CN111433358A - 用于管理疼痛的方法 - Google Patents

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CN111433358A CN201880059336.1A CN201880059336A CN111433358A CN 111433358 A CN111433358 A CN 111433358A CN 201880059336 A CN201880059336 A CN 201880059336A CN 111433358 A CN111433358 A CN 111433358A
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Abstract

本发明提供了一种治疗或预防有需要的受试者的疼痛的方法。所述方法包括向所述受试者施用表达载体，所述表达载体包括编码碳酸酐酶(10)或碳酸酐酶(11)的核酸序列，使得所述核酸被表达以产生碳酸酐酶(10)或碳酸酐酶(11)。可替代地，所述方法包括向所述受试者施用表达载体，所述表达载体包括编码碳酸酐酶(8)片段的核酸序列，使得所述核酸被表达以产生所述碳酸酐酶(8)片段。

Description

用于管理疼痛的方法
资助资金公开
本发明是在由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号DE022903下由政府支持进行的。政府享有本发明的某些权利。
技术领域
本发明涉及用于治疗或预防疼痛的材料和方法。
通过引用并入电子提交的材料
作为本公开的单独部分，本申请含有计算机可读形式的序列表(文件名：51774A_Seqlisting.txt；大小：73,7002字节；创建于：2018年7月13日)，其通过引用以其全文并入。
背景技术
持续性疼痛每年在医疗保健费用和生产力损失方面造成的费用约为6,500亿美元。2012年进行的国民健康访问调查估计，近5,000万美国成年人患有严重的慢性疼痛或剧烈疼痛。在americanpainsociety.org/about-us/press-room/nih-study-shows-prevalence-of-chronic-or-severe-pain-in-u-s-adults找到了美国疼痛协会(AmericanPain Society)2015年8月18日的新闻稿。其它研究表明，疼痛的负担更高。
当前可用于慢性疼痛的治疗与使大多数患者得不到充分治疗的缺点相关联。例如，由于完全的感觉阻滞和运动阻滞，当前的局部麻醉剂作用短暂并且无效。包含吗啡的阿片类药物是例如术后和慢性疼痛病状的主要治疗方法。过去几十年来，长期使用阿片样物质治疗慢性非癌症疼痛的情况急剧增加，并且阿片样物质的滥用、耐受性和依赖性是主要的公共卫生问题。事实上，阿片样物质施用的副作用(例如耐受性、药物依赖性/成瘾、呼吸抑制、便秘、恶心、瘙痒、镇静和情绪波动)，限制了阿片样物质的治疗潜力，并且缺乏合适的替代物已经导致阿片样物质过度使用、滥用和危及生命的并发症的流行。在美国，2007年仅处方阿片样物质滥用的费用估计约为557亿美元。这笔费用中几乎有一半归因于工作场所费用(例如，生产力损失)，45％归因于医疗保健费用(例如，滥用治疗)并且9％归因于刑事司法费用。Birnbaum等人，《疼痛医学(Pain medicine)》2011；12:657-67。
尽管对止痛药进行了大量的研究，但仍然需要提供镇痛的治疗选择，同时最小化(或避免)与阿片样物质使用相关联的不良反应。
发明内容
本公开提供一种治疗或预防有需要的受试者(例如，人类)的疼痛的方法。一方面，所述方法包括向所述受试者施用表达载体(例如，病毒载体，如腺相关病毒载体或单纯性疱疹病毒载体)，所述表达载体包括编码碳酸酐酶10或碳酸酐酶11的核酸序列，使得所述核酸被表达以产生碳酸酐酶10或碳酸酐酶11。可替代地，表达载体(例如，病毒载体，如腺相关病毒载体或单纯性疱疹病毒载体)包括编码羧基酸酐酶8或碳酸酐酶8片段的核酸序列。设想了人类和小鼠版本的碳酸酐酶(CA8/Car8、CA8/Car8片段、CA10/Car10和/或CA11/Car11)。将理解，本文中与人类版本的碳酸酐酶(例如，CA8、CA8片段、CA10和/或CA11)有关的描述也适用于小鼠版本(Car8、Car8片段、Car10和/或Car11)。编码碳酸酐酶8(CA8人类或Car8小鼠)的片段的核酸序列包括碳酸酐酶8编码序列的前三个外显子(或基本上由其组成或由其组成)。任选地，编码碳酸酐酶8的片段的核酸序列是替代性转录物CA8-204，所述转录物CA8-204包括具有细长的外显子3和保留的内含子的前三个外显子。在各个方面，碳酸酐酶是ITPR1活化(pITPR1)和ITPR1介导的细胞内钙释放的拮抗剂。
在各个方面，所述疼痛是神经性疼痛、癌症疼痛或炎性疼痛。在各个方面，所述方法包括向所述受试者的背根神经节施用所述表达载体，或通过关节内注射、皮内递送或口服递送来施用所述表达载体。
前述发明内容并非旨在定义本发明的每个方面，并且在其它部分，如具体实施方式中对另外的方面进行了描述。整个文档旨在作为统一的公开进行关联，并且应当理解，即使在本文档的同一句子或段落或部分中没有一起找到特征的组合，设想了本文所描述的特征的所有组合。另外，作为另外的方面，本发明包含本发明的所有实施例，其范围以任何方式比上面具体提到的变化窄。关于用“一个/种(a/an)”描述或要求保护的本发明的各方面，应当理解，除非上下文明确要求更受限制的含义，否则这些术语意味着“一个或多个”。关于被描述为组内的一个或多个的元件，应当理解，设想了组内的所有组合。如果本发明的各方面被描述为“包括”特征，则也设想了实施例“由”所述特征“组成”或“基本上由”所述特征“组成”。
尽管一个或多个申请人发明了随附于此的权利要求的全部范围，但是所附权利要求并不旨在在其范围内涵盖其它的现有技术作品。因此，如果专利局或其它实体或个人提请申请人注意权利要求范围内的法定现有技术，则一个或多个申请人保留根据适用专利法行使修正权利的权利，以重新定义此类权利要求的主题，从而将此类法定现有技术或法定现有技术的明显变化从此类权利要求的范围中具体地排除。由此类经过修正的权利要求定义的本发明的变化也旨在作为本发明的方面。从本申请的整体来看，本发明的另外的特征和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且所有此类特征均旨在作为本发明的方面。
附图说明
图1A-1C是展示相对pITPR1密度(图1A)、相对V5密度(图1B)和相对pITPR1密度(图1C)的条形图。Car10/CA10在HEK293细胞中的过表达抑制了佛司可林诱导的ITPR1磷酸化(pITPR1)。用表达鼠(Car10)和人类(CA10)的AAV-V5载体转染HEK293细胞。蛋白质印迹分析表明，佛司可林以剂量依赖性方式增加pITPR1水平(图1A)。在V5-Car10和V5-CA10载体转染后，在蛋白质印迹上使用V5标签来表明CA10和Car10蛋白过表达(图1B)。Car10和CA10过表达降低了HEK293细胞中响应于1微摩尔佛司可林刺激的ITPR1磷酸化(图1C)。N＝6，数据呈现为平均值±SEM**P<0.01，***P<0.001，单向ANOVA。
图2是展示AAV-V5-Car10和AAV-V5-CA10在HEK293细胞中的过表达抑制了1μM ATP诱导的细胞质钙释放(如Fura-2(340/380比率)所指示的)(y轴)的条形图。钙成像数据表明，当与空载体对照相比时，car10和CA10蛋白过表达抑制了HEK293细胞中1μM ATP诱导的细胞质钙释放。Car10和CA10过表达显著地抑制了游离钙释放(P<0.001)。N＝4个盖玻片和每个样品总共200个细胞**P<0.01，***P<0.001，采用双向ANOVA，然后进行Bonferroni测试。
图3是展示研究的各个天数(x轴)的缩爪潜伏期(秒)(y轴)的条形图，表明V5-Car10和V5-CA10的基因转移在角叉菜胶炎性疼痛小鼠模型中导致热抗痛觉过敏。在C57BL/6J小鼠中，V5-Car10和V5-CA10通过坐骨神经注射生理盐水、AAV8-null、AAV8-V5-Car10和AAV8-V5-CA10病毒颗粒(分别为1.06E14病毒颗粒和1.66E14病毒颗粒)的过表达后的热反应。在注射AAV8-V5-Car10和AAV8-V5-CA10病毒颗粒后第15天基础热潜伏期增加，但是在注射含有空载体的生理盐水或病毒颗粒后基础热潜伏期没有增加。在第16天结束时注射角叉菜胶后，生理盐水和含有病毒颗粒的AAV8-null示出从基线热潜伏期的显著降低。然而，AAV8-V5-Car10和AAV8-V5-CA10注射组与基线无差异(N＝8，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001,采用双向ANOVA，然后进行Bonferroni事后测试)。
图4是展示研究的各个天数(x轴)的缩爪潜伏期(秒)(y轴)的条形图，表明V5-Car10和V5-CA10的基因转移在完全弗氏佐剂(CFA)慢性炎性疼痛小鼠模型中导致热抗痛觉过敏。在坐骨神经注射生理盐水、AAV8-null、AAV8-V5-Car10和AAV8-V5-CA10病毒颗粒(分别为1.06E14病毒颗粒和1.66E14病毒颗粒)后示出热反应。在注射AAV8-V5-Car10和AAV8-V5-CA10病毒颗粒后第15天基础热潜伏期增加，但是在注射含有空载体的生理盐水或病毒颗粒后基础热潜伏期没有增加。在第16天结束时注射CFA后(测量热潜伏期后)，所有组均较基线显著降低。从第24天开始，AAV8-V5-Car10和AAV8-V5-CA10注射组示出镇痛作用(热潜伏期高于基线，与病毒注射后第15天和第16天类似)，而对照组与注射CFA前相比没有变化。(N＝8，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001,采用双向ANOVA，然后进行Bonferroni事后测试)。
图5是展示研究的各个天数(x轴)的缩爪潜伏期(秒)(y轴)的条形图，表明V5-Car10和V5-CA10的基因转移预防神经性(Chung)小鼠疼痛模型中的机械性痛觉过敏。在C57BL/6J小鼠中，在坐骨神经注射生理盐水、AAV8-null、AAV8-V5-Car10和AAV8-V5-CA10病毒颗粒(分别为1.06E14病毒颗粒和1.66E14病毒颗粒)后，示出机械缩爪阈值。在病毒注射后的第12天，AAV8-V5-Car10将机械缩爪阈值提高到基线以上(镇痛作用)，并且尽管在第19天进行了脊神经结扎，这种情况一直持续到第22天。其它组的缩爪阈值没有类似的增加。(N＝8，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001,采用双向ANOVA，然后进行Bonferroni测试)。
图6是展示吗啡剂量给药(腹膜内给药)(x轴)后约30分钟的缩爪潜伏期(秒)(y轴)之间的关系的条形图。当与10mg/kg、30mg/kg和60mg/kg剂量的生理盐水相比时，升高显著。
图7是展示在60kg人体中的缩爪潜伏期(秒)(x轴)与吗啡当量口服剂量之间的关系的图表(在给药后约30分钟评估的腹膜内剂量；使用异速生长转换，将数据外推到人体当量剂量)(y轴)。当与人口服当量剂量相比时，如图2到5所描述的，在V5-Car10和V5-CA10的转移后，缩爪潜伏期的升高在这些小鼠模型中产生了深度的镇痛作用。
图8是编码CA10的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)。
图9是编码CA10-203的核苷酸序列(SEQ ID NO:12)。
图10是编码CA8片段、CA8-204的核苷酸序列(SEQ ID NO:13)。
图11是展示研究的各个天数(x轴)的缩爪潜伏期(秒)(y轴)的条形图，表明在神经性(Chung)小鼠疼痛模型中，V5-CA8WT(左侧条＝SNL后CA8WT；右侧条＝SNL后CA8WT)和V5-CA8MT(CA8MT表示使蛋白质不稳定并且导致蛋白酶体迅速降解的S100P点突变；Turkmen S等人，《公共科学图书馆遗传学(PLoS Genet)》5，e1000487)(中间条＝SNL后CA8MT)表达的镇痛作用。在C57BL/6J小鼠中坐骨神经注射AAV病毒颗粒(约1.0×1014个病毒颗粒)后，示出机械缩爪阈值。在施用后的第7天，AAV8-V5-CA8WT将机械缩爪阈值提高到基线以上(镇痛作用)，并且尽管在第3天进行了脊神经结扎，这种情况一直持续到第38天。在施用编码AAV8-V5-CA8MT的表达载体后，缩爪阈值没有类似的增加。(N＝8，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001,采用双向ANOVA，然后进行Bonferroni测试)。研究的结果令人惊讶。首先，尚不清楚CA8是否会对小鼠ITPR1靶标产生作用。这些数据示出人类蛋白在小鼠细胞/组织中产生作用；并且本文所描述的体外生物测定可以用于测试CA镇痛肽和变体的药效学。另外，神经性疼痛被认为是由不同于炎性疼痛的机制引起的。此外，对炎性疼痛有效的药物在神经性疼痛模型中不会产生抗痛觉过敏或抗异常性疼痛。令人惊讶地，CA8在预防和治疗神经性疼痛方面是有效的。
图12A是条形图，其展示了由CA8编码序列的前三个外显子编码的CA8片段的基因表达：在NBL细胞中，通过qPCR测得的替代性剪接片段“CA ALTG”(SNP rs6471859处的“G”等位基因)和野生型CA8“CA ALT C”(SNP rs6471859的C等位基因)。野生型CA8正常剪接，并且NBL细胞产生几乎完全由CA8的前三个外显子编码的这种片段。SNP rs6471859处的“G”等位基因的表达导致替代性剪接，并且在NBL细胞中几乎没有可检测到的具有经延伸的外显子三和经保留的内含子的CA8-204产物。因此，基本上所有由CA8的前三个外显子编码的CA8转录物和蛋白质片段均在NBL细胞中产生并且稳定。图12B是表明这种CA8片段(仅由前三个外显子编码)抑制了NBL细胞中ATP刺激的钙释放的条形图。野生型CA8(SNP rs6471859的C等位基因)正常剪接，并且这种野生型基因产物的片段在NBL细胞中产生。SNP rs6471859处的“G”等位基因的表达导致了替代性剪接，并且在NBL细胞中CA8-204蛋白的产生极少。当与表达CA8-201的载体(野生型蛋白，左侧条)或由“C”等位基因产生的经截短的CA8片段(右侧条)相比时，这种片段在这些细胞中不介导抑制作用。
图13A是展示通过qPCR测量的HEK293细胞中CA8片段的表达的条形图。SNPrs6471859处的“G”等位基因的表达导致这些细胞中的替代性剪接，在HEK293细胞中产生具有经延伸的外显子3和经保留的内含子的CA8-204产物(左侧条)。在HEK293细胞中，基本上没有可检测到的野生型CA8(SNP rs6471859的C等位基因)(右侧条)，其产生对应于CA8的前三个外显子的片段。因此，HEK293细胞中基本上所有的载体表达都是CA8-204替代性转录物。图13B是表明CA8-204抑制HEK293细胞中ATP刺激的钙释放的条形图。表达SNPrs6471859处的“G”等位基因的载体导致在HEK293细胞中发现的CA8-204蛋白的替代性剪接和产生，与表达野生型CA8(CA8-201)和由“C”等位基因编码的片段的载体相比，其抑制了ATP诱导的钙释放。
图14是用于CA8递送的示例性HSV表达载体的图。TrkAp-CA8-Flag、Nav1.7p-CA8-204-Flag、Nav1.8p-CA8-204-Flag和(未示出)Tet-Advillin-CA8-204-Flag)盒可以并入到ICP4基因座中。对于ICP0、ICP4 IE调节基因、联合区域、ICP27、ICP47、ICP22 IE基因“TAATGARAT”和UL41 vhs基因，任选地使基础载体缺失。A gB：可能存在N/T突变(在各种实施例中，其增强了细胞进入)，并且BAC序列位于基因间区域中的loxP位点之间。载体构建体也适用于递送CA8片段。
图15是用于CA8递送的示例性HSV表达载体的图。TrkAp-CA8-Flag、Nav1.7p-CA8-Flag、Nav1.8p-CA8-Flag和(未示出)Tet-Advillin-CA8-Flag盒可以并入到ICP4基因座中。对于ICP0、ICP4 IE调节基因、联合区域、ICP27、ICP47、ICP22 IE基因“TAATGARAT”和UL41vhs基因，使基础载体缺失。A gB：N/T突变增强了细胞进入，并且BAC序列位于基因间区域中的loxP位点之间。
图16是用于CA10生物治疗性递送的示例性HSV表达载体的图。TrkAp-CA10-Flag、Nav1.7p-CA10-Flag、Nav1.8p-CA10-Flag和(未示出)Tet-Advillin-CA10-Flag盒的图可以并入到ICP4基因座中。对于ICP0、ICP4 IE调节基因、联合区域、ICP27、ICP47、ICP22 IE基因“TAATGARAT”和UL41 vhs基因，使基础载体缺失。A gB：N/T突变增强了细胞进入，并且BAC序列位于基因间区域中的loxP位点之间。
图17是用于CA11递送的示例性HSV表达载体的图。表示诱导型启动子系统的TrkAp-CA11-Flag、Nav1.7p-CA11-Flag、Nav1.8p-CA11-Flag和(未示出)Tet-Advillin-CA11-Flag盒也可以并入到ICP4基因座中。对于ICP0、ICP4 IE调节基因、联合区域、ICP27、ICP47、ICP22 IE基因“TAATGARAT”和UL41 vhs基因，使基础载体缺失。A gB：N/T突变增强了细胞进入，并且BAC序列位于基因间区域中的loxP位点之间。
图18是展示响应于各个剂量的NGF(1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL)(x轴)，NBL细胞中NGF诱导的细胞内钙释放(y轴)的条形图。HEK293细胞还通过增强的细胞内钙释放来响应NGF(数据未示出)。
图19是展示NBL细胞中NGF诱导的细胞内钙释放(y轴)几乎完全通过野生型CA8的过表达，而不是CA8的突变体形式的过表达的条形图。ATP诱导的细胞内钙释放也被CA10过表达抑制[数据未示出]。
图20是展示在NBL细胞中通过选择性ITPR1抑制剂2-APB阻断NGF诱导的细胞内钙释放的条形图。因此，NBL细胞中的NGF信号传导几乎完全通过ITPR1，并且几乎完全被这种ITPR1选择性抑制剂抑制。在HEK293细胞中也观察到通过2-APB的类似抑制作用[数据未示出]。
图21A是5HT-3受体启动子和小鼠(SEQ ID NO:14)与人类序列(SEQ ID NO:15)的比较的示意图(《神经科学杂志(Journal of Neuroscience)》15，1998年8月，18(16)6186-6194)。
图21B提供了5HT-3受体启动子序列(SEQ ID NO:16)。
图22提供了NPY-Y1受体启动子-外显子1A的序列(SEQ ID NO:17)(《生物化学杂志(JBC)》第270卷，第45期，11月10日发行，第27272–27276页，1995)。
图23提供了NPY-Y1受体启动子-外显子1B的序列(SEQ ID NO:18)(《生物化学杂志(JBC)》第270卷，第45期，11月10日发行，第27272–27276页，1995)。
图24提供了NPY-Y1受体启动子-外显子1C的序列(SEQ ID NO:19)(《生物化学杂志(JBC)》第270卷，第45期，11月10日发行，第27272–27276页，1995)。
图25A提供了小鼠(SEQ ID NO:20)、大鼠(SEQ ID NO:21)和人类(SEQ ID NO:22)Nav1.8启动子SCN10A的序列(《神经化学杂志(J Neurochem)》2008年8月；106(3):1209–1224)。
图25B提供了人类Nav1.8启动子SCN10A的序列(SEQ ID NO:23)。
图26提供了Nav1.7启动子SCN9A的序列(SEQ ID NO:24)。
图27A提供了人类Trk-A启动子的序列(SEQ ID NO:25)(《生物化学杂志(J.Biol.Chem)》1998，273:39-44)。潜在的DNA结合蛋白结合位点用方框标出。
图27B提供了Trk-A启动子的序列(SEQ ID NO:26)。
图28提供了Advillin启动子的序列(SEQ ID NO:27)。
图29提供了CGRP受体启动子的序列(SEQ ID NO:28)。
图30提供了GRIN3A启动子的序列(SEQ ID NO:29)。
图31是示出在产生镇痛抗增生的炎性疼痛动物模型中CA片段CA8204C的基因转移的图。
图32是示出在产生镇痛抗增生的炎性疼痛动物模型中CA片段CA8204G的基因转移的图。
图33描绘了示出RYR1结合到CA10(Car10)的凝胶，如通过免疫沉淀(IP)和蛋白质印迹(WB)检测所表明的。
图34A和34B是凝胶，并且提供了示出Car10和CA10抑制佛司可林诱导的pITPR1的条形图。图34A提供了未经处理的对照(无佛司可林)的结果。图34B提供了用1μM佛司可林处理的结果。
图35是示出V5-Car10和V5-CA10在HEK293细胞中的表达抑制ATP诱导的细胞质钙释放的条形图。
图36是示出NBL细胞中5HT诱导的RYR依赖性钙释放被利阿诺定抑制的条形图。
图37是示出V5-Car10和V5-CA10在NBL细胞中的过表达抑制50μM 5HT诱导的细胞质钙释放的条形图。
图38示出了pCMV-N-flag-CA8-204G和pCMV N-flag-CA8-204C的构建。
图39示出了pAAV-flag-CA8-204G(ALT G)和pAAV-flag-CA8-204C(ALT C)的构建。
图40示出了CA8-204G抑制NBL细胞中的钙释放(Ca2+Fura2成像)。
图41示出了CA8 ALT(G)(CA8-204G和CA8 ALT(C)(CA8-204C)在HEK293(图41A)和NBL(图41B)细胞中的差异组织表达。
图42是示出CA8-204C和CA8-204G片段具有可变的组织表达的图。
图43示出了CA8-204C片段抑制NBL细胞中ATP刺激的钙释放。
图44是示出CA8-204G或CA8-204C肽片段是如在HEK293或NBL细胞中选择性地表达为28kDa或26kDa的凝胶。
图45示出了CA8 204C抑制佛司可林诱导的pITPR1的磷酸化。
具体实施方式
在各个方面，本公开涉及提供安全和有效的镇痛的材料和方法。本公开首次示出，碳酸酐酶10(CA10(人类)和Car10(啮齿类动物))在例如慢性神经病和炎性疼痛模型中产生镇痛作用并且预防痛觉过敏。在至少一方面，材料和方法以对运动和其它感觉功能的最小干扰来减轻疼痛，由此提高生活质量，同时将对阿片样物质使用的需求最小化。
一方面，本公开提供一种治疗或预防有需要的受试者的疼痛的方法。所述方法包括向所述受试者施用表达载体，所述表达载体包括编码碳酸酐酶10或碳酸酐酶11的核酸序列，使得所述核酸被表达以在所述受试者中产生碳酸酐酶10或碳酸酐酶11。在替代性实施例中，所述方法包括向所述受试者施用表达载体，所述表达载体包括编码碳酸酐酶8片段的核酸序列，使得所述核酸被表达以在所述受试者中产生所述碳酸酐酶8片段。编码碳酸酐酶8的片段的核酸序列包括CA8的前三个外显子，并且任选地编码CA8片段的核酸序列是本文所描述的CA8-204。在各个实施例中，表达载体是病毒载体，如腺相关病毒载体或单纯性疱疹病毒载体。
以下对本发明的各个方面进行进一步描述。章节标题的使用仅是为了方便阅读，并且不旨在对其本身进行限制。整个文档旨在被视为统一的公开，并且应当理解，设想了本文所描述的特征的所有组合。
碳酸酐酶
碳酸酐酶10(CA10)是碳酸酐酶(CA)超基因家族的成员，并且是三种催化失活的CA同种型之一。虽然CA10保留了中心碳酸酐酶基序，但是其缺乏对酶活性至关重要的催化锌配位残基。CA10的功能此前仍然未知。序列比较揭示了人类(智人)、大鼠(褐家鼠)与小鼠(小家鼠)CA10蛋白之间的100％同一性，以及与斑马鱼(Danio rerio)在氨基酸水平上的90％同一性。存在编码人CA10的九种转录物，产生了七种功能同种型。人CA10的核酸和氨基酸序列在基因库登录号NM_020178(SEQ ID NO:3)；NP_064563(SEQ ID NO:4)；NM_001082534(SEQ ID NO:5)；NP_001076003(SEQ ID NO:6)；NM_001082533(SEQ ID NO:7)和NP_001076002(SEQ ID NO:8)中列出；在UniProtKB Q9NS85(SEQ ID NO:9)中也提供了人CA10的氨基酸序列。
在各个方面，表达载体包括编码肽的核酸序列，所述肽包括与SEQ ID NO:2至少90％同一性(例如，至少95％同一性或100％同一性)。在各个方面，表达载体包括与SEQ IDNO:1具有至少90％同一性(例如，至少95％同一性或100％同一性)的核酸序列。如本文所用，“至少90％同一性”和类似术语涵盖例如，90％到100％，如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％等的任何整数。而且，术语“至少[百分比]同一性”涵盖大于或等于同一核苷酸或氨基酸的数量除以核苷酸或氨基酸的总数的任何百分比，([至少百分比同一性]≥[同一核苷酸或氨基酸的数量]/[核苷酸或氨基酸的总数])。两个或更多个序列的对齐的氨基酸(或核苷酸)的同一性百分比的计算在本领域中是充分理解的，并且通常使用已知的计算机程序来确定。例如，使用Altschul等人所描述的算法，任选地进行两个或更多个序列的对齐，以确定序列同一性百分比。如并入到BLAST(基本局部对齐搜索工具)程序中的(《核酸研究(Nucleic Acids Res)》，25:3389-402(1997))，可在国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)网站上查阅。基因产物表现出至少一种碳酸酐酶(CA10)活性，如镇痛或ITPR1活化的拮抗剂(pITPR1)和ITPR1介导的细胞内钙释放。
令人惊讶的是，尽管CA8与CA10之间存在相当大的序列差异，但CA10和Car10均显示出本文所描述的活性(例如，镇痛)。CA10的氨基酸序列表明了与其它CA同工酶的整体同一性百分比仅为25-57％，与CA11的同一性百分比最高。具体地说，在氨基酸水平上，CA10(NP_001076003.1)表现出与CA8(NP_001308766.1)仅约33％的同一性。事实上，在氨基酸水平上，与CA8或任何其它家族成员相比，CA10与CA11最相似，CA10表明与CA11的序列同一性为58％，并且与CA8的序列同一性为33％。CA10缺乏三个锌配体结合组氨酸残基中的两个，表明其缺乏CA酶活性。CA11也缺乏锌配体结合位点，表明其缺乏酶活性。与CA8类似，发现CA10抑制ITPR1(pITPR1)的佛司可林诱导的磷酸化；以及HEK293细胞和NBL细胞中ATP诱导的ITPR1介导的细胞内钙释放。CA8被认为是IP3配体结合和ITPR1活化导致细胞内钙释放的变构抑制剂。ITPR1活化的变构抑制以前被认为依赖于CA8与ITPR1的结合(Hirota J等人，《生物化学杂志(Biochem J)》372,435-441)。与CA8形成明显对比的是，CA10和Car10在IP-western中不结合ITPR1。令人惊讶的是，尽管缺乏与ITPR1的结合，但CA10/Car10和CA8-204抑制ITPR1活化(pITPR1)和ATP诱导的细胞内钙释放，并且在体内产生深度镇痛。
在各个方面，表达载体包括编码CA8片段的核酸序列。核酸序列包括CA8(或Car8)编码序列的前三个外显子(或由其组成)。任选地，编码CA8片段的核酸序列是CA8-204，其序列提供在本文图10中。在一些实施例中，CA8片段是CA8-204C，其核酸序列在SEQ ID NO:32中列出(氨基酸序列在SEQ ID NO:30中列出)。在一些实施例中，CA片段是CA8-204G，其核酸序列在SEQ ID NO:33中列出(氨基酸序列在SEQ ID NO:31中列出)。在一些实施例中，CA-8片段是CA8-202(SEQ ID NO:34)或CA-203(SEQ ID NO:35)。在各个方面，表达载体包括与本文所描述的CA8-204核酸序列具有至少90％同一性(例如，至少95％或100％同一性)的核酸序列。如本文所用，“至少90％同一性”和类似术语涵盖例如，90％到100％的任何整数，如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％等。包括外显子1-3的CA8片段的核酸序列提供为SEQ ID NO:1。包括外显子1-5的CA8片段的核酸序列提供为SEQ ID NO:35。包括外显子1-8的CA8片段的核酸序列提供为SEQ ID NO:34。CA11的核苷酸和氨基酸序列提供为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11。本文所描述的序列中的任一个的表达产物表现出至少一种碳酸酐酶活性，如镇痛或ITPR1活化的拮抗剂(pITPR1)和ITPR1介导的细胞内钙释放。
关于CA8、CA10和CA11的材料和方法的描述也适用于小鼠(蛋白质的版本、Car8、Car10和Car11，设想了其用于本公开的各个方面)。
表达载体
“载体”或“表达载体”是包括用于导入到宿主细胞中的核酸(DNA或RNA)的任何类型的遗传构建体。在各种实施例中，表达载体是病毒载体，即包括全部或部分病毒基因组的病毒颗粒，其可以用作核酸递送媒剂。包括编码目标基因产物的一个或多个外源核酸的病毒载体也被称为重组病毒载体。如本领域将理解的，在一些上下文中，术语“病毒载体”(和类似术语)可以用来指代没有病毒衣壳的载体基因组。在本公开的上下文中使用的病毒载体包含，例如，逆转录病毒载体、基于单纯性疱疹病毒(HSV)的载体、基于细小病毒的载体，例如，基于腺相关病毒(AAV)的载体、AAV腺病毒嵌合载体和基于腺病毒的载体。可以使用在例如Sambrook等人，《分子克隆实验手册(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)》，第2版，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，冷泉港，纽约(1989)；Ausubel等人，《分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》，格林出版协会(GreenePublishing Associates)与约翰威立国际出版公司(John Wiley&Sons)，纽约，纽约(1994)；Coen D.M，《病毒学中动物病毒的分子遗传学(Molecular Genetics of AnimalViruses in Virology)》，第2版，B.N.Fields(编辑)，雷文出版社(Raven Press)，纽约(1990)和其中引用的参考文献中所描述的标准重组DNA技术来制备这些病毒载体中的任一种。另外，可以使用来自人类和其它宿主物种的大基因组编码序列制备病毒载体，所述大基因组编码序列包含包含5'和3'调控序列的完整基因，并且使用Gateway克隆(Hartley等人，《基因组研究(Genome Res)》2000,10:1788-1795)和/或“重组工程”系统(Copeland等人，《遗传学自然评论(Nat Rev Genet)》2001,2:769-779)，应用目标基因组区域的同源重组介导的克隆和操纵。
在各种实施例中，开发了随机或半随机文库，其中提供了编码不同的羧基酸酐酶肽的前体的DNA。此类文库可以含有数百个或更多个不同的序列。在各个方面，数千个或更多(至少1000个或至少10,000个)不同的表达盒构成文库，所述不同的表达盒在编码羧基酸酐酶肽的前体的DNA序列中不同。此类文库可以通过首先产生编码具有一种或多种所需特性的肽的前体(例如，类似于CA8、CA10或CA11的羧基酸酐酶肽的前体)的随机或半随机寡核苷酸群来构建。然后可以将此寡核苷酸群克隆到盒主链中(即，在前蛋白原信号序列和任选的生物标志物的帧中)。
用于构建随机或半随机文库的方法的实例采用GATEWAYTM系统(英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚，卡尔斯巴德)。在GATEWAYTM系统中，ccdB用作阴性选择标记，如果细菌细胞存在，则ccdB会杀死细菌细胞。ccdB通过由经过修饰的λ整合酶进行的位点特异性重组被随机或半随机序列取代。在GATEWAYTM技术中使用了两种细菌菌株，ccdB敏感和ccdB抗性。含有ccdB的质粒在抗ccdB的细菌中传播并且纯化。然后将这种质粒用于体外重组。将重组产物转化为ccdB敏感细菌，选择在体外重组期间ccdB基因被目标基因取代的质粒。通过取代ccdB，极大地减少或消除了克隆和文库构建的背景，从而允许基因随意穿梭进出或穿梭于各种质粒中。作为起点，基础质粒在对ccdB的毒性效应具有抗性的细菌中生长，其中可用的基因型数量非常有限。为了在本公开的上下文中采用GATEWAYTM技术，使用大型病毒载体系统，希望将适于转化为大DNA的细菌菌株(如BAC)修饰为表达对ccdB不敏感的基因。优选的菌株衍生自BAC传播和操作中使用的DH10B细菌菌株，所述细菌菌株也具有增加其被非常大的DNA转化的倾向的突变(fhuA：：IS2)。
在一些实施例中，病毒载体是基于HSV的载体。HSV是有包膜的二十面体双链DNA病毒，其感染包含人类的哺乳动物。野生型HSV在终末分化的非分裂细胞和分裂细胞两者中感染并且复制。HSV载体的优点是病毒能够进入潜伏期阶段，导致长期的DNA表达。另外，HSV优先地感染感觉神经，通常会逃避免疫监视，不会在CNS/PNS中传播，并且表现出优越的逆行转运能力(例如，皮内、关节内或周围神经)。另外，HSV允许使用Gateway和/或重组工程技术进行大的基因组插入。HSV的序列可见于ncbi.nlm.nih.gov：80/entrez/query.fcgi？cmd＝Retrieve&db＝nucleotide&list_uid-s＝9629378&dopt＝GenBank&term＝hsv-1&qty＝1。
任选地，HSV载体是复制缺陷型，例如，使复制或包装必需的至少一种HSV基因变得无功能(突变或缺失)。例如，复制缺陷型HSV载体可能缺乏HSV基因组的早期区域、即刻早期区域或晚期区域的一种或多种基因功能。在各个方面，HSV载体是“多重缺陷型”的，意味着病毒复制所必需的一个以上的基因功能已经被破坏。例如，多重缺陷型载体可能缺乏来自HSV基因组的早期区域、即刻早期区域和晚期区域中的两个或更多个的基因功能。HSV载体任选地缺乏选自由ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47和其任何组合组成的组的功能性即刻早期基因，例如，缺乏功能性ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47基因(任选地通过缺失使变得无功能)。也可以从如HSV载体等病毒载体中去除非必需基因，以容纳大块外源DNA。例如，HSV载体可以基本上缺乏整个HSV基因组。在这方面，载体优选地包括病毒反向末端重复序列(ITR)和/或包装信号，尽管在本公开的所有方面并不需要这些组分。任选地，一个或多个启动子或病毒ITR和包装信号保持完整(即，HSV扩增子)。
编码CA10(或Car10)或CA11(或Car11)的核苷酸任选地取代已经被去除的天然病毒遗传序列(任选地致使载体复制缺陷)。编码CA8(或Car8)或CA8片段(或Car8片段)的核苷酸任选地取代已经被去除的天然病毒遗传序列(例如，致使载体复制缺陷)。
当通过使多个基因组片段缺失而造成复制缺陷时，HSV载体任选地包含间隔元件，以在补体细胞系中提供病毒生长，类似于通过单复制缺陷型HSV载体实现的所述病毒生长。间隔元件可以含有任何具有所需长度并且编码所需镇痛碳酸酐酶分子的核酸序列或序列。间隔元件序列相对于HSV基因组可以是编码或非编码的，并且可以是天然或非天然的，但是不能将一个或多个复制基本功能恢复到缺陷区域。另外，在任何或所有缺陷HSV区域中包含间隔元件将降低HSV载体对于大型插入的容量。
在各种实施例中，HSV载体是复制缺陷型HSV(rdHSV)载体，其对于所有IE基因功能上缺失。去除另外的IE基因的优势包含但不限于降低神经元和其它细胞类型中的毒性。代表性载体主链的结构包括插入在例如潜伏期(LAT)基因座中的两个选定位点的转基因盒，其被固有的绝缘体/染色质边界元件(CTRL或CTCF)保护免受表观遗传学沉默。这些元件与HSV LAP2启动子一起提供长期的表达。将异位绝缘体与插入到病毒UL50-UL51基因间区域的转基因盒相邻放置也增强了原代人细胞中来自此基因座的已经延长的转基因表达。仅作为合适的载体系统的实例，已经使用表达ICP4/ICP27/Cre的U2OS细胞系表明了达到高滴度的HSV载体传播，所述细胞系通过Cre重组消除了载体构建体中存在的抑制性BAC序列。
应当了解，HSV载体的不同区域的缺失可以改变宿主的免疫应答。具体地，不同区域的缺失可以减少由HSV载体产生的炎症应答。更进一步，可以修饰HSV载体的蛋白质衣壳，从而降低HSV载体被针对野生型蛋白质衣壳的中和抗体识别的能力或无能力。
基础载体、补体细胞和工程技术可以产生用于长期表达CA10(或Car10)、CA11(或Car11)、CA8(或Car8)和/或CA8片段(或Car8片段)的安全载体，用于促进来自Gateway转移质粒内的下列启动子的镇痛作用：感觉神经元特异性Nav1.8(例如，钠通道)；神经元特异性Nav1.7(例如，钠通道)；高亲和力神经生长因子受体(TrkA)；体感特异性advillin CA8驱动子；以及非特异性构成性CMV启动子。如四环素响应性启动子等诱导型启动子序列也适用于本公开的上下文。使用HSV载体递送人类治疗学的优势包含独特的组织特异性、缺乏免疫应答以及即使在免疫功能低下的宿主中也缺乏潜在的再活化。
在各个方面，HSV载体包括HSV潜伏期相关的转录物(LAT)绝缘体。
基于HSV的载体在例如以下专利中有进一步描述：美国专利第5,837,532号；第5,846,782号；第5,849,572号；和第5,804,413号；以及国际专利公开第WO 91/02788号、第WO96/04394号、第WO 98/15637号和第WO 99/06583号，所述参考文献通过引用整体并入本文。
在本公开的上下文中使用的HSV载体的实例含有经过扩增的ICP4或ICP27缺失，并且优选地两者的缺失。“经过扩增的”缺失是指相对于用于HSV载体产生的补体细胞系，HSV载体在这些基因座中的一个或两个基因座处不含有同源序列。理想地，病毒没有残留的ICP4或ICP27(或两者)编码或启动子序列。优选地，ICP27中的缺失也延伸到UL55基因座，并且理想地两个基因都缺失。因此，在本公开的上下文中使用的病毒含有ICP4、ICP27和UL 55中的经过延伸的缺失，使得与补体细胞系中使用的这些基因没有病毒同源性。理想地，载体进一步不包含任何与补体细胞系中采用的同源的DNA序列(例如，甚至使用不同的调节序列和聚腺苷酸化序列)。
将理解，在本公开的上下文中，可以使用除基于HSV的载体之外的载体。例如，腺病毒、腺相关病毒(AAV)和逆转录病毒载体适用于本公开的方法和组合物。此类载体的构建是本领域普通技术人员已知的(参见，例如，美国专利第4,797,368号、第5,691,176号、第5,693,531号、第5,880,102号、第6,210,393号、第6,268,213号、第6,303,362号和第7,045,344号)。非病毒方法也可以用于基因递送，并且包含但不限于质粒的基因枪应用(例如，编码本文所描述的一种或多种羧基酸酐酶的前体的非病毒表达载体)。基因递送的另一种非病毒方法是电穿孔。可替代地，可植入的细胞系可以被工程化以产生所需的肽(或文库)。
在各个方面，病毒载体是AAV载体。AAV是一种未知的引起人类疾病的DNA病毒，使其成为理想的基因治疗选择。AAV基因组由两个基因，rep和cap构成，两侧是反向末端重复序列(ITR)，其中含有用于DNA复制和病毒包装的识别信号。AAV需要与辅助病毒(即腺病毒或疱疹性病毒)共同感染，或表达辅助基因，以实现高效复制。尽管这不是必需的，但用于施用治疗性核酸的AAV载体的大部分亲本基因组通常缺失，使得仅保留ITR。如果需要，递送AAV rep蛋白能够将包括AAV ITR的AAV载体整合到基因组的特定区域中。包括经过整合的AAV基因组的宿主细胞在细胞生长或形态上没有变化。因此，来自AAV载体的治疗因子的经过延长的表达可以用于治疗持续性和慢性疾病。AAV载体任选地基于AAV 1型、AAV 2型、AAV3型(包含3A型和3B型)、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型或AAV 11型。AAV的基因组序列，以及ITR、Rep蛋白和衣壳亚基的序列是本领域已知的。参见，例如，国际专利公开第WO 00/28061号、第WO 99/61601号、第WO98/11244号；以及美国专利第6,156,303号，Srivistava等人(1983)《病毒学杂志(J Virol.)》45:555；Chiorini等人(1998)《病毒学杂志(J Virol.)》71:6823；Xiao等人(1999)《病毒学杂志(J Virol.)》73:3994；Shade等人(1986)《病毒学杂志(J Virol.)》58:921；以及Gao等人(2002)《美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)》99:11854。
表达载体通常含有可操作地连接的编码序列的转录和翻译所需要的多种核酸序列。例如，表达载体可以包括复制起始点、聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)、启动子、增强子等。本公开的载体优选地包括可操作地连接到CA10(或Car10)或CA11(或Car11)编码序列的启动子。在各个方面，本公开的载体优选地包括可操作地连接到CA8(或Car8)或CA8片段(或Car8片段)编码序列的启动子。“可操作地连接”意味着如启动子等控制序列相对于另一个核酸序列处于正确的位置和朝向，以发挥其对核酸序列的作用(例如，转录的启动)。启动子对于其可操作地连接的核酸序列可以是天然或非天然的，并且对于特定靶细胞类型可以是天然或非天然的，并且在各个方面，启动子可以是构成性启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子(例如，包括Tet开/关元件的启动子系统、RU486诱导型启动子、蜕皮激素诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子或金属硫蛋白启动子)。例如，在各个实施例中，使用诱导型启动子系统，所述系统允许使用小分子来诱导或停止镇痛肽产生的产生。启动子的实例包含但不限于感觉神经元特异性启动子(如Nav1.8启动子)、体感特异性启动子(如advillin启动子)、p175启动子或TrkA(神经生长因子受体)启动子。其它启动子包含但不限于TrkB、TrkC、Nav1.7、CGRP、ASIC3、NPY、NK1、5HT、GRIN3A或NF200启动子。如图21A-30，本文提供了各种启动子的序列的非限制性实例。
任选地，修饰病毒表皮或衣壳(即，颗粒表面)以调节病毒的向性。例如，可以将一种血清型病毒的基因组包装到不同的血清型病毒的衣壳中，以例如逃避免疫应答。可替代地(或另外地)，可以修饰衣壳的组分，以例如扩增由所得载体转导的细胞的类型，避免(全部或部分)不需要的细胞类型的转导，或提高所需的细胞类型的转导效率。例如，通常通过参考对照(即未经修饰的、匹配的病毒载体)来确定转导效率。转导效率的提高可以导致，例如，给定细胞类型的转导率至少约25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、100％的提高。如果需要，可以修饰衣壳，使得其不能有效地转导非靶组织，如肝或生殖细胞(例如，所需的一种或多种靶组织转导水平的50％或更低、30％或更低、20％或更低、10％或更低、5％或更低)。
疼痛
“疼痛”通常是依据持续时间、原因和/或身体的患部来描述的。本发明包含任何类型的疼痛的治疗，所述疼痛包含神经性疼痛(例如，由体感神经系统的病变或疾病引发或引起的疼痛)、炎性疼痛(例如，由炎性介质对伤害性疼痛途径的活化和/或敏化引起的疼痛)和/或伤害性疼痛(例如，由组织损害或损伤引起的疼痛)。许多疼痛病症或事件不容易分类，并且可能引起与这些一般类别重叠的方面或特性。疼痛也被关于体内位置分类。躯体疼痛是由身体表面或肌肉骨骼组织中的疼痛受体活化引起的，而内脏器官会感觉到内脏疼痛，并且通常是由胸部、骨盆或腹部中的疼痛受体活化引起的。
神经性疼痛发生在真正的神经损伤时。初级传入体感神经表示外围的感觉神经，并且与脊髓背角的二阶神经元通信。二阶体感神经将脊髓连接到脑干和三阶神经元。创伤(例如，损伤、外科手术、中毒暴露、癌症和/或代谢性或传染性疾病)均可能损害体感途径，并且引起自发性疼痛。神经性疼痛可以表现为烧灼感、麻刺感、枪击感或刺痛感，或与更严重的感觉相关联，包含刺伤、刺穿、划破或钻进。这种类型的疼痛通常发生在频率和强度波中，并且通常扩散到身体的部分或全部。神经性疼痛病状的实例包含但不限于脊髓损伤介导的疼痛、中枢性疼痛综合征(例如，由神经系统内的病变引起的)、由神经卡压综合征(例如，腕管综合征、肘管综合征或跗管综合征)引起的与周围神经损伤相关的疼痛、多发性硬化、纤维肌痛、带状疱疹、病毒相关神经病、疼痛性创伤性单神经病、多发性神经病、糖尿病性神经病、外科手术后疼痛综合征(例如，乳房切除术后综合征、胸廓切开术后综合征、幻肢痛)和复杂的区域性疼痛综合症(例如，反射交感性营养不良和灼痛)。神经性疼痛的原因很多，并且包含例如化学物质暴露(例如，化学疗法)、创伤(例如，截肢、椎间盘突出或脊髓损伤)、辐射暴露、代谢性疾病、感染和癌症。
伤害性疼痛是由身体组织损伤引起的，并且通常被描述为锐痛、酸痛或搏动性疼痛。这种类型的疼痛可能是良性病变引起的，或可能是由在癌症部位附近的其它身体部位增殖并且聚集的肿瘤或癌细胞引起的。伤害性疼痛也可能是由癌症扩散到骨骼、肌肉或关节，或器官或血管的阻塞引起的。伤害性疼痛可以与炎症相关，所述炎症包含例如，关节炎疼痛(如类风湿性关节炎或骨关节炎)和炎症诱导的内脏疼痛(例如，与炎性肠疾、肠易激综合征IBS等相关的疼痛)。伤害性疼痛的实例包含例如，来自扭伤、骨折、灼伤、肿块、瘀伤、炎症(例如，由感染、创伤或关节炎病症引起的炎症)或梗阻以及肌筋膜疼痛(其可以指示异常的肌肉或肌腱应力)的疼痛。癌症疼痛可以是伤害性的或神经性的。
在各个方面，方法包含对例如长期持续性疼痛、慢性疼痛、爆发性疼痛、亚急性疼痛、急性疼痛和癌症疼痛的治疗。急性疼痛通常是对离散身体损害(例如，炎症、外科手术、骨折、头痛、扭伤、劳损、灼伤或化学物质暴露)的有限的生理反应。急性疼痛通常持续三到六个月的持续时间。慢性疼痛持续的时间比从离散身体损害治愈的预期时间长，例如，超过三个月。慢性疼痛与如背部疼痛、创伤(例如，外科手术或伤口)引起的神经损伤(包含脊髓损伤)、肌筋膜疼痛、关节炎、癌症相关的疼痛、神经性疼痛和纤维肌痛等病症相关。在一些实施例中，疼痛涉及慢加急疼痛，其中急性疼痛闪光叠加在持续性慢性疼痛上。
使用任何合适的方法确定治疗(即减轻、释放、抑制或缓解)或预防有需要的受试者的疼痛的疗效。在动物模型中，使用例如缩尾测试、甩尾测试、蜂毒测试、辣椒素测试或夹尾测试来测量镇痛效果。动物疼痛模型在本领域中是充分表征的，并且在例如，Lariviere等人，《疼痛(Pain)》97(2002)75-86中进行了描述。在人类中，使用例如疼痛评分、重新用药时间和生活质量测量来监测或确定(或有需要的)治疗的疗效。在临床环境中使用了若干种工具来建立疼痛强度的数值等级(参见例如，McCaffery等人(1989)，《疼痛：临床护理实践手册(Pain:Clinical manual for nursing practice)》，Mosby St.Louis,MO)或口头等级量表，其将疼痛分类为轻度、中度或重度。受试者的疼痛评级(强度、频率)降低、恢复活动的能力、睡眠能力增强以及对止痛药的需求减少，均表明了镇痛作用。
本公开提供了治疗有需要的受试者的疼痛的方法。“治疗”疼痛并不要求100％消除受试者的疼痛。疼痛感觉或症状的任何减轻均构成对受试者有益的生物效应。在各个方面，方法降低了疼痛的严重程度(其可以包含减少对通常用于这些病状的其它药物和/或疗法的需要和/或量(例如，暴露于所述药物和/或疗法))、持续时间和/或频率。“预防”疼痛并不要求完全排除疼痛感觉；设想了疼痛或相关症状的发作的任何抑制或延迟。就这点而言，任选地，在疼痛发作之前，向受试者预防性地施用表达载体。
本公开的各个实施例允许疼痛传递体感神经的靶向(例如，Nav1.7；Nav1.8；Nav1.9；Trk-A；5HT；等)以安全地产生镇痛作用。在一些方面，方法最小化或避免了不需要的脱靶效应，如与其它胃肠外(抗NGF)或离子通道抑制剂相关的理想的体感和/或运动功能的无区别损失。任选地，表达载体包含在病毒衣壳(例如，病毒颗粒)中，并且能够长期表达CA10和CA11(或CA8)，使当前长期管理所需的重复侵入性干预的需要最小化。
本公开进一步提供了包括编码碳酸酐酶10或碳酸酐酶11(或碳酸酐酶8)的核酸序列的表达载体在治疗或预防有需要的受试者的疼痛中的用途；包括编码碳酸酐酶10或碳酸酐酶11(或碳酸酐酶8)的核酸序列的表达载体在制备用于治疗或预防有需要的受试者的疼痛的药物中的用途；以及包括编码碳酸酐酶10或碳酸酐酶11(或碳酸酐酶8)的核酸序列的表达载体在用于治疗或预防有需要的受试者的疼痛中的用途。
镇痛药筛选
本公开进一步提供了包括编码一种或多种候选镇痛肽的多个基因转移载体的原种。原种可以具有任何所需的载体滴度，通常在病毒载体的环境中以噬菌斑形成单位(pfu)测量。通常，原种将介于约105pfu/ml到约108pfu/ml。在一些实施例中，原种是同质的。在一些实施例中，编码一种或多种候选镇痛肽(或其前体)的DNA序列在原种内的载体之间有所不同。在各个实施例中，原种内的载体中编码一个或多个候选镇痛肽(或其前体)的相应的DNA序列定义了随机或半随机的肽文库。任选地，DNA序列编码羧基酸酐酶肽的前体。
本公开提供了用于检测具有所需的镇痛特性的肽的方法。在适合于表达经过编码的肽的条件下，将本文所描述的表达载体群引入到宿主细胞群中(例如，作为NBL细胞或HEK293细胞)。然后，对一种或多种宿主细胞进行测定，以获得代表所需镇痛特性的所需效果。如果需要，与阳性和/或阴性对照剂相比，对一个或多个宿主细胞进行测定，如本文中针对Car8/CA8所述的那些。对照剂可以是已知能沉淀所需效果的试剂(阳性对照)或已知未表现出所需效果的试剂(阴性对照)。任选地，方法进一步包括推导编码表明所需镇痛特性的肽的DNA序列。
一种或多种宿主细胞可以在体内或体外。对于体外应用，测定任选地在多孔板(例如，96孔板)中进行，这可以促进对所需药效学和/或镇痛效果的高通量筛选。对于此类应用，任选地将来自文库的表达载体以每孔少于1个载体的经过计算的滴度(通常约每孔0.5个载体)引入到孔中，以将多于一种载体将转染或感染细胞的统计可能性最小化。在一些实施例中，表达载体是病毒载体，而在其它实施例中，表达载体是质粒或噬菌体。然而，在质粒或噬菌体(例如，BAC)包含病毒基因组的情况下，孔内的细胞将产生病毒颗粒。可替代地，可以使用含有病毒基因组(其包括相应的DNA序列和启动子)的BAC系统来转化大量细胞，并且挽救病毒颗粒。然后可以将所得病毒颗粒用于测定中。例如，如果将含有携带随机或半随机文库的HSV主链的约10,000个BAC引入到6孔培养皿中的宿主细胞中，则约24小时后，通常可以收获约100,000个病毒颗粒。可以将这些病毒颗粒用于测定中。理想地，应使用约30,000个病毒颗粒(约为原始载体数量的三倍)以增加文库的所有成员被测定的可能性。待测定的所需效果可以是任何可合适地测量的效果，如细胞凋亡、ITPR1活化和钙释放的拮抗作用或这种细胞信号传导途径的其它方面等。实例中提供了示例性测定和方法，其不应被解释为限制性的。
在一些实施例中，一种或多种宿主细胞是体内的(即动物模型)，当待测定的所需效果本质上是行为性时，其是特别合适的。例如，镇痛效果可以包含由例如外部刺激或医学状况导致的痛觉过敏或异常性疼痛的减轻。在此类实施例中，可以将文库克隆地扩增成载体的多个随机原种(所述原种中的每一个基本上是同源的)，并且将相应的原种引入到疼痛的动物模型中。然后，可以对来自那些减轻动物的疼痛反应的原种的载体DNA进行测序，以鉴定经过编码的镇痛肽。
调配物、施用方案
在各个方面，在包括生理学上可接受的(即，药理学上可接受的)载剂、缓冲液、赋形剂或稀释剂的组合物(例如，药物组合物)中提供表达载体。在本公开的上下文中，可以使用任何合适的生理学上可接受的(例如药学上可接受的)载剂，并且此类载剂是本领域众所周知的。载剂的选择将部分地由施用组合物的特定部位和用于施用组合物的特定方法来确定。组合物还可以包括促进表达载体被宿主细胞吸收的试剂。合适的组合物调配物包含水性和非水性溶液、可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂的等渗无菌溶液和使调配物与血液等渗的溶质以及可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。调配物可以存在于单位剂量或多剂量密封容器中，如安瓿和小瓶，并且可以在立即使用之前仅需要添加无菌液体载剂，例如水的冷冻干燥(冻干)条件下储存。一方面，将包括编码CA8-、CA8片段-、CA10-、或CA11-的表达载体的组合物与提供有关组合物使用说明的包装材料一起放置于容器内。通常，此类说明包含描述试剂浓度的有形表达，以及在某些实施例中，重组组合物可能需要的赋形剂成分或稀释剂(例如，水、盐水或PBS)的相对量。
在各个实施例中，将表达载体掺入到脂质囊泡中(其任选地增强吸收)或以纳米颗粒的形式提供(例如，通过掺入蛋白质、脂质、碳水化合物或其组合)。可以利用物理轰击来增强细胞对载体的吸收。任选地，表达载体被提供有基于化学物质的转导增强子。转导增强子的实例包含阳离子脂质体技术，其中带正电荷的DNA与阴离子脂质和中性脂质结合来构建阳离子脂质体以增强吸收。多聚物表示用于表达单元的化学物质递送复合物的另一种形式。通常，多聚物由阳离子聚合物组成，并且基于离子相互作用和自组装来制造。另一个实例，阳离子脂质体与细胞膜相互作用，以增强通过内吞作用的吸收。为了提高转染效率，添加了电中性脂质，如DOPE，以增强向细胞质中的释放，并且避免溶酶体降解。在另一个实施例中，聚合物囊泡用作脂质体的替代物。聚合物囊泡是脂质体的合成版本(具有脂质双层的囊泡)，往往比脂质体更稳定、机械强度更高，并且具有更长的储存寿命。核内体溶解剂包含失活的腺病毒，其促进纳米颗粒从吸收期间产生的细胞内小泡中逃逸。
由于它们的低毒性、更大的承载能力并且易于制造，聚阳离子纳米颗粒是有利的实施例。聚乙烯亚胺和壳聚糖是适合表达载体递送的聚合物载剂。其它聚阳离子载剂包含聚(β-氨基酯)和聚氨基磷酸酯。树状聚合物是具有圆形形状的高度支化的大分子，可用于帮助表达单元的细胞靶向。
一个实施例包含阳离子树状聚合物的使用。这些分子自然地吸引带负电荷的遗传物质，如DNA或RNA，并且这种复合物通过内吞作用被带入到靶细胞中。最近，已经使用动力学驱动的化学生产树状聚合物，所述动力学驱动的化学降低了成本并且缩短了处理时间。“Priostar”树状聚合物可以携带包含DNA或RNA的多种表达单元，并且以高效率有效地转染靶细胞，而几乎没有或没有毒性。
无机纳米颗粒，如金、二氧化硅、氧化铁和磷酸钙表示另一种将核酸递送到靶细胞的化学手段。无机纳米颗粒的益处包含稳定的延长储存、低成本制造、最小的免疫原性以及对微生物侵袭的抗性。如果需要，纳米大小的无机颗粒(例如，小于500nm、优选地小于250nm并且最优选地小于100nm)表示用于增强转导的另一种选择。纳米颗粒可以有效地捕获DNA或RNA，并且允许从核内体逃逸而不被降解。
细胞穿透肽，也称为肽转导结构域(PTD)，是短肽(<40个氨基酸)，其有效地穿过细胞膜，同时与各个表达单元共价或非共价结合，以促进其进入到细胞中。可以通过结合定位肽序列来构建PTD，以将外源核酸释放到特定的细胞器中。
将表达单元递送到靶细胞的一些众所周知的物理方法包含使用电穿孔、声孔效应(超声频率使膜空化，使其对表达单元进入更具渗透性)、磁转染(表达单元与磁性颗粒复合，用磁体增强进入到靶细胞中)以及流体动力学方法。
在各个实施例中，将表达载体掺入到表示感染性病毒颗粒(包含衣壳、单链或双链DNA、RNA或能够编码一个或多个必需的肽的其它核酸)的病毒衣壳(病毒颗粒)中，这可以有利于支持潜伏性感染和稳定的长期镇痛肽生产。肽表达可能是细胞内的，并且以产生镇痛作用或抗痛觉过敏的方式影响神经元兴奋性和功能。
表达载体(例如，病毒颗粒)以足以向受试者提供一些改善或益处的量和位置施用，即减轻或抑制受试者的疼痛感觉或知觉。根据情况，将包括表达载体的组合物施加到或滴入到体腔中、直接施加到靶组织和/或引入到循环中。例如，在各个情况下，期望通过静脉内、腹膜内、口腔内；管腔内(例如，膀胱、胆囊、胆管、胰管或窦)；肌肉内、眼内、经角膜、动脉内、门内、病灶内、皮内、关节内、神经细胞内、神经节内、神经节周围、真皮内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、吸入(例如，上和/或下呼吸道)、肠内、阴道或直肠手段递送包括表达载体的组合物。在各个方面，向胰管直接施用表达载体，其可用于例如治疗与胰腺癌或胰腺炎相关的疼痛。在各个方面，向三叉神经节施用表达载体。如果需要，通过动脉内或静脉内施用局部地施用表达载体以喂饲目标区域。在各个方面，向周围体感神经直接或间接施用本文所描述的表达载体。在一个实施例中，施用的途径涉及对背根神经节、其它神经节或体感神经元或脊髓的直接施用(例如，注射或输注)。任选地，通过关节内注射或周围神经(例如，坐骨神经)注射来施用表达载体。在各个方面，通过关节内插入施用表达载体，以通过例如，使供应受影响的关节炎关节的体感神经安定来治疗慢性伤害性疼痛。在其它实施例中，通过微导管或使用内窥镜直接显像，向各个腔、导管、窦或器官施用表达载体。其它实施例包含使用针来促进表达载体局部化到疼痛区域。例如，本公开设想使用导管或针，向疼痛出现的位点(例如，器官或其它身体位点，如关节)施用表达载体。仍其它实施例包含使用成像来引导表达载体的沉积，例如使用荧光透视法、超声波、CT或MRI。另外的实施例包含调配物的使用，其通过避免在胃或上胃肠道中降解，促进表达载体通过皮内途径递送到肠道。
在各个方面，肠溶包囊可以用于预防胃酸降解和表达载体失活。调配物可以包含掺入由使用Eudragit L30D-55开发的肠溶颗粒构成的胶囊，作为包裹表达载体的肠溶聚合物。胶囊调配物的优化可以通过具有Eudragit L30D-55的最佳保护涂层来实现，所述涂层在酸性培养基中孵育两小时并且在pH 6.8的缓冲液中分解一小时后，表明了最大的可行载体数量。胶囊中Eudragit L30D-55的量与抗胃酸相关。当从由载体、玉米淀粉、乳糖一水合物、聚乙烯吡咯烷酮构成的颗粒制备胶囊并用12.5％(m/V)的Eudragit L30D-55包衣时，观察到对人造胃液的保护性。其它包衣可以用于在明胶胶囊和
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上提供市售聚合物
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L100-55的肠溶保护特性。仍其它肠溶包衣包含，例如，
Figure BDA0002409045690000283
(Lonza)肠溶包衣胶囊，所述胶囊掺入了能够有效延迟释放、保护胃和保护具有轻度到中度酸敏感性的化合物的聚合物共混物；以及掺入了胶囊技术的enTRinsic药物递送技术，所述技术被描述为向高度酸敏感的小分子和大分子提供肠溶保护的聚合物共混物。
通过向其它剂型添加肠溶聚合物系统，也可以获得向不稳定载体提供胃抗性的仍其它实施例。片剂、迷你片剂、小丸和颗粒剂(通常装在胶囊壳中)是最常见的肠溶包衣剂型，其利用了别处提到的聚合物。
在各个方面，将表达载体注射到周围神经(例如，坐骨神经、股神经、眶下神经、三叉神经、面部神经或肩胛上神经)或通过神经节内注射。在其它实施例中，表达单元可以是环状的并且对核酸酶破坏具有抗性的裸露的单链或双链DNA表达单元。在其它实施例中，可以将载体掺入到脂质囊泡中以更好地吸收。仍其它实施例包含单链或双链DNA表达单元，其作为纳米颗粒掺入到蛋白质、脂质、碳水化合物分子或这些的组合中。仍其它实施例包含进入到靶细胞中的物理方法。示例性实施例包含使用化学方法以增强进入到靶细胞中的表达载体的吸收。其它实施例利用物理、化学和生物方法的组合来增强靶细胞对表达载体的吸收。
可替代地，通过植入膜、海绵或组合物已经被吸收或封装在其上的另一种合适的材料，局部施用组合物。在使用植入装置的情况下，一方面，装置被植入到合适的组织中，并且表达载体的递送例如，通过扩散、定时释放大剂量或连续施用来进行。
针对特定受试者的特定施用方案将部分地取决于所施用的治疗剂的量、施用途径以及任何副作用的原因和程度。根据本公开的施用于受试者(例如，哺乳动物，如人)的量应该足以在合理的时间范围内影响所需的反应。在治疗或预防受试者的疼痛的方法的各个实施例中，以诱导镇痛的量施用编码CA8(或Car8)、CA8(或Car8)片段(包含CA8-204、CA8-204C、CA8-204G、CA8-202和CA8-203)、CA10(或Car10)或CA11(或Car11)的表达载体。换句话说，所施用的组合物的剂量足以减轻、释放、抑制或缓解疼痛。基因组当量滴度的病毒颗粒的示例性剂量为104-1015个转导单位(例如，107-1012个转导单位)或至少约105个、106个、107个、108个、109个、1010个、1011个、1012个、1013个、1014个或1015个转导单位或更多个(例如，至少约107个、108个、109个、1010个、1011个、1012个、1013个或1014个转导单位，如约1010个或1012个转导单位)。一些病状需要延长治疗，随着时间的推移可能需要多次施用，或可能不需要。基因组当量中载体的当量剂量为104-1015，其可以在表达单元方面使用定量PCR(qPCR)在体外进行定量(其中表达单元是能够产生本文所描述的一种肽的离散遗传单元)。在各个方面，剂量包括107-1012个表达单元或至少约104个、105个、106个、107个、108个、109个、1010个、1011个、1012个、1013个、1014个或1015个表达单元或更多个(例如，至少约107个、108个、109个、1010个、1011个、1012个、1013个或1014个表达单元，如约1010个或1012个表达单元)。
适当时，将包括编码CA8、CA8片段(包含CA8-204、CA8-204C、CA8-204G、CA8-202和CA8-203)、CA10或CA11(或其小鼠版本)的核酸的表达载体与其它物质(例如，治疗剂)和/或其它治疗方式结合施用，以实现另外的(或增强的)生物效应。这方面包含表达载体和一种或多种另外地合适的试剂的同时施用(即，基本上同时施用)和非同时施用(即，在不同时间，以任何顺序施用，无论是否重叠)。应当理解，在某些方面，不同组分以相同或单独的组合物以及通过相同或不同的施用途径施用。
根据本公开的另外的方面，提供了根据本发明的任何其它方面的用途或方法，其中将CA8、CA8片段(包含CA8-204、CA8-204C、CA8-204G、CA8-202和CA8-203)、CA10或CA11载体与一种或多种可用于疼痛管理的试剂单独地、顺序地或结合同时施用。另外的试剂的实例包含但不限于阿片类镇痛药(例如，吗啡(morphine)、氢吗啡酮(hydromorphone)、羟吗啡酮(oxymorphone)、芬太尼(fentanyl)、可待因(codeine)、二氢可待因(dihydrocodeine)、羟考酮(oxycodone)或氢可酮(hydrocodone))；非甾体类抗炎药(NSAID)(例如，阿司匹林(aspirin)、双氯芬酸(diclofenac)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、奥沙普嗪(oxaprozin)或环氧合酶2(COX-2)抑制剂)；镇静剂(例如，巴比妥类镇静剂)；肌肉松弛剂；抗忧郁药；抗惊厥药(例如，卡马西平(carbamazepine)或丙戊酸钠(carbamazepine))；另外的麻醉剂；以及皮质类固醇(例如，地塞米松(dexamethasone))。
通过参考以下实例，将更容易地理解如此总体上描述的本发明，所述实例仅作为说明提供，并且不旨在限制本发明。
实例
实例1
这种实例表明了碳酸酐酶8(CA8人类基因符号、Car8啮齿类动物直系同源物)；碳酸酐酶10(CA10人类基因符号；Car10啮齿类动物直系同源物)和碳酸酐酶11(CA11人类基因符号；Car11啮齿类动物直系同源物)，调节ITPR1细胞溶质游离钙信号传导途径。ITPR被认为转导由代谢型受体活化而产生的信号，所述信号产生1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)信号传导分子以及从ITPR中释放的细胞内钙，其在炎性疼痛行为中起重要作用。Zhuang等人，《公共科学图书馆·综合(PloS one)》2015。本文首次描述的数据示出CA8/Car8、CA8/Car8片段(包含CA8-204)；CA10/Car10和CA11/Car11用于通过抑制细胞内钙的释放来抑制IPPR1钙释放通道的IP3活化、细胞内钙释放，并且令人惊讶地抑制对治疗性镇痛药(例如，吗啡和可乐定(clonidine))的镇痛反应，然而，这些CA肽产生深度的镇痛作用并且治疗或预防模型中的慢性神经性疼痛。同样令人惊讶地，CA8/Car8片段(包含CA8-204)和CA10/Car10不结合ITPR1(如通过共免疫沉淀表明的)。然而，与CA8(Car8)肽形成明显对比的是，响应于佛司可林和ATP刺激的细胞内钙释放，CA8/Car8片段(包含CA8-204)和CA10/Car10肽的细胞内过表达抑制ITPR1的活化(磷酸化)。
另外，本文提供的数据首次表明，CA8的过表达选择性地抑制神经生长因子(NGF)，所述神经生长因子几乎完全通过ITPR1在NBL细胞中发出信号，如几乎完整的2-APB所示。CA8还抑制NGF诱导的ITPR1活化(pITPR1)，细胞内钙释放。令人惊讶地，本文还表明了CA8(Car8)DRG过表达预防和治疗脊髓神经(SNL)根损伤后的慢性神经性疼痛。以下实例建立DRG CA8(Car8)和CA10(Car10)的转导以及CA8(Car8)和CA10(Car10)蛋白的过表达下调ITPR1活化(例如，Ser-1755处的pITPR1)并且抑制细胞内钙释放。令人惊讶地，尽管CA8与CA10(Car10)蛋白之间缺乏氨基酸同源性，但在坐骨神经注射后，它们还产生了深度的镇痛作用，预防慢性炎性和神经性疼痛模型(脊神经结扎(SNL))中的机械性异常性疼痛和热痛觉过敏。
吗啡通过触发细胞内钙的释放产生镇痛作用。本文提供的数据表明CA过表达抑制NBL细胞中吗啡诱导的ITPR1介导的钙释放。具体地，这些数据示出DRG Car水平与半最大吗啡和可乐定的镇痛反应有关。较高的Car表达与较高的吗啡和可乐定半最大镇痛剂量相关(Levitt等人，2017)。这些数据首次表明，CA可以诱导镇痛耐受性，将可乐定和吗啡的剂量反应向右转移(例如，需要更高剂量的镇痛药才能产生相同量的镇痛反应)，并且这些效果与细胞内钙释放的抑制有关。这是出乎意料的，因为吗啡需要释放细胞内钙以产生镇痛反应。因此，令人惊讶的是，CA通过抑制阿片样物质和可乐定镇痛反应所需的钙调节途径，产生了深度的镇痛作用，而不是产生伤害性疼痛。
材料和方法
动物：所有实验和程序均根据清醒动物的实验性疼痛研究者当前指南进行，并且得到迈阿密大学动物管理委员会(Animal Care and Use Committee of the Universityof Miami)的批准。从杰克逊实验室(Jackson Laboratories)(缅因州，巴尔港)获得体重为20-35克的雄性成年C57BL/6小鼠，并且将其供养在可随意取食和饮水的家庭笼舍环境中。将动物在湿度和温度受控的无病毒/无抗原设施中，以12-12h的光暗循环进行饲养。外科手术前允许动物适应环境7天，并且在测试前熟悉实验设备。
病毒构建体的产生：作为实例，描述了产生表达小鼠或人V5-Car10或V5-CA10蛋白的腺相关载体的方法。Car10(小鼠)和CA10(人)cDNA购自ATCC。这些基因产物通过Eppendorf Recycler梯度(型号5331)进行扩增，并且使用正向引物：TTTGGATCCGCCACCATGGCT-GACCTGAGCTTCATTG和反向引物：TTTCTCGAGCTGAAAGGCCGCTCGGA-TG，在pcDNA3.1/V5-HisA(英杰生命技术公司(InvitrogenTM Life Technologies)，加利福尼亚州，卡尔斯巴德)的BamHI与XhoI(NEB)限制性位点之间进行克隆。然后从pcDNA3.1/V5-His A扩增V5-Car10或V5-CA10构建体，并且使用正向引物：CTCGGATCCGCCACCATGGC和反向引物：CTCGGATCCGCCA-CCATGGC，在pAAV-MCS载体的BamHI与BglII限制性位点之间进行克隆，所述pAAV-MCS载体是AAV无辅助系统(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)，加利福尼亚州，圣克拉拉)的一种组分。
产生了重组的AAV8-V5-Car10和AAV8-V5-CA10病毒颗粒。简而言之，使用磷酸钙沉淀方法，将载体质粒和包装质粒AAV8 733(5)和pHelper(安捷伦科技公司，加利福尼亚州，圣克拉拉)以70％融合度共转染到HEK293细胞中。将细胞在37℃和5％CO2下孵育48小时。48小时后，将细胞收集并且冻融三次，以从细胞中释放AAV颗粒。在
Figure BDA0002409045690000331
核酸酶(Sigma)处理30分钟后，通过低速离心澄清粗裂解物。将上清液在OptiSealTM管(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))中以不连续的碘克沙醇步骤梯度装载，并且在70Ti型转子(贝克曼库尔特公司)中以69,000rpm(350,000g)在18℃下离心1小时。收集含有AAV颗粒的流分，并且使用AKTA FPLC系统(通用电气医疗集团(GE Healthcare))通过在5ml HiTrap柱(通用电气医疗集团)上的柱色谱法进一步纯化。使用洗脱缓冲液(20mM Tris、215mM NaCl、pH 8.0)从柱上洗脱约25mL，并且将AAV颗粒浓缩，并且使用Amicon Ultra-15 50K浓缩器(密理博(Millipore))在HBSS(英杰生命技术公司)中将缓冲液交换为200μl。然后，使用qPCR方法滴定经过纯化的AAV颗粒的基因组含量(表达单元)。获得的滴度范围为每mL 1-3×1014个GC(基因组拷贝)。
细胞培养和转染：可以使用人神经元衍生的(例如，NBL)、人非神经元衍生的(例如，HEK293)细胞或分散的啮齿类动物原代DRG细胞。将HEK293细胞(cat#CRL-1573美国菌种保藏中心(ATCC)弗吉尼亚州，马纳萨斯)培养在补充有10％胎牛血清FBS(cat#16140赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher science)，马萨诸塞州，沃尔瑟姆)和1％青霉素(penicillin)/链霉素(streptomycin)(cat#15140赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州，沃尔瑟姆)的经过Dulbecco改性的Eagle培养基(DMEM-谷氨酰胺cat#0566；英杰生命技术公司)中。将细胞以每孔1.0×105个细胞的密度接种在六孔培养板中。第二天，通过脂质体LTX试剂和plus(cat#15338赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州，沃尔瑟姆)用质粒转染细胞。对于每次转染，均使用2μg AAV2-ITR(对照)、AAV2-V5-Car10或AAV2-V5-CA10载体。在本文所描述的本公开的各个实施例中，在AAV2不是病毒载体的情况下，使用2μg表达载体(包含阳性和阴性对照)。
表达载体(腺相关的AAV8-V5-Car10和AAV8-V5-CA10载体)的坐骨神经注射：通过腹膜内注射氯胺酮(Ketamine)、甲苯噻嗪(xylazine)和乙酰丙嗪混合物(acepromazinecocktail)(VEDCO，密苏里州，圣约瑟夫)麻醉小鼠。坐骨神经暴露后，使用35号Nanofil针(世界精密仪器公司(World Precision Instruments)，佛罗里达州，萨拉索塔)，将约1.5μl的AAV8-null病毒颗粒(1.36E13个病毒颗粒，SL100832美国思科生物有限公司(SignaGenLaboratories)马里兰州，罗克维尔市)、AAV8-V5-Car10和AAV8-V5-CA10(分别为1.06E14个病毒颗粒和1.66E14个病毒颗粒)注射到坐骨神经中。坐骨神经注射位点距第三趾尖约45mm。
炎性痛觉过敏模型：在无菌的0.9％生理盐水中，小鼠接受30μl皮内注射1％角叉菜胶(cat#22049希玛科技(Sigma)，密苏里州，圣路易斯)2.5mg/ml，或在无菌的0.9％生理盐水中，接受完全的弗氏佐剂CFA(cat#F5881希玛科技，密苏里州，圣路易斯)0.5mg/ml注射到左后爪中。Fehrenbacher等人，《药理学当前协议(Curr Protoc Pharmacol)》2012；第5章：第54单元。
神经性疼痛模型：为了诱导周围神经病，首先通过腹膜内注射氯胺酮、盐酸赛拉嗪(xylazine hydrochloride)和乙酰丙嗪(acepromazine)(VEDCO，密苏里州，圣约瑟夫)麻醉小鼠。然后，使用先前描述的程序进行紧密的脊神经结扎(在小鼠模型中左L5)。Kim等人，《疼痛(Pain)》1992；50(3):355-363。
行为测试：热敏感性和机械敏感性分别通过哈格里夫测试和冯弗雷灯丝阈值计算来测量。参见，例如，Boyce-Rustay等人，《分子生物学方法(Methods Mol Biol)》2010；617:41-55；Hargreaves等人，《疼痛(Pain)》1988；32(1):77-88；以及Chaplan等人《神经科学方法杂志(J Neurosci Methods.)》1994；53(1):55-63。测试是在有类似日光照射的安静室内进行的。在不知情的研究者收集数据之前，动物对行为室和设备已经习惯了至少60分钟，持续1周。使用IITC足底镇痛仪设备(IITC生命科学仪器公司(IITC Life sciences)，加利福尼亚州，伍德兰希尔斯)，将塑料盒放在恒温(30℃)的玻璃板上进行热敏感性测试。将小鼠足底表面暴露于辐射热束中，以诱导缩爪。基线潜伏期调整为5-9秒，最长20秒为截止时间，以防止潜在伤害。从强光束开始到缩爪的以秒为单位的潜伏时间定义为缩爪潜伏期。将两个连续的测试平均以建立缩爪潜伏期。机械敏感性测试是在置于高架网格地板上的倒置塑料盒中进行的。用垂直于每个后爪的足底表面呈对数递增刚度的一系列冯弗雷灯丝(Stoelting公司，伊利诺伊州，伍德代尔)中的一个挤压小鼠后爪，持续1-2秒，使用上下方法确定50％的阈值。
药效学–钙释放的生物测定：将十五mm玻璃盖玻片(cat#72228电子显微科技公司(Electron Microscopy Sciences)，宾夕法尼亚州，哈特菲尔德)涂上多聚赖氨酸(希玛科技)，其次涂上层粘连蛋白，并且在每个盖玻片上接种1×105个细胞。二十四小时后，如先前所描述的，用AAV2-ITR、AAV2-V5-Car10或AAV2-V5-CA10载体转染细胞。在不使用AAV2的实施例中，使用其它表达载体(包含病毒载体)。将Fura-2AM(cat#F1221，赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州，沃尔瑟姆)作为储备溶液溶解于DMSO(50μg/50μl)和1％普朗尼克酸-127(cat#P2443，希玛科技，密苏里州，圣路易斯)中。接种后四十八小时，细胞在室温黑暗条件下，在标准Ca+2缓冲溶液中装载2μM Fura-2AM染料，持续45分钟，所述缓冲溶液含有：125mMNaCl、2mM MgCl、4.5mM Kcl、10葡萄糖、20mM HEPES、2mM CaCl2、pH 7.4.25。染料装载后，用Ca+2缓冲溶液洗涤盖玻片。对于成像和ATP刺激实验，将盖玻片放在Leica DMI6000B显微镜上的记录室(cat#QR-42LP华纳仪器(Warner Instruments)，康涅狄格州，哈姆登)中，并且在室温(～22℃)下用不含Ca+2的缓冲液灌注，所述缓冲液含有：125mM NaCl、4mM MgCl、4.5mM Kcl、10mM葡萄糖、20mM HEPES、pH 7.4。对于Fura-2AM的比率成像，激发光通过超高速波长切换器进行过滤，以提供340nm和384nm的波长，并且由高速数码相机(LeicaDFC365FX)捕获。ITPR1通道的活化是通过应用1μM ATP(希玛科技，密苏里州，圣路易斯)实现的。使用LAXS软件进行数据采集和处理。选择视场上方的目标区域，并且测量每个帧的平均像素强度。将数据绘制为荧光强度与时间的比率，并且随后转换为相对比例。
免疫沉淀：将五十μl磁珠(英杰生命技术公司)与1μg pITPR1抗体在4℃下一起孵育45分钟。弃去上清液，并且用结合缓冲液洗涤珠粒。加入200-400μg的样品蛋白，并且与珠粒一起在4℃下孵育4小时。然后，用洗涤缓冲液洗涤蛋白质复合物3次，并且然后用SDS样品缓冲液洗脱。然后，将样品在70℃下加热10分钟，并且然后对其进行Car10蛋白质印迹分析。本文所描述的方法也适合与Car8、CA8、CA8片段(CA8-204)、CA10、Car11和CA11结合使用。
免疫组织化学(IHC)：将HEK293细胞以每个盖玻片的密度接种在多聚-L-赖氨酸/层粘连蛋白涂覆的玻璃盖玻片中，24小时后，分别用Car10、CA10或空载体转染细胞。将细胞在37℃下再培养96小时，然后用1μM佛司可林(F6886，希玛科技，密苏里州，圣路易斯)处理5分钟，然后用4％多聚甲醛固定15分钟，并且用0.1％Triton X-100透化10分钟，并且用1％牛血清白蛋白(BSA，希玛科技)封闭1小时。然后将细胞与抗pITPR1(cat#8548s细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technology))、抗Car10(cat#SAB1102286希玛科技，密苏里州，圣路易斯)、抗V5(cat#R960英杰生命技术公司)、抗ITPR1(cat#8568细胞信号传导技术公司)抗体在4℃下一起孵育过夜。第二天，将细胞与对应的第二抗体(1:200)在室温黑暗中一起孵育1小时。干燥盖玻片，并且使用含有Dapi(cat#P36931生命技术公司(LifeTechnologies))的荧光封片剂，将其粘附在载玻片上。应当理解，还设想了使用抗Car8、抗CA8、抗CA8片段(CA8-204)、抗CA10、抗Car11和抗CA11抗体的IHC方法。
统计分析：数据表示为均值±均值标准误差(SEM)，并且通过学生t测试对两组比较进行统计学意义分析，使用Bonferroni事后测试的单向ANOVA对具有一个方差的多组比较(三组或更多组)进行分析，以及使用Bonferroni事后测试的双向ANOVA对具有两个方差的多组比较(三组或更多组)进行分析。所有数据分析和图形均使用GraphPadPrism 5.0软件(GraphPad软件公司(GraphPad Inc)，加利福尼亚州，圣地亚哥)进行。
药效学：病毒构建体的电生理影响的生物测定–体外神经元兴奋性降低的验证：在室温(20-25℃)下的电流钳、膜片钳技术的穿孔全细胞配置中研究神经元和其它经过转染的细胞。通过两性霉素B获得穿孔，以确保令人满意的电流钳记录，同时在每个待研究的细胞群中保持完整的细胞溶质钙浓度和相关的细胞溶质信号传导设备。如前所述，拉动并且抛光贴片微量移液器(电阻3-6M)。Sarantopoulos C等人，《神经科学方法杂志(J NeurosciMethods.)》2004；139(1):61-8；Sarantopoulos C等人，《区域麻醉与疼痛医学(Reg AnesthPain Med)》2002；27(1):47-57；Kawano T等人，《分子疼痛(Mol Pain)》2009；5:12；Sarantopoulos CD等人，《大脑研究(Brain Res)》2007；1132(1):84-99；Hogan QH等人，《疼痛(Pain)》2000；86(1-2):43-53。对于记录，使用了Multiclamp 700B放大器(Axon仪器(Axon Instruments)，美国加利福尼亚州，福斯特)，并且使用转换器(DigiData 1440A；Axon仪器)将信号数字化。使用pCLAMP软件(Axon仪器)进行分析。如前所述，使用细胞外台氏液和内部移液器溶液进行全细胞电流钳记录。将兴奋性参数在通过表达参数分类的细胞组之间进行比较。取决于病毒载体，使用了通过表达模式(例如，TrkA或Nav1.8阳性和阴性)、大小(大DRG体感神经元和小DRG体感神经元)和兴奋性而异的来自细胞群的记录。在组之间比较以下参数：(1)在基线处记录至少3分钟的静息膜电位(RMP)和自发电活动(自发动作电位(AP)峰值数量/分钟)。在稳定记录建立至少1分钟后，确定用于进一步比较的RMP。具有比指示较大的泄漏电流的-45mV更去极化的静息电位的神经元被拒绝。(2)响应由电流注入引起的超阈值刺激而诱发AP。电流阈值由连续的25pA步增量确定，直到触发单态AP为止，并且每个阈值将被记录。然后，通过单个2ms的超阈值电流脉冲引发AP，并且在持续500ms的后续记录中捕获(以测量AP和超极化后(AHP)参数两者)。(3)测量并且在组之间比较AP的特性，包含RMP、峰值AP振幅、AP阈值和处于阈值时的AP持续时间以及处于5％和50％振幅时的AP持续时间。在去极化阶段的急剧上升开始时测量AP阈值。AP也是通过从这种AP阈值画出的水平历时线的点到下行的、复极化阶段与这条线相交的点进行测量的。从RMP到AP峰值测量AP振幅。从RMP到AP峰值的5％电压，以及从RMP到峰值的50％电压的中点确定AP持续时间。AP幅值也表示为曲线下的面积。从RMP到AHP阶段的最超极化水平测量AHP振幅。在表示50％和90％恢复到RMP的点上测量AHP持续时间。AHP幅值也表示为曲线下的面积。使用了细胞兴奋性的其它两种措施，所述措施包含：基电流(其被确定为引发AP的一系列逐步增加的去极化200ms脉冲中的最小电流振幅)和在至少是基电流的两倍的电流注入步骤期间AP尖峰产生的模式，此时细胞产生单个AP，或重复性地激发。
HSV TrkA启动子和Nav1.8启动子驱动稳健的长期报道表达：病毒只能通过体内逆行转运到达DRG细胞体。由于这些病毒是rdHSV，因此其无法感染附近的胶质细胞或其它未投射到局部注射位点的DRG细胞。30+天后，在啮齿类动物中，从LAT基因座和ICP4基因座两者均观察到强表达。ICP4基因座随时间增加，这就是为什么选择其作为表达盒(TrkAp-CA、Nav1.8p-CA、Advillinp-CA等)的位点的原因。例如，如果未表明在神经元中有足够的表达，或者如果表达随时间下降，则可以将表达盒重新放置在LAT基因座中。
药代动力学：剂量反应和组织特异性–体内结构和功能验证：镇痛和运动功能测试包含机械性疼痛(冯弗雷)、热疼痛(Hargreaves)以及非自反性感觉和运动功能的测量(使用自动化测量进行的主动轮行驶：轮距/时间，轮时间；和步幅)。每种测定条件下使用十八只幼稚的雄性C57BL/6J小鼠。每隔一天监测镇痛反应的初始时间过程，直到D14为止，并且然后每周监测一次，直到D28(生命终点)为止。在基线处并且每周对每只小鼠进行临床安全性评估(例如，体重、大体外观、食物消耗、血压、体温)。使用qPCR(区域)和免疫组织化学(IHC)(细胞亚型)，在皮肤、周围神经、DRG和背角(DH)的这些初步研究中对限制性神经元表达进行评估。
评估施用途径：在各个方面，通过直接坐骨神经和股神经(SFN)或关节内(IA)注射来施用表达载体。将使用这些途径获得的生物反应与使用皮内施用获得的反应进行比较。直接坐骨神经注射通过腰椎DRG的转导实现深度的镇痛。可通过直接IA注射获得主要关节的感觉神经支配。通过这种方法实现DRG的转导，其可以让临床专家迅速采用、易于获得，并且对所有受疾病影响的皮节具有潜在地足够的病毒感染性。尽管对于一些主要关节(例如，通过膝关节神经阻滞的膝关节、通过肩胛上神经阻滞的肩膀)，使用射频消融的直接周围神经阻滞作为使用传统技术的替代性方法是容易实现的；周围神经阻滞不能用于缓解其它关节疼痛(例如，颞下颌关节、髋关节、踝关节、肘关节、腕关节等)。目前，治疗颞下颌关节疾病(TMJ)疼痛的选择非常有限。本文所描述的表达载体的关节内注射表示用于控制症状的转化疗法。
所有措施均由个体蒙面接受治疗。将动物随机分组。测定大约在一天中的同一时间进行。进行常规临床安全性评估(例如，体重、大体外观、食物消耗、脉冲、血压、体温)。最高可达到的剂量(PFU)用于SFN和IA注射以及一系列稀释(高达一万倍)，以优化所有表达载体的后续参数。使用十八只幼稚的雄性C57BL/6J小鼠。每隔一天监测镇痛反应，直到D14为止，并且此后每周监测一次，直到D28(生命终止)为止(镇痛，对机械和热诱发的反应的抗痛觉过敏；自动化的主动行驶轮(轮距/时间，轮时间，轮速度；步幅)。另外，在基线处并且每周对每只小鼠进行临床安全性评估(例如，体重、大体外观、食物消耗、血压、体温)。使用QPCR(区域)和IHC(具有双重染色的细胞亚型)对周围神经、DRG和DH中限制性神经元表达进行评估。直接DRG转导也可以使用经椎间孔硬膜外注射来实现。
药效学：镇痛和抗痛觉过敏的生物测定：使用慢性炎性模型和慢性神经性疼痛模型两者。这些研究包含对CFA(在疼痛之前注射的表达载体)的保护(预防)试验，以及对SNL和OA的保护和治疗试验(在神经损伤发生后注射表达载体并且随时间推移进行评估)。直接坐骨神经注射预防和治疗SNL模型中的慢性神经性疼痛(参见图7)。可以在两个模型中进行初步的短期和长期安全性相关机制研究和脱靶毒性。所有措施均记录为蒙面接受治疗的个体。将动物随机分组。测定将大约在一天中的同一时间进行。将评估临床病理、大体检查、器官重量和组织病理学；并且使用DRG、脊髓、CSF和血液测量CA8、CA8-204、CA10、CA11、ITPR1、pITPR1。检查了DRG神经元和神经胶质细胞凋亡。除了疗效评估外，还进行了临床安全性评估(例如，体重、大体外观、食物消耗、血压、体温)。基于响应的时间过程，在可行的情况下使用“治疗”设计。直接神经“阻滞”方法潜在地适用于多种疼痛病症，包含慢性头痛、三叉神经痛和其它颅面疼痛病症。如果需要，基于特定的模型和潜在的临床应用来更改途径。例如，IA途径与TMJD特别相关。由于这项技术在小鼠中具有挑战性，因此可以使用膝关节OA模型作为替代品，因为这不仅可行，也是慢性流行的临床病状。像TMJD一样的晚期OA可以引起静止时的疼痛(即自发性疼痛或神经性疼痛)，所述疼痛通常对非甾体类抗炎药(NSAID)具有抗性，并且因此表征为神经性疼痛和伤害性疼痛两者。OA的公认的碘乙酸单钠(MIA)关节内注射模型在这方面是有用的，所述模型由于关节骨溶解、软骨侵蚀以及小鼠的触觉和热超敏反应引起负重不对称。先前显示这种模型产生自发性疼痛，双氯芬酸、TRPV1和TRPA1拮抗剂无法缓解，但是关节内利多卡因可以完全缓解。介导Nav1.8特异性LALA(Nav是利多卡因和其它短效局部麻醉剂的靶标)的表达载体的IA注射将在这种模型中有效。
启动子：可用于本文所描述的研究的上下文中的启动子序列包含但不限于：TrkB、TrkC、Nav1.9、其它Nav基因启动子、NMDA启动子、advillin、CGRP、5HT、NK1、ASIC3、NPY或驱动包含CA8、CA8片段(如CA8-204)、CA10、CA11的CA表达序列的表达的NF200和包含Car8、Car10和Car11的非人类直系同源物。
结果
V5-Car10和V5-CA10蛋白过表达在体外抑制佛司可林诱导的pITPR1：本文所描述的结果表明，例如，使用药效学生物测定来检查Car10对通过磷酸化(pITPR1)调节ITPR1活化的作用，所述磷酸化增强了ITPR1对IP3配体的响应。使用过表达Car10和CA10的AAV8-V5载体、空载体和充当对照的媒剂转染HEK293细胞。为了在外源与内源CA10/Car10表达之间进行区分，将V5序列插入到Car10或CA10 C末端区域。蛋白质印迹分析表明，佛司可林以剂量依赖性方式增加pITPR1水平(图1A)。使用V5标签，在V5-Car10和V5-CA10载体转染后检测到蛋白质过表达(图1B)。Car10和CA10的过表达降低了HEK293细胞中佛司可林诱导的ITPR1磷酸化，而空载体则没有改变ITPR1的磷酸化(图1C)。
使用IHC，在用空载体(AAV-null)转染后，在HEK293细胞中观察到响应1μM佛司可林的pITPR1增加，但是在用V5-Car10和V5-CA10转染后，pITPR1没有增加。这些数据表明，Car10和CA10足以抑制HEK293细胞中Ser-1755处的调节结构域磷酸化，这对ITPR1活化和IP3诱导的钙释放至关重要。
V5-Car10和V5-CA10的过表达抑制体外ATP诱导的游离钙释放：ITPR1含有功能上独特的结构域，包含对如钙、钙调蛋白、ATP和碳酸酐酶8(Car8)等细胞内调节剂作出反应的‘调节’结构域。在存在活化浓度的IP3和钙的情况下，ATP通过增加通道的开放概率来增加ITPR1依赖性钙释放。据信，Car8介导的ITPR1活化抑制和ATP介导的钙释放需要结合这种调节结构域。因此，检查了CA8片段(例如，CA8-204)、Car10和CA10与ITPR1和pITPR1结合的能力。在进行HEK293细胞的佛司可林刺激之前和之后，将每种蛋白质与带有ITPR1和pITPR1的V5标签抗体进行共免疫沉淀。蛋白质印迹显示CA8-204、Car10和CA10不与ITPR1结合。令人惊讶地，在评估ITPR1活化(例如，pITPR1)的功能性生物测定中，这些蛋白质的共免疫沉淀显示所有这些非结合蛋白均抑制ITPR1活化，显示pITPR1的减少。
为了进一步检查FLAG-CA8-204(数据未显示)、V5-Car10和V5-CA10过表达是否可以抑制ATP诱导的钙释放，如果测量了这些构建体以及在基线和对ATP刺激的反应中实时细胞内钙浓度，则HEK293细胞被每个细胞感染(图2)。ATP以剂量依赖性方式刺激钙释放，并且增加细胞溶质游离钙水平。与HEK293细胞中的基线相比，AAV-null转染后的细胞质游离钙水平响应于1μM ATP增加。相比之下，在用AAV-FLAG-CA8-204、AAV-V5-Car10和AAV-V5-CA10转染后，并且与基线和AAV-V5-CA8相比，游离钙浓度响应于1μM ATP没有变化。这些数据表明，CA8-204、Car10和CA10可以抑制ITPR1活化，并且由此降低这些细胞中ATP刺激的细胞质游离钙水平。
Car10和CA10坐骨神经基因疗法产生镇痛作用，并且抑制炎性疼痛行为：与注射后第15天的对照相比，在C57BL/6小鼠坐骨神经注射后，AAV8-V5-Car10和AAV8-V5-CA10两者均产生镇痛作用(热潜伏期从基线增加)。在第16天(热测试后)进行的角叉菜胶的足底内注射在第17天和第18天在生理盐水和AAV8-null对照组中产生了急性热超敏反应。然而，在第16天注射角叉菜胶后，AAV8-V5-Car10和AAV8-V5-CA10两者均未显示超敏反应(热潜伏期低于基线)。第18天后，镇痛在AAV8-V5-Car10和AAV8-V5-CA10两组中均复发，并且一直保持到第27天。在对照组中未观察到类似的发现。参见图3。
类似地，与在完全弗氏佐剂(CFA)慢性炎性疼痛小鼠模型中病毒注射后第15天的对照相比，在C57BL/6小鼠坐骨神经注射后，AAV8-V5-Car10和AAV8-V5-CA10两者均产生镇痛作用(热潜伏期从基线增加)。在第16天(热测试后)进行的CFA的足底内注射在第17-19天在所有组中产生了急性热超敏反应。AAV8-V5-Car10和AAV8-V5-CA10两组似乎都在第24天恢复，表明镇痛作用持续到第34天，类似于在注射CFA前第16天观察到的。参见图4。
Car10基因疗法产生镇痛作用，并且抑制神经性疼痛行为：使用Chung小鼠模型，检查了本公开的病毒载体的施用在预防神经性疼痛中的效果。Chaplan等人《神经科学方法杂志(J Neurosci Methods)》1994；53(1):55-63。尽管在第19天进行了脊神经结扎，但AAV8-V5-Car10在第12天到第22天仍在机械缩爪阈值上产生了镇痛反应。任何其它组的缩爪阈值中没有类似的增加(图5)。
讨论
本文所描述的数据首次表明(1)在体外，CA8片段(CA8-204)、CA10和Car10蛋白的过表达抑制响应于佛司可林的Ser-1755处ITPR1的调节结构域磷酸化；(2)CA8片段(CA8-204)、CA10和Car10的过表达在体外抑制ATP刺激的细胞内钙释放；(3)以及通过将坐骨神经注射到C57BL/6J小鼠中，将AAV8-V5-CA10和AAV8-V5-Car10的基因转移到伤害感受器产生深度的镇痛作用，并且使用炎性和神经性疼痛模型来预防抗痛觉过敏。这些发现首次建立了CA8片段(CA8-204)、CA10和Car10调节ITPR1细胞溶质游离钙信号传导途径，这对伤害感受和疼痛至关重要。
CA10可能参与包含调节软骨细胞的其它功能。CA10表达的丧失可能潜在地通过ITPR1细胞溶质游离钙信号传导途径的失调而导致成软骨细胞瘤的形成。因此，成软骨细胞瘤的治疗可以通过使用病毒载体过表达CA10、CA8或CA8片段来实现。
骨关节炎(OA)表征为软骨降解。Akkiraju等人，《发育生物学杂志(J Dev Biol)》2015；3(4):177-192。有趣的是，最近在韩国人群中，拷贝数变异(CNV)与OA易感性之间的全基因组关联也表明了OA与CA10之间的强关联。Moon等人，《BMC肌肉骨骼失调(BMCMusculoskelet Disord)》2015；16:76。更进一步，Mori等人描述了CA8和CA10中单核苷酸多态性与日本女性骨质疏松症相关的脊柱和股骨矿物质密度(BMD)之间的遗传关联。Mori等人，《骨矿物质代谢杂志(J Bone Miner Metab)》2009；27(2):213-216。这些研究者认为，CA8和CA10基因座处的遗传性变型可能是这些女性以及其它潜在女性骨质疏松症的重要决定因素。如果这些关系在更广泛的人群中成立，则测试CA8和CA10基因座处的功能性变异是否与OA疾病的严重程度、疼痛和残疾相关联将是合理的。此外，似乎有必要测试ITPR1细胞溶质游离钙信号传导途径的作用以及CA8、CA10和CA11中的功能性变异是否可能在破骨细胞和软骨细胞调节中不同地影响ITPR1介导的钙释放，并且由此不同地影响骨质疏松症和骨关节炎。
最后，精神健康病症经常伴有慢性疼痛。三核苷酸重复扩增与脆性X综合征、亨廷顿氏疾病、强直性营养不良和脊髓小脑共济失调的遗传性相关。Akkiraju等人，《发育生物学杂志(J Dev Biol)》2015；3(4):177-192。另外，不稳定的重复也与精神分裂症和躁郁症有关。Vincent等人，《精神病遗传学(Psychiatr Genet)》2016；26(4):156-165。随后的研究显示，精神疾病的许多信号均来自染色体13q21.33、17q21.33-q22和18q21.2上有大重复的三个区域。17q三核苷酸扩增位于CA10基因的内含子内。Vincent等人，同上；Ikeuchi等人，《基因组学(Genomics)》1998；49(2):321-326。鉴于本文所描述的CA10的新的潜在作用，值得重新探讨由包含这种不稳定的三核苷酸重复和骨关节炎、骨质疏松症、慢性疼痛病状等CA10功能性变异导致的功能丧失与使用本文所述的组合物和方法治疗这些病症的CA10过表达在这些受影响的个体中的用途之间的关系。
总之，这种实例表明PK/PD生物测定和动物模型的效用以及编码CA8、CA8片段(CA8-204)片段和CA10的病毒载体的施用途径以治疗疼痛。具体地，这些数据证实了本文所述的材料和方法产生镇痛作用，并且抑制炎性和神经性疼痛两者。
实例2
以下实例表明，在临床相关动物模型角叉菜胶炎性疼痛模型中，施用编码本文所描述的CA8片段的腺相关病毒载体(AAV8-FLAG-CA8204C(CA8204C))和AAV8-FLAG-CA8204G(CA8204G)产生镇痛抗痛觉过敏。
pAAV-flag-CA8-204G(ALT G)和pAAV-flag-CA8-204C(ALT C)的构建。含有引物的SalI和KpnI位点被设计用于在SNP rs6471859处构建带有“G”或“C”的全长交替剪接变体(CA8-204)。右侧显示了pAAV-MCS表达构建体(右侧是载体图)。参见图39。
在基线时以及在施用病毒载体(坐骨神经注射(SN))和/或角叉菜胶注射(左爪)后的不同天，测量缩爪热潜伏期。施用后七天，与施用AAV8-V5-CA8 WT(CA8 WT；阳性对照)和AAV8-V5-CA8 MT(CA8突变体；阴性对照)的小鼠相比，接受SN注射AAV8-FLAG-CA8204C(CA8204C)或AAV8-FLAG-CA8204G(CA8204G)(1.5μl，1×1013个基因组拷贝/ml)的小鼠(每组n＝8只小鼠)的缩爪潜伏期增加。在病毒载体施用后第15天，接受角叉菜胶注射后，CA8 MT(阴性对照)组的小鼠在第16天到第18天显示的缩爪明显减少，表明无法从由角叉菜胶诱导的炎性疼痛中恢复过来。然而，CA8 WT、CA8204G和CA8204C组两者中的小鼠均表现出增加的缩爪潜伏期，表明CA8 WT、CA8204G和CA8204C提供了抗痛觉过敏保护(N＝8，****P<0.0001***P<0.001，双向Anova统计组测试GraphPad)。参见图31和32。
实例3
这种实例表明了CA10结合RYR和pRYR，如通过共免疫沉淀所表明的。使用脂质体(LTX)用AAV-V5-CA10和AAV-V5-Car10转染NBL细胞。转染后48小时提取细胞蛋白。
免疫沉淀(IP)和蛋白质印迹(WB)用于检测结合。兔抗RYR1用于IP，并且鸡抗V5用于WB分析。约1/10的IP蛋白用于WB，以通过WB示出V5标记的CA10或Car10。B-肌动蛋白用作装载对照。参见建立了CA10和RYR的共免疫沉淀的图33。用CA10和ITPR1获得了类似的结果。
这些数据首次表明，CA10还可能通过与RYR1和RYR3结合来调节RYR依赖性钙释放。
实例4
这种实例表明了V5-CA10蛋白的过表达在体外抑制佛司可林诱导的pITPR1。
为了检查CA10在增强ITPR1对IP3配体的反应的ITPR1磷酸化(pITPR1)调节中的作用，用AAV8-V5-CA10载体转染HEK293细胞。用空载体或应用媒剂的转染充当对照。为了在组织或细胞系中的天然蛋白的外源与内源表达之间进行区分，将V5序列插入CA10的C末端区域。用DAPI或pITPR1对细胞进行核染色并且合并。
使用V5标签，使用蛋白质印迹分析在AAV-V5-CA10(和鼠V5-Car10编码载体)转染后观察到蛋白质过表达(图34A)。CA10和Car10的过表达降低了HEK293细胞中佛司可林诱导的ITPR1磷酸化，而空载体则没有改变pITPR1水平(图34B)。这些实验表明CA10(和鼠Car10)在体外NBL细胞中的过表达抑制了响应于佛司可林的Ser-1755处ITPR1的调节结构域磷酸化。
实例5
以下实例表明，响应于疼痛介质，CA10过表达抑制ITPR1和RYR介导的钙释放。令人惊讶地，本文所描述的研究表明，在NBL细胞中，5HT-介导的RYR依赖性钙释放几乎完全被利阿诺定抑制。此外，观察到V5-CA10在NBL细胞中的过表达也抑制5HT介导的钙释放。因此，NBL细胞中5HT介导的信号传导似乎主要通过RYR。
接下来，确定V5-Car10和V5-CA10在HEK293细胞中的过表达抑制了ATP诱导的细胞质钙释放。Fura2钙成像数据表明，当与空载体对照相比时，Car10和CA10蛋白过表达抑制HEK293细胞中ITPR1介导的细胞质钙释放到1μM ATP(P<0.001)。(N＝4个盖玻片和每个样品总共200个细胞**P<0.01，***P<0.001，采用双向ANOVA，然后进行Bonferroni测试。)参见图35。
还确定了利阿诺定抑制了NBL细胞中5HT诱导的RYR依赖性钙释放。Fura2钙成像数据表明，当与媒剂对照相比时，50μM 5HT诱导的NBL细胞中的细胞质钙释放被利阿诺定以剂量依赖性方式显著抑制(P<0.001)。(N＝4个盖玻片和每个样品总共200个细胞**P<0.01，***P<0.001，采用双向ANOVA，然后进行Bonferroni测试)。参见图36。
这些发现表明，CA10调节ITPR1细胞溶质游离钙信号传导路径，这对伤害感受和疼痛行为至关重要。另外，数据显示5HT刺激几乎完全被利阿诺定抑制的钙释放，这表明血清素通过RYR而不是ITPR1。
接下来，确定V5-Car10和V5-CA10在NBL细胞中的过表达抑制了50μM 5HT诱导的细胞质钙释放。参见图37。Fura2钙成像数据表明，当与媒剂对照相比时，10nM利阿诺定几乎完全抑制了NBL细胞中50μM 5HT诱导的细胞质钙释放(P<0.001)。另外，当与空载体对照相比时，V5-Car10和V5-CA10蛋白在NBL细胞中的过表达也抑制了5HT诱导的NBL细胞中的细胞质钙释放(P<0.001)。(N＝4个盖玻片和每个样品总共200个细胞**P<0.01，***P<0.001，采用双向ANOVA，然后进行Bonferroni测试)。
实例6
pCMV-N-flag-CA8-204G和pCMV N-flag-CA8-204C的构建。含有引物的SalI和KpnI位点被设计用于将在rs6471859SNP处带有“G”的全长替代变体(CA8-204)构建到pCMV-N-flag载体(克隆科技公司(Clontech))中。使用定点诱变(英杰公司)构建pCMV-N-flag-CA8-204C，产生以在rs647859处带有“C”等位基因的外显子3结尾的新片段。参见图38。
CA8-204G抑制HEK293细胞中的钙释放(Ca2+Fura2成像)。用pCMV-N-flag-CA8-204G(1,695bp)、pCMV-N-flag-CA8-204C、AAV2-V5-CA8WT(阳性对照)或空载体(阴性对照)转染HEK293细胞。(n＝6，每个实验中盖玻片的数量，实验次数＝3，P值<0.001，三组之间的比较通过Tukey的多重比较测试(GraphPad棱镜软件(GraphPad Prism Software))进行。参见图40。
HEK293和NBL细胞中CA8 ALT(G)和CA8 ALT(C)的差异性组织表达。用在rs6471859处带有“G”等位基因的pCMV-FLAG-N CA8 ALTG(CA8-204的bp 1417)或pCMV-FLAG-N CA8ALTC(在rs 6471859处带有“C”等位基因)替代变体转染后，来自(a)HEK293细胞和(b)神经元细胞(NBL)的定量RT-PCR(实时PCR，应用生物系统)。使用β肌动蛋白(ACTB)基因产物，将相应载体的量归一化。所使用的引物被设计为覆盖CA8-204的3'UTR ewgion。HK细胞在变体rs6471859处不表达具有C基因型的可检测的CA8-002转录物。N＝3，实验次数＝3(使用GraphPad棱镜软件进行统计分析，**＝p值<0.001，***＝p值<0.0001，采用单向Anova，然后进行Tukey组比较。参见图41A和41B。
CA8-204C和CA8-204G片段显示可变的组织表达。用表达CA8-204C和CA8-204G转录物的载体转染HEK 293(非神经元细胞)和NBL(神经元细胞)，并且使用SyBr green(AB)进行定量的RT-PCR(QPCR应用生物系统)，使用β肌动蛋白作为内部对照进行归一化。引物被设计为位于这些细胞系中选择性地表达的CA8-204C和CA8-204G序列的3'UTR区域的侧翼。我们观察到CA8片段剪接和表达的显著差异，其中CA8-204C主要在NBL细胞中表达，并且CA8-204G主要在HEK293细胞中表达，这与决定每个片段的表达的细胞特异性剪接因子一致。(N＝4，***P值<0.001，采用单向ANOVA，然后是事后Tukey测试)。参见图42。
CA8-204C片段抑制NBL细胞中ATP刺激的钙释放。用具有表达CA8-204C、CA8-201的核苷酸插入的载体(CA8野生型阳性对照)或空载体(阴性对照)转染NBL细胞，并且使用1μMATP作为细胞内钙释放的刺激物进行钙成像(Fura2，Leica微系统)。CA8-204C和CA8-201能够抑制体外NBL细胞中的Ca2+释放。CA8-204C对钙释放的抑制超过了CA8-201(野生型全长转录物/肽)对钙释放的抑制。相比之下，空载体(阴性对照)在这项测定中未能抑制钙释放。(N＝6，***P<0.001，通过单向ANOVA进行统计分析，通过Tukey事后测试进行组比较，GraphPad棱镜)。参见图43。
如在HEK293细胞或NBL细胞中选择性地表达的，CA8-204G或CA8-204C肽片段为28kDa或26kDa。从用表达flag-CA8-204G、flag-CA8-204C或V5-CA8-201(野生型全长CA8)转录物的载体转染的HEK293细胞(中间)或NBL细胞(右侧)中提取蛋白质，在同一凝胶上运行，并且用抗flag或抗V5抗体进行免疫印迹。在HEK293细胞中的28kDa处仅检测到flag-CA8-204G肽片段，并且在NBL细胞中的26kDA处仅检测到flag-CA8-204C肽片段。在进行免疫印迹后合并数据。用β肌动蛋白(对照)对数据进行归一化。参见图44。
CA8204C抑制佛司可林诱导的pITPR1的磷酸化。用含有CA8WT、CA8204C的载体或空载体(媒剂)转染HEK 293细胞。媒剂用作阴性对照。使用粘着斑蛋白作为内部对照对数据进行了归一化。参见图45。
本说明书中所引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指示通过引用并入本文。尽管上述发明已经出于清楚理解的目的通过说明和举例的方式进行了一些详细描述，但是根据本发明的教导，对于本领域普通技术人员而言应当容易了解到，可以在不偏离随附权利要求书的精神或范围的情况下对本发明进行某些改变和修改。
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Claims (37)

1.一种治疗或预防有需要的受试者的疼痛的方法，所述方法包括向所述受试者施用表达载体，所述表达载体包括编码碳酸酐酶10或碳酸酐酶11的核酸序列，使得所述核酸被表达以产生碳酸酐酶10或碳酸酐酶11。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是人。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述表达载体是病毒载体。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述病毒载体是腺相关病毒载体。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述病毒载体是单纯性疱疹病毒载体。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其中编码碳酸酐酶10或碳酸酐酶11的所述核酸序列可操作地连接到选自由以下组成的组的启动子：CMV启动子、TrkA启动子、TrkB、TrkC启动子、Nav1.9启动子、Nav1.8启动子、Nav1.7启动子、NMDA启动子、advillin启动子、CGRP启动子、5HT启动子、NK1启动子、ASIC3启动子、NPY启动子和NF200启动子。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其中所述疼痛是神经性疼痛。
8.根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其中所述疼痛是炎性疼痛。
9.根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其中所述疼痛是由癌症或脊髓损伤引起的。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的方法，其包括向所述受试者的背根神经节施用所述表达载体。
11.根据权利要求1到9中任一项所述的方法，其包括通过关节内注射施用所述表达载体。
12.根据权利要求1到9中任一项所述的方法，其包括口服施用所述表达载体。
13.根据权利要求1到9中任一项所述的方法，其包括向三叉神经节施用所述表达载体。
14.根据权利要求1到9中任一项所述的方法，其包括通过周围神经注射施用所述表达载体。
15.根据权利要求1到9中任一项所述的方法，其包括通过导管向出现疼痛的部位施用所述表达载体。
16.根据权利要求1到9中任一项所述的方法，其包括通过针向出现疼痛的部位施用所述表达载体。
17.根据权利要求1到9中任一项所述的方法，其包括使用成像来施用所述表达载体。
18.一种治疗或预防有需要的受试者的疼痛的方法，所述方法包括向所述受试者施用表达载体，所述表达载体包括编码碳酸酐酶8的片段的核酸序列，使得所述核酸被表达以产生所述片段。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述受试者是人。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的方法，其中所述表达载体是病毒载体。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述病毒载体是腺相关病毒载体。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述病毒载体是单纯性疱疹病毒载体。
23.根据权利要求18到22中任一项所述的方法，其中编码碳酸酐酶8的片段的所述核酸序列可操作地连接到选自由以下组成的组的启动子：CMV启动子、TrkA启动子、TrkB启动子、TrkC启动子、Nav1.9启动子、Nav1.7启动子、Nav1.8启动子、NMDA启动子、advillin启动子、CGRP启动子、5HT启动子、NK1启动子、ASIC3启动子、NPY启动子和NF200启动子。
24.根据权利要求18到23中任一项所述的方法，其中所述疼痛是神经性疼痛。
25.根据权利要求18到23中任一项所述的方法，其中所述疼痛是炎性疼痛。
26.根据权利要求18到23中任一项所述的方法，其中所述疼痛是由癌症或脊髓损伤引起的。
27.根据权利要求18到26中任一项所述的方法，其包括向所述受试者的背根神经节施用所述表达载体。
28.根据权利要求18到26中任一项所述的方法，其包括通过关节内注射施用所述表达载体。
29.根据权利要求18到26中任一项所述的方法，其包括口服施用所述表达载体。
30.根据权利要求18到26中任一项所述的方法，其包括向三叉神经节施用所述表达载体。
31.根据权利要求18到26中任一项所述的方法，其包括通过周围神经注射施用所述表达载体。
32.根据权利要求18到26中任一项所述的方法，其包括通过导管向出现疼痛的部位施用所述表达载体。
33.根据权利要求18到26中任一项所述的方法，其包括通过针向出现疼痛的部位施用所述表达载体。
34.根据权利要求18到22中任一项所述的方法，其包括使用成像来施用所述表达载体。
35.根据权利要求18到34中任一项所述的方法，其中所述碳酸酐酶8的片段是CA8-204。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述碳酸酐酶8的片段是CA8-204C或CA8-204G。
37.根据权利要求18到34中任一项所述的方法，其中所述碳酸酐酶8的片段是CA8-202或CA8-203。
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