ES2569060T3

ES2569060T3 - Material antioxidante, agente antideterioro, y alimento o bebida

Info

Publication number: ES2569060T3
Application number: ES05822387.6T
Authority: ES
Inventors: Syuichi Fukumoto; Kazutaka Tsuruhami; Shigeharu Mori
Original assignee: Pokka Sapporo Food and Beverage Ltd
Current assignee: Pokka Sapporo Food and Beverage Ltd
Priority date: 2004-12-27
Filing date: 2005-12-27
Publication date: 2016-05-06
Anticipated expiration: 2025-12-27
Also published as: IL178962A0; JPWO2006070810A1; EP1783193B1; AR054419A1; AU2005320635B2; US20070244189A1; EP1783193A1; WO2006070810A1; CN1946830A; EP1783193A4; IL178962A; US20090175996A1; JP4659764B2; US8247002B2; AU2005320635A1

Abstract

Un procedimiento de preparación de un material antioxidante que contiene una aglicona flavonoide y vitamina C, en el que la aglicona flavonoide es eriodictiol y/o diosmetina, caracterizándose dicho procedimiento por: proporcionar una materia prima que contiene un glicósido flavonoide derivado de limones, limas o sudachis; y tratar la materia prima con ß-glicosidasa derivada de Penicillium multicolor para obtener una aglicona flavonoide a partir del glicósido flavonoide en la materia prima.

Description

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Cuando son adultos los que ingieren el primer alimento o bebida, la aglicona puede ingerirse de 0,1 a 10 g, o de 0,5 a 2 g, diarios. En el primer alimento o bebida, si la cantidad de aglicona ingerida es menor que 0,1 g diarios, los efectos antioxidantes ejercidos por los ingredientes eficaces pueden no ser potenciados con eficacia. Por otra parte, resulta poco rentable ingerir la aglicona en una cantidad mayor que 10 g. En el caso de niños, la cantidad de la aglicona ingerida puede ajustarse dependiendo principalmente de sus pesos corporales, y, como guía, puede ser la mitad de la cantidad para adultos. De forma similar, cuando son adultos los que ingieren el primer alimento o bebida, la vitamina C puede ingerirse de 0,1 a 10 g, o de 0,1 a 2 g diarios. En el primer alimento o bebida, si la cantidad de vitamina C ingerida es menor que 0,1 g diarios, los efectos antioxidantes ejercidos por los ingredientes eficaces pueden no ser potenciados con eficacia. Por otra parte, resulta poco rentable ingerir la vitamina C en una cantidad mayor que 10 g. Además, la concentración de vitamina C contenida en el primer alimento o bebida puede ser de 10 ppm o mayor, de 100 ppm al 0,5% en peso, o de 1000 ppm al 0,3% en peso. Si la concentración es menor que 10 ppm, la vitamina C no produce con eficacia el efecto sinérgico con la aglicona, mientras que resulta poco rentable utilizar la vitamina C a una concentración mayor que 0,5% en peso.

Un agente antideterioro puede contener el material antioxidante preparado mediante el procedimiento de la realización. Los ingredientes eficaces, es decir, la aglicona y la vitamina C, del material antioxidante muestran unos efectos inhibidores altos del deterioro. Por tanto, el material antioxidante puede suprimir, de modo eficaz, diversos tipos de deterioro de productos, por ejemplo, el deterioro oxidativo de grasas y aceites, el deterioro de componentes aromatizantes, la descomposición de pigmentos y la pérdida de color de pigmentos. Este agente antideterioro puede utilizarse como agente antideterioro oxidativo para grasas y aceites frente al deterioro térmico y al deterioro oxidativo de aceite vegetal, aceite de pescado y similares. Además, este agente antideterioro puede utilizarse como agente antideterioro para componentes aromatizantes frente al deterioro térmico y al deterioro oxidativo de agentes aromatizantes. Este agente antideterioro puede utilizarse como inhibidor de la pérdida de color para pigmentos frente al deterioro térmico y al deterioro por la luz de los pigmentos naturales.

Un segundo alimento o bebida puede contener el agente antideterioro preparado mediante el procedimiento de la realización y puede tener una propiedad conservante potenciada por los ingredientes activos. El segundo alimento o bebida puede producirse añadiendo vitamina C, por ejemplo, a un alimento o bebida que contenga la aglicona, o un material de estos, o, por el contrario, añadiendo la aglicona, por ejemplo, a un alimento o bebida que contiene vitamina C, o un material de estos. El segundo alimento o bebida puede incluir productos de grasas y aceites, productos de aromatizantes, y productos suplementados con pigmentos. El contenido en aglicona del segundo alimento o bebida puede ser de 10 ppm o mayor, de 100 ppm al 0,5% en peso, o de 1000 ppm al 0,3% en peso. Si el contenido es menor que 10 ppm, puede que el segundo alimento o bebida no produzca el suficiente efecto inhibidor sobre el deterioro, mientras que el uso de la aglicona a un contenido mayor que 0,5% en peso no resulta rentable y puede cambiar considerablemente y el sabor y el aroma del alimento o bebida. Por otra parte, la concentración de vitamina C contenida en el segundo alimento o bebida puede ser igual que en el primer alimento

o bebida.

Las ventajas producidas por las realizaciones se describirán a continuación.

El material antioxidante preparado mediante el procedimiento de la realización contiene la aglicona derivada del cítrico y vitamina C como ingredientes eficaces. Por tanto, este material antioxidante puede utilizarse en una amplia gama de aplicaciones, por ejemplo, alimentos saludables, productos farmacéuticos, cuasifármacos, cosméticos, antioxidantes y agentes que eliminan el oxígeno activo, debido a los efectos antioxidantes altos producidos por los ingredientes eficaces. En este contexto, la aglicona muestra una excelente absorbabilidad in vivo, en especial cuando se ingiere por vía oral, y un efecto antioxidante alto y, por tanto, muestra con facilidad un efecto saludable alto. Cuando este material antioxidante se incluye para su uso en productos farmacéuticos, cuasifármacos o cosméticos, las cantidades de la aglicona y la vitamina C ingerida, administrada o usada por día pueden ser las mismas que las cantidades de la aglicona y la vitamina C ingeridas en la descripción del alimento o bebida descrito anteriormente. Este material antioxidante también puede suprimir con eficacia el deterioro oxidativo de grasas y aceites, el deterior del aroma de los compuestos aromatizantes, y la descomposición o la pérdida de color de pigmentos. Por tanto, este material antioxidante puede añadirse a alimentos o bebidas que contengan grasas y aceites, componentes aromatizantes, o pigmentos, potenciando con facilidad con ello la propiedad conservante del alimento o bebida. Además, este material antioxidante tiene efectos para suprimir el deterioro térmico y el deterioro producido por la propia luz y, como tal, es muy útil y económico.

En especial, cuando la vitamina C con una concentración no menor que 500 ppm, más preferiblemente 1000 ppm, que es mayor que la de la vitamina C contenida en zumo de cítricos, está contenida en el material antioxidante y el alimento o bebida, los efectos antioxidantes se potencian sinérgicamente con facilidad. En general, la vitamina C también está contenida en un glicósido flavonoide que contiene una materia prima que, sin embargo, resulta eliminada durante el desarrollo de la purificación de la aglicona. Por consiguiente, la vitamina C puede mezclarse con la aglicona purificada, produciendo con ello unos efectos antioxidantes significativamente altos.

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En la presente invención, la aglicona se genera con facilidad y de modo adecuado tratando un glicósido flavonoide derivado de un cítrico para formar sus agliconas (tratamiento de glicósidos). También puede utilizarse un tratamiento fermentativo microbiano. En el tratamiento con glicosidasa, la aglicona puede generarse con una eficacia muy alta a partir del glicósido flavonoide empleando la glicosidasa derivada de Penicillium multicolor. Concretamente, la glicosidasa tiene una reactividad enzimática y una especificidad de sustrato significativamente alta por el glicósido flavonoide concreto (eriocitrina o diosmina) contenido en grandes cantidades en los limones, las limas y los sudachis, comparado con las enzimas disponibles en el mercado (enzimas conocidas en la técnica). Por tanto, la glicosidasa puede generar la aglicona con una eficacia muy alta. Por esta razón, el uso de la glicosidasa potencia con facilidad la tasa de conversión del glicósido flavonoide en la aglicona. Por tanto, la aglicona puede producirse con facilidad en grandes cantidades. Además, el coste de producción puede reducirse con facilidad.

Por otra parte, en el tratamiento fermentativo microbiano que emplea el limón fermentado convencional descrito anteriormente, la hesperidina (glicósido) se hidroliza para producir hesperetina (aglicona). Después, se desarrolla una reacción de modificación que añade un grupo hidroxilo a la hesperetina a medida que continúa el tratamiento de fermentación. Por tanto, es muy probable que se produzca una reacción incierta frente a un glicósido flavonoide distinto de la hesperidina, por ejemplo, una reacción de modificación análoga y una reacción que descomponga el glicósido, bajo las condiciones para el tratamiento fermentativo microbiano para producir el limón fermentado convencional. Por consiguiente, es difícil obtener una aglicona de interés con alto rendimiento. Por contraste, el tratamiento fermentativo microbiano puede iniciarse inoculando la materia prima con esporas o hifas de un microorganismo del género Aspergillus y terminarse antes de que se complete la posterior formación de esporas del microorganismo. Por tanto, puede realizarse con facilidad una transformación microbiana principalmente con las hifas vegetativas del microorganismo. Por tanto, la aglicona puede obtenerse con facilidad con un rendimiento alto terminando el tratamiento fermentativo microbiano antes de que se produzca la reacción de modificación, tal como una reacción de hidroxilación, o una reacción de descomposición. En general, es casi imposible generar la aglicona solo exprimiendo el zumo de un fruto cítrico o mediante extracción desde el fruto. Además, es casi imposible generar la aglicona en etapas de procesamiento distintas de los tratamientos para formar las agliconas.

Puede obtenerse una gran cantidad de glicósido flavonoide con mucha facilidad utilizando un residuo de zumo exprimido de un fruto cítrico del cual ya se ha exprimido el zumo, comparado con la utilización de zumo de cítricos. Como alternativa, puede obtenerse una gran cantidad de glicósido flavonoide con mucha facilidad utilizando un extracto de glicósido flavonoide extraído del resto de zumo exprimido como la materia prima que contiene el glicósido flavonoide, comparado con la utilización de zumo de cítricos. Puesto que una gran cantidad del residuo del zumo exprimido se desecha cuando, por ejemplo, se produce una bebida que contiene el zumo de cítrico, el residuo de zumo exprimido resulta disponible a unos precios muy bajos. Además, el uso del residuo de zumo exprimido es lo más preferido a la luz de la ley de reciclaje de alimentos.

El segundo alimento o bebida que contiene el material antioxidante preparado mediante el procedimiento de la invención puede tener una propiedad conservante significativamente excelente, debido al alto efecto inhibidor sobre la descomposición producida por los ingredientes eficaces en el material antioxidante. Por tanto, este alimento o bebida puede suprimir la reducción en la calidad con una eficacia significativa. Por consiguiente, es posible almacenarlo a lo largo de un periodo de tiempo más largo, y también es posible determinar un nuevo periodo de conservación de la calidad que sea mucho mayor. Esto contribuye en gran medida a la reducción de los costes, porque la cantidad de alimentos o bebidas que se desechan debido a que han excedido el periodo de conservación de la calidad se puede reducir con mucha facilidad. Es necesario que la conservación de la calidad después de la producción de alimentos o bebidas dependa menos, por ejemplo, del control de la temperatura a temperaturas bajas. Por otra parte, este alimento o bebida puede contener los ingredientes eficaces derivados de un producto natural y tener una absorbabilidad in vivo significativamente excelente. Por tanto, es fácil utilizar el alimento o bebida como aditivo alimentario.

Ejemplo 1 -Preparación de la muestra 1: Producción de una aglicona mediante un tratamiento con glicosidasa

Un residuo de zumo exprimido de limón se sumergió en una cantidad 10 veces mayor (en peso) de metanol durante 24 horas para obtener con ello un extracto de glicósido flavonoide de limón. El extracto obtenido se condensó a presión reducida con un evaporador y después se adsorbió sobre una resina Amberlite (XAD16; fabricada por Organo) para eliminar la pectina, los carbohidratos, etc., en la mayor medida posible. Se condensó un eluato eluido de este con metanol hídrico al 40% y se liofilizó para obtener con ello un polvo de la mezcla de glicósido flavonoide de limón (glicósido de limón del ejemplo comparativo 1). Este polvo contiene aproximadamente 30% de eriocitrina y aproximadamente de 2 a 5% de diosmina. Este glicósido de limón del ejemplo comparativo 1 se disolvió en agua, y se purificó la eriocitrina empleando el sistema de fraccionamiento de HPLC 1 descrito a continuación en la condición de HPLC 1 descrita a continuación. La eriocitrina purificada después se condensó y se liofilizó para obtener con ello un polvo de eriocitrina (eriocitrina del ejemplo comparativo

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Sistema de fraccionamiento de HPLC 1

Bomba: Shimadzu LC-8A, Controlador del sistema: Shimadzu SCL-8A, Autoinyector: Shimadzu SIL-8A, Detector: Shimadzu SPD-8A (detector espectrofotométrico de UV), Recolector de fracciones: Shimadzu FCV-100B

Condición de HPLC 1

Columna: YMC-Pack ODS-A (50 d.i. x 250 mm), Eluyente: metanol/agua= 50/50 (en v/v), Caudal: 100 ml/min, Longitud de onda de detección: 270 nm

Tratamiento con glicosidasa de eriocitrina y diosmina

La eriocitrina del ejemplo comparativo 2 o la diosmina fabricada por Wako Pure Chemical Industries se disolvieron a una concentración final de 5 mM en tampón acetato-ácido clorhídrico 20 mM. Se produjo una disolución de glicósido cuyo pH se ajusta a 3,0 por medio del tampón, y una disolución de glicósido cuyo pH se ajusta a 5,0 por medio del tampón. Debido a que la diosmina es refractaria al agua, la disolución de glicósido se produjo después de disolver la diosmina antes en sulfóxido de dimetilo. Estas disoluciones de glicósido se suplementaron con 100 ppm o 10 ppm de β-glicosidasa para producir disoluciones de reacción que, a su vez, se sometieron a un tratamiento con glicosidasa con agitación con un agitador a aproximadamente 30 °C. La β-glicosidasa es una enzima con actividad enzimática de descomposición de β-primeverósido, que se ha sido purificada de una cepa de Penicillium multicolor IAM 7153 por los presentes inventores utilizando un color desarrollado a partir de pNP como marcador, y tiene una actividad β-glicosidasa de 173 unidades/g. Una unidad define la cantidad de enzima capaz de hidrolizar pNPP para liberar 1 mmol de pNP a 30 °C durante 1 minuto. Se formaron muestras de partes alícuotas de varios mililitros a partir de las disoluciones de reacción después de 0, 0,5, 1, 2, 4, 5, y 8 horas después de la adición de la glicosidasa. Las muestras se calentaron a 95 °C durante 10 minutos para inactivar la enzima. Las muestras resultantes se enfriaron con rapidez y se crioconservaron. Las muestras obtenidas se analizaron empleando el sistema de análisis de HPLC 2 descrito a continuación en la condición de HPLC 2 para confirmar los cambios en la concentración de cada sustancia provocados por el tratamiento con glicosidasa. Los resultados se muestran en las figuras 1 a 4.

Sistema de análisis de HPLC 2

Bomba: Shimadzu LC-10AD, Controlador del sistema: Shimadzu SCL-10A, Autoinyector: Shimadzu SIL-10A, Detector: Shimadzu SPD-10A (detector espectrofotométrico de UV), Horno de la columna: Shimadzu CTO-10A

Condición de HPLC 2

Columna: YMC-Pack ODS-A (4,6 d.i. x 250 mm), Eluyente: metanol/agua = 40/60 (en v/v), Caudal: 1 ml/min, Longitud de onda de detección: 270 nm

Tal como puede observarse en las figuras 1 a 4, se observa una disminución rápida en la concentración con ambas eriocitrina (figuras 1 y 2) y diosmina (figuras 3 y 4) inmediatamente después de la adición de la glicosidasa, y se confirmó la generación de sus respectivas agliconas, eriodictiol y diosmetina. Se obtuvieron unas tasas de conversión tan altas como de aproximadamente 50 al 60% para la conversión de eriocitrina a eriodictiol, y de aproximadamente 80% para la conversión de diosmina a diosmetina. Este resultado demuestra que la presente enzima estimula la conversión a la aglicona con una eficacia muy alta sin pérdida. Se confirmó que la conversión a la aglicona se desarrolla con casi la misma eficacia en la disolución de pH 5,0, que está dentro del intervalo de pH óptimo de la glicosidasa, y en la disolución de pH 3,0 con casi la misma eficacia. Por ejemplo, el pH de los zumos de limón, lima y sudachi y el pH de la disolución de glicósido flavonoide extraído están cerca de 3. Por tanto, se confirmó que la actividad enzimática de la presente enzima casi no resultó afectada en los zumos de limón, lima y sudachi, o una disolución de glicósido flavonoide obtenida a partir de cualquiera de estos, y que la presente enzima puede utilizarse en estas disoluciones. Aunque se añadan 10 ppm de la glicosidasa, se demostró que la conversión a la aglicona se desarrolla suficientemente en un tiempo suficiente. En el tratamiento descrito a continuación, se realizó una investigación con respecto al tiempo de tratamiento, con la adición de 10 ppm de β-glicosidasa por mM de sustrato como guía.

Conversión del flavonoide de limón a la aglicona y su purificación

El glicósido de limón del ejemplo comparativo 1 se disolvió en una concentración final de eriocitrina de1 mM en tampón acetato de sodio-ácido clorhídrico 20 mM. Se produjo una disolución de glicósido cuyo pH se ajusta a 3,0 por medio del tampón, y una disolución de glicósido cuyo pH se ajusta a 5,0 por medio del tampón. Estas disoluciones de glicósido se suplementaron con 10 ppm de β-glicosidasa para producir disoluciones de reacción que, a su vez, se sometieron a un tratamiento con glicosidasa con agitación con un agitador a aproximadamente

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empleando el sistema de análisis de HPLC 2 descrito en la condición de HPLC 3. En el procedimiento de evaluar la actividad captadora de radicales, se considera que la cantidad de DPPH que permanece en la muestra de la sección de ensayo sin glicósido ni aglicona (control) es el 100%. Además, se midió la cantidad DPPH que permanece en la disolución de reacción suplementada con cada muestra y se indica mediante el porcentaje (%) 5 con respecto a la cantidad de DPPH en la sección de control. Debido a que la actividad captadora de radicales de la sección suplementada con eriodictiol y vitamina C es casi del 100%, el ensayo se volvió a realizar con la cantidad de la muestra reducida a la mitad. Concretamente, se disolvieron eriodictiol y vitamina C a una concentración de 500 ppm cada uno en un disolvente para producir una disolución acuosa; una parte alícuota de 50 l de esta después se suplementó con 1 ml de tampón Tris 0,1 M. Se midió la actividad captadora de radicales

10 de la disolución resultante como se describió anteriormente. El valor numérico obtenido se dobló para corregir con ello los datos. El resultado se muestra en la tabla 1.

Sistema de análisis de HPLC 2

15 Condición de HPLC 3

Columna: TSK-GEL octil-80Ts (4,6 d.i. x 150 mm), Eluyente: metanol/agua = 30/70 (v/v), Caudal: 1 ml/min, Longitud de onda de detección: 517 nm

Tabla 1

Actividad captadora de radicales DPPH: Tasa de inhibición frente a la oxidación de linoleato de metilo

Control: 0,00% 0,00%

Glicósido de limón: 6,18% 7,11%

Glicósido de limón + vitamena C: 24,18% 17,59%

Aglicona tratada con enzimas: 15,97% 14,19%

Aglicona tratada con enzimas vitamina C: + 35,91% 25,44%

Eriocitrina: 28,64% 8,00%

Eriocitrina + vitamina C: 51,09% 18,77%

Eriodictiol: 75,70% 20,99%

Eriodictiol + vitamina C: 101,10% 32,53%

Neoeriocitrina: 30,70% 9,24%

Vitamina C: 14,00% 8,32%

-tocoferol: 44,82% 16,97%

20 Tal como puede observarse en la tabla 1, la aglicona tratada con enzimas, la eriocitrina, y el eriodictiol tienen una alta actividad antioxidante principalmente bajo condiciones de sistemas acuosos. La actividad antioxidante de la aglicona tratada con enzimas, la eriocitrina, y el eriodictiol resultó notablemente potenciada en las secciones suplementadas cuando se mezclaron con la vitamina C. Además, se demostró que la actividad antioxidante de la aglicona tratada con enzimas, la eriocitrina, y el eriodictiol resultó también sinérgicamente potenciada en el

25 glicósido de limón cuando se mezclan con la vitamina C. La eriocitrina o el eriodictiol purificados suplementados con vitamina C mostraron un efecto sinérgico en casi la misma tasa que la del glicósido de limón o de la aglicona tratada con enzimas suplementados con vitamina C. Por consiguiente, se confirmó que el efecto sinérgico observado en el glicósido de limón y la aglicona tratada con enzimas se atribuye al efecto sinérgico de la eriocitrina

o el eriodictiol y la vitamina C. Por tanto, se demostró que un material antioxidante en el que cualquiera de estas

30 flavanonas se mezcla con la vitamina C tiene una actividad antioxidante muy alta y es útil como material antioxidante que suprime el deterioro provocado por la oxidación. Cuando la aglicona tratada con enzimas o, con el

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el desarrollo de la autoxidación. Se añade un reactivo de ácido tiobarbitúrico (TBA) para generar una sustancia roja (sustancia positiva a TBA), un producto de la reacción de aldehídos. Su grado de coloración se midió con un espectrofotómetro a λ = 535 nm y se empleó para determinar la tasa de oxidación de la membrana liposómica (%).

Como resultado, la tasa de oxidación de la membrana liposómica fue del 60,54% para el glicósido de limón del ejemplo comparativo 1, mientras que la tasa de oxidación de la membrana liposómica fue del 11,56% para la aglicona tratada con enzimas del ejemplo de ensayo 1. Por consiguiente, se demostró que la aglicona tratada con enzimas produce una alta actividad antioxidante. La tasa de oxidación es del 76,87% para α-tocoferol. La tasa de oxidación de la membrana liposómica fue del 9,52% y 6m80% para la eriocitrina del ejemplo comparativo 2 y el eriodictiol, respectivamente. Así, se demostró que la aglicona de limón y el eriodictiol ejercen un efecto antioxidante alto en una biomembrana y son útiles como inhibidores de la oxidación de biomembranas que erradican las lesiones oxidativas de las superficies de membranas celulares en organismos.

Mediciones de la tasa de eliminación del oxígeno activo

Se mezcló la xantina oxidasa (0,5 ml (5,6 unidades)) con 0,3 ml de xantina 1 mM (fabricada por Wako Pure Chemical Industries), 0,3 ml de nitro azul de tetrazolio 0,25 mM (fabricado por Wako Pure Chemical Industries), y 2,3 ml de tampón carbonato de sodio 0,05 M (pH 10,2). Las xantina oxidasa empleada es un reactivo (fabricado por Wako Pure Chemical Industries) diluido en 100 veces con tampón carbonato de sodio 0,05 M. La mezcla se suplementó con 0,1 ml (concentración: 1000 ppm) del glicósido de limón del ejemplo comparativo 1 o de la aglicona tratada con enzimas del ejemplo de ensayo 1 y se incubó. Debido a que se produce azul de formazano en el tiempo de incubación, se midió la absorbancia a λ = 560 nm utilizando un espectrofotómetro (espectrofotómetro HITACHI U2000) después de 3 minutos de incubación. Se empleó una sección de ensayo sin la adición de la muestra (glicósido y aglicona) como control. Como blanco, se añadió tampón carbonato de sodio en lugar de la xantina oxidasa para realizar los mismos procedimientos. El valor obtenido restando la absorbancia del ensayo del blanco de la absorbancia de la disolución suplementada con cada muestra se dividió entre la absorbancia del control para determinar con ello una tasa de eliminación del oxígeno activo (%). Como resultado, la tasa de eliminación de oxígeno activo fue del 26,7% para el glicósido de limón del ejemplo comparativo 1, mientras que la tasa de eliminación del oxígeno activo fue del 74,8% para la aglicona tratada con enzimas del ejemplo de ensayo

1. Por consiguiente, se demostró que la aglicona tratada con enzimas produce una alta actividad antioxidante. La tasa de oxidación es del 238,2% para α-tocoferol. Así, se demostró que la aglicona de limón tiene una alta capacidad para eliminar el oxígeno activo y es útil como agente de eliminación del oxígeno activo in vivo.

Ejemplo de referencia 2 -Preparación de la muestra 2: Producción de la aglicona mediante un tratamiento fermentativo microbiano

Una cepa de Aspergillus saitoi IAM 2210 precultivada por adelantado a 30 °C durante una semana en un medio de caldo de cultivo de dextrosa de patata en la oscuridad se inoculó sobre un residuo de zumo exprimido de limones para realizar el tratamiento fermentativo microbiano bajo condiciones de temperatura constante a 30 °C durante 10 días. Después, el residuo de zumo exprimido de limón que contenía la cepa se sumergió en 10 veces (en peso) de metanol durante 24 horas para obtener con ello un extracto de aglicona de limón. El extracto obtenido se condensó a presión reducida con un evaporador y después se adsorbió sobre una resina de Amberlite (XAD16) para retirar la pectina, los carbohidratos, etc., en la mayor medida posible. Se condensó un eluato eluido de este con metanol hídrico al 40% y se liofilizó para obtener con ello un polvo de aglicona de limón tratada con fermentación (aglicona tratada con fermentación del ejemplo comparativo 3). Se analizó la composición (contenido) del flavonoide contenido en cada uno del glicósido de limón del ejemplo comparativo 1 y la aglicona tratada con fermentación del ejemplo comparativo 3 empleando el sistema de análisis de HPLC 2 descrito a continuación bajo la condición de HPLC 5 descrita a continuación. El resultado se muestra en la tabla 2. En la tabla 2, "traza" significa que la sustancia casi no pudo detectarse bajo la condición de HPLC 5 descrita a continuación, y "nd" significa que la sustancia fue indetectable bajo la condición de HPLC 5 descrita a continuación.

Sistema de análisis de HPLC 2

Condición de HPLC 5

Columna: YMC-Pack ODS-A (4,6 d.i. x 250 mm), Eluyente: metanol/agua = 30/70 (v/v), Caudal: 1 ml/min, Longitud de onda de detección: 270 nm

Tabla 2

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A. saitoi IAM 2210: 0,00 1,70 1,89

Todas las mediciones se indican en las unidades mencionadas anteriormente.

Tal como puede observarse en la tabla 3, se demostró que casi todas las cepas poseían una fuerte actividad βglicosidasa atribuible a la glicosidasa de referencia en el momento que terminó la formación de esporas (muestras de disolución de enzima 2 y 3). Debido a que las cepas de A. awamori y A. shirousamii IAM 2414 tienen una actividad β-glicosidasa potente en el sobrenadante del cultivo en el momento de iniciarse la formación de esporas (muestra de disolución de enzima 1), se descubrió que las disoluciones de cultivo de estas cepas pueden utilizarse como enzimas para el tratamiento con glicosidasa mediante esterilización y filtración. Debido a que, por ejemplo, la actividad hidrolasa es extremadamente débil en este momento del inicio de la formación de esporas, es menos probable que se produzca la descomposición y otras reacciones de transformación microbianas de la aglicona generada. Por tanto, es posible obtener la aglicona con más eficacia. Cuando el tratamiento fermentativo microbiano se realiza utilizando estas cepas de A. awamori y A. shirousamii IAM 2414, puede suponerse con facilidad que su periodo de fermentación microbiana puede acortarse fácilmente, comparado con la utilización de otras cepas. Por el contrario, también se descubrió que otras cepas, tales como las cepas de A. niger (en especial, ATCC 10549), que muestran menos actividad β-glicosidasa extracelular, pero que sí tienen una alta actividad intracelular, son adecuadas para su uso en el tratamiento fermentativo microbiano.

Ensayo del efecto inhibidor del deterioro del componente aromatizante

Una disolución acuosa ajustada a Brix 4,8 y pH 3,0 mediante el uso de glucosa y ácido cítrico se suplementó con 0,1% de una esencia de limón (fabricada por Takasago International) para preparar una disolución de jarabe. Se preparó una sección suplementada con muestra o sin muestra de esta disolución de jarabe con o sin la adición del glicósido de limón del ejemplo comparativo 1, la aglicona tratada con fermentación del ejemplo comparativo 4 (indicada mediante la denominación aglicona en la tabla 4), o vitamina C. Estas secciones se sometieron a una pasteurización ultrarrápida calentando hasta 87 °C y después se introdujeron en botellas de PET incoloro transparente. Se añadió el glicósido de limón del ejemplo comparativo 1 de modo que su concentración en eriocitrina se llevó hasta la concentración añadida mostrada en la tabla 4. También se añadió la aglicona tratada con fermentación del ejemplo comparativo 4, de modo que su concentración final de eriodictiol se lleva hasta la concentración añadida mostrada en la tabla 4. Además, se estudió si la adición o no de la aglicona tratada con fermentación del ejemplo comparativo 4 afectaba al aroma de la disolución de jarabe completa, y se determinó que la adición de eriodictiol a 30 ppm o menos no afectaba al aroma en gran medida. Se empleó una muestra para cada una de estas secciones para realizar los ensayos de deterioro por calentamiento y radiación ultravioleta tal como se describe a continuación.

Ensayo de deterioro por calentamiento: Ensayo 1-1 (30 ppm) y ensayo 1-2 (3 ppm)

Una muestra de cada sección se dejó sin tratar y se conservó a 60 °C o 4°C (refrigeración) durante 4 días en la oscuridad, seguido de la evaluación sensorial por 12 panelistas bien entrenados. En el procedimiento de evaluación, los panelistas evaluaron las respectivas puntuaciones de las secciones, y la muestra conservada mediante refrigeración puntúa como la puntuación máxima de 5, para determinar una puntuación promedio. Los mismos panelistas realizaron cuatro ensayos de evaluación sensorial en el mismo día. El resultado se muestra en la tabla 4.

Ensayo de deterioro por radiación ultravioleta: Ensayo 2-1 (30 ppm) y ensayo 2-2 (3 ppm)

Una muestra de cada sección se conservó mediante refrigeración bajo condiciones de radiación ultravioleta (UV) (6 horas de radiación), con una cámara de exposición a luz ultravioleta de larga vida (fabricada por Suga Test Instruments) o en la oscuridad, seguido de la evaluación sensorial por 12 panelistas bien entrenados. En el procedimiento de evaluación, los panelistas proporcionaron las respectivas puntuaciones para las secciones, y la muestra conservada en la oscuridad puntúa como la puntuación máxima de 5, para determinar una puntuación promedio. Los mismos panelistas realizaron cuatro ensayos de evaluación sensorial en el mismo día. El resultado se muestra en la tabla 4.

Tabla 4

Condición de ensayo: Concentración añadida Puntuación promedio de la evaluación sensoriual

Frescura: Jugosidad Intensidad del Evaluación

aroma: global

Ensayo 1-1 60 ºC 4 días: Sección sin muestra - 2,0 2,2 2,1 2,1

Glicósido de limón: 30 ppm 3,0 3,0 2,8 3,0

Aglicona: 30 ppm 4,1 4,1 4,5 4,2

Aglicona Vitamina C: 30 ppm 30 ppm 4,2 4,3 4,5 4,4

Ensayo 1-2 60 ºC 4 días: Sección sin muestra - 2,0 2,2 2,1 2,2

Glicósido de limón: 3 ppm 3,2 3,2 3,0 3,2

Aglicona: 3 ppm 3,8 3,9 4,2 4,0

Aglicona Vitamina C: 3 ppm 3 ppm 4,0 4,0 4,3 4,2

Ensayo 2-1 UV 6 horas: Sección sin muestra - 2,0 2,2 2,1 2,2

Glicósido de limón: 30 ppm 3,2 3,8 3,6 3,5

Aglicona: 30 ppm 4,0 4,0 4,5 4,1

Aglicona Vitamina C: 30 ppm 30 ppm 4,1 4,1 4,6 4,4

Ensayo 2-2 UV 6 horas: Sección sin muestra - 2,4 2,4 2,4 2,6

Glicósido de limón: 3 ppm 3,2 3,2 3,8 3,5

Aglicona: 3 ppm 3,8 3,8 4,3 4,0

Aglicona Vitamina C: 3 ppm 3 ppm 4,0 4,0 4,3 4,2

Tal como puede observarse en la tabla 4, cuando se conservan a un temperatura cálida de 60 °C durante 4 días, la sección suplementada con glicósido de limón recibe mejores puntuaciones que las de la sección sin muestra en todas las categorías de evaluación, y la sección suplementada con aglicona tratada con fermentación recibe 5 mejores puntuaciones que las de la sección suplementada con glicósido de limón en todas las categorías de evaluación, y se puntuó como que producía un efecto notable en la intensidad del aroma. La sección suplementada con la aglicona tratada con fermentación y con vitamina C recibió mejores puntuaciones que las de la sección suplementada solo con la aglicona tratada con fermentación en todas las categorías de evaluación en el ensayo 11 y el ensayo 1-2. Aunque se evaluó de la misma manera una sección suplementada con muestra con la adición

10 del glicósido o la aglicona a una concentración de 1 ppm, los panelistas no observaron diferencias significativas en la evaluación sensorial. Estos resultados demuestran que la adición de eriocitrina o eriodictiol a una concentración de 3 ppm o mayor a la disolución de jarabe produce un significativo efecto inhibidor sobre el deterioro del aroma provocado por el calentamiento, y que la adición de eriocitrina o eriodictiol junto con vitamina C potencia notablemente el efecto.

5

10

15

20

25

30

35

Por otra parte, cuando se someten a la radiación ultravioleta, la sección suplementada con glicósido de limón recibe mejores puntuaciones que las de la sección sin muestra en todas las categorías de evaluación, y la sección suplementada con aglicona tratada con fermentación recibe mejores puntuaciones que las de la sección suplementada con glicósido de limón en todas las categorías de evaluación, y se demostró que tenía un efecto inhibidor sobre el deterioro del aroma provocado por la radiación ultravioleta. La sección suplementada con la aglicona tratada con fermentación y con vitamina C recibió igual o mejor puntuación que las de la sección suplementada solo con la aglicona tratada con fermentación en todas las categorías de evaluación en el ensayo 21 y en el ensayo 2-2. Estos resultados demuestran que la adición de aglicona de limón a una concentración de 3 ppm o mayor a la disolución de jarabe ejerce unos efectos inhibidores significativos sobre el deterioro del aroma provocado por la radiación ultravioleta.

Cuando se compara entre el ensayo 1 y el ensayo 2, parece existir una tendencia a suprimir con eficacia el deterioro por la radiación ultravioleta, más que por el calentamiento, aunque depende de las condiciones de ensayo. Los panelistas indicaron en sus respuestas que las secciones suplementadas con muestra tienen un regusto refrescante en general. Así, se confirmó que la adición de vitamina C preparada por separado a la aglicona tratada con fermentación del ejemplo comparativo 4 muestra unos efectos mucho mayores que el total de sus efectos individuales y produce un efecto sinérgico. Cuando el eriodictiol preparado por separado se añade a un alimento o bebida que contiene vitamina C, por ejemplo, zumo, puede suponerse con facilidad que se esperan unos efectos inhibidores sobre el deterioro más potentes que los efectos inhibidores sobre el deterioro esperados de la cantidad añadida de eriodictiol .

Ensayo del efecto inhibidor de la pérdida de color de un pigmento

Una disolución acuosa ajustada a Brix 4,8 y pH 3,0 mediante el uso de glucosa y ácido cítrico se suplementó con 0,1% en peso de un pigmento de antocianina (pigmento de repollo rojo) para preparar una disolución de jarabe. Se preparó una sección suplementada con muestra o sin muestra de esta disolución de jarabe con o sin la adición de la aglicona tratada con fermentación del ejemplo comparativo 4 a una concentración de eriodictiol de 30 ppm o ambas la aglicona y la vitamina C. Estas secciones se sometieron a una pasteurización ultrarrápida calentando hasta 87 °C y después se introdujeron en botellas de PET incoloro transparente. Después, una muestra de cada una de estas secciones se irradia con rayos ultravioleta durante 8 horas y después se conserva mediante refrigeración o se conserva calentando a 45 °C en la oscuridad durante 2 semanas. Se midió la absorbancia a A = 460 nm con un espectrofotómetro (espectrofotómetro HITACHI U2000) para determinar la tasa de pigmento remanente (%). El resultado se muestra en la tabla 5.

Tabla 5

Concentración añadida: Porcentaje de pigmento residual (%)

UV 8 horas: 45 ºC, 2 semanas

Sección sin muestra: - 11,48 40,98

Aglicona: 30 ppm 41,81 67,23

Aglicona Vitamina C: 30 ppm 30 ppm 53,21 75,32

Tal como puede observarse en la tabla 5, los efectos inhibidores del deterioro de los componentes de pigmentos naturales extraídos de verduras, por ejemplo, antocianina y carotenoide, mejoraron mediante la adición de la aglicona de limón y mejoraron significativamente mediante la adición de la aglicona de limón simultáneamente con la vitamina C. Además, los efectos se produjeron en especial con respecto a la irradiación con ultravioleta, y la aglicona tratada con fermentación y la vitamina C son útiles para inhibir el deterioro de la materia colorante natural.

Claims

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