BR112018076635A2 - vetores virais para tratar hiperatividade neurogênica do detrusor - Google Patents

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François GIULIANO
Alberto Epstein
Olivier Le Coz
Alejandro ARANDA
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Universite De Versailles-St Quentin En Yvelines
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Abstract

  A presente invenção fornece um método e uma composição farmacêutica para o tratamento da NDO compreendendo o vetor de expressão viral portador de um cassete de transcrição que abriga transgene(s) que inibe(m)/silencia(m) a neurotransmissão ou transmissão sináptica de neurônios aferentes.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “VETORES VIRAIS PARA TRATAR HIPERATIVIDADE NEUROGÊNICA DO DETRUSOR”
[001] A presente invenção é direcionada a um vetor de expressão viral e uma composição farmacêutica do mesmo que seletivamente modula ou silencia os nervos aferentes da bexiga, como uma estratégia de terapia gênica para o tratamento da hiperatividade neurogênica do detrusor (NDO).
[002] Em particular, a presente invenção refere-se ao campo de controle do armazenamento de urina e esvaziamento da bexiga ou micção, que é dependente da atividade de duas unidades funcionais no trato urinário inferior: (1) um reservatório (a bexiga urinária) e (2) uma saída que consiste no colo vesical, uretra e músculos estriados do esfíncter uretral externo (EUS) (Fowler et al. 2008; Morrison et al. 2005). Essas estruturas são controladas por três conjuntos de nervos periféricos eferentes: parassimpático sacral (nervos pélvicos), simpático toracolombar (nervos hipogástricos e cadeia simpática lombo-sacral) e nervos somáticos (nervos pudendos) distribuídos bilateralmente (de Groat, 1986; Morrison et al. 2005). Esses nervos consistem em axônios do eferente originados nos níveis toracolombar e espinhal sacral. Os nervos eferentes parassimpáticos contraem a bexiga e relaxam a uretra. Os nervos eferentes simpáticos relaxam a bexiga e contraem a uretra. Os nervos eferentes somáticos contraem o EUS. Esses nervos também contêm neurônios aferentes que transmitem informação do trato urinário inferior para a medula espinhal lombossacral. Os corpos celulares dos neurônios aferentes do trato urinário inferior humano estão localizados nos gânglios da raiz dorsal S2-S4 e T11-L2 (DRG). Sensações de plenitude vesical são transmitidas para a medula espinhal pelos nervos pélvico e hipogástrico, enquanto a entrada sensível do colo vesical e da uretra é portada nos nervos pudendo e hipogástrico.
[003] Uma organização segmentar semelhante ocorre em primatas não humanos, gatos e cães. Em ratos, os corpos celulares dos neurônios aferentes dos nervos pélvico, pudendo e hipogástrico estão localizados no GRD L6-S1 e T11-L2, respectivamente. As vias neurais que controlam a função do trato urinário inferior são organizadas como simples circuitos de comutação ligar-desligar que mantêm uma relação alternada entre a bexiga urinária e a via de saída da uretra. Os reflexos de armazenamento são ativados durante o enchimento da bexiga e são organizados principalmente na medula espinhal, enquanto o esvaziamento é mediado por mecanismos reflexos que são organizados no cérebro (Fowler et al. 2008).
[004] Ao longo do enchimento da bexiga, a inervação parassimpática do detrusor é inibida e as partes lisas e estriadas do esfíncter uretral são ativadas, evitando o esvaziamento involuntário da bexiga. Este processo é organizado por reflexos uretrais conhecidos coletivamente como 'reflexo de defesa'. Eles são ativados pela atividade aferente da bexiga que é transportada através dos nervos pélvicos, e organizados por circuitos interneuronais na medula espinhal (Fowler et al. 2008).
[005] NDO refere-se a uma condição na qual a função da bexiga anormal é observada em pacientes com doenças neurológicas, tais como, doença cerebrovascular ou enfarte cerebral, lesão cerebral ou da medula espinal devido a traumatismo, esclerose múltipla, doença de Parkinson, por exemplo, má formação congênita, por exemplo, espinha bífida, ou doença, por exemplo, paraplegia espástica hereditária do sistema nervoso central, neuropatia periférica e várias lesões espinais, isto é, compressão da medula espinhal e lesão por fratura de vértebra(s), espondilose cervical e lombar, espondilose deformante, espondilolistese, estenose espinhal, hérnia de disco vertebral e semelhantes.
[006] A NDO é caracterizada por contrações involuntárias do detrusor (bexiga) durante a fase de enchimento, que podem ser espontâneas ou provocadas devido a uma condição neurológica relevante. Está frequentemente associada a dissinergia vesico-esfincteriana.
[007] NDO devido à lesão medular (LME) é a forma mais grave de NDO.
Imediatamente após a lesão medular, há um período de choque espinhal com duração de 2-12 semanas, durante o qual a bexiga é reflexiva, responsável pela completa retenção urinária.
Então, um reflexo espinhal da micção progressivamente se desenvolve que é responsável pela NDO.
Para pacientes com LME, esses comprometimentos levam à incontinência urinária e ao aumento da pressão da bexiga, que, se não tratada, pode danificar o trato urinário superior e precipitar a insuficiência renal.
A incontinência urinária está associada a uma carga significativa e prejudica gravemente a qualidade de vida.
Em pacientes com LME, infecções recorrentes do trato urinário devido a esvaziamento incompleto da bexiga e insuficiência renal continuam sendo a primeira causa de reinternação e segunda causa de mortalidade, respectivamente.
A LME rompe o controle voluntário do esvaziamento, bem como as vias reflexas normais que coordenam as funções da bexiga e do esfíncter.
Em lesão espinhal suprassacral, NDO resulta do desmascaramento de um reflexo segmentar ao nível da medula sacral, mediada por fibras C nociceptivas aferentes da bexiga (de Groat e Yoshimura, 2006). Estas fibras C silenciosas tornam-se mecanicamente sensíveis e iniciam o reflexo automático de micção após a LME.
Esse reflexo é facilitado após a eliminação do controle supraespinal. A plasticidade ocorre em aferentes da bexiga e está associada a mudanças nas propriedades dos canais de íons e excitabilidade elétrica de neurônios aferentes, e parece ser mediada, em parte, por fatores neurotróficos liberados na medula espinal e nos órgãos alvo periféricos. No geral, o substrato neurobiológico para NDO compreende alterações funcionais no urotélio e sub-urotélio da bexiga, bem como mensagens sensoriais aferentes aumentadas para a medula espinhal, originadas na bexiga. Estímulos de aferentes exacerbados da bexiga, resultantes de hipertrofia e hiperatividade de neurônios aferentes da bexiga tipo C não mielinizados, são os principais mecanismos causadores de NDO em indivíduos com LME.
[008] O padrão de cuidado para o tratamento de NDO consiste na inibição da neurotransmissão eferente no nível do detrusor. Assim, os pacientes com NDO são atualmente tratados com antimuscarínicos, que bloqueiam a atividade dos receptores muscarínicos de acetilcolina inibindo assim as contrações do detrusor, e/ou injeção intradetrusora repetida de neurotoxina A de Clostridium botulinum (BoNT- A), novamente para bloquear as contrações do detrusor atuando nos eferentes da bexiga. Ambos os tratamentos devem ser combinados com cateterismo intermitente da bexiga (5-6 vezes/dia).
[009] As injeções de BoNT-A suprimem a formação do complexo SNARE, bloqueando a fusão de vesículas cheias de neurotransmissores com a membrana plasmática dos neurônios eferentes e sua liberação durante a exocitose. Por conseguinte, a injeção de BoNT-A é usada como medicação para o tratamento de pacientes com bexiga hiperativa de origem neurogênica ou não. Por exemplo, os pedidos de patente PCT WO 99/03483 e WO 2010/022979 descrevem o uso de injeção de BoNT-A para impedir que um nervo estimule o seu tecido alvo, por exemplo, um músculo, uma glândula ou outro nervo, para o tratamento de vários distúrbios urinários.
[0010] WO2013/180799 descreve o uso de um vetor viral que codifica uma neurotoxina botulínica modificada, produzindo desse modo uma proteína que possui propriedades de ligação melhoradas aos seus receptores humanos. Após a produção em linhagens celulares, uma vez recuperada e purificada a partir dos sobrenadantes, esta neurotoxina pode ser aplicada localmente para tratar uma condição associada à atividade neuronal indesejada, tal como NDO. No entanto, esses vetores não são concebidos para uma abordagem de terapia gênica.
[0011] No entanto, a injeção de neurotoxinas botulínicas apresenta o inconveniente da difusão da toxina, que é em grande parte devido à difusão de toxinas para outras regiões do corpo. Os efeitos adversos variam desde eventos transitórios não graves, como ptose e diplopia, até eventos com risco de vida, até a morte. Além disso, para NDO, essas injeções devem ser repetidas, em média, a cada 6 meses, devido à diminuição das horas extras de eficácia.
[0012] Como a NDO, com ou sem dissinergia do esfíncter da bexiga, causado por lesões espinais suprassacrais é devido ao surgimento de um reflexo anormal mediado por aferências da bexiga (fibras ad e c), uma abordagem alternativa para o tratamento de NDO foi desenvolvida por Brindley (Brindley et al 1986). Esta abordagem combina rizotomias sacrais posteriores e estimulação sacral das raízes anteriores (SARS). Este tratamento parece ser um dos métodos terapêuticos mais eficazes para a NDO causada por lesões completas espinhais suprassacrais: rizotomias sacrais aumentam permanentemente a complacência da bexiga e elimina a hiperatividade das dissinergias detrusor-esfincteriana e de detrusor, que são as principais causas de insuficiência renal e incontinência urinária, enquanto o implante de um estimulador das raízes espinais anteriores permite ao paciente obter e controlar a micção.
[0013] A desaferentação por rizotomias sacrais posteriores, proposta por Brindley (1986), consiste na transecção cirúrgica completa de todas as fibras neurais aferentes para os segmentos S2-S4 espinhais, incluindo aquelas que fornecem entradas sensoriais do músculo detrusor. Desta forma, os estímulos sensoriais do músculo detrusor não podem mais atingir o sistema nervoso central e, consequentemente, as atividades de reflexo geradas pelo sistema nervoso central, causando contrações descontroladas da bexiga, podem ser inibidas. O procedimento é necessário para prevenir as atividades de reflexo exacerbadas do detrusor e permite que uma quantidade maior de urina seja armazenada com baixa pressão vesical. Entretanto, a desaferentação da bexiga obtida a partir de desaferentação pelviperineal extensiva, não seletiva e irreversível, por rizotomias sacrais posteriores (S2-S4) apresenta muitas armadilhas e desvantagens, pois é responsável pela perda da sensação remanescente pelviperineal se presente, prejudicando o orgasmo se presente, ereção e ejaculação por reflexo, se presente, e micção e defecação por reflexo, se presente, e, possivelmente, facilitando escaras por causa da perda da inervação sensorial da pele. Além disso, a magnitude do procedimento neurocirúrgico o torna caro e pode ser responsável pelas fístulas do líquido cefalorraquidiano e, a longo prazo, pela artropatia espinhal de Charcot.
[0014] Consequentemente, há uma necessidade de uma nova estratégia para tratar NDO em caso de lesão supraespinal, visando especificamente sua fisiopatologia,
ou seja, o reflexo espinal anormal mediado por aferências da bexiga, mas sem afetar outros neurônios aferentes transmitidos nos mesmos nervos, poupando os neurônios eferentes da bexiga. A estratégia que foi proposta é uma abordagem de terapia gênica resultando em desaferentação seletiva da bexiga molecular, para restaurar a continência e a micção em pacientes com NDO quando combinados com a estimulação de raízes anteriores sacrais. Isto foi conseguido por uma nova estratégia que requer um vetor de expressão viral capaz de fornecer transgene(s) terapêutico(s) apresentando: - capacidade de inibir/silenciar a neurotransmissão ou transmissão sináptica de neurônios aferentes; - alta seletividade, notadamente para os neurônios aferentes da bexiga; - alta eficiência; - estabilidade de expressão ao longo do tempo; e - ausência de enervação fora do alvo.
[0015] No contexto da presente invenção, verificou- se surpreendentemente que, após a injeção do vetor de expressão viral na parede da bexiga, é possível obter a expressão de transgenes seletiva e estável nos neurônios aferentes da bexiga, usando um vetor de expressão viral que expressa estavelmente ao longo do tempo proteínas e/ou transcritos para tratar NDO, especificamente inibindo/silenciando a neurotransmissão ou transmissão sináptica de neurônios aferentes da bexiga no nível da medula espinhal.
[0016] A presente invenção fornece um método e uma composição farmacêutica para o tratamento da NDO compreendendo o vetor de expressão viral que porta um cassete de transcrição que abriga transgene (s) inibindo/silenciando a neurotransmissão ou transmissão sináptica de neurônios aferentes. De preferência, o método e uma composição farmacêutica de acordo com a invenção compreendem um vetor de expressão viral portador de um cassete de transcrição que abriga o(s) transgene(s) que rompe (m) o complexo SNARE e/ou o complexo ribossomal e/ou a ativação de receptores GABA(A) e/ou induzir a ablação de neurônios condicionalmente direcionados, quando transcritos, que inibem/silenciam a neurotransmissão ou a transmissão sináptica de neurônios aferentes da bexiga.
[0017] O termo “cassete de transcrição” como aqui usado refere-se a qualquer sequência de ácidos nucleicos contendo um promotor e uma sequência codificadora a jusante ou transgene, cuja expressão que é direcionada pelo referido “promotor, que é seguida por um sinal de poliadenilação. O termo “transgene” refere-se a uma sequência particular de ácido nucleico que codifica um RNA e/ou um polipeptídeo ou uma porção de um polipeptídeo a ser expressado em uma célula na qual a sequência de ácidos nucleicos é introduzida.
O termo “transgene” inclui (1) uma sequência de ácidos nucleicos que não é encontrada naturalmente na célula (isto é, uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga); (2) uma sequência de ácidos nucleicos que é uma forma mutante de uma sequência de ácidos nucleicos encontrada naturalmente na célula na qual foi introduzida; (3) uma sequência de ácidos nucleicos que serve para adicionar cópias adicionais da mesma sequência de ácidos nucleicos (isto é, homóloga) ou uma sequência de ácidos nucleicos semelhante de ocorrência natural na célula na qual foi introduzida; ou (4) uma sequência de ácidos nucleicos de ocorrência natural ou homóloga silenciosa, cuja expressão é induzida na célula na qual foi introduzida.
Por “forma mutante” entende-se uma sequência de ácidos nucleicos que contém um ou mais nucleotídeos que são diferentes da sequência natural ou do tipo selvagem, isto é, a sequência de ácidos nucleicos mutante contém uma ou mais substituições, eliminações e/ou inserções de nucleotídeos.
Em alguns casos, o transgene também pode incluir uma sequência que codifica um peptídeo líder ou uma sequência sinal de modo que o produto transgênico será secretado da célula, ou o transgene pode incluir um peptídeo líder ou uma sequência sinal mais um peptídeo âncora de membrana ou mesmo ser uma proteína de fusão entre duas proteínas de ocorrência natural ou parte delas, de modo que o transgene permanecerá ancorado nas membranas celulares.
[0018] Como aqui usado, o termo “complexo ribossômico” refere-se a um complexo que é essencialmente composto pelas subunidades dos ribossomas, tais como, as subunidades 80S e 70S que catalisam a síntese de proteínas, referida como tradução.
[0019] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece assim um vetor de expressão viral compreendendo pelo menos: a) um promotor seletivamente ativo nos neurônios aferentes da bexiga, b) um cassete de transcrição compreendendo uma sequência de nucleotídeos operacionalmente ligada ao referido “promotor, em que a referida sequência de nucleotídeos silencia ou inibe a transdução do sinal de neurotransmissor na célula pós-sináptica quando transcrita, e c) uma sequência que confere expressão a longo prazo, tal como a conhecida como LTE (Lokensgard et al., 1997) e/ou contendo isoladores de DNA (Amelio et al., 2006) do genoma de HSV-l, operacionalmente ligada ao referido cassete de transcrição.
[0020] Em uma modalidade preferida, a sequência de nucleotídeos do vetor de expressão viral de acordo com a invenção silencia ou inibe a transmissão neurotransmissora ou sináptica quando transcrita ou traduzida pela ruptura do complexo SNARE e/ou do complexo ribossomal e/ou pela ativação dos receptores de GABA (A), e/ou induzir a ablação de neurônios condicionalmente direcionados.
[0021] Em uma modalidade preferida, a sequência de nucleotídeos do vetor de expressão viral de acordo com a invenção, quando transcrita, rompe pelo menos uma das proteínas selecionadas de VAMP, SNAP-25 ou sintaxina la, que fazem parte do complexo SNARE, ou codifica a proteína GAD67 ou um fragmento ativo da mesma, ou codifica uma proteína que rompe o complexo ribossomal ou um fragmento ativo do mesmo, ou codifica uma proteína que induz a ablação de neurônios condicionalmente direcionada, ou um fragmento ativo da mesma.
[0022] Em uma modalidade particular, a referida proteína que rompe o complexo ribossomal de acordo com a invenção é uma proteína de inativação de ribossoma de tipo selvagem ou modificada (RIP) ou um fragmento ativo da mesma, de preferência, a referida RIP é selecionada de tipo 1 ou tipo 2, de preferência, a RIP de tipo 1 é selecionada de saporina, gelonina, diantina, tricosantina; e a RIP do tipo 2 é selecionada de ricina, volkensina e abrina, de preferência, a RIP do tipo ll é a saporina S6 ou um fragmento ativo da mesma.
[0023] O termo “proteína que induz a ablação de neurônios condicionalmente direcionados” refere-se a uma proteína que converte substratos pró-fármacos inócuos, tais como, metronidazol (MTZ), em agentes de reticulação de DNA citotóxicos - fornecendo ablação específica de célula do tipo de célula alvo, ou seja, neurônio aferente da bexiga. Exemplo de tal proteína que induz a ablação de neurônios condicionalmente direcionada são nitrorredutases (NTR).
[0024] A proteína que induz a ablação de neurônio direcionada condicional de acordo com a invenção é por isso selecionada do grupo consistindo em uma NTR de tipo selvagem ou modificada ou um fragmento ativo da mesma. De preferência, a referida NTR é selecionada do grupo consistindo em nitrorredutases NAD(P)H insensíveis a oxigênio ou de tipo selvagem ou um fragmento ativo da mesma, de preferência, a NTR é selecionada do grupo consistindo em um tipo selvagem ou nitrorredutases de E. coli modificadas, ainda mais de preferência, a referida NTR é do tipo selvagem ou um nfnB de E. coli modificada ou um fragmento ativo da mesma.
[0025] O termo “vetor viral” ou “vetor de expressão viral” como usado aqui refere-se a um vetor de ácido nucleico que inclui pelo menos um elemento de um genoma de vírus e pode ser acondicionado em uma partícula viral. No contexto da presente invenção, o termo “vetor viral” tem de ser entendido de uma forma abrangente como incluindo vetor de ácido nucleico (por exemplo, vetor viral de DNA) bem como partículas virais geradas a partir do mesmo. De acordo com a presente invenção, o vetor de expressão viral é um vetor de vírus adeno-associado (AAV) ou um vetor de vírus herpes simplex (HSV), de preferência, um vetor de HSV-1 ou um vetor de HSV-2, ainda mais, de preferência, um vetor viral defeituoso do HSV-l1. Como aqui usado, o termo “vetor viral defeituoso” refere-se a vetores virais que faltam genes ou partes de genes necessários para completar com sucesso o ciclo de vida viral.
[0026] De acordo com a presente invenção, o termo “AAV” refere-se ao próprio vírus adeno-associado ou aos derivados do mesmo, incluindo partículas de vetor AAV recombinantes. Além disso, como aqui usado, o termo “AAV” inclui muitos serotipos diferentes, que foram isolados de amostras de primatas de humanos e não humanos. Os serotipos de AAV preferidos são os serotipos humanos, mais de preferência, o AAV humano dos serotipos 2, 5 e 9, mais de preferência, o AAV humano de serotipo 5, que é o serotipo que apresenta o nível mais alto de neurotropismo.
[0027] De acordo com a presente invenção, o termo “vetor viral defeituoso derivado de HSV” refere-se aos vetores de HSV recombinantes defeituosos e aos vetores de
HSV do amplicon.
Os termos “HSV recombinante defeituoso", como usado aqui, descreve um vetor independente auxiliar, cujo genoma compreende, pelo menos, eliminações completas dos genes que codificam duas proteínas essenciais, conhecidas como ICP4 e ICP27. O gene ICP4 está presente em duas cópias, localizadas nas sequências repetidas invertidas conhecidas como c e c'” do genoma do vírus, e ambas as cópias desse gene são eliminadas.
O gene que codifica o ICP27 está localizado na única sequência longa (UL) do genoma do vírus.
De preferência, os vetores independentes auxiliares de acordo com a invenção porta (m) cassete(s) de transcrição terapêutica incorporada no locus de LAT (Transcritos Associados a Latência) (Berthomme et al. 2000 e Berthomme et al. 2001), que é um locus repetido que está contido nas sequências repetidas invertidas conhecidas como b e bb" do genoma do vírus.
Mais de preferência, o cassete de transcrição é colocado entre o Promotor Associado à Latência (LAP) e a região da Expressão a Longo Prazo (LTE) (sítio 1), ou entre a região de LTE e à sequência do Isolador de DNA (INS) a jusante de LTE (site 2) (como mostrado na Figura 1). Os vetores recombinantes de HSV-1 defeituosos de acordo com a presente invenção portam cassete(s) de transcrição que expressa(m) os diferentes transgenes descritos acima, de modo a inibir/silenciar a neurotransmissão, isto é, expressando toxinas botulínicas de cadeia leve de tipo selvagem ou modificadas e/ou RNA antissentido (RNA-AS) direcionadas(o) a proteínas SNARE, e/ou GAD67, e/ou RIPs, e ou NTRs, todos eles direcionados por promotores específicos para DRG a longo prazo como descrito na presente invenção. As sequências b e b' do genoma do vírus também são conhecidas como TRL (Repetição Terminal L) e IRL (Repetição Interna L) respectivamente, enquanto as sequências c"” e c também são conhecidas como IRS (Repetição Interna S) e TRS (Repetição Terminal S), onde L e S referem-se respectivamente às sequências únicas longas (L) e únicas curtas (S) do genoma do HSV-l1. Além disso, os vetores independentes auxiliares de acordo com a invenção podem compreender eliminações adicionais em genes que codificam proteínas não essenciais, tais como as proteínas ICP34.5, UL55, UL56 e UL41. Esses vetores de HSV defeituosos são multiplicados em linhagens celulares expressando simultaneamente as proteínas ICP4 e ICP27 (Marconi et al, 2010).
[0028] O WO 2006/050211 descreve o uso de um vetor de HSV-1 defeituoso para terapia gênica da dor.
[0029] No entanto, os vetores de acordo com a invenção diferem do vetor descrito em WO 2006/050211 em vários aspectos significativos, que são importantes no que se refere ao uso e à eficácia dos vetores de acordo com a invenção. Mais importante, os cassetes de transcrição transgênicos de acordo com a invenção são introduzidos no locus de LAT, uma vez que esta região contém LTE e as sequências isoladoras de DNA (INS) que conferem expressão a longo prazo aos promotores específicos de DRG que conduzem a expressão transgênica em cassetes de transcrição de acordo com a invenção, enquanto que o vetor descrito em WO 2006/050211 foi concebido e provado para ação de curto prazo e, consequentemente, os seus cassetes de transcrição são conduzidos por promotores ubíquos e não foram introduzidos nas regiões de LAT.
[0030] Por “amplicon ou vetor de amplicon” entende- se um vetor dependente de auxiliar, cujo genoma não possui a maioria ou todos os genes de HSV que codificam proteínas virais. O genoma dos vetores de amplicon é um DNA concatemérico composto de múltiplas cópias em tandem de um plasmídeo - conhecido como o plasmídeo de amplicon - que carrega uma origem de replicação do DNA e um sinal de acondicionamento do genoma do HSV-1, além do DNA transgênico (isto é, cassetes) de interesse. Os plasmídeos de amplicon de acordo com a presente invenção portam cassetes de transcrição que expressam os diferentes transgenes acima descritos de modo a inibir/silenciar a neurotransmissão, isto é, expressando toxinas botulínicas da cadeia leve de tipo selvagem ou modificadas e/ou RNA interferente (RNAi) direcionadas(o) a proteínas SNARE e/ou
GAD67 e/ou RIPs e/ou NTRs, todos eles conduzidos por promotores a longo prazo, de preferência, promotores específicos de DRG a longo prazo, como descrito na presente invenção (ver Figura 2).
[0031] Em uma modalidade preferida, o vetor de acordo com a invenção é um vetor recombinante deficiente, sem pelo menos os genes que codificam para as proteínas essenciais ICP4 e ICP27, de preferência, um vetor sem ICP4 e ICP27. Este vetor pode não possuir outros genes, codificadores de proteínas não essenciais, tais como, proteínas do gene ICP34.5, UL55, UL56 e/ou UL41, e porta o(s) cassete(s) de transcrição específico(s) de DRG, descrito na Figura 7, incorporado nas regiões de LAT do genoma do vetor.
[0032] Em outra modalidade, o vetor de acordo com a invenção um vetor de amplicon possuindo os cassetes de transcrição acima descritas acionadas por promotores específicos para DRG a longo prazo, como descrito em outras partes deste documento.
[0033] Em uma modalidade preferida, o cassete de transcrição de acordo com a invenção é introduzido no locus de LAT.
[0034] A expressão “DNA Recombinante”, como usado aqui, descreve uma molécula de ácido nucleico, isto é, um polinucleotídeo de origem genômica, CcDNA, viral, semi-
sintética e/ou sintética que, em virtude de sua origem ou manipulação, não está associada a todos ou a uma porção do polinucleotídeo com o qual é associada na natureza. O termo “recombinante” como usado em relação a vírus significa um vírus portador de um genoma recombinante ou um genoma que foi manipulado para introduzir mutações, eliminações ou um ou mais polinucleotídeos heterólogos, incluindo genes. O termo “recombinante” como usado em relação a uma proteína ou um polipeptídeo, significa um polipeptídeo produzido pela expressão de um ácido nucleico recombinante. O termo “recombinante” como usado em relação a uma célula hospedeira significa um vetor recombinante que porta DNA recombinante dentro da célula hospedeira ou uma célula que contém DNA recombinante inserido no seu genoma. O termo “infecção” refere-se à capacidade de um vetor viral para entrar em uma célula hospedeira ou um indivíduo.
[0035] Vetores defeituosos derivados do HSV permitem infectar neurônios sensoriais vizinhos e estabelecer infecções latentes no núcleo desses neurônios, localizados no trigêmeo ou nos gânglios da raiz dorsal (DRG), dependendo do sítio da infecção. Em particular, o HSV-l naturalmente infecta os neurônios sensoriais e estabelece infecções latentes ao longo da vida no núcleo desses neurônios. Assim, pode-se supor que, após a injeção na parede da bexiga, os vetores, tais como, vetor derivado de HSV-l1, atinjam o DRG sensível que inerva a bexiga, de onde expressarão de forma estável o transgene terapêutico, desde que promotores específicos de neurônios aferentes adequados da bexiga conduzem sua expressão.
No entanto, o HSV-1 também pode infectar e estabelecer infecções latentes em neurônios autônomos (Furuta et al., 1993; Warren et al. 1978), e resultados preliminares demonstram que esse é realmente o caso quando o vetor é inoculado na bexiga.
Portanto, é obrigatório que a expressão dos vetores seja totalmente controlada por promotores específicos de aferentes, também chamados de promotores seletivos ou promotores específicos de neurônios aferentes seletivos, a fim de se obter expressão transgênica significativa apenas nesses neurônios (isto é, neurônio aferente), evitando assim expressão em neurônios autonômicos, também chamado eferentes.
Desaferentação molecular ou bioquímica seletiva (como oposta à cirúrgica) de neurônios aferentes da bexiga é o aspecto mais crítico da presente invenção, pois é importante preservar a sensibilidade pelviperineal remanescente se presente, orgasmo se presente, ereção reflexa e ejaculação se presentes, e micção e defecação de reflexo se presentes, todos transmitidos pelos nervos sensoriais da pélvis, que não se originam na bexiga.
Além disso, a desaferentação seletiva da bexiga também permitiria preservar os neurônios eferentes da bexiga, que poderiam ser posteriormente estimulados por estimulação elétrica, por exemplo, via eletrodos. Alguns estudos descrevem o uso de vetores com base no HSV-l1, nos quais os cassetes de transcrição compreendem promotores transientes (Miyazato et al., 2009) ou a longo prazo (Puskovic et al., 2004; Miyagawa et al., 2015; WO 2015/009952Al). No entanto, os promotores usados nos estudos de Puscovic (LAP2), Miyazato (promotor de HCMV) e Miyagawa (promotor CAG artificial) não são seletivos, levando à expressão de seus transgenes em muitos tipos de células, incluindo neurônios autônomos, neurônios cerebrais e células não neuronais. Em contraste, combinando sequências reguladoras virais e promotores celulares específicos de neurônios aferentes, alguns dos vetores de acordo com a presente invenção permitem uma expressão específica de neurônios aferentes significativamente maior dos transgenes de interesse (ver Figura 13).
[0036] Os vetores usados na prática da invenção incluem pelo menos um promotor seletivamente ativo em neurônios aferentes que está operacionalmente ligado a nucleotídeos (usualmente DNA) que codificam uma molécula de RNA. Por “operacionalmente ligado” entende-se aqui que, no vetor, o promotor está associado aos nucleotídeos que codificanm o RNA de uma maneira que permite ao promotor conduzir a transcrição (isto é, expressão) do RNA dos nucleotídeos. Transcrição de RNA de, por exemplo, um molde de DNA é bem compreendido.
[0037] Um “promotor'", como aqui usado, é uma região reguladora de DNA capaz de ligar a RNA polimerase em uma célula de mamífero e iniciar a transcrição de uma sequência operacionalmente ligada a jusante (direção 3'). Para fins da presente invenção, uma sequência promotora inclui pelo menos o número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar a transcrição de um gene de interesse em níveis detectáveis acima do fundo. Dentro da sequência promotora está um sítio de iniciação da transcrição, bem como domínios de ligação da RNA polimerase. Os promotores eucarióticos irão muitas vezes, mas nem sempre, conter caixas “TATA” e outros motivos de DNA, tais como caixas “CAT” ou “SPI”. O promotor de acordo com a invenção compreende uma sequência de DNA que inicia pelo menos 2 kb, de preferência 3 kb, mais de preferência 4 kb a montante do sítio de iniciação do mensageiro que codifica produtos gênicos relevantes, específicos. Estas sequências contêm, de preferência, elementos de sequências de promotores conhecidos, tais como, locais de ligação de transcrição específicos e sequências distais a montante do gene, contendo elementos reguladores adicionais.
[0038] Por “ativo seletivamente em neurônios aferentes” entende-se aqui que o promotor é ativo principalmente ou apenas nos neurônios aferentes, de preferência, em neurônios aferentes da bexiga e conduz a transcrição (isto é, expressão) do RNA.
[0039] Além disso, os habilitados na técnica reconhecerão que muitos desses promotores específicos de neurônios —aferentes de mamífero são conhecidos, e promotores específicos de neurônios aferentes adicionais estão continuamente a ser descobertos. Todos esses promotores específicos de neurônios aferentes estão abrangidos pela presente invenção. No entanto, muitos candidatos a promotores específicos de células mostraram exibir seletividade apenas quando expressam a partir da sua localização endógena nos cromossomas celulares (McCart et al., 2002; Vassaux et al., 1996). Não há como prever como esses promotores se comportarão quando introduzidos no genoma de um vetor de expressão não integrativa, tais como vetores de HSV. Notavelmente, não se pode antecipar se os promotores aferentes específicos de neurônios reterão a mesma atividade específica do neurônio aferente. Isto é porque (a) os nucleossomas ligados ao promotor podem diferir em vários aspectos (por exemplo, eles podem estar em uma configuração repressiva ou permissiva) de acordo com a localização do promotor (nos cromossomos versus no genoma do vetor extra-cromossômico, ou mesmo entre diferentes posições nos cromossomos celulares) e também (b) porque a acessibilidade de fatores de transcrição positivos ou negativos também pode ser diferente. Isso significa que cada promotor candidato deve ser minuciosamente estudado em cada ambiente específico (isto é, vetor epissomal vs. localização cromossômica) para estabelecer se ele retém ou não sua atividade específica de neurônio aferente quando colocado no genoma do vetor, como fizemos experimentalmente (ver resultados no Exemplo 11 e na Figura 13).
[0040] Em uma modalidade preferida, o promotor de acordo com a invenção é selecionado de promotores de genes que codificam neuroreceptores sensoriais, tais como, oO Receptor de Potencial Transiente Valinoide (TRPV1) ou Receptor de Potencial Transiente membro 8 de subfamília M de canal de cátion (TRPM8), ou de promotores de genes que codificam neuromoduladores sensoriais ou neurotransmissores sensoriais, tais como, promotores da Substância P, PACAP Peptídeo Relacionado com o Gene da Calcitonina (CGRP) de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4. De preferência, promotor de genes que codificam neuroreceptores sensoriais de acordo com a invenção é um promotor da família dos genes TRP, mais de preferência, o promotor TRPV1l de SEQ ID NO: 1 ou TRPM8 de SEQ ID NO: 2. De preferência, os promotores de genes que codificam para neuromoduladores sensoriais ou neurotransmissores sensoriais de acordo com a invenção são os CGRP de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, ou o promotor de genes envolvidos no crescimento de neuritos e resposta ao estresse em neurônios sensoriais, de preferência, o promotor do gene que codifica advilina (ADVL) de SEQ ID NO: ou SEQ ID NO: 6.
[0041] O vetor de expressão viral da invenção é direcionado mais particularmente a vertebrados, de preferência a mamíferos, mais de preferência, primatas e humanos. Por conseguinte, os habilitados na técnica reconhecerão que tais promotores são específicos para espécies e serian capazes de selecionar sequências homólogas de uma determinada espécie de interesse. Em particular, os promotores de acordo com a invenção são homólogos humanos de TRPV1 de rato de SEQ ID NO: 1 ou TRPM8 humano de SEQ ID NO: 2, ou CGRP de SEQ ID NO: 3 de rato, ou CGRP de SEQ ID NO: 4 humano ou advilina de rato de SEQ ID NO: 5 ou advilina humana de SEQ ID NO: 6, entre outros.
[0042] Por “sequência de expressão a longo termo” ou “elemento de expressão a longo prazo (LTE)” entende-se uma sequência de nucleotídeos operacionalmente ligada ao referido cassete de transcrição incluída na sequência do vetor de expressão viral, permitindo sustentar a expressão de um produto gênico durante mais de 15 a 45 dias ou de 30 a 45 dias, de preferência de 45 a 90 dias, mais de preferência de 90 a 365 dias, ainda mais de preferência 365 dias a vários anos ou ainda mais de preferência durante a vida do paciente.
[0043] Sequências de expressão a longo prazo (LTE) foram identificadas no HSV-1 como uma região dos transcritos associados à Latência (LAT), que se originam do promotor associado ao LAT (LAP). Esta LTE está localizada a jusante do sítio de início da transcrição de LAT. De fato, os vírus que abrigam um fragmento de DNA 3' do promotor de LAT mantiveram a expressão do promotor detectável ao longo da Latência (Lokensgard et al, 1997, Berthomme et al., 2000, 2001). De preferência, a LTE está compreendida entre cerca de 1,5 kb a cerca de 3 kb a jusante do sítio de início da transcrição de LAT (Perng et al., 1996). Mais recentemente, sequências adicionais, conhecidas como isoladores de DNA, também foram descritas tanto a montante e a jusante da região de LTE (Amelio et al., 2006). Estas sequências também contribuem para proporcionar expressão a longo prazo a um dado cassete de transcrição, provavelmente através da inibição do silenciamento epigenético, e também serão incorporadas na presente invenção como parte dos elementos de LTE, para conferir expressão a longo prazo ao cassete de transcrição. Curiosamente, as sequências que conferem expressão a longo prazo ao cassete de transcrição (a LTE e as sequências isoladoras de DNA) podem ser colocadas a montante e/ou a jusante do cassete de transcrição.
[0044] Os habilitados na técnica reconhecerão que outras sequências semelhantes a LTE, bem como outras sequências isoladoras de DNA, foram descritas e estão continuamente a ser descobertas. Todas essas sequências como LTE e sequências isoladoras de DNA são abrangidas pela presente invenção.
[0045] Em uma modalidade preferida, o vetor de expressão viral da invenção compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos que é transcrita em uma sequência de nucleotídeos não codificadora que inibe a síntese de pelo menos uma proteína selecionada de VAMP, SNAP-25 e sintaxina, que fazem parte do complexo SNARE.
[0046] O complexo SNARE (receptor de proteína de ligação ao fator sensível ao N-etilmaleimida solúvel) é um dos dois componentes chave da maquinaria de fusão de membrana com as proteínas SM (Secl/Muncl18). O complexo SNARE compreende os “v-SNARES” associados à vesícula (Proteínas de Membrana Associadas a Vesículas, VAMPs, particularmente VAMP1, 2 e 3) e as Sintaxinas “t-SNAREs” associados à membrana alvo (Sin-l, 2, 3, e 4) e Proteína Associada a Sinaptossoma de 25 kDa (SNAP-25) que se agrupam em complexos para mediar diferentes eventos de fusão.
[0047] Por conseguinte, uma modalidade da presente invenção é direcionada a métodos capazes de silenciar um gene específico e/ou de destruir a proteína codificada correspondente (um “gene de interesse” ou “gene direcionado” ou “gene selecionado”). Ao “silenciar” um gene, queremos dizer que a expressão do produto gênico é reduzida ou eliminada, em comparação com um gene de controle correspondente que não está sendo silenciado. Os habilitados na técnica estão familiarizados com o conceito de comparar os resultados obtidos com os resultados de controle versus resultados experimentais. sem estar limitado pela teoria, acredita-se que o silenciamento é caracterizado por degradação específica de mRNA ou bloqueio de mRNA na tradução após a expressão de uma sequência complementar não codificante, tal como RNA antissentido (asRNA), um pequeno RNA de grampo (sShRNA), um microRNA (MiRNA), ou qualquer outra forma de RNA interferente (iRNA) nas células.
[0048] Como aqui usado, o termo “antissentido” refere-se a moléculas de ácido nucleico de cadeia simples não modificadas ou quimicamente modificadas que são relativamente curtas em geral e que são capazes de se hibridizarem com uma sequência única no grupamento total de alvos presentes nas células, a sequência de referida molécula de ácido nucleico complementar em virtude da hibridização de Watson-Crick pb, a um mRNA específico e capaz de inibir a expressão de mRNA e, depois, induzir um bloqueio na transferência de informação genética de DNA para proteína.
[0049] No contexto da invenção, “interferência de RNA” (daqui em diante referido como RNAi) é interpretado como um processo pelo qual um RNA de cadeia dupla (dsRNA) com uma sequência nucleica de determinado sentido leva à quebra de todo o RNA mensageiro (mRNA) compreendendo a referida sequência nucleica, de um modo específico para a referida sequência nucleica. Embora o processo de RNAi tenha sido originalmente demonstrado em Caenorhabditis elegans, agora está claro que o processo de RNAi é um fenômeno muito genérico, e a inibição de genes humanos por RNAi foi alcançada.
[0050] O processo de RNAi pode ser alcançado usando RNA interferente pequeno (ou siRNA). Estes siRNAs são dsRNA de menos de 30 nucleotídeos de comprimento, compreendendo em sua sequência de sentido uma sequência que é altamente complementar a um fragmento do mRNA alvo. Quando um siRNA cruza a membrana plasmática, a reação da célula é destruir o SiRNA e todas as sequências que compreendem uma sequência altamente complementar. Assim, um mRNA com um fragmento que é altamente complementar à sequência de siRNA será destruído, a expressão deste gene sendo assim inibida.
[0051] O shRNA também pode ser usado como inibidor de acordo com a presente invenção. Como usado aqui, uma “molécula de shRNA” inclui um SshRNA de enovelamento de haste convencional, que forma um miRNA precursor (pre- mMiRNA). “ShRNA” também inclui shRNAs embutidos em micro-RNA (ShRNAs com base em miRNA), em que a cadeia guia e a cadeia passageira do miRNA duplex são incorporadas em um miRNA existente (ou natural) ou em um miRNA modificado ou sintético (projetado). Quando transcrito, um ShRNA convencional forma um miRNA primário (pri-miRNA) ou uma estrutura muito semelhante a um pri-miRNA natural. O pri- miRNA é posteriormente processado por Drosha e seus cofatores em pre-miRNA. Portanto, o termo “shRNA” inclui moléculas de pri-miRNA (shRNA-mir) e moléculas pré-miRNA.
[0052] Em geral, “reduzido ou eliminado” refere-se a uma redução ou eliminação de quantidades detectáveis do produto gênico por uma quantidade na faixa de pelo menos cerca de 10% a cerca de 100%, ou de preferência de pelo menos cerca de 25% a 100%, ou mais de preferência cerca de 50% a cerca de 100%, e mais de preferência de cerca de 75% a cerca de 100%. Se desejado, uma redução ou eliminação pode ser determinada por qualquer um dos vários métodos que são bem conhecidos dos habilitados na técnica, e podem variar de caso para caso, dependendo do gene que está sendo silenciado. Por exemplo, tal redução ou eliminação da expressão do gene pode ser determinada por quantificação do produto gênico (por exemplo, pela determinação da quantidade de uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo que é produzida) ou quantificação de uma atividade do produto gênico (por exemplo, uma atividade, tal como, atividade de sinalização ou transporte, atividade como um componente estrutural da célula, atividade, tal como, atividade enzimática, etc.), ou por observação e quantificação de uma característica fenotípica da célula direcionada em comparação a uma célula de controle (por exemplo, a presença ou ausência de uma proteína usando anticorpos específicos). Quaisquer meios, adequados para determinar se um gene alvo foi ou não silenciado, podem ser usados
[0053] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos não codificadora de acordo com a invenção é selecionada de RNA antissentido (asRNA), um pequeno RNA de grampo (shRNA), um micro RNA (mi RNA) ou qualquer outro RNA interferente (RNAi), que inibe a síntese de pelo menos uma proteína selecionada de VAMP, SNAP-25 e sintaxina.
[0054] Em uma modalidade, o vetor de expressão viral compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos que é transcrita em um asRNA inibindo a síntese de VAMP, SNAP-25 e/ou sintaxina. Em particular, as sequências do ShRNA usadas no contexto da presente invenção são VAMP2 antissentido de SEQ ID NO: 7, SNAP25 antissentido de SEQ ID NO: 8 e sintaxina antissentido de SEQ ID NO: 9.
[0055] Em uma modalidade particular, o vetor de expressão viral compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos que é transcrita em um shRNA que inibe a síntese de VAMP, SNAP-25 e/ou sintaxina.
[0056] Em outra modalidade, o vetor de expressão viral compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos que é transcrita em um miRNA inibindo a síntese de VAMP, SNAP-25 e/ou sintaxina.
[0057] A molécula de RNA que é codificada pela construção da presente invenção forma, em última instância, uma molécula de RNA de cadeia dupla dentro da célula na qual é transcrita. Em geral, uma cadeia da estrutura de RNA de cadeia dupla estará na faixa de cerca de 10 a cerca de ribonucleotídeos de comprimento e, de preferência, de cerca de 19 a cerca de 25 ribonucleotídeos de comprimento. No caso de asRNA, uma das estruturas de RNA de cadeia dupla estará na faixa de cerca de 100 a várias centenas de ribonucleotídeos de comprimento. Na verdade, pode ser tão longo quanto o mRNA alvo. Os habilitados na técnica reconhecerão que existem várias estratégias viáveis para formar esse RNA de cadeia dupla.
[0058] Além disso, a provisão de múltiplos vetores virais com o mesmo promotor específico de neurônios aferentes, mas que codificam diferentes RNAsS de silenciamento pode ser usada dentro da prática da invenção.
[0059] Além disso, deve ser possível expressar mais do que um RNA silenciador em um único vetor viral,
conduzido por um único promotor específico de neurônio aferente, ou por mais do que um promotor disposto em série (por exemplo, dois ou mais promotores). Assim, a invenção contempla o uso de um único vetor viral para silenciar mais do que um gene.
[0060] Em outra modalidade, o vetor de expressão viral de acordo com a invenção compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica uma toxina do tipo selvagem ou uma toxina modificada que perturba o complexo SNARE ou o complexo ribossoma ou um fragmento ativo da mesma.
[0061] Vantajosamente, o fragmento ativo da toxina é uma neurotoxina bacteriana, de preferência, a referida neurotoxina bacteriana é a cadeia leve da referida neurotoxina bacteriana. Em particular, as sequências das cadeias leves de toxinas usadas no contexto da presente invenção são a cadeia leve da sequência de proteínas da neurotoxina botulínica A (BoONT-A) de SEQ ID NO: 10 (sequência de nucleotídeos codificadora de SEQ ID NO: 11), a cadeia leve da sequência de proteínas da neurotoxina botulínica B (BoNT-B) de SEQ ID NO: 12 (sequência de nucleotídeos codificadora de SEQ ID NO: 13), a cadeia leve da sequência de proteínas da neurotoxina botulínica C1 (BoNT-C1) de SEQ ID NO: 14 (sequência de nucleotídeos codificadora de SEQ ID NO: 15), a cadeia leve da sequência de proteínas da neurotoxina botulínica E3 (BoNT-E3) de SEQ ID NO: 16 (sequência de nucleotídeos codificadora de SEQ ID NO: 17), a cadeia leve da sequência de proteínas da neurotoxina botulínica Fl (BoNT-Fl1) de SEQ ID NO: 18 (sequência de nucleotídeos codificadora de SEQ ID NO: 19) e cadeia leve da sequência de proteínas da neurotoxina de tétano (TeNT) de SEQ ID NO: 20 (sequência de nucleotídeos codificadora de SEQ ID NO: 21).
[0062] Em uma modalidade preferida, o vetor de expressão viral de acordo com a invenção compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos codificadora de uma proteína GAD67 de tipo selvagem ou modificada ou um fragmento ativo da mesma, de preferência, sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína GAD67 de tipo selvagem de SEQ ID NO: 22 (sequência de nucleotídeos codificadora de SEQ ID NO: 23) ou um fragmento ativo da mesma.
[0063] Em uma modalidade preferida, o vetor de expressão viral de acordo com a invenção compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica uma RIP de tipo selvagem ou modificada ou um fragmento ativo da mesma, de preferência, a RIP é a proteína Saporina S6 de SEQ ID NO: 24 (sequência de nucleotídeos codificadora de SEQ ID NO: 25) ou um fragmento ativo da mesma.
[0064] Em uma modalidade preferida, o vetor de expressão viral de acordo com a invenção compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos codificadora de uma NTR tipo selvagem ou modificada ou um fragmento ativo da mesma, de preferência, a NTR é a proteína nitrorredutase nfnB de SEQ ID NO: 26 (sequência de nucleotídeos codificadora de SEQ ID NO: 27) ou um fragmento ativo da mesma.
[0065] Como aqui usado, o termo “sequência codificadora” refere-se a uma sequência de ácido ribonucleico (por exemplo, RNA) que, quando traduzida, produz o polipeptídeo de interesse. O polipeptídeo pode ser codificado por uma sequência codificadora completa ou por qualquer porção da sequência codificadora, desde que a atividade desejada ou propriedades funcionais (por exemplo, atividade enzimática, ligação de ligando, transdução de sinal, etc.) do comprimento total ou fragmento seja(m) retida(s).
[0066] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um vetor de expressão viral que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos codificadora de uma neurotoxina de tipo selvagem ou botulínica modificada de Clostridium botulinum de qualquer serotipo ou um fragmento ativo da mesma, de preferência, a cadeia leve de neurotoxina de Clostridium botulinum de qualquer serotipo.
[0067] Em outra modalidade, a invenção é direcionada a um vetor de expressão viral que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica uma neurotoxina do tipo selvagem ou tetânica modificada de Clostridium tetani ou um fragmento ativo da mesma, de preferência, a cadeia leve da neurotoxina de Clostridium tetani.
[0068] As neurotoxinas clostridiais são produzidas por várias espécies do gênero Clostridium, por exemplo, várias cepas de C. botulinum e C. tetani. Quando as moléculas da toxina de Clostridium entram no neurônio, a cadeia leve rompe as proteínas que formam o complexo SNARE localizado no terminal nervoso pré-sináptico. Isto evita que as vesículas sinápticas preenchidas com neurotransmissores se liguem à membrana pré-sináptica, inibindo assim a exocitose do neurotransmissor a partir do terminal nervoso pré-sináptico. Atualmente, existem oito classes diferentes das neurotoxinas conhecidas: toxina do tétano e neurotoxina botulínica em seus serotipos A, B, C, D, E, F e G, os quais compartilham homologia e estruturas moleculares semelhantes. Dentro dos referidos serotipos, OS subtipos também estão bem documentados, como os subtipos A1-A3z, Bi-B3, etc.
[0069] A neurotoxina botulínica de serotipos A, C e E cliva a proteína SNAP-25 localizada na membrana plasmática dos terminais nervosos pré-sinápticos. Como o SNAP-25 é necessário para a fusão de vesículas cheias de neurotransmissores com a membrana plasmática e sua liberação durante a exocitose, sua clivagem causa um bloqueio altamente específico da liberação do neurotransmissor vesicular em terminais nervosos pré- sinápticos somáticos e autonômicos. Os serotipos B, D, F e G da neurotoxina botulínica clivam a proteína sinaptobrevina (VAMP), de modo que as vesículas não possam se fundir às membranas celulares. Cada neurotoxina botulínica ou seu fragmento de cadeia leve cliva uma das proteínas SNARE, exceto a neurotoxina C botulínica, ou seu fragmento de cadeia leve, que cliva SNAP25 e a sintaxina la. De preferência, de acordo com a invenção, os serotipos da neurotoxina botulínica são A, B, C, E e F.
[0070] A estrutura das neurotoxinas de Clostridium tem sido bem documentada (Habermann et al, 1986; Sugiyama et al 1980); cada um destes documentos é aqui incorporado em sua totalidade por referência]. A este respeito, as neurotoxinas de Clostridium compreendem duas cadeias polipeptídicas, a cadeia pesada (cadeia H), que tem uma massa molecular de aproximadamente 100 kDa, e a cadeia leve (cadeia L), que tem uma massa molecular de aproximadamente 50 kDa, unidos por uma ligação dissulfeto.
[0071] Os diferentes serotipos da toxina botulínica variam nas espécies animais que eles afetam e na gravidade e na duração da paralisia que provocam. Por exemplo, foi determinado que a toxina botulínica tipo A é 500 vezes mais potente, como medido pela LD5SO0 em camundongos, do que a toxina botulínica tipo B. Além disso, a toxina botulínica tipo B foi determinada como não tóxica em primatas a um dose de 480 U/kg que é cerca de 12 vezes a LDSO de primata para toxina botulínica tipo A. Naturalmente, a toxina botulínica se liga com alta afinidade aos neurônios, é translocada para o neurônio e bloqueia a liberação de neurotransmissores.
[0072] Em uma modalidade particular, a invenção é direcionada para um vetor de expressão viral que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica uma neurotoxina do tipo selvagem ou de tetânica modificada de Clostridium tetani ou um fragmento ativo da mesma para clivar a proteína VAMP-2.
[0073] Em uma modalidade particular, a invenção é direcionada para um vetor de expressão viral que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica uma neurotoxina de tipo selvagem ou botulínica modificada de Clostridium botulinum de serotipo são B, D, F e G ou um fragmento ativo da mesma para clivar a proteína VAMP-2.
[0074] Em uma modalidade particular, a invenção é direcionada a um vetor de expressão viral que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos codificadora de uma neurotoxina de tipo selvagem ou botulínica modificada de Clostridium botulinum de serotipo A e E ou um fragmento ativo da mesma para clivar a proteína SNAP-25.
[0075] Em uma modalidade preferida, a invenção é direcionada a um vetor de expressão viral que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica uma neurotoxina de tipo selvagem ou botulínica modificada de Clostridium botulinum de serotipo C ou um fragmento ativo da mesma para clivar as proteínas SNAP25 e sintaxina la.
[0076] Em uma modalidade preferida, a sequência de nucleotídeos do transgene de acordo com a invenção codifica uma proteína de tipo selvagem ou modificada, silenciando ou inibindo a transdução do sinal de neurotransmissor na célula pós-sináptica que é fundida a um domínio de peptídeo sinal. O peptídeo sinal de acordo com a invenção é selecionado de acordo com o compartimento intracelular onde está localizado o transcrito ou proteína direcionada para silenciar ou inibir a transdução do sinal de neurotransmissor na célula pós-sináptica. Por conseguinte, os habilitados na técnica reconhecerão que tais peptídeos sinal são específicos a compartimento intracelular e seriam capazes de selecionar as sequências de nucleotídeos correspondentes apropriadas para serem fundidas com a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína que silencia ou inibe a neurotransmissão ou transmissão sináptica de acordo com a invenção. Em particular, os peptídeos sinal de acordo com a invenção compreendem pelo menos os domínios luminal, transmembranar ou citoplasmático de proteínas selecionadas de VAMP2 ou Sintaxina Ia.
[0077] Em uma modalidade particular, a proteína de fusão de acordo com a invenção compreende um domínio de peptídeo sinal selecionado a partir de domínios de peptídeo sinal luminal, transmembranar ou citoplasmático, de preferência, os domínios de peptídeo sinal luminal, transmembranar ou citoplasmático das proteínas SNARE, a substância P ou sequências CGRP. Tais domínios de peptídeo sinal incluem, notavelmente, o peptídeo sinal de sintaxina la (BoNTB-STX) de SEQ ID NO: 30 (sequência de nucleotídeos codificadora de SEQ ID NO: 31) e o peptídeo sinal de VAMP2 (BOoNTC-VAMP) de SEQ ID NO: 32 (sequência de nucleotídeos codificadora de SEQ ID NO: 33). Assim, de acordo com uma modalidade particular da invenção, a proteína de fusão compreende uma neurotoxina bacteriana modificada, tal como, por exemplo, uma neurotoxina botulínica modificada, e um peptídeo sinal, tal como, por exemplo, o peptídeo sinal da sintaxina la (BoNTA-STX) de SEQ ID NO: 28 ou (BoNTB-STX) de SEQ ID NO: 30 (sequência de nucleotídeos codificadora de SEQ ID NO: 31) e o peptídeo sinal de VAMP2 (BoNTC-VAMP) de SEQ ID NO: 32 (sequência de nucleotídeos codificadora de SEQ ID NO: 33).
[0078] Em uma modalidade específica, a proteína de fusão de acordo com a invenção compreende a neurotoxina de Clostridium botulinum de tipo selvagem ou modificada de serotipo A, B, C, E ou F ligada ao peptídeo sinal da sintaxina la, de preferência, a proteína de fusão compreende a neurotoxina de Clostridium botulinum de tipo selvagem ou modificada de serotipo A ligada ao peptídeo sinal da sintaxina 1la (BONTA-STX) de SEQ ID NO: 28 (sequência de nucleotídeos codificadora de SEQ ID NO: 29) ou a proteína de fusão compreende neurotoxina de Clostridium botulinum de tipo selvagem ou modificada de serotipo B ligada ao peptídeo sinal da sintaxina la (BoNTB- STX) de SEQ ID NO: 30 (sequência de nucleotídeos codificadora de SEQ ID NO: 31).
[0079] Em uma modalidade específica, a proteína de fusão de acordo com a invenção compreende a neurotoxina de Clostridium botulinum de tipo selvagem ou modificada de serotipo A, C e E ligada ao peptídeo sinal de VAMP2, de preferência, a proteína de fusão compreende a neurotoxina de Clostridium botulinum de tipo selvagem ou modificada de serotipo C ligada ao peptídeo sinal de VAMP2 (BoNTC-VAMP) de SEQ ID NO: 32 (sequência de nucleotídeos codificadora de SEQ ID NO: 33).
[0080] Em uma modalidade específica, a proteína de fusão de acordo com a invenção compreende a neurotoxina de Clostridium botulinum de tipo selvagem ou modificada de qualquer serotipo ligado ao peptídeo sinal de Substância P.
[0081] Em uma modalidade específica, a proteína de fusão de acordo com a invenção compreende a neurotoxina de Clostridium botulinum de tipo selvagem ou modificada de qualquer serotipo ligado ao peptídeo sinal da sequência de CGRP.
[0082] A presente invenção também é direcionada a um vetor de expressão viral de acordo com a invenção, compreendendo pelo menos: a) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma neurotoxina de tipo selvagem ou modificada de Clostridium tetani ou botulinum ou um fragmento ativo da mesma; e/ou b) uma sequência de nucleotídeos cujos transcritos inibem a síntese da proteína VAMP, SNAP-25 e/ou sintaxina; e/ou c) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína GAD67 de tipo selvagem ou modificada ou um fragmento ativo da mesma; e/ou d) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma RIP de tipo selvagem ou modificada ou um fragmento ativo da mesma; e/ou e) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma NTR de tipo selvagem ou modificada ou um fragmento ativo da mesma.
[0083] Em uma modalidade preferida, o vetor de expressão viral de acordo com a invenção compreende: i. uma referida sequência de expressão a longo prazo operacionalmente ligada a dois cassetes de transcrição de acordo com a invenção; ou ii. duas sequências de expressão a longo prazo, ambas operacionalmente ligadas a um referido cassete de transcrição de acordo com a invenção; e em que: a) um cassete de transcrição de acordo com a invenção abriga uma sequência codificadora de acordo com a invenção, e o segundo cassete de transcrição de acordo com a invenção abriga uma sequência que é transcrita em um nucleotídeo não codificante de acordo com à invenção; Ou b) ambos os cassetes de transcrição de acordo com a invenção abrigam uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de nucleotídeos não codificadora de acordo com a invenção; ou c) ambos os cassetes de transcrição de acordo com a invenção abrigam uma sequência de nucleotídeos que codifica uma neurotoxina de tipo selvagem ou modificada de Clostridium tetani e/ou botulinum ou um fragmento ativo da mesma; ou uma proteína GAD67 de tipo selvagem ou modificada ou um fragmento ativo da mesma; ou uma RIP de tipo selvagem ou modificada ou um fragmento ativo da mesma; ou uma NTR de tipo selvagem ou modificada ou um fragmento ativo da mesma.
[0084] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se a um vetor de expressão viral, em que i. uma referida sequência de expressão a longo prazo (LTE) é operacionalmente ligada a dois cassetes de transcrição transgênicos de acordo com à invenção; ou ii. cada uma das duas sequências de expressão a longo prazo (LTE) separadas é operacionalmente ligada a um referido cassete de transcrição de acordo com a invenção;
e em que:
a) um cassete de transcrição de acordo com a invenção abriga uma sequência que codifica uma neurotoxina bacteriana, uma GAD67, uma RIP ou uma NTR de acordo com a invenção, e o segundo cassete de transcrição transgênico de acordo com a invenção abriga uma sequência que é transcrita em uma sequência de nucleotídeos não codificadora de acordo com a invenção que inibe a síntese da proteína VAMP, SNAP- e/ou sintaxina; ou b) ambos os cassetes de transcrição de acordo com a invenção abrigam uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de nucleotídeos não codificadora de acordo com a invenção que inibem a síntese de pelo menos uma proteína selecionada de VAMP, SNAP-25 e/ou sintaxina; ou c) ambos os cassetes de transcrição transgênicos de acordo com a invenção abrigam um promotor e uma sequência de nucleotídeos que codifica uma neurotoxina de tipo selvagem ou modificada de Clostridium tetani e/ou botulinum ou um fragmento ativo da mesma; ou uma proteína GAD67 de tipo selvagem ou modificada ou um fragmento ativo da mesma; ou uma RIP de tipo selvagem ou modificada ou um fragmento ativo da mesma; ou uma NTR de tipo selvagem ou modificada ou um fragmento ativo da mesma.
[0085] Em uma modalidade preferida, a invenção refere-se a um vetor de expressão viral, em que pelo menos um dos referidos cassetes de transcrição transgênicos de acordo com a invenção abriga um promotor e uma sequência que codifica a proteína GAD67 de tipo selvagem ou um fragmento ativo da mesma.
[0086] Em uma modalidade mais preferida, a invenção refere-se a um vetor de expressão viral, em que um dos referidos cassetes de transcrição transgênicos de acordo com a invenção abriga um promotor e uma sequência que codifica a proteína GAD67 de tipo selvagem ou um fragmento ativo da mesma; e um dos referidos cassetes de transcrição transgênicos de acordo com a invenção abriga um promotor e uma sequência que codifica uma neurotoxina de tipo selvagem ou modificada de Clostridium tetani e/ou botulinum ou um fragmento ativo da mesma.
[0087] Em uma modalidade preferida, a invenção refere-se a um vetor de expressão viral, em que pelo menos um dos referidos cassetes de transcrição transgênicos de acordo com a invenção abriga um promotor e uma sequência que codifica a RIP de tipo selvagem ou um fragmento ativo da mesma.
[0088] Em uma modalidade mais preferida, a invenção refere-se a um vetor de expressão viral, em que um dos referidos cassetes de transcrição transgênicos de acordo com a invenção abriga um promotor e uma sequência que codifica a RIP de tipo selvagem ou um fragmento ativo da mesma; e um dos referidos cassetes de transcrição transgênicos de acordo com a invenção abriga um promotor e uma sequência que codifica uma neurotoxina de tipo selvagem ou modificada de Clostridium tetani e/ou botulinum ou um fragmento ativo da mesma; e/ou uma sequência que codifica a proteína GAD67 de tipo selvagem ou um fragmento ativo da mesma e/ou uma sequência que codifica a NTR de tipo selvagem ou um fragmento ativo da mesma.
[0089] Em uma modalidade preferida, a invenção refere-se a um vetor de expressão viral, em que pelo menos um dos cassetes de transcrição transgênicos de acordo com a invenção compreende um promotor e uma sequência que codifica a NTR de tipo selvagem ou um fragmento ativo da mesma.
[0090] Em uma modalidade mais preferida, a invenção refere-se a um vetor de expressão viral, em que o referido vetor de expressão viral compreende, pelo menos, 2 cassetes de transcrição transgênicos, em que:
- pelo menos um dos referidos cassetes de transcrição transgênicos de acordo com a invenção compreende um promotor e uma sequência que codifica a NTR de tipo selvagem ou um fragmento ativo da mesma; e - pelo menos um dos referidos cassetes de transcrição transgênicos de acordo com a invenção compreende um promotor e uma sequência que codifica uma neurotoxina de tipo selvagem ou modificada de Clostridium tetani e/ou botulinum ou um fragmento ativo da mesma; e/ou uma sequência que codifica a proteína GAD67 de tipo selvagem ou um fragmento ativo da mesma; e/ou uma sequência que codifica a RIP de tipo selvagem ou um fragmento ativo da mesma.
[0091] Em um segundo aspecto, a invenção refere-se a uma composição compreendendo o vetor de expressão viral da presente invenção para uso como um medicamento.
[0092] Em um terceiro aspecto, a invenção é direcionada a uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um vetor de expressão viral de acordo com a invenção.
[0093] Vantajosamente, a composição farmacêutica de acordo com a invenção é usada para o tratamento da NDO.
[0094] A invenção também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo: a) pelo menos um vetor de expressão viral compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeos transcrita em uma sequência de nucleotídeos não codificadora, de preferência selecionada de RNA antissentido (asRNA), um pequeno RNA de grampo (sShRNA) ou um microRNA (miRNA), mais de preferência RNA antissentido (asRNA), para inibir a síntese de pelo menos uma proteína selecionada de VAMP, SNAP-25 e sintaxina; e/ou b) pelo menos um vetor de expressão viral compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica uma neurotoxina de tipo selvagem ou uma neurotoxina bacteriana modificada rompendo o complexo SNARE ou um fragmento ativo da mesma, de preferência, a cadeia leve de uma neurotoxina bacteriana, e em que a referida neurotoxina bacteriana é vantajosamente a neurotoxina de Clostridium tetani e/ou Clostridium botulinum de qualquer serotipo, de preferência serotipos A, B, C, E e F; e/ou
Cc) pelo menos um vetor de expressão viral compreendendo pelo menos:
- uma sequência de nucleotídeos que codifica uma neurotoxina de tipo selvagem ou modificada de Clostridium tetani ou botulinum ou um fragmento ativo da mesma, e
- uma sequência de nucleotídeos cujos transcritos inibem a síntese da proteína VAMP, SNAP-25 e/ou sintaxina; e/ou d) pelo menos um vetor de expressão viral de acordo com a invenção, em que i. uma referida sequência de expressão a longo prazo (LTE) é operacionalmente ligada a dois cassetes de transcrição transgênicos de acordo com à invenção; ou ii. cada uma de duas sequências de expressão a longo prazo (LTE) é operacionalmente ligada a um referido cassete de transcrição transgênico de acordo com a invenção; e em que:
- um cassete de transcrição transgênico de acordo com a invenção abriga um promotor e uma sequência que codifica a referida neurotoxina, e o segundo cassete de transcrição transgênico de acordo com a invenção abriga um promotor e um nucleotídeo de sequência que inibe a síntese da proteína VAMP, SNAP-25 e/ou sintaxina; ou
- ambos os cassetes de transcrição transgênicos de acordo com a invenção abrigam um promotor e uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de nucleotídeos codificadora que inibe a síntese de pelo menos uma proteína selecionada de VAMP, SNAP-25 e/ou sintaxina; ou
- ambos os cassetes de transcrição transgênicos de acordo com a invenção abrigam uma sequência de nucleotídeos que codifica uma neurotoxina de tipo selvagem ou modificada de Clostridium tetani e/ou botulinum ou um fragmento ativo da mesma para uso simultâneo, separado ou escalonado para tratar NDO.
[0095] Em uma modalidade particular, a composição farmacêutica de acordo com a invenção compreende ainda pelo menos um vetor de expressão viral compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica a proteína GAD67 de tipo selvagem e/ou RIP e/ou NTR, ou um fragmento ativo da mesma.
[0096] Em uma modalidade particular, a composição farmacêutica de acordo com a invenção compreende pelo menos um vetor de expressão viral compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica a proteína GAD67 de tipo selvagem ou um fragmento ativo da mesma; e/ou pelo menos uma sequência de nucleotídeos codificadora de uma neurotoxina de tipo selvagem ou modificada de Clostridium tetani e/ou botulinum ou um fragmento ativo da mesma; e/ou RIP de tipo selvagem ou um fragmento ativo da mesma; e/ou NTR de tipo selvagem ou um fragmento ativo da mesma.
[0097] Em um quarto aspecto, a presente invenção refere-se a um kit compreendendo pelo menos um vetor de expressão viral ou a composição farmacêutica de acordo com a invenção, ou a composição farmacêutica de acordo com a invenção, e um sistema de estimulação elétrica compreendendo eletrodos a serem implantados nas raízes anteriores sacrais, tais como S2-S3-S4, para aplicar trens de pulso de estimulação intermitente, a fim de alcançar uma contração sustentada do músculo detrusor com intervalos de relaxamento do esfíncter uretral permitindo que a urina escoe.
[0098] Por “estimulação elétrica” entende-se aqui que uma estimulação elétrica é aplicada, através de eletrodos, em rajadas de alguns segundos, separadas por intervalos mais longos, para manter a pressão na bexiga, enquanto permite que o esfíncter uretral externo relaxe rapidamente entre as rajadas, fazendo com que a urina escoe durante esses intervalos. O sistema de estimulação elétrica preferido é o estimulador Finetech-Brindley (ref 6 a 19 em Ren et al, 2015).
[0099] A invenção refere-se ainda a um método para o tratamento de pacientes que sofrem de NDO compreendendo as etapas de: a) preparar pelo menos um vetor de expressão viral de acordo com a invenção; b) injetar o vetor de expressão viral da etapa a) na parede da bexiga (músculo detrusor); c) implantar sistema de estimulação elétrica através de eletrodos implantados nas raízes anteriores sacrais, tais como S2-S4 ou S3-S4, para provocar por estímulo em rajadas de poucos segundos, separados por intervalos mais longos, uma pressão sustentada na bexiga, permitindo o esfíncter uretral externo relaxa rapidamente entre rajadas, fazendo com que a urina escoe.
[00100] os exemplos seguintes apenas pretendem ilustrar a presente invenção.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1. Genoma de vetores recombinantes de HSV-1 defeituosos.
[00101] (A): A parte superior da figura descreve a espinha dorsal do genoma do HSV-l1 usado nesta invenção. O genoma do HSV-1 contém duas regiões únicas, conhecidas como Longa Única (UL) e Curta Única (US), cada uma delimitada por sequências invertidas repetidas, conhecidas — como Repetição Terminal L/Repetição Invertida L (TRL/IRL) e Repetição Invertida S/Repetição Terminal S (IRS/TRS). TRL/IRL também são denominados ab/b'a', enquanto IRS/TRS também são denominados a'c'/ca. O genoma, portanto, começa e termina pela sequência de repetição direta “a”. O quadrado preto em UL indica que o gene que codifica a proteína ICP27 essencial é eliminado no vetor usado nesta invenção. Similarmente, os dois quadrados pretos nas repetições IRS/TRS, indicam que os dois genes que codificam a proteína ICP4 essencial também são eliminados. O círculo branco na UL, assim como os dois círculos brancos nas regiões IRS e TRS, indicam as origens da replicação do DNA do HSV-l (respectivamente Oril. e duas cópias de OriS). Outros genes, que codificam proteínas não essenciais, tais como UL41, UL55 e UL56, também podem ser eliminados. Além disso, ambas as cópias dos promotores IE4/5 localizadas no IRS e TRS são modificadas de modo que (eliminação de uma sequência TAATGARAT) que estes promotores expressam com cinética inicial (em vez de cinética inicial imediata como no genoma do vírus tipo selvagem).
[00102] (B): A parte central da figura mostra um detalhe da região b'a'a'c" do genoma do vírus, indicando, em particular, a localização do locus de LAT na região de IRL, que contém o gene que expressa os transcritos associados à latência (LAT).
[00103] (C e C'): A parte inferior da figura mostra a estrutura detalhada da parte 5' do locus de LAT que porta os cassetes terapêuticos de transcrição específicos para DRG (indicados na figura como o Transgene marcado na seta). Este locus inclui uma sequência isoladora de DNA a montante (INS), o Promotor Associado à Latência (LAP), uma região que confere Expressão a longo prazo (LTE) e um isolador de DNA a jusante (INS). O cassete de transcrição específico de DRG terapêutica é introduzido entre o LAP e a LTE (sítio 1, em C) ou entre a LTE e o segundo isolador de DNA (sítio 2 em C"). Outros genes na vizinhança de LAT também são indicados em B (setas). os diferentes cassetes de transcrição específicos para DRG que são introduzidos na região de LAT para gerar os vetores recombinantes são mostrados na Figura 3. Deve ser enfatizado que a região b'a'a'c" é idêntica à região invertida de caab, que forma quando o genoma do vírus se torna envolto no núcleo da célula no início da infecção. Isto significa que ambas as cópias de ICP4 são eliminadas e que o cassete de transcrição transgênico pode ser introduzido em ambas as cópias do locus de LAT. Figura 2. Genoma dos vetores de amplicon (o plasmídeo de amplicon) .
[00104] Os plasmídeos de amplicon são plasmídeos de E. coli padrão geralmente portadores de três módulos: (1) O módulo bacteriano, que contém a sequência EM Cool para replicação de plasmídeo em bactérias, e um gene que confere resistência a um antibiótico, geralmente ampicilina (em preto). (2) O módulo de amplicon (em rosa), que contém uma origem de HSV-1 de replicação de DNA, geralmente OriS (O), e um sinal de acondicionamento (a) permitindo o amplicon e o acondicionamento de uma forma concatemérica do plasmídeo de amplicon; adicionalmente, este módulo expressa geralmente uma proteína repórter (no nosso caso, uma proteína GFP ou uma proteína de fusão GFP/luciferase renilla (rLuc)) direcionada pelo promotor inicial imediato de IE4/5 de HSV-1. (3) O terceiro módulo (em branco) é a unidade de transcrição, contendo o cassete de transcrição específico de DRG (Transgene marcado de seta cinza) colocado entre a LTE e o INS sequenciada(o), projetado para inibir ou silenciar a neurotransmissão estável e seletivamente em neurônios sensoriais, como descrita(o) nesta invenção. Os diferentes cassetes de transcrição que são introduzidos no plasmídeo de amplicon para gerar os vetores de amplicon são mostrados na Figura 3.
[00105] Figura 3. A. Esta figura representa a região do genoma de vetores de amplicon usados nesta invenção que porta os dois cassetes de transcrição eucarióticos. Um deles expressa o gene de GFP repórter (ou GFP-rluc de fusão) sob o controle do promotor inicial imediato IE4/5 de HSV-1. O segundo cassete de transcrição expressa qualquer das funções terapêuticas que inibem ou silenciam a neurotransmissão, como descrito nesta invenção. Um promotor específico de DRG conduz a expressão dos cassetes de transcrição, enquanto o cassete inteiro é envolvido por sequências que conferem expressão a longo prazo (quadrados pretos). B. Esta figura mostra alguns dos cassetes de transcrição usados neste estudo para demonstrar a eficácia e a seletividade das construções genéticas. Estes são: vetor A: cadeia leve de HCMV-TeNT, (LC); vetor B: HCMV- BoNT-A (LC); vetor C: HCMV-BoNT-C (LC); vetor D: RNA antissentido SNAP25; vetor E: HCMV-Luciferase; vetor F: TRPVl1-Luciferase. BoNT-A (LC) e BoNT-C (LC) são proteínas de fusão que expressam uma etiqueta HIS C-terminal, uma vez que anticorpos anti-BoNT não eficazes são disponíveis. O
HCMV é um promotor viral forte e onipresente, enquanto o TRPV1I é um promotor seletivo para DRG. Outros vetores, expressando outras toxinas botulínicas, ou toxinas de cadeia leve/SNARE de fusão, ou RNA antissentido endereçado a outras proteínas SNARE, ou proteína GAD67 humana, ou uma proteína RIP, tal como Saporina S6, não são mostrados nesta Figura.
[00106] A Figura 4 mostra a expressão de linhagens celulares de BoNT-A (LC), BoNT-C (LC) e TeNT (LC) em Gli36 (uma linhagem celular derivada de um glioblastoma humano) e BHK21 (células de fibroblastos de hamster). Células Gli36 e BHK21 foram infectadas com os vetores de amplicon HCMV-Luc, HCMV-BoNT-A (LC), HCMV-BoNT-C (LC) ou HCMV-TeNT (LC) (mostradas na Figura 2B). As células infectadas foram então fixadas e a expressão das toxinas foi demonstrada usando anticorpo específico em um ensaio Western. Os anticorpos anti-TeNnT foram usados para revelar TeNT (LC); os anticorpos anti-HIS foram usados para revelar BoNT-A (LC) e BoNT-C (LC).
[00107] A Figura 5 mostra que a toxina TeNT (LC) expressada em células Gli3ô6 e presente em extratos celulares possui atividade proteolítica em relação a VAMP2. Células Gli36 foram infectadas com o vetor de amplicon que expressa HCMV-TeNT (LC) em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1. A infecção foi terminada 2 dias mais tarde e os extratos de proteína foram preparados. Estes extratos foram incubados em um tampão adequado (Hepes 50 mM, NaCl 400 mM, ditiotreitol 5 mM e ZnSO0. 2 M) contendo a proteína alvo de TeNT, isto é, VAMP2. Após incubação durante 24 h a 37ºC com 2,5, 5 e 10 de extratos celulares, foram realizados westerns blots usando anticorpo anti-VAMP2 para revelar a atividade proteolítica da expressão de TeNT (LC).
[00108] A Figura 6A mostra que 48 horas após a infecção (hpi) de células SH-S5Y5 de neuroblastoma humano com vetores de amplicon expressando HCMV-BoNT-A (LC) (ver Figura 3B), existe uma diminuição significativa in cellulo de níveis de proteína SNAP25 em relação a células de controle infectadas com um vetor expressando luciferase (HCMV-Luc) ou não infectadas (simuladas). Os níveis de proteína foram detectados por ensaio Western blot usando anticorpos anti-SNAP25. Observe que a BoNT-A (LC) cliva o SNAP25 em dois fragmentos. Os anticorpos usados nestes experimentos reconhecem a proteína SNAP25 nativa (banda superior) e o fragmento grande da proteína clivada (banda inferior). B mostra que 48 horas pós-infecção (hpi) de células SH-S5Y5 de neuroblastoma humano com vetores de amplicon que expressam HCMV-BoNT-C (LC) (ver Figura 3B), há uma diminuição significativa in cellulo de níveis de proteína SNAP25 e Sintaxina (STX) em relação às células controle infectadas com um vetor expressando luciferase
(HCMV-Luc) ou não infectadas (simuladas). Os níveis de proteína foram detectados por ensaio de Western blot usando anticorpos anti-SNAP25 e anti-STX. Observe que a BoNT-C (LC) cliva o SNAP25 em dois fragmentos. Os anticorpos usados nestes experimentos reconhecem a proteína SNAP25 nativa (banda superior) e o fragmento grande da proteína clivada (banda inferior).
Figura 7. Cassetes de transcrição portados por genomas de vetor recombinante e amplicon.
[00109] Esta figura mostra alguns dos cassetes de transcrição que são portadas e expressadas pelos vetores de HSV-1 recombinantes e de amplicon. Esses cassetes de transcrição são classificados em três famílias. Os membros da família A2 são cassetes de transcrição que expressam diferentes produtos gênicos terapêuticos (proteínas ou RNA ou miRNA antissentido), conduzidos pelo promotor de HCMV forte e onipresente. Os vetores que portam os cassetes de transcrição A2 são usados para estudar o impacto destes produtos gênicos na neurotransmissão (clivagem de proteínas SNARE e inibição da liberação de neurotransmissores), permitindo assim selecionar os transgenes mais eficazes no contexto desta invenção. Os membros da família AS são cassetes de transcrição que expressam a luciferase de vagalume do gene repórter (fLuc) conduzida por diferentes promotores candidatos seletivos para DRG. Estes vetores são usados para estudar a intensidade, seletividade e duração de expressão em neurônios cultivados e em gânglios periféricos explantados, permitindo assim identificar os vetores mais seletivos no contexto desta invenção. Finalmente, membros da família A8 de vetores expressam cassetes de transcrição terapêutica (produtos gênicos terapêuticos conduzidos por promotores seletivos de DRG) permitindo assim a seleção de vetores com alto potencial terapêutico in vivo, no contexto desta invenção. Deve ser notado que, como apresentado na Figura 2, os vetores de amplicon expressam também um transgene GFP/rLuc conduzido pelo promotor IEV/5 de HSV-1. Abreviaturas: Produtos gênicos:
[00110] TeNT: cadeia leve da neurotoxina de tétano
[00111] BoNT-X: cadeias leves de neurotoxinas botulínicas BoNT-A, -B, -C, -D, -E ou F
[00112] BONT-X-SNARE-Y: proteínas de fusão, nas quais a cadeia leve de neurotoxinas botulínicas, são fundidas aos peptídeos sinal e transmembranar de proteínas SNARE. Mais precisamente, estes transgenes expressam BoNT- A-sintaxina, BoNT-B-sintaxina ou BoNT-C-Vamp2.
[00113] GAD67: ácido glutâmico descarboxilase de 67 kD
[00114] NTR: nitrorredutase
[00115] Luc: luciferase do vagalume (fLuc).
[00116] SNARE Antissentido: RNA antissentido às proteínas SNARE SNAP25, VAMP2 ou Sintaxina.
[00117] Promotores:
[00118] Promotor do fator 1 de alongamento humano (EFIA), Potencial Receptor Transitório do rato Vanolloide 1 (FTRPV1), Peptídeo Relacionado com o Gene da Calcitonina humano ou de rato (hCGRP e rCGRP), Canal 3 do Íon de sensoreação de ácido em rato (rASIC3) e promotores de Advilina humana e de rato (hADVL e rADVL).
Figura 8. BoNT-A expressada a partir de vetores de amplicon cliva a proteína SNARE SNAP25 em células SH-SY5Y.
[00119] Células de neuroblastoma humano (SH-S5Y5) são infectadas em uma MOI de 01; 1,0 e 10,0 pfu/célula com vetores de amplicon expressando unidades de transcrição A2- CMV-BoNT-A (LC) ou A2-CMV-Luc, conduzidas em ambos os casos pelo promotor de HCMV. No dia seguinte, as infecções foram interrompidas, e as proteínas celulares foram analisadas por Western blots, usando anticorpos específicos para BoNT- A LC e SNAP25. A parte superior do Western blot mostra que quantidades crescentes de BoNT-A LC correspondem ao aumento de MOI, demonstrando que os vetores usados expressam esta proteína nas células infectadas. A parte inferior dos blots mostra a clivagem de SNAP25, a proteína do complexo SNARE que é o alvo natural de BoNT-A, assim produzindo dois fragmentos. Na MOI inferior, principalmente a forma nativa (não clivada) do SNAP25 é observada. Na MOI intermediária, a forma nativa e a forma clivada (a banda ligeiramente inferior) podem ser vistas, enquanto na maior MOI a maior parte da proteína SNAP25 é clivada, uma vez que somente o fragmento inferior do dupleto pode ser observado. Isto demonstra que a BoNT-A LC sintetizado em células SH-S5Y5 é capaz de clivar SNAP25. Em contraste, nas células SH-S5Y5 infectadas com o vetor que expressa Luc, nenhuma clivagem de SNAP25 é observada.
Figura 9. Cadeias leves de neurotoxinas botulínicas clivam proteínas SNARE em neurônios infectados.
[00120] Culturas primárias de neurônios de gânglio da raiz dorsal embrionária de rato (DRG) são infectadas em uma MOI de 10 pfu/célula com vetores de amplicon expressando unidades de transcrição A2-CMV-BoNT-A, A2-CMV- BoONT-B, A2-CMV-BoNT- C, A2-CMV-BoNT-E e A2-CMV-BoNT-F. Os neurônios foram também infectados com vetores de amplicon que expressam A2-CMV-BoNT-A-sintaxina (STX), A2-CMV-BoNT-B- sintaxina (STX) e A2-CMV-BoNT-C-VAMP2 (V2). Vetor que expressa A2-CMV-Luc foi usado como controle negativo. Em todos os casos, o promotor de HCMV conduziu a expressão dos cassetes de transcrição. No dia seguinte, as infecções foram interrompidas e as proteínas celulares foram analisadas por Westerns blots. Como mostrado na figura,
cada BoNT LC sintetizado nos neurônios clivou a proteína SNARE esperada: assim, as cadeias leves de BoNT-A, -C e -E, clivaram SNP25, como evidenciado pela diminuição no tamanho desta proteína, enquanto as cadeias leves de BoNT-B e -F, o clivaram VAMP2, que não é mais detectável nos blots. Além disso, BoNT-C também clivou Sintaxina (STX), também não mais visível nos blots. A BoNT-C é a única toxina botulínica descrita para clivar duas proteínas SNARE diferentes (SNAP25 e STX). As cadeias leves de toxinas botulínicas fundidas com os peptídeos sinal e transmembranar de proteínas SNARE clivaram as proteínas SNARE correspondentes exatamente como as toxinas parentais não fundidas. A linhagem Luc mostra as posições de proteínas SNARE nativas, não clivadas (setas). Esta figura, portanto, demonstra que as cadeias leves de toxinas botulínicas (fundidas ou não com fragmentos das proteínas SNARE) sintetizadas em neurônios sensoriais após infecção por vetor, são capazes de clivar suas proteínas alvo correspondentes.
Figura 10. Cadeias leves de toxinas botulínicas inibem a liberação de neuropeptídeos em neurônios sensoriais.
[00121] Culturas primárias de neurônios de DRG embrionários de ratos são infectadas em MOI crescente (de 0,5 a 3 pfu/célula) com vetores de amplicon expressando A2- CMV-BONT-A, A2-CMV-BoNT-B, A2-CMV-BoNT-C, A2 -CMV-BoNT-D,
A2-CMV-BONT-E e A2-CMV-BoNT-F. Os neurônios foram também infectados com amplicons que expressam a sintaxina de A2- CMV-BoNT-A, A2-CMV-BoNT-B-sintaxina e A2-CMV-BoNT-C-VAMP2. O vetor expressando A2-CMV-Luc foi usado como controle negativo. Neurônios também foram infectados apenas com veículo (simulado). No dia seguinte, os neurônios infectados foram tratados com KCl 75 mM para estimular a liberação de CGRP, um neuropeptídeo normalmente sintetizado em neurônios de DRG. Trinta minutos antes e trinta minutos após tratamento com KCl, foram retiradas alíquotas de 100 microlitros do meio de cultura e avaliadas quanto à presença de CGRP por ELISA (usando o kit ELISA CGRP da Spi Bio, ref Nº A 05482). Os resultados, expressados como perfis de regressão linear após a conversão logarítmica, mostram que todas as toxinas inibiram a liberação de CGRP, mas que o fazem com diferentes intensidades, com BoNT-F BoNT-C e BoNT-A as mais efetivas neste aspecto. Em neurônios infectados de forma simulada, bem como em neurônios infectados com o vetor que expressa Luc, não foi observada inibição da liberação de CGRP. Estes resultados indicam claramente que a clivagem de proteínas SNARE por BoNT LC resulta na inibição da liberação de neuropeptídios, e que a BoNT-F é a mais eficaz a este respeito.
Figura 11. A GAD67 expressada a partir de vetores de amplicon induz a síntese e a liberação extracelular de GABA
(ácido gama-amino-butírico).
[00122] 7A) As células de glioblastoma (Gli36) foram infectadas em MOI 0,1; 1,0 e 10 pfu/célula com vetores de amplicon que expressam A2-CMV-GAD67 ou A2-CMV-Luc. No dia seguinte, as infecções foram interrompidas e as proteínas celulares foram analisadas por Western blots, usando anticorpos específicos para GAD67 e GAPDH (um gene de limpeza usado como controle interno). Extratos de cérebro de ratos foram usados como controles positivos para identificar GAD67 endógeno. A Figura 11A mostra que a expressão de GAD67 aumenta com a MOI, demonstrando que o vetor A2-CMV-GAD67 expressa esta proteína.
[00123] 7B) Culturas primárias de neurônios de DRG embriônicos de rato foram infectadas em MOI 0,1, 1,0 e 10 pfu/célula com vetores expressando A2-CMV-GAD67 ou A2-CMV Luc. As infecções do dia seguinte foram rompidas e ambas as concentrações intracelulares e extracelulares de GABA foram avaliadas usando o ensaio Resazurine, que é um ensaio de fluorescência acoplada para GABA (o ensaio é realizado como indicado em Ippolito et al., 2014). O painel superior mostra que a quantidade de GABA intracelular aumenta com a MOI, enquanto o painel inferior mostra o aumento do GABA extracelular. O marcado com GABA é um controle positivo para o ensaio Resazurine. Este resultado mostra claramente que a expressão de GAD67 a partir do vetor A2-CMV-GAD67 aumenta a síntese de GABA intracelular e a sua liberação para o meio extracelular. Figura 12. Nitrorredutase (NTR) ativa o nitro composto T'"nitrocumarina e induz a morte celular na presença de mitronidazol (MTZ).
[00124] 8A) Células de glioblastoma humano (Gli36) foram infectadas com vetores de amplicon expressando A2- CMV-NTR ou A2-CMV-Luc a uma MOI de 1,0 pfu/célula. Dois dias depois, as infecções foram interrompidas e os extratos de proteína foram preparados e usados para avaliar a ativação da 7'nitrocumarina, usando um ensaio acoplado à fluorescência (ensaio realizado como em Muller et al. 2015). A Figura 12A mostra que apenas as proteínas extraídas de células infectadas com o vetor A2-CMV-NTR induzem uma ativação significativa de 7'nitrocumarina, demonstrando que a NTR funcional foi expressada em células Gli36 infectadas com A2-CMV-NTR.
[00125] 8B). Para avaliar se a expressão de NTR induziu morte celular na presença de metronidazol (MTZ), as células Gli36 foram infectadas com os vetores de amplicon A2-CMV-NTR ou A2-CMV-Luc a uma MOI de 1,0 pfu/célula. No dia seguinte, as células foram incubadas com ou sem MTZ (0,5 mM) durante 24 horas. As infecções foram então interrompidas e a viabilidade celular foi avaliada usando o ensaio MTT (como indicado por Carmichael et al., 1987). A figura mostra que o MTZ aumentou significativamente a morte celular das células infectadas. Simulação: células não infectadas. Figura 13. Análise da seletividade da expressão de promotores “seletivos de DRG candidatos em gânglios autonômicos e sensoriais de ratos adultos.
[00126] Gânglios sensoriais de rato adulto (DRG), gânglios simpáticos autonômicos (gânglios cervicais superiores, SCG), e gânglios autonômicos parassimpáticos (gânglios paracervicais, GPC) foram explantados e mantidos como culturas organotípicas. Após 3 dias, os gânglios foram infectados individualmente com vetores expressando A5- TRPVl-Luc, AS-rYrCGRP-Luc, AS-ASIC3-Luc ou AS-EFlA-Luc, todos expressando luciferase de vagalume (fLuc), mas conduzidos respectivamente pelos seguintes promotores: TRPV1 de rato (rFrTRPV1), CGRP de rato (rCGRP), ASIC3 de rato (rASIC3) e EFla, um promotor não seletivo que serve como controle geral. Cada gânglio foi infectado com 10º partículas vetoriais. Os vetores também expressam luciferase renila (rLuc) conduzida por um promotor viral (IE4/5 de HSV-1). As infecções do dia seguinte foram interrompidas e os extratos de células foram preparados para testes de luciferase usando o sistema de ensaio de repórter de luciferase Dual da Promega. Os resultados são expressados como razão de fLuc/rLuc e foram normalizados como percentagem de expressão do promotor EFla em cada um dos DRG (esquerda) SCG (centro) e GPC (direita). A Figura 13 mostra que alguns promotores candidatos, tais como promotores rTRPVl e rCGRP, expressam níveis significativamente mais altos de Fluc em DRG do que nos gânglios autonômicos, enquanto outros promotores, tais como rASIC3, não exibem atividade preferencial no DRG. De acordo com estes resultados, os promotores rTRPV1l e rCGRP parecem exibir atividade seletiva para DRG, enquanto o rASIC3 não exibe tal seletividade quando expressado a partir do genoma do vírus.
[00127] A Figura 14 mostra que um vetor de amplicon que expressa a proteína repórter GFP pode infectar culturas primárias de neurônios de DRG de rato embriônico e explantes DRG de rato adulto, e expressar o transgene GFP dentro destes neurônios.
Figura 15 A inoculação intradetrusor de vetores defeituosos de HSV-1 atinge os gânglios da raiz dorsal (DRG) e expressa transgenes em neurônios sensoriais que inervam a bexiga.
[00128] O vetor viral expressando IE4/5-GFP e HCMV- Luciferase (mostrado na Figura 3B) é capaz de penetrar e expressar ambas as proteínas transgênicas nos neurônios aferentes da bexiga após sua inoculação na parede da bexiga de ratos com lesão medular (LME) . Neurônios de DRG expressando GFP e Luciferase (Luc) são mostrados no gânglio DRG L6, do qual os neurônios que inervam a bexiga se estendem. No entanto, no gânglio DRG T13, que não inerva a bexiga, os resultados são negativos. Uma semana após a infecção, os animais foram sacrificados e as proteínas transgênicas foram reveladas pelo IHC usando anticorpos específicos para GFP e Luciferase. Estes resultados indicam que após a inoculação na parede da bexiga, os vetores entram nos neurônios aferentes que inervam a bexiga e são transportados retrogradamente através dos axônios para os corpos celulares dos neurônios para os gânglios L6, que se encontram nos gânglios da raiz dorsal (DRG), de onde o genoma viral expressa ambas as proteínas transgênicas. Vetores não são capazes de atingir ou expressar em neurônios que não inervam a bexiga (T13).
[00129] A Figura 16 mostra a alta seletividade celular da expressão do vetor viral nos gânglios da raiz dorsal (DRG) quando a Luciferase é direcionada pelo promotor —TRPV1l seletivo para DRG. A luciferase é significativamente expressada apenas nos neurônios aferentes, e não nos neurônios autônomos (simpático ou parassimpático). Os resultados foram normalizados como percentagem da expressão de luciferase em relação ao vetor que expressa a luciferase sob o controle do promotor de HCMV forte, mas não específico, (ambos os vetores são mostrados na Figura 3B).
EXEMPLOS
Exemplo 1: Construção de vetores de HSV-1 recombinantes e de amplicon defeituosos Materiais e Métodos
[00130] A invenção fornece um conjunto de vetores de HSV-1 recombinantes defeituosos compreendendo eliminações completas de ICP27 e ICP4 (ambas as cópias), e que porta, além disso, os cassetes de transcrição terapêutica incorporados no locus de LAT, ou entre as sequências de LAP e LTE (sítio 1) ou entre as sequências de LTE e INS (sítio 2), como mostrado na Figura 1 e Figura 2, para fornecer expressão a longo prazo ao referido cassete. Alguns dos cassetes de transcrição usados para gerar esses vetores são mostrados na Figura 3.
[00131] os referidos cassetes de transcrição expressam as cadeias leves (LC) das toxinas de Clostridium TeNT (LC), BoNT-A (LC), BoNT B (LC), BoNT-C (LC), BoNT E (LC), BoNT-F (LC), ou um RNA antissentido (asRNA) direcionado para as proteínas SNARE, VAMP2, SNAP25 e Sintaxina, ou toxinas de cadeia leve/SNARE de fusão, ou a proteína GAD67 humana ou uma proteína RIP, tais como, Saporina s6, ou nfnB de NTR de E. coli, para inibir/silenciar a neurotransmissão especificamente em neurônios aferentes, quando colocados sob o controle de um promotor específico de neurônio aferente.
[00132] Para gerar os vetores, foi usado um genoma de HSV-l de comprimento total da cepa F clonado em um cromossomo bacteriano artificial (BAC) tal como descrito por Tanaka et al, 2003. As eliminações genéticas e inserções gênicas foram introduzidas por recombinação homóloga em bactérias e os vetores foram então reconstituídos por transfecção de linhagens celulares permissivas como já descrito (Tanaka et al. 2003). A estrutura geral desses vetores é ilustrada na Figura 1A. Genoma de vetores de amplicon de HSV-1. Figura 2.
[00133] A invenção também fornece um conjunto de vetores de amplicon defeituosos, que expressam os mesmos cassetes de transcrições terapêuticas transgênicas que os vetores recombinantes, e listados na Figura 7. As sequências que conferem expressão a longo prazo (LTE e INS) envolvem os cassetes de transcrição (Figura 2). A Figura 2 também mostra que, além dos cassetes de transcrição terapêutica, os vetores de amplicon portam um segundo cassete de transcrição, expressando uma proteína repórter (GFP ou a proteína de fusão GFP/luciferase renilla) conduzida em todos os casos pelo promotor IE4/5 de HSV-1.
[00134] Os vetores de amplicon são produzidos usando como auxiliar o vírus LaLdeltaJ] defeituoso e as linhagens celulares “complementares já descritas por Epstein e colaboradores (Zaupa, Revol-Guyot e Epstein, 2003), que expressam o conjunto de proteínas necessárias para amplificação e acondicionamento do genoma do vetor. Cassetes de transcrição portados por genomas de vetor recombinante e amplicon. Figura 7
[00135] Os vetores recombinantes e de amplicon descritos nesta invenção portam e expressam cassetes de transcrição transgênicos incorporados em sequências de HSV- l que conferem expressão a longo prazo (LAP, LTE, INS), em ambos os tipos de vetores, como mostrado nas Figuras | e 2. Alguns exemplos dos cassetes de transcrição usados nesta invenção estão listados na Figura 7.
Exemplo 2. Vetores de amplicon de HSV-1.
[00136] A invenção também fornece um conjunto de vetores de amplicon defeituosos, alguns destes vetores expressam proteínas repórter (luciferase) ou as cadeias leves (LC) das toxinas de Clostridium (TeNT (LC), BoNT-A (LC), BoNT B (LC), BoNT-C (LC), BoNT E (LC), BoNT-F (LC)), ou um RNA antissentido (asRNA) direcionado para as proteínas SNARE, VAMP2, SNAP25 e Sintaxina, ou toxinas de cadeia leve/SNARE quiméricas, ou a proteína GAD67 humana ou uma proteína RIP, tal como proteína Saporina S6 ou nitrorredutase (NTR), tal como nfínB. Os promotores (prom) que conduzem a expressão destes transgenes são promotores não específicos (HCMV, EFIA) ou promotores específicos de neurônios aferentes (TRPVl, TRPM8, ASIC3, GCRP, ADV1). Sequências adicionais que conferem expressão a longo prazo
(LTE e sequências isoladoras de DNA) são adicionadas a alguns destes promotores (Figura 3A). O promotor que governa a expressão da GFP repórter, ou a proteína de fusão GFP-rLuc, presente nos vetores de amplicon, é o promotor inicial imediato viral conhecido como promotor IE4/5 de HSV-1. A estrutura geral de alguns dos vetores de amplicon aqui usados é mostrada na Figura 3B. Exemplo 3: Expressão de BoNT-A, BoNT-C e TeNT. Figura 4
[00137] A expressão de BoNT-A (LC), BoNT-C (LC) e TeNT (LC) realizada em linhagens celulares Gli36 (uma linhagem celular derivada de um glioblastoma humano) e BHK21 (células de fibroblastos de hamster). Células Gli36 e BHK21 são infectadas com os vetores de amplicon que expressam HCMV-Luc, HCMV-BoNT-A (LC), HCMV-BoNT-C (LC) ou HCMV-TeNT (LC). As células foram então fixadas e a expressão da toxina foi demonstrada por Western blot usando anticorpos anti-TeNT para revelar os anticorpos TeNT (LC) e anti-HIS para revelar BoNT-A (LC) e BoNT-C (LC). De fato, não existem anticorpos anti-BoNT eficazes disponíveis, pelo que BoNT-A (LC) e BoNT-C (LC) são expressados como uma proteína de fusão com uma etiqueta HIS C-terminal. A Figura 4 mostra que o vetor viral que porta os genes que codificam para HCMV-BoNT-A (LC), HCMV-BoNT-C (LC) e HCMV-TeNT (LC) expressam respectivamente BoNT-A (LC), BoNT-C (LC) e TeNT (LC) nas células Gli36 e BHK21.
Exemplo 4: Atividade proteolítica in vitro da toxina recombinante TeNT. Figura 5
[00138] A atividade proteolítica da toxina TeNT (LC) em relação a VAMP2 foi avaliada por Westerns blots usando anticorpo anti-VAMP2. A toxina TeNT (LC) foi expressada em células Gli36 após infecção com o vetor de expressão viral expressando HCMV-TeNT (LC). A infecção foi terminada 2 dias depois e os extratos de proteína foram preparados. Estes extratos foram incubados em um tampão adequado (contendo Hepes a 50 mM, NaCl a 400 mM, ditiotreitol a 5 mM e ZnSO0's a 2 M) contendo a proteína alvo de TeNT, isto é, VAMP2. Os Westerns blots (Figura 5) foram realizados usando 2,5; 5 e de extratos celulares. Amostra não tratada, uma amostra de células infectadas com um vetor que não expressa transgene (pA-l), e uma amostra de células infectadas com um vetor que expressa HCMV-Luc (10) foram usadas como um controle negativo. Quantidades variáveis de TeNT recombinante (recTeNT) foram usadas como controle positivo. Os resultados mostram que a quantidade de VAMP2 diminui quando o extrato de proteína que expressa TeNT (LC) é aumentado, o que demonstra que a toxina presente no extrato de proteína exibe uma atividade proteolítica para a VAMP2. Exemplo 5: Atividade proteolítica in cellulo das toxinas recombinantes BoNT-A (LC) e BoNT-C (LC). Figura 6.
[00139] A linhagem de células do neuroblastoma humano SH-S5Y5 foi usada para sua propriedade para expressar “espontaneamente proteínas SNARE, a fim de acompanhar a clivagem de SNAP25 e Sintaxina la (STX) in cellulo após infecção por vetores de amplicon expressando BoNT-A (LC) ou BoNT-C (LC). Os níveis de SNAP25 e STX foram detectados por ensaio de Western blot usando anticorpos anti-SNAP25 ou anti-STX, respectivamente. Como controles negativos, as células não foram infectadas (simuladas) ou foram infectadas com o vetor expressando HCMV-Luc. Os resultados (Figuras 6a e 6b) mostram que 48 horas pós- infecção (hpi) de células SH-S5Y5 com vetores que expressam as cadeias leves de BoNT-A ou BoONT-C, existe respectivamente clivagem e diminuição significativa de SNAP25 in cellulo (Fig. 6a) ou níveis de proteína SNAP25 e STX (Fig. 6b) em relação a células infectadas com o vetor de controle que expressa a luciferase. Exemplo 6. Figura 8. BONT-A expressada a partir de vetores de amplicon cliva a SNARE proteína SNAP25 em células SH-SYS5
[00140] Este experimento foi projetado para avaliar se os vetores que expressam a cadeia leve de BoNT-A expressam esta proteína, e para estudar se esta toxina possui a mesma atividade biológica que a neurotoxina completa (cadeia leve + cadeia pesada), isto é, a capacidade de clivar sua proteína SNARE alvo (SNAP25). Como mostrado na Figura 8, as células infectadas a multiplicidades crescentes com o amplicon que expressa A2- CMV-BoNT-A expressam quantidades crescentes da toxina. Além disso, quando as células são infectadas em alta MOI, virtualmente toda a SNAP25 é clivada, demonstrando claramente a atividade funcional da cadeia leve de BoNT-A. Exemplo 7. Figura 9. Cadeias leves de neurotoxinas botulínicas clivam proteínas SNARE em neurônios infectados.
[00141] Este experimento foi projetado para confirmar que todas as cadeias leves de BoNT sintetizadas em neurônios infectados com vetores são capazes de clivar a sua proteína alvo SNARE natural em neurônios sensoriais. Para este fim, culturas primárias de neurônios de DRG de ratos embrionários foram infectadas em uma MOI de 10 com vetores de amplicon expressando A2-CMV-BoNT-A, -B, -C, -D, -E e -F, ou A2-CMV- Luc como controle negativo. As infecções foram interrompidas no dia seguinte e os extratos celulares foram analisados por Western blots. Como mostrado na Figura 9, cada uma das neurotoxinas botulínicas expressadas pelos vetores clivou a sua proteína SNARE alvo natural. Assim, BoNT-A e -E clivaram SNAP25, BoNT-B, -D e - F clivaram VAMP2, enquanto BoNT-C clivou SNAP25 e Sintaxina. Isto demonstra claramente que as cadeias leves de todas as neurotoxinas exibem a mesma atividade biológica que as neurotoxinas completas (cadeia leve + cadeia pesada). Exemplo 8. Figura 10. Cadeias leves de toxinas botulínicas inibem a liberação de neuropeptídeos em neurônios sensoriais.
[00142] Este experimento foi projetado para avaliar se as cadeias leves de neurotoxinas botulínicas induzem a inibição da liberação de neurotransmissores e avaliam a sua eficácia comparativa a este respeito. Culturas primárias de neurônios de DRG embriônicos de rato foram infectadas em MOI crescente com os vetores como descrito na Figura 10. No dia seguinte, os neurônios infectados foram tratados com KCl para a liberação estimulada de neuropeptídeo CGRP e as concentrações extracelulares de CGRP foram avaliadas por ELISA. Como mostrado na Figura 10, todas as neurotoxinas induzem a inibição da liberação de CGRP. Além disso, a Figura 6 mostra que a BoNT-F foi a mais eficaz a esse respeito, seguido pela BoNT-A e -C.
Exemplo 9. Figura 11. GAD67 expressada a partir de vetores de amplicon induz a síntese e a liberação extracelulares de GABA.
[00143] O objetivo deste experimento é avaliar se os vetores que expressam GAD67 induzem a síntese e a liberação do GABA de neutransmissor inibidor. Para este fim, as células de glioblastoma (Gli36) foram infectadas em MOI crescente com vetores de amplicon como descrito na Figura 11, e os extratos de células infectadas do dia seguinte foram analisados por Western blots, usando anticorpos específicos para GAD67 e GAPDH. A Figura 11 mostra que a expressão de GAD67 aumenta com a MOI, demonstrando que o vetor A2-CMV-GAD67 expressada esta proteína. Além disso, culturas primárias de neurônios de DRG embriônicos de ratos foram infectadas em diferentes MOIs com os mesmos vetores. As infecções do dia seguinte foram interrompidas e ambas as concentrações de GABA intracelular e extracelular foram avaliadas usando o ensaio Resazurine (como indicado na legenda da Figura 11). O painel superior desta figura mostra que a quantidade de GABA intracelular aumenta com a MOI, enquanto o painel inferior mostra o aumento de GABA extracelular, demonstrando claramente que a expressão de GAD67 do vetor A2-CMV-GAD67 aumenta a síntese de GABA intracelular e sua liberação para o meio extracelular. Exemplo 10. Figura 12. A nitrorredutase (NTR) ativa o nitro composto T'"nitrocumarina e induz a morte celular na presença de mitronidazol (MTZ).
[00144] Este experimento foi projetado para avaliar se a nitrorredutase expressada a partir de vetores de amplicon induziu morte celular na presença, mas não na ausência de metronidazol. Não há anticorpos disponíveis específicos para nitrorredutase (NTR) . Portanto, para avaliar se esta proteína é expressada em células infectadas com A2-CMV-NTR, foi usado um teste funcional in vitro baseado na avaliação da redução de 7'nitrocumarina (Muller et al., 2015). A Figura 12 mostra que os vetores de amplicon que expressam NTV-CMV-A2 ativam o composto nitro. Além disso, a Figura 12 mostra que a expressão de NTR induziu morte celular significativa na presença de metronidazol (MTZ). Isto é explicado pelo fato de que a NTR pode ativar MTZ, transformando esta molécula em um fármaco citotóxico. Exemplo 11. Figura 13. Análise da seletividade da expressão de promotores seletivos de DRG candidatos em gânglios autônomos e sensíveis de ratos adultos.
[00145] Este teste foi projetado para investigar se os promotores específicos de neurônios aferentes candidatos, que normalmente são ativos apenas ou principalmente em neurônios aferentes, preservam sua atividade específica de neurônios aferentes também quando são expressados a partir do genoma do vetor de HSV-l1 não replicativo. Gânglios aferentes adultos (GRD), gânglios simpáticos “autônomos (SCG) e gânglios parassimpáticos autônomos (GPC) foram explantados e mantidos como culturas organotípicas. Após 3 dias, um tempo necessário para o crescimento de neurites, os gânglios foram infectados individualmente com 3 x 10º partículas de vetor como descrito na legenda da Figura 13. Estes vetores expressam a luciferase de vagalume (fLlLuc) conduzida pelos seguintes promotores: TRPV1 de rato (rTRPV1), CGRP de rato (rCGRP), ASIC3 de rato (rASIC3), todos os quais são considerados como promotores específicos de neurônios aferentes, e EFla, um promotor não seletivo que serve como controle geral.
Além do fLuc, esses vetores também expressam a luciferase renilla (rLluc) conduzida por um promotor viral (IE4/5 de HSV-1). As infecções do dia seguinte foram interrompidas e os extratos de células foram preparados para testes de luciferase.
Os resultados são expressados como a razão de fLuc/rLluc e como percentagem da atividade de luciferase conduzida por EFla.
A Figura 13 mostra que rTRPV1 e rCGRP expressam atividade de luciferase de vagalume, de preferência, em DRG e podem assim ser considerados como específicos de DRG mesmo quando expressam a partir do genoma de vetor.
Em contraste, o rASIC3 não exibe tal expressão preferencial no DRG, demonstrando que este promotor não preserva a sua seletividade quando expressado a partir do genoma do vetor.
Portanto, este exemplo mostra que alguns promotores específicos de DRG candidatos, tais como os promotores rTRPV1 e rCGRP, preserva sua seletividade para DRG enquanto outros promotores candidatos, tal como rASIC3, embora sejam considerados promotores específicos de DRG quando expressam a partir dos cromossomos celulares, não preserva essa especificidade quando expressada a partir do genoma do vetor. Portanto, o comportamento de qualquer promotor específico de DRG candidato específico não pode ser previsto e deve ser avaliado experimentalmente.
Exemplo 12: Infecção e expressão da proteína recombinante em culturas de células.
[00146] Culturas neuronais de rato primárias de culturas embrionárias de DRG e organotípicas de explantes de DRG de rato adulto foram infectadas com vetor de amplicon expressando GFP direcionado pelo promotor IE4/5 inicial imediato de HSV-l. Os resultados mostram que o vetor de expressão viral infectou e expressou o transgene (GFP) em culturas de neurônios sensoriais de ratos primários e em explantes de gânglios de ratos adultos (DRG) (Figura 14).
Exemplo 13: Expressão in vivo de proteínas recombinantes em neurônios
[00147] Ratos com lesão medular (LME) foram infectados pelo vetor de amplicon HCMV-Luc, que simultaneamente expressa GFP e proteínas repórter Luc. Uma semana após a infecção, os animais foram sacrificados e as expressões das proteínas transgênicas foram reveladas pelo
IHC. Como indicado pelo IHC, quando inoculado na bexiga, o vetor do amplicon entra nos neurônios aferentes que inervam a bexiga, e é então transportado retrogradamente através dos axônios para os corpos celulares dos neurônios, que se encontram nos gânglios dorsais (DRG), e onde o genoma viral expressa ambas as proteínas transgênicas. Os resultados indicam que os vetores de amplicon HCMV-Luc são assim capazes de penetrar e especificamente expressar proteínas transgênicas nos neurônios aferentes da bexiga após a sua inoculação na parede da bexiga (Figura 15). Além disso, os neurônios que expressam GFP e Luc são observados apenas no gânglio do qual os neurônios que inervam a bexiga se estendem (o gânglio L6). Em contraste, no gânglio T13, que não inerva a bexiga, nenhuma expressão de transgene pode ser observada (dados não mostram). Exemplo 14: Expressão da especificidade celular do vetor de expressão viral
[00148] os vetores de amplicon TRPVl1-Luc, expressando luciferase sob controle do promotor TRPV1l (promotor ativo seletivamente em neurônios aferentes) e HCMV-Luc, expressando luciferase sob o controle do promotor de HCMV não seletivo, foram usados para infectar gânglios sensíveis ou autonômicos (gânglios simpáticos e parassimpáticos). Os resultados mostram que a expressão da luciferase sob o promotor TRPV1 é especificamente expressada nos neurônios aferentes dos gânglios sensíveis (Gânglios da Raiz Dorsal, DRG), e não nos neurônios autônomos (simpáticos ou parassimpáticos) (Figura 16). Os resultados são expressados como percentagem de expressão conduzidos pelo promotor de HCMV não seletivo, que é igualmente alto em todos os tipos de gânglios.

Claims (17)

REIVINDICAÇÕES
1. Vetor de expressão viral caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos: a) um promotor ativo seletivamente nos neurônios aferentes da bexiga, b) um cassete de transcrição compreendendo uma sequência de nucleotídeos operacionalmente ligada ao referido promotor, em que a referida sequência de nucleotídeos silencia ou inibe a transdução do sinal de neurotransmissor na célula pós-sináptica quando transcrita, e c) uma sequência que confere expressão a longo prazo, tal como aquelas conhecidas como isoladoras de LTE e/ou DNA do genoma de HSV-l, operacionalmente ligadas ao referido cassete de transcrição.
2. Vetor de expressão viral, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos silencia ou inibe a neurotransmissão ou transmissão sináptica de neurônios aferentes quando transcrita pela ruptura do complexo SNARE e/ou do complexo de ribossomas e/ou pela ativação de receptores GABA(A) e/ou induzir a ablação de neurônios condicionalmente direcionados.
3. Vetor de expressão viral, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor selecionado de promotores de genes que codificam neurorreceptores sensoriais, preferivelmente um promotor da família de genes TRP, mais preferencialmente o promotor de TRPV1l de SEQ ID NO: 1 ou TRPM8 de SEQ ID NO: 2, ou promotores de genes que codificam neuromoduladores sensoriais ou neurotransmissores sensoriais, preferencialmente promotor de substância P, PACAP, CGRP, ADVL, mais preferencialmente promotor de CGRP de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, ADVL de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6.
4. Vetor de expressão viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o referido vetor é um vetor de vírus adenoassociado (AAV) ou um vetor de vírus herpes simplex (HSV), de preferência, um vetor de HSV-1 ou um vetor de HSV-2, mais preferivelmente um vetor viral defeituoso derivado de HSV, tal como um vetor de HSV recombinante ou um vetor de HSV de amplicon.
5. Vetor de expressão viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a referida pelo menos uma sequência de nucleotídeos é transcrita em uma sequência de nucleotídeos não codificante que inibe a síntese de pelo menos uma proteína selecionada de VAMP, SNAP-25 e sintaxina.
6. Vetor de expressão viral, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de nucleotídeos não codificante é selecionada de RNA antissentido (asRNA), pequeno RNA de grampo (sSshRNA) ou microRNA (miRNA), preferencialmente um RNA antissentido (asRNA) .
7. Vetor de expressão viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a referida pelo menos uma sequência de nucleotídeos codifica para uma neurotoxina de tipo selvagem ou uma neurotoxina bacteriana modificada que rompe o complexo SNARE ou para um fragmento ativo da mesma, ou para uma proteína GAD67 modificada ou do tipo selvagem ou para um fragmento ativo da mesma, ou para uma VDPproteína de inativação de ribossoma (RIP) do tipo selvagem ou modificada ou um fragmento ativo da mesma, ou para uma nitrorredutase modificada (NTR) ou um fragmento ativo da mesma.
8. Vetor de expressão viral, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o referido fragmento ativo da neurotoxina de tipo selvagem ou modificada é a cadeia leve da referida neurotoxina bacteriana.
9. Vetor de expressão viral, de acordo com à reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a referida neurotoxina bacteriana é a neurotoxina de
Clostridium botulinum de qualquer sorotipo ou a neurotoxina tetânica de Clostridium tetani.
10. Vetor de expressão viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 9, caracterizado pelo fato de que o referido vetor de expressão viral compreende uma neurotoxina bacteriana modificada e um domínio peptídico de sinal escolhido entre o peptídeo sinal de sintaxina 1la (BONTA-STX) de SEQ ID NO: 28 ou (BoNTB-STX) de SEQ ID NO: e o peptídeo sinal de VAMP2 (BoNTC-VAMP) de SEQ ID NO:
32.
11. Vetor de expressão viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos: a) uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma neurotoxina de tipo selvagem ou modificada de Clostridium tetani ou botulinum ou para um fragmento ativo da mesma; e/ou b) uma sequência de nucleotídeos cujos transcritos inibem a síntese da proteína VAMP, SNAP-25 e/ou sintaxina; e/ou c) uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma proteína GAD67 de tipo selvagem ou modificada ou para um fragmento ativo da mesma; e/ou d) uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma RIP de tipo selvagem ou modificada ou para um fragmento ativo da mesma e/ou e) uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma NTR de tipo selvagem ou modificada ou para um fragmento ativo da mesma.
12. Vetor de expressão viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que i. uma referida sequência de expressão a longo prazo é operacionalmente ligada a dois cassetes de transcrição como definidos na reivindicação 1; ou ii. duas sequências de expressão a longo prazo estão ambas operacionalmente ligadas a um referido cassete de transcrição como definido na reivindicação 1; e em que: a) um cassete de transcrição, de acordo com a reivindicação 1, abriga uma sequência de nucleotídeos codificante como definida em qualquer uma das reivindicações de 7 a 10, e o segundo cassete de transcrição de acordo com a reivindicação 1 abriga uma sequência de nucleotídeos que é transcrita para um nucleotídeo não codificante como definido na reivindicação ou 6; Ou b) ambos os cassetes de transcrição, como definidos na reivindicação 1, abrigam uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de nucleotídeos não codificante como definida na reivindicação 5 ou 6; ou c) ambos os cassetes de transcrição, como definidos na reivindicação 1, abrigam uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma neurotoxina de tipo selvagem ou modificada de Clostridium tetani e/ou botulinum ou para um fragmento ativo da mesma; ou uma proteína GAD67 de tipo selvagem ou modificada ou para um fragmento ativo da mesma; ou uma RIP de tipo selvagem ou modificada ou para um fragmento ativo da mesma; ou para uma NTR de tipo selvagem ou modificada ou para um fragmento ativo da mesma.
13. Composição caracterizada pelo fato de que compreende o vetor de expressão viral como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, para uso como um medicamento.
14. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um vetor de expressão viral como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 12.
15. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que compreende: a) pelo menos um vetor de expressão viral como definido na reivindicação 5 ou 6; e/ou b) pelo menos um vetor de expressão viral como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a 10; e/ou c) pelo menos um vetor de expressão viral como definido na reivindicação 11 ou 12,
para uso simultâneo, separado ou escalonado no tratamento da hiperatividade neurogênica do detrusor.
16. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um vetor de expressão viral como definido nas reivindicações de 1 a 11, para uso no tratamento da hiperatividade neurogênica do detrusor.
17. Kit caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um vetor de expressão viral como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, ou composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações de 14 a 16, e um sistema de estimulação elétrica compreendendo eletrodos a serem implantados nas raízes anteriores Ssacrais, tais como, S2-S83-SA4, para aplicar trens de pulso de estimulação intermitente a fim de alcançar uma contração sustentada do músculo detrusor com intervalos de relaxamento do esfíncter uretral permitindo que a urina escoe.
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