ES2562425T3

ES2562425T3 - Proteínas de fusión terapéuticas

Info

Publication number: ES2562425T3
Application number: ES12722486.3T
Authority: ES
Inventors: John Chaddock; Elaine HARPER
Original assignee: Ipsen Bioinnovation Ltd
Current assignee: Ipsen Bioinnovation Ltd
Priority date: 2011-05-16
Filing date: 2012-05-16
Publication date: 2016-03-04
Anticipated expiration: 2032-05-16
Also published as: US10081803B2; HK1192587A1; EP2710129A1; MX348047B; JP6050330B2; AU2012257578A1; EP2710129B1; JP2014516526A; US20140147429A1; UA112985C2; CA2835285C; RU2651492C2; BR112013029525A2; AU2012257578B9; KR20140036239A; RU2013155594A; MX2013013447A; BR112013029525A8; US20190062721A1; CA2835285A1

Abstract

Una proteína de fusión de polipéptido monocatenario, que comprende: (a) una proteasa no citotóxica capaz de romper una proteína del aparato de fusión exocítica de una célula diana; (b) un resto de transporte dirigido que es capaz de unirse a un sitio de unión sobre la célula diana, y dicho sitio diana es capaz de sufrir una endocitosis para ser incorporado en un endosoma dentro de la célula diana; (c) un dominio de translocación que es capaz de translocar la proteasa desde el interior de un endosoma, a través de la membrana endosómica y hacia el citosol de la célula diana; (d) un primer sitio de ruptura de proteasas, en cuyo sitio la proteína de fusión puede ser rota por una primera proteasa, en la que el primer sitio de ruptura de proteasas está localizado entre la proteasa no citotóxica y el dominio de translocación; (e) un segundo sitio de ruptura de proteasas, en cuyo sitio la proteína de fusión puede ser rota por una segunda proteasa, en la que el segundo sitio de ruptura de proteasas está localizado entre el dominio de translocación y el resto de transporte dirigido; y (f) un enlace covalente entre el resto de transporte dirigido y el dominio de translocación, en la que, después de la ruptura proteolítica en el segundo sitio de ruptura de proteasas, el resto de transporte dirigido permanece unido al dominio de translocación por dicho enlace covalente; en la que, después de la ruptura en el primer y segundo sitio de ruptura de proteasas, el resto de transporte dirigido es capaz de interaccionar con el sitio de unión sobre la célula diana a través de una interacción entre un dominio Nterminal del resto de transporte dirigido y un dominio del sitio de unión, y simultáneamente a través de una interacción entre un dominio C-terminal del resto de transporte dirigido y un dominio del sitio de unión.

Description

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ADN en células que expresan α9β1 integrina (Schneider et al., 1999). La referencia a estos TM peptídicos incluye todos sus fragmentos de unión funcionales, variantes y análogos.

Otros TM de la presente invención incluyen los descubiertos mediante técnicas de presentación de fagos, en particular aquellos que se dirigen y son internalizados por células epiteliales de las vías respiratorias humanas. Estos incluyen los péptidos THALWHT lineal y cíclico (Jost et al., 2001); LEBP-1 (QPFMQCLCLIYDASC), LEBP-2 (RNVPPIFNDVYWIAF) y LEBP-3 (VFRVRPWYQSTSQS) (Wu et al., 2003); CDSAFVTVDWGRSMSLC (Florea et al., 2003); SERSMNF, YGLPHKF, PSGAARA, LPHKSMP, LQHKSMP (Writer et al., 2004); FSLSKPP, HSMQLST y STQAMFQ (Rahim et al., 2003). La referencia a estos TM peptídicos incluye todos sus fragmentos de unión funcionales, variantes y análogos.

En una realización, el TM comprende o consiste en una primera y una segunda porción (por ejemplo, dominios). En una realización, la primera y la segunda porción del resto de transporte dirigido pueden derivarse del mismo ligando (por ejemplo, cualquiera de los ligandos de TM identificados anteriormente). La primera y la segunda porción pueden unirse al mismo sitio o a sitios diferentes sobre el mismo receptor. Como alternativa, la primera y la segunda porción pueden unirse a sitios sobre receptores diferentes.

La primera y la segunda porción del resto de transporte dirigido pueden derivarse de ligandos diferentes (por ejemplo, cualquiera de los ligandos de TM identificados anteriormente), que pueden unirse al mismo receptor o a receptores diferentes. Por consiguiente, el TM puede ser un híbrido de dos TM. La primera y la segunda porción pueden unirse al mismo sitio o a sitios diferentes sobre el mismo receptor. Como alternativa, la primera y la segunda porción pueden unirse a sitios sobre receptores diferentes.

El TM puede incluir también una tercera y/o posterior porción procedente de otros TM (por ejemplo, cualquiera de los ligandos de TM identificados anteriormente).

En una realización, la primera porción (por ejemplo, dominio) comprende o consiste en un ligando que se une a través de una porción N-terminal libre (por ejemplo un N-terminal libre) a su receptor diana. Un ejemplo de este ligando es un ligando que se une a un receptor de opioides (por ejemplo, un ligando que se une a un receptor ORL1, tal como un péptido opioide). Otros ejemplos de péptidos opioides incluyen nociceptina, dinorfina, beta-endorfina, y encefalina. Otros ligandos de TM peptídicos no opioides incluyen los péptidos de BAM, galanina, sustancia P, GnRH, CRF, GRP, neuromedina B, bombesina, gastrina, CCK, SST, CST, y GHRH (así como sus truncamientos, variantes y análogos).

En otra realización (o la misma), la segunda porción (por ejemplo, dominio) comprende o consiste en un ligando que se une a través de una porción C-terminal libre (por ejemplo, un C-terminal libre) a su receptor diana. Un ejemplo de este ligando es un ligando que se une a un receptor de bradiquinina (por ejemplo, un péptido de bradiquinina) o a un receptor de la sustancia P (por ejemplo, un péptido de la sustancia P). Otros ligandos de TM peptídicos incluyen los péptidos de BAM, galanina, sustancia P, GnRH, CRF, GRP, neuromedina B, bombesina, gastrina, CCK, SST, CST, y GHRH (así como sus truncamientos, variantes y análogos).

Como ejemplo, el TM híbrido incluye una primera porción que comprende o consiste en un péptido de nociceptina, y una segunda porción que comprende o consiste en un péptido de bradiquinina (o un péptido de la sustancia P). En otros ejemplos, la primera porción comprende o consiste en un péptido de nociceptina, y la segunda porción comprende o consiste en un péptido seleccionado de un péptido de BAM, un péptido opioide, un péptido de betaendorfina, un péptido de bradiquinina, un péptido de encefalina, un péptido de dinorfina, un péptido de galanina, y un péptido de la sustancia P.

En otro ejemplo, el TM híbrido incluye una primera porción que comprende o consiste en un péptido de dinorfina, y una segunda porción que comprende o consiste en un péptido de bradiquinina (o un péptido de la sustancia P). En otros ejemplos, la primera porción comprende o consiste en un péptido de dinorfina, y la segunda porción comprende o consiste en un péptido seleccionado de un péptido de BAM, un péptido opioide, un péptido de betaendorfina, un péptido de bradiquinina, un péptido de encefalina, un péptido de nociceptina, un péptido de galanina, y un péptido de la sustancia P.

En otro ejemplo, el TM híbrido incluye una primera porción que comprende o consiste en un péptido de galanina, y una segunda porción que comprende o consiste en un péptido de bradiquinina (o un péptido de la sustancia P). En otros ejemplos, la primera porción comprende o consiste en un péptido de galanina, y la segunda porción comprende o consiste en un péptido seleccionado de un péptido de BAM, un péptido opioide, un péptido de betaendorfina, un péptido de bradiquinina, un péptido de encefalina, un péptido de nociceptina, un péptido de dinorfina, y un péptido de la sustancia P.

En otro ejemplo, el TM híbrido incluye una primera porción que comprende o consiste en un péptido de BAM, y una segunda porción que comprende o consiste en un péptido de bradiquinina (o un péptido de la sustancia P). En otros ejemplos, la primera porción comprende o consiste en un péptido de BAM, y la segunda porción comprende o consiste en un péptido seleccionado de un péptido opioide, un péptido de beta-endorfina, un péptido de bradiquinina, un péptido de encefalina, un péptido de nociceptina, un péptido de dinorfina, un péptido de galanina, y un péptido de la sustancia P.

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En otro ejemplo, el TM híbrido incluye una primera porción que comprende o consiste en un péptido de betaendorfina, y una segunda porción que comprende o consiste en un péptido de bradiquinina (o un péptido de la sustancia P). En otros ejemplos, la primera porción comprende o consiste en un péptido de beta-endorfina, y la segunda porción comprende o consiste en un péptido seleccionado de un péptido opioide, un péptido de BAM, un péptido de bradiquinina, un péptido de encefalina, un péptido de nociceptina, un péptido de dinorfina, un péptido de galanina, y un péptido de la sustancia P.

En otro ejemplo, el TM híbrido incluye una primera porción que comprende o consiste en un péptido de una encefalina (por ejemplo, leu-o met-encefalina), y una segunda porción que comprende o consiste en un péptido de bradiquinina (o un péptido de la sustancia P). En otros ejemplos, la primera porción comprende o consiste en un péptido de encefalina, y la segunda porción comprende o consiste en un péptido seleccionado de un péptido opioide, un péptido de beta-endorfina, un péptido de bradiquinina, un péptido de BAM, un péptido de nociceptina, un péptido de dinorfina, un péptido de galanina, y un péptido de la sustancia P.

En una realización, el TM comprende o consiste en una primera y un segunda porción (por ejemplo dominios) que son idénticos (o similares) y que, en combinación, proporcionan una interacción eficaz con el receptor sobre la célula diana. Además, también pueden incluirse porciones idénticas/similares (por ejemplo, una tercera y opcionalmente más, etc.). Así, en esta realización, los polipéptidos de la presente invención comprenden una estructura repetida (por ejemplo, TM-TM; TM-TM-TM etc.) del mismo TM (o de un TM similar).

Los ejemplos de dichas estructuras TM repetidas (por ejemplo, TM-TM; TM-TM-TM; etc.) son un TM seleccionado de un péptido opioide, un péptido de beta-endorfina, un péptido de bradiquinina, un péptido de BAM, un péptido de nociceptina, un péptido de dinorfina, un péptido de galanina, un péptido de encefalina, un péptido de la sustancia P, un péptido de GnRH, un péptido de CRF, un péptido de GRP, un péptido de neuromedina B, un péptido de bombesina, un péptido de gastrina, un péptido de CCK, un péptido de SST, un péptido de CST, y un péptido de GHRH (así como sus truncamientos, variantes y análogos).

En una realización, la primera y la segunda porción (y/o posteriores) del TM están separadas por una secuencia espaciadora, por ejemplo, una secuencia peptídica. En una realización, la primera y la segunda porción (y/o posteriores) pueden estar separadas por una secuencia de un máximo de 40 o un máximo de 35 o un máximo de 30

o un máximo de 25 o un máximo de 20 o un máximo de 15 o un máximo de 10 o un máximo de 5 restos aminoácidos. En una realización, la primera y la segunda porción (y/o posteriores) pueden estar separadas por una secuencia de 4, 3, 2, 1 o cero restos aminoácidos.

Las proteínas de fusión de la presente invención en general muestran una afinidad de unión reducida (en la región de hasta 100 veces) por las células diana, cuando se comparan con el correspondiente TM 'libre' (es decir, el TM aislado per se). Sin embargo, a pesar de esta observación, las proteínas de fusión de la presente invención demuestran una sorprendente buena eficacia. Esto puede atribuirse a dos características principales. En primer lugar, la proteasa no citotóxica es catalítica y, así, el efecto terapéutico de unas pocas moléculas se amplifica con rapidez dentro de una célula diana. En segundo lugar, los recetores presentes sobre las células diana solo necesitan actuar como puerta de acceso para la entrada del producto terapéutico y no necesitan ser estimuladas necesariamente hasta el nivel requerido para lograr una respuesta farmacológica mediada por receptor-ligando. Por consiguiente, las proteínas de fusión de la presente invención pueden administrarse a una dosificación que sea menor que la empleada para otros tipos de moléculas terapéuticas, que generalmente se administran en cantidades altas de microgramos a miligramos (incluso hasta cientos de miligramos). Por contraste, las proteínas de fusión de la presente invención pueden administrarse a dosificaciones mucho menores, generalmente al menos 10 veces menores, y más generalmente 100 veces menores.

El dominio de translocación

El componente de translocación de la presente invención permite la translocación de la proteasa no citotóxica (o uno de sus fragmentos) hacia el interior de la célula diana de modo que la expresión funcional de la actividad proteasa se produce dentro del citosol de la célula diana. El componente de translocación preferiblemente es capaz de formar poros permeables a iones en las membranas lipídicas (por ejemplo, membranas endosómicas) bajo condiciones de bajo pH. El componente de translocación puede obtenerse a partir de una fuente de proteínas microbianas, por ejemplo, una fuente de proteínas bacterianas o víricas. Por tanto, en una realización, el componente de translocación comprende o consiste en un dominio de translocación de una enzima, tal como una toxina bacteriana. En otra realización, el dominio de translocación comprende o consiste en el dominio de translocación de una proteína vírica. En una realización, el componente de translocación de la presente invención puede comprender o consistir en una cadena H de neurotoxina clostridial, o uno de sus fragmentos, tal como el dominio HN (o uno de sus fragmentos de translocación) de una neurotoxina clostridial.

El primer y segundo sitio de ruptura de proteasas

Los polipéptidos de la presente invención comprenden un primer sitio de ruptura de proteasas. El primer sitio de ruptura de proteasas permite la ruptura (por ejemplo, la ruptura controlada) de la proteína de fusión en una posición entre el componente de proteasa no citotóxica y el resto de la proteína de fusión. Este acontecimiento de ruptura

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Como un aspecto separado de la presente invención, los sitios de ruptura/proteasa de ruptura mencionados anteriormente pueden emplearse por separado como un sitio de ruptura/proteasa "destructivos" (tal como se analiza a continuación) si uno se incorpora en un polipéptido de la presente invención.

En una realización, en el polipéptido monocatenario, el componente de proteasa no citotóxica y el componente de dominio de translocación están unidos entre sí mediante un enlace disulfuro. Así, después de la ruptura del primer sitio de ruptura de proteasa, el polipéptido adopta una conformación dicatenaria, en la que los componentes de proteasa y de translocación permanecen unidos juntos mediante el enlace disulfuro. Esta reacción de ruptura en general se denomina la etapa de "activación", puesto que provoca que el componente de proteasa no citotóxica tenga una mayor actividad proteasa (por ejemplo, óptima).

En una realización, el componente de proteasa no citotóxica forma un enlace covalente con el componente de dominio de translocación de la proteína de fusión. Por ejemplo, en una realización, el resto aminoácido del componente de proteasa que forma el enlace covalente está localizado dentro de los últimos 20, preferiblemente dentro de los últimos 10 restos aminoácidos C-terminales del componente de proteasa. De modo similar, en una realización, el resto aminoácido dentro del componente de translocación que forma la segunda parte del enlace covalente puede estar localizado dentro de los primeros 20, preferiblemente dentro de los primeros 10 restos aminoácidos N-terminales del componente de translocación.

Las anteriores disposiciones del enlace covalente tienen la ventaja de que los componentes de proteasa y translocación están dispuestos de una manera similar a la de una proteasa no citotóxica nativa (por ejemplo, una neurotoxina clostridial nativa). Como comparación, haciendo referencia a la secuencia de aminoácidos primaria de una neurotoxina clostridial nativa, los respectivos restos aminoácidos cisteína están separados por entre 8 y 27 restos aminoácidos (tomado de Popoff, M.R. y Marvaud, J.-C., 1999, Structural & genomic features of clostridial neurotoxins, capítulo 9, en The Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins, ed. Alouf & Freer:

Serotipo1: Secuencia Longitud 'nativa' entre C-C

BoNT/A1: CVRGIITSKTKS----LDKGYNKALNDLC 23

BoNT/A2: CVRGIIPFKTKS----LDEGYNKALNDLC 23

BoNT/B: CKSVKAPG-------------------IC 8

BoNT/C: CHKAIDGRS----------LYNKTLDC 15

BoNT/D: CLRLTK----------------NSRDDSTC 12

BoNT/E: CKN-IVSVK----------GIRK---SIC 13

BoNT/F: CKS-VIPRK----------GTKAPP-RLC 15

BoNT/G: CKPVMYKNT----------GKSE----QC 13

TeNT: CKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELC 27

1Información solo de cepas proteolíticas

En una realización, el componente de proteasa no citotóxica y el componente del primer sitio de ruptura de proteasas de una proteína de fusión monocatenaria de la presente invención están separados por un máximo de 30, 25, 20, 15 o 10 restos aminoácidos. En una realización, dichos dos componentes están separados dentro de la proteína de fusión monocatenaria por un máximo de 5, 4, 3, 2 o 1 restos aminoácidos. En otra realización, dichos dos componentes están separados dentro de la proteína de fusión monocatenaria por cero restos aminoácidos.

Así, en una realización, la proteasa no citotóxica y el primer sitio de ruptura de proteasas pueden separarse empleando una primera secuencia espaciadora, y dicha secuencia espaciadora está localizada N-terminal con respecto al primer sitio de ruptura de proteasas y C-terminal del componente de proteasa no citotóxica. En una realización, la primera secuencia espaciadora puede comprender todo o parte del primer sitio de ruptura de proteasas, o puede ser parte del componente de proteasa no citotóxica.

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En una realización, el componente de dominio de translocación (o TM) y el componente del primer sitio de ruptura de proteasas de la proteína de fusión monocatenaria están separados por un máximo de 30, 25, 20, 15 o 10 restos aminoácidos. En una realización, dichos dos componentes están separados dentro de la proteína de fusión monocatenaria por un máximo de 5, 4, 3, 2 o 1 restos aminoácidos. En otra realización, dichos dos componentes están separados dentro de la proteína de fusión monocatenaria por cero restos aminoácidos.

Así, en una realización, el dominio de translocación (o TM) y el primer sitio de ruptura de proteasas pueden separarse por una segunda secuencia espaciadora, y dicha segunda secuencia espaciadora está localizada Cterminal con respecto al primer sitio de ruptura de proteasas y N-terminal del componente de dominio de translocación (o TM). La segunda secuencia espaciadora puede ser idéntica o diferente de la primera secuencia espaciadora que separa la proteasa no citotóxica y el primer sitio de ruptura de proteasas. En una realización, la segunda secuencia espaciadora puede comprender todo o parte del segundo sitio de ruptura de proteasas, o puede ser parte del componente de dominio de translocación.

En una realización, el componente de dominio de translocación y el componente del segundo sitio de ruptura de proteasas de la proteína de fusión monocatenaria están separados por un máximo de 30, 25, 20, 15 o 10 restos aminoácidos. En una realización, dichos dos componentes están separados dentro de la proteína de fusión monocatenaria por un máximo de 5, 4, 3, 2 o 1 restos aminoácidos. En otra realización, dichos dos componentes están separados dentro de la proteína de fusión monocatenaria por cero restos aminoácidos.

Así, en una realización, el dominio de translocación y el segundo sitio de ruptura de proteasas pueden estar separados por una tercera secuencia espaciadora, y dicha tercera secuencia espaciadora está localizada N-terminal

o C-terminal con respecto al dominio de translocación. La tercera secuencia espaciadora puede ser idéntica (o diferente) de una o ambas de la primera y la segunda secuencia espaciadora. En una realización, la tercera secuencia espaciadora puede comprender todo o parte del segundo sitio de ruptura de proteasas, o puede ser parte del componente de dominio de translocación.

En una realización, el resto de transporte dirigido y el segundo sitio de ruptura de proteasas están separados por un máximo de 30, 25, 20, 15 o 10 aminoácidos. En una realización, dichos dos componentes están separados dentro de la proteína de fusión monocatenaria por un máximo de 5, 4, 3, 2 o 1 restos aminoácidos. En otra realización, dichos dos componentes están separados dentro de la proteína de fusión monocatenaria por cero restos aminoácidos.

Así, después de la ruptura en el segundo sitio de ruptura de proteasas, se produce un polipéptido con un resto de transporte dirigido que tiene un dominio N-terminal y un dominio C-terminal que están sustancialmente exentos del resto del conjugado. Esta disposición facilita la interacción de los componentes N-terminal y C-terminal del resto de transporte dirigido con un sitio de unión sobre una célula diana.

En una realización, el resto de transporte dirigido y el segundo sitio de ruptura de proteasas pueden estar separados por una cuarta secuencia espaciadora, y dicha cuarta secuencia espaciadora está localizada N-terminal o C-terminal con respecto al resto de transporte dirigido. La cuarta secuencia espaciadora puede ser idéntica (o diferente) de una, dos o todas de la primera, la segunda y la tercera secuencia espaciadora. En una realización, la cuarta secuencia espaciadora puede comprender todo o parte del segundo sitio de ruptura de proteasas, o puede ser parte del componente de dominio de translocación.

En una realización, la primera proteasa (mediante la cual puede romperse el primer sitio de ruptura de proteasas) es la misma que la segunda proteasa (mediante la cual puede romperse el segundo sitio de ruptura de proteasas).

Así, en una realización, el tratamiento de la proteína de fusión de polipéptido monocatenario con una única proteasa puede producir la ruptura del primero y del segundo sitio de ruptura de proteasas.

Puede emplearse una diversidad de moléculas espaciadoras diferentes en cualquiera de las proteínas de fusión de la presente invención. Los ejemplos de dichas moléculas espaciadoras incluyen GS5, GS10, GS15, GS20, GS25, y Hx27.

El enlace covalente

Las proteínas de fusión de polipéptido de la presente invención comprenden dos enlaces covalentes: el primer de dichos enlaces se produce entre el componente de proteasa no citotóxica y el resto de la proteína de fusión; el segundo de dichos enlaces es entre el resto de transporte dirigido y el dominio de translocación. Después de la ruptura proteolítica en el respectivos primer y segundo sitio de ruptura de proteasas, dichos dos enlaces covalentes permanecen intactos. En una realización, los enlaces covalentes no son enlaces peptídicos (es decir, los enlaces covalentes son enlaces no peptídicos). Por ejemplo, en una realización, uno o ambos de dichos enlaces covalentes son enlaces disulfuro.

Después de la ruptura proteolítica en el segundo sitio de ruptura de proteasas, el enlace covalente permanece intacto. La ruptura en el segundo sitio de ruptura de proteasas tiene el efecto de exponer el N-terminal (o C-terminal)

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una realización, el enlace covalente entre el componente de proteasa no citotóxica y el componente de dominio de translocación emplea restos cisteína naturales localizados sobre los respectivos componentes, tal como, por ejemplo, uno o más de los restos cisteína ilustrados anteriormente en la sección de la descripción. Como alternativa, pueden introducirse uno o más restos cisteína apropiados en los respectivos componentes.

La proteína de fusión puede comprender uno o más marcadores de purificación, que están localizados en posición N-terminal con respecto al componente de proteasa y/o en posición C-terminal con respecto al componente de translocación.

Aunque puede emplearse cualquier marcador de purificación, se prefieren los siguientes:

marcador His (por ejemplo, 6 × histidina), preferiblemente como marcador C-terminal y/o N-terminal,

marcador MBP (proteína de unión a maltosa), preferiblemente como marcador N-terminal,

marcador GST (glutatión-S-transferasa), preferiblemente como marcador N-terminal,

marcador His-MBP, preferiblemente como marcador N-terminal,

marcador His-GST, preferiblemente como marcador N-terminal,

marcador tiorredoxina, preferiblemente como marcador N-terminal,

marcador CBD (dominio de unión a quitina), preferiblemente como marcador N-terminal.

Aplicaciones terapéuticas

El componente de TM dirige la molécula terapéutica del inhibidor de la secreción dirigido (TSI) de la presente invención hacia la célula diana deseada.

Como ejemplo, el uso de los TM descritos en esta memoria descriptiva (tales como un péptido opioide, un péptido de beta-endorfina, un péptido de bradiquinina, un péptido de BAM, un péptido de nociceptina, un péptido de dinorfina, un péptido de galanina, un péptido de encefalina, un péptido de la sustancia P) dirige la molécula terapéutica del inhibidor de la secreción dirigido (TSI) de la presente invención hacia células sensibles al dolor (por ejemplo, aferentes sensoriales primarias). Por tanto, las proteínas de fusión resultantes proporcionan moléculas terapéuticas para suprimir el dolor; el solicitante se remite a los documentos WO2006/059093, WO2007/138339 y WO96/33273.

Los TM descritos en esta memoria descriptiva pueden utilizarse para dirigir las moléculas del inhibidor de la secreción dirigido (TSI) de la presente invención hacia células que estimulan la inflamación neurogénica. Por consiguiente, las moléculas del inhibidor de la secreción dirigido (TSI) de la presente invención proporcionan moléculas terapéuticas para suprimir la inflamación neurogénica; el solicitante se remite a los documentos WO2010/138395, WO2010/138392, WO2010/138387, WO2010138382 y WO2010/138379. Los TM preferidos para su uso en estas terapias y moléculas de TSI incluyen TM opioides, tales como nociceptina y dinorfina.

Los TM descritos en esta memoria descriptiva pueden utilizarse para dirigir las moléculas del inhibidor de la secreción dirigido (TSI) de la presente invención hacia células que estimulan trastornos urogenitales-neurológicos, tales como una vejiga hiperactiva. Por consiguiente, las moléculas del inhibidor de la secreción dirigido (TSI) de la presente invención proporcionan moléculas terapéuticas para suprimir trastornos urogenitales-neurológicos, tales como una vejiga hiperactiva; el solicitante se remite a los documentos WO2010/138393,WO2010/138389, WO2010/138384, y WO2010/138366. Los TM preferidos para su uso en estas terapias y moléculas de TSI incluyen TM opioides, tales como nociceptina y dinorfina.

Los TM tales como el péptido de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), el péptido de CRF, el péptido de GRP, el péptido de neuromedina B, el péptido de bombesina, el péptido de gastrina, el péptido de CCK, el péptido de SST, el péptido de CST, y el péptido de GHRH pueden utilizarse para dirigir las moléculas de TSI de la presente invención a células que estimulan el cáncer o que son células cancerosas per se. Por consiguiente, las moléculas del inhibidor de la secreción dirigido (TSI) de la presente invención proporcionan moléculas terapéuticas para suprimir trastornos neuroendocrinos, tales como acromegalia y enfermedad de Cushing, y para suprimir el cáncer (por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer renal, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer adrenal, cáncer esofágico, linfoma, leucemia, leucemia aguda, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, cáncer de intestino, cáncer cervical, leucemia linfocítica crónica, linfoma de Hodgkin, cáncer de hígado, cáncer de piel, cáncer orofaríngeo, mieloma, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer testicular, cáncer uterino o sarcoma de Kaposi; el solicitante se remite a los documentos WO2009/150489, WO2009/150470 y WO2010/055358. Los TM preferidos para su uso en estas terapias y moléculas de TSI incluyen péptidos de GHRH, péptidos de SST y péptidos de CST.

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Sitios de ruptura destructivos

Los polipéptidos de la presente invención puede modificarse aún más para reducir o prevenir efectos secundarios no deseados asociados con la dispersión hacia áreas no deseadas. Según esta realización, el polipéptido comprende un sitio de ruptura destructivo. El sitio de ruptura destructivo se diferencia del sitio de 'activación' (es decir, de formación de una cadena doble) y del segundo sitio de ruptura de proteasas (es decir, de formación de un TM con dominios C-terminal y N-terminal libres). Dicho sitio de ruptura destructivo puede ser roto por una tercera proteasa y no por la primera ni la segunda proteasa. Además, cuando es roto en un sitio de ruptura destructivo por la tercera proteasa, el polipéptido de la invención tienen una menor potencia (por ejemplo, una menor capacidad de unión a la célula diana prevista, una menor actividad de translocación y/o una menor actividad proteasa no citotóxica). Como ejemplo, el solicitante se remite a los documentos WO 2010/094905 y WO 02/044199.

Así, según esta realización, la presente invención proporciona un polipéptido que puede inactivarse y/o destruirse de una manera controlable en una localización fuera de sitio.

En una realización, el sitio de ruptura destructivo es reconocido y roto por una tercera proteasa (es decir, una proteasa destructiva) seleccionada de una proteasa en circulación (por ejemplo, una proteasa extracelular, tal como una proteasa sérica o una proteasa de la cascada de coagulación sanguínea), una proteasa asociada a un tejido (por ejemplo, una metaloproteasa de matriz (MMP), tal como una MMP del músculo), y una proteasa intracelular (preferiblemente una proteasa que esté ausente en el célula diana). Así, en uso, si un polipéptido de la presente invención se aleja de su célula diana prevista y/o es captado por una célula que no es su diana, el polipéptido será inactivado por medio de la ruptura del sitio de ruptura destructivo (por la tercera proteasa).

Las metaloproteasas de matriz (MMP) son un grupo preferido de proteasas destructivas en el contexto de la presente invención. Dentro de este grupo se prefiere ADAM17 (EC 3.4.24.86, también conocida como TACE), que rompe una diversidad de proteínas ancladas a la membrana de la superficie celular para "desprender" los dominios extracelulares. Otras MMP preferidas incluyen adamalisinas, serralisinas, y astacinas. Otro grupo de proteasas destructivas preferidas son las proteasas de sangre de mamífero, tales como trombina, factor de coagulación VIIa, factor de coagulación IXa, factor de coagulación Xa, factor de coagulación XIa, factor de coagulación Xlla, calicreína, proteína C, y serina proteasa asociada a MBP.

Según un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de polipéptido descrita anteriormente.

En un aspecto preferido de la presente invención, la secuencia de ADN se prepara como parte de un vector de ADN, y dicho vector comprende un promotor y un terminador. La secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión de polipéptido descrita anteriormente se localiza cadena abajo del promotor; el terminador se localiza cadena arriba de la secuencia de ácido nucleico.

En una realización preferida, el vector presenta un promotor seleccionado de:

Promotor: Agente de inducción Condición de inducción típica

tac (híbrido): IPTG 0,2 mM (0,05-2,0 mM)

AraBAD: L-arabinosa 0,2% (0,002-0,4%)

operador lac-T7: IPTG 0,2 mM (0,05-2,0 mM)

La construcción de ADN de la presente invención se diseña preferiblemente por medios electrónicos y después se sintetiza mediante técnicas de síntesis de ADN convencionales.

La información de la secuencia de ADN mencionada anteriormente se modifica opcionalmente para el sesgo de codones según el sistema de expresión de la célula hospedante (por ejemplo, E. coli) que se va a emplear finalmente.

El esqueleto de ADN preferiblemente se selecciona para detectar cualquier secuencia de ácido nucleico inherente que, tras transcribirse y traducirse, produciría una secuencia de aminoácidos que se corresponde con el sitio de ruptura de proteasas codificado por la segunda secuencia codificadora de péptido. Esta selección puede realizarse de forma manual o con la ayuda de un programa informático (por ejemplo, el programa MapDraw de DNASTAR, Inc.).

Según otra realización de la presente invención, se proporciona un método para preparar una proteína de fusión de polipéptido monocatenario, según se describió anteriormente, que comprende expresar una secuencia de ácido

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nucleico que codifica la proteína de fusión descrita anteriormente, o un vector de ADN según se describió anteriormente, en una célula hospedante.

Según otra realización de la presente invención, se proporciona un método para preparar un agente no citotóxico, que comprende:

a.: proporcionar una disolución que contienen una proteína de fusión de polipéptido monocatenario de la invención;

b.: añadir a dicha disolución una primera proteasa capaz de romper el primer sitio de ruptura de proteasas, y una segunda proteasa capaz de romper el segundo sitio de ruptura de proteasas;

c.: romper el primer sitio de ruptura de proteasas y el segundo sitio de ruptura de proteasas;

formando con ello una proteína de fusión tricatenaria.

En una realización, la primera proteasa y la segunda proteasa se añaden secuencialmente. En una realización alternativa, la segunda proteasa se añade antes de la primera proteasa. En otra realización, la primera proteasa y la segunda proteasa se añaden simultáneamente.

Este aspecto proporciona un polipéptido tricatenario. Con más detalle, el polipéptido tricatenario resultante generalmente tiene una estructura en la que:

a.: la primera cadena comprende la proteasa no citotóxica, o uno de sus fragmentos, y dicha proteasa o fragmento de proteasa es capaz de romper una proteína del aparato de fusión exocítica de una célula diana;

b.: la segunda cadena comprende el dominio de translocación que es capaz de translocar la proteasa o el fragmento de proteasa desde el interior de un endosoma, a través de la membrana endosómica y hacia el citosol de la célula diana;

c.: la tercera cadena comprende el resto de transporte dirigido que es capaz de unirse a un sitio de unión sobre la célula diana, y dicho sitio diana es capaz de sufrir una endocitosis para ser incorporado en un endosoma dentro de la célula diana;

d.: la primera y la segunda cadena están unidos entre sí mediante un enlace disulfuro; y el segundo y el tercer dominio están unidos entre sí mediante un enlace covalente no peptídico.

Transporte del polipéptidos

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una proteína de fusión de polipéptido monocatenario según se describió anteriormente, o un polipéptido no citotóxico según se describió anteriormente, para su uso para tratar, prevenir o mejorar un trastorno médico.

En uso, la presente invención emplea una composición farmacéutica que comprende un polipéptido, junto con al menos un componente seleccionado de un vehículo, excipiente, adyuvante, propelente y/o sal farmacéuticamente aceptable.

Los polipéptidos de la presente invención pueden formularse para la aplicación oral, parenteral, en infusión continua, mediante implante, inhalación o aplicación tópica. Las composiciones adecuadas para la inyección pueden estar en forma de disoluciones, suspensiones o emulsiones, o polvos secos que se disuelven o se suspenden en un vehículo adecuado antes del uso.

Los medios de transporte local pueden incluir un aerosol o cualquier otro pulverizado (por ejemplo, un nebulizador). A este respecto, una formulación en aerosol de un polipéptido permite el transporte a los pulmones y/u otras vías nasales y/o bronquiales o respiratorias. Una vía de administración preferida se selecciona de: sistémica (por ejemplo, intravenosa), laparoscópica y/o inyección localizada (por ejemplo, una inyección transesfenoidal directamente en una célula diana, tal como un tumor).

En el caso de formulaciones para inyección, se puede incluir una sustancia farmacéuticamente activa para ayudar a la retención o reducir la eliminación del polipéptido del sitio de la administración. Un ejemplo de dicha sustancia farmacéuticamente activa es un vasoconstrictor, tal como adrenalina. Esta formulación confiere la ventaja de aumentar el tiempo de residencia del polipéptido después de la administración y, así, aumenta y/o potencia su efecto.

Los intervalos de dosificación para la administración de los polipéptidos de la presente invención son los que producen el efecto terapéutico deseado. Se apreciará que el intervalo de dosificación requerido depende de la naturaleza concreta del polipéptido o la composición, la vía de administración, la naturaleza de la formulación, la edad del paciente, la naturaleza, el grado o la gravedad del trastorno del paciente, las contraindicaciones, si existen, y el criterio del médico encargado. Las variaciones en estos niveles de dosificación pueden ajustarse empleando rutinas empíricas convencionales para la optimización.

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Las dosificaciones diarias adecuadas (por kg de peso del paciente) están en el intervalo de 0,0001-1 mg/kg, preferiblemente de 0,0001-0,5 mg/kg, más preferiblemente 0,002-0,5 mg/kg, y en particular preferiblemente 0,0040,5 mg/kg. La dosificación unitaria puede variar de menos de 1 microgramo a 30 mg, pero generalmente estará en la región de 0,01 a 1 mg por dosis, que pueden administrarse a diario o preferiblemente con menos frecuencia, tal como una vez a la semana o cada seis meses. Un régimen de dosificación particularmente preferido se basa en 2,5 ng de polipéptido como la dosis 1X. A este respecto, las dosificaciones preferidas están en el intervalo de 1X-100X (concretamente, 2,5-250 ng).

Las formas de dosificación fluidas generalmente se preparan utilizando el polipéptido y un vehículo estéril apirógeno. El polipéptido, dependiendo del vehículo y la concentración utilizados, puede disolverse o suspenderse en el vehículo. Cuando se preparan disoluciones, el polipéptido puede disolverse en el vehículo, la disolución puede hacerse isotónica si es necesario mediante la adición de cloruro de sodio, y puede esterilizarse mediante filtración a través de un filtro estéril utilizando técnicas asépticas antes de ser introducido en viales o ampollas estériles adecuados y sellarse. Como alternativa, si la estabilidad de la disolución es adecuada, la disolución en sus recipientes sellados puede esterilizarse mediante un autoclave. De forma ventajosa, pueden disolverse en el vehículo ciertos aditivos, tales como agentes tamponantes, solubilizantes, estabilizantes, conservantes o bactericidas, agentes suspensores o emulgentes y/o agentes anestésicos locales.

Pueden prepararse polvos secos, que se disuelven o se suspenden en un vehículo adecuado antes del uso, introduciendo los ingredientes preesterilizados en un recipiente estéril utilizando una técnica aséptica en un área estéril. Como alternativa, los ingredientes pueden disolverse en recipientes adecuados utilizando una técnica aséptica en un área estéril. El producto después se liofiliza y los recipientes se sellan asépticamente.

Las suspensiones parenterales, adecuadas para la inyección intramuscular, subcutánea o intradérmica, se preparan sustancialmente de la misma manera, excepto que los componentes estériles se suspenden en el vehículo estéril, en lugar de ser disueltos, y la esterilización no puede realizarse mediante filtración. Los componentes pueden aislarse en un estado estéril o, como alternativa, pueden esterilizarse después del aislamiento, por ejemplo, mediante irradiación con rayos gamma.

De forma ventajosa, un agente suspensor, por ejemplo, polivinilpirrolidona, se incluye en las composiciones para facilitar la distribución uniforme de los componentes.

Sección de definiciones

El resto de transporte dirigido (TM) significa cualquier estructura química que interacciona funcionalmente con un sitio de unión para provocar una asociación física entre el polipéptido de la invención y la superficie de una célula diana. El término TM incluye cualquier molécula (es decir, una molécula natural o uno de sus variantes química o físicamente modificados) que es capaz de unirse a un sitio de unión sobre la célula diana, y dicho sitio de unión es capaz de ser internalizado (por ejemplo, mediante la formación de endosomas), lo cual también se denomina endocitosis mediada por receptores. El TM puede poseer una función de translocación de membrana endosómica, en cuyo caso no es necesario que estén presentes un componente de TM y de dominio de translocación separados en un agente de la presente invención. A lo largo de la descripción anterior se han descrito TM específicos. La referencia a dichos TM es solo como ejemplos, y la presente invención incluye todos sus variantes y derivados, que conserven la capacidad de unión básica (es decir, dirigida) de los ejemplos de TM.

Tal como se mencionó previamente, los TM preferidos incluyen anticuerpos (por ejemplo, fragmentos de anticuerpos) y andamiajes de unión, en especial, anticuerpos/fragmentos y andamiajes disponibles en el mercado diseñados para unirse (por ejemplo, específicamente) a células diana.

Los andamiajes de proteínas representan una nueva generación de marcos de unión universales para complementar el repertorio en expansión de anticuerpos monoclonales terapéuticos y derivados, tales como scFv, moléculas de Fab, dAb (anticuerpos de dominio único), de camélidos, diacuerpos y minicuerpos, cada uno de los cuales puede emplearse como TM de la presente invención. Los sistemas de andamiaje crean o modifican dominios de reconocimiento de proteínas conocidos mediante la creación de nuevos andamiajes o la modificación de dominios de unión a proteínas conocidos. Estos andamiajes incluyen, pero no se limitan a:

(i): andamiajes basados en la proteína A -aficuerpos (Nord, K. et al., 1997, "Binding proteins selected from combinatorial libraries of an alpha-helical bacterial receptor domain", Nat. Biotechnol., 15, 772-777);

(ii): andamiajes basados en lipocalina -anticalinas (Skerra, 2008, "Alternative binding proteins: anticalins -harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities", FEBS J., 275:2677-2683);

(iii) andamiajes basados en fibronectina -adnectina (Dineen et al., 2008, "The Adnectin CT-322 is a novel VEGF receptor 2 inhibitor that decreases tumor burden in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer", BMC Cancer, 8:352);

(iv) avímeros (Silverman et al., 2005, "Multivalent avimer proteins evolved by exon shuffling of a family of human receptor domains", Nat. Biotechnol., 23:1556-1561);

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(v): andamiajes basados en anquirina -darpinas (Zahnd et al., 2006, "Selection and characterization of Her2 bindingdesigned ankyrin repeat proteins", J. Biol. Chem., 281:35167-35175); y

(vi): andamiajes de centirina -basados en un plegamiento de la proteína que tiene una significativa homología estructural con los dominios Ig con bucles que son análogos a CDR. Los dominios Ig son un módulo habitual en proteínas humanas y se han aplicado mucho como proteínas de andamiaje alternativas.

Los andamiajes de unión pueden utilizarse para dirigirse a tipos celulares concretos mediante la interacción con proteínas de la superficie celular específicas, receptores u otros epitopos de la superficie celular, tales como grupos azúcar. Estos andamiajes modificados pueden introducirse sobre los polipéptidos basados en una proteasa no citotóxica recombinante de la presente invención.

El TM de la presente invención se une (preferiblemente se une específicamente) a la célula diana en cuestión. La expresión "se une específicamente" significa preferiblemente que un TM concreto se une a la célula diana con una afinidad de unión (Ka) de 106 M-1 o mayor, preferiblemente 107 M-1 o mayor, más preferiblemente 108 M-1 o mayor, y lo más preferiblemente 109 M-1 o mayor.

La referencia a TM en la presente memoria descriptiva incluye fragmentos y sus variantes, que conservan la capacidad de unirse a la célula diana en cuestión. Como ejemplo, un variante puede tener al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, y lo más preferiblemente al menos 97 o al menos 99% de homología de secuencia de aminoácidos con el TM de referencia. Así, un variante puede incluir uno

o más análogos de un aminoácido (por ejemplo, un aminoácido no natural) o un enlace sustituido. Además, como ejemplo, el término fragmento, cuando se emplea en relación con un TM, significa un péptido que tiene al menos diez, preferiblemente al menos veinte, más preferiblemente al menos treinta, y lo más preferiblemente al menos cuarenta restos aminoácidos en el TM de referencia. El término fragmento también se refiere a los variantes mencionados anteriormente. Así, como ejemplo, un fragmento de la presente invención puede comprender una secuencia peptídica que tenga al menos 10, 20, 30 o 40 aminoácidos, en el que la secuencia peptídica tiene al menos 80% de homología de secuencia frente a una correspondiente secuencia peptídica de aminoácidos (contiguos) del péptido de referencia.

Es habitual confirmar que un TM se une a la célula diana seleccionada. Por ejemplo, puede emplearse un experimento de desplazamiento radiactivo simple, en el que el tejido o las células representativas de una célula diana en cuestión se exponen a un TM marcado (por ejemplo, tritiado) en presencia de un exceso de TM no marcado. En este experimento, las proporciones relativas de unión no específica y específica pueden evaluarse, lo cual permite confirmar que el TM se une a la célula diana. Opcionalmente, el ensayo puede incluir uno o más antagonistas de la unión, y el ensayo puede comprender también observar la pérdida de unión del TM. Los ejemplos de este tipo de experimentos pueden encontrarse en Hulme, E.C. (1990), Receptor-binding studies, a brief outline, pp. 303-311, en Receptor biochemistry, A Practical Approach, ed. E.C. Hulme, Oxford University Press.

En el contexto de la presente invención, la referencia a un TM peptídico incluye sus análogos de péptidos, con la condición de que el análogo se una al mismo receptor que el correspondiente TM de 'referencia'. Dichos análogos pueden incluir restos sintéticos, tales como:

ß-Nal = ß-naftilalanina

ß-Pal = ß -piridilalanina

hArg(Bu) = N-guanidino-(butil)-homoarginina

hArg(Et)2 = N,N'-guanidino-(dimetil)-homoarginina

hArg(CH2CF3)2 = N,N-guanidino-bis-(2,2,2,-trifluoroetil)-homoarginina

hArg(CH3, hexil) = N,N'-guanidino-(metil, hexil)-homoarginina

Lys(Me) = Ne-metil-lisina

Lys(iPr) = Ne-isopropil-lisina

AmPhe = aminometilfenilalanina

AChxAla = aminociclohexilalanina

Abu = ácido α-aminobutírico

Tpo = 4-tiaprolina

MeLeu = N-metil-leucina

Orn = ornitina

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Nva = norvalina

Trp(Br) = 5-bromo-triptófano

Trp(F) = 5-fluoro-triptófano

Trp(N02) = 5-nitro-triptófano

Gaba = ácido γ-aminobutírico

Bmp = J-mercaptopropionilo

Ac = acetilo

Pen -pencilamina

Los polipéptidos de la presente invención pueden carecer de un dominio HC o HCC funcional de una neurotoxina clostridial. Por consiguiente, dichos polipéptidos no son capaces de unirse a las membranas sinaptosómicas de rata (a través del componente HC clostridial) en los ensayos de unión descritos en Shone et al. (1985), Eur. J. Biochem., 151, 75-82. En una realización, los polipéptidos carecen de los últimos 50 aminoácidos C-terminales de una holotoxina de neurotoxina clostridial. En otra realización, los polipéptidos carecen de los últimos 100, 150, 200, 250,

: o 300 restos aminoácidos C-terminales de una holotoxina de neurotoxina clostridial. Como alternativa, la actividad de unión de HC puede negarse/reducirse mediante mutagénesis; como ejemplo, referido a BoNT/A por comodidad, la modificación de una o dos mutaciones de restos aminoácidos (W1266 a L, e Y1267 a F) en el bolsillo de unión a gangliósidos provoca que la región HC pierda su función de unión al receptor. Pueden realizarse mutaciones análogos en los componentes que no son el péptido clostridial de serotipo A, por ejemplo, una construcción basada en toxina botulínica B con mutaciones (W1262 a L, e Y1263 a F) o toxina botulínica E (W1224 a L, e Y1225 a F). Otras mutaciones en el sitio activo logran la misma ablación de la actividad de unión al receptor de HC, por ejemplo Y1267S en la toxina botulínica de tipo A y el correspondiente resto altamente conservado en otras neurotoxinas clostridiales. Los detalles de esta y otras mutaciones se describen en Rummel et al. (2004) (Molecular Microbiol., 51:631-634).

El péptido HC de una neurotoxina clostridial nativa comprende aproximadamente 400-440 restos aminoácidos, y consiste en dos dominios funcionalmente diferenciados de aproximadamente 25 kDa cada uno, concretamente la región N-terminal (denominada habitualmente el péptido o dominio de HCN) y la región C-terminal (denominada habitualmente el péptido o dominio de HCC). Además, está bien documentado que la región C-terminal (HCC), que constituyen 160-200 restos aminoácidos C-terminales, es responsable de la unión de una neurotoxina clostridial a sus receptores celulares naturales, concretamente a los terminales nerviosos en la zona de unión neuromuscular. Así, la referencia a lo largo de esta memoria descriptiva a una cadena pesada clostridial que carece de un péptido (o dominio) de HC de cadena pesada funcional, de modo que dicha cadena pesada es incapaz de unirse a los receptores de la superficie celular a los cuales se une una neurotoxina clostridial nativa, significa que la cadena pesada clostridial simplemente carece de un péptido de HCC funcional. En otras palabras, la región del péptido de HCC está parcial o totalmente delecionada, o modificada de otra forma (por ejemplo, mediante un tratamiento químico

: o proteolítico convencional) para inactivar su capacidad de unión nativa por los terminales nerviosos en la zona de unión neuromuscular.

Así, en una realización, un péptido de HN clostridial de la presente invención carece de parte de una porción de péptido C-terminal (HCC) de una neurotoxina clostridial y, así, carece de la función de unión de HC de la neurotoxina clostridial nativa. Como ejemplo, en una realización, el péptido de HN clostridial C-terminalmente extendido carece de los 40 restos aminoácidos C-terminales, o los 60 restos aminoácidos C-terminales, o los 80 restos aminoácidos Cterminales, o los 100 restos aminoácidos C-terminales, o los 120 restos aminoácidos C-terminales, o los 140 restos aminoácidos C-terminales, o los 150 restos aminoácidos C-terminales, o los 160 restos aminoácidos C-terminales de una cadena pesada de neurotoxina clostridial. En otra realización, el péptido de HN clostridial de la presente invención carece de la porción de péptido C-terminal (HCC) entera de una neurotoxina clostridial y, así, carece de la función de unión de HC de la neurotoxina clostridial nativa. Como ejemplo, en una realización, el péptido de HN clostridial carece de los 165 restos aminoácidos C-terminales, o los 170 restos aminoácidos C-terminales, o los 175 restos aminoácidos C-terminales, o los 180 restos aminoácidos C-terminales, o los 185 restos aminoácidos Cterminales, o los 190 restos aminoácidos C-terminales, o los 195 restos aminoácidos C-terminales de una cadena pesada de neurotoxina clostridial. Como otro ejemplo, el péptido de HN clostridial de la presente invención carece de una secuencia de referencia de HCC clostridial seleccionada del grupo que consiste en:

neurotoxina botulínica de tipo A -restos aminoácidos (Y1111-L1296)

neurotoxina botulínica de tipo B -restos aminoácidos (Y1098-E1291)

neurotoxina botulínica de tipo C -restos aminoácidos (Y1112-E1291)

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neurotoxina botulínica de tipo D -restos aminoácidos (Y1099-E1276)

neurotoxina botulínica de tipo E -restos aminoácidos (Y1086-K1252)

neurotoxina botulínica de tipo F -restos aminoácidos (Y1106-E1274)

neurotoxina botulínica de tipo B -restos aminoácidos (Y1106-E1297)

neurotoxina del tétanos -restos aminoácidos (Y1128-D1315).

Las secuencias de referencia identificadas anteriormente deben considerarse una guía, puesto que pueden producirse ligeras variaciones según los subserotipos.

La proteasa de la presente invención incluye todas las proteasas no citotóxicas que son capaces de romper una o más proteínas del aparato de fusión exocítica en células eucariotas. La proteasa de la presente invención preferiblemente es una proteasa bacteriana (o uno de sus fragmentos). Más preferiblemente, la proteasa bacteriana se selecciona de los géneros Clostridium o Neisseria/Streptococcus (por ejemplo, una cadena L clostridial o una IgA proteasa neisserial, preferiblemente de N. gonorrhoeae o S. pneumoniae).

La presente invención también incluye variantes de proteasas no citotóxicas (es decir, variantes de moléculas de proteasa naturales), con la condición de los variantes de proteasas aún demuestren la actividad proteasa necesaria. Como ejemplo, un variante puede tener al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90%, y lo más preferiblemente al menos 95 o al menos 98% de homología de secuencia de aminoácidos con una secuencia de proteasa de referencia. Así, el término variante incluye proteasas no citotóxicas que tiene una mayor (o menor) actividad endopeptidasa; se menciona particularmente la mayor Kcat/Km de los mutantes de BoNT/A Q161A, E54A, y K165L, véase Ahmed, S.A. (2008), Protein J. DOI, 10.1007/s10930-007-9118-8. El término fragmento, cuando se emplea en relación con una proteasa, generalmente significa un péptido que tiene al menos 150 , preferiblemente al menos 200, más preferiblemente al menos 250, y lo más preferiblemente al menos 300 restos aminoácidos de la proteasa de referencia. Con respecto al componente del 'fragmento' de TM (tal como se analizó anteriormente), los 'fragmentos' de proteasas de la presente invención incluyen fragmentos de variantes de proteasas basados en una secuencia de referencia.

La proteasa de la presente invención preferiblemente muestra una actividad serina o metaloproteasa (por ejemplo, actividad endopeptidasa). La proteasa es preferiblemente específica para una proteína SNARE (por ejemplo, SNAP25, sinaptobrevina/VAMP, o sintaxina).

Se mencionan en particular los dominios de proteasa de neurotoxinas, por ejemplo, los dominios de proteasa de neurotoxinas bacterianas. Así, la presente invención incluye el uso de dominios de neurotoxinas, que aparecen en la naturaleza, así como las versiones preparadas de modo recombinante de dichas neurotoxinas que aparecen en la naturaleza. Los ejemplos de neurotoxinas son las producidas por clostridios, y la expresión neurotoxina clostridial incluye neurotoxinas producidas por C. tetani (TeNT), y por C. botulinum (BoNT), serotipos A-G, así como las neurotoxinas similares a BoNT muy relacionadas producidas por C. baratii y C. butyricum. Las abreviaturas mencionadas anteriormente se emplean a lo largo de la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, la nomenclatura BoNT/A indica que la fuente de la neurotoxina es BoNT (serotipo A).

Los BoNT comparten una estructura común, siendo proteínas dicatenarias de aproximadamente 150 kDa, que consisten en una cadena pesada (cadena H) de aproximadamente 100 kDa unida covalentemente mediante un único enlace disulfuro a una cadena ligera (cadena L) de aproximadamente 50 kDa. La cadena H consiste en dos dominios, cada uno de aproximadamente 50 kDa. El dominio C-terminal (HC) es necesario para la unión neuronal de alta afinidad, mientras que se ha propuesto que el dominio N-terminal (HN) está implicado en la translocación de membrana. La cadena L es una metaloproteasa dependiente de cinc que es responsable de la ruptura del sustrato de proteína SNARE.

La expresión fragmento de cadena L significa un componente de la cadena L de una neurotoxina, en el que dicho fragmento muestra una actividad metaloproteasa y es capaz de romper proteolíticamente una vesícula y/o una proteína asociada a la membrana plasmática implicada en la exocitosis celular.

Los ejemplos de secuencias de proteasa (de referencia) adecuadas incluyen:

neurotoxina botulínica de tipo A -restos aminoácidos (1-448)

neurotoxina botulínica de tipo B -restos aminoácidos (1-440)

neurotoxina botulínica de tipo C -restos aminoácidos (1-441)

neurotoxina botulínica de tipo D -restos aminoácidos (1-445)

neurotoxina botulínica de tipo E -restos aminoácidos (1-422)

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Un dominio de translocación es una molécula que permite la translocación de una proteasa hacia el interior de una célula diana, de modo que se produce una expresión funcional de la actividad proteasa dentro del citosol de la célula diana. Si cualquier molécula (por ejemplo, una proteína o un péptido) posee la función de translocación necesaria de la presente invención es algo que se puede confirmar mediante cualquiera de una serie de ensayos convencionales.

Por ejemplo, Shone C. (1987), describe un ensayo in vitro que emplea liposomas, que son expuestos a una molécula de ensayo. La presencia de la función de translocación necesaria se confirma mediante la liberación desde los liposomas de K+ y/o NAD marcado, que puede controlarse con facilidad [véase Shone C. (1987), Eur. J. Biochem., vol. 167(1): pp. 175-180]. Otro ejemplo lo proporciona Blaustein R. (1987), que describe un ensayo in vitro simple que emplea membranas de bicapas de fosfolípidos planas. Las membranas se exponen a una molécula de ensayo y se confirma la función de translocación necesaria mediante un aumento en la conductancia a través de dichas membranas [véase Blaustein (1987) FEBS Letts., vol. 226, n.º 1: pp. 115-120]. Otra metodología para permitir la evaluación de la fusión de membranas y, por tanto, la identificación de dominios de translocación adecuados para su uso en la presente invención se proporciona en Methods in Enzymology, vol. 220 y 221, Membrane Fusion Techniques, partes A y B, Academic Press 1993.

La presente invención también incluye variantes de dominios de translocación, con la condición de que los variantes de los dominios sigan demostrando la actividad de translocación necesaria. Como ejemplo, un variante puede tener al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90%, y lo más preferiblemente al menos 95% o al menos 98% de homología de secuencia de aminoácidos con un dominio de translocación de referencia. El término fragmento, cuando se emplea en relación con una dominio de translocación, significa un péptido que tiene al menos 20, preferiblemente al menos 40, más preferiblemente al menos 80, y lo más preferiblemente al menos 100 restos aminoácidos del dominio de translocación de referencia. En el caso de un dominio de translocación clostridial, el fragmento preferiblemente presenta al menos 100 , preferiblemente al menos 150, más preferiblemente al menos 200, y lo más preferiblemente al menos 250 restos aminoácidos del dominio de translocación de referencia (por ejemplo, el dominio HN). Con respecto al componente del 'fragmento' de TM (tal como se analizó anteriormente), los 'fragmentos' de translocación de la presente invención incluyen fragmentos de variantes de dominios de translocación basados en las secuencias de referencia.

Se ha documentado que ciertos dominios de moléculas de toxinas bacterianas son capaces de formar poros. También se sabe que ciertos dominios de translocación de proteínas de fusión de membranas viralmente expresados son capaces de formar estos poros. Estos dominios pueden emplearse en la presente invención.

El dominio de translocación puede tener un origen clostridial, tal como el dominio HN (o uno de sus componentes funcionales). HN significa una porción o fragmento de la cadena H de una neurotoxina clostridial que es aproximadamente equivalente a la mitad amino-terminal de la cadena H, o el dominio correspondiente a ese fragmento en la cadena H intacta. A este respecto, puede resultar deseable eliminar la función de unión a la célula de HC, esto se puede hacer mediante la deleción de la secuencia de aminoácidos de HC o HCC (al nivel de síntesis de ADN, o al nivel de postsíntesis mediante un tratamiento con una nucleasa o proteasa). Como alternativa, la función HC puede inactivarse mediante un tratamiento químico o biológico.

Los ejemplos de dominios de translocación (de referencia) adecuados incluyen:

neurotoxina botulínica de tipo A -restos aminoácidos (449-871)

neurotoxina botulínica de tipo B -restos aminoácidos (441-858)

neurotoxina botulínica de tipo C -restos aminoácidos (442-866)

neurotoxina botulínica de tipo D -restos aminoácidos (446-862)

neurotoxina botulínica de tipo E -restos aminoácidos (423-845)

neurotoxina botulínica de tipo F -restos aminoácidos (440-864)

neurotoxina botulínica de tipo G -restos aminoácidos (442-863)

neurotoxina del tétanos -restos aminoácidos (458-879)

La secuencia de referencia identificada anteriormente debe considerarse una guía, puesto que pueden producirse ligeras variaciones según los subserotipos. Como ejemplo, el documento US 2007/0166332 cita secuencias clostridiales ligeramente diferentes:

neurotoxina botulínica de tipo A -restos aminoácidos (A449-K871)

neurotoxina botulínica de tipo B -restos aminoácidos (A442-S858)

neurotoxina botulínica de tipo C -restos aminoácidos (T450-N866)

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Claims

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