CN105567739B

CN105567739B - 病毒载体颗粒及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN105567739B
Application number: CN201610077434.0A
Authority: CN
Inventors: 孟疆辉; 刚轶金; 孟宝玺
Original assignee: Zhengzhou Keerlier Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Zhengzhou Keerlier Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2016-02-04
Filing date: 2016-02-04
Publication date: 2019-07-12
Anticipated expiration: 2036-02-04
Also published as: CN105567739A

Abstract

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种病毒载体颗粒及其构建方法和在治疗人类慢性疼痛药物中的应用。该病毒载体颗粒包括pspax2、pmd2.G和pwpi质粒，所述pwpi质粒包含启动子、肉毒素酶活区以及内部核糖体进入位点序列。该病毒载体颗粒的构建方法包括（1）细胞系 lenti‑x293T的培养；（2）换成DMEM培养基；（3）将pspax2、pmd2.G和pwpi质粒转染到lenti‑x293T细胞；（4）洗掉转染液，加入含10wt%小牛血清的培养液进行培养；（5）回收培养液，过滤、离心，即可获得高滴度的病毒载体颗粒。本发明病毒载体颗粒对治疗慢性疼痛更有针对性，可以阻止神经系统和外周细胞之间的恶性循环。

Description

病毒载体颗粒及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种病毒载体颗粒及其构建方法和在治疗人类慢性疼痛药物中的应用。

背景技术

疼痛是对于实际的或潜在的损害产生的一种不愉快的感觉和情感体验，是一个复杂的感性经验，包括传达感官信息的nociceptors（疼痛感受器）对于如位置、类型和强度的刺激产生的反应。一直以来疼痛及其治疗被视为重要和有趣的医学领域。

慢性疼痛是组织所造成的伤害，很多时候伴有神经的长期损伤。慢性疼痛是由于激活了nociceptors (疼痛接收器) 导致nociception (神经处理有害刺激)，疼痛的感觉开始于神经传入。中枢系统也发挥了作用，从而维持疼痛的持久性。

神经和免疫系统是链接外围炎症反应之间的一个重要环节。细胞因子在没有人身伤害或损坏的情况下可以触发疼痛，促进炎症，细胞因子的产生水平升高在大脑和脊髓的外围神经系统 (感官神经细胞) 造成损害。在外周神经受到伤害后，免疫反应在背根Ganglia (DRGs) 由macrophages（巨噬细胞）、淋巴细胞和卫星细胞产生。因痛觉感受神经元释放痛觉递质 (P物质、CGRP和激素产生的基因相关肽) 从而刺激免疫细胞，如macrophages（巨噬细胞）、synoviocytes（滑膜细胞）导致分泌炎性细胞因子，如TNF-α和IL-6。另一方面，neurodegeneration（神经退行性变）造成痛觉多肽P物质和降钙素CGRP等刺激免疫细胞释放细胞因子。总之，神经系统和外周炎症细胞建立了一个恶性循环的过程。

目前治疗急性和慢性疼痛依靠三大类的止痛药物：nonsteroidal抗炎药物(NSAIDs)、阿片类药物和adjuvants(抗抑郁药、抗痉挛药、当地麻醉气体、2-adrenoceptor「一种促效剂」)。NSAIDs和阿片类药物过度使用会产生副作用 (恶心、呕吐、胃粘膜溃疡、肾功能衰竭、肝功能衰竭、呼吸抑制、咳嗽抑制等)，甚至涉及神经伤害。所以通常需要进行剂量滴定直到足够剂量但又不会产生疼痛或不可容忍的副作用。令人遗憾的是，第二种结果常常发生所以必须终止治疗，结果是只有部分程度的疼痛能被消除。

近年来，由于肉毒素的特异性切割SNARE蛋白并抑制过度的痛觉和炎症因子分泌，已成功应用到治疗疾病。根据肉毒素的血清型共分为7类，A-G，每一类都拥有独一无二的特点，它们会选择性地切割各自的SNARE 蛋白底物，比如SNAP-25（突触小体相关蛋白）能被肉毒素A/C1/E型所切割、syntaxin1（突触融合蛋白）被肉毒素C1型、synaptobrevin（小突触泡蛋白）能被肉毒素B/D/F和/G型所切割(表1)。

表1 肉毒素的血清型和切割位点

目前，小剂量的肉毒素已被成功用作化妆品和骨关节肌肉病治疗，其持续作用时间较长（6个月以上），副作用小。近年来临床上又被用于偏头痛/张力头痛和肌肉疼痛综合症软组织疼痛的综合症等，注射3个月的患者还仍能起到镇痛作用。

肉毒素的经典作用机理是抑制肌肉运动的神经递质（乙酰胆碱， acetylcholine)的分泌从而导致肌肉瘫痪，临床上用作治疗肌肉过度紧张。神经递质的释放是一个多阶段过程，包括突触小泡和等离子膜之间的融合，从而建立一个通道，致使突触小泡中的分泌物释放到细胞外。在神经细胞分泌中, 小突触泡蛋白的C-端位于突触小泡泡膜，突触融合蛋白和通过几个半胱氨酸-链接棕榈酰链位于细胞膜的SNAP-25会形成蛋白复合体。这种复合体新的形成还需要大量涌入的Ca2+激活钙传感器突触结合蛋白。这一复合体介导突触小泡和细胞膜的融合从而小泡内的神经递质或细胞因子被释放到细胞外。

最近几年来，肉毒素也被用作治疗长期疼痛的制剂。因为科学家们发现它们也能抑制痛觉神经递质的传导，比如CGRP 和SP。风湿病专家发现肉毒素不仅治疗紧张头痛/偏头痛，在RA（类风湿性关节炎）和OA（骨关节炎）患者中对其他药品效果不佳的病人注射这种毒素到关节也能很有效的去除疼痛和发炎，但是，由于关节内膜细胞和巨噬细胞对毒素不敏感，不具有毒素作用的细胞受体，所以不能很好的抑制炎症因子和炎症因子对感官神经细胞的刺激，所以感觉神经元仍能分泌痛觉递质。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种病毒载体颗粒，对治疗慢性疼痛更有针对性，可以阻止神经系统和外周细胞之间的恶性循环。可广泛应用于治疗人类慢性疼痛的药物，尤其用于治疗类风湿性关节炎、骨关节炎的药物。

为解决以上问题，本发明通过以下技术方案实现：

设计一种病毒载体颗粒，包括pspax2、pmd2.G和pwpi质粒，所述pwpi质粒包含启动子、肉毒素酶活区以及内部核糖体进入位点（IRES）序列。

优选的，所述肉毒素酶活区为A型、B型、C型或D型。

优选的，所述病毒为慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒中的一种。

优选的，所述D型肉毒素酶活区序列的起始编码序列之前插入有增强表达序列ACCATGGGC。

上述病毒载体颗粒的构建方法，包括以下步骤：

（1）将细胞系 lenti-x293T的细胞密度培养至70%；

（2）洗去培养液中的血清，换成无血清的DMEM培养基；

（3）将pspax2、pmd2.G和pwpi质粒用磷酸钙转染法转染到lenti-x293T细胞中；

（4）四小时后，洗掉转染液，加入含10wt%小牛血清的培养液进行培养；

（5）回收培养液，将细胞碎片过滤，再进行超速离心，即可获得高滴度的病毒载体颗粒。

优选的，步骤（3）所述pwpi、pmd2.G和pspax2的转染用量比例为2：1：10。

优选的，步骤（3）所述转染方法具体包括以下步骤：

在10mL的Falcon管A中加入288μL 2mol/L的 CaCl₂溶液，以及pwpi质粒10μg、pmd2.G质粒5μg和pspax2质粒100μg，补水到2880μL的总体积；

在10mL的Falcon管B中加入2880μL的2xHBS buffer，再将Falcon管A中液体滴入Falcon管B，在2～3秒内迅速混合均匀；

将所得混合液在室温下放置15～20分钟，再滴入长有lenti-x293T细胞的直径为15cm的培养皿中。

优选的，将所述所述细胞碎片通过0.45微米过滤器进行过滤；所述超速离心的转速为30000rpm，时间为2h。

本发明具有以下积极有益效果：

发明人以膝关节病发时起关键作用的人类关节滑膜细胞、巨噬细胞和感官神经细胞为研究对象，这些细胞在痛觉和炎症发生时过多的分泌细胞因子或神经多肽，而这些与痛觉和炎症相关的因子需要SNARE蛋白的介导才能分泌。

（1）本发明有针对性的在神经和非神经元细胞进行基因水平的治疗，利用病毒靶向性介导肉毒素的蛋白酶活力到特异细胞，从而切割SNARE蛋白，以控制炎症因子的分泌，实验结果显示肉毒素蛋白酶成功作用，在巨噬细胞、关节滑膜细胞中阻断释放细胞因子(TNF-α和IL6)。这对于现有的镇痛和抗炎药物研究有开创性的作用。

（2）由于关节炎和慢性头疼的发生系统涉及到神经和其外周非神经系统，痛觉和炎症因子过度分泌，两种系统之间的恶性循环和相互作用，只针对其中一种系统的肉毒素的治疗已现不足，所以本发明利用复制缺陷型的病毒靶向性的将肉毒素的酶活区导入以上两种系统，从而利用稳定表达的酶蛋白区切割炎症因子分泌的SNARE 蛋白，从而有效的减少炎症因子的分泌。

（3）通过慢病毒介导的基因治疗与其他传统抗炎治疗相比是一种非常有用的方法。本发明由于克隆的大容量和便于生产的高病毒颗粒滴度，达到了商业化的含发夹RNA的慢病毒和目标生物疗法。

（4）由于产生这种基因治疗的病毒颗粒同时需要三个不同的质粒（pspax2、pmd2.G和pwpi-肉毒素D型酶活区基因），加强了对制造和使用过程中的有效性和安全性。同时，我们使用的是自我灭活的病毒颗粒，U3的区域的5'LTR改为CMV，野生型的启动子和U3的区域的3'LTR (包含TATA框和转录因子绑定站点)已被删除。

（5）体外经化学方法介导肉毒素酶活区的DNA 进入细胞内发现也能起到切割SNARE蛋白的作用，而这一方发不能用于体内作用，只能用作培养的细胞的体外研究。在体外研究非神经元细胞关节细胞、肥大细胞、巨噬细胞等释放的细胞因子作用中发现任何一种血清型的肉毒素蛋白不能进入该细胞，而经过本发明精心设计的有针对性的慢病毒包装的新毒素病毒颗粒可以顺利进入这些细胞并且切割SNARE 蛋白底物，这一作用可以达到用慢病毒包装的发夹RNA（shRNA）进行的基因敲除的功效。

（6）慢病毒颗粒既能感染神经又能感染非神经细胞，而且能经过定点注射进入体内，从而起到在特异性的组织上表达肉毒素的酶活区而切割SNARE蛋白。所介导的肉毒素DNA能表达毒素活性酶并有效切割神经和非神经细胞的痛觉和炎症因子分泌。

（7）研究发现巨噬细胞和关节滑膜细胞使用SNAP-23 和VAMP3 作为介导细胞炎症因子分泌的关键蛋白，但是这些蛋白并不被神经细胞所使用，所以我们可以使用本发明能作用到神经和非神经细胞SNARE 蛋白的慢病毒颗粒。比如产生能切割SNAP-23 和SNAP-25的突变型E酶(Chen et al，PNAS，2009)。另外，由于神经细胞使用的VAMP1、VAMP2，和非神经细胞所使用的VAMP3可以被B、D、F、G型肉毒素血清型的酶活区所切割，我们的包装有这些酶活区的慢病毒颗粒当进入到神经和非神经细胞后就能对这些底物进行切割，达到同时对神经和非神经细胞所分泌的递质进行有效抑制。

（8）以肉毒素的D 血清型为例，所用慢病毒颗粒属于retroviridae（逆转录病毒科），因为它们不能自我复制，且其复制的基因缺失产生的非复制的粒子慢病毒已被证明能将调解转录和表达的治疗基因(transgenes) 转到多种细胞，例如巨噬细胞、关节滑膜细胞、淋巴细胞和神经细胞 (jurgens et al,2012)。此外，使用在活体外细胞介导，慢病毒颗粒可有助于在活体内提供基因表达。此外，慢病毒颗粒可长期支持转移基因的表达，与其他抗逆转录病毒引导程序不同，慢病毒颗粒为我们提供了一种更长期的治疗和控制慢性疾病的临床手段 (tiscornia et al,2006; jurgens et al,2012)。

附图说明

图1 为实施例1病毒质粒转染成功指示信号荧光蛋白-GFP；

图2 为实施例1的肉毒素D型酶切割滑膜细胞VAMP3、阻碍SW982释放炎症细胞因子对比图；

图3 为实施例1的肉毒素D型酶切割巨噬细胞VAMP3、阻止其释放细胞因子对比图；

图4为实施例1的肉毒素D型酶切割痛觉神经细胞VAMP1、抑制释放痛觉神经递质对比图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。以下各实施例中所用原料，如无特别说明，则均为市售；所用方法，如无特别说明，均为常规方法。

以下实施例所用细胞系 lenti-x293T购自Clontech Laboratories, Inc；所用pspax2、pmd2.G和pwpi质粒购自Addgene；所用CaCl₂ 和2xHBS buffer 购自ClontechLaboratories, Inc.。

实施例1

一种慢病毒载体颗粒，包括pspax2、pmd2.G和pwpi质粒，所述pwpi质粒包含启动子、肉毒素D型酶活区以及内部核糖体进入位点（IRES）序列。

合成的肉毒素D型酶活区基因设计有用于增强表达的区域（ACC ATG GGC），位于其起始编码之前，以及含有用于克隆用的PmeI位点，在5’及3’端，见序列表中序列1。肉毒素D型酶活区基因被PmeI 酶切及回收后，克隆到PmeI酶切及碱性磷酸酶处理后的pwpi质粒。其正确克隆的方向通过PstI 酶切及基因序列测定来证实。

上述pwpi质粒的构建方法，包括以下步骤：

（1）首先，将1μg含有标记基因 (GFP或者RFP) 的pwpi载体经过1μL PME1酶消化处理，在50μL eppendorf 管中，于37℃消化2小时；同时，将合成的含有PME1酶切位点和肉毒素酶活区D型基因的pEx-K4进行同样条件的消化；

（2）然后，将消化后的DNA 用去磷酸化酶在37℃进行1小时的去磷酸化；

（3）之后，回收pwpi线状DNA，并和肉毒素酶活区D型基因在37℃连接，连接反应为：1μL的20ng载体+4μL 5×DNA稀释液+5μL的大约80ng的肉毒素酶活区D型基因+10ng 2×DNA连接酶buffer+1μL的DNA连接酶，5分钟37℃进行连接；

（4）然后将连接产物转染到NEB® Stable Competent E. coli细胞内，挑取单菌落，并将单菌落进行培养和提取大量的DNA，即得。

为了验证上述提出的DNA 含有肉毒素酶活区D型基因，DNA 要经过限制酶Pme1 和PST1双酶消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，如果展示出正确条带（肉毒素酶活区D型基因大约1.3KB大小），就证明所制备的含有肉毒素酶活区D型基因的pwpi质粒载体正确。

所合成的肉毒素D型酶活区基因核苷酸序列含有以下区域（序列表中序列1）：1～8、1329～1336的碱基序列是限制内切酶PmeI，用作克隆肉毒素D型酶活区基因核苷酸序列。9～17的碱基序列是用来提高蛋白质表达的核苷酸序列。余下是肉毒素D型酶活区基因核苷酸序列。推导的氨基酸序列见序列表中序列2。

该慢病毒载体颗粒的构建方法，包括以下步骤：

（1）将细胞系 lenti-x293T的细胞密度培养至70%（细胞所占据培养皿的空间比例）；

（2）洗去培养液中的血清，换成无血清的DMEM培养基；

（3）将pspax2、pmd2.G和pwpi质粒用磷酸钙法共同转染到lenti-x293T细胞中；

所述转染方法具体包括以下步骤：

将所得混合液在室温下放置15～20分钟，再滴入长有lenti-x293T细胞的直径为15cm的培养皿中；

（5）回收培养液，将细胞碎片过滤（通过0.45微米），再进行超速离心（30000rpm，2h），即可获得高滴度的慢病毒载体颗粒。

在种植有1百万炎症细胞（关节滑膜细胞细胞）的培养皿中将所得慢病毒载体颗粒加入，然后在37℃培养， 24小时后观察细胞的感染程度：约90%的细胞在质粒转化的40小时后产生如图1所示的高程度的荧光蛋白（绿色荧光或红色荧光），图中比例栏表示100μm。

图1表明：（1）本发明所得慢病毒载体颗粒成功将肉毒素的D型酶活基因引入人类关节滑膜细胞；（2）在37^oC、5%CO₂环境中种植的关节滑膜细胞细胞，被我们所设计的具有肉毒素的D型酶活基因的慢病毒载体颗粒所感染，对其细胞蛋白质进行回收后用电转染检测VAMP3的切割，然后对免疫印迹分析后发现VAMP3能被肉毒素的D型酶活基因表达的肉毒素所成功切割；（3）从关节滑膜细胞细胞释放的细胞因子能被肉毒素D型酶所抑制，完全是由于对细胞因子分泌起关键作用的VAMP3被肉毒素D型酶所切割；（4）数目相等的关节滑膜细胞细胞被慢病毒颗粒的肉毒素的D型酶感染后，VAMP3被肉毒素D型酶所切割，这一反应导致IL1β引起TNF-α释放和IL6的分泌被有效抑制。

图2中，对照：未处理的细胞样品；肉毒素：实施例1慢病毒载体颗粒处理的细胞样品。同样的细胞被对照和慢病毒颗粒的肉毒素D型酶处理后，细胞蛋白进行了蛋白质电泳和西点杂交。西点杂交的条带进行扫描后计算蛋白量发现VAMP3 被慢病毒颗粒的肉毒素D型酶成功切割。在左边第一个柱状图中切割VAMP3的程度与对照相比以百分比形式表达出来。关节滑膜细胞被慢病毒颗粒的肉毒素D型酶转染的三天后，由于VAMP3被切割，不再起到介导炎症因子释放的作用，白细胞介素1β引起的肿瘤坏死因子α和白细胞介素6被有效抑制。数据表示±S.E.M、N=3。

为了进一步调查是否实施例1慢病毒载体颗粒的肉毒素D型酶切割能切割巨噬细胞的VAMP3和抑制细胞因子的产生释放，我们进行了同样的试验，见图3。在巨噬细胞中，慢病毒载体颗粒所含有的肉毒素D型酶切割了VAMP3，也有效抑制了其炎症因子的分泌。

图3中，对照：未处理的细胞样品；肉毒素：实施例1慢病毒载体颗粒处理的细胞样品。同样的细胞被对照和慢病毒颗粒的肉毒素D型酶处理后，细胞蛋白进行了蛋白质电泳和西点杂交。西点杂交的条带进行扫描后计算蛋白量发现VAMP3 被慢病毒颗粒的肉毒素D型酶成功切割。在左边第一个柱状图中切割VAMP3的程度与对照相比以百分比形式表达出来。关节滑膜细胞被慢病毒颗粒的肉毒素D型酶转染的三天后，由于VAMP3被切割，不再起到介导炎症因子释放的作用，白细胞介素1β引起的肿瘤坏死因子α和白细胞介素6被有效抑制。数据表示±S.E.M、N=3。

图4中，对照：未处理的细胞样品；肉毒素：实施例1慢病毒载体颗粒处理的细胞样品。同样的原理，当培养的痛觉神经细胞（DRG）被对照和慢病毒载体颗粒的肉毒素D型酶处理后，细胞蛋白也进行了蛋白质电泳和西点杂交。西点杂交的条带进行扫描后计算蛋白量发现VAMP1 被慢病毒载体颗粒的肉毒素D型酶成功切割。在左边第一个柱状图中切割VAMP1的程度与对照相比以百分比形式表达出来。痛觉神经细胞被慢病毒颗粒的肉毒素D型酶转染的7天后，由于VAMP1被切割，不再起到介导痛觉神经递质释放的作用，高浓度的KCl所刺激的痛觉神经递质的释放被有效抑制。数据表示±S.E.M、N=3。

SEQUENCE LISTING

<110> 郑州可尔利尔生物科技有限公司

<120> 病毒载体颗粒及其构建方法和应用

<130> /

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1336

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtttaaacac catgggcatg acctggccgg tgaaagactt taactatagc gatccggtga 60

acgataacga tattctgtat ctgcgtatcc cgcagaacaa actgattacc accccggtga 120

aagcgttcat gattacccag aacatttggg tgattccgga acgttttagc agcgatacca 180

atccgagcct gagcaaaccg ccgcgtccga ccagcaaata tcagagctat tacgatccga 240

gctatctgag caccgatgaa cagaaagata ccttcctgaa aggcatcatc aaactgttca 300

aacgcattaa cgaacgcgat attggcaaaa aactgatcaa ctatctggtg gtgggcagcc 360

cgtttatggg cgatagcagc accccggaag atacctttga ttttacccgt cataccacga 420

acattgcggt ggaaaaattt gaaaacggca gctggaaagt gaccaacatt attaccccga 480

gcgtgctgat ttttggcccg ctgccgaaca ttctggatta taccgcgagc ctgacgctgc 540

aaggccagca gagcaatccg agctttgaag gctttggcac cctgagcatt ctgaaagtgg 600

cgccggaatt tctgctgacc tttagcgatg tgaccagcaa ccagagcagc gcggtgctgg 660

gcaaaagcat tttttgcatg gatccggtga ttgcgctgat gcatgaactg acccatagcc 720

tgcatcagct gtatggcatt aacattccga gcgataaacg tattcgtccg caggtgagcg 780

aaggcttttt tagccaggat ggcccgaacg tgcagtttga agaactgtat acctttggcg 840

gcctggatgt ggaaattatt ccgcagattg aacgtagcca gctgcgtgaa aaagcgctgg 900

gccactataa agatattgcg aaacgcctga acaacatcaa caaaaccatt ccgagcagct 960

ggattagcaa catcgataaa tacaaaaaaa tcttcagcga aaaatataac ttcgataaag 1020

ataacaccgg caacttcgtg gtgaacattg ataaattcaa cagcctgtat agcgatctga 1080

ccaacgtgat gagcgaagtg gtgtatagca gccagtataa cgtgaaaaac cgcacccatt 1140

atttcagccg tcattatctg ccggtgtttg cgaatattct ggatgataac atctatacca 1200

tccgtgatgg ctttaacctg accaacaaag gctttaacat tgaaaacagc ggccagaaca 1260

ttgaacgtaa tccggcgctg cagaaactgt ctagcgaaag cgtggtggac ctgtttacca 1320

aagtgtgagt ttaaac 1336

<210> 2

<211> 438

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Gly Met Thr Trp Pro Val Lys Asp Phe Asn Tyr Ser Asp Pro Val

1 5 10 15

Asn Asp Asn Asp Ile Leu Tyr Leu Arg Ile Pro Gln Asn Lys Leu Ile

20 25 30

Thr Thr Pro Val Lys Ala Phe Met Ile Thr Gln Asn Ile Trp Val Ile

35 40 45

Pro Glu Arg Phe Ser Ser Asp Thr Asn Pro Ser Leu Ser Lys Pro Pro

50 55 60

Arg Pro Thr Ser Lys Tyr Gln Ser Tyr Tyr Asp Pro Ser Tyr Leu Ser

65 70 75 80

Thr Asp Glu Gln Lys Asp Thr Phe Leu Lys Gly Ile Ile Lys Leu Phe

85 90 95

Lys Arg Ile Asn Glu Arg Asp Ile Gly Lys Lys Leu Ile Asn Tyr Leu

100 105 110

Val Val Gly Ser Pro Phe Met Gly Asp Ser Ser Thr Pro Glu Asp Thr

115 120 125

Phe Asp Phe Thr Arg His Thr Thr Asn Ile Ala Val Glu Lys Phe Glu

130 135 140

Asn Gly Ser Trp Lys Val Thr Asn Ile Ile Thr Pro Ser Val Leu Ile

145 150 155 160

Phe Gly Pro Leu Pro Asn Ile Leu Asp Tyr Thr Ala Ser Leu Thr Leu

165 170 175

Gln Gly Gln Gln Ser Asn Pro Ser Phe Glu Gly Phe Gly Thr Leu Ser

180 185 190

Ile Leu Lys Val Ala Pro Glu Phe Leu Leu Thr Phe Ser Asp Val Thr

195 200 205

Ser Asn Gln Ser Ser Ala Val Leu Gly Lys Ser Ile Phe Cys Met Asp

210 215 220

Pro Val Ile Ala Leu Met His Glu Leu Thr His Ser Leu His Gln Leu

225 230 235 240

Tyr Gly Ile Asn Ile Pro Ser Asp Lys Arg Ile Arg Pro Gln Val Ser

245 250 255

Glu Gly Phe Phe Ser Gln Asp Gly Pro Asn Val Gln Phe Glu Glu Leu

260 265 270

Tyr Thr Phe Gly Gly Leu Asp Val Glu Ile Ile Pro Gln Ile Glu Arg

275 280 285

Ser Gln Leu Arg Glu Lys Ala Leu Gly His Tyr Lys Asp Ile Ala Lys

290 295 300

Arg Leu Asn Asn Ile Asn Lys Thr Ile Pro Ser Ser Trp Ile Ser Asn

305 310 315 320

Ile Asp Lys Tyr Lys Lys Ile Phe Ser Glu Lys Tyr Asn Phe Asp Lys

325 330 335

Asp Asn Thr Gly Asn Phe Val Val Asn Ile Asp Lys Phe Asn Ser Leu

340 345 350

Tyr Ser Asp Leu Thr Asn Val Met Ser Glu Val Val Tyr Ser Ser Gln

355 360 365

Tyr Asn Val Lys Asn Arg Thr His Tyr Phe Ser Arg His Tyr Leu Pro

370 375 380

Val Phe Ala Asn Ile Leu Asp Asp Asn Ile Tyr Thr Ile Arg Asp Gly

385 390 395 400

Phe Asn Leu Thr Asn Lys Gly Phe Asn Ile Glu Asn Ser Gly Gln Asn

405 410 415

Ile Glu Arg Asn Pro Ala Leu Gln Lys Leu Ser Ser Glu Ser Val Val

420 425 430

Asp Leu Phe Thr Lys Val

435

Claims

1.一种病毒载体颗粒，包括pspax2、pmd2.G和pwpi质粒，其特征在于：所述pwpi质粒包含启动子、肉毒素D型酶活区以及内部核糖体进入位点序列；所述肉毒素D型酶活区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，所述肉毒素D型酶活区序列的起始编码序列之前插入有增强表达序列ACCATGGGC；所述病毒为慢病毒。

2.权利要求1所述病毒载体颗粒的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将细胞系 lenti-x293T的细胞密度培养至70%；

（2）洗去培养液中的血清，换成无血清的DMEM培养基；

（3）将权利要求1中所述pspax2、pmd2.G和pwpi质粒用磷酸钙转染法转染到lenti-x293T细胞中；

3.根据权利要求2所述的病毒载体颗粒的构建方法，其特征在于：步骤（3）所述pwpi、pmd2.G和pspax2的转染用量比例为2：1：10。

4.根据权利要求2所述的病毒载体颗粒的构建方法，其特征在于：步骤（3）所述转染法具体包括以下步骤：

①在10mL的Falcon管A中加入288μL 2mol/L的 CaCl₂溶液，以及pwpi质粒10μg、 pmd2.G质粒5μg和pspax2质粒100μg，补水到2880μL的总体积；

②在10mL的Falcon管B中加入2880μL的2xHBS buffer，再将Falcon管A中液体滴入Falcon管B，在2～3秒内迅速混合均匀；

③将所得混合液在室温下放置15～20分钟，再滴入长有lenti-x293T细胞的直径为15cm的培养皿中。

5.根据权利要求2所述的病毒载体颗粒的构建方法，其特征在于：将所述细胞碎片通过0.45μm过滤器进行过滤；所述超速离心的转速为30000rpm，时间为2h。