ES2566830T3

ES2566830T3 - Péptido capaz de extender la semivida de péptido de interés en plasma

Info

Publication number: ES2566830T3
Application number: ES09750669.5T
Authority: ES
Inventors: Naomi Wakabayashi; Seiji Sato
Original assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Current assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 2008-05-23
Filing date: 2009-05-22
Publication date: 2016-04-15
Anticipated expiration: 2029-05-22
Also published as: PL2277890T3; US8551937B2; EP2277890B1; EP2277890A4; US20100305031A1; BRPI0904622A2; SI2277890T1; JPWO2009142307A1; HRP20160303T1; KR20100038236A; KR101350251B1; CY1117478T1; CN101809029A; CN101809029B; DK2277890T3; CA2698582A1; PT2277890E; HUE028539T2; JP5524049B2; WO2009142307A1

Abstract

Un péptido quimérico, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID: 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 118, 119, 120, 121, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 139, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 154, 155, 156, 157 o 158.

Description

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La composición farmacéutica según el punto 37, en donde el péptido objeto en el péptido quimérico es un péptido natriurético auricular o un derivado del mismo. Punto 39:

5 La composición farmacéutica según el punto 38, en donde es para el tratamiento de enfermedades seleccionadas de insuficiencia cardiaca aguda, insuficiencia cardiaca crónica, arterioesclerosis obliterante, cardiopatía isquémica, hipertensión, edema, miocardiopatía, retinitis, enfermedad renal diabética, nefroesclerosis e infarto de miocardio.

10 Punto 40: La composición farmacéutica según el punto 37, en donde el péptido objeto en el péptido quimérico es un péptido natriurético de tipo C o un derivado del mismo. 15 Punto 41: La composición farmacéutica según el punto 40, en donde es para el tratamiento de enfermedades seleccionadas de condrodisplasia atípica, restenosis después de PTCA después de estenosis de arteria coronaria, hipertensión pulmonar, enfermedad obliterante de la arteria periférica, artrosis, artritis reumatoide, fibrosis pulmonar, fibrosis

20 hepática, fibrosis renal, infarto de miocardio y miocarditis. Punto 42: La composición farmacéutica según el punto 37, en donde el péptido objeto en el péptido quimérico es motilina o un

25 derivado de la misma. Punto 43: La composición farmacéutica según el punto 42, en donde es para el tratamiento de enfermedades seleccionadas de

30 dispepsia funcional, esofagitis por reflujo, parálisis de motilidad gástrica diabética, síndrome del intestino irritable de tipo estreñimiento, pseudoíleo crónico, íleo posoperatorio, gastritis crónica y gastritis atrófica. Punto 44:

35 Un proceso para producir un péptido quimérico donde la semivida en plasma se extiende comparada con el péptido objeto y está disponible una actividad fisiológica del péptido objeto, caracterizado en que, un péptido seleccionado del grupo que consiste en los péptidos mencionados en cualquiera de los puntos 1 a 30 se une al N terminal, C terminal o ambos del péptido objeto.

40 Punto 45: El proceso según el punto 44, en donde un péptido seleccionado del grupo que consiste en los péptidos mencionados en cualquiera de los puntos 1 a 30 se une al N terminal del péptido objeto. 45 Punto 46: El proceso según el punto 44, en donde un péptido seleccionado del grupo que consiste en los péptidos mencionados en cualquiera de los puntos 1 a 30 se une al C terminal del péptido objeto. 50 Punto 47: El proceso según el punto 44, en donde un péptido seleccionado del grupo que consiste en los péptidos mencionados en cualquiera de los puntos 1 a 30 se une a ambos terminales del péptido objeto. 55 Punto 48: El proceso según cualquiera de los puntos 44 a 47, en donde el péptido objeto es un péptido natriurético o motilina o derivados de los mismos. 60 Punto 49: El proceso según el punto 48, en donde el péptido objeto es un péptido natriurético auricular o un derivado del mismo. 65 Punto 50:

El proceso según el punto 48, en donde el péptido objeto es un péptido natriurético de tipo C o un derivado del mismo.

Punto 51: 5 El proceso según el punto 48, en donde el péptido objeto es motilina o un derivado de la misma.

Punto 52:

10 Un método para el tratamiento de una enfermedad que se puede tratar por el péptido objeto contenido en una composición farmacéutica, que comprende la administración de la composición farmacéutica seleccionada de las composiciones farmacéuticas mencionadas en cualquiera de los puntos 36 a 43 a un individuo.

Punto 53:

15 El método para el tratamiento según el punto 52, en donde la composición farmacéutica es la composición farmacéutica mencionada en el punto 37.

Punto 54:

20 El método para el tratamiento según el punto 53, en donde la composición farmacéutica es la composición farmacéutica mencionada en el punto 38.

Punto 55:

25 El método para el tratamiento según el punto 54, en donde la enfermedad es una enfermedad seleccionada de insuficiencia cardiaca aguda, insuficiencia cardiaca crónica, arterioesclerosis obliterante, cardiopatía isquémica, hipertensión, edema, miocardiopatía, retinitis, enfermedad renal diabética, nefroesclerosis e infarto de miocardio.

30 Punto 56:

El método para el tratamiento según el punto 53, en donde la composición farmacéutica es la composición farmacéutica mencionada en el punto 40.

35 Punto 57:

El método para el tratamiento según el punto 56, en donde la enfermedad es una enfermedad seleccionada de condrodisplasia, restenosis después de PTCA después de estenosis de arteria coronaria, hipertensión pulmonar, enfermedad obliterante de la arteria periférica, artrosis, artritis reumatoide, fibrosis pulmonar, fibrosis hepática,

40 fibrosis renal, infarto de miocardio y miocarditis.

Punto 58:

El método para el tratamiento según el punto 53, en donde la composición farmacéutica es la composición 45 farmacéutica mencionada en el punto 42.

Punto 59:

El método para el tratamiento según el punto 58, en donde la enfermedad es una enfermedad seleccionada de 50 dispepsia funcional, esofagitis por reflujo, parálisis de motilidad gástrica diabética, síndrome del intestino irritable de tipo estreñimiento, pseudoíleo crónico, íleo posoperatorio, gastritis crónica y gastritis atrófica.

Punto 60:

55 Un método para la extensión de la semivida en plasma del péptido objeto, caracterizado en que, el péptido seleccionado de los péptidos mencionados en cualquiera de los puntos 1 a 30 se une al N terminal, C terminal o ambos del péptido objeto.

Punto 61:

60 El método según el punto 60, en donde un péptido seleccionado del grupo que consiste en los péptidos mencionados en cualquiera de los puntos 1 a 30 se une al N terminal del péptido objeto.

Punto 62: 65

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Además, cualquier aminoácido puede estar presente entre el grupo de aminoácidos básicos y E (Glu) en RKESKK como se muestra en motilina quimérica (Z) (MG-i17G), (I) (MG-i19G), (II) (MG-i17G2) , (III) (MG-i17G2-i19G), (IV) (MG-dPP), (V) (MG-dPPH1), (VI) (MG-H1), (VII) (MG-H3), (VIII) (MGH4), (XI) (MG-d12/14), (XII) (MGP1), (XIII) (MGP)2 etc., y CNP quimérico (K). Por ejemplo, se puede hacer que existan G, A, Y, SP y/o V entre el grupo de

5 aminoácidos básicos (parte correspondiente a RK) y E y, entre E y el grupo de aminoácidos básicos (parte correspondiente a KK), se puede hacer que exista S, H y/o P.

En vista de lo anterior, la estructura B (secuencia central: parte RKESKK para ser humano) necesaria para una acción de extensión de semivida tiene, en primer lugar, una secuencia representada por la siguiente fórmula 2 10 Fórmula 2: Wk-Xl-Y-Zm-Wn

En la fórmula, W es un aminoácido básico; X y Z es cada uno cualquier aminoácido; e Y es un aminoácido ácido. cada uno de k, l, m y n es 0 o un número natural, k es 1 o 2, 4 ≥ l ≥ 0, 2 ≥ m ≥ 0 (donde l y m son 4 ≥ l + m ≥ 0) y n es 15 1 o 2.

Como se muestra en motilina quimérica (Y) (MG-BR), el modo de alineamiento de RKESKK se puede invertir (KKSEKR).

20 Además, como se muestra en motilina quimérica (XII) (MGP1) y (XIII) (MGP2), puesto que se potencia una acción de extensión de la semivida cuando la secuencia central se alinea en dos tándems (tal como KKAYSPK + ERK), también es un medio eficaz en alcanzar extensión de la semivida más larga que secuencias centrales plurales estén disponibles en una molécula como se muestra por la siguiente fórmula.

25 Según esto, la estructura (secuencia central: parte RKESKK) necesaria para una acción de extensión de semivida se expresa por la siguiente fórmula 1:

Fórmula 1: (Wk-Xl-Y-Zm-Wn) + (Wo-Xp-Y-Zq-Wr)s

30 En la fórmula, W, X, Y, Z, K, l, m y n son los mismos que esos en la anterior fórmula 2 y s es 0 o 1. Además, o, p, q y r es cada uno 0 o un número natural 2 ≥ o ≥ 0, 4 ≥ p ≥ 0, 2 ≥ q ≥ 0 (donde p y q son 4 ≥ p + q ≥ 0) y r es 1 o 2.

El aminoácido ácido es E (Glu) o D (Asp) y, preferiblemente, E (Glu). Con respecto a X y Z que son cualquier aminoácido, X y Z pueden ser iguales o diferentes y, cuando son plurales, cada uno de ellos puede ser igual o

35 diferente. Preferiblemente, X y Z es cada uno Ser, Pro, Leu, Phe o Ala, más preferiblemente Ser, Thr, Pro o Ala y, lo más preferiblemente, Ser. Con respecto al aminoácido básico W, ambos W pueden ser iguales o diferentes y, cuando hay plurales, cada uno de ellos puede ser igual o diferente. W es preferiblemente R (Arg) o K (Lys).

Preferiblemente, en la fórmula 1, s es 1; o, p y q es cada uno 0; y r es 2.

40 C se puede seleccionar de cualquier secuencia de números de aminoácidos tal como aproximadamente de 2 a 14 aminoácidos como se muestra en la secuencia de aminoácidos (dos aminoácidos: tabla 14) en las posiciones 22 a 23 en motilina quimérica (J), la secuencia de aminoácidos (14 aminoácidos: tabla 5) en las posiciones 7 a 20 en el fragmento C terminal (SEQ ID NO: 58) derivado de grelina de rana y la motilina quimérica (VI) (MG-H1), (VII) (MG

45 H3) y (VIII) (MG-H4) alineada con una secuencia (tal como AK (o E) LAALK (o E) A) predicha que forma una estructura en hélice α por un método conocido para predecir la estructura secundaria (tal como el método de Chou-Fasman: Biochemistry. 15 enero 1974; 13 (2): 222-45 Prediction of protein conformation. Chou PY, Fasman GD; o el método de Garnier: J Mol Biol. 25 Mar. 1978;120(1):97-120. Analysis of the accuracy and implications of simple methods for predicting the secondary structure of globular proteins. Garnier J, Osguthorpe DJ, Robseon B. etc.).

50 Se prefiere que sea cualquier secuencia que comprende de 3 a 11 aminoácidos que puede formar una estructura de hélice α, más preferiblemente KKPPAKLQPR (una secuencia que comprende los aminoácidos en las posiciones 22 a 29 desde el extremo N en motilina quimérica (C)) o PPAELAALEA (una secuencia que comprende los aminoácidos en las posiciones 22 a 31 desde el extremo N en motilina quimérica (VII) (MG-H3)) y, aún más preferiblemente,

55 PPAELAALEA. También es posible usar cualquier secuencia que pueda formar una estructura en lámina mediante el anterior método de predicción.

Además, cuando no está presente Pro entre la secuencia de aminoácidos correspondiente a la fórmula C del péptido de extensión de la semivida y la secuencia de aminoácidos correspondiente a la fórmula B del mismo, se prefiere

60 que la secuencia Pro (números de Pro en un intervalo en los que los números de aminoácidos de C se vuelven de 2 a 14 o, preferiblemente, Pro-Pro) se alinee en el sitio terminal de la secuencia de aminoácidos correspondiente a la fórmula C como se muestra por una comparación de motilina quimérica (IV) (MG-dPP) con motilina quimérica (D), una comparación de motilina quimérica (V) (MG-dPPH1) con motillina quimérica (VI) (MG-H1) y una comparación de motilina quimérica (IX) (MG-dPPS) con motilina quimérica (X) (MG-S).

65

Además, puesto que un CNP quimérico que contiene una secuencia correspondiente a B (secuencia central) de la fórmula del péptido de extensión de la semivida también muestra una acción de extensión de semivida como se muestra en el CNP quimérico (J) y (K), los expertos en la materia pueden predecir fácilmente que la misma acción de extensión de semivida se puede conseguir cuando los requisitos para A y C de la fórmula del péptido de

5 extensión de la semivida introducidos de la comparación en semividas de motilina quimérica se aplica a CNP quimérico. Los expertos en la materia también pueden predecir fácilmente que la misma acción de extensión de la semivida se puede conseguir cuando los requisitos para B y C de la fórmula del péptido de extensión de la semivida introducidos de la comparación de las semividas de CNP quimérico se aplica a motilina quimérica.

10 Además, los expertos en la materia también pueden predecir fácilmente que la misma acción de extensión de la semivida se puede conseguir cuando los requisitos para A, B y C de la fórmula del péptido de extensión de la semivida se aplica al péptido quimérico de otros péptidos objeto.

A, B y/o C pueden estar cada uno en la dirección normal o la dirección invertida. Por tanto, A, B y C cada uno

15 independientemente pueden estar en una dirección normal o en una dirección invertida o A-B, B-C y A-B-C pueden estar en la dirección normal o la dirección invertida como un todo. La dirección normal y el orden invertido usados aquí significa que la dirección de la secuencia desde el N terminal al C terminal está invertida una respecto a la otra.

Cuando el péptido es un B único, incluye el caso donde una secuencia que satisface los requisitos de A y/o C está 20 presente en el lado del péptido objeto.

En el péptido de extensión de la semivida, el preferido es un péptido de los siguientes (1) o (2).

(1) A es una secuencia de aminoácidos de uno o más números de aminoácidos 1 a 4 que sigue a B en SEQ IDNO:

25 34 o una secuencia de aminoácidos donde uno o algunos aminoácido(s) en la secuencia de aminoácidos anterior se deleciona(n), sustituye(n) y/o añade(n);

B es una secuencia de aminoácidos de uno o más números de aminoácidos 5 a 9 en SEQ ID NO: 34 o una secuencia de aminoácidos donde uno o algunos aminoácido(s) en la secuencia de aminoácidos anterior se

30 deleciona(n), sustituye(n) y/o añade(n); y

C es una secuencia de uno o más números de aminoácidos 10 a 17 que siguen a B en SEQ IDNO: 34 o una secuencia de aminoácidos donde uno o algunos aminoácido(s) en la secuencia de aminoácidos anterior se deleciona(n), sustituye(n) y/o añade(n).

35

(2) A es una secuencia de aminoácidos de uno o más números de aminoácidos 1 a 8 que sigue a B en SEQ IDNO: 67 o una secuencia de aminoácidos donde uno o algunos aminoácido(s) en la secuencia de aminoácidos anterior se deleciona(n), sustituye(n) y/o añade(n);

40 B es una secuencia de aminoácidos de uno o más números de aminoácidos 9 a 13 en SEQ ID NO: 67 o una secuencia de aminoácidos donde uno o algunos aminoácido(s) en la secuencia de aminoácidos anterior se deleciona(n), sustituye(n) y/o añade(n); y

C es una secuencia de uno o más números de aminoácidos 14 a 17 que siguen a B en SEQ IDNO: 67 o una

45 secuencia de aminoácidos donde uno o algunos aminoácido(s) en la secuencia de aminoácidos anterior se deleciona(n), sustituye(n) y/o añade(n).

SEQ ID NO: 67 es una secuencia invertida de SEQ ID NO: 34.

50 B es una secuencia central esencial.

En otras palabras, el péptido de extensión de la semivida es un péptido que contiene una secuencia de aminoácidos de números de aminoácido 5 a 9 en SEQ ID NO: 34 o una secuencia de aminoácidos de números de aminoácidos 9 a 13 en SEQ ID NO: 67 que es una secuencia invertida de la anterior y que comprende 17 o menos aminoácidos o

55 un péptido en que uno o algunos aminoácido(s) en la secuencia de aminoácidos anterior se deleciona(n), sustituye(n) y/o añade(n) en la secuencia de aminoácidos. El término “uno o algunos” usado en el presente documento anteriormente significa de 1 a 35 por ejemplo, preferiblemente de 1 a 15, más preferiblemente de 1 a 10, aún más preferiblemente de 1 a 8, aún más preferiblemente de 1 a 6, aún más preferiblemente de 1 a 5, aún más preferiblemente de 1 a 4, aún más preferiblemente de 1 a 3 y, aún más preferiblemente de 1 a 2.

60 El péptido de extensión de la semivida incluye un péptido de extensión de la semivida que comprende una secuencia parcial C terminal de grelina de mamíferos tal como ser humano, mono, ganado, caballo, cerdo, perro, ciervo, oveja, cabra, gato, conejo, rata, Suncus (rata almizclera) o ballena, aves tal como pavo o aves domésticas, reptiles tal como tortuga, anfibios tal como rana y peces tal como anguila, bagre o tiburón.

65

Respecto a la deleción, sustitución y/o adición de uno o algunos aminoácido(s) en la secuencia de aminoácidos de A, B y C cada uno de SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 67, los expertos en la materia pueden seleccionar apropiadamente la posición y tipo de del aminoácido adecuado para realizar la modificación como tal por comparación entre las secuencias de aminoácidos derivadas de varias especies. 5 La secuencia de aminoácidos de grelina derivada de varios organismos, péptido de extensión de la semivida de la parte C terminal de la misma, longitud completa de la secuencia central B, longitud completa de la secuencia A que puede estar presente en el lado N terminal de la secuencia central y longitud completa de la secuencia C que puede estar presente en el lado C terminal de la secuencia central se muestran en las siguientes tablas 1 a 7. 10 Tabla 1

Especie: No. de secuencia de grelina No. de aminoácido de cada parte del No. de secuencia (dirección normal) del péptido de extensión de semivida No. de aminoácido de cada parte del No. de secuencia (dirección invertida) del péptido de extensión de semivida

Ser humano: SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 34 A: 1 a 4 B: 5 a 9 C: 10 a 17 SEQ ID NO: 67 A: 1 a 8 B: 9 a 13 C: 14 a 17

SEQ ID NO: 2: SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 68

A: 1 a 3: A: 1 a 8

B: 4 a 8: B: 9 a 13

C: 9 a 16: C: 14 a 16

Mono: SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 36 SEQ ID NO: 69

A: 1 a 4: A: 1 a 8

B: 5 a 9: B: 9 a 13

C: 10 a 17: C: 14 a 17

Ganado: SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 37 A: 1 a 3 B: 4 a 8 C: 9 a 16 SEQ ID NO: 70 A: 1 a 8 B: 9 a 13 C: 14 a 16

SEQ ID NO: 5: SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 71

A: 1 a 3: A: 1 a 8

B: 4 a 8: B: 9 a 13

C: 9 a 16: C: 14 a 16

Caballo: SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 72

A: 1 a 4: A: 1 a 8

B: 5 a 9: B: 9 a 13

C: 10 a 17: C: 14 a 17

Cerdo: SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 40 SEQ ID NO: 73

A: 1 a 4: A: 1 a 8

B: 5 a 9: B: 9 a 13

C: 10 a 17: C: 14 a 17

Tabla 2

Perro: SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 74

A: 1 a 4: A: 1 a 8

B: 5 a 9: B: 9 a 13

C: 10 a 17: C: 14 a 17

Ciervo: SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 42 A: 1 a 3 B: 4 a 8 C: 9 a 16 SEQ ID NO: 75 A: 1 a 8 B: 9 a 13 C: 14 a 16

SEQ ID NO: 10: SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 76

A: 1 a 3: A: 1 a 8

B: 4 a 8: B: 9 a 13

C: 9 a 16: C: 14 a 16

Oveja: SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 44 A: 1 a 3 B: 4 a 8 C: 9 a 16 SEQ ID NO: 77 A: 1 a 8 B: 9 a 13 C: 14 a 16

Cabra: SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 45 A: 1 a 3 B: 4 a 8 C: 9 a 16 SEQ ID NO: 78 A: 1 a 8 B: 9 a 13 C: 14 a 16

Gato: SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 46 A: 1 a 3 B: 4 a 8 C: 9 a 16 SEQ ID NO: 79 A: 1 a 8 B: 9 a 13 C: 14 a 16

Conejo: SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 47 A: 1 a 4 B: 5 a 9 C: 10 a 17 SEQ ID NO: 80 A: 1 a 8 B: 9 a 13 C: 14 a 17

Tabla 3

Rata: SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 48 A: 1 a 4 B: 5 a 9 C: 10 a 17 SEQ ID NO: 81 A: 1 a 8 B: 9 a 13 C: 14 a 17

SEQ ID NO: 16: SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 82

A: 1 a 3: A: 1 a 8

B: 4 a 8: B: 9 a 13

C: 9 a 16: C: 14 a 16

SEQ ID NO: 17: SEQ ID NO: 50 SEQ ID NO: 83

A: 1 a 4: A: 1 a 8

B: 5 a 9: B: 9 a 13

C: 10 a 17: C: 14 a 17

Suncus: SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 84

A: 1 a 2: A: 1 a 7

B: 3 a 8: B: 8 a 13

C: 9 a 15: C: 14 a 15

Ballena: SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 85

A: 1 a 3: A: 1 a 8

B: 4 a 8: B: 9 a 13

C: 9 a 16: C: 14 a 16

Pavo: SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 53 SEQ ID NO: 86

A: 1 a 4: A: 1 a 8

B: 5 a 9: B: 9 a 13

C: 10 a 17: C: 14 a 17

Tabla 4

Ave doméstica: SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 54 A: 1 a 4 B: 5 a 9 C: 10 a 17 SEQ ID NO: 87 A: 1 a 8 B: 9 a 13 C: 14 a 17

SEQ ID NO: 22: SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 88

A: 1 a 4: A: 1 a 6

B: 5 a 9: B: 7 a 11

C: 10 a 15: C: 12 a 15

SEQ ID NO: 23: SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 89

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Las secuencias de aminoácidos de grelina derivadas de varios organismos en las tablas 1 a 7 se muestran a continuación. Las subrayadas son las partes correspondientes al péptido de extensión de semivida.

Ser humano GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR (SEQ ID NO: 1)

GSSFLSPEHQRVQ-RKESKKPPAKLQPR (SEQ ID NO: 2) Mono GSSFLSPEHQRAQQRKESKKPPAKLQPR (SEQ ID NO: 3) Ganado GSSFLSPEHQKLQ-RKEAKKPSGRLKPR (SEQ ID NO: 4)

GSSFLSPEHQKLQ-RKEPKKPSGRLKPR (SEQ ID NO: 5) Caballo GSSFLSPEHHKVQHRKESKKPPAKLKPR (SEQ ID NO: 6) Cerdo GSSFLSPEHQKVQQRKESKKPAAKLKPR (SEQ ID NO: 7) Perro GSSFLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPR (SEQ ID NO: 8) Ciervo GSSFLSPEHQKLQ-RKEPKKPSGRLKPR (SEQ ID NO: 9)

GSSFLSPDHQKLQ-RKEPKKPSGRLKPR (SEQ ID NO: 10) Oveja GSSFLSPEHQKLQ-RKEPKKPSGRLKPR (SEQ ID NO: 11) Cabra GSSFLSPEHQKLQ-RKEPKKPSGRLKPR (SEQ ID NO: 12) Gato GSSFLSPEHQKVQ-RKESKKPPAKLQPR (SEQ ID NO: 13) Conejo GSSFLSPEHQKVQQRKESKKPAAKLKPR (SEQ ID NO: 14) Rata GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR (SEQ ID NO: 15) GSSFLSPEHQKAQ-RKESKKPPAKLQPR (SEQ ID NO: 16) GSSFLSPEHQKTQQRKESKKPPAKLQPR (SEQ ID NO: 17) Suncus GSSFLSPEHQKGP-KKDPRKPPKLQPR (SEQ ID NO: 18) Ballena GSSFLSPEHQKLQ-RKEAKKPSGRLKPR (SEQ ID NO: 19) Pavo GSSFLSPAYKNIQQQKDTRKPTARLHPR (SEQ ID NO: 20) Ave doméstica GSSFLSPTYKNIQQQKDTRKPTARLHRR (SEQ ID NO: 21) GSSFLSPTYKNIQQQKDTRKPTARLH (SEQ ID NO: 22) GSSFLSPTYKNIQQQKDTRKPTAR (SEQ ID NO: 23) Tortuga GSSFLSPEYQNTQQRKDPKKHTK-LNRR (SEQ ID NO: 24) Rana GLTFLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNMNRR (SEQ ID NO: 25) GLTFLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNMN (SEQ ID NO: 26) GLTFLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM (SEQ ID NO: 27) Anguila GSSFLSPS-QRPQG-KD-KKP-PRVGRR (SEQ ID NO: 28) GSSFLSPS-QRPQG-KD-KKP-PRV-NH2 (SEQ ID NO: 29) Bagre GSSFLSPT-QKPQNR-GDRKPP-RVGRR (SEQ ID NO: 30) GSSFLSPT-QKPQNR-GDRKPP-RVG (SEQ ID NO: 31) GSSFLSPT-QKPQNR-GDRKPP-RV-NH2 (SEQ ID NO: 32) Tiburón GVSFHPRLKEKDDNSSGNSRKSNPKR (SEQ ID NO: 33)

5 Las secuencias de aminoácidos del péptido de extensión de la semivida (secuencias normales) derivadas de varios organismos en las tablas 1 a 7 se muestran a continuación. Las subrayadas son las partes correspondientes a la secuencia central B, el lado N-terminal de la secuencia central B es la parte correspondiente a la secuencia A y el lado C terminal de la secuencia central B es la parte correspondiente a la secuencia C.

10 Ser humano VQQRKESKKPPAKLQPR (SEQ ID NO: 34) VQ-RKESKKPPAKLQPR (SEQ ID NO: 35) Mono AQQRKESKKPPAKLQPR (SEQ ID NO: 36) Ganado LQ-RKEAKKPSGRLKPR (SEQ ID NO: 37) LQ-RKEPKKPSGRLKPR (SEQ ID NO: 38) Caballo VQHRKESKKPPAKLKPR (SEQ ID NO: 39) Cerdo VQQRKESKKPAAKLKPR (SEQ ID NO: 40) Perro LQQRKESKKPPAKLQPR (SEQ ID NO: 41) Ciervo LQ-RKEPKKPSGRLKPR (SEQ ID NO: 42) LQ-RKEPKKPSGRLKPR (SEQ ID NO: 43) Oveja LQ-RKEPKKPSGRLKPR (SEQ ID NO: 44) Cabra LQ-RKEPKKPSGRLKPR (SEQ ID NO: 45) Gato VQ-RKESKKPPAKLQPR (SEQ ID NO: 46) Conejo VQQRKESKKPAAKLKPR (SEQ ID NO: 47) Rata AQQRKESKKPPAKLQPR (SEQ ID NO: 48) AQ-RKESKKPPAKLQPR (SEQ ID NO: 49) TQQRKESKKPPAKLQPR (SEQ ID NO: 50) Suncus GP-KKDPRKPPKLQPR (SEQ ID NO: 51) Ballena LQ-RKEAKKPSGRLKPR (SEQ ID NO: 52) Pavo IQQQKDTRKPTARLHPR (SEQ ID NO: 53) Ave doméstica IQQQKDTRKPTARLHRR (SEQ ID NO: 54)

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Cuando es levadura, se puede usar el promotor GAP, promotor PH05, promotor ADH, etc. Cuando es una célula animal, se puede usar un promotor derivado de SV40, promotor derivado de retrovirus, etc.

Las células huésped se transforman usando un vector que contiene el gen objeto producido como antes. Respecto a la célula huésped, se pueden usar bacterias (tal como el género Escherichia o el género Bacillus), levadura (tal como el género (Saccharomyces, género Pichia o género Candida), célula animal (tal como célula CHO o célula COS), etc. Respecto a un medio para la incubación, el medio líquido es apropiado y es particularmente preferido que el medio contenga fuente de carbono, fuente de nitrógeno, etc., necesarias para el crecimiento de las células transformadas que se van a incubar. Si se desea, se pueden añadir al medio vitaminas, factores que fomentan el crecimiento, suero, etc.

Después de la incubación, el péptido quimérico se separa y purifica por un método convencional a partir de los productos incubados. Por ejemplo, al extraer la sustancia objeto de los de los microbios o células incubados, los microbios o células se recogen después de la incubación y se resuspenden en un tampón que contiene un modificador de proteína (tal como clorhidrato de guanidina) y los microbios o células se disgregan por onda ultrasónica o similar seguido por someter a separación centrífuga. Al purificar la sustancia diana del líquido sobrenadante, se realizan medios de separación y purificación tal como filtración en gel, ultrafiltración, diálisis, SDS-PAGE o varias cromatografías mediante una combinación apropiada de los mismos considerando el peso molecular, solubilidad, carga (punto isotónico) afinidad etc., de la sustancia objeto.

El péptido quimérico también se puede sintetizar químicamente por métodos convencionales. Por ejemplo, se condensa un aminoácido que tiene grupos protectores por un método de fase líquida y/o un método de fase sólida para elongar la cadena peptídica, todos los grupos protectores se eliminan por un ácido y el producto crudo resultante se purifica para dar el producto diana. Con respecto a un método que se puede usar para la producción del péptido quimérico, se conocen ya varios métodos y el péptido quimérico como la sustancia también se puede producir fácilmente por métodos conocidos. Por ejemplo, se puede usar una síntesis peptídica clásica o se puede realizar un método de fase sólida por lo cual el producto se puede producir fácilmente.

Además, se puede usar un proceso de producción en el que se combinan una técnica de ADN recombinante y una síntesis química. Por tanto, cuando se añade un péptido de extensión de semivida a la cadena lateral de un aminoácido sobre el péptido objeto (tal como el grupo amino de un residuo de lisina o el grupo carboxílico de ácido glutámico o ácido aspártico), la producción se realiza por una síntesis química mientras, en otras partes, la producción se realiza usando una técnica de ADN recombinante y, después de eso, los fragmentos se fusionan para producir el producto.

Tal método también se puede comprender como un método donde el péptido de extensión de la semivida mencionado anteriormente en el presente documento se une al lado N terminal, lado C terminal o ambos lados terminales del péptido objeto por lo cual la semivida en plasma del péptido objeto se alarga.

(4) Preparaciones farmacéuticas

El péptido quimérico de la presente invención se puede usar como un fármaco para animales (individuos) incluyendo seres humanos. El péptido quimérico de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se mezcla con un soporte farmacéuticamente aceptable por lo cual se puede fabricar una composición farmacéutica (preparación farmacéutica). No hay limitación para la forma farmacéutica y, por ejemplo, la preparación se usa como preparación sólida o preparación líquida para administración oral o como una preparación de inyección para uso parenteral.

Los ejemplos de la preparación sólida para administración oral incluyen comprimidos, píldoras, cápsulas, polvo diluido y gránulos mientras que los ejemplos de la preparación líquida incluyen para administración oral incluyen jarabe.

Respecto al soporte farmacéuticamente aceptable, varias sustancias soporte orgánicas o inorgánicas que se han usado comúnmente como materiales para la preparación se pueden usar y los ejemplos de las mismas en la preparación sólida incluyen excipiente, lubricante, aglutinante y agente disgregante mientras que ejemplos de las mismas en la preparación líquida incluyen solvente, ayuda de solubilización, agente de suspensión, agente isotonizante, tampón y agente analgésico. Si es necesario, también se pueden usar aditivos para la preparación tales como antiséptico, antioxidante, agente colorante o edulcorante.

Los ejemplos apropiados del excipiente incluyen lactosa, azúcar, D-manitol, almidón, celulosa cristalina y anhídrido de ácido silícico ligero.

Los ejemplos apropiados del lubricante incluyen estearato de magnesio, estearato de calcio, talco y sílice coloidal.

Los ejemplos apropiados del aglutinante incluyen celulosa microcristalina, azúcar, D-manitol, dextrina, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y polivinilpirrolidona.

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Por otra parte, cambios en la concentración de inmunorreactividad de CNP en plasma cuando se administró el CNP quimérico no cambiaron incluso cuando se usó junto con un inhibidor de NEP y se confirmó que, en el cuerpo de la rata, el CNP quimérico (B) apenas se descomponía por NEP comparado con el CNP-22 nativo (tabla 13).

Ejemplo 4 (Acción promotora de extensión de CNP-22 nativo y CNP quimérico) (1)

Se investigó una acción promotora de extensión de CNP-22 nativo y CNP quimérico usando ratones.

En el experimento, se usaron ratones S/VAF Crlj:CD1 (ICR) hembras de tres semanas de edad (Nippon Charles River) donde un grupo comprendía diez ratones y se usaron en total 30 ratones para el experimento. Los animales (dos semanas de edad) se compraron junto con tres ratones madre y diez crías de ratones con una madre ratón y se criaron juntos durante una semana y después se destetaron. Durante el periodo de administración, cada grupo en 5 ratones x 2 jaulas se crio en una jaula transparente. Respecto al agua, se dio agua del grifo a voluntad para beber y, respecto al pienso, se dio pienso sólido (CRF-1 fabricado por Oriental Yeast Industry) libremente a ingerir. Se administraron repetidamente medio, CNP-22 nativo o CNP quimérico (B) (estructura ya mencionada) dos veces al día durante 29 días por vía subcutánea desde el lomo en una dosis de 10 ml/kg, 0,25 mg/kg o 0,25 mg/kg, respectivamente y se midieron la longitud del cuerpo, la longitud de la cola y el peso corporal durante el periodo de administración. El resultado se muestra en la figura 5.

Como se muestra en la figura 5, la longitud del cuerpo de los ratones a los se les administró repetidamente un CNP quimérico (B) donde un péptido de extensión de la semivida se unió a CNP por vía subcutánea aumentó significativamente comparado con un grupo al que se administró medio, mientras que la longitud del cuerpo del grupo al que se administró CNP-22 nativo no mostró diferencia del grupo al que se administró el medio.

Por otra parte, con respecto al peso corporal, no hubo diferencia entre todos los grupos administrados.

Ejemplo 5 (Antigenicidad de CNP-22 nativo y CNP quimérico)

Para investigar si se producía un anticuerpo a CNP-22 nativo o CNP quimérico (B) usando suero recogido de los ratones después de terminar la administración repetida durante cuatro semanas en el ejemplo 4, se evaluó la antigenicidad de cada uno de ellos por medio de un ELISA indirecto.

Se añadió una solución de péptido (100 µl) ajustada a 1,0 ng/µl usando NaCHO3 50 mM a pH 8,5 a una placa de 96 pocillos (fabricada por Nalge Nunc International; Dinamarca) tratada con Maxisoap y sometida a una operación de recubrimiento durante la noche a 4ºC. Se llevó a cabo el bloqueo a temperatura ambiente durante 1 hora usando Block Ace al 2,0% (fabricado por Snow Brand Milk). Después del bloqueo, se añadió una muestra de suero diluida a un nivel de 102 a 105 veces y la mezcla se sometió a una reacción antígeno-anticuerpo a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar los pocillos, se añadió a los mismos un anticuerpo anti-IgG de ratón HRP (fabricado por Zymed Laboratories, EE UU). La reacción antígeno-anticuerpo se realizó durante 1 hora a temperatura ambiente, después los pocillos se lavaron y se añadió a los mismos un sustrato ABTS (fabricado por KPL, EE UU). Después de la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora, se midió la absorbancia a 405 nm por Spectra Max 190 (fabricado por Molecular Devices, EE UU) y se analizó el grado de coloración como un valor de anticuerpo.

Como resultado, incluso cuando el CNP-22 nativo o el CNP quimérico se administró repetidamente por vía subcutánea (lomo) en una dosis de 0,25 mg/kg dos veces al día durante 29 días, no se advirtió subida el valor de anticuerpo a CNP-22 nativo ni a CNP quimérico (B).

Ejemplo 6 (Semivida en plasma de motilina nativa y motilina quimérica) (1)

Se investigaron cambios en las concentraciones de inmunorreactividad de motilina cuando se administraron por vía intravenosa motilina nativa (SEQ ID NO: 102) y 13 tipos de motilinas quiméricas A a M (SEQ ID NO: 111 a 123) donde péptido de extensión de semivida en varias semividas que comprenderían de 5 a 22 residuos de aminoácidos se unieron a una secuencia de aminoácidos de números de aminoácidos 1 a 12 de SEQ ID NO: 102 que era el centro activo de motilina nativa. El experimento se llevó a cabo usando ratas en las que un tubo de polietileno (PE50 fabricado por Clay Adams) se insertó previamente en la arteria del muslo en condición de anestesia con Nembutal. Respecto al sistema de prueba, se usaron ratas de la cepa SD machos (Nippon Charles River) de 7 semanas de edad donde un grupo comprendía 3 ratas. Se administró motilina de tipo humano o un derivado de la misma en una dosis de 10 nmol/kg en la vena de la cola de la rata y se recogió sangre antes de la administración y hasta 60 minutos después de la administración por un tubo de polietileno insertado en la arteria del muslo. A la sangre recogida se añadieron EDTA (Fabricado por Dojin Laboratories) y aprotinina (fabricada por Bayer) como un estabilizante y un anticoagulante, respectivamente y el plasma se separó de la misma por separación centrífuga. Se midió la concentración de inmunorreactividad de motilina en el plasma por un radioinmunoensayo (RIA) competitivo (Fig. 6). En ese momento, se usó un anticuerpo policlonal de conejo (#870623) que específicamente reconoce los números de aminoácido 1 a 12 de motilina nativa mostrada por SEQ ID NO: 102 como anticuerpo y, como compuesto marcado, se usó 125I-[Tyr7] motilina de tipo humano.

Se muestran las secuencias de aminoácidos, pesos moleculares y tiempo medio para la desaparición del plasma para motilina nativa y motilina quimérica (A a M) en la siguiente tabla 14.

5 Tabla 14 Lista de secuencias de aminoácidos, pesos moleculares y tiempo medio para la desaparición del plasma para motilina quimérica tras la administración intravenosa a ratas.

10 (Valor medio ± desviación estándar, N = 3)

Péptido: Secuencia de aminoácidos Peso Mol. T1/2 (min) Valor P

Valor medio: ±DE

Motilina nativa: FVPIFTYGELQRMQEKERNKGQ 2699,05 3,26 ±0,95* -

Motilina quimérica (A): FVPIFTYGELQRSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 4204,79 11,74 ±3,36* 0,014

Motilina quimérica (B): FVPIFTYGELQREHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 4020,60 11,14 ±0,73* 0,000

Motilina quimérica (C): FVPIFTYGELQRQRVQQRKESKKPPAKLQPR 3754,35 8,90 ±0,53* 0,001

Motilina quimérica (D): FVPIFTYGELQRVQQRKESKKPPAKLQPR 3470,03 8,90 ±0,50* 0,001

Motilina quimérica (E): FVPIFTYGELQRQRKESKKPPAKLQPR 3242,77 8,03 ±0,73* 0,002

Motilina quimérica (F): FVPIFTYGELQRKESKKPPAKLQPR 2958,46 9,37 ±0,58* 0,000

Motilina quimérica G): FVPIFTYGELQRSKKPPAKLQPR 2701,17 5,25 ±1,32 NS 0,101

Motilina quimérica (H): FVPIFTYGELQRVQQRKESKKPAKLQ 3216,73 10,43 ±0,14* 0,000

Motilina quimérica (I): FVPIFTYGELQRVQQRKESKKPPAK 2975,45 5,76 ±0,66* 0,018

Motilina quimérica (J): FVPIFTYGELQRVQQRKESKKPP 2776,20 6,34 ±0,48* 0,008

Motilina quimérica (K): FVPIFTYGELQRVQQRKESKK 2581,97 6,14 ±2,37* 0,032

Motilina quimérica (L): FVPIFTYGELQRVQQRKES 2325,62 4,89 ±4,26 NS 0,296

Motilina quimérica (M): FVPIFTYGELQRVQQRK 2109,43 2,39 ±2,37 NS 0,272

* En la prueba de la t, estaba disponible una diferencia significativa del tiempo medio de desaparición de motilina nativa (p < 0,05). NS: En la prueba de la t, no estaba disponible una diferencia significativa del tiempo medio de desaparición de motilina nativa (p > 0,05).

15 El resultado se muestra también en la figura 6.

Todos los 13 tipos de motilinas quiméricas que se evaluaron conservaron la actividad agonista del receptor de motilina. Con respecto a la motilina quimérica (G, L y M), no se pudo confirmar una acción de extensión del tiempo

20 medio de desaparición significativo in vivo que motilina nativa y se confirmó que, cuando la estructura de la secuencia de aminoácidos ESKK se perdía, la acción desaparecía. Con respecto a otros motivos, todos ellos tenían una acción de extender la semivida in vivo comparado con la motilina nativa y, entre ellos, el hecho de si la estructura de RKESKK se mantiene o no tiene la mayor influencia en la acción de extensión para la semivida.

25 Ejemplo 7 (Semivida de CNP-22 nativo y CNP quimérico en plasma) (1)

Se investigaron cambios en las concentraciones de inmunorreactividad de CNP en plasma cuando se administraron por vía intravenosa el CNP-22 nativo mostrado en SEQ ID NO: 101 y siete tipos de CNP quiméricos (C a I) (SEQ ID NO: 124 a 130) en los que un péptido de extensión de semivida que comprendía 17 residuos de aminoácidos se

30 unió al extremo N, extremo C o ambos extremos del péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 6 a 22 desde el extremo N de SEQ ID NO: 101 que era el centro activo de CNP-22 nativo.

El experimento se llevó a cabo usando ratas en las que un tubo de polietileno (PE-50 fabricado por Clay Adams) se insertó previamente en la arteria del muslo en condición de anestesia con Nembutal. Respecto al sistema de prueba,

35 se usaron ratas de la cepa SD machos (Nippon Charles River) de 7 semanas de edad donde un grupo comprendía 3

ratas. Se administró CNP-22 nativo o CNP quimérico en una dosis de 10 nmol/kg en la vena de la cola de la rata y se recogió sangre antes de la administración y hasta 60 minutos después de la administración por un tubo de polietileno insertado en la arteria del muslo. A la sangre recogida se añadieron EDTA (Fabricado por Dojin Laboratories) y aprotinina (fabricada por Bayer) como un estabilizante y un anticoagulante, respectivamente y el

5 plasma se separó de la misma por separación centrífuga. Se midió la concentración de inmunorreactividad de CNP en el plasma por un radioinmunoensayo (RIA) competitivo. En ese momento, se usó un anticuerpo policlonal de conejo (#2) que específicamente reconoce la estructura parcial de anillo del CNP-22 nativo como anticuerpo y, como compuesto marcado, se usó 125I-[Tyr0] CNP.

10 Se muestran las secuencias de aminoácidos, pesos moleculares y tiempo medio para la desaparición del plasma para CNP quimérico en la siguiente tabla 15.

Tabla 15

15 Lista de secuencias de aminoácidos, pesos moleculares y tiempo medio para la desaparición del plasma para CNP22 nativo y CNP quimérico (C a I) tras la administración intravenosa a ratas en una dosis de 10 nmol/kg.

(Valor medio ± desviación estándar, N = 3)

Péptido: Secuencia de aminoácidos Peso Mol. T1/2 (min) Valor P

Valor medio ±DE

CNP-22 nativo: GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC 2197,6 4,34 ±0,20 -

CNP quimérico (C): CFGLKLDRIGSMSGLGCVQQRKESKKPPAKLQPR 3755,5 15,03 ±4,31* 0,013

CNP quimérico (D): GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGCVQQRKESKKPPAKLQPR 4198,0 20,30 ±3,09* 0,001

CNP quimérico (E): VQQRKESKKPPAKLQPRCFGLKLDRIGSMSGLGCVQQRK ESKKPPAKLQPR 5755,9 18,40 ±2,05* 0,000

CNP quimérico (F): RPQLKAPPKKSEKRQQVCFGLKLDRIGSMSGLGCVQQR KESKKPPAKLQPR 5755,9 17,38 ±1,00* 0,000

CNP quimérico (G): VQQRKESKKPPAKLQPRCFGLKLDRIGSMSGLGC 3755,5 17,75 ±3,99* 0,004

CNP quimérico (H): RPQLKAPPKKSEKRQQVCFGLKLDRIGSMSGLGC 3755,5 14,86 ±2,64* 0,002

CNP quimérico (I): CFGLKLDRIGSMSGLGCVQQRKESKKPPAKLQPR-amida 3754,5 14,50 ±0,85* 0,000

En todos ellos, se formó enlace S-S en los residuos de cisteína en cursiva subrayados para formar una estructura 20 cíclica.

* En la prueba de la t, estaba disponible una diferencia significativa del tiempo medio de desaparición de CNP-22 nativo (p < 0,05).

El resultado se muestra también en la figura 7.

25 Todos los CNP quiméricos (C a I) evaluados conservaron la actividad agonista del receptor de CNP humano.

Todos los CNP quiméricos evaluados en este momento mostraron semivida de desaparición más larga que CNP-22 nativo. Por tanto, se encontró que el péptido de extensión de semivida evaluado en este momento mostró una

30 acción de extensión para la semivida cuando estaba unido a cualquiera del lado N terminal y lado C terminal o a ambos lados y que, incluso cuando la secuencia de aminoácidos estaba invertida, la propiedad no se deterioraba. También se encontró que, incluso cuando la estructura C terminal estaba amidada, una acción de extensión para la semivida aún estaba disponible por lo cual, dependiendo de la estructura del péptido diana, se pudo seleccionar un sistema de unión.

35 Ejemplo 8 (Semivida en plasma de motilina nativa y motilina quimérica en plasma) (2)

Se investigaron cambios en las concentraciones de inmunorreactividad de motilina cuando se administraron por vía intravenosa motilina nativa (SEQ ID NO: 102) y 26 tipos de motilinas quiméricas (N a Z y I a XIII) (SEQ ID NO: 131 a

156) donde un péptido de extensión de semivida en varias semividas que comprendía de 14 a 22 residuos de aminoácidos se unieron a una secuencia de aminoácidos de números de aminoácidos 1 a 12 de SEQ ID NO: 102 que era el centro activo de motilina nativa.

5 El experimento se llevó a cabo usando ratas en las que un tubo de polietileno (PE-50 fabricado por Clay Adams) se insertó previamente en la arteria del muslo en condición de anestesia con Nembutal. Respecto al sistema de prueba, se usaron ratas de la cepa SD machos (Nippon Charles River) de 7 semanas de edad donde un grupo comprendía 3 ratas. Se administró motilina humana o un derivado de la misma en una dosis de 10 nmol/kg en la vena de la cola de la rata y se recogió sangre periódicamente antes de la administración y hasta 60 minutos después de la

10 administración por un tubo de polietileno insertado en la arteria del muslo. A la sangre recogida se añadieron EDTA (Fabricado por Dojin Laboratories) y aprotinina (fabricada por Bayer) como un estabilizante y un anticoagulante, respectivamente y el plasma se separó de la misma por separación centrífuga. Se midió la concentración de inmunorreactividad de motilina en el plasma por un radioinmunoensayo (RIA) competitivo (Fig. 8). En ese momento, se usó un anticuerpo policlonal de conejo (#870623) que específicamente reconoce los números de aminoácido 1 a

15 12 de motilina nativa mostrada por SEQ ID NO: 102 como anticuerpo y, como compuesto marcado, se usó 125I-[Tyr7] motilina humana.

Se muestran las secuencias de aminoácidos, pesos moleculares y tiempo medio para la desaparición del plasma para motilina nativa y motilina quimérica (N a Z y I a XIII) en la siguiente tabla 16 y figura 8.

20 Tabla 16

Lista de secuencias de aminoácidos, pesos moleculares y tiempo medio para la desaparición del plasma para motilina quimérica tras la administración intravenosa a ratas. 25 (Valor medio ± desviación estándar, N = 3)

Péptido: Secuencia de aminoácidos Peso Mol. T1/2 (min) Valor P

Valor medio: ±DE

Motilina nativa: FVPIFTYGELQRMQEKERNKGQ 2699,1 3,26 ±0,95 -

Motilina quimérica (D): FVPIFTYGELQRVQQRKESKKPPAKLQPR 3470,0 8,90 ±0,50* 0,001

Motilina quimérica (N) (MG-dS): FVPIFTYGELQRVQQRKEKKPPAKLQPR 3383,0 9,12 ±1,22* 0,003

Motilina quimérica (O) (MG-18S/F): FVPIFTYGELQRVQQRKEFKKPPAKLQPR 3530,2 7,73 ±1,14* 0,007

Motilina quimérica (P) (MG-18S/T): FVPIFTYGELQRVQQRKETKKPPAKLQPR 3484,1 9,67 ±0,13* 0,000

Motilina quimérica (Q) (MG-18S/P): FVPIFTYGELQRVQQRKEPKKPPAKLQPR 3480,1 9,65 ±0,96* 0,001

Motilina quimérica (R) (MG-18S/L): FVPIFTYGELQRVQQRKELKKPPAKLQPR 3496,2 9,13 ±0,67* 0,001

Motilina quimérica (S) (MG-18S/A): FVPIFTYGELQRVQQRKEAKKPPAKLQPR 3454,1 9,29 ±0,30* 0,000

Motilina quimérica (T) (MG-17E/N): FVPIFTYGELQRVQQRKNSKKPPAKLQPR 3455,1 5,47 ±0,22* 0,017

Motilina quimérica (U) (MG-17E/Q): FVPIFTYGELQRVQQRKQSKKPPAKLQPR 3469,1 5,66 ±0,66* 0,023

Motilina quimérica (V) (MG-17ES/DS): FVPIFTYGELQRVQQRKDSKKPPAKLQPR 3456,1 10,14 ±0,92* 0,001

Motilina quimérica (W) (MG-dES): FVPIFTYGELQRVQQRKKKPPAKLQPR 3253,9 5,39 ±1,23NS 0,077

Motilina quimérica (X) (MG-17E/D): FVPIFTYGELQRVQQKRDSRRPPAKLQPR 3512,1 7,89 ±0,34* 0,001

Motilina quimérica (Y) (MG-BR): FVPIFTYGELQRVQQKKSEKRPPAKLQPR 3470,1 11,60 ±1,18* 0,001

Motilina quimérica (Z) (MG-i17G): FVPIFTYGELQRVQQRKGESKKPPAKLQPR 3527,1 10,53 ±1,66* 0,003

Motilina quimérica (I) (MG-i19G): FVPIFTYGELQRVQQRKESGKKPPAKLQPR 3527,1 11,55 ±2,00* 0,003

Motilina quimérica (II) (MG-i17G2): FVPIFTYGELQRVQQRKGGESKKPPAKLQPR 3584,1 11,50 ±0,64* 0,000

Motilina quimérica (III) (MG-i17G219iG): FVPIFTYGELQRVQQRKGGESGKKPRAKLQPR 3641,2 10,65 ±0,72* 0,000

Motilina quimérica (IV) (MG-dPP): FVPIFTYGELQRVQQRKESKKAKLQPR 3196,8 7,73 ±0,52* 0,002

Motilina quimérica (V) (MG-dPPH1): FVPIFTYGELQRVQQRKESKKAKLAALKA 3349,0 8,94 ±0,68* 0,001

Motilina quimérica (VI) (MG-H1): FVPIFTYGELQRVQQRKESKKPPAKIAALKA 3543,2 9,94 ±0,30* 0,000

Motilina quimérica (VII) (MG-H3): FVPIFTYGELQRVQQRKESKKPPAELAALEA 3545,1 12,78 ±0,27* 0,000

Motilina quimérica (VIII) (MG-H4): FVPIFTYGELQRVQQRKESKKPPAELAALKA 3544,2 11,56 ±0,93* 0,000

Motilina quimérica (IX) (MG-dPPS): FVPIFTYGELQRVQQRKESKKMITIR 3196,8 4,39 ±0,38NS 0,170

Motilina quimérica (X) (MG-S): FVPIFTYGELQRVQQRKESKKPPMITIR 3391,0 5,25 ±0,45* 0,031

Motilina quimérica (XI) (MG-d12/14): FVPIFTYGELQRKESKKPPAKLAALKA 3031,6 10,29 ±1,00* 0,001

Motilina quimérica (XII) (MGP1): FVPIFTYGELQRVQQKKAYSPDKERKPPALQPR 3916,5 13,03 ±0,98* 0,000

Motilina quimérica (XIII) (MGP2): FVPIFTYGELQRVQQKKAYSPDKERKPPAKLQPR 4044,7 13,09 ±2,90* 0,005

5 Del resultado para la motilina quimérica (XI) (MG-d12/14) junto con el resultado para las motilinas quiméricas (A a M) del ejemplo 6, se mostró que, con respecto a A en la fórmula del péptido de extensión de semivida de la presente invención, que puede no estar presente o que puede tener una secuencia de cualquier número de aminoácidos. Respecto a la longitud cuando la secuencia está presente, se mostró que era la longitud de aproximadamente 1 a 9

10 aminoácido(s), preferiblemente de 3 a 9 aminoácidos, más preferiblemente 3 aminoácidos y, lo más preferiblemente, Val-Gln-Gln.

Del resultado para las motilinas quiméricas (T) (MG-17E/N), (U) (MG-17E/Q) y (W) (MG-Des), se mostró que E (Glu) en RKESKK en la estructura (secuencia central: parte de la secuencia RKESKK) necesaria para la extensión de la

15 semivida de la presente invención es un aminoácido que es necesario para la acción de extensión de la semivida y que, de los resultados para las motilinas quiméricas (V) (MG-ES/ED) y (X) (MG-17E/D), el aminoácido se puede sustituir con D (Asp). Por tanto, se mostró que el aminoácido en la posición del anterior E (Glu) puede ser un aminoácido ácido.

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Claims

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