KR20190028440A - 신경성 배뇨근 과활동(neurogenic detrusor overactivity)의 치료용 바이러스 벡터 - Google Patents

신경성 배뇨근 과활동(neurogenic detrusor overactivity)의 치료용 바이러스 벡터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신경전달 또는 구심성 뉴우런의 시냅스 전달을 억제/무반응시키는 전이유전자(들)을 지닌 전사 카세트를 수반하는 바이러스 발현 벡터를 포함하는 NDO의 치료를 위한 방법 및 약제학적 조성물을 제공한다.

Description

신경성 배뇨근 과활동(neurogenic detrusor overactivity)의 치료용 바이러스 벡터
본 발명은 신경성 배뇨근 과활동(neurogenic detrusor overactivity: NDO)의 치료를 위한 유전자 치료요법 전략으로서, 방광의 구심성 신경(afferent nerve)을 선택적으로 조절하거나 무반응(silence)시키는 바이러스 발현 벡터 및 이의 약제학적 조성물에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 뇨(urine) 저장 및 방광 비움(baldder emptying) 또는 배뇨의 제어 분야에 관한 것이며, 이는 하부 요로내 2개의 기능성 단위의 활성에 의존한다: (1) 저장소(the urinary bladder) 및 (2) 방광 경부(bladder neck), 요도, 및 외부 요도 괄약근(external urethral sphincter: EUS)의 가로무늬근으로 이루어진 배출구(outlet)(Fowler et al. 2008;　Morrison et al. 2005). 이러한 구조는 원심성 말초 신경의 3개의 세트에 의해 제어된다: 엉치 부교감신경(sacral parasympathetic)(골반 신경), 흉요추 교감신경(하복부 신경 및 요천추 교감신경줄기(lumbo-sacral sympathetic chain)), 및 양측으로 분산된 체신경(somatic nerves)(음부 신경(pudendal nerves))(de Groat 1986;　Morrison et al. 2005). 이들 신경은 흉요추 및 엉치 천골 수준에서 기원하는 상이한 엑손으로 이루어져 있다. 부교감 원심성 신경(parasympathetic efferent nerves)은 방광을 수축시키고 요도를 이완시킨다. 교감 원심성 신경(sympathetic efferent nerves)은 방광을 이완시키고 요도를 수축시킨다. 체 원심성 신경(somatic efferent nerves)은 EUS를 수축시킨다. 이들 신경은 또한 하부 요로로부터의 정보를 요천골 척수(lumbosacral spinal cord)로 전송하는 구심성 뉴우런을 함유한다. 사람 하부 요로의 구심성 뉴우런의 세포체는 S2-S4 및 T11-L2 배근 신경절(DRG)에 위치한다. 방광이 채워진 느낌은 골반 및 하복부 신경에 의해 척수로 전달되는 반면, 방광 경부 및 요도로부터의 감각 도입(sensory input)은 음부 신경 및 하복 신경(hypogastric nerve)에서 수반된다.
유사한 분절 조직(segmental organization)이 비사람 영장류, 고양이 및 개에서 존재한다. 랫트에서는, 골반, 음부 및 하복 신경의 구심성 뉴우런의 세포체가 L6-S1 및 T11-L2 DRG 각각에 위치한다. 하부 요로 기능을 제어하는 신경 경로는 방광과 방광 경부 사이의 상호간 관계를 유지하는 단순한 온-오프 스위칭 회로(on-off switching circuit)로서 조직화되어 있다. 저장 반사작용(storage reflex)은 방광이 채워지는 동안 활성화되며 주로 척수에서 조직화되어 있지만, 비는 것은 뇌에 조직화된 반사 메카니즘에 의해 매개된다(Fowler et al. 2008). 방광이 완전히 채워지면, 배뇨근의 부교감신경의 신경분포가 억제되어 요도 괄약근의 평활근 및 횡문근 부분이 활성화되어, 불수의적인 방광 비움이 방지된다. 이러한 과정은 총괄적으로 '가딩 반사작용(guarding reflex)'으로 알려진 요도 반사작용에 의해 조직화되어 있다. 이들은 골반 신경을 통해 전달되는 방광 구심성 활성에 의해 활성화되며, 척수내 신경세포간 회로에 의해 조직화되어 있다(Fowler et al. 2008).
NDO는 비정상적인 방광 기능이 뇌혈관 질환 또는 뇌 경색, 외상으로 인한 뇌 또는 척수 손상, 다발 경화증, 파킨슨 질환(Parkinson's disease), 선천성 기형, 예컨대, 척추뼈갈림증, 또는 질환, 예컨대, 중추 신경계의 유전성 강직성 하반신마비, 말초신경병증, 및 다양한 척추 장애, 즉, 척추 골절로 인한 척수 압박 및 손상, 경추 및 요추증, 변형성 척추증, 척추전방전위증, 척추관협착증, 추간판 헤르니아 등을 지닌 환자에서 관찰된 상태를 지칭한다.
NDO는 채워진 상(filling phase) 동안 불수의 배뇨근(방광) 수축에 의해 특징화되며, 이는 관련된 신경학적 상태로 인하여 자발적으로 일어나거나 유발된다. 이는 흔히 방광-괄약근 협동장애(bladder-sphincter dyssynergia)와 관련되어 있다.
척수 손상(SCI)으로 인한 NDO는 NDO의 가장 심각한 형태이다. SCI 직후 방광이 무반사인 2 내지 12주 동안 지속되는 척수 쇼크(spinal shock) 기간이 존재한다. 이후에, NDO에 관여하는 척수 배뇨 반사가 점진적으로 발달한다. SCI 환자의 경우, 이러한 손상은 요실금 및 방광압에 있어서의 증가를 야기하며, 이는 치료되지 않는 경우, 상부 요로를 손상시키고 신부전을 촉발시킨다. 뇨실금은 유의적인 부담과 관련되어 있으며 삶의 질을 심각하게 손상시킨다. SCI 환자에서, 불완전한 방광 비움 및 신부전으로 인한 재발성 요로 감염은 각각 재입원의 첫번째 원인 및 사망률의 두번째 원인으로 남아있다. SCI는 배뇨뿐만 아니라 방광 및 괄약근 기능을 조정하는 정상의 반사 경로의 자발적인 제어를 파괴한다. 상부천골 척추 병변(suprasacral spinal lesion)에서, 천수(sacral cord) 수준에서 단절 반사(segmental reflex)의 비차폐의 NDO 결과는 방광 구심성 통각 C-섬유에 의해 매개되었다(de Groat and Yoshimura, 2006). 이러한 사일런트(silent) C-섬유는 기계-민감성(mechano-sensitive)이 되어 SCI 후 자동적인 배뇨 반사를 개시한다. 이러한 반사는 척추위 제어의 제거 후 촉진된다. 성형력(plasticity)이 방광 구심성에서 일어나서 구심성 뉴우런의 이온 채널 및 전기적 감수성 특성에 있어서의 변화와 관련되어 있으며, 부분적으로 척수 및 말초 표적 기관 내에서 방출된 신경영양 인자에 의해 매개되는 것으로 여겨진다. 전반적으로, NDO에 대한 신경생물학적 기질은 방광 요로상피 및 서브(sub)-요로상피에 있어서 기능적 변경 뿐만 아니라 방광 내에서 기원하는 척수에 대한 증가된 구심성 감각 메세지를 포함한다. 비-말이집(non-myelinated) C형 방광 구심성 뉴우런의 이상비대 및 과활성으로부터 야기되는, 악화된 구심성 방광 자극은 SCI 대상체에서 NDO를 유발하는 주요 메카니즘이다.
NDO의 치료를 위한 보호 기준은 배뇨근 수준에서 원심성 신경전달을 억제하는 것으로 이루어진다. 따라서, NDO 환자는 현재 무스카린성 아세틸콜린 수용체의 활성을 차단함으로써 배뇨근 수축을 억제하는 항무스카린제, 및/또는 클로스트리디움 보툴리늄(Clostridium botulinum) 신경독소 A(BoNT-A)의 반복된 배뇨근내 주사로 방광 원심성에 작용하여 배뇨근 수축을 다시 차단하여 치료한다. 치료 둘 다는 간헐적인 방광 카테터설치(5 내지 6회/일)와 조합되어야만 한다.
BoNT-A 주사는 SNARE 복합체의 형성을 억제하여, 배뇨작용 동안 신경전달물질-충전된 소낭(neurotransmitter-filled vesicle)과 원심성 뉴우런의 원형질 막의 융합 및 이들의 방출을 차단한다. 따라서, BoNT-A의 주사는 신경 기원이거나 신경 기원이 아닌 과활성 방광을 지닌 환자를 치료하기 위한 의약으로서 사용되고 있다. 예를 들면, PCT 특허원 제WO 99/03483호 및 제WO 2010/022979호는 다양한 뇨 장애의 치료를 위해, 이의 표적 조직, 예컨대, 근육, 선(gland), 또는 다른 신경의 자극으로부터 신경을 보호하기 위한 BoNT-A 주사의 용도를 개시하고 있다.
제WO2013/180799호는 변형된 보툴리늄 신경독소를 암호화함으로써 이의 사람 수용체에 대해 증진된 결합 특성을 갖는 단백질을 생산하는 바이러스 벡터의 용도를 개시하고 있다. 세포주 내에서 생산한 후, 상층액으로부터 회수하여 정제하면, 이러한 신경독소는 NDO와 같은 원치않은 신경 활성과 관련된 상태를 치료하기 위해 국소 적용될 수 있다. 그러나, 이러한 벡터는 유전자 치료요법 시도용으로 고려되지 않고 있다.
그럼에도 불구하고, 보툴리늄 신경독소의 주사는 독소 확산의 불편함을 나타내는데, 이는 주로 신체의 다른 부위로의 독소의 확산에 기인한다. 이러한 부작용은 하수증 및 복시(diplopia)와 같은 일시적인 심각하지 않은 현상으로부터 생명을 위협하는 현상, 심지어 죽음까지의 범위에 이른다. 또한, NDO의 경우 이러한 주사는 시간에 걸쳐 감소된 효능으로 인하여 평균 6개월마다 반복되어야만 한다.
상부천골 척추 장애에 의해 유발된 방광-괄약근 협동장애의 존재 또는 부재하에서 NDO는 방광 구심성(aδ 및 c 섬유)에 의해 매개된 비정상적인 반사의 출현에 기인하므로, NDO의 치료를 위한 대안적인 시도가 브린들리(Brindley)에 의해 개발되었다(Brindley et al 1986). 이러한 시도는 후방 천골 척추 신경근 전달 수술(posterior 천골 척추 신경근 절단 수술)과 천골 전방 루트 자극(sacral anterior roots stimulation: SARS)을 조합한다. 이러한 치료는 완전한 상부천골 척수 병변에 의해 유발된 NDO에 대한 가장 효과적인 치료 방법 중 하나인 것으로 여겨졌다: 천골 척추 신경근 절단 수술은 방광의 순응도를 영구적으로 증가시키며 신부전과 요실금의 주요 원인인 배뇨근- 및 배뇨근-괄약근 협동장애의 과활성을 제거하는 반면, 전방 척추근의 자극 인자의 이식은 환자가 배뇨를 유도하고 이를 제어할 수 있도록 한다.
브린들리(Brindley)(1986)에 의해 제안된 바와 같은, 후방 천골 척추 신경근 절단 수술에 의한 구심로차단은 배뇨근 근육으로부터 감각 도입을 제공하는 것들을 포함하는, 척추 S2 내지 S4 분절에 대한 모든 구심성 신경 섬유의 완전한 수술적 절단으로 이루어진다. 이러한 방식으로, 배뇨근 근육으로부터의 감각 자극은 더 이상 중추 신경계에 도달할 수 없으며, 그 결과 제어되지 않는 방광 수축을 유발하는 중추 신경계에 의해 생성된 반사 활성이 억제될 수 있다. 이러한 수술은 배뇨근의 악화된 반사 활성을 방지하는데 필수적이며 낮은 방광압에서 보다 많은 양의 뇨가 저장되도록 한다. 그러나, 후방 천골 척추 신경근 절단 수술(S2-S4)에 의한 대규모의, 비-선택적이고, 비가역성인 골반-회음 구심로차단으로부터 수득된 방광 구심로차단은, 이것이 존재할 경우 남아있는 골반-회음 감각의 상실에 관여하여, 존재할 경우 오르가즘, 반사 발기 및 사정, 및 가능하게는 피부 감각 신경지배로 인한 욕창을 촉진하므로, 많은 위험 및 단점을 갖는다. 또한, 신경외과 수술의 규모는 이를 비용이 많이 들게 하고 뇌척수 액루 및 장기간 동안 샤르코 척추 관절병(Charcot spinal arthropathy)의 원인이 된다.
결과적으로, 척추위 병변(supraspinal lesion)의 경우에, 이의 병리생리학, 즉, 방광 구심성에 의해 매개된 비정상적인 척추 반사를 구체적으로 표적화하지만, 방광 원심성 뉴우런에 위해를 가하지 않으면서, 동일한 신경에서 전달된 다른 구심성 뉴우런에 영향을 미치지 않는, NDO를 치료하기 위한 새로운 전략이 요구되고 있다. 본 발명자들이 제안하는 이러한 전략은 천골 전방 근 자극과 조합되는 경우 선택적인 분자 방광 구심로차단을 초래하여, NDO 환자에서 배뇨자제 및 배뇨를 회복시키는 유전자 치료요법 접근법이다. 이는 다음을 나타내는 치료학적 전이유전자(들)을 전달할 수 있는 바이러스 발현 벡터를 필요로 하는 새로운 전략에 의해 달성되었다:
- 구심성 뉴우런의 신경전달 또는 시냅스 전달을 억제/무반응시키는 능력;
- 특히 방광의 구심성 뉴우런에 대한 고 선택성;
- 고 효능;
- 시간에 걸친 발현의 안정성; 및
- 오프-표적 신경제거의 부재.
본 발명의 맥락에서, 본 발명자들은 놀랍게도 방광 벽 내에 바이러스 발현 벡터의 주사 후, 시간에 걸쳐 단백질을 안정하게 발현하고/하거나 전사하여 NDO를 치료하는 바이러스 발현 벡터를 사용하여, 척수 수준에서 방광 구심성 뉴우런의 신경전달 또는 시냅스 전달을 억제/무반응시킴으로써, 방광의 구심성 뉴우런 내에서 선택적이고 안정한 전이유전자 발현을 수득할 수 있음을 발견하였다.
본 발명은 구심성 뉴우런의 신경전달 또는 시냅스 전달을 억제/무반응시키는 전이유전자(들)을 지닌 전사 카세트(trasncription cassette)를 수반하는 바이러스 발현 벡터를 포함하는 NDO의 치료를 위한 방법 및 약제학적 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법 및 약제학적 조성물은 SNARE 복합체, 및/또는 리보소옴 복합체를 파괴하고/하거나 GABA(A) 수용체를 활성화시키고/시키거나 전사된 경우, 방광 구심성 뉴우런의 신경전달 또는 시냅스 전달을 억제/무반응시키는 표적화된 뉴우런 제거를 조건적으로 유도하는 바이러스 발현 벡터를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "전사 카세트"는 프로모터 및 하부 암호화 서열 또는 전이유전자를 함유하는 어떠한 핵산 서열도 지칭하며, 상기 서열의 발현은 상기 프로모터에 의해 구동되고, 이후에 폴리아데닐화 시그널(signal)이 존재한다. 용어 "전이유전자"는 핵산 서열이 도입되는 세포내에서 발현될 RNA 및/또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 일부를 암호화하는 특수한 핵산 서열을 지칭한다. 용어 "전이유전자"는 (1) 세포내에서 천연적으로 발견되지 않는 핵산 서열(즉, 이종 핵산 서열); (2) 이것이 도입된 세포내에서 천연적으로 발견된 핵산 서열의 돌연변이체 형태인 핵산 서열; (3) 이것이 도입된 세포내에 천연적으로 존재하는 동일(즉, 동종)하거나 유사한 핵산 서열의 추가의 카피를 부가하기 위해 제공되는 핵산 서열; 또는 (4) 이것이 도입된 세포내에서 이의 발현이 유도되는 사일런트의 천연적으로 존재하거나 동종인 핵산 서열. "돌연변이체 형태"는 야생형 또는 천연적으로 존재하는 서열과는 상이한 하나 이상의 뉴클레오타이드를 함유하는 핵산 서열을 의미하는데, 즉, 돌연변이체 핵산 서열은 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함한다. 일부 경우에, 전이유전자는 또한 리더 펩타이드 또는 시그널 서열을 포함함으로써 전이유전자 생성물이 세포로부터 분비되거나, 전이유전자가 리더 펩타이드(leader peptide) 또는 시그널 펩타이드 및 막 앵커 펩타이드(membrane anchor peptide) 둘 다를 포함할 수 있도록 하거나 심지어 2개의 천연적으로 존재하는 단백질 또는 이들의 부분 사이에 융합 단백질이 존재하도록 하여, 전이유전자가 세포 막에 앵커(anchor)되어 남도록 할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "리보소옴 복합체"는 해독(translation)으로 지칭된, 단백질의 합성을 촉매진시키는 80S 및 70S 소단위(subunit)와 같은, 리보소옴의 소단위로 필수적으로 구성된 복합체를 지칭한다.
제1 국면에서, 본 발명은 따라서 적어도:
a) 방광의 구심성 뉴우런 속에서 선택적으로 활성인 하나의 프로모터,
b) 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나의 전사 카세트(여기서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 전사된 경우 시냅스후 세포(postsynaptic cell)내 신경전달물질 시그널의 형질도입을 무반응시키거나 억제한다), 및
c) 상기 전사 카세트에 작동적으로 연결된, LTE(Lokensgard et al, 1997)로서 공지된 것과 같이, 장기간 발현을 부여하고/하거나 HSV-1 게놈으로부터의 DNA 인슐레이터(DNA insulator)(Amelio et al, 2006)를 함유하는 하나의 서열을 포함하는 바이러스 발현 벡터를 제공한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 바이러스 발현 벡터의 뉴클레오타이드 서열은 전사되거나 해독되는 경우 SNARE 복합체, 및/또는 리보소옴 복합체를 파괴하고/하거나 GABA(A) 수용체를 활성화시키고/시키거나 조건적으로 표적화된 뉴우런 제거를 유도함으로써 신경전달 또는 시냅스 전달을 무반응하거나 억제한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 바이러스 발현 벡터의 뉴클레오타이드 서열은 전사되는 경우, SNARE 복합체의 일부분인, VAMP, SNAP-25 또는 신탁신 1a로부터 선택된 단백질 중 적어도 하나를 파괴하거나, 단백질 GAD67 또는 이의 활성 단편을 암호화하거나, 리보소옴 복합체를 파괴하는 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하거나, 조건적으로 표적화된 뉴우런 제거를 유도하는 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화한다.
특수한 구현예에서, 본 발명에 따른 리보소옴 복합체를 파괴하는 상기 단백질은 야생형 또는 변형된 리보소옴 불활성화 단백질(RIP) 또는 이의 활성 단편이며, 우선적으로 상기 RIP는 제1형 또는 제2형의 RIP로부터 선택되고, 우선적으로 제1형 RIP는 사포린, 겔로닌, 디안틴, 트리코산틴으로부터 선택되고; 제2형의 RIP는 리신, 볼켄신 및 아브린으로부터 선택되고, 보다 우선적으로 상기 제1형의 RIP는 사포린 S6 또는 이의 활성 단편이다.
용어 "조건적으로 표적화된 뉴우런 제거를 유도하는 단백질"은 메트로니다졸(MTZ)과 같은 무해한 전구약물 물질은 세포독성 DNA 가교결합제로 전환시켜 표적화된 세포 유형, 즉, 방광의 구심성 뉴우런의 세포-특이적인 제거를 제공하는 단백질에 관한 것이다. 조건적으로 표적화된 뉴우런 제거를 유도하는 이러한 단백질의 예는 니트로리덕타제(NTR)이다.
따라서, 본 발명에 따른 조건적으로 표적화된 뉴우런 제거를 유도하는 단백질은 야생형 또는 변형된 NTR 또는 이의 활성 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 우선적으로, 상기 NTR은 야생형 또는 변형된 산소-무감각성 NAD(P)H 니트로리덕타제 또는 이의 활성 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 보다 우선적으로 상기 NTR은 야생형 또는 변형된 이. 콜라이(E. coli) 니트로리덕타제로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 심지어 보다 우선적으로 상기 NTR은 야생형 또는 변형된 이. 콜라이 nfnB 또는 이의 활성 단편이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "바이러스 벡터" 또는 "바이러스 발현 벡터"는 바이러스 게놈의 적어도 하나의 성분을 포함하는 핵산 벡터를 지칭하며 바이러스 입자로 패키징될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "바이러스 벡터"는 광의적으로 핵산 벡터(예컨대, DNA 바이러스 벡터) 뿐만 아니라 이의 생성된 바이러스 입자도 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명에 따라서 바이러스 발현 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터 또는 헤르페스 단성 바이러스(HSV) 벡터, 바람직하게는 HSV-1 벡터 또는 HSV-2 벡터, 심지어 보다 바람직하게는 HSV-1으로부터 기원한 결손 바이러스 벡터(defective virus vector)이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "결합이 있는 바이러스 벡터"는 바이러스 생애 주기를 성공적으로 완성시키는데 필수적인 유전자 또는 유전자의 일부를 결여한 바이러스 벡터를 지칭할 수 있다.
본 발명에 따라서, 용어 "AAV"는 재조합 AAV 벡터 입자를 포함하는 아데노-관련 바이러스 자체 또는 이의 유도체를 지칭한다. 또한, 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "AAV"는 많은 상이한 혈청형을 포함하며, 이는 사람 및 비-사람 영장류 샘플로부터 분리된다. 바람직한 AAV 혈청형은 사람 혈청형, 보다 바람직하게는 혈청형 2, 5 및 9의 사람 AAV, 가장 바람직하게는 혈청형 5의 사람 AAV이며, 이는 최고 수준의 향신경성을 나타내는 혈청형이다.
본 발명에 따라서, 용어 "HSV로부터 기원한 결손 바이러스 벡터"는 결손 재조합 HSV 벡터 및 앰플리콘(amplicon) HSV 벡터 둘 다를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "결손 재조합 HSV"는 헬퍼-독립성 벡터를 기술하며, 이의 게놈은 ICP4 및 ICP27로 공지된, 2개의 필수 단백질을 암호화하는 유전자의 적어도 완전한 결실을 포함한다. ICP4 유전자는 바이러스 게놈의 c 및 c'로 알려진 역위된 반복 서열에 위치한, 2개의 카피로 존재하며, 이러한 유전자의 카피 둘 다는 결실되어 있다. ICP27을 암호화하는 유전자는 바이러스 게놈의 유일한 긴(unique long: UL) 서열 내에 위치한다. 우선적으로, 본 발명에 따른 헬퍼-독립성 벡터는 LAT(잠재성 관련 전사) 유전자자리(locus)내로 포매된(embedded) 치료학적 전사 카세트(들)을 수반(carring)하며(Berthomme et al. 2000 및 Berthomme et al. 2001), 이는 바이러스 게놈의 b 및 b'로서 공지된 역위된 반복 서열내에 함유된 반복된 유전자자리이다. 보다 우선적으로, 전사 카세트는 잠복성 관련 프로모터(Latency Associated 프로모터: LAP)와 장-기간 발현(Long-Term Expression: LTE) 영역(부위 1) 사이, 또는 LTE 영역과 LTE(부위 2)의 하부에 존재하는 DNA 인슐레이터(INS) 서열 사이에 위치한다(도 1에 나타낸 바와 같음). 본 발명에 따른 결손 재조합 HSV-1 벡터는 신경전달을 억제/무반응시키기 위하여 상기 기술한 상이한 전이유전자를 발현하는, 즉, 이들 모두가 본 발명에 기술된 바와 같은 장-기간 DRG-특이적인 프로모터에 의해 구동되는, 야생형 또는 변형된 경쇄 보툴리늄 독소, 및/또는 안티센스 RNA(AS-RNA) 표적화 SNARE 단백질, 및/또는 GAD67, 및/또는 RIP, 및/또는 NTR을 발현하는 전사 카세트(들)을 수반한다. 바이러스 게놈의 b 및 b' 서열은 또한 각각 TRL(말단 반복체 L) 및 IRL(내부 반복체 L)로 공지되어 있는 반면, c' 및 c 서열은 또한 IRS(내부 반복체 S) 및 TRS(말단 반복체 S)로 공지되어 있고, 여기서 L 및 S는 각각 HSV-1 게놈의 유일한 긴(L) 및 유일한 짧은(S) 서열을 지칭한다. 더욱이, 본 발명에 따른 헬퍼-독립성 벡터는 ICP34.5, UL55, UL56, 및 UL41 단백질과 같은 비-필수 단백질을 암호화하는 유전자내에 추가의 결실을 포함할 수 있다. 이들 결손 HSV 벡터는 단백질 ICP4 및 ICP27를 동시 발현하는 세포주내에서 증식된다(Marconi et al, 2010).
제WO 2006/050211호는 통증의 유전자 치료요법을 위한 결손 HSV-1 벡터의 용도를 개시하고 있다. 그러나, 본 발명에 따른 벡터는 몇가지 유의적인 국면에서 제WO 2006/050211호에 기술된 벡터와는 상이하며, 이는 본 발명에 따른 벡터의 유용성 및 효능과 관련하여 중요하다. 가장 중요하게는, 본 발명에 따른 전이유전자성 전사 카세트는 LAT 유전자자리내로 도입되며, 이러한 영역은 본 발명에 따른 전사 카세트내 전이유전자 발현을 구동하는 DRG-특이적인 프로모터에 장기간 발현을 부여하는 LTE 및 DNA 인슐레이터 서열(INS) 둘 다를 함유하지만, 제WO 2006/050211호에 기술된 벡터는 단기간 작용을 위해 고려되어 이를 입증하였으므로, 이들의 전사 카세트는 편재된 프로모터에 의해 구동되며 LAT 영역내로 도입되지 않았다.
"앰플리콘 또는 앰플리콘 벡터"는 헬퍼-의존성 벡터를 의미하며, 이의 게놈은 바이러스 단백질을 암호화하는 HSV 유전자의 대부분 또는 전부를 결여한다. 앰플리콘 벡터의 게놈은 목적한 전이유전자성 DNA(즉, 전사 카세트) 외에, HSV-1 게놈으로부터의 하나의 DNA 복제 오리진 및 하나의 패키징 시그널을 수반하는 앰플리콘 플라스미드로 공지된 플라스미드의 탄뎀식(in tandem)의 다수의 카피로 구성된 콘카티머(concatemeric) DNA이다. 본 발명에 따른 앰플리콘 플라스미드는 신경전달을 억제/무반응시키기 위하여 상기 기술된 상이한 전이유전자를 발현하고, 즉 야생형 또는 변형된 경쇄 보툴리늄 독소를 발현하고/하거나, 이들 모두 장기간 프로모터, 우선적으로 본 발명에 기술된 바와 같은 장기간 DRG-특이적인 프로모터에 의해 구동된, SNARE 단백질, 및/또는 GAD67, 및/또는 RIP, 및/또는 NTR을 표적화하는 RNA(RNAi)를 방해하는 전사 카세트를 수반한다(참고: 도 2).
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 벡터는 필수 단백질 ICP4 및 ICP27을 암호화하는 유전자를 적어도 결여하고 있는 결손 재조합 벡터, 우선적으로 ICP4 및 ICP27 둘 다를 결여한 벡터이다. 이러한 벡터는 ICP34.5, UL55, UL56 및/또는 UL41 유전자 단백질과 같은 비-필수 단백질을 암호화하는 다른 유전자를 결여할 수 있고 벡터 게놈의 LAT 영역내로 포매된, 도 7에 기술된 DRG-특이적인 전사 카세트(들)을 수반한다.
다른 구현예에서, 본 발명에 따른 벡터는 이러한 문서의 다른 부분에 기술된 바와 같은, 장 기간 DRG-특이적인 프로모터에 의해 구동된 상술한 전사 카세트를 수반하는 앰플리콘 벡터이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 카세트는 LAT 유전자자리내로 도입된다.
본원에 사용된 바와 같은 표현 "재조합 DNA"는 이의 기원 또는 조작으로 인하여, 천연적으로 관련된 폴리뉴클레오타이드의 모두 또는 일부와 관련되지 않은, 핵산 분자, 즉, 게놈성, cDNA, 바이러스, 반합성, 및/또는 합성 기원의 폴리뉴클레오타이드를 기술한다. 바이러스와 관련하여 사용된 바와 같은 용어 "재조합체"는 유전자를 포함하는, 돌연변이, 결실 또는 하나 이상의 이종 폴리뉴클레오타이드를 도입하기 위해 조작된 게놈 또는 재조합 게놈을 수반하는 바이러스를 의미한다. 단백질 또는 폴리펩타이드와 관련하여 사용된 바와 같은 용어 "재조합체"는 재조합 핵산의 발현에 의해 생산된 폴리펩타이드를 의미한다. 숙주 세포와 관련하여 사용된 바와 같은 용어 "재조합체"는 이의 게놈 내에 삽입된 재조합 DNA를 함유하는 숙주 세포 또는 세포 내에 재조합 DNA를 수반하는 재조합 벡터를 의미한다. 용어 "감염"은 숙주 세포 또는 대상체내로 도입하는 바이러스 벡터의 능력을 지칭한다.
HSV로부터 기원한 결손 벡터는 이웃하는 감각 뉴우런을 감염시켜 감염 부위에 따라, 삼차 또는 배근 신경절(DRG) 내에 위치한, 이들 뉴우런의 핵 내에서 잠복성 감염을 확립하도록 한다. 특히, HSV-1은 감각 뉴우런을 천연적으로 감염시키고 이들 뉴우런의 핵에서 일생의 잠재성 감염을 확립한다. 따라서, 방광 벽 내에 주사 후, HSV-1으로부터 기원한 벡터와 같은 벡터는 이들이 치료학적 전이유전자를 안정하게 발현할 방광에 신경을 통하게 하는 감각 DRG가 도달하도록 하며, 단 적절한 방광 구심성 뉴우런-특이적인 프로모터가 이들의 발현을 구동한다고 가설을 세울 수 있었다. 그러나, HSV-1는 자율 뉴우런 속에서 감염시켜 잠복성 감염을 확립할 수 있으며(Furuta et al., 1993; Warren et al. 1978), 예비 결과는 이것이 실제로 벡터가 방광내로 접종되는 경우임을 입증한다. 따라서, 벡터로부터의 발현이 또한 선택적인 프로모터 또는 선택적인 구심성 뉴우런-특이적인 프로모터로 불리는, 구심성-특이적인 프로모터에 의해 완전히 제어되어, 이들 뉴우런(즉, 구심성 뉴우런)에서만 유의적인 전이유전자 발현을 수득하도록 함으로써, 또한 원심성, 뉴우런으로 불리는, 자율적인 발현을 피하도록 하는 것이 의무적이다. 방광 구심성 뉴우런의 선택적인 분자 또는 생화학적(수술과 대치되는 것으로서) 구심로차단은 이들 모두 방광 내에서 기원하지 않는 골반의 감각 신경에 의해 전달되는, 존재할 경우 남아있는 골반-외음, 존재할 경우, 오르가즘, 존재할 경우, 반사 발기 및 사정, 및 존재할 경우 반사 배뇨 및 배변을 보존하는 것이 중요하므로 본 발명의 가장 중요한 국면이다. 또한, 선택적인 방광 구심로차단은 또한 방광 원심성 뉴우런이 보존되도록 할 수 있으며, 이는 후에 예를 들면, 전극을 통한 전기적 자극에 의해 자극될 수 있다. 일부 연구는 HSV-1-계 벡터의 용도를 기술하고 있으며, 여기서 전사 카세트는 일시적인(Miyazato et al., 2009) 또는 장-기간(Puskovic et al., 2004; Miyagawa et al., 2015; WO 2015/009952A1) 프로모터를 포함한다. 그러나, 푸스코빅(Puscovic)(LAP2), 미야자토(Miyazato)(HCMV 프로모터) 및 미야가와(Miyagawa)(인공 CAG 프로모터)의 연구에서 사용된 프로모터는 비-선택성이어서, 자율 뉴우런, 뇌 뉴우런, 및 비-뉴우런 세포를 포함하는, 만흔 세포 유형에서 이들의 전이유전자의 발현을 야기한다. 대조적으로, 바이러스 조절 서열 및 구심성 뉴우런-특이적인 세포 프로모터를 조합함으로써, 본 발명에 따른 벡터 중 일부는 목적한 전이유전자의 유의적으로 더 높은 구심성 뉴우런-특이적인 발현을 가능하도록 한다(참고: 도 13).
본 발명의 실시에서 사용된 벡터는 RNA 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드(일반적으로 DNA)에 작동적으로 연결된 구심성 뉴우런에서 선택적으로 활성인 적어도 하나의 프로모터를 포함한다. "작동적으로 연결된"이라는 용어는, 이는 본원에서 벡터 내에서, 프로모터가 뉴클레오타이드로부터의 RNA의 전사(즉, 발현)을 구동하도록 하는 방식으로 프로모터가 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드에 관련되어 있음을 의미한다. 예컨대, DNA 주형으로부터 RNA의 전사는 잘-이해되고 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "프로모터"는 포유동물 세포내에서 RNA 폴리머라제를 결합시킬 수 있고 작동적으로 연결된 하부(3' 방향) 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 본 발명의 목적을 위해, 프로모터 서열은 상기 배경을 검출할 수 있는 수준에서 목적한 유전자의 전사를 개시하는데 필수적인 적어도 최소의 수의 염기 또는 성분을 포함한다. 프로모터 서열 내에 전사 개시 부위, 및 RNA 폴리머라제 결합 도메인이 존재한다. 진핵 프로모터는 흔히, 그러나 항상은 아니게, "CAT" 또는 "SP1" 박스와 같은, "TATA" 박스 및 다른 DNA 모티프( motif)를 함유한다. 본 발명에 따른 프로모터는 특수한, 관련 유전자 생성물을 암호화하는 전령(messenger)의 개시 부위에 대해 적어도 2 kb, 바람직하게는 3 kb, 보다 바람직하게는 4 kb 상부(upstream)에서 시작하는 DNA 서열을 포함한다. 이들 서열은 바람직하게는 특이적인 전사 결합 부위, 및 추가의 조절 성분을 함유하는, 유전자의 상부의 먼 서열을 함유한다.
"구심성 뉴우런에서 선택적으로 활성인"은 본원에서 프로모터가 구심성 뉴우런, 바람직하게는 방광의 구심성 뉴우런에서 주로 또는 유일하게 활성이며 RNA의 전사(즉, 발현)를 구동함을 의미한다.
또한, 당해 분야의 숙련가는 많은 이러한 포유동물 구심성 뉴우런 특이적인 프로모터가 알려져 있으며, 추가의 구심성 뉴우런 특이적인 프로모터가 연속적으로 발견됨을 인식할 것이다. 모든 이러한 구심성 뉴우런 특이적인 프로모터는 본 발명에 포함된다. 그러나, 많은 세포-특이적인 프로모터 후보물들은 이들이 세포 염색체내 이들의 내인성 위치로부터 발현되는 경우에만 선택적으로 나타남이 입증되어 왔다(McCart et al., 2002; Vassaux et al., 1996). 이들 프로모터가 HSV 벡터와 같은 비-통합성 발현 벡터의 게놈 내로 도입되는 경우 거동할 방법을 예측하는 방법은 존재하지 않는다. 특히, 구심성 뉴우런-특이적인 프로모터가 동일한 구심성 뉴우런-특이적인 활성을 보유할 것인지를 예측할 수 없다. 이는 (a) 프로모터에 결합된 뉴클레오솜(nucleosome)이 프로모터의 위치(염색체내 대 염색체외 벡터 게놈, 또는 심지어 세포 염색체내 상이한 위치들 사이)에 따라 수개의 국면(예를 들면, 이들은 억압(repressive) 또는 허용(permissive) 구조로 존재할 수 있다)에서 상이할 수 있기 때문이고 또한 (b) 포지티브 또는 네거티브 전사 인자의 접근가능성이 또한 상이할 수 있기 때문이다. 이는 모든 프로모터 후보물이 각각의 특수한 셋팅(즉, 에피좀 벡터 대 염색체 위치)에서 완전히 연구되어 본 발명자들이 실험적으로 행한 바와 같이, 이것이 벡터 게놈내에 위치하는 경우 이의 구심성 뉴우런-특이적인 활성을 보유하는지 또는 보유하지 않는지의 여부를 확립하여야 함을 의미한다(참고: 실시예 11 및 표 13에서의 결과).
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 프로모터는 일시적인 수용체 잠재적인 바닐로이드 1(Transient Receptor Potential Vanilloid 1: TRPV1) 또는 일시적인 수용체 잠재적인 양이온 채널 서브계열 M 구성원 8(Transient Receptor Potential cation channel subfamily M member 8: TRPM8)과 같은, 감각 신경수용체를 암호화하는 유전자의 프로모터로부터, 또는 감전 신경조절인자 또는 물질 P, PACAP, 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 4의 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin Gene Related Peptide: CGRP)의 프로모터와 같은 감각 신경전달물질을 암호화하는 유전자의 프로모터로부터 선택된다. 우선적으로, 본 발명에 따르는 감각 신경 수용체를 암호화하는 유전자의 프로모터는 TRP 유전자 계열의 프로모터, 보다 우선적으로 서열번호: 1의 프로모터 TRPV1 또는 서열번호: 2의 TRPM8이다. 우선적으로, 본 발명에 따른 감각 신경조절인자 또는 감각 신경전달물질을 암호화하는 유전자의 프로모터는 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 4의 CGRP, 또는 신경돌기 성장(outgrowth) 및 감각 뉴우런에서 스트레스 반응에 관여한 유전자의 프로모터, 바람직하게는 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 6의 아드빌린(ADVL)을 암호화하는 유전자의 프로모터이다.
본 발명의 바이러스 발현 벡터는 보다 특히 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 영장류 및 사람에 관한 것이다. 따라서, 당해 분야의 숙련가는 이러한 프로모터가 종에 대해 특이적이며 목적한 특별한 종의 상동성 서열을 선택할 수 있음을 인식할 것이다. 특히, 본 발명에 따른 프로모터는 다른 것들 중에서도 서열 번호: 1의 랫트 TRPV1 또는 서열 번호: 2의 사람 TRPM8, 또는 서열 번호: 3의 랫트 CGRP, 또는 서열 번호: 4의 사람 CGRP, 또는 서열 번호: 5의 랫트 아드빌닌 또는 서열 번호: 6의 사람 아드빌린이다.
"장기간 발현 서열" 또는 "장기간 발현 성분(LTE)"은 바이러스 발현 벡터의 서열 내에 포함된 전사 카세트에 작동적으로 연결되어 15 내지 45일 또는 30 내지 45일 이상, 바람직하게는 45 내지 90일, 보다 바람직하게는 90 내지 365일, 심지어 보다 바람직하게는 365일 내지 수년 또는 심지어 보다 바람직하게는 환자의 일생 동안 유전자 생성물의 발현을 지속하도록 하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
장기간 발현(LTE) 서열은 잠복성-관련 전사체(LAT)의 영역으로서 HSV-1에서 확인되었으며, 이는 LAT-관련된 프로모터(LAP)로부터 기원한다. 이러한 LTE는 LAT 전사 출발 부위의 하부에 위치한다. 실제로, LAT 프로모터의 DNA 단편 3'를 지닌 바이러스는 잠복기 전체에서 검출가능한 프로모터 발현을 유지하였다(Lokensgard et al, 1997, Berthomme et al., 2000, 2001). 바람직하게는, LTE는 LAT 전사 출발 부위의 하부로 약 1.5 kb 내지 약 3 kb 사이에 포함된다(Perng et al., 1996). 보다 최근에, DNA 인슐레이터로 불리는 추가의 서열이 또한 LTE 영역의 상부 및 하부 둘 다에서 기술되었다(Amelio et al., 2006). 이들 서열은 또한, 아마도 후생적 무반응을 억제함으로써 제공된 전사 카세트에 대해 장기간 발현을 제공하는데 기여하며, 또한 본 발명에 LTE 성분의 일부분으로서 포함되어, 전사 카세트에 장기간 발현을 부여할 것이다. 흥미롭게도, 전사 카세트(LTE 및 DNA 인슐레이터 서열 둘 다)에 장기간 발현을 부여하는 서열은 전사 카세트의 상부 및/또는 하부에 위치할 수 있다.
당해 분야의 숙련가는 다른 LTE-유사 서열, 및 다른 DNA 인슐레이터 서열이 기술되어 있으며 연속적으로 발견됨을 인지할 것이다. 모든 이러한 LTE-유사 서열 및 DNA 인슐레이터 서열은 본 발명에 포함된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 바이러스 발현 벡터는 SNARE 복합체의 일부분인, VAMP, SNAP-25 및 신탁신으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 합성을 억제하는 비-암호화 뉴클레오타이드 서열내로 전사된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
SNARE 복합체(가용성 N-에틸말레이미드-민감성 인자 부착 단백질 수용체)는 SM(Sec1/Munc18) 단백질을 지닌 막 융합 기구(machinery)의 2개의 주요 성분 중 하나이다. SNARE 복합체는 소낭-관련 "v-SNAREs"(소낭 관련 막 단백질, VAMP, 특히 VAMP1, 2 및 3) 및 표적 막-관련 "t-SNARE" 신탁신(Syn-1, 2, 3, 및 4) 및 상이한 융합 현상을 매개하기 위해 복합체로 조립되는 25 kDa의 시냅토좀-관련 단백질(SNAP-25)을 포함한다.
따라서, 본 발명의 하나의 구현예는 특이적인 유전자를 무반응시킬 수 있고/있거나 상응하는 암호화된 단백질("목적한 유전자" 또는 "표적화된 유전자" 또는 "선택된 유전자")를 파괴할 수 있는 방법에 관한 것이다. 유전자를 "무반응"한다는 것은, 본 발명자들 유전자 생성물의 발현이 무반응되지 않은 상응하는 대조군 유전자와 비교하여 감소되거나 제거됨을 의미한다. 당해 분야의 기술자는 대조군 대 실험 결과로 수득된 결과를 비교하는 개념에 친숙하다. 이론에 얽메이지 않고, 무반응은 안티센스 RNA(asRNA), 소 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA(miRNA), 또는 어떠한 다른 형태의 방해하는 RNA(iRNA)와 같은 비-암호화 상보성 서열의 세포내로의 발현 후 해독시 특이적인 mRNA 분해 또는 mRNA 차단에 의해 특징화되는 것으로 여겨진다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "안티센스"는 일반적으로 비교적 짧고 세포 속에 존재하는 표적의 전체 혼주물(pool) 속에서 유일한 서열에 하이브리드화할 수 있는 변형되지 않거나 화학적으로 변형된 단일 가닥 핵산 분자에 관한 것이며, 상기 핵산 분자의 서열은 왓슨-크릭 bp 하이브리드화(Watson-Crick bp hybridization)에 의해 특수한 mRNA에 대해 상보성이며 상기 mRNA 발현을 억제하고 이후에 DNA로부터의 단백질로 유전자 정보의 전달 시 차단을 유도할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, "RNA 방해"(이후 RNAi로 지칭됨)는 이에 의해 제공된 센스 핵산 서열을 지닌 이중 가닥 RNA(dsRNA)가 상기 핵산 서열에 대해 특이적인 방식으로, 상기 핵산 서열을 포함하는 모든 전령 RNA(mRNA)의 파단(breakdown)을 야기하는 과정으로 해석된다. RNAi 과정이 카에노르하브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans)에서 원래 입증되었지만, RNAi 과정이 매우 일반적인 현상이며, RNAi에 의한 사람 유전자의 억제가 달성되었다는 것은 현재 명확하다.
RNAi의 과정은 소 방해 RNA(또는 siRNA)를 사용하여 달성할 수 있다. 이러한 siRNA는 표적 mRNA의 단편에 대해 고도로 상보성인 이들의 센스 서열을 포함하는, 길이가 30개 뉴클레오타이드 미만인 dsRNA이다. siRNA가 혈장 막을 교차하는 경우, 세포의 반응은 siRNA 및 고도로 상보성인 서열을 포함하는 서열 모두를 파괴하여야 한다. 따라서, siRNA 서열에 대해 고도로 상보성인 단편을 지닌 mRNA는 파괴될 것이고, 따라서, 이러한 유전자의 발현은 억제된다.
shRNA는 또한 본 발명에 따른 억제제로서 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, "shRNA 분자"는 통상의 줄기-루프(stem-loop) shRNA를 포함하며, 이는 전구체 miRNA(프레-miRNA)를 형성한다. "shRNA"는 또한 마이크로-RNA 포매된 shRNA(miRNA-계 shRNA)를 포함하며, 여기서 miRNA 듀플렉스(duplex)의 가이드 가닥 및 패신저 가닥(passenger strand)은 기존의(또는 천연의) miRNA 내로 혼입되거나 변형되거나 합성(설계된) miRNA로 혼입된다. 전사되는 경우, 통상의 shRNA는 1차 miRNA(프리(pri)-miRNA) 또는 천연의 프리-miRNA와 매우 유사한 구조를 형성한다. 프리-miRNA는 후속적으로 드로샤(Drosha) 및 이의 보조인자에 의해 프레-miRNA로 가공된다. 따라서, 용어 "shRNA"는 프리-miRNA(shRNA-mir) 분자 및 프레-miRNA 분자를 포함한다.
일반적으로, "감소되거나 제거된"은 유전자 생성물의 검출가능한 양을 적어도 약 10% 내지 약 100%, 또는 바람직하게는 적어도 약 25% 내지 100%, 또는 보다 바람직하게는 약 50% 내지 약 100%, 및 가장 바람직하게는 약 75% 내지 약 100%의 범위의 양까지 감소 또는 제거함을 지칭한다. 경우에 따라, 감소 또는 제거는 당해 분야의 기술자에게 잘 공지된 수개의 방법들 중 어느 것으로도 측정할 수 있으며, 무반응되는 유전자에 따라서, 사안별로 변할 수 있다. 예를 들면, 유전자의 발현의 이러한 감소 또는 제거는 유전자 생성물의 정량화에 의해(예컨대, 제조되는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 양을 측정함으로써) 또는 유전자 생성물의 활성(예컨대, 시그널링과 같은 활성 또는 수송 활성, 세포의 구조 성분으로서의 활성, 효소 활성과 같은 활성 등)의 정량화에 의해, 또는 대조군 세포와 비교하여(예컨대, 특이적인 항체를 사용한 단백질의 존재 또는 부재) 표적화된 세포의 표현형적 특징의 관찰 및 정량화에 의해 측정할 수 있다. 표적화된 유전자가 무반응되었는지의 여부를 측정하는 어떠한 적합한 수단도 사용할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 비-암호화 뉴클레오타이드 서열은 안티센스 RNA(asRNA), 소 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 또는 임의의 다른 간섭 RNA(iRNA)로부터 선택되며, 이는 VAMP, SNAP-25 및 신탁신으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 합성을 억제한다.
일 구현예에서, 바이러스 발현 벡터는 VAMP, SNAP-25 및/또는 신탁신의 합성을 억제하는 asRNA내로 전사되는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특히, 본 발명의 맥락에서 사용된 asRNA의 서열은 서열 번호: 7의 VAMP2 안티센스, 서열 번호: 8의 SNAP25 안티센스 및 서열 번호: 9의 신탁신 안티센스이다.
특수한 구현예에서, 바이러스 발현 벡터는 VAMP, SNAP-25 및/또는 신탁신의 합성을 억제하는 shRNA 내로 전사되는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 바이러스 발현 벡터는 VAMP, SNAP-25 및/또는 신탁신의 합성을 억제하는 miRNA내로 전사되는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 작제물에 의해 암호화되는 RNA 분자는 궁극적으로 이것이 전사되는 세포 내에서 이중 가닥 RNA 분자를 형성한다. 일반적으로 이중 가닥 RNA 구조의 하나의 가닥은 길이가 약 10 내지 약 30개의 리보뉴클레오타이드, 및 바람직하게는 길이가 약 19 내지 약 25개의 리보뉴클레오타이드의 범위일 것이다.
asRNA의 경우에, 이중 가닥 RNA 구조물 중의 하나는 길이가 약 100 내지 수백개의 리보뉴클레오타이드의 범위일 것이다. 실제로 이것은 표적 mRNA와 같이 길 수 있다. 당해 분야의 기술자는 몇가지 가변적인 전략이 이러한 이중 가닥 RNA를 형성하기 위해 존재함을 인식할 것이다.
더욱이, 동일한 구심성 뉴우런-특이적인 프로모터를 지니지만 상이한 무반응 RNA를 암호화하는 다수의 바이러스 벡터의 제공이 본 발명의 실시 내에서 사용될 수 있다.
또한, 단일의 구심성 뉴우런-특이적인 프로모터에 의해, 또는 탄뎀으로 정렬된 하나 이상의 프로모터(예컨대, 2개 이상의 프로모터)에 의해 구동된, 단일 바이러스 벡터내 하나 이상의 무반응 RNA를 발현시키는 것이 가능하여야 한다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 유전자를 무반응시키기 위한 단일 바이러스 벡터를 사용함을 고려한다.
다른 구현예에서, 본 발명에 따른 바이러스 발현 벡터는 SNARE 복합체 또는 리보좀 복합체를 파괴하는 변형된 독소 또는 야생형 독소를 암호화하거나 이의 활성 단편을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
유리하게는, 독소의 활성 단편은 세균 신경독소이며, 우선적으로 상기 세균 신경독소는 상기 세균 신경독소의 경쇄이다. 특히, 본 발명의 맥락에서 사용된 독소 경쇄의 서열은 서열번호: 10(서열 번호: 11의 뉴클레오타이드 서열을 암호화함)의 단백질 서열 경쇄, 서열 번호: 12(서열 번호: 13의 뉴클레오타이드 서열을 암호화함)의 보툴리늄 신경독소 B(BoNT-A)의 단백질 서열 경쇄, 서열 번호: 14(서열 번호; 15의 뉴클레오타이드 서열을 암호화함)의 보툴리늄 신경독소 C1(BoNT-C1)의 단백질 서열 경쇄, 서열 번호: 16(서열 번호: 17의 뉴클레오타이드 서열을 암호화함)의 보툴리늄 신경독소 E3(BoNT-E3)의 단백질 서열 경쇄, 서열 번호: 18(서열 번호: 19의 뉴클레오타이드 서열을 암호화함)의 보툴리늄 신경독소 F1(BoNT-F1)의 단백질 서열 경쇄 및 서열 번호: 20(서열 번호: 21의 뉴클레오타이드 서열을 암호화함)의 테타닉(tetanic) 신경독소(TeNT)의 단백질 서열 경쇄이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 바이러스 발현 벡터는 야생형 또는 변형된 GAD67 단백질을 암호화하거나 이의 활성 단편을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열, 우선적으로 서열 번호: 22(서열 번호: 23의 뉴클레오타이드 서열을 암호화함)의 야생형 GAD67 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 바이러스 발현 벡터는 야생형 또는 변형된 RIP 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 우선적으로 상기 RIP는 서열 번호: 24(서열 번호: 25의 뉴클레오타이드 서열을 암호화함)의 사포린 S6 단백질 또는 이의 활성 단편이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 바이러스 발현 벡터는 야생형 또는 변형된 NTR 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 우선적으로 상기 NTR은 서열 번호: 26(서열 번호: 27의 뉴클레오타이드 서열을 암호화함)의 니트로리덕타제 nfnB 단백질 또는 이의 활성 단편이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "암호화 서열"은 해독되는 경우, 목적한 폴리펩타이드를 생산하는 리보핵산(예컨대, RNA) 서열을 지칭한다. 폴리펩타이드는 완전한 길이의 암호화 서열에 의해 또는 완전한 길이 또는 단편의 바람직한 활성 또는 기능적 특성(예컨대, 효소 활성, 리간드 결합, 시그널 형질도입 등)이 보유되는 한 암호화 서열의 임의의 일부분에 의해 암호화될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 임의의 혈청형의 클로스트리디움 보툴리늄(Clostridium botulinum)의 야생형 또는 변형된 보툴리늄 신경독소 또는 이의 활성 단편, 바람직하게는 임의의 혈청형의 클로스트리디움 보툴리늄 신경독소의 경쇄를 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani)의 야생형 또는 변형된 테타누스 신경독소, 바람직하게는 클로스트리디움 테타니 신경독소를 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 발현 벡터에 관한 것이다.
클로스트리디움 신경독소는 클로스트리디움 속(genus)의 다양한 종, 예를 들면, 씨. 보툴리늄(C. botulinum) 및 씨. 테타니(C. tetani)의 몇가지 균주에 의해 생산된다. 클로스트리디움 독소 분자가 뉴우런으로 도입되면, 경쇄가 시냅스 신경 말단에 위치한 SNARE 복합체를 형성하는 단백질을 파괴한다. 이는 신경전달물질이 충전된 시냅스 소낭이 시냅스 막에 대해 부착하는 것을 방지하므로, 전시냅스 신경 말단으로부터 신경전달물질의 배출작용(exocytosis)을 억제한다. 현재, 공지된 신경독소의 8개의 상이한 부류가 존재한다: 이의 혈청형 A, B, C, D, E, F 및 G의 테타누스 독소 및 보툴리늄 신경독소, 이들 모두는 상동성 및 유사한 분자 구조를 공유한다. 상기 혈청형 내에서, 서브형(subtype) A1-A3, B1-B3 등과 같은 서브-유형이 또한 잘 문서화되어 있다.
보툴리늄 신경독소 혈청형 A, C, 및 E는 전시냅스 신경 말단의 혈장 막에 위치한 SNAP-25 단백질을 절단한다. SNAP-25는 신경전달물질이 충전된 소낭과 혈장막의 융합 및 배출작용 동안 이들의 방출에 필수적이므로, 이의 절단은 체세포 및 자율성 전시냅스 신경 말단에서 소낭 신경전달물질 방출의 고도로 특이적인 차단을 유발한다. 보툴리늄 신경독소 혈청형 B, D, F, 및 G는 시냅토브레빈(VAMP) 단백질을 절단하므로, 소낭은 세포 막에 융합할 수 없다. 각각의 보툴리늄 신경독소 또는 이의 경쇄 단편은 SNAP25 및 신탁신 1a 둘 다를 절단하는, 보툴리늄 신경독소 C, 또는 이의 경쇄 단편을 제외하고는 SNARE 단백질 중 하나를 절단한다. 바람직하게는, 본 발명에 따라서 보툴리늄 신경독소의 혈청형은 A, B, C, E 및 F이다.
클로스트리디움 신경독소의 구조는 잘-문서화되어 왔으며(Habermann et al, 1986; Sugiyama et al 1980); 이들 문서 각각은 이의 전문이 참고로 본원에 포함된다]. 이와 관련하여, 클로스트리디움 신경독소는 2개의 폴리펩타이드 쇄, 즉 이황화물 결합에 의해 서로 결합된, 분자량이 대략 100 kDa인 중쇄(H-쇄), 및 분자량이 대략 50 kDa인 경쇄(L-쇄)를 포함한다.
보툴리늄 독소의 상이한 혈청형은 이들이 영향을 미치는 동물 종 및 이들이 유발하는 마비의 중증도 및 기간에 있어서 다양하다. 예를 들면, 보툴리늄 독소 A형은 마우스에서 LD50에 의해 측정된 것으로서, 보툴리늄 독소 B형보다 500배 이상 강력하다. 또한, 보툴리늄 독소 B형은 보툴리늄 독소 A형의 경우 영장류 LD50의 약 12배인 480 U/kg의 용량에서 영장류에서 무-독성인 것으로 측정되었다. 천연적으로, 보툴리늄 독소는 뉴우런에 고 친화성으로 결합하며, 뉴우런내로 전좌되어 신경전달물질의 방출을 차단한다.
특수한 구현예에서, 본 발명은 클로스트리디움 테타니의 야생형 또는 변형된 테타누스 신경독소를 암호화하거나 이의 활성 단편을 암호화함으로써 단백질 VAMP-2를 절단하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 발현 벡터에 관한 것이다.
특수한 구현예에서, 본 발명은 혈청형 B, D, F, 및 G의 클로스트리디움 보툴리늄의 야생형 또는 변형된 보툴리늄 신경독소를 암호화하거나 이의 활성 단편을 암호화함으로써 단백질 VAMP-2를 절단하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 발현 벡터에 관한 것이다.
특수한 구현예에서, 본 발명은 혈청형 A 및 E의 클로스트리디움 보툴리늄의 야생형 또는 변형된 보툴리늄 신경독소 또는 이의 활성 단편을 암호화함으로써 단백질 SNAP-25를 절단하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 발현 벡터에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 혈청형 C의 클로스트리디움 보툴리늄의 야생형 또는 변형된 보툴리늄 신경독소 또는 이의 활성 단편을 암호화함으로써 단백질 SNAP-25 및 신탁신 1a를 절단하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 발현 벡터에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 전이유전자의 뉴클레오타이드 서열은 시그널 펩타이드 도메인에 융합된 시냅스후 세포내 신경전달물질 시그널의 형질도입을 무반응시키거나 억제하는 야생형 또는 변형된 단백질을 암호화한다. 본 발명에 따른 시그널 펩타이드는 시냅스후 세포내 신경전달물질의 시그널을 무반응시키거나 억제하도록 표적화된 전사체 또는 단백질이 위치하는 세포내 구획에 따라 선택된다. 따라서, 당해 분야의 기술자는 이러한 시그널 펩타이드가 세포내 구획에 대해 특이적이며 본 발명에 따른 신경전달 또는 시냅스 전달을 무반응시키거나 억제하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 융합된 적절한 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 선택할 수 있음을 인식할 것이다. 특히, 본 발명에 따른 시그널 펩타이드는 적어도 VAMP2 또는 신탁신 1a로부터 선택된 단백질의 내강의(luminal) 전이막 또는 세포질성 도메인을 포함한다.
특수한 구현예에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 내강의 전이막 또는 세포질성 시그널 펩타이드 도메인, 우선적으로 SNARE 단백질의 내강의 전이막 또는 세포질성 시그널 펩타이드 도메인, 물질 P 또는 CGRP 서열로부터 선택된 시그널 펩타이드 도메인을 포함한다. 이러한 시그널 펩타이드 도메인은 서열 번호: 30(서열 번호: 31의 뉴클레오타이드 서열을 암호화함)의 신탁신 1a(BoNTB-STX) 및 서열 번호: 32(서열 번호: 33의 뉴클레오타이드 서열을 암호화함)의 VAMP2(BoNTC-VAMP)의 시그널 펩타이드를 포함한다. 따라서, 본 발명의 특수한 구현예에 따라서, 융합 단백질은 예컨대, 변형된 보툴리늄 신경독소와 같은 변형된 세균 신경독소, 및 예컨대, 서열 번호: 28의 1a(BoNTA-STX) 또는 서열 번호: 30(서열 번호: 31의 뉴클레오타이드 서열을 암호화함)의 (BoNTB-STX) 및 서열 번호: 32(서열 번호: 33의 뉴클레오타이드 서열을 암호화함)의 VAMP2(BoNTC-VAMP)의 시그널 펩타이드와 같은 시그널 펩타이드를 포함한다.
하나의 특수한 구현예에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 신탁신 1a의 시그널 펩타이드에 연결된 혈청형 A, B, C, E 또는 F의 야생형 또는 변형된 클로스트리디움 보툴리늄 신경독소를 포함하며, 우선적으로 융합 단백질은 서열 번호: 28(서열 번호: 29의 뉴클레오타이드 서열을 암호화함)의 신탁신 1a(BoNTA-STX)의 시그널 펩타이드에 연결된 혈청형 A의 야생형 또는 변형된 클로스트리디움 보툴리늄 신경독소를 포함하거나, 융합 단백질은 서열 번호: 30(서열 번호: 31의 뉴클레오타이드 서열을 암호화함)의 신탁신 1a(BoNTA-STX)의 시그널 펩타이드에 연결된 혈청형 B의 야생형 또는 변형된 클로스트리디움 보툴리늄 신경독소를 포함한다.
하나의 구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 VAMP2의 시그널 펩타이드에 연결된 혈청형 A, C 및 E의 야생형 또는 변형된 클로스트리디눔 보툴리늄 신경독소를 포함하고, 우선적으로 융합 단백질은 서열 번호: 32(서열 번호: 33의 뉴클레오타이드 서열을 암호화함)의 VAMP2(BoNTC-VAMP)의 시그널 펩타이드에 연결된 혈청형 C의 야생형 또는 변형된 클로스트리디움 보툴리늄 신경독소를 포함한다.
하나의 구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 물질 P의 시그널 펩타이드에 연결된 임의의 혈청형의 야생형 또는 변형된 클로스트리디움 보툴리늄 신경독소를 포함한다.
하나의 구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 CGRP 서열의 시그널 펩타이드에 연결된 임의의 혈청형의 야생형 또는 변형된 클로스트리디움 보툴리늄 신경독소를 포함한다.
본 발명은 또한 적어도:
a) 클로스트리디움 테타니 또는 보툴리늄의 야생형 또는 변형된 신경독소 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 하나의 뉴클레오타이드 서열; 및/또는
b) 이의 전사체가 단백질 VAMP, SNAP-25 및/또는 신탁신의 합성을 억제하는 하나의 뉴클레오타이드 서열; 및/또는
c) 야생형 또는 변형된 GAD67 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 하나의 뉴클레오타이드 서열; 및/또는
d) 야생형 또는 변형된 RIP 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 하나의 뉴클레오타이드 서열; 및/또는
e) 야생형 또는 변형된 NTR 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 본 발명에 따른 바이러스 발현 벡터에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 바이러스 발현 벡터는:
i. 본 발명에 따른 2개의 전사 카세트에 작동적으로 연결된 하나의 상기 장기간 발현 서열; 또는
ii. 둘 다 본 발명에 따른 하나의 상기 전사 카세트에 작동적으로 연결된 2개의 장기간 발현 서열을 포함하고; 여기서:
a) 본 발명에 따른 하나의 전사 카세트는 본 발명에 따른 암호화 서열을 지니며, 본 발명에 따른 제2의 전사 카세트는 본 발명에 따른 비-암호화 뉴클레오타이드내로 전사된 서열을 지니거나;
b) 본 발명에 따른 전사 카세트 둘 다는 본 발명에 따른 비-암호화 뉴클레오타이드 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 지니거나;
c) 본 발명에 따른 전사 카세트 둘 다는 클로스트리디움 테타니 및/또는 보툴리늄의 야생형 또는 변형된 신경독소 또는 이의 활성 단편; 또는 야생형 또는 변형된 GAD67 단백질 또는 이의 활성 단편; 또는 야생형 또는 변형된 RIP 또는 이의 활성 단편; 또는 야생형 또는 변형된 NTR 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 지닌다.
특수한 구현예에서, 본 발명은 바이러스 발현 벡터에 관한 것이며, 여기서
i. 하나의 상기 장기간 발현(LTE) 서열은 본 발명에 따른 2개이 전이유전자성 전사 카세트에 작동적으로 연결되거나;
ii. 2개의 별개의 장기간 발현(LTE) 서열은 본 발명에 따른 하나의 상기 전사 카세트에 각각 작동적으로 연결되며; 여기서:
a) 본 발명에 따른 하나의 전사 카세트는 본 발명에 따른 세균 신경독소, GAD67, RIP, 또는 NTR을 암호화하는 서열을 지니고, 본 발명에 따른 제2의 전이유전자성 전사 카세트는 단백질 VAMP, SNAP-25 및/또는 신탁신의 합성을 억제하는 본 발명에 따른 비-암호화 뉴클레오타이드 서열내로 전사된 서열을 지니거나;
b) 본 발명에 따른 전사 카세트 둘 다는 VAMP, SNAP-25 및/또는 신탁신으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 합성을 억제하는 본 발명에 따른 비-암호화 뉴클레오타이드 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 지니거나;
c) 본 발명에 따른 전이유전자성 전사 카세트 둘 다는 프로모터 및 클로스트리디움 테타니 및/또는 보툴리늄의 야생형 또는 변형된 신경독소 또는 이의 활성 단편; 또는 야생형 또는 변형된 GAD67 단백질 또는 이의 활성 단편; 또는 야생형 또는 변형된 RIP 또는 이의 활성 단편; 또는 야생형 또는 변형된 NTR 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 지닌다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 바이러스 발현 벡터에 관한 것이며, 여기서 본 발명에 따른 상기 전이유전자성 전사 키세트 중 적어도 하나는 프로모터 및 야생형 단백질 GAD67 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 서열을 지닌다.
보다 바람직한 구현예에서, 본 발명은 바이러스 발현 벡터에 관한 것이며, 여기서 본 발명에 따른 상기 전이유전자성 전사 카세트 중 하나는 프로모터 및 야생형 단백질 GAD67 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 서열을 지니고; 본 발명에 따른 상기 전이유전자성 전사 카세트 중 하나는 프로모터 및 클로스트리디움 테타니 및/또는 보툴리늄의 야생형 또는 변형된 신경독소 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 서열을 지닌다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 바이러스 발현 벡터에 관한 것이며, 여기서 본 발명에 따른 상기 전이유전자성 전사 키세트 중 적어도 하나는 프로모터 및 야생형 RIP 또는 이의 단편을 암호화하는 서열을 지닌다.
보다 바람직한 구현예에서, 본 발명은 바이러스 발현 벡터에 관한 것이며, 여기서 본 발명에 따른 상기 전이유전자성 전사 카세트 중 하나는 프로모터 및 야생형 RIP 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 서열을 지니고; 본 발명에 따른 상기 전이유전자성 전사 카세트 중 하나는 프로모터 및 클로스트리디움 테타니 및/또는 보툴리늄의 야생형 또는 변형된 신경독소 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 서열; 및/또는 야생형 단백질 GAD67 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 서열, 및/또는 야생형 NTR 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 서열을 지닌다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 바이러스 발현 벡터에 관한 것이며, 여기서 본 발명에 따른 전이유전자성 전사 카세트 중 적어도 하나는 프로모터 및 야생형 NTR 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 서열을 포함한다.
보다 바람직한 구현예에서, 본 발명은 바이러스 발현 벡터에 관한 것이며, 여기서 상기 바이러스 발현 벡터는 적어도 2개의 전이유전자성 전사 카세트를 포함하고, 여기서:
- 본 발명에 따른 상기 전이유전자성 전사 카세트 중 적어도 하나는 프로모터 및 야생형 NTR 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 서열을 포함하고;
- 본 발명에 따른 상기 전이유전자성 전사 카세트 중 적어도 하나는 프로모터 및 클로스트리디움 테타니 및/또는 보툴리늄의 야생형 또는 변형된 신경독소 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 서열; 및/또는 야생형 단백질 GAD67 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 서열; 및/또는 야생형 RIP 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 서열을 포함한다.
제2 국면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 바이러스 발현 벡터를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
제3 국면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 바이러스 발현 벡터를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
유리하게는, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 NDO의 치료용으로 사용된다.
본 발명은 또한:
a) VAMP, SNAP-25 및 신탁신으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 합성을 억제하기 위한, 바람직하게는 안티센스 RNA (asRNA), 소 헤어핀(small hairpin) RNA (shRNA) 또는 마이크로RNA (miRNA), 보다 바람직하게는 안티센스 RNA (asRNA)로부터 선택된, 비-암호화 뉴클레오타이드 서열내로 전사된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 바이러스 발현 벡터; 및/또는
b) SNARE 복합체를 붕괴시키는 야생형 또는 변형된 세균 신경독소 또는 이의 활성 단편, 바람직하게는 세균 신경독소의 경쇄를 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 바이러스 발현 벡터(여기서, 상기 세균 신경독소는 유리하게는 임의의 혈청형, 바람직하게는 혈청형 A, B, C, E 및 F의 클로스트리디움 테타니 및/또는 클로스트리디움 보툴리늄의 신경독소이다); 및/또는
c) - 클로스트리디움 테타니 또는 보툴리늄의 야생형 또는 변형된 신경독소 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 하나의 뉴클레오타이드 서열, 및
- 이의 전사체가 단백질 VAMP, SNAP-25 및/또는 신탁신의 합성을 억제하는 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 바이러스 발현 벡터; 및/또는
d) 본 발명에 따른 적어도 하나의 바이러스 발현 벡터를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이며, 여기서
i. 하나의 상기 장기간 발현(LTE) 서열은 본 발명에 따른 2개의 전이유전자성 전사 카세트에 작동적으로 연결되거나;
ii. 2개의 장기간 발현(LTE) 서열은 각각 본 발명에 따른 하나의 상기 전이유전자성 전사 카세트에 작동적으로 연결되고; 여기서:
- 본 발명에 따른 하나의 전이유전자성 전사 카세트는 프로모터 및 상기 신경독소를 암호화하는 서열을 지니고, 본 발명에 따른 제2의 전이유전자성 전사 카세트는 프로모터 및 단백질 VAMP, SNAP-25 및/또는 신탁신의 합성을 억제하는 서열 뉴클레오타이드를 지니거나;
- 본 발명에 따른 전이유전자성 전사 카세트 둘 다는 프로모터 및, VAMP, SNAP-25 및/또는 신탁신으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 합성을 억제하는 비-암호화 뉴클레오타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 지니거나;
- 본 발명에 따른 전이유전자성 전사 카세트 둘 다는 NDO를 치료하기 위해 동시, 별도 또는 시차를 둔 사용을 위한 클로스트리디움 테타니 및/또는 보툴리늄의 야생형 또는 변형된 신경독소 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 지닌다.
특수한 구현예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 야생형 단백질 GAD67 및/또는 RIP 및/또는 NTR, 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 바이러스 발현 벡터를 추가로 포함한다.
특수한 구현예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 야생형 단백질 GAD67 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열; 및/또는 클로스트리디움 테타니 및/또는 보툴리늄의 야생형 또는 변형된 신경독소; 및/또는 이의 활성 단편; 및/또는 야생형 RIP 또는 이의 활성 단편; 및/또는 야생형 NTR 또는 이의 활성 단편를 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 바이러스 발현 벡터를 포함한다.
제4의 국면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 바이러스 발현 벡터 또는 약제학적 조성물, 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물, 및 간혈적인 자극 펄스 훈련을 적용하여, 요도 괄약근 이완 간격으로 지속적인 배뇨근 근육 수축을 달성하여 뇨가 방뇨되도록 하기 위한, S2-S3-S4와 같은 천골 전방 루트(root)에 이식될 전극을 포함하는 전기 자극 시스템을 포함하는 키트(kit)에 관한 것이다.
"전기적 자극"은 본원에서, 전기적 자극이 전극을 통해 수초의 버스트(burst)로, 보다 길게 떨어져서 적용되어 방광내 압력을 유지하는 한편, 외부 방광 괄약근이 버스트 사이에서 신속하게 이완되어, 뇨가 이들 갭 사이에서 흐르도록 함을 의미한다. 바람직한 전기적 자극 시스템은 파인테크-브린들리 자극기(Finetech-Brindley stimulator)(참고: 6 a 19 in Ren et al, 2015)이다.
본 발명은 또한:
a) 본 발명에 따른 적어도 하나의 바이러스 발현 벡터를 제조하는 단계;
b) 단계 a)의 바이러스 발현 벡터를 방광 벽(배뇨근 근육) 내에 주사하는 단계;
c) 천골 전방 루트에 이식된 전극을 통해, S2-S4 또는 S3-S4와 같은 전기 자극 시스템을 이식시켜, 보다 긴 갭으로 떨어진, 수초간의 버스트로 자극에 의해 방광내에 지속적인 압력을 유발하면서, 외부 요도 괄약근이 버스트들 사이에서 신속하게 이완되어 뇨가 방뇨되도록 하는 단계를 포함하는, NDO를 앓는 환자의 치료방법에 관한 것이다.
다음의 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것이다.
도면의 설명
도 1. 재조합 결손 HSV-1 벡터의 게놈.
(A): 도면의 상부는 본 발명에 사용된 HSV-1 게놈의 골격을 기술한다. HSV-1 게놈은 말단 반복체 L/역위된 반복체 L(TRL/IRL) 및 역위된 반복체 S/말단 반복체 S (IRS/TRS)로 알려진, 반복된 역위된 서열에 의해 각각 접하고 있는 유일한 긴(Unique Long: UL) 및 유일한 짧은(US)으로 공지된 2개의 유일한 영역을 포함한다. TRL/IRL은 또한 ab/b'a'로 명명되는 반면, IRS/TRS는 또한 a'c'/ca로 명명된다. 따라서 게놈은 직접적인 반복 서열 'a'에 의해 시작하고 끝난다. UL 내 검정색 사각형은 필수 ICP27 단백질을 암호화하는 유전자가 본 발명에서 사용된 벡터 내에서 결실되어 있음을 나타낸다. 유사하게, IRS/TRS 반복체 내에서 2개의 검정색 사각형은 필수 ICP4 단백질을 암호화하는 2개의 유전자가 또한 결실되어 있음을 나타낸다. UL내 백색 원, 및 IRS 및 TRS 영역 내 2개의 백색 원은 HSV-1의 DNA 복제의 기원(각각 OriL 및 2개 카피의 OriS)을 나타낸다. UL41, UL55 및 UL56과 같은 비-필수 단백질을 암호화하는 다른 유전자도 또한 결실될 수 있다. 또한, IRS 및 TRS 내에 위치한 IE4/5 프로모터의 카피 둘 다는 이들 프로모터가 조기 동력학(early kinetics)(야생형 바이러스 게놈에서와 같은 즉시-조기 동력학(immediate-early kinetics) 대신에)으로 발현하는 방식(하나의 TAATGARAT 서열의 결실)으로 변형된다.
(B): 도면의 중간 부분은 바이러스 게놈의 b'a'a'c' 영역의 세부사항을 나타내며, 이는 특히 IRL 영역내 LAT 유전자자리(locus)의 국재화를 나타내고, 이는 잠복성 관련 전사체(LAT)를 발현하는 유전자를 함유한다.
(C 및 C'): 도면의 하부 부분은 치료학적 DRG-특이적인 전사 카세트(도면에서 화살표 표지된 전이유전자로 나타냄)를 수반하는 LAT 유전자자리의 5' 부분의 상세한 구조를 나타낸다. 이러한 유전자자리는 상부 DNA 인슐레이터(INS) 서열, 잠복성 관련 프로모터(LAP), 장기간 발현(LTE)을 부여하는 영역 및 하부 DNA 인슐레이터(INS)를 포함한다. 치료학적 DRG-특이적인 전사 카세트는 LAP와 LTE 사이(C에서 부위 1) 또는 LTE와 제2의 DNA 인슐레이터 사이(C'에서 부위 2)에 도입된다. LAT의 부근의 다른 유전자는 또한 B(화살표)에서 나타낸다. LAT 영역내로 도입되어 재조합 벡터를 생성하는 상이한 DRG-특이적인 전사 카세트는 도 3에 나타낸다. 영역 b'a'a'c'가 역위된 caab 영역과 동일하다는 것이 강조되어야 하며, 이는 바이러스 게놈이 감염의 개시시 세포 핵 내에서 환형으로 되는 경우 형성된다. 이는 ICP4의 카피 둘 다가 결실되고 전이유전자 전사 카세트가 LAT 유전자자리의 카피 둘 다에 도입될 수 있음을 의미한다.
도 2. 앰플리콘 벡터의 게놈(앰플리콘 플라스미드)
앰플리콘 플라스미드는 3개의 모듈(module)을 수반하는 표준 이. 콜라이 플라스미드이다: (1) 세균 내에서 플라스미드 복제를 위한 Col E1 서열, 및 항생제, 일반적으로 암피실린에 대해 내성을 부여하는 유전자를 함유하는 세균 모듈(검정색), (2) DNA 복제의 HSV-1 오리진, 일반적으로 OriS(O), 및 (a) 앰플리콘 플라스미드의 콘카티머 형태의 증폭 및 패키징을 허용하는 패키징 시그널 (a)를 함유하는 앰플리콘 모듈(분홍색); 또한 이러한 모듈은 일반적으로 리포터 단백질(본 발명자들의 경우, GFP 단백질, 또는 HSV-1 이미디에이트 얼리 프로모터 IE4/5에 의해 구동된 융합 GFP/레닐라 루시퍼라제(rLuc) 단백질). (3) 본 발명에 기술된 바와 같이, 감각 뉴우런 내에서 안정적으로 및 선택적으로 신경전달을 억제하거나 무반응하도록 설계된, 서열분석된 LTE와 INS 사이에 위치한 DRG-특이적인 전사 카세트(회색 화살표 표지된 전이유전자)를 함유하는 전사 단위인 제3 모듈(백색). 앰플리콘 벡터를 생성하기 위해 앰플리콘 플라스미드내로 도입된 상이한 전사 카세트는 도 3에 나타나 있다.
도 3. A. 본 도면은 2개의 진핵 세포 전사 카세트를 수반하는 본 발명에서 사용된 앰플리콘 벡터의 게놈의 영역을 나타낸다. 이들 중 하나는 HSV-1의 IE4/5 이미디어트-얼리 프로모터의 제어 하에서 리포터 GFP(또는 융합 GFP-rLuc) 유전자를 발현한다. 제2의 전사 카세트는 본 발명에 기술된 바와 같은, 신경전달을 억제 또는 무반응시키는 치료학적 기능 중 어느 것도 발현한다. DRG-특이적인 프로모터는 전사 카세트의 발현을 구동하는 반면, 전체 카세트는 장기간 발현을 부여하는 서열에 의해 둘러싸여 있다(검정색 사각형). B. 본 도면은 유전자 작제물의 효능 및 선택성을 입증하는 본 연구에 사용된 전사 카세트 중 일부를 나타낸다. 이들은 벡터 A: HCMV-TeNT 경쇄(LC); 벡터 B: HCMV-BoNT-A(LC); 벡터 C: HCMV-BoNT-C(LC); 벡터 D: SNAP25 안티센스 RNA; 벡터 E: HCMV-루시퍼라제; 벡터 F: TRPV1-루시퍼라제. BoNT-A(LC) 및 BoNT-C(LC)는 효율적인 항-BoNT 항체가 이용가능하지 않으므로, C-말단 HIS-태그를 발현하는 융합 단백질이다. HCMV는 강력하고 편재된 바이러스 프로모터인 반면, TRPV1은 DRG-선택성 프로모터이다. 다른 보툴리늄 독소, 또는 융합 SNARE/경쇄 독소, 또는 다른 SNARE 단백질, 또는 사람 GAD67 단백질, 또는 사포린 S6과 같은 RIP 단백질에 초점을 맞춘 안티센스 RNA는 본 도면에 나타나 있지 않다.
도 4는 Gli36(사람 교아종으로부터 기원한 세포주) 및 BHK21(햄스터 섬유모세포 세포)에서 BoNT-A(LC), BoNT-C(LC) 및 TeNT(LC)의 발현을 나타낸다. Gli36 및 BHK21 세포를 앰플리콘 벡터 HCMV-Luc, HCMV-BoNT-A(LC), HCMV-BoNT-C(LC), 또는 HCMV-TeNT(LC)(도 2b에 나타냄)로 감염시켰다. 이후에, 감염된 세포를 고정시키고, 독소의 발현을 특이적인 항체를 사용하여 웨스턴 검정에서 입증하였다. 항-TeNT 항체를 사용하여 TeNT(LC)를 나타내고; 항-HIS 항체를 사용하여 BoNT-A(LC) 및 BoNT-C(LC) 둘 다를 나타내었다.
도 5는 Gli36 세포에서 발현되며 세포 추출물 속에 존재하는 독소 TeNT(LC)가 VAMP2와 관련하여 단백질분해 활성을 지님을 나타낸다. Gli36 세포를 1의 감염다중도(MOI)에서 HCMV-TeNT(LC)를 발현하는 앰플리콘 벡터로 감염시켰다. 감염은 2일 후 종료하고 단백질 추출물을 제조하였다. 이들 추출물을 TeNT의 표적 단백질, 즉 VAMP2를 함유하는 적합한 완충액(50 mM Hepes, 400 mM NaCl, 5 mM 디티오트레이톨 및 2 μM ZnSO4) 속에서 항온처리하였다. 37℃에서 24시간 동안 2.5, 5, 및 10 μL의 세포 추출물과 함께 항온처리한 후, 웨스턴 블롯을 항-VAMP2 항체를 사용하여 수행함으로써 TeNT(LC) 발현의 단백질분해 활성을 나타내었다.
도 6a는 사람 신경모세포종 SH-S5Y5 세포를 HCMV-BoNT-A(LC)를 발현하는 앰플리콘 벡터로 형질감염시킨 후(hpi) 48시간 째에(참고: 도 3의 B), 루시퍼라제(HCMV-Luc)를 발현하는 벡터로 감염되거나 감염되지 않은(Mock) 대조군 세포와 비교하여 SNAP25 단백질 수준의 세포내(in cellulo) 유의적인 감소가 있음을 나타낸다. 단백질 수준은 항-SNAP25 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 검정으로 검출하였다. BoNT-A(LC)가 SNAP25를 2개의 단편으로 절단함에 주목한다. 이러한 시험에 사용된 항체는 천연의 SNAP25 단백질(상부 밴드) 및 절단된 단백질의 큰 단편(하부 밴드) 둘 다를 인식한다. 도 6b는 사람 신경모세포종 SH-S5Y5 세포를 HCMV-BoNT-C(LC)를 발현하는 신경모세포종으로 감염 후(hpi) 48시간 째에(참고: 도 3의 B), 루시퍼라제(HCMV-Luc)를 발현하는 벡터로 감염되거나 감염되지 않은(Mock) 대조군 세포에 비해 SNAP25 및 신탁신(STX) 단백질 수준 둘 다의 세포내 유의적인 감소가 있음을 나타낸다. 단백질 수준은 항-SNAP25 및 항-STX 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 검정으로 검출하였다. BoNT-C(LC)는 SNAP25를 2개의 단편으로 절단함에 주목한다. 이러한 실험에 사용된 항체는 천연의 SNAP25 단백질(상부 밴드) 및 절단된 단백질의 큰 단편(하부 패널)을 인식한다.
도 7. 재조합 및 앰플리콘 벡터 게놈에 의해 수반된 전사 카세트
본 도면은 재조합체 및 앰플리콘 HSV-1 벡터에 의해 수반되어 발현된 전사 카세트 중 일부를 나타낸다. 이러한 전사 카세트는 3개의 계열로 분류된다. A2 계열의 구성원은 강하고 편재하는 HCMV 프로모터에 의해 구동된, 상이한 치료학적 유전자 생성물(단백질 또는 안티센스 RNA 또는 miRNA)을 발현하는 전사 카세트이다. A2 전사 카세트를 수반하는 벡터를 사용하여 신경전달에 대한 이들 유전자 생성물의 영향(SNARE 단백질의 절단 및 신경전달물질 방출의 억제)을 연구함으로써, 본 발명의 맥락에서 가장 효율적인 전이유전자를 선택하도록 한다. A5 계열의 구성원은 상이한 DRG-선택적인 후보물 프로모터에 의해 구동된 리포터 유전자 반딧불이 루시퍼라제(fLuc)를 발현하는 전사 카세트이다. 이들 벡터를 사용하여 배양된 뉴우런 및 체외이식된(explanted) 말초 신경절내 발현의 강도, 선택성, 및 기간을 연구함으로써, 본 발명의 맥락에서 가장 선택적인 벡터를 확인하도록 한다. 최종적으로, 벡터의 A8 계열의 구성원은 치료학적 전사 카세트(DRG-선택적인 프로모터에 의해 구동된 치료학적 유전자 생성물)를 발현함으로써, 본 발명의 맥락에서, 고 치료학적 잠재성을 지닌 벡터를 생체내에서 선택하도록 한다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 앰플리콘 벡터는 또한 HSV-1 IE4/5 프로모터에 의해 구동된 GFP/rLuc 전이유전자를 발현한다.
약어:
유전자 생성물:
TeNT: 테타누스 신경독소의 경쇄
BoNT-X: 보툴리늄 신경독소 BoNT-A, -B, -C, -D, -E, 또는 F의 경쇄
BoNT-X-SNARE-Y: 보툴리늄 신경독소의 경쇄가 SNARE 단백질의 시그널 및 전이막 펩타이드에 융합된 융합 단백질. 보다 구체적으로, 이러한 전이유전자는 BoNT-A-신탁신, BoNT-B-신탁신 또는 BoNT-C-Vamp2를 발현한다.
GAD67: 67 kD의 글루탐산 데카복실라제
NTR: 니트로리덕타제.
Luc: 반딧불이 루시퍼라제(fLuc).
안티센스-SNARE: SNARE 단백질 SNAP25, VAMP2 또는 신탁신에 대한 안티센스 RNA.
프로모터:
사람 신장 인자 1 프로모터(EF1A), 랫트 일시적인 수용체 잠재적 바닐로이드 1(rTRPV1), 사람 및 랫트 칼시토닌 유전자-관련 펩타이드(hCGRP 및 rCGRP), 랫트 산-감지 이온 채널 3(rASIC3), 및 사람 및 랫트 애드빌린(hADVL 및 rADVL) 프로모터.
도 8. 앰플리콘 벡터로부터 발현된 BoNT-A는 SH-SY5Y 세포내에서 SNARE 단백질 SNAP25를 절단한다.
사람 신경모세포종 세포(SH-S5Y5)를 01, 1.0, 및 10.0 pfu/세포의 MOI에서 둘 다의 경우 HCMV 프로모터에 의해 구동된 전사 단위 A2-CMV-BoNT-A(LC) 또는 A2-CMV-Luc를 발현하는 앰플리콘 벡터로 감염시킨다. 다음 날, 감염을 중지하고, 세포 단백질을 BoNT-A LC 및 SNAP25에 대해 특이적인 항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 분석한다. 웨스턴 블롯의 보다 높은 부분은, 증가하는 양의 BoNT-A LC가 증가하는 MOI에 상응함을 나타내며, 이는 사용된 벡터가 감염된 세포내에서 이러한 단백질을 발현함을 입증한다. 블롯의 보다 낮은 부분은 BoNT-A의 천연 표적인 SNARE 복합체로부터의 단백질인, SNAP25를 절단하여, 2개의 단편을 생산함을 나타낸다. 보다 낮은 MOI에서, 주로 천연(절단되지 않은) 형태의 SNAP25가 관찰된다. 중간 MOI에서, 천연 및 절단된 형태(약간 더 낮은 밴드)가 관찰될 수 있는 반면, 이중(doublet)의 보다 적은 단편이 관찰될 수 있으므로, 보다 높은 MOI에서 대부분의 SNAP25 단백질이 절단된다. 이는 SH-S5Y5 세포내에서 합성된 BoNT-A LC가 SNAP25를 절단할 수 있음을 입증한다. 대조적으로, Luc를 발현하는 벡터로 감염된 SH-S5Y5 세포 내에서, SNAP25의 절단은 관찰되지 않는다.
도 9. 보툴린 신경독소의 경쇄는 감염된 뉴우런에서 SNARE 단백질을 절단한다.
랫트 배아 배근 신경절(DRG) 뉴우런의 1차 배양물을 10 pfu/세포의 MOI에서 전사 단위 A2-CMV-BoNT-A, A2-CMV-BoNT-B, A2-CMV-BoNT-C, A2-CMV-BoNT-E, 및 A2-CMV-BoNT-F를 발현하는 앰플리콘 벡터로 감염시킨다. 뉴우런을 또한 A2-CMV-BoNT-A-신탁신(STX), A2-CMV-BoNT-B-신탁신(STX), 및 A2-CMV-BoNT-C-VAMP2(V2)를 발현하는 앰플리콘 벡터로 감염시켰다. A2-CMV-Luc를 발현하는 벡터는 음성 대조군으로 사용하였다. 모든 경우에, HCMV 프로모터는 전사 카세트의 발현을 구동하였다. 다음 날, 감염을 중지하고 세포 단백질을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 도에 나타낸 바와 같이, 뉴우런에서 합성된 각각의 BoNT LC는 예측된 SNARE 단백질을 절단하였다: 따라서, 이러한 단백질의 크기에 있어서의 감소에 의해 입증된 바와 같이 BoNT-A, -C 및 -E의 경쇄는 SNP25를 절단한 반면, BoNT-B, 및 -F의 경쇄는, VAMP2를 절단하였고, 이는 블롯 내에서 더 이상 검출되지 않는다. 또한, BoNT-C는 또한 신탁신(STX)을 절단하였고, 또한 블롯에서 더 이상 가시성이 아니다. BoNT-C는 2개의 상이한 SNARE 단백질(SNAP25 및 STX)을 절단하기 위해 기술된 유일한 보툴린 독소이다. SNARE 단백질의 시그널 및 전이막 펩타이드에 융합된 보툴리늄 독소의 경쇄는 모체(parental)의 융합되지 않은 독소가 그랬던 것처럼 상응하는 SNARE 단백질을 정확하게 절단하였다. 레인 Luc는 천연의, 절단되지 않은, SNARE 단백질의 위치를 나타낸다(화살표). 따라서, 본 도면은 벡터 감염시 감각 뉴우런에서 합성된 보툴린 독소(융SNARE 단백질과 융합되거나 이의 단편이 없는)의 경쇄가 이들의 상응하는 표적 단백질을 절단할 수 있음을 입증한다.
도 10. 보툴린 독소의 경쇄는 감각 뉴우런에서 신경펩타이드의 방출을 억제한다.
랫트 배아 DRG 뉴우런의 1차 배양물을 증가하는 MOI(0.5 내지 3 pfu/세포)에서 A2-CMV-BoNT-A, A2-CMV-BoNT-B, A2-CMV-BoNT-C, A2-CMV-BoNT-D, A2-CMV-BoNT-E, 및 A2-CMV-BoNT-F를 발현하는 앰플리콘 벡터로 감염시킨다. 뉴우런을 또한 A2-CMV-BoNT-A-신탁신, A2-CMV-BoNT-B-신탁신, 및 A2-CMV-BoNT-C-VAMP2를 발현하는 앰플리콘으로 감염시켰다. A2-CMV-Luc를 발현하는 벡터는 음성 대조군으로 사용하였다. 뉴우런을 또한 비히클만으로 감염시켰다(mock). 다음 날, 감염된 뉴우런을 75 mM KCl로 처리하여 DRG 뉴우런내에서 일반적으로 합성된 신경펩타이드인, CGRP의 방출을 자극하였다. KCl 처리 30분 전 및 30분 후에, 100 마이크로리터의 분취량을 배양 배지로부터 취하고 ELISA(Spi Bio, ref N° A05482로부터의 CGRP ELISA 키트 사용)에 의해 CGRP의 존재에 대해 평가하였다. 로그 변환 후 선형 회귀 프로파일로 나타낸 결과는 모든 독소가 CGRP 방출을 억제하였으나 이들이 상이한 강도로 그것을 억제하며, BoNT-F, BoNT-C 및 BoNT-A가 이와 관련하여 가장 우수함을 나타낸다. mock-감염된 뉴우런에서 뿐만 아니라 Luc를 발현하는 벡터로 감염된 뉴우런에서, CGRP 방출의 억제는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 BoNT LC 결과에 의한 SNARE 단백질의 절단이 신경펩타이드 방출을 억제하며, BoNT-F가 이와 관련하여 가장 효율적임을 명확하게 나타낸다.
도 11. 앰플리콘 벡터로부터 발현된 GAD67은 GABA(감마 아미노-부티르산)의 합성 및 세포외 방출을 유도한다.
7A) 교모세포종 세포(Gli36)를 MOI 0.1, 1.0 및 10 pfu/세포에서 A2-CMV-GAD67 또는 A2-CMV-Luc를 발현하는 앰플리콘 벡터로 감염시켰다. 다음 날, 감염을 중지하고 세포 단백질을 GAD67 및 GAPDH(내부 대조군으로 사용된 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)에 대해 특이적인 항체를 사용하여, 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 랫트 뇌로부터의 추출물을 양성 대조군으로 사용하여 내인성 GAD67을 확인하였다. 도 11a는 GAD67의 발현이 MOI와 함께 증가함을 나타내는데, 이는 벡터 A2-CMV-GAD67이 이러한 단백질을 발현하지 않음을 입증한다.
7B) 쥐 배아 DRG 뉴우런의 1차 배양물을 MOI 0.1, 1.0 및 10 pfu/세포에서 A2-CMV-GAD67 또는 A2-CMV Luc를 발현하는 벡터로 감염시켰다. 다음 날, 감염을 세포내 및 세포외 둘 다에서 중지하고, GABA의 농도를 GABA에 대한 형광성-커플링된 검정(이러한 검정은 Ippolito et al., 2014에 나타낸 바와 같이 수행된다)인 레자주린 검정(Resazurine assay)을 사용하여 평가하였다. 상부 패널은 세포내 GABA의 양이 MOI와 함께 증가함을 나타내지만, 하부 패널은 세포외 GABA의 증가를 나타낸다. 채널 표지된 GABA는 레자주린 검정에 대한 양성 대조군이다. 이러한 결과는 A2-CMV-GAD67 벡터로부터 GAD67의 발현이 세포내 GABA의 합성 및 세포외 매질로의 이의 방출을 증가시킴을 나타낸다.
도 12. 니트로리덕타제(NTR)는 니트로 화합물 7' 니트로코우마린을 활성화시키며 미트로니다졸(MTZ)의 존재하에서 세포 사멸을 유도한다.
8A) 사람 교모세포종(Gli36) 세포를 A2-CMV-NTR 또는 A2-CMV-Luc를 발현하는 앰플리콘 벡터로 1.0 pfu/세포의 MOI에서 감염시켰다. 2일 후에, 감염을 중지하고 단백질 추출물을 제조하고 형광성-커플링된 검정(Muller et al. 2015에서와 같이 수행된 검정)을 사용하여 7' 니트로코우마린의 활성화를 평가하였다. 도 12a는 벡터 A2-CMV-NTR로 감염된 세포로부터 추출한 단백질만이 7'니트로코우마린의 유의적인 활성화를 유도하였음을 나타내며, 이는 기능적 NTR이 A2-CMV-NTR로 감염된 Gli36 세포내에서 발현되었음을 입증한다.
8B). NTR의 발현이 메트로니다졸(MTZ)의 존재하에서 세포 사멸을 유도하였는지를 평가하기 위하여, Gli36 세포를 앰플리콘 벡터 A2-CMV-NTR 또는 A2-CMV-Luc로 1.0 pfu/세포의 MOI에서 감염시켰다. 다음 날, 세포를 MTZ(0.5. mM)의 존재 또는 부재하에 24시간 동안 항온처리하였다. 이후에, 감염을 중지하고 세포 생존능을 MTT 검정(Carmichael et al., 1987에 나타낸 바와 같음)으로 평가하였다. 도면은 MTZ가 감염된 세포의 세포 사멸을 유의적으로 증가시켰음을 나타낸다. Mock: 감염되지 않은 세포.
도 13. 성체 랫트로부터 자율 및 감각 신경절에 있어서 DRG-선택적인 프로모터 후보물의 발현의 선택성의 분석.
랫트 성체 감각 신경절(DRG), 자율 교감 신경절(상경 신경절(superior cervical ganglia: SCG)), 및 자율 부교감 신경절(자궁경부곁 신경절(paracervical ganglia: GPC))을 체외이식하고 기관형적 배양물(organotypic culture)로서 유지하였다. 3일 후, 신경절을 개별적으로, 이들 모두 반딧불이 루시퍼라제(fLuc)를 발현하지만 각각 다음의 프로모터: 랫트 TRPV1(rTRPV1), 랫트 CGRP(rCGRP), 랫트 ASIC3(rASIC3), 및 일반적인 대조군으로서 제공된 비-선택적 프로모터인, EF1a로 구동된 A5-TRPV1-Luc, A5-rCGRP-Luc, A5-ASIC3-Luc, 또는 A5-EF1A-Luc를 발현하는 벡터로 감염시켰다. 각각의 신경절을 106개의 벡터 입자로 감염시켰다. 벡터는 또한 바이러스 프로모터(HSV-1 IE4/5)에 의해 구동된 레닐라 루시퍼라제(rLuc)를 발현한다. 다음 날, 감염을 중지하고 세포 추출물을 Promega로부터의 이중-루시퍼라제 리포터 검정 시스템을 사용하여 루시퍼라제 시험을 위해 제조하였다. 결과는 fLuc/rLuc의 비로 나타내고 각각의 DRG(좌측), SCG(중앙) 및 GPC(우측)에서 EF1a 프로모터의 발현 퍼센트로 표준화하였다. 도 13은 rTRPV1 및 rCGRP 프로모터와 같은 일부 후보물 프로모터가 자율 신경절에서보다 DRG에서 유의적으로 보다 높은 수준의 fLuc를 발현하지만, rASIC3와 같은 다른 프로모터는 DRG에서 우선적인 활성을 나타내지 않음을 나타낸다. 이들 결과에 따라서, rTRPV1 및 rCGRP 프로모터는 DRG에 대해 선택적인 활성을 나타내는 것으로 나타나지만 rASIC3은 바이러스 게놈으로부터 발현된 경우 이러한 선택성을 나타내지 않는다.
도 14는 리포터 단백질 GFP를 발현하는 앰플리콘 벡터가 배아 랫트 DRG 뉴우런 및 성체 랫트 DRG 체외이식편(explant)의 1차 배양물을 감염시킬 수 있으며 이들 뉴우런 내에서 전이유전자 GFP를 발현함을 나타낸다.
도 15 결손 HSV-1 벡터의 배뇨근내 접종은 배근 신경절(DRG)에 도달하여 감각 뉴우런에서 전이유전자를 발현시켜 방광에 신경을 통하게 한다.
IE4/5-GFP 및 HCMV-루시퍼라제(도 3의 B에 나타냄)를 발현하는 바이러스 벡터는 척수-손상된(SCI) 랫트의 방광 벽내로 이들의 접종 후 방광 구심성 뉴우런내 전이유전자성 단백질 둘 다를 침투하고 발현할 수 있다. GFP 및 루시퍼라제(Luc) 둘 다를 발현하는 DRG 뉴우런은 DRG 신경절 L6에 나타나며, 이로부터 방광에 신경을 통하게 하는 뉴우런이 확장한다. 그러나, 방광에 신경을 통하게 하지 않는 DRG 신경절 T13에서, 결과는 부정적이다. 감염 1주 후, 동물을 희생시키고 전이유전자 단백질을 GFP 및 루시퍼라제에 대한 특이적인 항체를 사용하여 IHC에 의해 나타내었다. 이들 결과는, 방광 벽내로의 접종 후, 벡터가 방광에 신경을 통하게 하는 구심성 뉴우런에 도입되어 엑손을 통해 뉴우런의 세포체에 이어 배근 신경절(DRG) 내에 있는 L6 신경절로 역행하여 수송되며, 이로부터 바이러스 게놈이 전이유전자성 단백질을 발현함을 나타낸다. 벡터는 방광에 신경을 통하게 하지 않는 뉴우런(T13)에 도달하거나 발현할 수 없다.
도 16은 루시퍼라제가 DRG-선택적인 TRPV1 프로모터에 의해 구동되는 경우 배근 신경절(DRG) 내에서 바이러스 벡터의 발현의 고 세포 선택성을 나타낸다. 루시퍼라제는 구심성 뉴우런에서만 유의적으로 발현되며, 자율 뉴우런(교감 또는 부교감) 내에서는 발현되지 않는다. 결과는 강력하지만 특이적이지 않은 HCMV 프로모터의 제어 하에서 루시퍼라제를 발현하는 벡터로부터의 것에 대한 루시퍼라제 발현의 퍼센트로서 표준화하였다(벡터 둘 다는 도 3의 B에 나타낸다).
실시예
실시예 1: 결손 재조합 및 앰플리콘 HSV-1 벡터의 작제
물질 및 방법
본 발명은 ICP27 및 ICP4(둘 다 카피)의 완전한 결실을 포함하고, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, LAP와 LTE 서열 사이(부위 1) 또는 LTE와 INS 서열 사이(부위 2)에, LAT 유전자자리내로 포매된 치료학적 전사 카세트를 또한 수반하는 결손 재조합 HSV-1 벡터의 세트를 제공함으로써 상기 카세트에 대해 장기간 발현을 제공한다. 이들 벡터를 생성하는데 사용된 전사 카세트 중 일부는 도 3에 나타낸다.
상기 전사 카세트는 클로스트리디움 독소 TeNT(LC), BoNT-A(LC), BoNT B(LC), BoNT-C(LC), BoNT E(LC), BoNT-F(LC), 또는 SNARE 단백질, VAMP2, SNAP25 및 신탁신에 대해 지시된 안티센스 RNA(asRNA), 또는 융합 SNARE/경쇄 독소, 또는 사람 GAD67 단백질 또는 사포린 S6와 같은 RIP 단백질, 또는 이. 콜라이 NTR nfnB의 경쇄(LC)를 발현함으로써, 구심성 뉴우런-특이적인 프로모터의 제어 하에 위치하는, 구심성 뉴우런 내에서 신경전달을 특이적으로 억제/무반응시킨다.
벡터를 생성시키기 위하여, 본 발명자들은 Tanaka et al, 2003에 기술된 것과 같은 세균 인공 염색체(BAC)내로 클로닝된 균주 F의 완전한 길이의 HSV-1 게놈을 사용하였다. 유전자 결실 및 유전자 삽입을 세균 내에서 동종 재조합에 의해 도입한 후 벡터를 이미 기술된 바와 같이(Tanaka et al. 2003), 허용 세포주의 형질감염에 의해 재구성하였다. 이들 벡터의 일반적인 구조는 도 1a에 나타낸다.
HSV-1 앰플림콘 벡터의 게놈, 도 2.
본 발명은 또한 결손 앰플리콘 벡터의 세트를 제공하며, 이는 재조합 벡터와 동일한 전이유전자성 치료학적 전사 카세트를 발현하며, 도 7에 나열되어 있다. 장기간 발현(LTE 및 INS)을 부여하는 서열은 전사 카세트를 둘러싸고 있다(도 2). 도 2는 또한 치료학적 전사 카세트 외에, 앰플리콘 벡터가 HSV-1 IE4/5 프로모터에 의해 모든 경우에 구동된 리포터 단백질(GFP 또는 융합 단백질 GFP/레닐라 루시퍼라제)을 발현하는 제2 전사 카세트를 수반함을 나타낸다.
앰플리콘 벡터는 헬퍼로서 결손 LaLdeltaJ 바이러스 및 이미 엡슈타인(Epstein) 및 공동연구자(Zaupa, Revol-Guyot 및 Epstein, 2003)에 의해 기술되어 있는 보완하는 세포주를 사용하여 생산되며, 이는 벡터 게놈의 증폭 및 패키징에 필요한 단백질의 세트를 발현한다.
재조합 및 앰플리콘 벡터 게놈에 의해 수반된 전사 카세트, 도 7.
본 발명에 기술된 재조합체 및 앰플리콘 벡터는 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 벡터 유형 둘 다에서 장기간 발현(LAP, LTE, INS)을 부여하는 HSV-1 서열 내로 포매된 전이유전자성 전사 카세트를 발현한다. 본 발명에 사용된 전사 카세트의 일부 예는 도 7에 나열되어 있다.
실시예 2. HSV-1 앰플리콘 벡터.
본 발명은 또한 결손 앰플리콘 벡터의 세트를 제공하며, 이들 벡터 중 일부는 리포터 단백질(루시퍼라제) 또는 클로스트리디움 독소(TeNT (LC), BoNT-A (LC), BoNT B (LC), BoNT-C (LC), BoNT E (LC), BoNT-F (LC))의 경쇄(LC), 또는 SNARE 단백질, VAMP2, SNAP25 및 신탁신, 또는 키메라 SNARE/경쇄 독소, 또는 사람 GAD67 단백질 또는 사포린 S6과 같은 RIP 단백질 또는 nfnB와 같은 니트로리덕타제(NTR) 단백질에 대해 지시된 안티센스 RNA(asRNA)를 발현한다. 이들 전이유전자의 발현을 구동하는 프로모터(prom)는 비-특이적인 프로모터(HCMV, EF1A)이거나 프로모터 (TRPV1, TRPM8, ASIC3, GCRP, ADVl)의 구심성 뉴우런-특이적이다. 장기간 발현을 부여하는 추가의 서열(LTE 및 DNA 인슐레이터 서열)은 이들 프로모터의 일부에 첨가된다(도 3의 A). 앰플리콘 벡터 속에 존재하는, 리포터 GFP, 또는 GFP-rLuc 융합 단백질의 발현을 지배하는 프로모터는 HSV-1 IE4/5 프로모터로 알려진 바이러스 이미디어트-얼리 프로모터이다. 본원에 사용된 앰플리콘 벡터 중 일부의 일반적인 구조는 도 3의 B에 나타나 있다.
실시예 3: BoNT-A, BoNT-C 및 TeNT의 발현. 도 4.
BoNT-A(LC), BoNT-C(LC) 및 TeNT(LC)의 발현을 Gli36(사람 교모세포종으로부터 기원한 세포주) 및 BHK21(햄스터 섬유모세포 세포) 세포주에서 수행한다. Gli36 및 BHK21 세포를 HCMV-Luc, HCMV-BoNT-A(LC), HCMV-BoNT-C(LC), 또는 HCMV-TeNT(LC)를 발현하는 앰플리콘 벡터로 감염시킨다. 이후에, 세포를 고정시키고 독소의 발현을 TeNT(LC)를 나타내기 위한 항-TeNT 항체 및 BoNT-A(LC) 및 BoNT-C(LC)를 나타내기 위한 항-HIS 항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 입증하였다. 실제로, 효율적인 항-BoNT 항체가 이용가능하지 않으므로, BoNT-A(LC) 및 BoNT-C(LC)를 C-말단 HIS-태그와의 융합 단백질로서 발현시킨다. 도 4는 HCMV-BoNT-A(LC), HCMV-BoNT-C(LC), 및 HCMV-TeNT(LC)를 암호화하는 유전자를 수반하는 바이러스 벡터가 각각 Gli36 및 BHK21 세포 둘 다에서 BoNT-A(LC), BoNT-C(LC) 및 TeNT(LC)를 발현함을 나타낸다.
실시예 4: 재조합 독소 TeNT의 시험관내 단백질분해 활성. 도 5
VAMP2와 관련하여 독소 TeNT(LC)의 단백질분해 활성을 항-VAMP2 항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 평가하였다. 독소 TeNT(LC)를 HCMV-TeNT(LC)를 발현하는 바이러스 발현 벡터로 감염시킨 후 Gli36 세포내에서 발현시켰다. 감염을 2일 후 종결시키고 단백질 추출물을 제조하였다. 이들 추출물을 TeNT의 표적 단백질, 즉, VAMP2를 함유하는 적합한 완충액(50 mM Hepes, 400 mM NaCl, 5 mM 디티오트레이톨 및 2 μM ZnSO4) 속에서 항온처리하였다. 웨스턴 블롯(도 5)을 2.5, 5, 및 10 μL의 세포 추출물을 사용하여 수행하였다. 처리되지 않은 샘플, 전이유전자를 발현하는 않는 벡터(pA-1)로 감염된 세포로부터의 샘플, 및 HCMV-Luc(10 μL)를 발현하는 벡터로 감염된 세포로부터의 샘플을 음성 대조군으로 사용하였다. 다양한 양의 재조합 TeNT(recTeNT)를 양성 대조군으로서 사용하였다. 결과는 TeNT(LC)를 발현하는 단백질 추출물이 증가하는 경우 VAMP2의 양이 감소함을 나타내며, 이는 단백질 추출물 속에 존재하는 독소가 VAMP2에 대해 단백질분해 활성을 나타냄을 입증한다.
실시예 5: 재조합체 독소 BoNT-A(LC) 및 BoNT-C(LC)의 세포내 단백질분해 활성. 도 6.
BoNT-A(LC) 또는 BoNT-C(LC)를 발현하는 앰플리콘 벡터에 의한 감염 후 세포내 SNAP25 및 신탁신 1a(STX) 절단을 수행하기 위하여, SH-S5Y5 사람 신경아세포종 세포주를 SNARE 단백질을 자발적으로 발현하는 이들의 특성에 대해 사용하였다. SNAP25 및 STX 수준을 항-SNAP25 또는 항-STX 항체를 각각 사용하여 웨스턴 블롯 검정으로 검출하였다. 음성 대조군으로서, 세포를 감염시키지 않거나(Mock) HCMV-Luc를 발현하는 벡터로 감염시켰다. 결과(도 6a 및 6b)는 BoNT-A 또는 BoNT-C의 경쇄를 발현하는 벡터로 SH-S5Y5 세포의 감염 후(hpi) 48시간 째에, 루시퍼라제를 발현하는 대조군 벡터로 감염시킨 세포와 비교하여 각각 절단 및 세포내 SNAP25(도 6a) 또는 SNAP25 및 STX(도 6b) 단백질 수준의 유의적인 감소가 존재함을 나타낸다.
실시예 6. 도 8.
앰플리콘 벡터로부터 발현된 BoNT-A는 SH-SYS5 세포내에서 SNARE 단백질 SNAP25을 절단한다.
본 실험은 BoNT-A의 경쇄를 발현하는 벡터가 이러한 단백질을 발현하는지를 평가하고, 이러한 독소가 완전한 신경독소(경쇄 + 중쇄)와 동일한 생물학적 활성, 즉, 이의 표적 SNARE 단백질(SNAP25)을 절단하는 능력을 갖는지를 연구하기 위해 설계하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, A2-CMV-BoNT-A를 발현하는 앰플리콘으로 증가하는 다중도로 감염된 세포는 증가하는 양의 독소를 발현한다. 더욱이, 세포를 고 MOI에서 감염시키는 경우, 실제로 모든 SNAP25가 절단되며, 이는 BoNT-A의 경쇄의 기능적 활성을 명확하게 입증한다.
실시예 7. 도 9.
보툴린 신경독소의 경쇄는 감염된 뉴우런에서 SNARE 단백질을 절단한다.
본 실험은 벡터-감염된 뉴우런에서 합성된 모든 BoNT 경쇄가 감각 뉴우런에서 이들의 천연 SNARE 표적 단백질을 절단할 수 있음을 확인하기 위해 설계하였다. 이러한 목적을 위해, 랫트 배아 DRG 뉴우런의 1차 배양물을 10의 MOI에서 음성 대조군으로서 rA2-CMV-BoNT-A, -B, -C, -D, -E 및 -F, 또는 A2-CMV-Luc를 발현하는 앰플리콘 벡터로 감염시켰다. 다음 날 감염을 중지하고 세포 추출물을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 벡터에 의해 발현된 보툴리늄 신경독소 각각은 이의 천연 표적 SNARE 단백질을 절단하였다. 따라서, BoNT-A 및 -E는 SNAP25를 절단하였고, BoNT-B, -D 및 -F는 VAMP2를 절단한 반면, BoNT-C는 SNAP25 및 신탁신 둘 다를 절단하였다. 이는 모든 신경독소의 경쇄가 완전한 신경독소(경쇄 + 중쇄)와 동일한 생물학적 활성을 나타냄을 명확하게 입증한다.
실시예 8. 도 10.
보툴린 독소의 경쇄는 감각 뉴우런에서 신경펩타이드의 방출을 억제한다.
본 실험은 보툴리늄 신경독소의 경쇄가 신경전달물질의 방출의 억제를 유도하였는지를 평가하고 이와 관련하여 이들의 비교 효능을 평가하기 위해 설계되었다. 랫트 배아 DRG 뉴우런의 1차 배양물을 증가하는 MOI에서 도 10에 기술된 벡터로 감염시켰다. 다음 날, 감염된 뉴우런을 KCl로 처리하여 신경펩타이드 CGRP의 방출을 자극시키고 CGRP의 세포내 농도를 ELISA로 평가하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 모든 신경독소는 CGRP의 방출의 억제를 유도하였다. 더욱이, 도 6은 BoNT-F가 이와 관련하여 가장 효과적이었으며, BoNT-A 및 -C가 이어짐을 나타낸다.
실시예 9. 도 11.
앰플리콘 벡터로부터 발현된 GAD67은 GABA의 합성 및 세포외 방출을 유도한다.
본 실험의 목표는 GAD67을 발현하는 벡터가 억제성 신경전달물질 GABA의 합성 및 방출을 유도하는지를 평가하기 위한 것이다. 이러한 목적을 위해, 교모세포종 세포(Gli36)를 증가하는 MOI에서 도 11에 기술된 바와 같은 앰플리콘 벡터로 감염시키고, 다음 날, 감염된 세포 추출물을 GAD67 및 GAPDH에 대해 특이적인 항체를 사용하여, 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 도 11은 GAD67의 발현이 MOI와 함께 증가함을 나타내며, 이는 벡터 A2-CMV-GAD67가 이러한 단백질을 발현함을 입증한다. 또한, 랫트 배아 DRG 뉴우런의 1차 배양물을 상이한 MOI에서 동일한 벡터로 감염시켰다. 다음 날 감염을 중지시키고, 세포내 및 세포외 둘 다의, GABA의 농도를 레사주린 검정(Resazurine assay)(도 11에 대한 범례에서 나타낸 바와 같음)을 사용하여 평가하였다. 이러한 도의 상부 패널은 세포내 GABA의 양이 MOI와 함께 증가함을 나타내는 반면, 하부 패널은 세포외 GABA의 증가를 나타내고, 이는 A2-CMV-GAD67 벡터로부터의 GAD67의 발현이 세포내 GABA의 합성 및 세포외 배지로의 이의 방출을 증가시킴을 입증한다.
실시예 10. 도 12.
니트로리덕타제(NTR)는 니트로 화합물 7'니트로코우마린을 활성화시키고 미트로니다졸(MTZ)의 존재하에서 세포 사멸을 유도한다.
본 실험은 앰플리콘 벡터로부터 발현된 니트로리덕타제가 메트로니다졸의 존재하에서 세포 사멸을 유도하나, 이의 부재하에서는 세포 사멸을 유도하지 않는지를 평가하기 위해 설계되었다. 니트로리덕타제(NTR)에 대해 특이적인 이용가능한 항체는 존재하지 않는다. 따라서, 이러한 단백질이 A2-CMV-NTR 감염된 세포내에서 발현되는지를 평가하기 위하여, 본 발명자들은 7'니트로코우마린의 감소의 평가를 기반으로 시험관내 시험에서의 기능을 사용하였다(Muller et al., 2015). 도 12는 A2-CMV-NTR을 발현하는 앰플리콘 벡터가 니트로 화합물을 활성화시키지 않음을 나타낸다. 더욱이, 도 12는 NTR의 발현이 메트로니다졸(MTZ)의 존재하에서 유의적인 세포 사멸을 유도하였음을 나타낸다. 이는 NTR이 MTZ를 활성화시킴으로써 이러한 분자를 세포독성 약물로 전환시킬 수 있다는 사실에 의해 설명된다.
실시예 11. 도 13.
성체 랫트로부터 자율 및 감각 신경절내 DRG-선택적인 프로모터 후보물의 발현의 선택성의 분석
본 시험은 일반적으로 구심성 뉴우런에서만 또는 구심성 뉴으런에서 주로 활성인, 구심성 뉴우런-특이적인 프로모터 후보물이 비-복제성 HSV-1 벡터 게놈으로부터 발현되는 경우에 또한 이들의 구심성 뉴우런-특이적인 활성을 보존하는지를 시험하기 위해 설계되었다. 성체 랫트 구심성 신경절(DRG), 자율 교감 신경절(SCG), 및 자율 부교감 신경절(GPC)을 체외이식하고 기관형 배양물로서 유지시켰다. 신경돌기의 외성장(outgrowth)에 필요한 시간인, 3일 후, 신경절을 도 13에 대한 범례에서 기술된 바와 같은 3 x 106 벡터 입자로 개별적으로 감염시켰다. 이들 벡터는 다음의 프로모터에 의해 구동된 반딧불이 루시퍼라제(fLuc)를 발현하며: 랫트 TRPV1(rTRPV1), 랫트 CGRP(rCGRP), 랫트 ASIC3(rASIC3), 이들 모두는 구심성-뉴우런 특이적인 프로모터, 및 일반적인 대조군으로서 제공된 비-선택적인 프로모터인 EF1a로 고려된다. fLuc 외에, 이들 벡터는 또한 바이러스 프로모터(HSV-1 IE4/5)에 의해 구동된 레닐라 루시퍼라제(rLuc)를 발현한다. 다음 날, 감염을 중지하고 세포 추출물을 루시퍼라제 시험을 위해 제조하였다. 결과는 fLuc/rLuc의 비로서 및 EF1a에 의해 구동된 루시퍼라제 활성의 퍼센트로서 나타낸다. 도 13은 rTRPV1 및 rCGRP가 DRG에서 우선적으로 반딧불이 루시퍼라제 활성을 발현하므로 이들이 벡터 게놈으로부터 발현되는 경우에서도 DRG-특이적인 것으로 고려될 수 있음을 나타낸다. 대조적으로, rASIC3은 DRG내에서 이러한 우선적인 발현을 나타내지 않으며, 이는 이러한 프로모터가 벡터 게놈으로부터 발현되는 경우 이의 선택성을 보존하지 않음을 입증한다. 따라서, 본 실시예는 rTRPV1 및 rCGRP 프로모터와 같은 일부 DRG-특이적인 프로모터 후보물이 DRG에 대한 이들의 선택성을 보존하지만 rASIC3와 같은 다른 프로모터 후보물은, 세포 염색체로부터 발현되는 경우 DRG-특이적인 프로모터로 고려된다고 해도, 벡터 게놈으로부터 발현될 때 이러한 특이성을 보존하지 않음을 나타낸다. 따라서, 어떠한 특수한 DRG-특이적인 프로모터 후보물의 거동도 예측될 수 없으며 실험적으로 평가되어야 한다.
실시예 12: 세포 배양물 속에서 재조합 단백질의 감염 및 배양
배아 DRG로부터의 1차 랫트 뉴우런 배양물 및 성체 랫트 DRG 체외이식편의 기관형 배양물을 HSV-1 이미디어트 얼리 IE4/5 프로모터에 의해 구동된 GFP를 발현하는 앰플리콘 벡터로 감염시켰다. 결과는 바이러스 발현 벡터가 1차 랫트 감각 뉴우런 배양물 및 성체 랫트 신경절(DRG) 체외이식편 둘 다에서 감염시켜 전이유전자(GFP)를 발현하였음을 나타낸다(도 14).
실시예 13: 뉴우런에서 재조합 단백질의 생체내 발현
척수 손상된(SCI) 랫트를 앰플리콘 벡터 HCMV-Luc로 감염시켰으며, 이는 GFP 및 Luc 리포터 단백질을 동시 발현한다. 감염 1 주일 후, 동물을 희생시키고 전이유전자성 단백질을 IHC로 나타내었다. IHC에 의해 나타난 바와 같이, 방광내로 접종하는 경우 앰플리콘 벡터는 방광에 신경을 통하게 하는 구심성 뉴우런으로 도입된 후 액손(axon)을 통해 배근 신경절(DRG) 내에 있는, 뉴우런의 세포체로 역행하여 수송되며, 여기서 바이러스 게놈은 전이유전자성 단백질 둘 다를 발현한다. 따라서 결과는 앰플리콘 벡터 HCMV-Luc가 전이유전자성 단백질을 이들의 방광 벽내로의 도입 후 방광 구심성 뉴우런내로 침투하여 특이적으로 발현할 수 있음을 나타낸다(도 15). 더욱이, GFP 및 Luc를 발현하는 뉴우런은 이로부터 방광에 신경을 통하게 하는 뉴우런이 확장되는 신경절(L6 신경절)에서만 관찰된다. 대조적으로, 방광에 신경을 통하게 하지 않는 신경절 T13에서, 전이유전자 발현은 관찰될 수 없었다(데이타는 나타내지 않음).
실시예 14: 바이러스 발현 벡터의 세포 특이성 발현
프로모터 TRPV1(구심성 뉴우런 내에서 선택적으로 활성인 프로모터)의 제어하에서 루시퍼라제를 발현하는 앰플리콘 벡터 TRPV1-Luc 및 비-선택적인 HCMV 프로모터의 제어 하에서 루시퍼라제를 발현하는 HCMV-Luc를 사용하여 감각 또는 자율 신경절(둘다 교감 및 부교감 신경절)을 감염시켰다. 결과는 TRPV1 프로모터 하에서 루시퍼라제의 발현이 감각 신결절(배근 신경절, DRG)의 구심성 뉴우런에서 특이적으로 발현되나, 자율 뉴우런(교감 또는 부교감)내에서 발현되지 않음을 나타낸다(도 16). 결과는 비-특이적인 HCMV 프로모터로 구동된 발현 퍼센트로서 나타내며, 이는 모든 유형의 신경절에서 동일하게 높다.
참고문헌 목록
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Ile Asn Phe Gln Ser Ser Arg Gly Thr Val Ser 50 55 60 Leu Gly Leu Lys Arg Asp Asn Leu Tyr Val Val Ala Tyr Leu Ala Met 65 70 75 80 Asp Asn Thr Asn Val Asn Arg Ala Tyr Tyr Phe Arg Ser Glu Ile Thr 85 90 95 Ser Ala Glu Ser Thr Ala Leu Phe Pro Glu Ala Thr Thr Ala Asn Gln 100 105 110 Lys Ala Leu Glu Tyr Thr Glu Asp Tyr Gln Ser Ile Glu Lys Asn Ala 115 120 125 Gln Ile Thr Gln Gly Asp Gln Ser Arg Lys Glu Leu Gly Leu Gly Ile 130 135 140 Asp Leu Leu Ser Thr Ser Met Glu Ala Val Asn Lys Lys Ala Arg Val 145 150 155 160 Val Lys Asp Glu Ala Arg Phe Leu Leu Ile Ala Ile Gln Met Thr Ala 165 170 175 Glu Ala Ala Arg Phe Arg Tyr Ile Gln Asn Leu Val Ile Lys Asn Phe 180 185 190 Pro Asn Lys Phe Asn Ser Glu Asn Lys Val Ile Gln Phe Glu Val Asn 195 200 205 Trp Lys Lys Ile Ser Thr Ala Ile Tyr Gly Asp Ala Lys Asn Gly Val 210 215 220 Phe Asn Lys Asp Tyr Asp Phe Gly Phe Gly Lys Val Arg Gln Val Lys 225 230 235 240 Asp Leu Gln Met Gly Leu Leu Met Tyr Leu Gly Lys Pro Lys 245 250 <210> 25 <211> 765 <212> DNA <213> plant 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Pro Asn Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr 245 250 255 Tyr Glu Met Ser Gly Leu Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe 260 265 270 Gly Gly His Asp Ala Lys Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe 275 280 285 Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn 290 295 300 Lys Ala Lys Ser Ile Val Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys 305 310 315 320 Asn Val Phe Lys Glu Lys Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys 325 330 335 Phe Ser Val Asp Lys Leu Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr 340 345 350 Glu Ile Tyr Thr Glu Asp Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn 355 360 365 Arg Lys Thr Tyr Leu Asn Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile 370 375 380 Val Pro Lys Val Asn Tyr Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn 385 390 395 400 Thr Asn Leu Ala Ala Asn Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn 405 410 415 Met Asn Phe Thr Lys Leu Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr 420 425 430 Lys Leu Leu Cys Val Arg Gly Ile Ile Thr Ser Ile Met Ile Ile Ile 435 440 445 Cys Cys Val Ile Leu Gly Ile Val Ile Ala Ser Thr Val Gly Gly Ile 450 455 460 Phe 465 <210> 29 <211> 1401 <212> DNA <213> bacteria <400> 29 atgcaccacc accaccacca ccagttcgtg aataaacaat tcaattataa agacccagtg 60 aatggtgttg acatagcata catcaaaatc ccgaacgtgg gacagatgca accggtgaaa 120 gccttcaaga ttcataacaa gatctgggtt attcctgaac gggacacttt taccaaccct 180 gaagaaggtg acctgaaccc tcctccagag gctaagcagg ttcctgtttc ctactacgat 240 tcaacttatc tgagcactga taacgaaaag gataattacc ttaagggagt taccaaactg 300 ttcgagcgca tttatagcac agacctcggc agaatgctgc tgaccagcat agtgcgggga 360 attccatttt gggggggcag cacaatcgac acggagttga aggtcatcga tacgaattgc 420 atcaacgtga tacaaccaga tggctcttac agatccgagg aactgaacct ggtgatcatc 480 ggcccctctg ctgatataat ccaattcgaa tgcaaaagct tcggtcacga ggtgctgaat 540 cttacccgga acggatacgg gtccacccag tacatacgct ttagtcccga ctttacattc 600 ggcttcgagg aaagtcttga agtggacacg aatccactgc tgggagctgg caagttcgcc 660 actgatcctg ccgttacact tgctcatgaa ctgattcatg ctggacaccg gctttatggg 720 atagctataa atccgaatag agtctttaag gttaacacaa atgcctacta cgaaatgtct 780 ggccttgagg tttcattcga ggagcttagg acctttggag gccacgacgc taaattcatc 840 gactctctgc aggagaatga gtttcggctg tactactaca acaagtttaa ggacattgcc 900 agtactctga acaaggctaa gagcatcgtc gggaccacag ccagcctcca atatatgaaa 960 aacgtgttca aggaaaagta ccttctgtca gaagacacat caggaaaatt ctcagtcgac 1020 aaactgaaat ttgacaagct gtacaagatg ctgactgaaa tatacacaga ggacaacttc 1080 gtgaagtttt ttaaagtcct gaacagaaag acttacttga acttcgacaa agccgtcttt 1140 aaaatcaata tcgtcccaaa ggttaattac actatctatg acggattcaa tctcagaaac 1200 acgaacttgg ctgccaactt caatggacag aacacagaga tcaacaacat gaattttact 1260 aagcttaaaa atttcacagg cctgttcgag ttctataagc ttctttgcgt ccgaggcatc 1320 attacatcca tcatgatcat aatctgctgt gtgatattgg gcatagtgat tgcatccacc 1380 gtggggggca tttttgccta g 1401 <210> 30 <211> 469 <212> PRT <213> bacteria <400> 30 Met His His His His His His Pro Val Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr 1 5 10 15 Asn Asp Pro Ile Asp Asn Asn Asn Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Phe 20 25 30 Ala Arg Gly Thr Gly Arg Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg 35 40 45 Ile Trp Ile Ile Pro Glu Arg Tyr Thr Phe Gly Tyr Lys Pro Glu Asp 50 55 60 Phe Asn Lys Ser Ser Gly Ile Phe Asn Arg Asp Val Cys Glu Tyr Tyr 65 70 75 80 Asp Pro Asp Tyr Leu Asn Thr Asn Asp Lys Lys Asn Ile Phe Leu Gln 85 90 95 Thr Met Ile Lys Leu Phe Asn Arg Ile Lys Ser Lys Pro Leu Gly Glu 100 105 110 Lys Leu Leu Glu Met Ile Ile Asn Gly Ile Pro Tyr Leu Gly Asp Arg 115 120 125 Arg Val Pro Leu Glu Glu Phe Asn Thr Asn Ile Ala Ser Val Thr Val 130 135 140 Asn Lys Leu Ile Ser Asn Pro Gly Glu Val Glu Arg Lys Lys Gly Ile 145 150 155 160 Phe Ala Asn Leu Ile Ile Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Glu Asn 165 170 175 Glu Thr Ile Asp Ile Gly Ile Gln Asn His Phe Ala Ser Arg Glu Gly 180 185 190 Phe Gly Gly Ile Met Gln Met Lys Phe Cys Pro Glu Tyr Val Ser Val 195 200 205 Phe Asn Asn Val Gln Glu Asn Lys Gly Ala Ser Ile Phe Asn Arg Arg 210 215 220 Gly Tyr Phe Ser Asp Pro Ala Leu Ile Leu Met His Glu Leu Ile His 225 230 235 240 Val Leu His Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Val Asp Asp Leu Pro Ile Val 245 250 255 Pro Asn Glu Lys Lys Phe Phe Met Gln Ser Thr Asp Ala Ile Gln Ala 260 265 270 Glu Glu Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gln Asp Pro Ser Ile Ile Thr Pro 275 280 285 Ser Thr Asp Lys Ser Ile Tyr Asp Lys Val Leu Gln Asn Phe Arg Gly 290 295 300 Ile Val Asp Arg Leu Asn Lys Val Leu Val Cys Ile Ser Asp Pro Asn 305 310 315 320 Ile Asn Ile Asn Ile Tyr Lys Asn Lys Phe Lys Asp Lys Tyr Lys Phe 325 330 335 Val Glu Asp Ser Glu Gly Lys Tyr Ser Ile Asp Val Glu Ser Phe Asp 340 345 350 Lys Leu Tyr Lys Ser Leu Met Phe Gly Phe Thr Glu Thr Asn Ile Ala 355 360 365 Glu Asn Tyr Lys Ile Lys Thr Arg Ala Ser Tyr Phe Ser Asp Ser Leu 370 375 380 Pro Pro Val Lys Ile Lys Asn Leu Leu Asp Asn Glu Ile Tyr Thr Ile 385 390 395 400 Glu Glu Gly Phe Asn Ile Ser Asp Lys Asp Met Glu Lys Glu Tyr Arg 405 410 415 Gly Gln Asn Lys Ala Ile Asn Lys Gln Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Lys 420 425 430 Glu His Leu Ala Val Tyr Lys Ile Gln Met Cys Lys Ser Val Ile Met 435 440 445 Ile Ile Ile Cys Cys Val Ile Leu Gly Ile Val Ile Ala Ser Thr Val 450 455 460 Gly Gly Ile Phe Ala 465 <210> 31 <211> 1410 <212> DNA <213> bacteria <400> 31 atgcaccacc accatcatca tcccgtgacc atcaacaatt tcaactataa tgaccctatc 60 gataacaaca acatcattat gatggagccc cctttcgccc gcggcaccgg gagatactac 120 aaggccttca aaataaccga taggatctgg atcatcccag agaggtacac cttcgggtac 180 aagcctgagg actttaataa atcaagcggt atctttaata gggatgtgtg tgaatactac 240 gaccctgact atctcaatac caacgacaaa aagaatatct tccttcagac tatgatcaag 300 cttttcaatc gaattaagag taagccgctt ggtgagaaac tgctggagat gatcataaac 360 ggcatcccct acctcggaga tcgccgcgtt ccgctggaag agtttaacac taatatcgca 420 agcgtcactg taaataaact catcagcaac ccgggggaag tggaaaggaa gaagggaatc 480 tttgctaacc tgattatctt tggaccaggc ccagtgttga atgaaaacga gaccatcgac 540 atcgggatcc agaaccactt tgcatcacga gaggggtttg gggggattat gcagatgaag 600 ttctgccccg agtacgtgtc agtgttcaat aacgtgcagg aaaacaaagg agcatccatc 660 ttcaatcgcc gaggctactt ctctgatcct gctctcatcc tcatgcacga gctcattcac 720 gtgctgcacg gactttatgg catcaaggtg gacgacctgc ctattgtgcc gaatgaaaag 780 aagttcttca tgcagagtac tgatgccatc caggctgagg aactgtacac tttcgggggc 840 caggacccat ccattatcac cccaagtact gataagtcaa tctatgacaa agttctgcag 900 aacttccgcg gaatcgtgga taggctcaac aaagtgctgg tgtgtattag cgaccccaac 960 attaacatca atatttacaa gaacaaattc aaggacaaat ataaattcgt ggaggactct 1020 gagggcaagt attcaattga cgtggagagc ttcgacaaac tgtacaaaag cctgatgttc 1080 ggtttcacag agaccaacat agcagagaac tataagatta aaactcgcgc gagctacttt 1140 tcagattcac tgcctccggt gaaaatcaag aacctcctgg ataatgagat ctataccata 1200 gaagaaggat ttaacatttc cgacaaggac atggaaaagg agtaccgggg acagaacaag 1260 gccatcaaca aacaggccta tgaagaaatc agcaaggagc acctcgccgt ctacaaaatt 1320 caaatgtgca aaagcgtcat aatgattatt atctgctgcg taatcctggg gatagtgatc 1380 gcttccaccg taggcggcat cttcgcctga 1410 <210> 32 <211> 476 <212> PRT <213> bacteria <400> 32 Met His His His His His His Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr 1 5 10 15 Ser Asp Pro Val Asp Asn Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Asp Thr His Leu 20 25 30 Asn Thr Leu Ala Asn Glu Pro Glu Lys Ala Phe Arg Ile Thr Gly Asn 35 40 45 Ile Trp Val Ile Pro Asp Arg Phe Ser Arg Asn Ser Asn Pro Asn Leu 50 55 60 Asn Lys Pro Pro Arg Val Thr Ser Pro Lys Ser Gly Tyr Tyr Asp Pro 65 70 75 80 Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Ser Asp Lys Asp Pro Phe Leu Lys Glu Ile 85 90 95 Ile Lys Leu Phe Lys Arg Ile Asn Ser Arg Glu Ile Gly Glu Glu Leu 100 105 110 Ile Tyr Arg Leu Ser Thr Asp Ile Pro Phe Pro Gly Asn Asn Asn Thr 115 120 125 Pro Ile Asn Thr Phe Asp Phe Asp Val Asp Phe Asn Ser Val Asp Val 130 135 140 Lys Thr Arg Gln Gly Asn Asn Trp Val Lys Thr Gly Ser Ile Asn Pro 145 150 155 160 Ser Val Ile Ile Thr Gly Pro Arg Glu Asn Ile Ile Asp Pro Glu Thr 165 170 175 Ser Thr Phe Lys Leu Thr Asn Asn Thr Phe Ala Ala Gln Glu Gly Phe 180 185 190 Gly Ala Leu Ser Ile Ile Ser Ile Ser Pro Arg Phe Met Leu Thr Tyr 195 200 205 Ser Asn Ala Thr Asn Asp Val Gly Glu Gly Arg Phe Ser Lys Ser Glu 210 215 220 Phe Cys Met Asp Pro Ile Leu Ile Leu Met His Glu Leu Asn His Ala 225 230 235 240 Met His Asn Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Pro Asn Asp Gln Thr Ile Ser 245 250 255 Ser Val Thr Ser Asn Ile Phe Tyr Ser Gln Tyr Asn Val Lys Leu Glu 260 265 270 Tyr Ala Glu Ile Tyr Ala Phe Gly Gly Pro Thr Ile Asp Leu Ile Pro 275 280 285 Lys Ser Ala Arg Lys Tyr Phe Glu Glu Lys Ala Leu Asp Tyr Tyr Arg 290 295 300 Ser Ile Ala Lys Arg Leu Asn Ser Ile Thr Thr Ala Asn Pro Ser Ser 305 310 315 320 Phe Asn Lys Tyr Ile Gly Glu Tyr Lys Gln Lys Leu Ile Arg Lys Tyr 325 330 335 Arg Phe Val Val Glu Ser Ser Gly Glu Val Thr Val Asn Arg Asn Lys 340 345 350 Phe Val Glu Leu Tyr Asn Glu Leu Thr Gln Ile Phe Thr Glu Phe Asn 355 360 365 Tyr Ala Lys Ile Tyr Asn Val Gln Asn Arg Lys Ile Tyr Leu Ser Asn 370 375 380 Val Tyr Thr Pro Val Thr Ala Asn Ile Leu Asp Asp Asn Val Tyr Asp 385 390 395 400 Ile Gln Asn Gly Phe Asn Ile Pro Lys Ser Asn Leu Asn Val Leu Phe 405 410 415 Met Gly Gln Asn Leu Ser Arg Asn Pro Ala Leu Arg Lys Val Asn Pro 420 425 430 Glu Asn Met Leu Tyr Leu Phe Thr Lys Phe Cys His Lys Ala Ile Asp 435 440 445 Gly Arg Ser Leu Tyr Asn Met Met Ile Ile Leu Gly Val Ile Cys Ala 450 455 460 Ile Ile Leu Ile Ile Ile Ile Val Tyr Phe Ser Thr 465 470 475 <210> 33 <211> 1431 <212> DNA <213> bacteria <400> 33 atgcaccacc atcatcatca tcctattaca atcaacaatt ttaattattc tgacccagtg 60 gacaacaaaa acatacttta ccttgatacc cacctcaata ctctggcgaa cgagccagag 120 aaagcgttcc gcataacagg aaacatatgg gtgattcctg acagattcag tcgaaatagt 180 aacccaaacc tgaacaagcc tccgagggtt acatccccta agtccggtta ttacgacccc 240 aattacctgt ctacagatag cgataaagat cctttcctga aagagatcat taaactgttc 300 aaacgaataa actcccgcga aatcggggag gaactcattt atcgattgtc cacggacatc 360 cctttccctg gtaataacaa caccccgatt aatacctttg acttcgacgt cgactttaac 420 tctgtggatg tgaagactcg gcagggtaac aactgggtta aaactgggtc aatcaacccg 480 tctgtcataa ttacaggccc tagggagaat ataattgatc cggagaccag cacctttaaa 540 ttgactaata atactttcgc cgcacaggag gggttcggcg ccctgtctat catatcaatc 600 agtccccgat ttatgctgac ctactctaat gcaactaacg acgtcgggga aggtcggttt 660 agcaaaagtg agttctgcat ggacccgatc ctcatactga tgcacgagtt gaaccatgca 720 atgcataatc tgtatggaat cgctattccc aacgatcaga caatatcttc cgtcacgtca 780 aacattttct attctcagta taatgtgaaa ctggaatatg ctgagatcta cgcctttggt 840 ggccccacaa ttgacctgat tccaaagagc gccaggaagt acttcgagga aaaggcactt 900 gattattata ggagcatcgc aaagcgcctg aacagcatca caacggccaa cccaagctct 960 ttcaacaaat atataggcga atacaagcaa aaactcatta gaaaatacag gtttgtggtg 1020 gaaagcagcg gagaggtaac cgtaaaccgc aacaaattcg tggagctgta caacgaactg 1080 actcagatct ttacggaatt caattacgct aagatctaca atgtgcagaa ccggaagatt 1140 tacctgtcca atgtttacac acctgtcact gctaatattc tcgatgacaa tgtgtacgac 1200 attcagaatg gcttcaacat ccccaagtct aacctgaacg tgctgttcat gggccagaac 1260 cttagccgca atcctgcgct gcgcaaagtc aaccctgaga atatgctgta tctcttcacg 1320 aagttctgtc acaaggccat agacggtaga agtctttata atatgatgat tatactgggg 1380 gtgatctgcg cgattatcct tattattatc attgtatact tctctacatg a 1431

Claims (17)

  1. 적어도:
    a) 방광의 구심성 뉴우런(afferent neuron) 속에서 선택적으로 활성인 하나의 프로모터,
    b) 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나의 전사 카세트(여기서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 전사된 경우 시냅스후 세포(postsynaptic cell)내 신경전달물질 시그널(signal)의 형질도입을 무반응(silence)시키거나 억제한다), 및
    c) 상기 전사 카세트에 작동적으로 연결된, LTE로서 공지된 것들 및/또는 HSV-1 게놈으로부터의 DNA 인슐레이터(DNA insulator)와 같은, 장기간 발현(long-term expression)을 부여하는 하나의 서열을 포함하는 바이러스 발현 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열이 전사되는 경우 SNARE 복합체, 및/또는 리보소옴 복합체를 파괴하고/하거나 GABA(A) 수용체를 활성화시키고/시키거나, 조건적으로 표적화된 뉴우런 제거를 유도함으로써 신경전달 또는 시냅스 전달을 무반응시키거나 억제하는 바이러스 발현 벡터.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 프로모터가 감각 신경수용체를 암호화하는 유전자의 프로모터, 바람직하게는 TRP 유전자 계열의 프로모터, 보다 바람직하게는 서열 번호: 1의 TRPV1 또는 서열 번호: 2의 TRPM8의 프로모터, 또는 감각 신경조절인자 또는 감각 신경전달물질을 암호화하는 유전자의 프로모터, 우선적으로 물질 P, PACAP, CGRP, ADVL의 프로모터, 보다 우선적으로 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 4의 CGRP, 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 6의 ADVL의 프로모터로부터 선택된 프로모터인 바이러스 발현 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터 또는 헤르페스 단성 바이러스(herpes simplex virus: HSV) 벡터, 바람직하게는 HSV-1 벡터 또는 HSV-2 벡터, 보다 바람직하게는 재조합 HSV 벡터 또는 앰플리콘 HSV 벡터와 같은, HSV로부터 기원한 결손 바이러스 벡터(defective virus vector)인 바이러스 발현 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열이 VAMP, SNAP-25 및 신탁신으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 합성을 억제하는 비-암호화 뉴클레오타이드 서열내로 전사된 바이러스 발현 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 비-암호화 뉴클레오타이드 서열이 안티센스 RNA (asRNA), 소 헤어핀(small hairpin) RNA (shRNA), 또는 마이크로RNA (miRNA), 우선적으로 안티센스 RNA (asRNA)로부터 선택된 바이러스 발현 벡터.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열이 SNARE 복합체를 파괴하는 야생형 또는 변형된 세균 신경독소 또는 이의 활성 단편, 또는 야생형 또는 변형된 GAD67 단백질 또는 이의 활성 단편, 또는 야생형 또는 현형된 리보소옴 불활성화 단백질(RIP) 또는 이의 활성 단편, 또는 야생형 또는 변형된 니트로리덕타제(NTR) 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 바이러스 발현 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 상기 야생형 또는 변형된 세균 신경독소의 활성 단편이 상기 세균 신경독소의 경쇄인 바이러스 발현 벡터.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 세균 신경독소가 임의의 혈청형의 클로스트리디움 보툴리늄(Clostridium botulinum)의 신경독소 또는 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani)의 테타누스 신경독소인 바이러스 발현 벡터.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 발현 벡터가 변형된 세균 신경독소 및 서열 번호: 28의 신탁신 1a(BoNTA-STX) 또는 서열 번호: 30의 (BoNTB-STX)의 시그널 펩타이드와 서열 번호: 32의 VAMP2 (BoNTC-VAMP)의 시그널 펩타이드 사이에서 선택된 시그널 펩타이드 도메인을 포함하는 바이러스 발현 벡터.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도:
    a) 클로스트리디움 테타니 또는 보툴리늄의 야생형 또는 변형된 신경독소 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 하나의 뉴클레오타이드 서열; 및/또는
    b) 이의 전사체가 단백질 VAMP, SNAP-25 및/또는 신탁신의 합성을 억제하는 하나의 뉴클레오타이드 서열; 및/또는
    c) 야생형 또는 변형된 GAD67 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 하나의 뉴클레오타이드 서열; 및/또는
    d) 야생형 또는 변형된 RIP 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 하나의 뉴클레오타이드 서열; 및/또는
    e) 야생형 또는 변형된 NTR 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 바이러스 발현 벡터.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    i. 하나의 상기 장기간 발현 서열(long-term expression sequence)이 제1항에 따른 2개의 전사 카세트에 작동적으로 연결되거나; 또는
    ii. 2개의 장기간 발현 서열이 둘 다 제1항에 따른 하나의 상기 전사 카세트에 작동적으로 연결되며; 여기서:
    a) 제1항에 따른 하나의 전사 카세트는 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 암호화 서열을 지니며, 제1항에 따른 제2의 전사 카세트는 제5항 또는 제6항에 따른 비-암호화 뉴클레오타이드내로 전사된 뉴클레오타이드 서열을 지니거나;
    b) 제1항에 따른 전사 카세트 둘 다는 제5항 또는 제6항에 따른 비-암호화 뉴클레오타이드 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 지니거나;
    c) 제1항에 따른 전사 카세트 둘 다는 클로스트리디움 테타니 및/또는 보툴리늄의 야생형 또는 변형된 신경독소 또는 이의 활성 단편; 또는 야생형 또는 변형된 GAD67 단백질 또는 이의 활성 단편; 또는 야생형 또는 변형된 RIP 또는 이의 활성 단편; 또는 야생형 또는 변형된 NTR 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 지니는 바이러스 발현 벡터.
  13. 의약으로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 발현 벡터를 포함하는 조성물.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따르는 적어도 하나의 바이러스 발현 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 신경성 배뇨근 과활성을 치료하기 위한 동시, 별도 또는 시차를 둔 사용을 위한,
    a) 제5항 또는 제6항에서 정의한 바와 같은 적어도 하나의 바이러스 발현 벡터; 및/또는
    b) 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에서 정의한 바와 같은 적어도 하나의 바이러스 발현 벡터; 및/또는
    c) 제11항 또는 제12항에서 정의한 바와 같은 적어도 하나의 바이러스 발현 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
  16. 신경성 배뇨근 과활성의 치료용으로 사용하기 위한, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 바이러스 발현 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 바이러스 발현 벡터, 또는 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물, 및 간혈적인 자극 펄스 훈련을 적용하여, 요도 괄약근 이완 간격으로 지속적인 배뇨근 근육 수축을 달성하여 뇨가 방뇨되도록 하기 위한, S2-S3-S4와 같은 천골 전방 루트(sacral anterior root)에 이식될 전극을 포함하는 전기 자극 시스템을 포함하는 키트(kit).
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