttc tac ccc aaa gac atc aat gtc aag tgg aag att gat ggc 528 Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly 165 170 175 agt gaa cga caa aat ggc gtc ctg aac agt tgg act gat cag gac agc 576 Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser 180 185 190 aaa gac agc acc tac agc atg agc agc acc ctc acg ttg acc aag gac 624 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp 195 200 205 gag tat gaa cga cat aac agc tat acc tgt gag gcc act cac aag aca 672 Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr 210 215 220 tca act tca ccc att gtc aag agc ttc aac agg aat gag tgt 714 Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 235 <210> 10 <211> 238 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Phe Cys 100 105 110 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly 165 170 175 Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp 195 200 205 Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr 210 215 220 Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 235 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EFF1 <400> 11 ccacgcgccc tgtagcggcg cattaagc 28 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EFsmaR <400> 12 aaacccggga gctttttgca aaagcctagg 30 <210> 13 <211> 1704 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of signal peptide, Fc region and poly A addition signal of human kappa chain <400> 13 ggtaccaccc aagctggcta ggtaagcttg ctagcgccac catggtgctg cagacccagg 60 tgttcatctc cctgctgctg tggatctccg gcgcatatgg cgatatcgtg atgattaaac 120 gtacggtggc cgccccctcc gtgttcatct tccccccctc cgacgagcag ctgaagtccg 180 gcaccgcctc cgtggtgtgc ctgctgaata acttctaccc cagagaggcc aaggtgcagt 240 ggaaggtgga caacgccctg cagtccggga actcccagga gagcgtgacc gagcaggaca 300 gcaaggacag cacctacagc ctgagcagca ccctgaccct gagcaaagcc gactacgaga 360 agcacaaggt gtacgcctgc gaggtgaccc accagggcct gagctccccc gtcaccaaga 420 gcttcaacag gggggagtgt taggggcccg tttaaacggg tggcatccct gtgacccctc 480 cccagtgcct ctcctggccc tggaagttgc cactccagtg cccaccagcc ttgtcctaat 540 aaaattaagt tgcatcattt tgtctgacta ggtgtccttc tataatatta tggggtggag 600 gggggtggta tggagcaagg ggcaagttgg gaagacaacc tgtagggcct gcggggtcta 660 ttgggaacca agctggagtg cagtggcaca atcttggctc actgcaatct ccgcctcctg 720 ggttcaagcg attctcctgc ctcagcctcc cgagttgttg ggattccagg catgcatgac 780 caggctcacc taatttttgt ttttttggta gagacggggt ttcaccatat tggccaggct 840 ggtctccaac tcctaatctc aggtgatcta cccaccttgg cctcccaaat tgctgggatt 900 acaggcgtga accactgctc cacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 960 tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt 1020 tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 1080 tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg 1140 gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 1200 agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct 1260 cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg 1320 agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt aattctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg 1380 tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc 1440 agcaaccagg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca 1500 tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc 1560 gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc 1620 cgaggccgcc tctgcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct 1680 aggcttttgc aaaaagctcc cggg 1704 <210> 14 <211> 1120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of signal peptide and Fc region of human IgG1 chain <400> 14 tgctagcgcc accatgaaac acctgtggtt cttcctcctg ctggtggcag ctcccagatg 60 ggtgctgagc caggtgcaat tgtgcaggcg gttagctcag cctccaccaa gggcccaagc 120 gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctggcg gcacagccgc cctgggctgc 180 ctggtcaagg actacttccc cgaacccgtg accgtgagct ggaactcagg cgccctgacc 240 agcggcgtgc acaccttccc cgctgtcctg cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 300 gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 360 aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 420 acatgcccac cctgcccagc acctgaactc ctggggggac cctcagtctt cctcttcccc 480 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 540 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 600 cataatgcca agacaaagcc ccgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg ggtggtcagc 660 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 720 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg ccagccccgg 780 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 840 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 900 ggccagcccg agaacaacta caagaccacc cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 960 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcagggcaa cgtcttctca 1020 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacaccc agaagagcct ctccctgtct 1080 cccggcaaat gagatatcgg gcccgtttaa acgggtggca 1120 <210> 15 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence coding the light chain of chimera B273 <220> <221> CDS <222> (1)..(717) <400> 15 atg gtg ctg cag acc cag gtg ttc atc tcc ctg ctg ctg tgg atc tcc 48 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 ggc gca tat ggc gat gtt gtg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct 96 Gly Ala Tyr Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc 144 Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 ctt gta cac agt aat gga aac acc tat cta cat tgg tac ctg cag aag 192 Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 cca ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt 240 Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc 288 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 aca ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga att tat ttc 336 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Phe 100 105 110 tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc aag 384 Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125 ctg gaa atc aaa cgt acg gtg gcc gcc ccc tcc gtg ttc atc ttc ccc 432 Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 ccc tcc gac gag cag ctg aag tcc ggc acc gcc tcc gtg gtg tgc ctg 480 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 ctg aat aac ttc tac ccc aga gag gcc aag gtg cag tgg aag gtg gac 528 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 aac gcc ctg cag tcc ggg aac tcc cag gag agc gtg acc gag cag gac 576 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 agc aag gac agc acc tac agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc aaa 624 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 gcc gac tac gag aag cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac cag 672 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 ggc ctg agc tcc ccc gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt 717 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 16 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 16 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Phe 100 105 110 Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 17 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer B273LF <400> 17 aaacatatgg cgatgttgtg atgacccaaa ctccactctc c 41 <210> 18 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer B273LR <400> 18 aaacgtacgt ttgatttcca gcttggtgcc tccaccgaac g 41 <210> 19 <211> 1413 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence coding the heavy chain of chimera B273 <220> <221> CDS <222> (1)..(1413) <400> 19 atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 gtg ctg agc gag gtt cag ctg cag cag tct gga cct gag ctg gtg aag 96 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 cct ggg gct tca gtg aag ata tcc tgc aag gct tct ggt tac tca ttt 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 att ggc tac ttt atg aac tgg atg aag cag agc cat gga aag agc ctt 192 Ile Gly Tyr Phe Met Asn Trp Met Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60 gag tgg att gga cgt ttt aat cca tac aat ggt gat act ttc tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Arg Phe Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttc aag ggc aag gcc aca ttg act gta gac aaa tcc tct acc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr 85 90 95 aca gcc cac atg gag ctc ctg agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc 336 Thr Ala His Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 tat ttt tgt gga aga tcg gcg tat tac ttc gat agt ggg ggc tac ttt 384 Tyr Phe Cys Gly Arg Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 gac tac tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc agc tca gcc tcc acc 432 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 aag ggc cca agc gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct 480 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 ggc ggc aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa 528 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 ccc gtg acc gtg agc tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac 576 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 acc ttc ccc gct gtc ctg cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc 624 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc 672 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt gag 720 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccc tgc cca gca cct 768 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 gaa ctc ctg ggg gga ccc tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag 816 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg 864 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac 912 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccc cgg gag gag cag tac 960 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac 1008 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc 1056 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggc cag ccc cgg 1104 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag 1152 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac 1200 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggc cag ccc gag aac aac tac aag 1248 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 acc acc cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc 1296 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggc aac gtc ttc tca 1344 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acc cag aag agc 1392 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 ctc tcc ctg tct ccc ggc aaa 1413 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 20 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 20 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Ile Gly Tyr Phe Met Asn Trp Met Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Arg Phe Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr 85 90 95 Thr Ala His Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Gly Arg Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 21 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer B273HF <400> 21 aaagctgagc gaggttcagc tgcagcagtc tggacctgag c 41 <210> 22 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer B273HR <400> 22 aaagctgagc tgactgtgag agtggtgcct tggccccagt ag 42 <210> 23 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln Gln Arg Ala Ala Pro 1 5 10 15 Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu Cys Pro Pro Gly His 20 25 30 His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser Cys Lys Tyr Gly Gln 35 40 45 Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe Cys Leu Arg Cys Thr 50 55 60 Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro Cys Thr Thr Thr Arg 65 70 75 80 Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser 85 90 95 Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys Pro Arg Gly Met Val 100 105 110 Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile Glu Cys Val His Lys 115 120 125 Glu Ser 130 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer DR5 Ndefw <400> 24 gtggcatatg gctctgatca cccaacaa 28 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer DR5 Xhorv <400> 25 cgcctcgagt gattctttgt ggacaca 27 <210> 26 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rsDR5 <400> 26 Met Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln Gln Arg Ala Ala 1 5 10 15 Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu Cys Pro Pro Gly 20 25 30 His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser Cys Lys Tyr Gly 35 40 45 Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe Cys Leu Arg Cys 50 55 60 Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro Cys Thr Thr Thr 65 70 75 80 Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp 85 90 95 Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys Pro Arg Gly Met 100 105 110 Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile Glu Cys Val His 115 120 125 Lys Glu Ser Leu Glu His His His His His His 130 135 <210> 27 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence coding hB273_L1 <220> <221> CDS <222> (1)..(717) <400> 27 atg gtg ctg cag acc cag gtg ttc atc tcc ctg ctg ctg tgg atc tcc 48 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 ggc gca tat ggc gac atc gta atg acc cag tct ccg ctg agt ctt cct 96 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 gtg act cca ggg gag ccc gca agc atc tct tgt cgc agc agt cag tca 144 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 ctg gtc cat agc aat ggg aac act tac ctg cat tgg tac ctc caa aaa 192 Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 cca ggg cag tcc cca cag ctc ttg atc tac aag gtg tcc aat cgg ttc 240 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 agt ggt gtg cct gac cgc ttc tcc gga agt ggc tcc ggg aca gat ttc 288 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 act ctt aag att tca aga gtg gag gca gaa gac gtt gga gtc tat tat 336 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 tgc tca cag agc aca cat gtc ccc tgg act ttc ggt ccc ggc aca aaa 384 Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys 115 120 125 gtc gag atc aag cgt acg gtg gcc gcc ccc tcc gtg ttc atc ttc ccc 432 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 ccc tcc gac gag cag ctg aag tcc ggc acc gcc tcc gtg gtg tgc ctg 480 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 ctg aat aac ttc tac ccc aga gag gcc aag gtg cag tgg aag gtg gac 528 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 aac gcc ctg cag tcc ggg aac tcc cag gag agc gtg acc gag cag gac 576 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 agc aag gac agc acc tac agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc aaa 624 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 gcc gac tac gag aag cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac cag 672 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 ggc ctg agc tcc ccc gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt 717 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 28 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 28 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys 115 120 125 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 29 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence coding hB273_L2 <220> <221> CDS <222> (1)..(717) <400> 29 atg gtg ctg cag acc cag gtg ttc atc tcc ctg ctg ctg tgg atc tcc 48 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 ggc gca tat ggc gac gtc gtc atg aca cag aca cct ctg agc ctg ccc 96 Gly Ala Tyr Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 gtg tct ctg ggc gaa ccc gcc agt att tct tgt agg tca tct cag tct 144 Val Ser Leu Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 ctg gtg cac agt aac gga aac aca tat ctc cat tgg tac ctg cag aag 192 Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 cca ggt cag tcc cca aag ctc ctg atc tat aag gtg agc aac aga ttc 240 Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 tcc gga gtg cct gat cga ttc agc ggg agt ggt tca ggg acc gac ttc 288 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 acc ttg aag att agc cgg gtc gag gcc gag gat gtt gga gtg tat ttc 336 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe 100 105 110 tgt agc cag agt aca cac gtg ccc tgg acc ttc gga cct ggg act aaa 384 Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys 115 120 125 gtc gag att aaa cgt acg gtg gcc gcc ccc tcc gtg ttc atc ttc ccc 432 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 ccc tcc gac gag cag ctg aag tcc ggc acc gcc tcc gtg gtg tgc ctg 480 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 ctg aat aac ttc tac ccc aga gag gcc aag gtg cag tgg aag gtg gac 528 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 aac gcc ctg cag tcc ggg aac tcc cag gag agc gtg acc gag cag gac 576 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 agc aag gac agc acc tac agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc aaa 624 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 gcc gac tac gag aag cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac cag 672 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 ggc ctg agc tcc ccc gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt 717 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 30 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 30 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 Val Ser Leu Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe 100 105 110 Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys 115 120 125 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 31 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence coding hB273_L3 <220> <221> CDS <222> (1)..(717) <400> 31 atg gtg ctg cag acc cag gtg ttc atc tcc ctg ctg ctg tgg atc tcc 48 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 ggc gca tat ggc gac gtg gtg atg acg cag act ccg ctg tca ctg ccc 96 Gly Ala Tyr Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 gta tct ctg gga gag cct gcc agc atc agc tgc agg agc tct caa tca 144 Val Ser Leu Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 ctg gtg cac tct aac ggt aat acc tac ctc cac tgg tat ctc cag aag 192 Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 cca gga caa tcc cca aag ttg ctc ata tat aaa gtg tcc aac cgg ttc 240 Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 tca gga gtc cct gac cgg ttt agc ggt agt ggc tct ggt aca gat ttc 288 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 acc ctg aaa ata tca agg gtt gaa gcg gaa gac gta gga gtg tat ttt 336 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe 100 105 110 tgc agc cag agc acc cat gtc ccc tgg aca ttt ggg ggc ggc acc aag 384 Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125 gtc gaa atc aag cgt acg gtg gcc gcc ccc tcc gtg ttc atc ttc ccc 432 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 ccc tcc gac gag cag ctg aag tcc ggc acc gcc tcc gtg gtg tgc ctg 480 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 ctg aat aac ttc tac ccc aga gag gcc aag gtg cag tgg aag gtg gac 528 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 aac gcc ctg cag tcc ggg aac tcc cag gag agc gtg acc gag cag gac 576 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 agc aag gac agc acc tac agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc aaa 624 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 gcc gac tac gag aag cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac cag 672 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 ggc ctg agc tcc ccc gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt 717 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 32 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 Val Ser Leu Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe 100 105 110 Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 33 <211> 1413 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence coding hB273_H1 <220> <221> CDS <222> (1)..(1413) <400> 33 atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 gtg ctg agc caa gtt cag ctc gtg cag tcc ggc gcg gag gtt aag aaa 96 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cca ggc gca tcc gtt aaa gtg tca tgt aag gcc agc ggg tac tcc ttt 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 atc ggc tac ttt atg aac tgg gtg cgg cag gcc cct ggt atg ggc ctg 192 Ile Gly Tyr Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Met Gly Leu 50 55 60 gag tgg atg gga cgg ttt aat cca tat aat ggc gat act ttt tac aac 240 Glu Trp Met Gly Arg Phe Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn 65 70 75 80 cag aaa ttt aaa gga agg gtc act ctc aca gtg gat aaa agc act agt 288 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 acg gct tac atg gaa ctg tcc tcc ctc aga tca gaa gat act gcc gtc 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 tac tac tgc gcc cga agt gct tac tat ttc gac agc ggg ggc tac ttt 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 gat tat tgg ggc cag ggg acc ctg gta act gtg agc tca gcc tcc acc 432 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 aag ggc cca agc gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct 480 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 ggc ggc aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa 528 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 ccc gtg acc gtg agc tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac 576 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 acc ttc ccc gct gtc ctg cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc 624 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc 672 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt gag 720 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccc tgc cca gca cct 768 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 gaa ctc ctg ggg gga ccc tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag 816 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg 864 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac 912 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccc cgg gag gag cag tac 960 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac 1008 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc 1056 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggc cag ccc cgg 1104 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag 1152 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac 1200 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggc cag ccc gag aac aac tac aag 1248 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 acc acc cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc 1296 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggc aac gtc ttc tca 1344 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acc cag aag agc 1392 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 ctc tcc ctg tct ccc ggc aaa 1413 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 34 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 34 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Ile Gly Tyr Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Met Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Arg Phe Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 35 <211> 1413 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence coding hB273_H2 <220> <221> CDS <222> (1)..(1413) <400> 35 atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 gtg ctg agc cag gtc cag ctg gtg cag agt gga gcc gag gta aaa aaa 96 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cca ggg gct agt gtc aag gtc tcc tgt aag gca tct ggt tac tct ttt 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 ata gga tac ttc atg aac tgg atg aag cag tct ccc ggt atg tct ctg 192 Ile Gly Tyr Phe Met Asn Trp Met Lys Gln Ser Pro Gly Met Ser Leu 50 55 60 gag tgg att ggc aga ttc aac ccc tac aac ggg gac act ttt tat aat 240 Glu Trp Ile Gly Arg Phe Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttc aaa ggg aaa gcc act ctg acc gtg gac aag tca act tcc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 aca gca tac atg gaa ttg tcc tca ctg agg tcc gaa gat acc gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 tac ttc tgc gct cgg agt gct tat tat ttc gat agc gga ggg tat ttt 384 Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 gac tat tgg ggg caa ggg acc ctt gta acc gtg agc tca gcc tcc acc 432 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 aag ggc cca agc gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct 480 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 ggc ggc aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa 528 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 ccc gtg acc gtg agc tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac 576 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 acc ttc ccc gct gtc ctg cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc 624 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc 672 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt gag 720 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccc tgc cca gca cct 768 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 gaa ctc ctg ggg gga ccc tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag 816 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg 864 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac 912 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccc cgg gag gag cag tac 960 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac 1008 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc 1056 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggc cag ccc cgg 1104 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag 1152 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac 1200 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggc cag ccc gag aac aac tac aag 1248 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 acc acc cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc 1296 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggc aac gtc ttc tca 1344 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acc cag aag agc 1392 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 ctc tcc ctg tct ccc ggc aaa 1413 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 36 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Ile Gly Tyr Phe Met Asn Trp Met Lys Gln Ser Pro Gly Met Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Arg Phe Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 37 <211> 1413 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence coding hB273_H3 <220> <221> CDS <222> (1)..(1413) <400> 37 atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 gtg ctg agc gaa gtg cag ctc gtg caa agc ggc gct gaa gtg aaa aaa 96 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cca gga gcc tca gtc aaa gtg tcc tgt aag gcc tcc ggg tat agc ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 atc ggc tat ttt atg aac tgg atg aag cag agc ccg ggc aaa agc ctc 192 Ile Gly Tyr Phe Met Asn Trp Met Lys Gln Ser Pro Gly Lys Ser Leu 50 55 60 gaa tgg atc ggg aga ttc aat cca tac aat ggt gac acc ttt tac aat 240 Glu Trp Ile Gly Arg Phe Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn 65 70 75 80 cag aaa ttc aaa ggc aag gcc acg ctg act gta gac aaa tcc acc agc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 aca gcc cac atg gaa ttg tct tcc ctg agg tct gag gat acc gcg gtg 336 Thr Ala His Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 tac ttt tgt ggc cga agt gcg tat tat ttc gat tca ggc ggg tac ttc 384 Tyr Phe Cys Gly Arg Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 gat tac tgg ggt cag ggg acg ctc gtc acc gta agc tca gcc tcc acc 432 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 aag ggc cca agc gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct 480 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 ggc ggc aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa 528 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 ccc gtg acc gtg agc tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac 576 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 acc ttc ccc gct gtc ctg cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc 624 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc 672 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt gag 720 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccc tgc cca gca cct 768 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 gaa ctc ctg ggg gga ccc tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag 816 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg 864 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac 912 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccc cgg gag gag cag tac 960 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac 1008 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc 1056 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggc cag ccc cgg 1104 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag 1152 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac 1200 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggc cag ccc gag aac aac tac aag 1248 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 acc acc cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc 1296 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggc aac gtc ttc tca 1344 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acc cag aag agc 1392 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 ctc tcc ctg tct ccc ggc aaa 1413 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 38 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 38 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Ile Gly Tyr Phe Met Asn Trp Met Lys Gln Ser Pro Gly Lys Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Arg Phe Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala His Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Gly Arg Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 39 <211> 1413 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence coding hB273_H1-1 <220> <221> CDS <222> (1)..(1413) <400> 39 atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 gtg ctg agc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggc gcc gaa gtg aag aaa 96 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cct ggc gct tct gtg aag gtg tcc tgc aag gcc agc ggc tac agc ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 atc ggc tac ttc atg aac tgg atg cgg cag gcc cct ggc atg gga ctg 192 Ile Gly Tyr Phe Met Asn Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Met Gly Leu 50 55 60 gaa tgg atg ggc cgg ttc aac ccc tac aac ggc gac acc ttc tac aac 240 Glu Trp Met Gly Arg Phe Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn 65 70 75 80 cag aaa ttc aag ggc aga gtg acc ctg acc gtg gac aag agc acc agc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 acc gcc tac atg gaa ctg agc agc ctg cgg agc gag gat acc gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat ttc tgc ggc aga agc gcc tac tac ttc gac agc ggc ggc tac ttc 384 Tyr Phe Cys Gly Arg Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 gac tac tgg ggc cag ggc acc ctg gtg aca gtg agc tca gcc tcc acc 432 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 aag ggc cca agc gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct 480 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 ggc ggc aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa 528 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 ccc gtg acc gtg agc tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac 576 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 acc ttc ccc gct gtc ctg cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc 624 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc 672 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt gag 720 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccc tgc cca gca cct 768 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 gaa ctc ctg ggg gga ccc tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag 816 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg 864 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac 912 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccc cgg gag gag cag tac 960 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac 1008 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc 1056 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggc cag ccc cgg 1104 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag 1152 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac 1200 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggc cag ccc gag aac aac tac aag 1248 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 acc acc cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc 1296 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggc aac gtc ttc tca 1344 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acc cag aag agc 1392 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 ctc tcc ctg tct ccc ggc aaa 1413 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 40 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 40 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Ile Gly Tyr Phe Met Asn Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Met Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Arg Phe Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Gly Arg Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 41 <211> 1413 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence coding hB273_H2-1 <220> <221> CDS <222> (1)..(1413) <400> 41 atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 gtg ctg agc gag gtg cag ctg gtg cag tct ggc gcc gaa gtg aag aaa 96 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cct gga gcc agc gtg aag gtg tcc tgc aag gcc agc ggc tac agc ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 atc ggc tac ttc atg aac tgg atg aag cag agc ccc ggc atg agc ctg 192 Ile Gly Tyr Phe Met Asn Trp Met Lys Gln Ser Pro Gly Met Ser Leu 50 55 60 gaa tgg atc ggc cgg ttc aac ccc tac aac ggc gac acc ttc tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Arg Phe Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttc aag gga aag gcc acc ctg aca gtg gac aag agc acc agc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 acc gcc tac atg gaa ctg agc agc ctg cgg agc gag gat acc gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 tac ttc tgc gcc aga agc gcc tac tac ttc gac agc ggc ggc tac ttc 384 Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 gac tac tgg ggc cag ggc acc ctg gtg aca gtg agc tca gcc tcc acc 432 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 aag ggc cca agc gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct 480 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 ggc ggc aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa 528 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 ccc gtg acc gtg agc tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac 576 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 acc ttc ccc gct gtc ctg cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc 624 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc 672 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt gag 720 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccc tgc cca gca cct 768 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 gaa ctc ctg ggg gga ccc tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag 816 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg 864 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac 912 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccc cgg gag gag cag tac 960 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac 1008 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc 1056 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggc cag ccc cgg 1104 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag 1152 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac 1200 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggc cag ccc gag aac aac tac aag 1248 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 acc acc cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc 1296 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggc aac gtc ttc tca 1344 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acc cag aag agc 1392 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 ctc tcc ctg tct ccc ggc aaa 1413 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 42 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 42 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Ile Gly Tyr Phe Met Asn Trp Met Lys Gln Ser Pro Gly Met Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Arg Phe Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 43 <211> 1413 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence coding hB273_H2-2 <220> <221> CDS <222> (1)..(1413) <400> 43 atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 gtg ctg agc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggc gcc gaa gtg aag aaa 96 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cct gga gcc agc gtg aag gtg tcc tgc aag gcc agc ggc tac agc ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 atc ggc tac ttc atg aac tgg atg aag cag agc ccc ggc atg agc ctg 192 Ile Gly Tyr Phe Met Asn Trp Met Lys Gln Ser Pro Gly Met Ser Leu 50 55 60 gaa tgg atc ggc cgg ttc aac ccc tac aac ggc gac acc ttc tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Arg Phe Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttc aag gga aag gcc acc ctg aca gtg gac aag agc acc agc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 acc gcc cac atg gaa ctg agc agc ctg cgg agc gag gat acc gcc gtg 336 Thr Ala His Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 tac ttc tgc gcc aga agc gcc tac tac ttc gac agc ggc ggc tac ttc 384 Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 gac tac tgg ggc cag ggc acc ctg gtg aca gtg agc tca gcc tcc acc 432 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 aag ggc cca agc gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct 480 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 ggc ggc aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa 528 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 ccc gtg acc gtg agc tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac 576 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 acc ttc ccc gct gtc ctg cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc 624 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc 672 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt gag 720 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccc tgc cca gca cct 768 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 gaa ctc ctg ggg gga ccc tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag 816 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg 864 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac 912 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccc cgg gag gag cag tac 960 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac 1008 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc 1056 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggc cag ccc cgg 1104 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag 1152 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac 1200 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggc cag ccc gag aac aac tac aag 1248 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 acc acc cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc 1296 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggc aac gtc ttc tca 1344 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acc cag aag agc 1392 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 ctc tcc ctg tct ccc ggc aaa 1413 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 44 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 44 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Ile Gly Tyr Phe Met Asn Trp Met Lys Gln Ser Pro Gly Met Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Arg Phe Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala His Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 45 <211> 1413 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence coding hB273_H2-3 <220> <221> CDS <222> (1)..(1413) <400> 45 atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 gtg ctg agc gag gtg cag ctg gtg cag tct ggc gcc gaa gtg aag aaa 96 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cct gga gcc agc gtg aag gtg tcc tgc aag gcc agc ggc tac agc ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 atc ggc tac ttc atg aac tgg atg aag cag agc ccc ggc atg agc ctg 192 Ile Gly Tyr Phe Met Asn Trp Met Lys Gln Ser Pro Gly Met Ser Leu 50 55 60 gaa tgg atc ggc cgg ttc aac ccc tac aac ggc gac acc ttc tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Arg Phe Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttc aag gga aag gcc acc ctg aca gtg gac aag agc acc agc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 acc gcc cac atg gaa ctg agc agc ctg cgg agc gag gat acc gcc gtg 336 Thr Ala His Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 tac ttc tgc gcc aga agc gcc tac tac ttc gac agc ggc ggc tac ttc 384 Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 gac tac tgg ggc cag ggc acc ctg gtg aca gtg agc tca gcc tcc acc 432 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 aag ggc cca agc gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct 480 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 ggc ggc aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa 528 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 ccc gtg acc gtg agc tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac 576 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 acc ttc ccc gct gtc ctg cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc 624 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc 672 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt gag 720 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccc tgc cca gca cct 768 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 gaa ctc ctg ggg gga ccc tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag 816 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg 864 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac 912 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccc cgg gag gag cag tac 960 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac 1008 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc 1056 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggc cag ccc cgg 1104 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag 1152 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac 1200 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggc cag ccc gag aac aac tac aag 1248 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 acc acc cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc 1296 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggc aac gtc ttc tca 1344 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acc cag aag agc 1392 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 ctc tcc ctg tct ccc ggc aaa 1413 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 46 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 46 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Ile Gly Tyr Phe Met Asn Trp Met Lys Gln Ser Pro Gly Met Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Arg Phe Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala His Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 47 <211> 1413 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence coding hB273_H2-4 <220> <221> CDS <222> (1)..(1413) <400> 47 atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 gtg ctg agc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggc gcc gaa gtg aag aaa 96 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cct gga gcc agc gtg aag gtg tcc tgc aag gcc agc ggc tac agc ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 atc ggc tac ttc atg aac tgg atg aag cag agc ccc ggc atg agc ctg 192 Ile Gly Tyr Phe Met Asn Trp Met Lys Gln Ser Pro Gly Met Ser Leu 50 55 60 gaa tgg atc ggc cgg ttc aac ccc tac aac ggc gac acc ttc tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Arg Phe Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttc aag gga aag gcc acc ctg aca gtg gac aag agc acc agc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 acc gcc tac atg gaa ctg agc agc ctg cgg agc gag gat acc gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 tac ttc tgc ggc aga agc gcc tac tac ttc gac agc ggc ggc tac ttc 384 Tyr Phe Cys Gly Arg Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 gac tac tgg ggc cag ggc acc ctg gtg aca gtg agc tca gcc tcc acc 432 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 aag ggc cca agc gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct 480 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 ggc ggc aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa 528 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 ccc gtg acc gtg agc tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac 576 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 acc ttc ccc gct gtc ctg cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc 624 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc 672 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt gag 720 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccc tgc cca gca cct 768 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 gaa ctc ctg ggg gga ccc tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag 816 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg 864 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac 912 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccc cgg gag gag cag tac 960 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac 1008 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc 1056 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggc cag ccc cgg 1104 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag 1152 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac 1200 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggc cag ccc gag aac aac tac aag 1248 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 acc acc cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc 1296 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggc aac gtc ttc tca 1344 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acc cag aag agc 1392 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 ctc tcc ctg tct ccc ggc aaa 1413 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 48 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 48 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Ile Gly Tyr Phe Met Asn Trp Met Lys Gln Ser Pro Gly Met Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Arg Phe Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Gly Arg Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 49 <211> 1413 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence coding hB273_H2-5 <220> <221> CDS <222> (1)..(1413) <400> 49 atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 gtg ctg agc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggc gcc gaa gtg aag aaa 96 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cct gga gcc agc gtg aag gtg tcc tgc aag gcc agc ggc tac agc ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 atc ggc tac ttc atg aac tgg atg aag cag agc ccc ggc aag agc ctg 192 Ile Gly Tyr Phe Met Asn Trp Met Lys Gln Ser Pro Gly Lys Ser Leu 50 55 60 gaa tgg atc ggc cgg ttc aac ccc tac aac ggc gac acc ttc tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Arg Phe Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttc aag gga aag gcc acc ctg aca gtg gac aag agc acc agc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 acc gcc tac atg gaa ctg agc agc ctg cgg agc gag gat acc gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 tac ttc tgc ggc aga agc gcc tac tac ttc gac agc ggc ggc tac ttc 384 Tyr Phe Cys Gly Arg Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 gac tac tgg ggc cag ggc acc ctg gtg aca gtg agc tca gcc tcc acc 432 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 aag ggc cca agc gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct 480 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 ggc ggc aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa 528 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 ccc gtg acc gtg agc tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac 576 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 acc ttc ccc gct gtc ctg cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc 624 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc 672 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt gag 720 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccc tgc cca gca cct 768 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 gaa ctc ctg ggg gga ccc tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag 816 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg 864 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac 912 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccc cgg gag gag cag tac 960 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac 1008 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc 1056 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggc cag ccc cgg 1104 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag 1152 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac 1200 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggc cag ccc gag aac aac tac aag 1248 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 acc acc cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc 1296 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggc aac gtc ttc tca 1344 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acc cag aag agc 1392 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 ctc tcc ctg tct ccc ggc aaa 1413 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 50 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 50 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Ile Gly Tyr Phe Met Asn Trp Met Lys Gln Ser Pro Gly Lys Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Arg Phe Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Gly Arg Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 51 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence coding hB273_L1-NE <220> <221> CDS <222> (1)..(717) <400> 51 atg gtg ctg cag acc cag gtg ttc atc tcc ctg ctg ctg tgg atc tcc 48 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 ggc gca tat ggc gac atc gta atg acc cag tct ccg ctg agt ctt cct 96 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 gtg act cca ggg gag ccc gca agc atc tct tgt cgc agc agt cag tca 144 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 ctg gtc cat agc aat gag aac act tac ctg cat tgg tac ctc caa aaa 192 Leu Val His Ser Asn Glu Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 cca ggg cag tcc cca cag ctc ttg atc tac aag gtg tcc aat cgg ttc 240 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 agt ggt gtg cct gac cgc ttc tcc gga agt ggc tcc ggg aca gat ttc 288 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 act ctt aag att tca aga gtg gag gca gaa gac gtt gga gtc tat tat 336 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 tgc tca cag agc aca cat gtc ccc tgg act ttc ggt ccc ggc aca aaa 384 Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys 115 120 125 gtc gag atc aag cgt acg gtg gcc gcc ccc tcc gtg ttc atc ttc ccc 432 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 ccc tcc gac gag cag ctg aag tcc ggc acc gcc tcc gtg gtg tgc ctg 480 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 ctg aat aac ttc tac ccc aga gag gcc aag gtg cag tgg aag gtg gac 528 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 aac gcc ctg cag tcc ggg aac tcc cag gag agc gtg acc gag cag gac 576 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 agc aag gac agc acc tac agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc aaa 624 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 gcc gac tac gag aag cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac cag 672 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 ggc ctg agc tcc ccc gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt 717 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 52 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 52 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Val His Ser Asn Glu Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys 115 120 125 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 53 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer L-F1 <400> 53 aggtaagctt gctagcgcca ccatggtgct gc 32 <210> 54 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer L-NE-R2 <400> 54 ccaatgcagg taagtgttct cattgctatg gaccagtgac tg 42 <210> 55 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer L-NE-F2 <400> 55 cagtcactgg tccatagcaa tgagaacact tacctgcatt gg 42 <210> 56 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer L-R1 <400> 56 ggatgccacc cgtttaaacg ggcccctaac ac 32 <210> 57 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence coding hB273_L1-NF <220> <221> CDS <222> (1)..(717) <400> 57 atg gtg ctg cag acc cag gtg ttc atc tcc ctg ctg ctg tgg atc tcc 48 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 ggc gca tat ggc gac atc gta atg acc cag tct ccg ctg agt ctt cct 96 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 gtg act cca ggg gag ccc gca agc atc tct tgt cgc agc agt cag tca 144 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 ctg gtc cat agc aat ttc aac act tac ctg cat tgg tac ctc caa aaa 192 Leu Val His Ser Asn Phe Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 cca ggg cag tcc cca cag ctc ttg atc tac aag gtg tcc aat cgg ttc 240 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 agt ggt gtg cct gac cgc ttc tcc gga agt ggc tcc ggg aca gat ttc 288 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 act ctt aag att tca aga gtg gag gca gaa gac gtt gga gtc tat tat 336 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 tgc tca cag agc aca cat gtc ccc tgg act ttc ggt ccc ggc aca aaa 384 Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys 115 120 125 gtc gag atc aag cgt acg gtg gcc gcc ccc tcc gtg ttc atc ttc ccc 432 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 ccc tcc gac gag cag ctg aag tcc ggc acc gcc tcc gtg gtg tgc ctg 480 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 ctg aat aac ttc tac ccc aga gag gcc aag gtg cag tgg aag gtg gac 528 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 aac gcc ctg cag tcc ggg aac tcc cag gag agc gtg acc gag cag gac 576 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 agc aag gac agc acc tac agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc aaa 624 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 gcc gac tac gag aag cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac cag 672 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 ggc ctg agc tcc ccc gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt 717 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 58 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 58 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Val His Ser Asn Phe Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys 115 120 125 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 59 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer L-NF-R2 <400> 59 ccaatgcagg taagtgttga aattgctatg gaccagtgac tg 42 <210> 60 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer L-NF-F2 <400> 60 cagtcactgg tccatagcaa tttcaacact tacctgcatt gg 42 <210> 61 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence coding hB273_L1-NK <220> <221> CDS <222> (1)..(717) <400> 61 atg gtg ctg cag acc cag gtg ttc atc tcc ctg ctg ctg tgg atc tcc 48 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 ggc gca tat ggc gac atc gta atg acc cag tct ccg ctg agt ctt cct 96 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 gtg act cca ggg gag ccc gca agc atc tct tgt cgc agc agt cag tca 144 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 ctg gtc cat agc aat aag aac act tac ctg cat tgg tac ctc caa aaa 192 Leu Val His Ser Asn Lys Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 cca ggg cag tcc cca cag ctc ttg atc tac aag gtg tcc aat cgg ttc 240 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 agt ggt gtg cct gac cgc ttc tcc gga agt ggc tcc ggg aca gat ttc 288 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 act ctt aag att tca aga gtg gag gca gaa gac gtt gga gtc tat tat 336 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 tgc tca cag agc aca cat gtc ccc tgg act ttc ggt ccc ggc aca aaa 384 Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys 115 120 125 gtc gag atc aag cgt acg gtg gcc gcc ccc tcc gtg ttc atc ttc ccc 432 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 ccc tcc gac gag cag ctg aag tcc ggc acc gcc tcc gtg gtg tgc ctg 480 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 ctg aat aac ttc tac ccc aga gag gcc aag gtg cag tgg aag gtg gac 528 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 aac gcc ctg cag tcc ggg aac tcc cag gag agc gtg acc gag cag gac 576 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 agc aag gac agc acc tac agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc aaa 624 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 gcc gac tac gag aag cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac cag 672 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 ggc ctg agc tcc ccc gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt 717 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 62 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 62 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Val His Ser Asn Lys Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys 115 120 125 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 63 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer L-NK-R2 <400> 63 ccaatgcagg taagtgttct tattgctatg gaccagtgac tg 42 <210> 64 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Priemr L-NK-F2 <400> 64 cagtcactgg tccatagcaa taagaacact tacctgcatt gg 42 <210> 65 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence coding hB273_L1-NL <220> <221> CDS <222> (1)..(717) <400> 65 atg gtg ctg cag acc cag gtg ttc atc tcc ctg ctg ctg tgg atc tcc 48 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 ggc gca tat ggc gac atc gta atg acc cag tct ccg ctg agt ctt cct 96 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 gtg act cca ggg gag ccc gca agc atc tct tgt cgc agc agt cag tca 144 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 ctg gtc cat agc aat ctg aac act tac ctg cat tgg tac ctc caa aaa 192 Leu Val His Ser Asn Leu Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 cca ggg cag tcc cca cag ctc ttg atc tac aag gtg tcc aat cgg ttc 240 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 agt ggt gtg cct gac cgc ttc tcc gga agt ggc tcc ggg aca gat ttc 288 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 act ctt aag att tca aga gtg gag gca gaa gac gtt gga gtc tat tat 336 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 tgc tca cag agc aca cat gtc ccc tgg act ttc ggt ccc ggc aca aaa 384 Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys 115 120 125 gtc gag atc aag cgt acg gtg gcc gcc ccc tcc gtg ttc atc ttc ccc 432 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 ccc tcc gac gag cag ctg aag tcc ggc acc gcc tcc gtg gtg tgc ctg 480 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 ctg aat aac ttc tac ccc aga gag gcc aag gtg cag tgg aag gtg gac 528 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 aac gcc ctg cag tcc ggg aac tcc cag gag agc gtg acc gag cag gac 576 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 agc aag gac agc acc tac agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc aaa 624 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 gcc gac tac gag aag cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac cag 672 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 ggc ctg agc tcc ccc gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt 717 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 66 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 66 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Val His Ser Asn Leu Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys 115 120 125 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 67 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer L-NL-R2 <400> 67 ccaatgcagg taagtgttca gattgctatg gaccagtgac tg 42 <210> 68 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer L-NL-F2 <400> 68 cagtcactgg tccatagcaa tctgaacact tacctgcatt gg 42 <210> 69 <211> 1413 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence coding hB273_H2-1-NE <220> <221> CDS <222> (1)..(1413) <400> 69 atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 gtg ctg agc gag gtg cag ctg gtg cag tct ggc gcc gaa gtg aag aaa 96 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cct gga gcc agc gtg aag gtg tcc tgc aag gcc agc ggc tac agc ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 atc ggc tac ttc atg aac tgg atg aag cag agc ccc ggc atg agc ctg 192 Ile Gly Tyr Phe Met Asn Trp Met Lys Gln Ser Pro Gly Met Ser Leu 50 55 60 gaa tgg atc ggc cgg ttc aac ccc tac aac gag gac acc ttc tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Arg Phe Asn Pro Tyr Asn Glu Asp Thr Phe Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttc aag gga aag gcc acc ctg aca gtg gac aag agc acc agc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 acc gcc tac atg gaa ctg agc agc ctg cgg agc gag gat acc gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 tac ttc tgc gcc aga agc gcc tac tac ttc gac agc ggc ggc tac ttc 384 Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 gac tac tgg ggc cag ggc acc ctg gtg aca gtg agc tca gcc tcc acc 432 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 aag ggc cca agc gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct 480 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 ggc ggc aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa 528 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 ccc gtg acc gtg agc tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac 576 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 acc ttc ccc gct gtc ctg cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc 624 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc 672 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt gag 720 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccc tgc cca gca cct 768 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 gaa ctc ctg ggg gga ccc tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag 816 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg 864 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac 912 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccc cgg gag gag cag tac 960 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac 1008 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc 1056 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggc cag ccc cgg 1104 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag 1152 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac 1200 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggc cag ccc gag aac aac tac aag 1248 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 acc acc cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc 1296 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggc aac gtc ttc tca 1344 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acc cag aag agc 1392 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 ctc tcc ctg tct ccc ggc aaa 1413 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 70 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 70 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Ile Gly Tyr Phe Met Asn Trp Met Lys Gln Ser Pro Gly Met Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Arg Phe Asn Pro Tyr Asn Glu Asp Thr Phe Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 71 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H-F1 <400> 71 aggtaagctt gctagcgcca ccatgaaaca cc 32 <210> 72 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H-NE-R2 <400> 72 ctggttgtag aaggtgtcct cgttgtaggg gttgaaccgg cc 42 <210> 73 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H-NE-F2 <400> 73 ggccggttca acccctacaa cgaggacacc ttctacaacc ag 42 <210> 74 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Priemr H-R1 <400> 74 ggatgccacc cgtttaaacg ggcccgatat ctc 33 <210> 75 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence coding the light chain of conatumumab <220> <221> CDS <222> (1)..(705) <400> 75 atg gtg ctg cag acc cag gtg ttc atc tcc ctg ctg ctg tgg atc tcc 48 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 ggc gca tat ggc gaa atc gtg ttg aca cag agt ccc ggc act ctt agc 96 Gly Ala Tyr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30 ctt agc ccg ggt gaa cgc gcc acc ctg tcc tgc cgc gcc tct cag gga 144 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly 35 40 45 atc tct cgc tct tac ctc gcg tgg tac cag cag aaa ccc ggc cag gcc 192 Ile Ser Arg Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 ccc agt ttg ctg ata tac ggt gcc tct agc cga gca act ggc atc cca 240 Pro Ser Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro 65 70 75 80 gac cgg ttc tca gga tct ggc tcc ggg act gac ttc act ctg acc atc 288 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 tcc aga ctg gag ccc gag gat ttc gcg gta tat tac tgc cag cag ttc 336 Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe 100 105 110 ggc agc agt cct tgg acc ttc gga cag ggt act aag gtg gag att aaa 384 Gly Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 cgt acg gtg gcc gcc ccc tcc gtg ttc atc ttc ccc ccc tcc gac gag 432 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 cag ctg aag tcc ggc acc gcc tcc gtg gtg tgc ctg ctg aat aac ttc 480 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 tac ccc aga gag gcc aag gtg cag tgg aag gtg gac aac gcc ctg cag 528 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 165 170 175 tcc ggg aac tcc cag gag agc gtg acc gag cag gac agc aag gac agc 576 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 acc tac agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc aaa gcc gac tac gag 624 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 aag cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac cag ggc ctg agc tcc 672 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 210 215 220 ccc gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt 705 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 76 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 76 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly 35 40 45 Ile Ser Arg Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Ser Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro 65 70 75 80 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe 100 105 110 Gly Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 165 170 175 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 210 215 220 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 77 <211> 1413 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence coding the heavy chain of conatumumab <220> <221> CDS <222> (1)..(1413) <400> 77 atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 gtg ctg agc cag gtg cag ctt cag gaa agc ggg ccc ggc ctc gtg aag 96 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 ccc tcc cag acc ctg tct ctt act tgt aca gtg agc ggt ggc agc att 144 Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile 35 40 45 tct tca ggc gat tac ttc tgg agt tgg att cgc caa ctg cct ggt aaa 192 Ser Ser Gly Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys 50 55 60 ggg ctg gaa tgg atc ggg cat att cac aat tca gga acc aca tat tat 240 Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 aac cct tca ctg aag agc cgg gta act atc tcc gtt gac act agc aag 288 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys 85 90 95 aaa cag ttc tcc ctc cgg ctg tct tct gtc aca gcc gct gac acc gct 336 Lys Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 100 105 110 gtt tac tac tgt gca aga gat cgg ggt ggc gac tac tat tac ggc atg 384 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met 115 120 125 gat gtt tgg gga cag gga acc acc gta aca gtg agc tca gcc tcc acc 432 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 aag ggc cca agc gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct 480 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 ggc ggc aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa 528 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 ccc gtg acc gtg agc tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac 576 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 acc ttc ccc gct gtc ctg cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc 624 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc 672 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt gag 720 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccc tgc cca gca cct 768 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 gaa ctc ctg ggg gga ccc tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag 816 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg 864 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac 912 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccc cgg gag gag cag tac 960 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac 1008 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc 1056 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggc cag ccc cgg 1104 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag 1152 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac 1200 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggc cag ccc gag aac aac tac aag 1248 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 acc acc cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc 1296 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggc aac gtc ttc tca 1344 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acc cag aag agc 1392 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 ctc tcc ctg tct ccc ggc aaa 1413 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 78 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 78 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile 35 40 45 Ser Ser Gly Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys 85 90 95 Lys Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met 115 120 125 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 79 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 79 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 80 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 80 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 81 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 81 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 82 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 82 Gly Tyr Phe Met Asn 1 5 <210> 83 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 83 Arg Phe Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 84 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 84 Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 85 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of hB273_L1-NE <400> 85 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Glu Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 86 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of hB273_L1-NF <400> 86 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Phe Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 87 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of hB273_L1-NK <400> 87 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Lys Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 88 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of hB273_L1-NL <400> 88 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Leu Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 89 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of hB273_H2-1-NE <400> 89 Arg Phe Asn Pro Tyr Asn Glu Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly

Claims

중사슬 배열이 CDRH1, CDRH2, CDRH3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRH1 은 배열 번호 82 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH2 는 배열 번호 83 또는 89 에 나타내는 어느 하나의 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH3 은 배열 번호 84 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ; 및
경사슬 배열이 CDRL1, CDRL2, CDRL3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRL1 은 배열 번호 79, 85, 86, 87 또는 88 에 나타내는 어느 하나의 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL2 는 배열 번호 80 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL3 은 배열 번호 81 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ;
을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 1 항에 있어서,
배열 번호 20 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 16 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
키메라 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 3 항에 있어서,
배열 번호 20 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 16 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 1 항에 있어서,
인간화되어 있는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 5 항에 있어서,
항체 또는 그 항체의 기능성 단편으로서,
(a) 이하의 아미노산 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬 가변 영역 배열 :
a1) 배열 번호 42 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
a2) 배열 번호 70 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
a3) a1) 또는 a2) 에서 선택되는 아미노산 배열과 적어도 95 ％ 의 상동성을 갖는 아미노산 배열 ;
a4) a1) 또는 a2) 에서 선택되는 아미노산 배열과 적어도 99 ％ 의 상동성을 갖는 아미노산 배열 ;
a5) a1) 내지 a2) 에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 배열에 1 내지 수 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 배열 ; 및
(b) 이하의 아미노산 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 경사슬 가변 영역 배열 :
b1) 배열 번호 28 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
b2) 배열 번호 52 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
b3) 배열 번호 58 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
b4) 배열 번호 62 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
b5) 배열 번호 66 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
b6) b1) 내지 b5) 에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 배열과 적어도 95 ％ 의 상동성을 갖는 아미노산 배열 ;
b7) b1) 내지 b5) 에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 배열과 적어도 99 ％ 의 상동성을 갖는 아미노산 배열 ;
b8) b1) 내지 b5) 에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 배열에 1 내지 수 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 배열 ;
을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 6 항에 있어서,
배열 번호 42 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 28 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 6 항에 있어서,
배열 번호 70 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 52 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 6 항에 있어서,
배열 번호 70 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 58 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 6 항에 있어서,
배열 번호 70 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 62 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 6 항에 있어서,
배열 번호 70 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 66 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 134 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 6 항에 있어서,
배열 번호 42 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 28 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 6 항에 있어서,
배열 번호 70 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 52 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 6 항에 있어서,
배열 번호 70 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 58 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 6 항에 있어서,
배열 번호 70 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 62 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 6 항에 있어서,
배열 번호 70 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 66 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
Fab, F(ab')₂, Fab' 및 Fv 로 이루어지는 군에서 선택되는 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 항체의 기능성 단편.
제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 중 적어도 어느 하나를 함유하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 18 항에 있어서,
암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 1 항 내지 제 17 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 중 적어도 어느 하나, 그리고, paclitaxel, carboplatin, CPT-11, 또는 vinblastin 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나를 함유하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
제 19 항 또는 제 20 항에 있어서,
암이 폐암, 전립선암, 갑상선암, 위암, 간암, 난소암, 대장암, 유방암, 췌장암, 자궁암, 멜라노머, 신경 교아종 및 혈구암으로 이루어지는 군에서 선택되는 의약 조성물.
제 1 항 내지 제 17 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 중 적어도 어느 하나를 투여하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방 방법.
제 1 항 내지 제 17 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 중 적어도 어느 하나, 그리고, paclitaxel, carboplatin, CPT-11, vinblastin 및 5-FU 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나를 동시 또는 연속하여 투여하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방 방법.
제 22 항 또는 제 23 항에 있어서,
암이 폐암, 전립선암, 갑상선암, 위암, 간암, 난소암, 대장암, 유방암, 췌장암, 신장암, 자궁암, 멜라노머, 섬유 육종, 신경 교아종 및 혈구암으로 이루어지는 군에서 선택되는 치료 및/또는 예방 방법.
제 2 항, 제 4 항 또는 제 6 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드.
제 25 항에 있어서,
배열 번호 19 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 423 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 15 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 402 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 25 항에 있어서,
배열 번호 19 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1413 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 15 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 717 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 25 항에 있어서,
(a) 이하의 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 :
a1) 배열 번호 41 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 423 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
a2) 배열 번호 69 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 423 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
a3) a1) 또는 a2) 에서 선택되는 뉴클레오티드 배열과 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드가 보유하는 뉴클레오티드 배열 ;
a4) a1) 또는 a2) 에서 선택되는 뉴클레오티드 배열에 1 내지 수 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 뉴클레오티드 배열 ; 및
(b) 이하의 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 :
b1) 배열 번호 27 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 402 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
b2) 배열 번호 51 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 402 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
b3) 배열 번호 57 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 402 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
b4) 배열 번호 61 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 402 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
b5) 배열 번호 65 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 402 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
b6) b1) 내지 b5) 에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열과 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드가 보유하는 뉴클레오티드 배열 ;
b7) b1) 내지 b5) 에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열에 1 내지 수 개의 뉴클레오티드가 치환, 결실 또는 부가된 뉴클레오티드 배열 ;
을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 28 항에 있어서,
배열 번호 41 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 423 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 27 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 402 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 28 항에 있어서,
배열 번호 69 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 423 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 51 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 402 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 28 항에 있어서,
배열 번호 69 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 423 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 57 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 402 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 28 항에 있어서,
배열 번호 69 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 423 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 61 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 402 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 28 항에 있어서,
배열 번호 69 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 423 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 65 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 402 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 28 항에 있어서,
배열 번호 41 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1413 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 27 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 717 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 28 항에 있어서,
배열 번호 69 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1413 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 51 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 717 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 28 항에 있어서,
배열 번호 69 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1413 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 57 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 717 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 28 항에 있어서,
배열 번호 69 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1413 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 61 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 717 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 28 항에 있어서,
배열 번호 69 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1413 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 65 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 717 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 25 항 내지 제 38 항에 기재된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제 25 항 내지 제 38 항에 기재된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질 전환 숙주 세포.
제 39 항에 기재된 벡터를 포함하는 형질 전환 숙주 세포.
제 40 항 또는 제 41 항에 기재된 숙주 세포를 배양하고, 배양 산물로부터 항체를 정제하는 공정을 포함하는 제 2 항, 제 4 항 또는 제 6 항 내지 제 16 항에 기재된 항체의 생산 방법.
배열 번호 20 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 16 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
배열 번호 20 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 16 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 239 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 항체와 경합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 43 항 또는 제 44 항에 있어서,
Papain 소화에 의해 조제된 Fab 프래그먼트가 배열 번호 23 에 기재된 재조합 단백질의 26 번째의 글리신 잔기, 34 번째의 이소류신 잔기, 36 번째의 글루탐산 잔기, 37 번째의 아스파르트산 잔기, 38 번째의 글리신 잔기, 56 번째의 아스파르트산 잔기, 57 번째의 류신 잔기, 58 번째의 류신 잔기, 59 번째의 페닐알라닌 잔기, 61 번째의 류신 잔기 및 62 번째의 아르기닌 잔기와 4 Å 이내의 거리에서 인접하고 있는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 45 항에 있어서,
배열 번호 23 에 기재된 재조합 단백질을 구성하는 각 아미노산 잔기와 Fab 프래그먼트 사이의 거리를, X 선 회절 데이터를 사용한 복합체 구조 해석에 의해 결정하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.