WO2023032726A1 - 環状ペプチド、環状ペプチドの塩、医薬組成物及び生体組織石灰化抑制剤 - Google Patents

環状ペプチド、環状ペプチドの塩、医薬組成物及び生体組織石灰化抑制剤 Download PDF

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朋子 南崎
尚平 河野
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Definitions

  • the biological tissue calcification inhibitor according to the third aspect of the present invention is It contains the cyclic peptide or its salt according to the first aspect of the present invention.
  • CPP calciprotein particles
  • cyclic means a closed ring structure formed in a molecule by binding two amino acids separated by two or more amino acid residues directly or via a linker or the like.
  • the cyclic peptide may be cyclized in any manner.
  • a cyclic peptide can be obtained by connecting the N-terminus and the C-terminus of a peptide directly via an amide bond (peptide bond) or a peptide linker.
  • the cyclic peptide or peptide linker may be cyclized by linking functional groups of side chains of amino acid residues contained in the peptide linker.
  • Embodiments of cyclic peptides are not limited to binding between the N-terminal amino acid residue and the C-terminal amino acid residue of the linear peptide, binding between the terminal amino acid residue and an amino acid residue other than the terminal, or It may be formed by binding amino acid residues other than the terminal.
  • the N-terminal amino acid residue and the C-terminal amino acid residue are linked.
  • cyclic peptide In the cyclic peptide according to this embodiment, at least two of the three serine residues corresponding to the 2nd, 4th and 6th serine residues from the N-terminus in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are phosphorylated It is Preferably, in the cyclic peptide according to this embodiment, all of the three serine residues are phosphorylated.
  • SEQ ID NO: 23 shows the amino acid sequence when the second, fourth and sixth serine residues from the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are phosphorylated.
  • SEQ ID NO: 24 shows the amino acid sequence when the 4th and 6th serine residues from the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are phosphorylated.
  • Each peptide was purified by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) using an ODS column and 0.1% TFA/acetonitrile, and the purity was 90-95%.
  • Each peptide was prepared with a TFA salt (partially ammonium salt).

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Abstract

環状ペプチド又はその塩は、配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列においてＮ末端のアミノ酸及びＣ末端のアミノ酸の少なくとも一方のアミノ酸が欠失若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列におけるＮ末端から２番目、４番目及び６番目のセリン残基に相当する３個のセリン残基の少なくとも２個がリン酸化されている。環状ペプチド又はその塩は、生体組織石灰化を抑制する作用を有する。

Description

環状ペプチド、環状ペプチドの塩、医薬組成物及び生体組織石灰化抑制剤
　本発明は、環状ペプチド、環状ペプチドの塩、医薬組成物及び生体組織石灰化抑制剤に関する。
　生体組織の石灰化には、硬組織石灰化及び異所性石灰化等がある。硬組織石灰化は、具体的には骨及び歯の石灰化である。異所性石灰化は、腎機能障害、動脈硬化、代謝障害、加齢及び遺伝等によって全身の軟部組織に生ずる石灰化である。石灰化が発生する軟組織は、例えば、血管、靭帯、腱、骨格筋、肺胞壁、腎、胃粘膜、関節周囲、軟骨及び皮膚等である。より詳細には、異所性石灰化には、乳児全身性動脈石灰化（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ　ａｒｔｅｒｉａｌ　ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｆａｎｃｙ：ＧＡＣＩ）、進行性骨化性線維異形成症（ｆｉｂｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａ　ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖａ：ＦＯＰ）に加え、慢性腎臓病又は動脈硬化による血管石灰化等がある。異所性石灰化は、疼痛、運動障害及び潰瘍形成等を引き起こし、血管石灰化等の場合は、生命予後にも影響する。
　ＳＩＢＬＩＮＧ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｇｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｌｉｇａｎｄ　Ｎ－ｌｉｎｋｅｄ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）は、硬組織基質を構成するタンパク質である。ＳＩＢＬＩＮＧが切断されると、ＡＳＡＲＭ（ａｃｉｄｉｃ　ｓｅｒｉｎｅ　ａｎｄ　ａｓｐａｒｔａｔｅ－ｒｉｃｈ　ｍｏｔｉｆ）を含むペプチド断片（以下、“ＡＳＡＲＭペプチド”という）が生じる。
　ＳＩＢＬＩＮＧの一つであるＭＥＰＥ（ｍａｔｒｉｘ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）から生じるＡＳＡＲＭペプチドは、ハイドロキシアパタイトとの結合親和性が高く、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでアパタイト結晶に結合し、骨芽細胞による基質石灰化を抑制する（非特許文献１及び非特許文献２）。
　特許文献１では、ＭＥＰＥ由来のＡＳＡＲＭペプチドの石灰化抑制に関する活性部位を利用した硬組織石灰化抑制剤及び異所性石灰化抑制剤が開示されている。
特開２０１３－１４５６６号公報
Ｐ．Ｓ．Ｎ．Ｒｏｗｅ、外１１名、「ＭＥＰＥ　ｈａｓ　ｔｈｅ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ａｎ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｉｃ　ｐｈｏｓｐｈａｔｏｎｉｎ　ａｎｄ　ｍｉｎｈｉｂｉｎ」、Ｂｏｎｅ、２００４年、３４（２）、３０３－３１９ Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｎ　Ａｄｄｉｓｏｎ、外４名、「ＭＥＰＥ－ＡＳＡＲＭ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｍａｔｒｉｘ　Ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｏ　Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ：Ａｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ＰＨＥＸ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　ｏｆ　ＡＳＡＲＭ」、Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ　Ｒｅｓ．、２００８年、２３（１０）、１６３８－１６４９
　ヒトＭＥＰＥ由来のＡＳＡＲＭペプチドは、１８個のアミノ酸から構成される。医薬品としての製造工程の簡素化及び製造コストの抑制を図る場合、生体組織石灰化抑制等の活性を維持しつつも分子量がより小さいペプチドが有利である。
　本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、ＡＳＡＲＭペプチドより分子量が小さく、かつ生体組織石灰化を抑制することができる環状ペプチド、環状ペプチドの塩、医薬組成物及び生体組織石灰化抑制剤を提供することを目的とする。
　ＡＳＡＲＭペプチドのアミノ酸配列に基づく解析によれば、ＡＳＡＲＭペプチドは特定の立体構造を保持せず不規則な立体構造をとる天然変性領域であることが予測される。天然変性領域は、他のタンパク質と相互作用したり、リン酸化等の修飾を受けたりして、シグナル伝達等において重要な役割を担う。天然変性領域の中で他のタンパク質に結合し、特定の二次構造を形成するモチーフをＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｆｅａｔｕｒｅｓ（ＭｏＲＦｓ）という。本発明者は、ＭｏＲＦｓであると予測されるＡＳＡＲＭペプチドのＣ末端側の立体構造に基づいて設計した環状ペプチドが生体組織石灰化抑制活性を有することを見いだし、本発明を完成させた。
　本発明の第１の観点に係る環状ペプチド又はその塩は、
　配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列においてＮ末端のアミノ酸及びＣ末端のアミノ酸の少なくとも一方のアミノ酸が欠失若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、
　配列番号１に示されるアミノ酸配列におけるＮ末端から２番目、４番目及び６番目のセリン残基に相当する３個のセリン残基の少なくとも２個がリン酸化されており、
　生体組織石灰化を抑制する作用を有する。
　上記本発明の第１の観点に係る環状ペプチド又はその塩は、
　配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる、
　こととしてもよい。
　前記３個のセリン残基がリン酸化されている、
　こととしてもよい。
　上記本発明の第１の観点に係る環状ペプチド又はその塩は、
　配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなる、
　こととしてもよい。
　上記本発明の第１の観点に係る環状ペプチド又はその塩は、
　配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなる、
　こととしてもよい。
　本発明の第２の観点に係る医薬組成物は、
　上記本発明の第１の観点に係る環状ペプチド又はその塩を含有する。
　本発明の第３の観点に係る生体組織石灰化抑制剤は、
　上記本発明の第１の観点に係る環状ペプチド又はその塩を含有する。
　本発明に係る環状ペプチド、環状ペプチドの塩、医薬組成物及び生体組織石灰化抑制剤は、ＡＳＡＲＭペプチドより分子量が小さく、かつ生体組織石灰化を抑制することができる。
（Ａ）ＡＳＡＲＭペプチド誘導体の立体構造を示す図である。（Ｂ）ＡＳＡＲＭペプチド誘導体の立体構造に基づいて設計された環状ペプチドＹＳ－１の立体構造を示す図である。（Ｃ）ＡＳＡＲＭペプチド誘導体の立体構造と重ね合わせたＹＳ－１の立体構造を示す図である。 （Ａ）図１（Ｂ）に示されたＹＳ－１の立体構造に基づいて設計された環状ペプチドＹＳ－２の立体構造を示す図である。（Ｂ）ＹＳ－１の立体構造と重ね合わせたＹＳ－２の立体構造を示す図である。 環状ペプチドの安定性試験における保存日数ごとの主成分の残量を示す図である。 環状ペプチドの平滑筋細胞における石灰化抑制活性を示す図である。 （Ａ）平滑筋細胞における石灰化マーカー遺伝子Ｓｐｐ１の発現量を示す図である。（Ｂ）平滑筋細胞における平滑筋細胞のマーカー遺伝子Ｔａｇｌｎの発現量を示す図である。 環状ペプチドの骨芽細胞における石灰化抑制活性を示す図である。 （Ａ）骨芽細胞における骨芽細胞のマーカー遺伝子Ｓｐｐ１の発現量を示す図である。（Ｂ）骨芽細胞における骨芽細胞のマーカー遺伝子Ｉｂｓｐの発現量を示す図である。（Ｃ）骨芽細胞における骨芽細胞のマーカー遺伝子Ｂｇｌａｐの発現量を示す図である。 血管石灰化への関与が強く示唆されているカルシプロテイン粒子（ＣＰＰ）の形成抑制試験における吸光度を示す図である。 ＣＰＰの形成抑制試験における非晶質リン酸カルシウム含有一次ＣＰＰ（ＣＰＰＩ）から結晶性ヒドロキシアパタイト含有二次ＣＰＰ（ＣＰＰＩＩ）の形成を５０％抑制するのに要する時間の陰性対照（ＮＣ）との差（ΔＴ５０）を示す図である。
　本発明に係る実施の形態について図面を参照して説明する。本発明は下記の実施の形態及び図面によって限定されるものではない。下記の実施の形態において、“有する”、“含む”又は“含有する”といった表現は、“からなる”又は“から構成される”という意味も包含する。なお、本実施の形態における環状ペプチドについての説明はその塩についても適用される。
　（実施の形態１）
　本実施の形態に係る環状ペプチドは、生体組織石灰化を抑制する作用を有する。ここでの生体組織石灰化は、例えば、硬組織石灰化及び異所性石灰化の少なくとも一方である。“異所性石灰化”は、特には“血管石灰化”である。血管石灰化として、腎疾患又は透析に伴う血管石灰化及び動脈硬化による血管石灰化等が挙げられる。“硬組織”は、生体硬組織を意味し、例えば、頭蓋及び体幹の骨格を形成する骨組織、歯周組織を構成する歯槽骨及びセメント質、象牙質又はこれらを構成する細胞等を含む。好ましくは、硬組織は骨組織である。
　本実施の形態に係る環状ペプチドは、分子内脱水を引き起こすアスパルチミド化を抑制するために、アミノ酸配列が配列番号３に示されるヒトＡＳＡＲＭペプチドのアミノ酸配列中の一部のアスパラギン酸残基を欠失又は置換し、安定性の向上が図られた直鎖状のＡＳＡＲＭペプチド誘導体の立体構造に基づいて設計された環状ペプチドである。ＡＳＡＲＭペプチド誘導体のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
　当該環状ペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列においてＮ末端のアミノ酸及びＣ末端のアミノ酸の少なくとも一方のアミノ酸が欠失若しくは置換されたアミノ酸配列からなる。配列番号１に示されるアミノ酸配列においてＮ末端及びＣ末端の少なくとも１個のアミノ酸が欠失若しくは置換されたアミノ酸配列は、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端のシステイン残基が欠失、好ましくは置換されており、Ｃ末端のシステイン残基が置換、好ましくは欠失しているアミノ酸配列である。このようなアミノ酸配列として、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列が挙げられる。
　本実施の形態に係る環状ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末端、すなわちグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列であってもよい。別のアミノ酸残基とは、例えば、アラニン残基（Ａ）、アルギニン残基（Ｒ）、アスパラギン残基（Ｎ）、アスパラギン酸残基（Ｄ）、システイン残基（Ｃ）、グルタミン残基（Ｑ）、グルタミン酸残基（Ｅ）、ヒスチジン残基（Ｈ）、イソロイシン残基（Ｉ）、ロイシン残基（Ｌ）、リシン残基（Ｋ）、メチオニン残基（Ｍ）、フェニルアラニン残基（Ｆ）、セリン残基（Ｓ）、トレオニン残基（Ｔ）、トリプトファン残基（Ｗ）、チロシン残基（Ｙ）及びバリン残基（Ｖ）である。これらの置換されたアミノ酸配列は、配列番号５～２２に示される。なお、上記別のアミノ酸残基は、環状ペプチドの立体構造における側鎖の配向から好ましくはＤ体であるが、Ｌ体であることは除外されない。
　本実施の形態に係る環状ペプチドのアミノ酸配列は、生体組織石灰化抑制作用を有する限り、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から５番目のグルタミン酸残基及び７番目のアスパラギン酸残基が他のアミノ酸残基に置換されてもよい。グルタミン酸残基は、好ましくはアスパラギン酸残基又はグルタミン残基に置換される。アスパラギン酸残基は、好ましくは、グルタミン酸残基又はアスパラギンに置換される。なお、アスパラギン酸に置き換わる他のアミノ酸は、ヒト以外の生物種のＭＥＰＥ由来のＡＳＡＲＭペプチドにおける対応するアミノ酸であってもよい。
　本実施の形態において“環状”とは、２アミノ酸残基以上離れた２個のアミノ酸が直接、又はリンカー等を介して結合することによって分子内に形成される閉環構造を意味する。当該環状ペプチドは任意の態様で環状化されてよい。例えば、ペプチドのＮ末端とＣ末端とを直接アミド結合（ペプチド結合）又はペプチドリンカーによって連結することによって環状ペプチドが得られる。また、当該環状ペプチド又はペプチドリンカーに含まれるアミノ酸残基の側鎖の官能基同士を連結することによって環状化してもよい。環状ペプチドの態様は、直鎖状としたペプチドのＮ末端のアミノ酸残基とＣ末端のアミノ酸残基との結合に限られず、末端のアミノ酸残基と末端以外のアミノ酸残基との結合、又は末端以外のアミノ酸残基同士の結合により形成されてもよい。好ましくは、本実施の形態に係る環状ペプチドは、Ｎ末端のアミノ酸残基とＣ末端のアミノ酸残基とが連結されている。
　環状ペプチドには、ペプチドを構成するアミノ酸残基の官能基を介した分子内結合で環状化した環状ペプチドが包含される。分子内結合は共有結合であれば特に限定されず、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、ペプチド結合、エーテル結合、エステル結合、アルキル結合、アルケニル結合、ホスホネートエーテル結合、アゾ結合、Ｃ－Ｓ－Ｃ結合、Ｃ－Ｎ－Ｃ結合、Ｃ＝Ｎ－Ｃ結合、アミド結合、ラクタム架橋、カルバモイル結合、尿素結合、チオ尿素結合、アミン結合及びチオアミド結合等が挙げられる。２個のアミノ酸残基が主鎖において結合する場合、ペプチド結合により閉環構造が形成される。また、２個のアミノ酸残基間の共有結合は、２個のアミノ酸残基の側鎖同士、あるいは、２個のアミノ酸残基の側鎖と主鎖との結合等により形成されてもよい。好ましくは、配列番号１に示すアミノ酸配列のように両末端がシステイン残基の場合、環状ペプチドは、Ｎ末端の側鎖とＣ末端の側鎖とがジスルフィド結合で連結されてもよい。また、環状ペプチドのアミノ酸配列が配列番号２、５～２２に示される場合、Ｎ末端のアミノ基とＣ末端のカルボキシル基とのペプチド結合を介して環状にしてもよい。
　環状ペプチドは、Ｎ末端及びＣ末端の少なくとも一方を化学修飾したうえでＮ末端とＣ末端とを連結したものでもよい。Ｎ末端の化学修飾としては、アミノ基のアセチル化、クロロアセチル化、ミリストイル化、パルミトイル化、アセチル化及びマレイミド化等が挙げられる。Ｃ末端の化学修飾としては、カルボキシル基のアミド化、エステル化及びアルコール化等が挙げられる。例えば、環状ペプチドは、Ｎ末端のアセチル基と、Ｃ末端のシステイン残基のチオール基とがチオエーテル結合を介して結合していてもよい。また、環状ペプチドは、Ｎ末端のクロロアセチル基と、Ｃ末端のシステイン残基のチオール基とがチオエーテル結合を介して結合していてもよい。
　本実施の形態に係る環状ペプチドの塩としては、薬理学的に許容される塩であれば特に限定されず、酸性塩及び塩基性塩のいずれであってもよい。酸性塩として、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩及びリン酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩及びプロピオン酸塩等の有機酸塩等が挙げられる。塩基性塩として、例えば、ナトリウム塩及びカリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩及びマグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
　本実施の形態に係る環状ペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列におけるＮ末端から２番目、４番目及び６番目のセリン残基に相当する３個のセリン残基の少なくとも２個がリン酸化されている。好ましくは、本実施の形態に係る環状ペプチドは、当該３個のセリン残基のすべてがリン酸化されている。配列番号１に示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から２番目、４番目及び６番目のセリン残基がリン酸化された場合のアミノ酸配列を配列番号２３に示す。配列番号１に示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から４番目及び６番目のセリン残基がリン酸化された場合のアミノ酸配列を配列番号２４に示す。
　本実施の形態に係る環状ペプチドは、公知の方法で合成することができる。例えば、当該環状ペプチドは、化学的なポリペプチド合成法で合成されてもよいし、大腸菌等を用いた遺伝子工学的な方法で合成されてもよい。例えば、ポリペプチド合成法としては、フラグメント縮合法等の液相法又はＦｍｏｃ法等の固相法を挙げることができる。液相法は、反応を溶液状態で行い、反応混合物から生成物を単離精製し、得られた生成物を中間体として次のペプチド伸長反応に用いる方法である。一方、固相法は、反応溶媒に対して不溶の固相担体にアミノ酸を結合させ、このアミノ酸に縮合反応を順次行い、ペプチドを伸長する方法である。ペプチドは、ペプチドを構成する部分ペプチド又はアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより合成することもできる。なお、上記のペプチド合成法は、市販の自動合成機を用いて行うこともできる。
　リン酸化したセリン残基については、保護リン酸化セリンを縮合し、合成の最終段階においてリン酸の保護基を除去するプレリン酸化法等の公知の方法で行うことができる。
　好ましくは、環状ペプチドは、上述の方法で得られた非環状ペプチドを環化させることで得られる。非環状ペプチドを環化させる方法として公知の方法を採用すればよい。ペプチド結合によりペプチドを環化させる方法としては、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド等を用いる脱水縮合反応、対称酸無水物法及び活性エステル法等が挙げられる。ジスルフィド結合により環状ペプチドを環化させる方法としては、例えば空気酸化法及びフェリシアン化カリウムを用いる酸化法が挙げられる。
　また、非環状ペプチドのＮ末端を、ハロゲン化アセチル基で修飾した場合、当該残基のハロゲン化アセチル基とＣ末端のシステイン残基のチオール基とを塩基性の緩衝液中で反応させることにより反応させてチオエーテル結合を形成させることにより環化させる方法が挙げられる。
　得られた環状ペプチドは、例えば、再結晶、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及びエドマン分解法等により精製又は解析してもよい。上記の環化反応では、反応条件によっては環状ペプチド以外に、複数の非環状ペプチドが分子間結合により連結したオリゴマーが形成される場合がある。したがって、環状ペプチドを得るために、環化反応後の環状ペプチドを逆相高速液体クロマトグラフィー等により精製することが好ましい。
　本実施の形態に係る環状ペプチドは、生体組織石灰化抑制等の活性を有するうえ、ＡＳＡＲＭペプチドより分子量が小さい。よって、分子量が小さいため、製造工程が簡素化でき、製造コストを抑制することができる。また、ＡＳＡＲＭペプチドは、アミノ酸配列内にアスパルチミド化が生じやすい部位を構成するアスパラギン酸残基が複数存在し、安定性に改善の余地があった。本実施の形態に係る環状ペプチドは、アミノ酸配列に含まれるアスパラギン酸残基の個数が少ないためＡＳＡＲＭペプチドより安定である。
　（実施の形態２）
　本実施の形態に係る医薬組成物は、上記の実施の形態１に係る環状ペプチド又はその塩を含有する。当該医薬組成物は、上記環状ペプチド又はその塩を有効成分として含む。好適には、当該医薬組成物は生体組織石灰化抑制剤である。以下では、医薬組成物として、生体組織石灰化抑制剤について説明する。
　本実施の形態に係る生体組織石灰化抑制剤は、例えば、液剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、粉剤、タブレット又はカプセル剤等である。生体組織石灰化抑制剤における実施の形態１に係る環状ペプチドの有効成分としての含有量は、適宜調整される。
　本実施の形態に係る生体組織石灰化抑制剤の使用対象は、細胞、生体組織、生物及び動物等である。さらに使用方法等については、石灰化抑制剤としての効能、対象とする物質、動物もしくは生物等、及び当該対象の石灰化状態の程度を考慮したうえで、適当な使用量及び使用手段を用いればよい。
　本実施の形態に係る生体組織石灰化抑制剤が使用される疾患として、例えば、ＧＡＣＩ、ＦＯＰ、後縦靭帯骨化症（ＯＰＬＬ）、黄色靭帯骨化症、変形性関節症並びに血管石灰化を呈する慢性腎臓病及び動脈硬化等が挙げられる。医薬品としての生体組織石灰化抑制剤は、ヒト及び非ヒト動物に投与される。非ヒト動物としては、好ましくは哺乳類で、より具体的には、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ及びシカ等があげられる。
　本実施の形態に係る生体組織石灰化抑制剤のヒト等への投与経路は特に限定されない。上記生体組織石灰化抑制剤は、注射剤又は経口投与剤として用いられるのが好ましい。生体組織石灰化抑制剤は、例えば、上記の環状ペプチドと、薬理的に許容される担体とを含む。薬理的に許容される担体は、製剤素材として用いられる各種の有機担体物質又は無機担体物質である。薬理的に許容される担体は、例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤、又は液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤である。また、必要に応じて、生体組織石灰化抑制剤に、防腐剤、抗酸化剤、着色剤及び甘味剤等の添加物が配合されてもよい。
　本実施の形態に係る生体組織石灰化抑制剤は、既知の方法で製造され、有効成分として０．０００００１～９９．９重量％、０．００００１～９９．８重量％、０．０００１～９９．７重量％、０．００１～９９．６重量％、０．０１～９９．５重量％、０．１～９９重量％、０．５～６０重量％、１～５０重量％又は１～２０重量％の上記環状ペプチドを含む。
　本実施の形態に係る生体組織石灰化抑制剤の投与量は、投与対象のヒト又は非ヒト動物の年齢、体重及び症状等によって適宜決定される。当該生体組織石灰化抑制剤は、上記環状ペプチドが有効量となるように投与される。有効量とは、所望の結果を得るために必要な環状ペプチドの量であり、治療又は処置する状態、例えば生体組織の石灰化の進行の遅延、阻害、予防、逆転又は治癒をもたらすのに必要な量である。
　本実施の形態に係る生体組織石灰化抑制剤の投与量は、典型的には、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．２ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇであり、１日に１回、又は複数回投与することができる。また、生体組織石灰化抑制剤は、毎日、隔日、１週間に１回、隔週、１ヶ月に１回等の様々な投与頻度で投与してもよい。好ましくは、投与頻度は、医師等により容易に決定される。なお、必要に応じて、上記の範囲外の量を用いることもできる。
　また、本実施の形態に係る生体組織石灰化抑制剤は、変形性関節症又は血管石灰化の病態進展阻止等の研究の手段として利用してもよい。
　本実施の形態に係る生体組織石灰化抑制剤によれば、安定性が向上した環状ペプチドを含有するため、ＡＳＡＲＭペプチドよりも生体内で分解されにくいと考えられる。これにより、病態に応じた投与方法を適用することができる。また、本実施の形態に係る生体組織石灰化抑制剤は、生体組織石灰化抑制活性が高いため、投与量を減らすことができる。
　なお、本実施の形態に係る環状ペプチドの血中安定性を向上させるため、環状ペプチドを糖鎖で修飾してもよいし、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等で修飾してもよい。また、上述の置換可能なアミノ酸を他のアミノ酸に置換することで安定性を向上させてもよい。また、標的の臓器又は組織に環状ペプチドを効率よく輸送するため、リポソーム製剤化等の公知のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）を利用してもよい。
　別の実施の形態では、上記実施の形態１に係る環状ペプチドを含む試薬が提供される。また、他の実施の形態では、上記生体組織石灰化抑制剤は、生体組織石灰化抑制用経口組成物としても使用できる。経口組成物としては、具体的には、サプリメント、食品組成物、飲食品、機能性食品及び食品添加剤が挙げられる。
　サプリメントの形態は、特に制限されず、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、糖衣錠、フイルム剤、トローチ剤、チュアブル剤、溶液、乳濁液及び懸濁液等の任意の形態でよい。サプリメントは、サプリメントとして通常使用される任意の成分を含んでもよい。
　“機能性食品”とは、健康の維持の目的で摂取する食品又は飲料を意味し、保健機能食品である特定保健用食品、栄養機能食品、健康食品及び栄養補助食品等を含む。機能性食品としては、保健機能食品である特定保健用食品又は栄養機能食品が好ましい。なお、機能性食品として製品化する場合には、食品に用いられる様々な添加剤、具体的には、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、漂白剤、防菌防黴剤、酸味料、甘味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤及び香料等を添加してもよい。なお、機能性食品である食品及び飲料は特に限定されるものではない。機能性食品の形態は、例えば、飲料、菓子、穀類加工品、練り製品、乳製品及び調味料等である。
　また、上記生体組織石灰化抑制剤は、食品添加剤として食品に添加されてもよい。この場合、当該食品添加剤は、食品に添加しやすいように、ペースト剤、ゲル状剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤及び顆粒剤等であってもよい。
　他の実施の形態では、上記実施の形態１に係る環状ペプチドを患者に投与することにより生体組織の石灰化を抑制する方法が提供される。また、別の実施の形態は、生体組織の石灰化を抑制するための上記実施の形態１に係る環状ペプチドの使用である。他の実施の形態では、生体組織石灰化抑制剤としての使用のための上記実施の形態１に係る環状ペプチドが提供される。また、別の実施の形態は、生体組織石灰化抑制剤の製造のための上記実施の形態１に係る環状ペプチドの使用である。
　以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
　［環状ペプチドの構造の検討］
　上記実施の形態に係る環状ペプチドは、直鎖状のＡＳＡＲＭペプチド誘導体（配列番号４）の立体構造に基づいて設計された。ＡＳＡＲＭペプチド誘導体について、主に生体高分子の解析用ソフトウェアであるＹＡＳＡＲＡ（ＹＡＳＡＲＡ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて伸長構造を発生させた後、ＹＡＳＡＲＡのＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓモジュールを用いて立体構造を構築した。ＹＡＳＡＲＡのＥｎｅｒｇｙ　Ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎモジュールによって最適化したＡＳＡＲＭペプチド誘導体の立体構造を図１（Ａ）に示す。ＡＳＡＲＭペプチド誘導体の立体構造は、環状に近い構造で安定化すると予測される。
　ＹＡＳＡＲＡを用いて、ＡＳＡＲＭペプチド誘導体のＣ末端側の領域（配列番号４に示されるアミノ酸配列のＮ末端から８番目のグリシン残基からＣ末端まで）の立体構造を抽出し、グリシン残基をシステイン残基に置換し、Ｃ末端にシステイン残基を付加した後、Ｎ末端のシステイン残基の側鎖とＣ末端のシステイン残基の側鎖とをジスルフィド結合で連結した環状ペプチドＹＳ－１（配列番号２５）を設計した。なお、ＹＳ－１のＮ末端のアミノ基及びＣ末端のカルボキシル基はそれぞれアセチル化及びアミド化されている。Ｅｎｅｒｇｙ　Ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎモジュールにより最適化したＹＳ－１の立体構造を図１（Ｂ）に示す。ＡＳＡＲＭペプチド誘導体の立体構造とＹＳ－１の立体構造とを重ね合わせると、図１（Ｃ）に示すように、ＹＳ－１の立体構造は、生体組織石灰化抑制に係る活性中心であると考えられるＡＳＡＲＭペプチド誘導体のＣ末端側の領域の立体構造と類似すると予測された。
　さらにＹＳ－１の立体構造を観察し、アミノ酸配列が配列番号２６に示される環状ペプチドＹＳ－２を設計した。ＹＳ－２のＮ末端のアミノ基とＣ末端のカルボキシル基とをペプチド結合を介して連結して環状にし、Ｅｎｅｒｇｙ　Ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎモジュールにより最適化したＹＳ－２の立体構造を図２（Ａ）に示す。ＹＳ－２の立体構造をＹＳ－１の立体構造と重ねて表示した図２（Ｂ）に示すように、図２（Ａ）に示すＹＳ－２の立体構造はＹＳ－１の立体構造とほとんど同じであることが予測された。なお、ＹＳ－２の立体構造を観察することで、ＹＳ－２のアミノ酸配列のＮ末端のグリシン残基は、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ又はＶに置換しても環状ペプチドの立体構造に大きな変化はなく、活性を有すると考えられる。特に、Ｎ末端のグリシン残基に置換するアミノ酸残基は、側鎖の配向からこれらのアミノ酸残基のＤ体が好ましい。
　［環状ペプチドの合成］
　配列番号２７に示すペプチドｐＡＳＡＲＭ、配列番号２８に示す環状ペプチドｃＡＳＡＲＭ及びＹＳ－１を合成した。ｐＡＳＡＲＭ、ｃＡＳＡＲＭ及びＹＳ－１は固相化法で合成し、リン酸化セリンには、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ）－ＯＨをビルディングブロックとして用いた。ｃＡＳＡＲＭの合成では、Ｎ末端のアミノ基をクロロアセチル化し、Ｃ末端のシステイン残基のカルボキシル基をアミド化した。続いて、Ｎ末端のクロロアセチル基とＣ末端のシステイン残基のチオール基とをチオエーテル結合で連結した。ＹＳ－１の合成では、Ｎ末端のアミノ基をアセチル化し、Ｃ末端のカルボキシル基をアミド化し、Ｎ末端のシステイン残基の側鎖とＣ末端のシステイン残基の側鎖とをジスルフィド結合で連結した。
　各ペプチドはＯＤＳカラム及び０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルを用いた高効率液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＨＰＬＣ）で精製し、純度は９０～９５％であった。各ペプチドはＴＦＡ塩（一部アンモニウム塩）で調製した。
　［環状ペプチドの安定性試験］
　ＨＰＬＣを用いて環状ペプチドの安定性を評価した。ＰＢＳに溶解したｐＡＳＡＲＭ、ｃＡＳＡＲＭ及びＹＳ－１（すべて８．３μｇ／ｍＬ）を１０μＬずつ１２本用意し、うち３本ずつは０日（用事調製）として直ちに－８０℃で保存した。残りの９本については、３日、７日及び１４日間３７℃でインキュベートした後、－８０℃で保存した。ＨＰＬＣでは、４．６ｍｍ径のＩｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３カラム（ＧＬ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用し、Ａ液を０．１％トリフルオロ酢酸、Ｂ液を１００％アセトニトリルとして、流速１．５ｍＬ／分で測定した。グラジエントは３０分でＢ液を１～６０％とし、波長２２０ｎｍで検出した。各ペプチドに対応するピーク値を算出し、０日を１００％として、各ペプチドの残量を算出した。
　（結果）
　図３に保存日数ごとの各ペプチドの残量を示す。ＹＳ－１及びｃＡＳＡＭＲの残量は１４日間保存してもほとんど減少しなかった。
　［マウス平滑筋細胞を用いた石灰化抑制活性の検討］
　マウス大動脈血管平滑筋細胞由来の細胞株であるＭＯＶＡＳ細胞（ＡＴＣＣより取得）を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（増殖培地）にて３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養及び維持した。７．５×１０３個のＭＯＶＡＳ細胞を４８穴プレートに播種した。播種１日後、培地を石灰化誘導培地（２．７ｍＭカルシウムと２．５ｍＭリン酸とを加えた増殖培地）に交換した。石灰化誘導培地には５μＭ　ｐＡＳＡＲＭ、５μＭ　ｃＡＳＡＲＭ、５μＭ　ＹＳ－１、５μＭ　フィチン酸（ＩＰ６）又はＰＢＳを添加した（ｎ＝４又は６）。ＩＰ６は石灰化抑制活性を有することが知られている。培地を２～３日おきに交換し、石灰化誘導７日で次の各解析を行った。
　７日間の石灰化誘導後、１００μＬの０．６Ｎ　ＨＣｌで２４時間振盪し、細胞外基質に沈着したカルシウムを可溶化した。カルシウム量はカルシウムＥ－テストワコー（富士フィルム和光純薬社製）を用いて定量した。また、カルシウム可溶化後の細胞に１００μＬの０．１Ｎ　ＮａＯＨ／０．１％ＳＤＳを加えて２時間振盪し、タンパク質を抽出した。タンパク質はＰｉｅｒｃｅ（商標）　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて定量した。各サンプル中のカルシウム量をタンパク質量で補正し、各サンプルのカルシウム量を比較した。
　７日間の石灰化誘導後、ＲＮＡｉｓｏ　Ｐｌｕｓ（タカラバイオ社製）を用いてマニュアルに従いトータルＲＮＡを抽出した。５００ｎｇのトータルＲＮＡからＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ（商標）　ｑＰＣＲ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　ｗｉｔｈ　ｇＤＮＡ　Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。ｑＰＣＲはＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）とＴｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄ　Ｎｅｘｔ　ＳＹＢＲ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘとを用いて行った。Ｒｐｌ１８の発現量を内部標準として、ターゲットの遺伝子の発現量を相対定量した。以下にｑＰＣＲに使用したプライマーのシークエンスを示す。Ｒｐｌ１８に対するプライマーの塩基配列を配列番号２９及び３０に示す。Ｓｐｐ１に対するプライマーの塩基配列を配列番号３１及び３２に示す。Ｔａｇｌｎに対するプライマーの塩基配列を配列番号３３及び３４に示す。
　（結果）
　図４に細胞外基質に沈着したカルシウム（石灰化）量を示す。石灰化を誘導していないサンプル（陰性対照；ＮＣ）に対して石灰化誘導培地によって石灰化沈着が増加するところ（“ＰＢＳ”参照）、ｐＡＳＡＲＭ、ｃＡＳＡＲＭ又はＹＳ－１によって石灰化沈着が抑制された。
　図５（Ａ）に示すように、骨基質に多く分布し、平滑筋の石灰化で高発現するＳｐｐ１の発現をｐＡＳＡＲＭ、ｃＡＳＡＲＭ及びＹＳ－１は抑制した。図５（Ｂ）に示すように、ｐＡＳＡＲＭ、ｃＡＳＡＲＭ及びＹＳ－１を添加した場合、石灰化誘導培地で培養したにも関わらず、平滑筋細胞のマーカーであるＴａｇｌｎの高発現が維持された。
　ヒトＡＳＡＲＭペプチドの活性には、リン酸化セリンを含むＣ末端側の領域のみならずＮ末端側の領域も必須である（Ｔｏｍｏｋｏ　Ｍｉｎａｍｉｚａｋｉ、外６名、「Ａｃｔｉｖｅ　ｓｉｔｅｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ＭＥＰＥ－ＡＳＡＲＭ　ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ｂｏｎｅ　ｍａｔｒｉｘ　ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、２０２０年、５１７、１１０９３１）が、Ｃ末端側の領域を欠くＹＳ－１は血管石灰化を抑制した。
　［マウス骨芽細胞を用いた石灰化抑制活性及び骨形成への影響の検討］
　マウス頭頂骨由来の細胞株であるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞（ＲＩＫＥＮから取得）を、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭ（増殖培地）に３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養及び維持した。まず、０．４×１０４個／ｃｍ２のＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を４８穴プレートに播種した。播種１日後、培地を、分化誘導培地（５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸を加えた増殖培地）に交換した。播種５日後（９０％コンフルエンス）より、石灰化誘導培地（３ｍＭ　βグリセロリン酸（βＧＰ）を加えた分化誘導培地）に１０μＭ　ｐＡＳＡＲＭ、１０μＭ　ｃＡＳＡＲＭ、１０μＭ　ＹＳ－１又はＰＢＳを添加した（ｎ＝３）。培地は２～３日おきに交換し、石灰化誘導８日で次の各解析を行った。
　８日間の石灰化誘導後、ＰＢＳで洗浄したのち２００μＬの４％パラフォルムアルデヒドで細胞を固定した。アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）／ｖｏｎ　Ｋｏｓｓａ二重染色を施してＫＥＹＥＮＣＥ　ＢＺ－Ｘ８００で写真撮影後、ＡＬＰ陽性かつｖｏｎ　Ｋｏｓｓａ陽性の石灰化沈着部位の面積をＩｍａｇｅＪで定量した。
　８日間の石灰化誘導後、ＲＮＡｉｓｏ　Ｐｌｕｓ（タカラバイオ社製）を用いてマニュアルに従いトータルＲＮＡを抽出した。２μｇのトータルＲＮＡからＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ及びＯｌｉｇｏ　ｄｔ（２０）プライマー（東洋紡社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。ｑＰＣＲはＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）とＴｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄ　Ｎｅｘｔ　ＳＹＢＲ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘとを用いて行った。Ｒｐｌ３２の発現量を内部標準として、ターゲットの遺伝子の発現量を相対定量した。Ｒｐｌ３２に対するプライマーの塩基配列を配列番号３５及び３６に示す。Ｉｂｓｐに対するプライマーの塩基配列を配列番号３７及び３８に示す。Ｂｇｌａｐに対するプライマーの塩基配列を配列番号３９及び４０に示す。Ｓｐｐ１に対するプライマーは、上述のマウス平滑筋細胞を用いた石灰化抑制活性の検討と同じである。
　（結果）
　図６に石灰化沈着部位の面積を示す。ｐＡＳＡＲＭ、ｃＡＳＡＲＭ及びＹＳ－１は、石灰化沈着を抑制しなかった。図７（Ａ）～（Ｃ）に示すように、骨基質に多く分布するＳｐｐ１並びに骨芽細胞マーカーであるＩｂｓｐ及びＢｇｌａｐの発現量において、ｐＡＳＡＲＭ、ｃＡＳＡＲＭ及びＹＳ－１は、βＧＰと有意差はなかった。よって、ＹＳ－１は骨形成に影響しないことが示された。
　［カルシプロテイン粒子（ＣＰＰ）の形成抑制試験］
　４０ｍＭ　ＣａＣｌ２を含む１００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－１４０ｍＭ　ＮａＣｌバッファー（ＨＢＳ、ｐＨ７．４）にヒト血清を添加し、１分間撹拌した後、２４ｍＭリン酸ブッファー（ｐＨ７．４）を添加し、さらに１分間撹拌した。それぞれ３７℃に維持した。この溶液に２０μＭのＹＳ－１、２０μＭのＩＰ６又は溶媒のみ（ＮＣ、１／５０　ＰＢＳ）を添加した。混合比率は容積比で５：８：５：２とした。３７℃で加温したまま、測定前に１分間撹拌し、３分間隔で５５０ｎｍの吸光度を測定し、ＣＰＰの形成を測定した。ＣＰＰの形成に対する効果はΔＴ５０で評価した。
　（結果）
　図８は５５０ｎｍにおける吸光度の経時変化を示す。ＣＰＰＩからＣＰＰＩＩが形成されるに従って吸光度が大きくなる。ΔＴ５０を図９に示す。ＹＳ－１はＩＰ６よりもＣＰＰＩＩの形成を遅延させた。
　上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
　本出願は、２０２１年８月３１日に出願された日本国特許出願２０２１－１４０６２０号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０２１－１４０６２０号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
　本発明は、硬組織石灰化及び異所性石灰化等の生体組織の石灰化を抑制する医薬に好適である。

Claims (7)

  1. 　配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列においてＮ末端のアミノ酸及びＣ末端のアミノ酸の少なくとも一方のアミノ酸が欠失若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、
    　配列番号１に示されるアミノ酸配列におけるＮ末端から２番目、４番目及び６番目のセリン残基に相当する３個のセリン残基の少なくとも２個がリン酸化されており、
    　生体組織石灰化を抑制する作用を有する、
    　環状ペプチド又はその塩。
  2. 　配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる、
    　請求項１に記載の環状ペプチド又はその塩。
  3. 　前記３個のセリン残基がリン酸化されている、
    　請求項１又は２に記載の環状ペプチド又はその塩。
  4. 　配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなる、
    　請求項１に記載の環状ペプチド又はその塩。
  5. 　配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなる、
    　請求項１に記載の環状ペプチド又はその塩。
  6. 　請求項１から５のいずれか一項に記載の環状ペプチド又はその塩を含有する、
    　医薬組成物。
  7. 　請求項１から５のいずれか一項に記載の環状ペプチド又はその塩を含有する、
    　生体組織石灰化抑制剤。
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