ES2923104T3 - Vectores virales para tratar la hiperactividad neurógena del detrusor - Google Patents

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Abstract

La presente invención proporciona un método y una composición farmacéutica para el tratamiento del NDO que comprende el vector de expresión viral que lleva un casete de transcripción que alberga transgenes que inhiben/silencian la neurotransmisión o la transmisión sináptica de neuronas aferentes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Vectores virales para tratar la hiperactividad neurógena del detrusor
En la presente memoria se proporciona un vector de expresión viral y una composición farmacéutica del mismo que modula y silencia selectivamente los nervios aferentes de la vejiga, como estrategia de terapia génica para el tratamiento de la hiperactividad neurógena del detrusor (NDO).
En particular, la presente invención se refiere al campo del control del almacenamiento de orina y el vaciado vesical o micción, que depende de la actividad de dos unidades funcionales en las vías urinarias bajas: (1) un depósito (la vejiga urinaria) y (2) una salida que consiste en el cuello de la vejiga, la uretra y los músculos estriados del esfínter uretral externo (EUS) (Fowler et al. 2008; Morrison et al. 2005). Estas estructuras están controladas por tres conjuntos de nervios periféricos eferentes: parasimpático sacro (nervios pélvicos), simpático toracolumbar (nervios hipogástricos y cadena simpática lumbosacra) y nervios somáticos (nervios pudendos) distribuidos bilateralmente (de Groat 1986; Morrison et al. 2005). Estos nervios consisten en axones eferentes que se originan en los niveles espinales toracolumbar y sacro. Los nervios eferentes parasimpáticos contraen la vejiga y relajan la uretra. Los nervios eferentes simpáticos relajan la vejiga y contraen la uretra. Los nervios eferentes somáticos contraen el EUS. Estos nervios asimismo contienen neuronas aferentes que transmiten información desde las vías urinarias bajas hasta la médula espinal lumbosacra. Los cuerpos celulares de las neuronas aferentes de las vías urinarias bajas humanas se localizan en los ganglios de la raíz dorsal (DRG) S2-S4 y T11-L2. Las sensaciones de llenado vesical se transmiten a la médula espinal a través de los nervios pélvicos e hipogástricos, mientras que la información sensitiva del cuello de la vejiga y la uretra se transmite a través de los nervios pudendos e hipogástricos.
Una organización segmentaria similar se produce en primates no humanos, gatos y perros. En ratas, los cuerpos celulares de las neuronas aferentes de los nervios pélvicos, pudendos e hipogástricos están ubicados en los DRG L6-S1 y T11-L2, respectivamente. Las vías neurales que controlan la función de las vías urinarias bajas están organizadas como simples circuitos de encendido y apagado que mantienen una relación recíproca entre la vejiga urinaria y la salida de la uretra. Los reflejos de almacenamiento se activan durante el llenado vesical y se organizan principalmente en la médula espinal, mientras que la micción está mediada por mecanismos reflejos que se organizan en el cerebro (Fowler et al. 2008). Durante el llenado vesical se inhibe la inervación parasimpática del detrusor y se activan las partes lisas y estriadas del esfínter uretral, impidiendo el vaciado vesical involuntario. Este proceso está organizado por reflejos uretrales conocidos colectivamente como el “reflejo de protección”. Se activan por la actividad aferente de la vejiga que se transmite a través de los nervios pélvicos y están organizados por circuitos interneuronales en la médula espinal (Fowler et al. 2008).
La NDO se refiere a una afección en la que se observa una función anómala de la vejiga en pacientes con enfermedades neurológicas, tales como enfermedad cerebrovascular o infarto cerebral, lesión cerebral o de la médula espinal debido a traumatismo, esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, malformación congénita, por ejemplo espina bífida, o enfermedad por ejemplo paraplejia espástica hereditaria del sistema nervioso central, neuropatía periférica y diversas lesiones medulares, es decir, compresión y lesión de la médula espinal debido a fractura de vértebra(s), espondilosis cervical y lumbar, espondilosis deformante, espondilolistesis, estenosis espinal, hernia de disco vertebral y similares.
La NDO se caracteriza por contracciones involuntarias del detrusor (vejiga) durante la fase de llenado, que pueden ser espontáneas o provocadas por una afección neurológica relevante. A menudo se asocia a disinergia vesicoesfinteriana.
La NDO debida a lesión de la médula espinal (SCI) es la forma más grave de NDO. Inmediatamente después de la SCI existe un período de shock medular que dura 2-12 semanas durante el cual la vejiga está arrefléxica, responsable de la retención urinaria completa. Luego, se desarrolla progresivamente un reflejo medular de la micción que es responsable de la NDO. Para los pacientes con SCI, estas deficiencias conducen a incontinencia urinaria y a un aumento de la presión de la vejiga que, si no se trata, puede dañar las vías urinarias altas y precipitar la insuficiencia renal. La incontinencia urinaria se asocia con una carga significativa y deteriora gravemente la calidad de vida. En los pacientes con SCI, las infecciones recurrentes de las vías urinarias debidas al vaciado vesical incompleto y la insuficiencia renal siguen siendo la primera causa de nueva hospitalización y la segunda causa de mortalidad, respectivamente. La SCI altera el control voluntario de la micción, así como las vías reflejas normales que coordinan las funciones de la vejiga y el esfínter. En la lesión medular suprasacra, la NDO resulta del desenmascaramiento de un reflejo segmentario a nivel de la médula sacra, mediado por fibras C nociceptivas aferentes de la vejiga (de Groat y Yoshimura, 2006). Estas fibras C silenciosas devienen mecanosensibles e inician el reflejo de micción automático después de la SCI. Este reflejo se facilita después de la eliminación del control supraespinal. Se produce plasticidad en las vías aferentes de la vejiga y se asocia con cambios en las propiedades de los canales iónicos y la excitabilidad eléctrica de las neuronas aferentes, y parece estar mediada en parte por factores neurotróficos liberados en la médula espinal y los órganos diana periféricos. En general, el sustrato neurobiológico para la NDO comprende alteraciones funcionales en el urotelio y el suburotelio de la vejiga, así como un aumento de los mensajes sensitivos aferentes a la médula espinal, que se originan en la vejiga. Los estímulos vesicales aferentes exacerbados, que resultan de la hipertrofia y la hiperactividad de las neuronas aferentes vesicales tipo C no mielinizadas, son los principales mecanismos que provocan NDO en sujetos con SCI.
Las normas asistenciales para el tratamiento de la NDO consisten en inhibir la neurotransmisión eferente a nivel del detrusor. Por lo tanto, los pacientes con NDO se tratan actualmente con antimuscarínicos, que bloquean la actividad de los receptores muscarínicos de acetilcolina, inhibiendo de ese modo las contracciones del detrusor y/o la inyección intradetrusor repetida de neurotoxina A de Clostridium botulinum (BoNT-A), nuevamente para bloquear las contracciones del detrusor al actuar sobre los nervios eferentes de la vejiga. Ambos tratamientos deben combinarse con sondajes vesicales intermitentes (5-6 veces/día).
Las inyecciones de BoNT-A suprimen la formación del complejo SNARE, bloqueando la fusión de vesículas llenas de neurotransmisores con la membrana plasmática de las neuronas eferentes y su liberación durante la exocitosis. Por lo tanto, la inyección de BoNT-A se utiliza como medicamento para tratar pacientes con vejiga hiperactiva de origen neurógeno o no. Por ejemplo, las solicitudes de patente PCT WO 99/03483 y WO 2010/022979 dan a conocer la utilización de la inyección de BoNT-A para prevenir que un nervio estimule su tejido diana, por ejemplo, un músculo, una glándula u otro nervio, para el tratamiento de diversos trastornos urinarios.
El documento WO2013/180799 da a conocer la utilización de un vector viral que codifica una neurotoxina botulínica modificada, produciendo así una proteína que presenta propiedades de unión mejoradas a sus receptores humanos. Después de la producción en líneas celulares, una vez recuperada y purificada de los sobrenadantes, esta neurotoxina puede aplicarse localmente para tratar una afección asociada con actividad neuronal no deseada, como la NDO. Sin embargo, estos vectores no están concebidos para un enfoque de terapia génica.
No obstante, la inyección de neurotoxinas botulínicas presenta el inconveniente de la difusión de toxinas, que se debe en gran medida a la difusión de toxinas a otras regiones del cuerpo. Los efectos adversos van desde acontecimientos transitorios no graves, tales como ptosis y diplopía, hasta acontecimientos potencialmente mortales, incluso la muerte. Además, para la NDO, estas inyecciones deben repetirse en promedio cada 6 meses debido a la disminución de la eficacia a lo largo del tiempo.
Debido a que la NDO, con o sin disinergia vesicoesfinteriana, provocada por lesiones medulares suprasacras se debe a la aparición de un reflejo anómalo mediado por las aferencias de la vejiga (fibras a8 y c), Brindley ha desarrollado un enfoque alternativo para el tratamiento de la NDO (Brindley et al 1986). Este enfoque combina rizotomías sacras posteriores y estimulación de raíces sacras anteriores (SARS). Este tratamiento pareció ser uno de los métodos terapéuticos más eficaces para la NDO provocada por lesiones medulares suprasacras completas: las rizotomías sacras aumentan permanentemente la distensibilidad de la vejiga y eliminan la hiperactividad del detrusor (y la disinergia detrusoesfinteriana) que son las principales causas de insuficiencia renal e incontinencia urinaria, mientras que la implantación de un estimulador de las raíces espinales anteriores permite que el paciente provoque y controle la micción.
La desaferenciación mediante rizotomías sacras posteriores, según lo propuesto por Brindley (1986), consiste en la transección quirúrgica completa de todas las fibras neurales aferentes a los segmentos espinales S2-S4, incluyendo las que proporcionan entrada sensitiva desde el músculo detrusor. De este modo, los estímulos sensitivos procedentes del músculo detrusor ya no pueden llegar al sistema nervioso central y, por lo tanto, pueden inhibirse las actividades reflejas generadas por el sistema nervioso central que provocan contracciones incontroladas de la vejiga. El procedimiento es necesario para prevenir las actividades reflejas exacerbadas del detrusor y permite que se almacene una mayor cantidad de orina con una presión vesical baja. Sin embargo, la desaferenciación de la vejiga obtenida a partir de la desaferenciación pelviperineal irreversible, no selectiva y extensa mediante rizotomías sacras posteriores (S2-S4) presenta muchas trampas e inconvenientes, ya que es responsable de la pérdida de la sensibilidad pelviperineal restante, si está presente, lo que perjudica el orgasmo si está presente, la erección y eyaculación reflejas si están presentes, y la micción y defecación reflejas si están presentes, y facilita posiblemente la escara de decúbito debido a la pérdida de la inervación sensitiva de la piel. Además, la magnitud del procedimiento neuroquirúrgico lo hace costoso y puede ser responsable de fístulas de líquido cefalorraquídeo y, a largo plazo, de artropatía medular de Charcot.
Por lo tanto, existe la necesidad de una nueva estrategia para tratar la NDO en caso de lesión supraespinal, que se dirija específicamente a su fisiopatología, es decir, el reflejo medular anómalo mediado por las aferencias de la vejiga, pero sin afectar a otras neuronas aferentes transportadas en los mismos nervios, mientras se evitan las neuronas eferentes de la vejiga. La estrategia que se propone es un enfoque de terapia génica que da como resultado la desaferenciación molecular selectiva de la vejiga, para restablecer la continencia y la micción en pacientes con NDO cuando se combina con la estimulación de las raíces sacras anteriores. Esto se ha logrado mediante una nueva estrategia que requiere un vector de expresión viral que puede suministrar transgén/transgenes terapéutico(s) que presenten:
- capacidad para inhibir/silenciar la neurotransmisión o transmisión sináptica de las neuronas aferentes; - alta selectividad, en particular para las neuronas aferentes de la vejiga;
- alta eficacia;
- estabilidad de expresión a lo largo del tiempo; y
- ausencia de denervación inespecífica.
La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Cualesquier otros aspectos o formas de realización expuesto en la presente memoria que se encuentre fuera del alcance de las reivindicaciones se proporcionan con fines informativos únicamente. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a las composiciones o células de la presente invención para su utilización en un método para el tratamiento de un sujeto.
En el contexto de la presente invención, los inventores encontraron sorprendentemente que, después de la inyección del vector de expresión viral en la pared de la vejiga, es posible obtenertransgenes de expresión selectiva y estable en las neuronas aferentes de la vejiga, utilizando un vector de expresión viral que expresa de manera estable a lo largo del tiempo proteínas y/o transcritos para tratar la NDO, inhibiendo/silenciando específicamente la neurotransmisión o transmisión sináptica de las neuronas aferentes de la vejiga a nivel de la médula espinal.
En la presente memoria se detallan en particular un método y una composición farmacéutica para el tratamiento de la NDO que comprende el vector de expresión viral que porta un casete de transcripción que alberga un transgén/unos transgenes que inhibe(n)/silencia(n) la neurotransmisión o transmisión sináptica de neuronas aferentes. Preferentemente, el método y una composición farmacéutica comprenden un vector de expresión viral que porta un casete de transcripción que alberga transgén/transgenes que altera(n) el complejo SNARE, y/o el complejo ribosómico, y/o que activan los receptores de GABA(A), y/o que inducen la ablación de neuronas dirigida (“targeted”) de manera condicional, cuando se transcribe, que inhibe/silencia la neurotransmisión o transmisión sináptica de las neuronas aferentes de la vejiga.
El término “casete de transcripción”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico que contenga un promotor y un transgén o una secuencia codificante en el sentido de 3', cuya expresión está impulsada por dicho promotor, que va seguida por una señal de poliadenilación. El término “transgén” se refiere a una secuencia de ácido nucleico particular que codifica un ARN y/o un polipéptido o una parte de un polipéptido que va a expresarse en una célula en la que se introduce la secuencia de ácido nucleico. El término “transgén” incluye (1) una secuencia de ácido nucleico que no se encuentra de manera natural en la célula (es decir, una secuencia de ácido nucleico heteróloga); (2) una secuencia de ácido nucleico que es una forma mutante de una secuencia de ácido nucleico que se encuentra de manera natural en la célula en la que se ha introducido; (3) una secuencia de ácido nucleico que sirve para añadir copias adicionales de la misma secuencia de ácido nucleico (es decir, homóloga) o similar que se produce de manera natural en la célula en la que se ha introducido; o (4) una secuencia de ácido nucleico silenciosa homóloga o que se produce de manera natural cuya expresión se induce en la célula en la que se ha introducido. Por “forma mutante” se entiende una secuencia de ácido nucleico que contiene uno o más nucleótidos que son diferentes de la secuencia de tipo natural o que se produce de manera natural, es decir, la secuencia de ácido nucleico mutante contiene una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones de nucleótidos. En algunos casos, el transgén asimismo puede incluir una secuencia que codifica un péptido líder o una secuencia señal de manera que el producto de transgén se secrete por la célula, o el transgén puede incluir un péptido líder o una secuencia señal más un péptido de anclaje a la membrana o puede ser incluso una proteína de fusión entre dos proteínas que se producen de manera natural o parte de ellas, de modo que el transgén permanecerá anclado a las membranas celulares.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “complejo ribosómico” se refiere a un complejo que se compone esencialmente de las subunidades de los ribosomas, tales como las subunidades 80S y 70S, que catalizan la síntesis de proteínas, denominada traducción.
En un primer aspecto, no comprendido dentro del alcance de las reivindicaciones, se proporciona un vector de expresión viral en la presente memoria que comprende por lo menos:
a) un promotor activo selectivamente en neuronas aferentes de la vejiga,
b) un casete de transcripción que comprende una secuencia de nucleótidos unida funcionalmente a dicho promotor, en el que dicha secuencia de nucleótidos silencia o inhibe la transducción de la señal de neurotransmisor en una célula postsináptica cuando se transcribe, y
c) una secuencia que confiere expresión a largo plazo, tal como la conocida como LTE (Lokensgard et al, 1997) y/o que contiene aisladores de ADN (Amelio et al, 2006) del genoma de HSV-1, unida funcionalmente a dicho casete de transcripción.
Específicamente, la presente invención proporciona un vector de expresión viral del virus del herpes simple (HSV) que comprende por lo menos:
a) un promotor activo selectivamente en neuronas aferentes de la vejiga seleccionado de un promotor de la familia génica de TRP y un promotor de CGRP,
b) un casete de transcripción que comprende una secuencia de nucleótidos unida funcionalmente a dicho promotor, en el que dicha secuencia de nucleótidos silencia o inhibe la transducción de la señal de neurotransmisor en una célula postsináptica cuando se transcribe, y
c) una secuencia de expresión a largo plazo, en el que dicha secuencia de expresión a largo plazo es una LTE y un aislador de ADN del genoma de HSV-1 y en el que dicho casete de transcripción está colocado entre la LTE y el aislador de ADN.
En una forma de realización preferida, la secuencia de nucleótidos del vector de expresión viral según la invención silencia o inhibe la neurotransmisión o la transmisión sináptica cuando se transcribe o traduce mediante la alteración del complejo SNARE, y/o el complejo ribosómico, y/o mediante la activación de receptores de GABA(A), y/o mediante la inducción de una ablación de neuronas dirigida de manera condicional.
En una forma de realización preferida, la secuencia de nucleótidos del vector de expresión viral según la invención, cuando se transcribe, altera por lo menos una de las proteínas seleccionadas de VAMP, SNAP-25 o sintaxina 1a, que forman parte del complejo SNARE, o codifica la proteína GAD67 o un fragmento activo de la misma, o codifica una proteína que altera el complejo ribosómico o para un fragmento activo de la misma, o codifica una proteína que induce la ablación neuronal dirigida de manera condicional, o un fragmento activo de la misma.
En una forma de realización particular, la proteína que altera el complejo ribosómico según la invención es una proteína de inactivación de ribosomas (RIP) de tipo natural o modificada o un fragmento activo de la misma, seleccionándose preferentemente dicha RIP de RIP de tipo 1 o tipo 2, seleccionándose preferentemente la RIP de tipo 1 de saporina, gelonina, diantina, tricosantina; y seleccionándose la RIP de tipo 2 de ricina, volkensina y abrina, siendo más preferentemente dicha RIP de tipo 1 saporina S6 o un fragmento activo de la misma.
El término “proteína que induce la ablación de neuronas dirigida de manera condicional” se refiere a una proteína que convierte sustratos de profármacos inocuos, tales como metronidazol (MTZ), en agentes de reticulación de ADN citotóxicos, proporcionando una ablación específica de célula del tipo celular diana, es decir, las neuronas aferentes de la vejiga. Los ejemplos de tales proteínas que inducen ablación neuronal dirigida de manera condicional son las nitrorreductasas (NTR).
La proteína que induce la ablación de neuronas dirigida de manera condicional según la invención se selecciona por tanto de entre el grupo que consiste en una NTR de tipo natural o modificada o un fragmento activo de la misma. Preferentemente, dicha NTR se selecciona de entre el grupo que consiste en una NAD(P)H nitrorreductasa insensible al oxígeno, de tipo natural o modificada, o un fragmento activo de la misma, más preferentemente dicha NTR se selecciona de entre el grupo que consiste en una nitrorreductasa de E. coli de tipo natural o modificada, incluso más preferentemente dicha NTR es una nfnB de E. coli de tipo natural o modificada o un fragmento activo de la misma.
El término “vector viral” o “vector de expresión viral” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un vector de ácido nucleico que incluye por lo menos un elemento de un genoma de virus y que puede empaquetarse en una partícula viral. En el presente contexto, el término “vector viral” ha de entenderse en sentido amplio que incluye el vector de ácido nucleico (por ejemplo, vector viral de ADN) así como las partículas virales generadas a partir del mismo. El vector de expresión viral puede ser un vector de virus adenoasociado (AAV) o un vector de virus del herpes simple (HSV). Según la presente invención, el vector de expresión viral es un vector de virus del herpes simple (HSV), preferentemente un vector de HSV-1 o un vector de h SV-2, incluso más preferentemente un vector viral defectuoso derivado de HSV-1. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “vector viral defectuoso” se referirá a vectores virales a los que les faltan genes o partes de genes necesarios para completar satisfactoriamente el ciclo de vida viral.
El término “AAV” se refiere al propio virus adenoasociado o a derivados del mismo, incluyendo partículas de vector de AAV recombinante. Además, tal como se utiliza en la presente memoria, el término “AAV” incluye muchos serotipos diferentes, que se han aislado de muestras de primates humanos y no humanos. Los serotipos de AAV preferidos son los serotipos humanos, más preferentemente AAV humano de los serotipos 2, 5 y 9, lo más preferentemente AAV humano de serotipo 5, que es el serotipo que muestra el nivel más alto de neurotropismo.
Según la presente invención, el término “vector viral defectuoso derivado de HSV” se refiere tanto a vectores de HSV recombinantes defectuosos como a vectores de amplicón de HSV. El término “HSV recombinante defectuoso”, tal como se utiliza en la presente memoria, describe un vector independiente de auxiliar, cuyo genoma comprende por lo menos deleciones completas de los genes que codifican para dos proteínas esenciales, conocidas como ICP4 y ICP27. El gen de ICP4 está presente en dos copias, ubicadas en las secuencias repetidas invertidas conocidas como c y c' del genoma del virus, y ambas copias de este gen están delecionadas. El gen que codifica ICP27 está ubicado en la secuencia única larga (UL) del genoma del virus. Preferentemente, los vectores independientes de auxiliar según la invención portan el/los casete(s) de transcripción terapéutico(s) incluido(s) en el locus LAT (transcritos asociados a latencia) (Berthomme et al., 2000 y Berthomme et al., 2001), que es un locus repetido que está contenido en las secuencias repetidas invertidas conocidas como b y b' del genoma del virus. Más preferentemente, el casete de transcripción está colocado o bien entre el promotor asociado de latencia (LAP) y la región de expresión a largo plazo (LTE) (sitio 1), o bien entre la región LTE y la secuencia de aislador de ADN (INS) presente en el sentido de 3' de la LTE (sitio 2) (tal como se muestra en la figura 1). Los vectores de HSV-1 recombinantes defectuosos según la presente invención portan casete(s) de transcripción que expresa(n) los diferentes transgenes descritos anteriormente para inhibir/silenciar la neurotransmisión, es decir, que expresa(n) toxinas botulínicas de cadena ligera de tipo natural o modificadas, y/o ARN antisentido (AS-ARN) dirigido a proteínas SNARE, y/o GAD67, y/o RIP, y/o NTR, todos ellos impulsados por promotores específicos de DRG a largo plazo tal como se describe en la presente invención. Las secuencias b y b' del genoma del virus asimismo se conocen como TRL (repetición terminal L) e IRL (repetición interna L) respectivamente, mientras que las secuencias c' y c asimismo se conocen como IRS (repetición interna S) y TRS (repetición terminal S), donde L y S se refieren respectivamente a las secuencias única larga (L) y única corta (S) del genoma del HSV-1. Además, los vectores independientes de auxiliar según la invención pueden comprender deleciones adicionales en genes que codifican para proteínas no esenciales tales como las proteínas ICP34.5, UL55, UL56 y UL41. Estos vectores defectuosos de HSV se multiplican en líneas celulares que expresan simultáneamente las proteínas ICP4 e ICP27 (Marconi et al, 2010).
Los documentos WO 2006/050211 y US 2015/297649 dan a conocer la utilización de un vector defectuoso de HSV-1 para la terapia génica del dolor.
Sin embargo, los vectores según la invención difieren de los vectores descritos en el documento WO 2006/050211 o en el documento US 2015/297649 en varios aspectos significativos, que son importantes con respecto a la utilidad y eficacia de los vectores según la invención. Y lo que es más importante, los casetes de transcripción transgénicos según la invención se introducen en el locus LAT, ya que esta región contiene tanto la LTE como las secuencias aislador de ADN (INS) que confieren expresión a largo plazo a los promotores específicos de DRG que impulsan la expresión de transgenes en los casetes de transcripción según la invención, a diferencia de los proporcionados en los documentos WO 2006/050211 y US 2015/297649. Cabe destacar que el vector descrito en el documento WO 2006/050211 se concibió y se probó para una acción a corto plazo y, por tanto, sus casetes de transcripción están impulsados por promotores ubicuos y no se introdujeron en las regiones LAT.
Por “amplicón o vector de amplicón” se entiende un vector dependiente de auxiliar, cuyo genoma carece de la mayoría o de todos los genes del HSV que codifican para las proteínas del virus. El genoma de los vectores de amplicón es un ADN concatemérico compuesto por múltiples copias en tándem de un plásmido, conocido como plásmido de amplicón, que porta un origen de replicación de ADN y una señal de empaquetamiento del genoma de HSV-1, además del ADN transgénico (es decir, casetes de transcripción) de interés. Los plásmidos de amplicón según la presente invención portan casetes de transcripción que expresan los diferentes transgenes descritos anteriormente para inhibir/silenciar la neurotransmisión, es decir, que expresan toxinas botulínicas de cadena ligera de tipo natural o modificadas, y/o ARN de interferencia (ARNi) dirigido a proteínas SNARE, y/o GAD67, y/o RIP, y/o NTR, todos ellos impulsados por promotores a largo plazo, preferentemente un promotor específico de DRG a largo plazo tal como se describe en la presente invención (ver la figura 2).
En una forma de realización preferida, el vector según la invención es un vector recombinante defectuoso que carece de por lo menos los genes que codifican para las proteínas esenciales ICP4 e ICP27, preferentemente un vector que carece tanto de ICP4 como de ICP27. Este vector puede carecer de otros genes, que codifican para proteínas no esenciales, tales como las proteínas génicas ICP34.5, UL55, UL56 y/o UL41, y porta el/los casete(s) de transcripción específico(s) de DRG, descritos en la figura 7, incluidos en las regiones LAT del genoma del vector.
En otra forma de realización, el vector según la invención es un vector de amplicón que porta los casetes de transcripción descritos anteriormente impulsados por promotores específicos de DRG a largo plazo, tal como se describe en otras partes de este documento.
El casete de transcripción según la invención se introduce en el locus LAT.
La expresión “ADN recombinante” tal como se utiliza en la presente memoria describe una molécula de ácido nucleico, es decir, un polinucleótido de origen genómico, ADNc, viral, semisintético y/o sintético que, en virtud de su origen o manipulación, no está asociado con la totalidad o una parte del polinucleótido con el que se asocia en la naturaleza. El término “recombinante” tal como se utiliza con respecto a virus, significa un virus que porta un genoma recombinante o un genoma que se ha manipulado para introducir mutaciones, deleciones o uno o más polinucleótidos heterólogos, incluyendo genes. El término “recombinante” tal como se utiliza con respecto a una proteína o polipéptido, significa un polipéptido producido por la expresión de un ácido nucleico recombinante. El término “recombinante” tal como se utiliza con respecto a una célula huésped significa un vector recombinante que porta ADN recombinante dentro de la célula huésped o una célula que contiene ADN recombinante insertada en su genoma. El término “ infección” se refiere a la capacidad de un vector viral para entrar en una célula huésped o sujeto.
Los vectores defectuosos derivados de HSV permiten la infección de neuronas sensitivas vecinas y establecen infecciones latentes en el núcleo de estas neuronas, ubicadas en los ganglios del trigémino o de la raíz dorsal (DRG), dependiendo del sitio de infección. En particular, el HSV-1 infecta de manera natural las neuronas sensitivas y establece infecciones latentes de por vida en el núcleo de estas neuronas. Por tanto, podría plantearse la hipótesis de que después de la inyección en la pared de la vejiga, los vectores, tal como el vector derivado del HSV-1, llegarán al DRG sensitivo que inerva la vejiga desde donde expresarán de manera estable el transgén terapéutico, siempre que promotores específicos adecuados de las neuronas aferentes de la vejiga impulsen su expresión. Sin embargo, el HSV-1 asimismo puede infectar y establecer infecciones latentes en neuronas autónomas (Furuta et al., 1993; Warren et al. 1978), y los resultados preliminares demuestran que este es realmente el caso cuando el vector se inocula en la vejiga. Por tanto, es obligatorio que la expresión de los vectores esté completamente controlada por promotores específicos de aferentes, asimismo denominados promotores selectivos o promotores específicos selectivos de neuronas aferentes, con el fin de obtener una expresión transgénica significativa solo en estas neuronas (es decir, neuronas aferentes), evitando así la expresión en neuronas autónomas, asimismo denominadas eferentes. La desaferenciación selectiva molecular o bioquímica (en contraposición a la quirúrgica) de las neuronas aferentes de la vejiga es el aspecto más crítico de la presente invención, ya que es importante preservar la sensibilidad pelviperineal restante si está presente, el orgasmo si está presente, la erección y eyaculación reflejas si están presente, y la micción y defecación reflejas si están presentes, transmitiéndose todas ellas por los nervios sensitivos de la pelvis que no se originan en la vejiga. Además, la desaferenciación selectiva de la vejiga asimismo permitiría la preservación de las neuronas eferentes de la vejiga, que luego podrían estimularse mediante estimulación eléctrica, por ejemplo, a través de electrodos. Algunos estudios describen la utilización de vectores basados en HSV-1 en los que los casetes de transcripción comprenden promotores o bien transitorios (Miyazato et al., 2009) o bien a largo plazo (Puskovic et al., 2004; Miyagawa et al., 2015; documento WO 2015/009952A1). Sin embargo, los promotores utilizados en los estudios de Puscovic (LAP2), Miyazato (promotor de HCMV) y Miyagawa (promotor de CAG artificial) no son selectivos, lo que conduce a la expresión de sus transgenes en muchos tipos de células, incluyendo neuronas autónomas, neuronas cerebrales y células no neuronales. Por el contrario, al combinar secuencias reguladoras virales y promotores celulares específicos de neuronas aferentes, algunos de los vectores según la presente invención permiten una expresión significativamente mayor específica de neuronas aferentes de los transgenes de interés (ver la figura 13).
Los vectores utilizados en la práctica de la invención incluyen por lo menos un promotor activo selectivamente en neuronas aferentes que está unido funcionalmente a nucleótidos (habitualmente ADN) que codifican para una molécula de ARN. Por “unido funcionalmente” se entiende en la presente memoria que, en el vector, el promotor está asociado con los nucleótidos que codifican para el ARN de manera que se permite que el promotor impulse la transcripción (es decir, la expresión) del ARN a partir de los nucleótidos. Se conoce bien la transcripción de ARN, por ejemplo, a partir de un molde de ADN.
Un “promotor,” tal como se utiliza en la presente memoria, es una región reguladora de ADN que puede unirse a la a Rn polimerasa en una célula de mamífero e iniciar la transcripción de una secuencia en sentido de 3' unida funcionalmente. Para los fines de la presente invención, una secuencia promotora incluye por lo menos el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción de un gen de interés a niveles detectables por encima del fondo. Dentro de la secuencia del promotor existe un sitio de iniciación de la transcripción, así como dominios de unión a la ARN polimerasa. Los promotores eucariotas a menudo, pero no siempre, contendrán “cajas TATA” y otros motivos de ADN, tales como cajas “CAT” o “SP1”. El promotor según la invención comprende una secuencia de ADN que comienza por lo menos 2 kb, preferentemente 3 kb, más preferentemente 4 kb en el sentido de 5' del sitio de iniciación del mensajero que codifica productos génicos relevantes específicos. Estas secuencias contienen preferentemente elementos de secuencia conocidos del promotor, tales como sitios específicos de unión de transcripción y secuencias distales en el sentido de 5' del gen, que contienen elementos reguladores adicionales.
Por “activo selectivamente en neuronas aferentes” se entiende en la presente memoria que el promotor es activo principalmente o solo en las neuronas aferentes, preferentemente en neuronas aferentes de la vejiga e impulsa la transcripción (es decir, la expresión) del ARN.
Además, los expertos en la materia reconocerán que se conocen muchos de tales promotores específicos de neuronas aferentes de mamíferos, y continuamente están descubriéndose promotores adicionales específicos de neuronas aferentes. La presente divulgación comprende todos estos promotores específicos de neuronas aferentes. Sin embargo, se ha demostrado que muchos candidatos a promotor específico de célula muestran selectividad solo cuando se expresan desde su ubicación endógena en los cromosomas celulares (McCart et al., 2002; Vassaux et al., 1996). No hay modo de predecir cómo se comportarán estos promotores cuando se introducen en el genoma de un vector de expresión no integrador, tal como los vectores de HSV. En particular, no puede preverse si los promotores específicos de neuronas aferentes conservarán la misma actividad específica de neuronas aferentes. Esto se debe a que (a) los nucleosomas unidos al promotor podrían diferir en varios aspectos (por ejemplo, pueden estar en una configuración represiva o permisiva) según la ubicación del promotor (en los cromosomas frente al genoma del vector extracromosómico, o incluso entre diferentes posiciones en cromosomas celulares) y asimismo (b) porque la accesibilidad de factores de transcripción positivos o negativos asimismo podría diferir. Esto significa que cada candidato a promotor debe estudiarse a fondo en cada entorno específico (es decir, vector episómico frente a ubicación cromosómica) para establecer si conserva o no su actividad específica de neuronas aferentes cuando se coloca en el genoma del vector, tal como se ha realizado experimentalmente (ver los resultados en el ejemplo 11 y la figura 13).
Aunque no se incluye en el alcance de las reivindicaciones adjuntas, el promotor puede seleccionarse de promotores de genes que codifican para neurorreceptores sensitivos, tales como el receptor de potencial transitorio vaniloide 1 (TRPV1) o el miembro 8 de la subfamilia M del canal catiónico de potencial de receptor transitorio (TRPM8), o de promotores de genes que codifican para neuromodulatores sensitivos o neurotransmisores sensitivos, tales como los promotores de la sustancia P, PACAP, péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP) de SEC ID N°: 3 o SEC ID N°: 4. Preferentemente, el promotor de genes que codifican para neurorreceptores sensitivos según la invención es un promotor de la familia génica de TRP, más preferentemente el promotor TRPV1 de SEC ID N°: 1 o TRPM8 de SEC ID N°: 2. Preferentemente, los promotores de genes que codifican para neuromodulatores sensitivos o neurotransmisores sensitivos según la invención es el CGRP de SEC ID N°: 3 o SEC ID N°: 4.
El vector de expresión viral de la invención se dirige más particularmente a vertebrados, preferentemente a mamíferos, más preferentemente a primates y humanos. Por tanto, los expertos en la materia reconocerán que tales promotores son específicos de especies y podrían seleccionar secuencias homólogas de una especie particular de interés. En particular, los promotores según la invención son homólogos humanos de TRPV1 de rata de SEC ID N°: 1 o TRPM8 humano de SEC ID N°: 2, o CGRP de rata de SEC ID N°: 3, o CGRP humano de SEC ID N°: 4, entre otros.
Por “secuencia de expresión a largo plazo” o “elemento de expresión a largo plazo (LTE)” se entiende una secuencia de nucleótidos unida funcionalmente al casete de transcripción incluido en la secuencia del vector de expresión viral, que permite que la expresión de un producto génico sea sostenida durante más de 15 a 45 días o de 30 a 45 días, preferentemente de 45 a 90 días, más preferentemente de 90 a 365 días, incluso más preferentemente de 365 días a varios años o incluso más preferentemente durante la vida del paciente.
Se identificaron secuencias de expresión a largo plazo (LTE) en HSV-1 como una región de los transcritos asociados a la latencia (LAT), que se originan a partir del promotor asociado a LAT (LAP). Esta LTE está ubicada en el sentido de 3' del sitio de inicio de transcripción de lAt . De hecho, los virus que albergaban un fragmento en 3' de ADN del promotor de LAT mantuvieron una expresión de promotor detectable durante la latencia (Lokensgard et al, 1997, Berthomme et al., 2000, 2001). Preferentemente, la LTE está comprendida entre aproximadamente 1.5 kb y aproximadamente 3 kb en el sentido de 3' del sitio de inicio de transcripción de LAT (Perng et al., 1996). Más recientemente, asimismo se han descrito secuencias adicionales, conocidas como aisladores de ADN, tanto en el sentido de 5' como en el sentido de 3' de la región LTE (Amelio et al., 2006). Estas secuencias asimismo contribuyen a proporcionar expresión a largo plazo a un casete de transcripción dado, probablemente al inhibir el silenciamiento epigenético, y asimismo se incorporarán en la presente invención como parte de los elementos de LTE, para conferir expresión a largo plazo al casete de transcripción. Resulta interesante que las secuencias que confieren expresión a largo plazo al casete de transcripción (tanto las secuencias de LTE como las del aislador de ADN) pueden colocarse en el sentido de 5' y/o en el sentido de 3' del casete de transcripción.
Los expertos en la materia reconocerán que se han descrito y están descubriéndose continuamente otras secuencias similares a LTE, así como otras secuencias de aislador de ADN. Están comprendidas todas estas secuencias de tipo LTE y secuencias de aislador de ADN.
En una forma de realización preferida, el vector de expresión viral de la invención comprende por lo menos una secuencia de nucleótidos que se transcribe para proporcionar una secuencia de nucleótidos no codificante que inhibe la síntesis de por lo menos una proteína seleccionada de VAMP, SNAP-25 y sintaxina, que forman parte del complejo SNARE.
El complejo SNARE (receptor de proteína de unión del factor sensible a N-etilmaleimida soluble) es uno de los dos componentes clave de la maquinaria de fusión de membrana con las proteínas SM (Sec1/Munc18). El complejo SNARE comprende las “v-SNARE” asociadas a vesículas (proteínas de membrana asociadas a vesículas, VAMP, particularmente VAMP1, 2 y 3) y las sintaxinas “t-SNARE” asociadas a membrana diana (Syn-1, 2, 3 y 4) y la proteína asociada a sinaptosoma de 25 kDa (SNAP-25) que se ensamblan para dar lugar a complejos para mediar en diferentes eventos de fusión.
Por tanto, en la presente memoria se proporcionan métodos que pueden silenciar un gen específico y/o alterar la proteína codificada correspondiente (un “gen de interés” o “gen dirigido” o “gen seleccionado”). Por “silenciar” un gen, quiere decirse que la expresión del producto génico se reduce o elimina, en comparación con un gen de control correspondiente que no se silencia. Los expertos en la materia están familiarizados con el concepto de comparar resultados obtenidos con control frente a resultados experimentales. Sin querer restringirse a la teoría, se cree que el silenciamiento se caracteriza por la degradación específica del ARNm o el bloqueo del ARNm en la traducción después de la expresión de una secuencia complementaria no codificante tal como ARN antisentido (ARNas), un ARN de horquilla pequeño (ARNhp), un microARN (miARN) o cualquier otra forma de ARN de interferencia (ARNi) en las células.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “antisentido” se refiere a moléculas de ácido nucleico monocatenarias, no modificadas o modificadas químicamente, que son relativamente cortas en general y que pueden hibridarse con una secuencia única del conjunto total de dianas presentes en células, siendo complementaria la secuencia de dicha molécula de ácido nucleico, en virtud de la hibridación de pb de Watson-Crick, a un ARNm específico y pudiendo inhibir la expresión de dicho ARNm y luego inducir un bloqueo en la transferencia de información genética desde el ADN a la proteína.
En el contexto de la invención, la “interferencia de ARN” (denominada a continuación en la presente memoria, iARN) se interpreta como un proceso mediante el cual un ARN bicatenario (ARNbc) con una secuencia nucleica sentido dada conduce a la rotura de todo el ARN mensajero (ARNm) que comprende dicha secuencia nucleica, de una manera específica para dicha secuencia nucleica. Aunque el proceso iARN se demostró originalmente en Caenorhabditis elegans, actualmente está claro que el proceso de iARN es un fenómeno muy general, y se ha logrado la inhibición de genes humanos mediante iARN.
El proceso de iARN puede lograrse utilizando un ARN de interferencia pequeño (o ARNip). Estos ARNip son ARNbc de menos de 30 nucleótidos de longitud, que comprenden en su secuencia sentido una secuencia que es altamente complementaria a un fragmento del ARNm diana. Cuando un ARNip atraviesa la membrana plasmática, la reacción de la célula es destruir el ARNip y todas las secuencias que comprenden una secuencia altamente complementaria. Por tanto, se destruirá un ARNm con un fragmento que es altamente complementario a la secuencia de ARNip, inhibiéndose así la expresión de este gen.
El ARNhp asimismo puede utilizarse como inhibidor según la presente invención. Tal como se utiliza en la presente memoria, una “molécula de ARNhp” incluye un ARNhp de tallo-bucle convencional, que forma un miARN precursor (pre-miARN). El “ARNhp” asimismo incluye ARNhp incluidos en micro-ARN (ARNhp basados en miARN), en los que la cadena guía y la cadena pasajera del dúplex de miARN se incorporan en un miARN existente (o natural) o en un miARN modificado o sintético (diseñado). Cuando se transcribe, un ARNhp convencional forma un miARN primario (pri-miARN) o una estructura muy similar a un pri-miARN natural. El pri-miARN se procesa posteriormente por Drosha y sus cofactores para proporcionar pre-miARN. Por tanto, el término “ARNhp” incluye moléculas de primiARN (ARNhp-mir) y moléculas de pre-miARN.
En general, “reducido o eliminado” se refiere a una reducción o eliminación de cantidades detectables del producto génico en una cantidad en el intervalo de por lo menos aproximadamente el 10% a aproximadamente el 100%, o preferentemente de por lo menos aproximadamente el 25% al 100%, o más preferentemente de aproximadamente el 50% a aproximadamente el 100%, y lo más preferentemente desde aproximadamente el 75% hasta aproximadamente el 100%. Si se desea, una reducción o eliminación puede determinarse mediante cualquiera de varios métodos que conocen bien los expertos en la materia, y pueden variar de un caso a otro, dependiendo del gen que esté silenciándose. Por ejemplo, tal reducción o eliminación de la expresión del gen puede determinarse mediante la cuantificación del producto génico (por ejemplo, determinando la cantidad de una proteína, polipéptido, o péptido que se produce) o la cuantificación de una actividad del producto génico (por ejemplo, una actividad tal como señalización o actividad de transporte, actividad como componente estructural de la célula, actividad tal como actividad enzimática, etc.), o mediante la observación y cuantificación de una característica fenotípica de la célula diana en comparación con una célula de control (por ejemplo, la presencia o ausencia de una proteína utilizando anticuerpos específicos). Pueden utilizarse cualesquier medios adecuados para determinar si se ha silenciado un gen diana o no.
En una forma de realización, la secuencia de nucleótidos no codificante según la invención se selecciona de ARN antisentido (ARNas), un ARN de horquilla pequeño (ARNhp), un micro ARN (miARN), o cualquier otro ARN de interferencia (ARNi), que inhibe la síntesis de por lo menos una proteína seleccionada de VAMP, SNAP-25 y sintaxina.
En una forma de realización, el vector de expresión viral comprende por lo menos una secuencia de nucleótidos que se transcribe para proporcionar un ARNas que inhibe la síntesis de VAMP, SNAP-25 y/o sintaxina. En particular, las secuencias del ARNas utilizado en el contexto de la presente invención son antisentido de VAMP2 de SEC ID N°: 7, antisentido de SNAP25 de SEC ID N°: 8 y antisentido de sintaxina de SEC ID N°: 9.
En una forma de realización particular, el vector de expresión viral comprende por lo menos una secuencia de nucleótidos que se transcribe para proporcionar un ARNhp que inhibe la síntesis de VAMP, SNAP-25 y/o sintaxina.
En otra forma de realización, el vector de expresión viral comprende por lo menos una secuencia de nucleótidos que se transcribe para proporcionar un miARN que inhibe la síntesis de VAMP, SNAP-25 y/o sintaxina.
La molécula de ARN que se codifica por el constructo de la presente invención forma en última instancia una molécula de ARN bicatenario dentro de la célula en la que se transcribe. En general, una cadena de la estructura de ARN bicatenario estará en el intervalo de desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 30 ribonucleótidos de longitud, y preferentemente desde aproximadamente 19 hasta aproximadamente 25 ribonucleótidos de longitud. En el caso del ARNas, una de las estructuras de ARN bicatenario estará en el intervalo de desde aproximadamente 100 hasta varios cientos de ribonucleótidos de longitud. Realmente podría ser tan largo como el ARNm diana. Los expertos en la materia reconocerán que existen varias estrategias viables para formar un ARN bicatenario de este tipo.
Además, dentro de la práctica de la invención puede utilizarse el hecho de proporcionar múltiples vectores virales con el mismo promotor específico de neuronas aferentes pero que codifican para ARN de silenciamiento diferentes.
Además, debe ser posible expresar más de un ARN de silenciamiento en un solo vector viral, impulsado por un solo promotor específico de neuronas aferentes, o por más de un promotor dispuesto en tándem (por ejemplo, dos o más promotores). Por tanto, la invención contempla utilizar un solo vector viral para silenciar más de un gen.
En otra forma de realización, el vector de expresión viral según la invención comprende por lo menos una secuencia de nucleótidos que codifica una toxina de tipo natural o modificada que altera el complejo SNARE o el complejo ribosómico o un fragmento activo de la misma.
Ventajosamente, el fragmento activo de la toxina es una neurotoxina bacteriana, preferentemente dicha neurotoxina bacteriana es la cadena ligera de dicha neurotoxina bacteriana. En particular, las secuencias de las cadenas ligeras de la toxina utilizadas en el contexto de la presente invención son la cadena ligera de la secuencia proteica de la neurotoxina botulínica A (BoNT-A) de SEC ID N°: 10 (secuencia de nucleótidos codificante SEC ID N°: 11), la cadena ligera de la secuencia proteica de la neurotoxina botulínica B (BoNT-B) de SEC ID N°: 12 (secuencia de nucleótidos codificante SEC Id N°: 13), la cadena ligera de la secuencia proteica de la neurotoxina botulínica C1 (BoNT-C1) de SEC ID N°: 14 (secuencia de nucleótidos codificante SEC iD: 15), la cadena ligera de la secuencia proteica de la neurotoxina botulínica E3 (BoNT-E3) de SEC ID N°: 16 (secuencia de nucleótidos codificante SEC ID N°: 17), la cadena ligera de la secuencia proteica de la neurotoxina botulínica F1 (BoNT-F1) de SEC ID N°: 18 (secuencia de nucleótidos codificante SEC iD N°: 19), y la cadena ligera de la secuencia proteica de la neurotoxina tetánica (TeNT) de SEC ID N°: 20 (secuencia de nucleótidos codificante SEC ID N°: 21).
En una forma de realización preferida, el vector de expresión viral según la invención comprende por lo menos una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína GAD67 de tipo natural o modificada o un fragmento activo de la misma, preferentemente una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína GAD67 de tipo natural de SEC ID N°: 22 (secuencia de nucleótidos codificante SEC ID N°: 23) o un fragmento activo de la misma.
En una forma de realización preferida, el vector de expresión viral según la invención comprende por lo menos una secuencia de nucleótidos que codifica una RIP de tipo natural o modificada o un fragmento activo de la misma, siendo preferentemente dicha RIP la proteína saporina S6 de SEC ID N°: 24 (secuencia de nucleótidos codificante SEC ID N°: 25) o un fragmento activo de la misma.
En una forma de realización preferida, el vector de expresión viral según la invención comprende por lo menos una secuencia de nucleótidos que codifica una NTR de tipo natural o modificada o un fragmento activo de la misma, preferentemente dicha NTR es la proteína nitrorreductasa NfnB de SEC ID N°: 26 (secuencia de nucleótidos codificante SEC ID N°: 27) o un fragmento activo de la misma.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “secuencia codificante” se refiere a una secuencia de ácido ribonucleico (por ejemplo, ARN) que, cuando se traduce, produce el polipéptido de interés. El polipéptido puede codificarse por una secuencia codificante de longitud completa o por cualquier parte de la secuencia codificante, siempre que se conserve la actividad deseada o las propiedades funcionales (por ejemplo, actividad enzimática, unión a ligando, transducción de señales, etc.) de la longitud completa o el fragmento.
En una forma de realización, la invención se refiere a un vector de expresión viral que comprende por lo menos una secuencia de nucleótidos que codifica una neurotoxina botulínica de tipo natural o modificada de Clostridium botulinum de cualquier serotipo o un fragmento activo de la misma, preferentemente la cadena ligera de la neurotoxina de Clostridium botulinum de cualquier serotipo.
En otra forma de realización, la invención se refiere a un vector de expresión viral que comprende por lo menos una secuencia de nucleótidos que codifica una neurotoxina tetánica de tipo natural o modificada de Clostridium tetani o un fragmento activo de la misma, preferentemente la cadena ligera de la neurotoxina de Clostridium tetani.
Las neurotoxinas clostridiales se producen por varias especies del género Clostridium, por ejemplo varias cepas de C. botulinum y C. tetani. Cuando las moléculas de toxina de Clostridium entran en la neurona, la cadena ligera altera las proteínas que forman el complejo SNARE ubicado en la terminación nerviosa presináptica. Esto impide que las vesículas sinápticas llenas con neurotransmisor se unan a la membrana presináptica, inhibiendo de ese modo la exocitosis del neurotransmisor de la terminación nerviosa presináptica. En la actualidad se conocen ocho clases diferentes de neurotoxinas: toxina tetánica y neurotoxina botulínica en sus serotipos A, B, C, D, E, F y G, que comparten todas ellas homología y estructuras moleculares similares. Dentro de dichos serotipos, asimismo están bien documentados los subtipos, tales como los subtipos A1-A3 , B1-B3 , etc.
Los serotipos A, C y E de la neurotoxina botulínica escinden la proteína SNAP-25 ubicada en la membrana plasmática de las terminaciones nerviosas presinápticas. Dado que SNAP-25 es necesaria para la fusión de vesículas llenas de neurotransmisor con la membrana plasmática y su liberación durante la exocitosis, su escisión provoca un bloqueo altamente específico de la liberación de neurotransmisores vesiculares en las terminaciones nerviosas presinápticas somáticas y autónomas. Los serotipos B, D, F y G de la neurotoxina botulínica escinden la proteína sinaptobrevina (VAMP), de modo que las vesículas no pueden fusionarse a las membranas celulares. Cada neurotoxina botulínica o su fragmento de cadena ligera escinde una de las proteínas SNARE excepto la neurotoxina botulínica C o su fragmento de cadena ligera, que escinde tanto SNAP-25 como sintaxina 1a. Preferentemente, según la invención los serotipos de neurotoxina botulínica son A, B, C, E y F.
La estructura de las neurotoxinas clostridiales se ha documentado bien (Habermann et al, 1986; Sugiyama et al 1980). En este sentido, las neurotoxinas clostridiales comprenden dos cadenas polipeptídicas, la cadena pesada (cadena H), que presenta una masa molecular de aproximadamente 100 kDa, y la cadena ligera (cadena L), que presenta una masa molecular de aproximadamente 50 kDa, unidas por un enlace disulfuro.
Los diferentes serotipos de toxina botulínica varían en las especies animales a las que afectan y en la gravedad y duración de la parálisis que provocan. Por ejemplo, se ha determinado que la toxina botulínica tipo A es 500 veces más potente, medida por la LD50 en ratones, que la toxina botulínica tipo B. Adicionalmente, se ha determinado que la toxina botulínica tipo B no es tóxica en primates a una dosis de 480 U/kg, que es aproximadamente 12 veces la LD50 de primates para la toxina botulínica tipo A. Naturalmente, la toxina botulínica se une con gran afinidad a las neuronas, se transloca en la neurona y bloquea la liberación de neurotransmisores.
En una forma de realización particular, la invención se refiere a un vector de expresión viral que comprende por lo menos una secuencia de nucleótidos que codifica una neurotoxina tetánica de tipo natural o modificada de Clostridium tetani o un fragmento activo de la misma para escindir la proteína VAMP-2.
En una forma de realización particular, la invención se refiere a un vector de expresión viral que comprende por lo menos una secuencia de nucleótidos que codifica una neurotoxina botulínica de tipo natural o modificada de Clostridium botulinum del serotipo B, D, F y G o un fragmento activo de la misma para escindir la proteína VAMP-2.
En una forma de realización particular, la invención se refiere a un vector de expresión viral que comprende por lo menos una secuencia de nucleótidos que codifica una neurotoxina botulínica de tipo natural o modificada de Clostridium botulinum de serotipo A y E o un fragmento activo de la misma para escindir la proteína SNAP-25.
En una forma de realización preferida, la invención se refiere a un vector de expresión viral que comprende por lo menos una secuencia de nucleótidos que codifica una neurotoxina botulínica de tipo natural o modificada de Clostridium botulinum de serotipo C o un fragmento activo de la misma para escindir las proteínas SNAP25 y sintaxina 1a.
Preferentemente, la secuencia de nucleótidos del transgén codifica una proteína de tipo natural o modificada que silencia o inhibe la transducción de la señal de neurotransmisor en una célula postsináptica que se fusiona a un dominio de péptido señal. El péptido señal se selecciona según el compartimento intracelular en el que se ubique el transcrito o la proteína dirigida a silenciar o inhibir la transducción de la señal de neurotransmisor en una célula postsináptica. Por tanto, los expertos en la materia reconocerán que tales péptidos señal son específicos para el compartimento intracelular y podrían seleccionar las secuencias de nucleótidos correspondientes apropiadas para fusionarlas a la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína que silencia o inhibe la neurotransmisión o transmisión sináptica. En particular, los péptidos señal comprenden por lo menos los dominios luminal, transmembrana o citoplasmático de proteínas seleccionadas de VAMP2 o sintaxina 1a.
Preferentemente, la proteína de fusión comprende un dominio de péptido señal seleccionado de dominios de péptido señal luminal, transmembrana o citoplasmático, preferentemente los dominios de péptido señal luminales, transmembrana o citoplasmáticos de las proteínas SNARE, la sustancia P o las secuencias CGRP. Tales dominios de péptido señal incluyen en particular el péptido señal de sintaxina 1a (BoNTB-STX) de SEC ID N°: 30 (secuencia de nucleótidos codificante SEC ID N°: 31) y el péptido señal de VAMP2 (BoNTC-VAMP) de SEC ID N°: 32 (secuencia de nucleótidos codificante SEC ID N°: 33). Por tanto, la proteína de fusión comprende preferentemente una neurotoxina bacteriana modificada, tal como por ejemplo, una neurotoxina botulínica modificada, y un péptido señal tal como por ejemplo, el péptido señal de sintaxina 1a (BoNTA-STX) de SEC ID N°: 28 o (BoNTB-STX) de SEC ID N°: 30 (secuencia de nucleótidos codificante SEC ID N°: 31) y el péptido señal de VAMP2 (BoNTC-VAMP) de SEC ID N°: 32 (secuencia de nucleótidos codificante SEC ID N°: 33).
En un ejemplo específico, la proteína de fusión comprende la neurotoxina de Clostridium botulinum de tipo natural o modificada del serotipo A, B, C, E o F unida al péptido señal de sintaxina 1a, preferentemente la proteína de fusión comprende la neurotoxina de Clostridium botulinum de tipo natural o modificada del serotipo A unida al péptido señal de sintaxina 1a (BoNTA-STX) de SEC ID N°: 28 (secuencia de nucleótidos codificante SEC ID N°: 29) o la proteína de fusión comprende la neurotoxina de Clostridium botulinum de tipo natural o modificada del serotipo B unida al péptido señal de sintaxina 1a (BoNTB-STX) de SEC ID N°: 30 (secuencia de nucleótidos codificante SEC ID N°: 31).
En un ejemplo, la proteína de fusión comprende la neurotoxina de Clostridium botulinum de tipo natural o modificada del serotipo A, C y E unida al péptido señal de VAMP2, preferentemente la proteína de fusión comprende la neurotoxina de Clostridium botulinum de tipo natural o modificada del serotipo C unida al péptido señal de VAMP2 (BoNTC-VAMP) de SEC ID N°: 32 (secuencia de nucleótidos codificante SEC ID N°: 33).
En un ejemplo, la proteína de fusión comprende la neurotoxina de Clostridium botulinum de tipo natural o modificada de cualquier serotipo unida al péptido señal de la sustancia P.
En un ejemplo, la proteína de fusión comprende la neurotoxina de Clostridium botulinum de tipo natural o modificada de cualquier serotipo unida al péptido señal de la secuencia CGRP.
La presente invención asimismo se refiere a un vector de expresión viral según la invención, que comprende por lo menos:
a) una secuencia de nucleótidos que codifica una neurotoxina de tipo natural o modificada de Clostridium tetani o botulinum o un fragmento activo de la misma; y/o
b) una secuencia de nucleótidos cuyos transcritos inhiben la síntesis de la proteína VAMP, SNAP-25 y/o sintaxina; y/o
c) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína GAD67 de tipo natural o modificada o un fragmento activo de la misma; y/o
d) una secuencia de nucleótidos que codifica una RIP de tipo natural o modificada o un fragmento activo de la misma; y/o
e) una secuencia de nucleótidos que codifica una NTR de tipo natural o modificada o un fragmento activo de la misma.
En una forma de realización preferida, el vector de expresión viral según la invención comprende:
i. dicha una secuencia de expresión a largo plazo unida funcionalmente a dos casetes de transcripción según la invención; o
ii. dos secuencias de expresión a largo plazo tanto unidas funcionalmente a uno dichos casetes de transcripción según la invención; y en los que:
a) un casete de transcripción según la invención alberga una secuencia codificante según la invención, y el segundo casete de transcripción según la invención alberga una secuencia que se transcribe para proporcionar un nucleótido no codificante según la invención; o
b) ambos casetes de transcripción según la invención albergan una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de nucleótidos no codificante según la invención; o
c) ambos casetes de transcripción según la invención albergan una secuencia de nucleótidos que codifica una neurotoxina de tipo natural o modificada de Clostridium tetani y/o botulinum o un fragmento activo de la misma; o una proteína GAD67 de tipo natural o modificada o un fragmento activo de la misma; o una RIP de tipo natural o modificada o un fragmento activo de la misma; o una NTR de tipo natural o modificada o un fragmento activo de la misma.
En una forma de realización particular, la invención se refiere a un vector de expresión viral, en el que i. dicha una secuencia de expresión a largo plazo (LTE) está unida funcionalmente a dos casetes de transcripción transgénicos según la invención; o
ii. cada una de dos secuencias de expresión a largo plazo (LTE) independientes está unida funcionalmente a uno de dichos casetes de transcripción según la invención;
y en el que:
a) un casete de transcripción según la invención alberga una secuencia que codifica una neurotoxina bacteriana, una GAD67, una RIP o una NTR según la invención, y el segundo casete de transcripción transgénico según la invención alberga una secuencia que se transcribe para proporcionar una secuencia de nucleótidos no codificante según la invención que inhibe la síntesis de la proteína VAMP, SNAP-25 y/o sintaxina; o
b) ambos casetes de transcripción según la invención albergan una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de nucleótidos no codificante según la invención que inhibe la síntesis de por lo menos una proteína seleccionada de VAMP, SNAP-25 y/o sintaxina; o
c) ambos casetes de transcripción transgénicos según la invención albergan un promotor y una secuencia de nucleótidos que codifica una neurotoxina de tipo natural o modificada de Clostridium tetani y/o botulinum o un fragmento activo de la misma; o una proteína GAD67 de tipo natural o modificada o un fragmento activo de la misma; o una RIP de tipo natural o modificada o un fragmento activo de la misma; o una NTR de tipo natural o modificada o un fragmento activo de la misma.
En una forma de realización preferida, la invención se refiere a un vector de expresión viral, en el que por lo menos uno de dichos casetes de transcripción transgénicos según la invención alberga un promotor y una secuencia que codifica la proteína GAD67 de tipo natural o un fragmento activo de la misma.
En una forma de realización más preferida, la invención se refiere a un vector de expresión viral, en el que uno de dichos casetes de transcripción transgénicos según la invención alberga un promotor y una secuencia que codifica la proteína GAD67 de tipo natural o un fragmento activo de la misma; y uno de dichos casetes de transcripción transgénicos según la invención alberga un promotor y una secuencia que codifica una neurotoxina de tipo natural o modificada de Clostridium tetani y/o botulinum o un fragmento activo de la misma.
En una forma de realización preferida, la invención se refiere a un vector de expresión viral, en el que por lo menos uno de dichos casetes de transcripción transgénicos según la invención alberga un promotor y una secuencia que codifica la RIP de tipo natural o un fragmento activo de la misma.
En una forma de realización más preferida, la invención se refiere a un vector de expresión viral, en el que uno de dichos casetes de transcripción transgénicos según la invención alberga un promotor y una secuencia que codifica la RIP de tipo natural o un fragmento activo de la misma; y uno de dichos casetes de transcripción transgénicos según la invención alberga un promotor y una secuencia que codifica una neurotoxina de tipo natural o modificada de Clostridium tetani y/o botulinum o un fragmento activo de la misma; y/o una secuencia que codifica la proteína GAD67 de tipo natural o un fragmento activo de la misma, y/o una secuencia que codifica la NTR de tipo natural o un fragmento activo de la misma.
En una forma de realización preferida, la invención se refiere a un vector de expresión viral, en el que por lo menos uno de los casetes de transcripción transgénicos según la invención comprende un promotor y una secuencia que codifica la NTR de tipo natural o un fragmento activo de la misma.
En una forma de realización más preferida, la invención se refiere a un vector de expresión viral, en el que dicho vector de expresión viral comprende por lo menos 2 casetes de transcripción transgénicos, en los que:
- por lo menos uno de dichos casetes de transcripción transgénicos según la invención comprende un promotor y una secuencia que codifica la NTR de tipo natural o un fragmento activo de la misma; y
- por lo menos uno de dichos casetes de transcripción transgénicos según la invención comprende un promotor y una secuencia que codifica una neurotoxina de tipo natural o modificada de Clostridium tetani y/o botulinum o un fragmento activo de la misma; y/o una secuencia que codifica la proteína GAD67 de tipo natural o un fragmento activo de la misma; y/o una secuencia que codifica la RIP de tipo natural o un fragmento activo de la misma.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende el vector de expresión viral de la presente invención para su utilización como medicamento.
En un tercer aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende por lo menos un vector de expresión viral según la invención.
Ventajosamente, la composición farmacéutica según la invención se utiliza para el tratamiento de NDO.
La invención asimismo se refiere a una composición farmacéutica que comprende:
a) por lo menos un vector de expresión viral que comprende por lo menos una secuencia de nucleótidos transcrita para proporcionar una secuencia de nucleótidos no codificante, seleccionada preferentemente de ARN antisentido (ARNas), un ARN de horquilla pequeño (ARNhp) o un microARN (miARN), más preferentemente ARN antisentido (ARNas), para inhibir la síntesis de por lo menos una proteína seleccionada de VAMP, SNAP-25 y sintaxina; y/o
b) por lo menos un vector de expresión viral que comprende por lo menos una secuencia de nucleótidos que codifica una neurotoxina bacteriana de tipo natural o modificada que altera el complejo SNARE o un fragmento activo de la misma, preferentemente la cadena ligera de una neurotoxina bacteriana, y en el que dicha neurotoxina bacteriana es ventajosamente la neurotoxina de Clostridium tetani y/o Clostridium botulinum de cualquier serotipo, preferentemente los serotipos A, B, C, E y F; y/o
c) por lo menos un vector de expresión viral que comprende por lo menos:
- una secuencia de nucleótidos que codifica una neurotoxina de tipo natural o modificada deClostridium tetani o botulinum o un fragmento activo de la misma, y
- una secuencia de nucleótidos cuyos transcritos inhiben la síntesis de la proteína VAMP, SNAP-25 y/o sintaxina; y/o
d) por lo menos un vector de expresión viral según la invención, en el que
i. dicha una secuencia de expresión a largo plazo (LTE) está unida funcionalmente a dos casetes de transcripción transgénicos según la invención; o
ii. cada una de dos secuencias de expresión a largo plazo (LTE) está unida funcionalmente a uno de dichos casetes de transcripción transgénicos según la invención; y en el que:
- un casete de transcripción transgénico según la invención alberga un promotor y secuencia que codifica dicha neurotoxina, y el segundo casete de transcripción transgénico según la invención alberga un promotor y una secuencia de nucleótidos que inhibe la síntesis de la proteína VAMP, SNAP-25 y/o sintaxina; o
- ambos casetes de transcripción transgénicos según la invención albergan un promotor y una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de nucleótidos no codificante que inhibe la síntesis de por lo menos una proteína seleccionada de VAMP, SNAP-25 y/o sintaxina; o
- ambos casetes de transcripción transgénicos según la invención albergan una secuencia de nucleótidos que codifica una neurotoxina de tipo natural o modificada de Clostridium tetani y/o botulinum o un fragmento activo de la misma para su utilización simultánea, separada o escalonada para tratar la NDO.
En una forma de realización particular, la composición farmacéutica según la invención, comprende además por lo menos un vector de expresión viral que comprende por lo menos una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína GAD67 de tipo natural y/o RIP y/o n Tr , o un fragmento activo de la misma.
En una forma de realización particular, la composición farmacéutica según la invención, comprende por lo menos un vector de expresión viral que comprende por lo menos una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína GAD67 de tipo natural o un fragmento activo de la misma; y/o por lo menos una secuencia de nucleótidos que codifica una neurotoxina de tipo natural o modificada de Clostridium tetani y/o botulinum o un fragmento activo de la misma; y/o la RIP de tipo natural o un fragmento activo de la misma; y/o para la NTR de tipo natural o un fragmento activo de la misma.
En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un kit que comprende por lo menos un vector de expresión viral o la composición farmacéutica según la invención, o la composición farmacéutica según la invención, y un sistema de estimulación eléctrica que comprende electrodos que han de implantarse en las raíces anteriores sacras, tales como S2-S3-S4, para aplicar trenes de impulsos de estimulación intermitentes con el fin de lograr una contracción sostenida del músculo detrusor con intervalos de relajación del esfínter uretral permitiendo que la orina fluya.
Por “estimulación eléctrica” se entiende en la presente memoria que se aplica una estimulación eléctrica, a través de electrodos, en ráfagas de algunos segundos, separadas por intervalos más lagos, para mantener la presión en la vejiga, mientras se permite que el esfínter uretral externo se relaje rápidamente entre ráfagas, haciendo que la orina fluya durante estos intervalos. El sistema de estimulación eléctrica preferido es el estimulador de Finetech-Brindley (ref. 6 a 19 en Ren et al, 2015).
Aunque no está incluido en el alcance de la invención, en la presente memoria se proporciona un método para el tratamiento de paciente que padecen de NDO que comprende las etapas siguientes:
a) preparar por lo menos un vector de expresión viral según la invención;
b) inyectar el vector de expresión viral de la etapa a) en la pared de la vejiga (músculo detrusor);
c) implantar un sistema de estimulación eléctrica a través de electrodos implantados en las raíces anteriores sacras, tales como S2-S4 o S3-S4, para provocar mediante estimulación en ráfagas de algunos segundos, separadas por intervalos más largos, una presión sostenida en la vejiga, a la vez que se permite que el esfínter uretral externo se relaje rápidamente entre ráfagas, haciendo que la orina fluya, se incluye además en el presente documento.
Los siguientes ejemplos pretenden únicamente ilustrar la presente invención.
Descripción de las figuras
Figura 1. Genoma de vectores de HSV-1 defectuosos recombinantes.
(A) : La parte superior de la figura describe la estructura principal del genoma de HSV-1 en la presente memoria. El genoma del HSV-1 contiene dos regiones únicas, conocidas como única larga (UL) y única corta (US), cada una bordeada por secuencias de repetición invertidas, conocidas como repetición terminal L/repetición invertida L (TRL/IRL) y repetición invertida S/repetición terminal S (IRS/TRS). t Rl/IRL asimismo se denominan ab/b'a', mientras que IRS/TRS asimismo se denominan a'c'/ca. Por tanto, el genoma comienza y termina con la secuencia de repetición directa 'a'. El cuadrado negro en UL indica que el gen que codifica la proteína ICP27 esencial está delecionado en el vector en la presente memoria. De manera similar, los dos cuadrados negros en las repeticiones IRS/TRS indican que los dos genes que codifican la proteína ICP4 esencial asimismo están delecionados. El círculo blanco en UL, así como los dos círculos blancos en las regiones IRS y TRS, indican los orígenes de la replicación del ADN de HSV-1 (OriL y dos copias de OriS, respectivamente). Asimismo pueden delecionarse otros genes que codifican para proteínas no esenciales, tales como UL41, UL55 y UL56. Además, ambas copias de los promotores IE4/5 localizados en IRS y TRS se modifican de tal manera (deleción de una secuencia TAATGARAT) que estos promotores se expresan con una cinética temprana (en lugar de una cinética temprana inmediata como en el genoma del virus de tipo natural).
(B) : La parte central de la figura muestra un detalle de la región b'a'a'c' del genoma del virus, que indica en particular la localización del locus LAT en la región IRL, que contiene el gen que expresa los transcritos asociados a latencia (LAT).
(C y C'): La parte inferior de la figura muestra la estructura detallada de la parte 5' del locus LAT que transporta los casetes de transcripción terapéuticos específicos de DRG (indicados en la figura como la flecha marcada como transgén). Este locus incluye una secuencia de aislador de ADN (INS) en el sentido de 5', el promotor asociado a latencia (LAP), una región que confiere expresión a largo plazo (LTE) y un aislador de ADN (INS) en el sentido de 3'. El casete de transcripción específico de DRG terapéutico se introduce o bien entre LAP y LTE (sitio 1, en C) o bien entre LTE y el segundo aislador de ADN (sitio 2 en C'). Otros genes en las proximidades de LAT asimismo se indican en B (flechas). En la figura 3 se muestran los diferentes casetes de transcripción específicos de DRG que se introducen en la región LAT para generar los vectores recombinantes. Cabe destacar que la región b'a'a'c' es idéntica a la región caab invertida, que se forma cuando el genoma del virus se circulariza en el núcleo celular al comienzo de la infección. Esto significa que ambas copias de ICP4 se delecionan y que el casete de transcripción transgénico puede introducirse en ambas copias del locus LAT.
Figura 2. Genoma de vectores de amplicón (el plásmido de amplicón).
Los plásmidos de amplicón son plásmidos de E. coli convencionales que portan generalmente tres módulos: (1) El módulo bacteriano, que contiene la secuencia Col E1 para la replicación del plásmido en bacterias, y un gen que confiere resistencia a un antibiótico, generalmente ampicilina (en negro). (2) El módulo de amplicón (en rosa), que contiene un origen de replicación de ADN de HSV-1, generalmente OriS (O), y una señal de empaquetamiento (a) que permite la amplificación y el empaquetamiento de una forma concatemérica del plásmido de amplicón; además, este módulo generalmente expresa una proteína indicadora (en este caso, o bien una proteína GFP o bien una proteína de fusión GFP/luciferasa de Renilla (rLuc)) impulsado por el promotor temprano inmediato IE4/5 de HSV-1. (3) El tercer módulo (en blanco) es la unidad de transcripción, que contiene el casete de transcripción específico de DRG (flecha gris marcada como Transgén) colocado entre el LTE y el INS secuenciado, diseñado para inhibir o silenciar la neurotransmisión de manera estable y selectiva en neuronas sensitivas, tal como se describe en esta invención. En la figura 3 se muestran los diferentes casetes de transcripción que se introducen en el plásmido de amplicón para generar los vectores de amplicón.
Figura 3. A. Esta figura representa la región del genoma de los vectores de amplicón utilizados en la presente memoria que porta los dos casetes de transcripción eucariotas. Uno de ellos expresa el gen indicador GFP (o la fusión GFP-rLuc) bajo el control del promotor temprano inmediato IE4/5 de HSV-1. El segundo casete de transcripción expresa cualquiera de las funciones terapéuticas que inhiben o silencian la neurotransmisión, tal como se describe en la presente memoria. Un promotor específico de DRG impulsa la expresión de los casetes de transcripción, mientras que todo el casete está rodeado por secuencias que confieren expresión a largo plazo (cuadrados negros). B. Esta figura muestra algunos de los casetes de transcripción utilizados en este estudio para demostrar la eficacia y selectividad de los constructos génicos. Estos son: vector A: cadena ligera de HCMV-TeNT, (LC); vector B: HCMV-BoNT-A (LC); vector C: HCMV-BoNT-C (LC); vector D: ARN antisentido de SNAP25; vector E: HCMV-luciferasa; vector F: TRPV1-Luciferasa. BoNT-A (Lc ) y BoNT-C (LC) son proteínas de fusión que expresan una etiqueta de HIS C-terminal, ya que no se dispone de anticuerpos anti-BoNT eficaces. HCMV es un promotor viral fuerte y ubicuo, mientras que TRPV1 es un promotor selectivo de DRG. En esta figura no se muestran otros vectores, que expresan otras toxinas botulínicas, o toxinas de fusión SNARE/cadena ligera, o ARN antisentido dirigido a otras proteínas SNARE, o la proteína GAD67 humana, o una proteína RIP tal como saporina S6.
La figura 4 muestra la expresión de BoNT-A (LC), BoNT-C (LC) y TeNT (LC) en líneas celulares Gli36 (una línea celular derivada de un glioblastoma humano) y BHK21 (fibroblastos de hámster). Las células Gli36 y BHK21 se infectaron con los vectores de amplicón HCMV-Luc, HCMV-BoNT-A (LC), HCMV-BoNT-C (LC) o HCMV-TeNT (LC) (mostrados en la figura 2B). Entonces se fijaron las células infectadas y se demostró la expresión de las toxinas utilizando un anticuerpo específico en un ensayo de tipo Western. Se utilizaron anticuerpos anti-TeNT para revelar TeNT (LC); se utilizaron anticuerpos anti-HIS para revelar tanto BoNT-A (LC) como BoNT-C (LC).
La figura 5 muestra que la toxina TeNT (LC) expresada en células Gli36 y presente en extractos celulares posee actividad proteolítica con respecto a VAMP2. Se infectaron células Gli36 con el vector de amplicón que expresa HCMV-TeNT (LC) a una multiplicidad de infección (MOI) de 1. La infección se terminó 2 días después y se prepararon extractos de proteínas. Estos extractos se incubaron en un tampón adecuado (Hepes 50 mM, NaCl 400 mM, ditiotreitol 5 mM y ZnSO42 |iM)) que contiene la proteína diana de TeNT, es decir, VAMP2. Después de la incubación durante 24 h a 37°C con 2,5, 5 y 10 |iL de extractos celulares, se realizaron inmunotransferencias de tipo Western utilizando anticuerpos anti-VAMP2 para revelar la actividad proteolítica de la expresión de TeNT (LC).
La figura 6A muestra que a las 48 horas después de la infección (hpi) de células de neuroblastoma humano SH-S5Y5 con vectores de amplicón que expresan HCMV-BoNT-A (LC) (ver la figura 3B), existe una disminución significativa en células de los niveles de proteína SNAP25 en relación con las células de control infectadas con un vector que expresa luciferasa (HCMV-Luc) o no infectadas (simulado). Los niveles de proteína se detectaron mediante ensayo de inmunotransferencia de tipo Western utilizando anticuerpos anti-SNAP25. Obsérvese que BoNT-A (LC) escinde SNAP25 en dos fragmentos. Los anticuerpos utilizados en estos experimentos reconocen tanto la proteína SNAP25 nativa (banda superior) como el fragmento grande de la proteína escindida (banda inferior). B muestra que a las 48 horas después de la infección (hpi) de células de neuroblastoma humano SH-S5Y5 con vectores de amplicón que expresan HCMV-BoNT-C (LC) (ver la figura 3B), existe una disminución significativa en células de los niveles de proteína tanto de SNAP25 como de sintaxina (STX) en relación con las células de control infectadas con un vector que expresa luciferasa (HCMV-Luc) o no infectadas (simulado). Los niveles de proteína se detectaron mediante ensayo de inmunotransferencia de tipo Western utilizando anticuerpos anti-SNAP25 y anti-STX. Obsérvese que BoNT-C (LC) escinde SNAP25 en dos fragmentos. Los anticuerpos utilizados en estos experimentos reconocen tanto la proteína SNAP25 nativa (banda superior) como el fragmento grande de la proteína escindida (banda inferior).
Figura 7. Casetes de transcripción portados por genomas de vectores recombinantes y de amplicón. Esta figura muestra algunos de los casetes de transcripción que portan y expresan los vectores recombinantes y de amplicón de HSV-1. Estos casetes de transcripción se clasifican en tres familias. Los miembros de la familia A2 son casetes de transcripción que expresan diferentes productos génicos terapéuticos (proteínas o ARN antisentido o miARN), impulsados por el promotor de HCMV potente y ubicuo. Los vectores que portan los casetes de transcripción A2 se utilizan para estudiar el impacto de estos productos génicos sobre la neurotransmisión (la escisión de proteínas SNARe y la inhibición de la liberación de neurotransmisores), permitiendo por tanto la selección de los transgenes más eficaces en el presente contexto. Los miembros de la familia A5 son casetes de transcripción que expresan el gen indicador de luciferasa de luciérnaga (fLuc) impulsados por diferentes promotores candidatos selectivos de DRG. Estos vectores se utilizan para estudiar la intensidad, selectividad y duración de la expresión en neuronas cultivadas y en ganglios periféricos explantados, permitiendo por tanto la identificación de los vectores más selectivos en el presente contexto. Finalmente, los miembros de la familia de vectores A8 expresan casetes de transcripción terapéuticos (productos génicos terapéuticos impulsados por promotores selectivos de DRG), permitiendo por tanto la selección de vectores con alto potencial terapéutico in vivo, en el presente contexto. Cabe señalar que, tal como se muestra en la figura 2, los vectores de amplicón asimismo expresan un transgén GFP/rLuc impulsado por el promotor IE4/5 de HSV-1.
Abreviaturas:
Producto génicos:
TeNT: cadena ligera de neurotoxina tetánica
BoNT-X: cadenas ligeras de neurotoxinas botulínicas BoNT-A, -B, -C, -D, -E o F
BoNT-X-SNARE-Y: proteínas de fusión en las que la cadena ligera de las neurotoxinas botulínicas se fusiona con los péptidos señal y transmembrana de las proteínas SNARE. Más precisamente, estos transgenes expresan BoNT-A-sintaxina, BoNT-B-sintaxina o BoNT-C-Vamp2.
GAD67: ácido glutámico descarboxilasa de 67 kD
NTR: nitrorreductasa
Luc: luciferasa de luciérnaga (fLuc)
Antisentido-SNARE: ARN antisentido dirigido a las proteínas SNARE, SNAP25, VAMP2 o sintaxina
Promotores:
Promotor del factor de elongación 1 humano (EF1A), receptor de potencial transitorio de rata vaniloide 1 (rTRPV1), péptido relacionado con el gen de la calcitonina humana y de rata (hCGRP y rCGRP), canal iónico de detección de ácido 3 de rata (rASIC3) y promotores de advillina humana y de rata (hADVL y rADVL).
Figura 8. BoNT-A expresada a partir de vectores de amplicón escinde la proteína SNARE SNAP25 en células SH-SY5Y.
Se infectan células de neuroblastoma humano (SH-S5Y5) a una MOI de 0.1, 1.0 y 10.0 ufp/célula con vectores de amplicón que expresan unidades de transcripción A2-CMV-BoNT-A (LC) o A2-CMV-Luc, impulsados en ambos casos por el promotor de HCMV. Al día siguiente, se detuvieron las infecciones y se analizaron las proteínas celulares mediante inmunotransferencias de tipo Western utilizando anticuerpos específicos para BoNT-A LC y SNAP25. La parte superior de la inmunotransferencia de tipo Western muestra que cantidades crecientes de BoNT-A LC corresponden a una MOI creciente, lo que demuestra que los vectores utilizados expresan esta proteína en las células infectadas. La parte inferior de las inmunotransferencias muestra la escisión de SNAP25, la proteína del complejo SNARE que es la diana natural de BoNT-A, produciendo así dos fragmentos. A la MOI más baja, se observa principalmente la forma nativa (no escindida) de SNAP25. A la MOI intermedia, puede observarse tanto la forma nativa como la escindida (la banda ligeramente inferior), mientras que a la MOI más alta se escinde la mayor parte de la proteína SNAP25, ya que solo puede observarse el fragmento inferior del doblete. Esto demuestra que BoNT-A LC sintetizada en células SH-S5Y5 puede escindir SNAP25. Por el contrario, en las células SH-S5Y5 infectadas con el vector que expresa Luc, no se observa escisión de SNAP25.
Figura 9. Las cadenas ligeras de las neurotoxinas botulínicas escinden las proteínas SNARE en neuronas infectadas. Se infectaron cultivos primarios de neuronas embrionarias de ganglios de la raíz dorsal (DRG) de rata a una MOI de 10 ufp/célula con vectores de amplicón que expresaban las unidades de transcripción A2-CMV-BoNT-A, A2-CMV-BoNT-B, A2-CMV-BoNT-C, A2-CMV-BoNT-E y A2-CMV-BoNT-F. Las neuronas asimismo se infectaron con vectores de amplicón que expresaban A2-CMV-BoNT-A-sintaxina (STX), A2-CMV-BoNT-B-sintaxina (STX) y A2-CMV-BoNT-C-VAMP2 (v 2). El vector que expresa A2-CMV-Luc se utilizó como control negativo. En todos los casos, el promotor de HCMV dirigió la expresión de los casetes de transcripción. Al día siguiente, se detuvieron las infecciones y se analizaron las proteínas celulares mediante inmunotransferencias de tipo Western. Tal como se muestra en la figura, cada LC de BoNT sintetizada en las neuronas escindió la proteína SNARE esperada: por tanto, las cadenas ligeras de BoNT-A, -C y -E, escindieron SNP25, como lo demuestra la disminución del tamaño de esta proteína, mientras que las cadenas ligeras de BoNT-B y -F escindieron VAMP2, que ya no es detectable en las inmunotransferencias. Además, BoNT-C asimismo escindió la sintaxina (STX), que tampoco es ya visible en las inmunotransferencias. BoNT-C es la única toxina botulínica descrita para escindir dos proteínas SNARE diferentes (SNAP25 y STX). Las cadenas ligeras de las toxinas botulínicas fusionadas con los péptidos señal y transmembrana de las proteínas SNARE escindieron las proteínas SNARE correspondientes exactamente como lo hicieron las toxinas parentales no fusionadas. El carril de Luc muestra las posiciones de las proteínas SNARE nativas, no escindidas (flechas). Esta figura demuestra por tanto que las cadenas ligeras de las toxinas botulínicas (fusionadas o no con fragmentos de las proteínas SNARE) sintetizadas en las neuronas sensitivas después de la infección del vector, pueden escindir sus correspondientes proteínas diana.
Figura 10. Las cadenas ligeras de las toxinas botulínicas inhiben la liberación de neuropéptidos en las neuronas sensitivas.
Se infectaron cultivos primarios de neuronas embrionarias del DRG de rata a una MOI creciente (desde 0.5 hasta 3 ufp/célula) con vectores de amplicón que expresaban A2-CMV-BoNT-A, A2-CMV-BoNT-B, A2-CMV-BoNT-C, A2 -CMV-BonT-D, A2-CMV-BoNT-E y A2-CMV-BoNT-F. Las neuronas asimismo se infectaron con amplicones que expresaban A2-CMV-BoNT-A-sintaxina, A2-CMV-BoNT-B-sintaxina y A2-CMV-BoNT-C-VAMP2. El vector que expresa A2-CMV-Luc se utilizó como control negativo. Las neuronas asimismo se infectaron solo con vehículo (simulado). Al día siguiente, las neuronas infectadas se trataron con KCl 75 mM para estimular la liberación de CGRP, un neuropéptido sintetizado normalmente en las neuronas de DRG. Treinta minutos antes y treinta minutos después del tratamiento con KCl, se tomaron alícuotas de 100 microlitros del medio de cultivo y se evaluó para determinar la presencia de CGRP mediante ELISA (utilizando el kit ELISA para CGRP de Spi Bio, n.° de ref. A05482). Los resultados, expresados como perfiles de regresión lineal después de la conversión logarítmica, muestran que todas las toxinas inhibieron la liberación de CGRP pero lo hicieron con diferentes intensidades, siendo BoNT-F, BoNT-C y BoNT-A las más eficaces a este respecto. En neuronas con infección simulada, así como en neuronas infectadas con el vector que expresa Luc, no se observó inhibición de la liberación de CGRP. Estos resultados indican claramente que la escisión de las proteínas SNARE por LC de BoNT da como resultado la inhibición de la liberación de neuropéptidos, y que BoNT-F es la más eficaz a este respecto.
Figura 11. GAD67 expresado a partir de vectores de amplicón induce la síntesis y liberación extracelular de GABA (ácido gamma-aminobutírico).
7A) Se infectaron células de glioblastoma (Gli36) a una MOI de 0.1, 1.0 y 10 ufp/célula con vectores de amplicón que expresaban A2-CMV-GAD67 o A2-CMV-Luc. Al día siguiente, se detuvieron las infecciones y se analizaron las proteínas celulares mediante inmunotransferencias de tipo Western, utilizando anticuerpos específicos para GAD67 y GAPDH (un gen de mantenimiento utilizado como control interno). Se utilizaron extractos de cerebro de rata como controles positivos para identificar GAD67 endógeno. La figura 11A muestra que la expresión de GAD67 aumenta con la MOI, lo que demuestra que el vector A2-CMV-GAD67 expresa esta proteína. 7B) Se infectaron cultivos primarios de neuronas embrionarias del DRG de rata a una MOI de 0.1, 1.0 y 10 ufp/célula con vectores que expresaban A2-CMV-GAD67 o A2-CMV Luc. Al día siguiente, se detuvieron las infecciones y se evaluaron las concentraciones intracelulares y extracelulares de GABA utilizando el ensayo de resazurina, que es un ensayo acoplado a fluorescencia para GABA (el ensayo se realiza tal como se indica en Ippolito et al., 2014). El panel superior muestra que la cantidad de GABA intracelular aumenta con la MOI, mientras que el panel inferior muestra el aumento de GABA extracelular. El canal marcado como GABA es un control positivo para el ensayo de resazurina. Este resultado muestra claramente que la expresión de GAD67 a partir del vector A2-CMV-GAD67 aumenta la síntesis de GABA intracelular y su liberación al medio extracelular.
Figura 12. La nitrorreductasa (NTR) activa el nitrocompuesto 7'-nitrocumarina e induce la muerte celular en presencia de mitronidazol (MTZ).
8A) Se infectaron células de glioblastoma humano (Gli36) con vectores de amplicón que expresaban A2-CMV-NTR o A2-CMV-Luc a una MOI de 1.0 ufp/célula. Dos días después, se detuvieron las infecciones y se prepararon y utilizaron extractos de proteínas para evaluar la activación de la 7'-nitrocumarina utilizando un ensayo acoplado a fluorescencia (ensayo realizado como en Muller et al., 2015). La figura 12A muestra que únicamente las proteínas extraídas de células infectadas con el vector A2-CMV-NTR indujeron una activación significativa de 7'-nitrocumarina, demostrando que la NTR funcional se expresó en células Gli36 infectadas con A2-CMV-NTR.
8B). Para evaluar si la expresión de NTR inducía la muerte celular en presencia de metronidazol (MTZ), se infectaron células Gli36 con vectores de amplicón A2-CMV-NTR o A2-CMV-Luc a una MOI de 1.0 ufp/célula. Al día siguiente, las células se incubaron con o sin MTZ (0.5 mM) durante 24 horas. A continuación, se detuvieron las infecciones y se evaluó la viabilidad celular utilizando el ensayo MTT (tal como indica Carmichael et al., 1987). La figura muestra que MTZ aumentó significativamente la muerte celular de las células infectadas. Simulado: células no infectadas.
Figura 13. Análisis de la selectividad de expresión de candidatos de promotores selectivos de DRG en ganglios autónomos y sensitivos de ratas adultas.
Se explantaron ganglios (DRG) sensitivos adultos de rata, ganglios simpáticos autónomos (ganglios cervicales superiores, SCG) y ganglios parasimpáticos autónomos (ganglios paracervicales, GPC) y mantuvieron como cultivos organotípicos. Después de 3 días, los ganglios se infectaron individualmente con vectores que expresaban A5-TRPV1-Luc, A5-rCGRP-Luc, A5-ASIC3-Luc o A5-EF1A-Luc, que expresaban todos ellos luciferasa de luciérnaga (fLuc), pero impulsados respectivamente por los siguientes promotores: TRPV1 de rata (rTRPV1), CGRP de rata (rCGRP), ASIC3 de rata (rASIC3) y EF1a, un promotor no selectivo que sirve como control general. Cada ganglio se infectó con 106 partículas vectoriales. Los vectores asimismo expresan luciferasa de Renilla (rLuc) impulsada por un promotor viral (IE4/5 de HSV-1). Al día siguiente, se detuvieron las infecciones y se prepararon extractos celulares para pruebas de luciferasa utilizando el sistema de ensayo indicador Dual-luciferasa de Promega. Los resultados se expresaron como la razón de fLuc/rLuc y se normalizaron como porcentaje de expresión del promotor EF1a en cada DRG (izquierda), SCG (centro) y GPC (derecha). La figura 13 muestra que algunos promotores candidatos, tales como los promotores rTRPV1 y rCGRP, expresan niveles significativamente más altos de fLuc en DRG que en los ganglios autónomos, mientras que otros promotores, tales como rASIC3, no muestran actividad preferente en DRG. Según estos resultados, los promotores rTRPV1 y rCGRP parecen mostrar actividad selectiva para DRG mientras que rASIC3 no muestra tal selectividad cuando se expresa a partir del genoma del virus.
La figura 14 muestra que un vector de amplicón que expresa la proteína indicadora GFP puede infectar cultivos primarios de neuronas embrionarias del d Rg de rata y explantes de DRG de rata adulta, y expresar el transgén de GFP dentro de estas neuronas.
Figura 15. La inoculación intradetrusor de vectores de HSV-1 defectuosos llega a los ganglios de la raíz dorsal (DRG) y expresa transgenes en neuronas sensitivas que inervan la vejiga.
El vector viral que expresa IE4/5-GFP y HCMV-Luciferasa (mostrado en la figura 3B) puede penetrar y expresar ambas proteínas transgénicas en las neuronas aferentes de la vejiga después de su inoculación en la pared de la vejiga de ratas con lesión de la médula espinal (SCI). Las neuronas de DRG que expresan tanto GFP como luciferasa (Luc) se muestran en el ganglio DRG L6, desde el cual se extienden las neuronas que inervan la vejiga. Sin embargo, en el ganglio DRG T13, que no inerva la vejiga, los resultados son negativos. Una semana después de la infección, los animales se sacrificaron y las proteínas transgénicas se revelaron mediante IHC utilizando anticuerpos específicos para GFP y luciferasa. Estos resultados indican que después de la inoculación en la pared de la vejiga, los vectores entran en las neuronas aferentes que inervan la vejiga y se transportan de manera retrógrada a través de los axones a los cuerpos celulares de las neuronas hacia los ganglios L6, que se encuentran en los ganglios de la raíz dorsal (DRG) a partir de los cuales el genoma viral expresa ambas proteínas transgénicas. Los vectores no pueden alcanzar o expresarse en neuronas que no inervan la vejiga (T13).
La figura 16 muestra la alta selectividad celular de la expresión del vector viral en los ganglios de la raíz dorsal (DRG) cuando la luciferasa se impulsa por el promotor TRPV1 selectivo de DRG. La luciferasa se expresa significativamente solo en las neuronas aferentes y no en las neuronas autónomas (simpáticas o parasimpáticas). Los resultados se normalizaron como porcentaje de expresión de luciferasa en relación con la del vector que expresa luciferasa bajo el control del promotor de HCMV fuerte pero no específico (ambos vectores se muestran en la figura 3B).
Ejemplos
Ejemplo 1: construcción de vectores de HSV-1 defectuosos recombinantes y de amplicón
Materiales y métodos
La invención proporciona un conjunto de vectores de HSV-1 defectuosos recombinantes que comprenden deleciones completas de ICP27 y ICP4 (ambas copias), y que portan además, los casetes de transcripción terapéuticos incluidos en el locus de LAT, o bien entre las secuencias de LAP y LTE (sitio 1) o bien entre las secuencias de LTE e INS (sitio 2), tal como se muestra en la figura 1 y la figura 2, para proporcionar expresión a largo plazo para dicho casete. Algunos de los casetes de transcripción utilizados para generar estos vectores se muestran en la figura 3.
Dichos casetes de transcripción expresan las cadenas ligeras (LC) de las toxinas de Clostridium TeNT (LC), BoNT-A (LC), BoNT B (LC), BoNT-C (LC), BoNT E (LC), BoNT-F (LC), o un ARN antisentido (ARNas) dirigido a las proteínas SNARE, VAMP2, SNAP25 y sintaxina, o a las toxinas de fusión SNARE/cadena ligera, o a la proteína GAD67 humana o a una proteína RIP tal como saporina S6, o la NTR nfnB de E. coli, para inhibir/silenciar la neurotransmisión específicamente en neuronas aferentes cuando se coloca bajo el control de un promotor específico de neuronas aferentes.
Para generar los vectores, se utilizó un genoma de longitud completa de HSV-1 de la cepa F clonada en un cromosoma artificial bacteriano (BAC) tal como el descrito por Tanaka et al, 2003. Se introdujeron deleciones génicas e inserciones génicas mediante recombinación homóloga en bacterias y los vectores se reconstituyeron entonces mediante la transfección de líneas celulares permisivas tal como ya se ha descrito (Tanaka et al., 2003). La estructura general de estos vectores se ilustra en la figura 1A.
Genoma de vectores de amplicón de HSV-1. Figura 2.
La invención asimismo proporciona un conjunto de vectores de amplicón defectuosos, que expresan los mismos casetes de transcripción terapéuticos transgénicos que los vectores recombinantes, y se enumeran en la figura 7. Las secuencias que confieren expresión a largo plazo (LTE e INS) rodean los casetes de transcripción (figura 2). La figura 2 asimismo muestra que además de los casetes de transcripción terapéuticos, los vectores de amplicón portan un segundo casete de transcripción, que expresa una proteína indicadora (o bien GFP o bien la proteína de fusión GFP/luciferasa de Renilla) impulsada en todos los casos por el promotor IE4/5 de HSV-1.
Los vectores de amplicón se producen utilizando como auxiliar el virus defectuoso LaLdeltaJ y las líneas celulares complementarias ya descritas por Epstein y colaboradores (Zaupa, Revol-Guyot y Epstein, 2003), que expresa el conjunto de proteínas requeridas para la amplificación y el empaquetamiento del genoma del vector.
Casetes de transcripción portados por genomas de vectores de amplicón y recombinantes. Figura 7. Los vectores de amplicón y recombinantes descritos en la presente memoria portan y expresan casetes de transcripción transgénicos incluidos en las secuencias de HSV-1 que confieren expresión a largo plazo (LAP, LTE, INS), en ambos tipos de vectores, tal como se muestra en las figuras 1 y 2. Algunos ejemplos de los casetes de transcripción utilizados en la presente memoria se enumeran en la figura 7.
Ejemplo 2. Vectores de amplicón de HSV-1.
En la presente memoria asimismo se proporciona un conjunto de vectores de amplicón defectuosos; algunos de estos vectores expresan o bien proteínas indicadoras (luciferasa) o bien las cadenas ligeras (LC) de las toxinas de Clostridium (TeNT (LC), BoNT-A (LC), BoNT B (LC), BoNT-C (LC), BoNT E (LC), BoNT-F (LC)) o un ARN antisentido (ARNas) dirigido a las proteínas SNARE, VAMP2, SNAP25 y sintaxina, o las toxinas quiméricas SNARE/cadena ligera, o la proteína GAD67 humana o una proteína RIP tal como saporina S6 o una proteína nitrorreductasa (NTR) tal como NfnB. Los promotores (prom) que impulsan la expresión de estos transgenes o bien son promotores no específicos (HCMV, e F1A), o bien son promotores específicos de neuronas aferentes (TRPV1, TRPM8, ASIC3, GCRP, ADVl). Se añaden secuencias adicionales que confieren expresión a largo plazo (secuencias LTE y aisladoras de ADN) a algunos de estos promotores (figura 3A). El promotor que rige la expresión del indicador GFP, o la proteína de fusión GFP-rLuc, presente en vectores de amplicón, es el promotor viral temprano inmediato conocido como el promotor IE4/5 de HSV-1. La estructura general de algunos de los vectores de amplicón utilizados en la presente memoria se muestra en la figura 3B.
Ejemplo 3: expresión de BoNT-A, BoNT-C y TeNT. Figura 4.
La expresión de BoNT-A (LC), BoNT-C (LC) y TeNT (LC) se realiza en líneas celulares Gli36 (una línea celular derivada de un glioblastoma humano) y BHK21 (fibroblastos de hámster). Las células Gli36 y BHK21 se infectan con los vectores de amplicón que expresan HCMV-Luc, HCMV-BoNT-A (Lc ), HCMV-BoNT-C (LC), o HCMV-TeNT (LC). Entonces se fijaron las células y se demostró la expresión de la toxina mediante inmunotransferencia de tipo Western utilizando anticuerpos anti-TeNT para revelar TeNT (LC) y anticuerpos anti-HIS para revelar BoNT-A (LC) y BoNT-C (LC). De hecho, no se dispone de anticuerpos anti-BoNT, por tanto BoNT-A (LC) y BoNT-C (LC) se expresan como una proteína de fusión con una cola de HIS C-terminal. La figura 4 muestra que el vector viral que porta los genes que codifican para HCMV-BoNT-A (LC), HCMV-BoNT-C (LC) y HCMV-TeNT (LC) expresan respectivamente BoNT-A (LC), BoNT-C (LC) y TeNT (Lc ) en ambas células Gli36 y BHK21.
Ejemplo 4: actividad proteolítica in vitro de la toxina recombinante TeNT. Figura 5
Se evaluó la actividad proteolítica de la toxina TeNT (LC) con respecto a VAMP2 mediante inmunotransferencias de tipo Western utilizando anticuerpos anti-VAMP2. La toxina TeNT (LC) se expresó en células Gli36 después de la infección con el vector de expresión viral que expresa HCMV-TeNT (LC). La infección se terminó 2 días después y se prepararon extractos de proteínas. Estos extractos se incubaron en un tampón adecuado (que contenía Hepes 50 mM, NaCl 400 mM, ditiotreitol 5 mM y ZnSO42 |iM) que contenía la proteína diana de TeNT, es decir, VAMP2. Se realizaron inmunotransferencias de tipo Western (figura 5) utilizando 2.5, 5 y 10 |il de extractos celulares. Como control negativo se utilizó una muestra sin tratar, una muestra de células infectadas con un vector que no expresa transgén (pA-1) y una muestra de células infectadas con un vector que expresa HCMV-Luc (10 |il). Como control positivo se utilizaron cantidades variables de TeNT recombinante (recTeNT). Los resultados muestran que la cantidad de VAMP2 disminuye cuando se aumenta el extracto de proteína que expresa TeNT (LC), lo que demuestra que la toxina presente en el extracto de proteína muestra actividad proteolítica hacia VAMP2.
Ejemplo 5: actividad proteolítica in cellulo de las toxinas recombinantes BoNT-A (LC) y BoNT-C (LC). Figura 6.
Se utilizó una línea celular de neuroblastoma humano SH-S5Y5 por su propiedad para expresar espontáneamente proteínas SNARE, con el fin de seguir la escisión in cellulo de SNAP25 y sintaxina 1a (STX) después de la infección por vectores de amplicón que expresan BoNT-A (LC) o BoNT-C (LC). Los niveles de SNAP25 y STX se detectaron mediante ensayo de inmunotransferencia de tipo Western utilizando anticuerpos anti-SNAP25 o anti-STX, respectivamente. Como controles negativos, las células no se infectaron (simulado) o se infectaron con el vector que expresa HCMV-Luc. Los resultados (figuras 6a y 6b) muestran que a las 48 horas después de la infección (hpi) de las células SH-S5Y5 con vectores que expresan las cadenas ligeras de BoNT-A o BoNT-C, se produce respectivamente escisión y disminución significativa in cellulo de los niveles de proteína de SNAP25 (figura 6a) o SNAP25 y STX (figura 6b) en relación con las células infectadas con el vector de control que expresa luciferasa.
Ejemplo 6. Figura 8.
BoNT-A expresada a partir de vectores de amplicón escinde la proteína SNARE SNAP25 en células SH-SYS5
Este experimento se diseñó para evaluar si los vectores que expresan la cadena ligera de BoNT-A expresan esta proteína, y para estudiar si esta toxina presenta la misma actividad biológica que la neurotoxina completa (cadena ligera cadena pesada), es decir, la capacidad para escindir su proteína diana SNARE (SNAP25). Tal como se muestra en la figura 8, las células infectadas a multiplicidades crecientes con amplicón que expresa A2-CMV-BoNT-A expresan cantidades crecientes de la toxina. Además, cuando las células se infectan a alta MOI, prácticamente toda la SNAP25 se escinde, demostrando claramente la actividad funcional de la cadena ligera de BoNT-A.
Ejemplo 7. Figura 9.
Las cadenas ligeras de las neurotoxinas botulínicas escinden las proteínas SNARE en neuronas infectadas.
Este experimento se diseñó para confirmar que todas las cadenas ligeras de BoNT sintetizadas en las neuronas infectadas por vectores pueden escindir su proteína diana SNARE natural en neuronas sensitivas. Para este fin, se infectaron cultivos primarios de neuronas embrionarias del DRG a una MOI de 10 con vectores de amplicón que expresan A2-CMV-BoNT-A, -B, -C, -D, -E y -F o A2-CMV-Luc como control negativo. Las infecciones se detuvieron al día siguiente y se analizaron los extractos celulares mediante inmunotransferencias de tipo Western. Tal como se muestra en la figura 9, cada de las neurotoxinas botulínicas expresadas por los vectores escindió su proteína SNARE diana natural. Por tanto, BoNT-A y-E escindieron SNAP25, BoNT-B, -D y-F escindieron VAMP2, mientras que BoNT-C escindió tanto SNAP25 como sintaxina. Esto demuestra claramente que las cadenas ligeras de todas las neurotoxinas muestran la misma actividad biológica que las neurotoxinas completas (cadena ligera cadena pesada).
Ejemplo 8. Figura 10.
Las cadenas ligeras de las toxinas botulínicas inhiben la liberación de neuropéptidos en las neuronas sensitivas.
Este experimento se diseñó para evaluar si las cadenas ligeras de las neurotoxinas botulínicas inducían la inhibición de la liberación de neurotransmisores y para evaluar su eficacia comparativa a este respecto. Se infectaron cultivos primarios de neuronas embrionarias del DRG de rata a una MOI creciente con los vectores tal como se describe en la figura 10. Al día siguiente, se trataron las neuronas infectadas con KCl para estimular la liberación del neuropéptido CGRP y se evaluaron las concentraciones extracelulares de CGRP mediante ELISA. Tal como se muestra en la figura 10, todas las neurotoxinas indujeron inhibición de liberación de CGRP. Además, la figura 6 muestra que BoNT-F fue la más eficaz a este respecto, seguida por BoNT-A y -C.
Ejemplo 9. Figura 11.
GAD67 expresado a partir de vectores de amplicón induce la síntesis y la liberación extracelular de GABA.
El objetivo de este experimento es evaluar si los vectores que expresan GAD67 inducen la síntesis y la liberación del neurotransmisor inhibidor GABA. Para este fin, se infectaron células de glioblastoma (Gli36) a una MOI creciente con vectores de amplicón tal como se describe en la figura 11 y al día siguiente se analizaron los extractos de células infectadas mediante inmunotransferencias de tipo Western, utilizando anticuerpos específicos para GAD67 y GAPDH. La figura 11 muestra que la expresión de GAD67 aumenta con la MOI, lo que demuestra que el vector A2-CMV-GAD67 no expresa esta proteína. Además, se infectaron cultivos primarios de neuronas embrionarias del DRG de rata a diferentes MOI con los mismos vectores. Al día siguiente se detuvieron las infecciones y se evaluaron las concentraciones tanto intracelulares como extracelulares de GABA utilizando el ensayo de resazurina (tal como se indica en la leyenda de la figura 11). El panel superior de esta figura muestra que la cantidad de GABA intracelular aumenta con la MOI, mientras que el panel inferior muestra el aumento de GABA extracelular, demostrando claramente que la expresión de GAD67 a partir del vector A2-CMV-GAD67 aumenta la síntesis de GABA intracelular y su liberación al medio extracelular.
Ejemplo 10. Figura 12.
La nitrorreductasa (NTR) activa el nitrocompuesto 7'-nitrocumarina e induce la muerte celular en presencia de mitronidazol (MTZ).
Este experimento se diseñó para evaluar si la nitrorreductasa expresada a partir de vectores de amplicón inducía la muerte celular en presencia, pero no en ausencia de metronidazol. No existen anticuerpos disponibles específicos para nitrorreductasa (NTR). Por tanto, para evaluar que esta proteína se expresa en células infectadas con A2-CMV-NTR, se utilizó una prueba funcional in vitro basándose en la evaluación de la reducción de 7'-nitrocumarina (Muller et al., 2015). La figura 12 muestra que vectores de amplicón que expresan A2-CMV-NTR activan el nitrocompuesto. Además, la figura 12 muestra que expresión de NTR indujo muerte celular significativa en presencia de metronidazol (MTZ). Esto se explica por el hecho de que NTR puede activar MTZ transformando de ese modo esta molécula en un fármaco citotóxico.
Ejemplo 11. Figura 13.
Análisis de la selectividad de expresión de candidatos de promotores selectivos de DRG en ganglios autónomos y sensitivos para ratas adultas.
Esta prueba se diseñó para investigar si los candidatos de promotor específico de neuronas aferentes, que normalmente son activas solo o principalmente en neuronas aferentes, conservan su actividad específica de neuronas aferentes asimismo cuando se expresan a partir del genoma del vector de HSV-1 no replicativo. Se explantaron ganglios aferentes (DRG) adultos de rata, ganglios simpáticos autónomos (SCG) y ganglios parasimpáticos autónomos (GPC) y se mantuvieron como cultivos organotípicos. Después de 3 días, un tiempo requerido para el crecimiento de neuritas, los ganglios se infectaron individualmente con 3 * 106 partículas de vectores tal como se describe en la leyenda de la figura 13. Estos vectores expresan luciferasa de luciérnaga (fLuc) impulsada por los siguientes promotores: TRPV1 de rata (rTRPV1), Cg Rp de rata (rCGRP), ASIC3 de rata (rASIC3), que se consideran todos ellos promotores específicos de neuronas aferentes, y EF1a, un promotor no selectivo que sirve como control general. Además de fLuc, estos vectores asimismo expresan luciferasa de Renilla (rLuc) impulsada por un promotor viral (IE4/5 de HSV-1). Al día siguiente se detuvieron las infecciones y se prepararon extractos celulares para pruebas de luciferasa. Los resultados se expresan como la razón de fLuc/rLuc y como el porcentaje de la actividad de luciferasa impulsada por EF1a. La figura 13 muestra que rTRPV1 y rCGRP expresan actividad de luciferasa de luciérnaga preferentemente en DRG y por tanto pueden considerarse específicos de DRG incluso cuando se expresan a partir del genoma del vector. En cambio, rASIC3 no muestra tal expresión preferente en los DRG, lo que demuestra que este promotor no conserva su selectividad cuando se expresa a partir del genoma del vector. Por tanto, este ejemplo muestra algunos candidatos de promotor específico de DRG, tales como los promotores rTRPV1 y rCGRP, conservan su selectividad por DRG mientras que otros candidatos de promotor, tales como rASIC3, aunque se considera un promotor específico de DRG cuando se expresa a partir de cromosomas celulares, no conserva esta especificidad cuando se expresa a partir del genoma del vector. Por tanto, no puede predecirse el comportamiento de cualquier candidato de promotor específico de DRG particular y debe evaluarse experimentalmente.
Ejemplo 12: infección y expresión de la proteína recombinante en cultivos celulares.
Se infectaron cultivos neuronales primarios de rata procedentes de cultivos organotípicos y embrionarios de DRG de explantes de DRG de rata adulta con un vector de amplicón que expresa GFP impulsado por el promotor temprano inmediato IE4/5 de HSV-1. Los resultados muestran que vector de expresión viral infectó y expresó el transgén (GFP) tanto en cultivos neuronales sensitivos primarios de rata como en explantes de ganglios de rata adulta (DRG) (figura 14).
Ejemplo 13: expresión in vivo de proteínas recombinantes en neuronas
Se infectaron ratas con lesión de la médula espinal (SCI) por el vector de amplicón HCMV-Luc, que expresa simultáneamente las proteínas indicadoras GFP y Luc. Una semana después de la infección, los animales se sacrificaron y se revelaron las expresiones de proteínas transgénicas mediante IHC. Tal como se indica mediante IHC, cuando se inocula en la vejiga, el vector de amplicón entra en las neuronas aferentes inervando la vejiga, y luego se transporta de manera retrógrada a través de los axones hasta los cuerpos celulares de las neuronas, que se encuentran en los ganglios dorsales (DRG), y donde el genoma viral expresa ambas proteínas transgénicas. Los resultados indican que los vectores de amplicón HCMV-Luc pueden por tanto penetrar y expresar específicamente proteínas transgénicas en neuronas aferentes de la vejiga después de su inoculación en la pared de la vejiga (figura 15). Además, las neuronas que expresan GFP y Luc se observan solo en el ganglio desde el que se extienden las neuronas que inervan la vejiga (el ganglio L6). En cambio, en el ganglio T13, que no inerva la vejiga, no pudo observarse expresión transgénica (datos no representados).
Ejemplo 14: expresión de especificidad celular del vector de expresión viral
Los vectores de amplicón TRPV1-Luc, que expresan luciferasa bajo el control del promotor TRPV1 (promotor activo selectivamente en neuronas aferentes) y HCMV-Luc, que expresan luciferasa bajo el control del promotor de HCMV no selectivo, se utilizaron para infectar ganglios sensitivos y autónomos (tanto ganglios simpáticos cono parasimpáticos). Los resultados muestran que la expresión de la luciferasa bajo el promotor de TRPV1 se expresa específicamente en las neuronas aferentes de los ganglios sensoriales (ganglios de la raíz dorsal, DRG), y no en las neuronas autónomas (simpáticas o parasimpáticas) (figura 16). Los resultados se expresan como porcentaje de la expresión impulsada por el promotor de HCMV no selectivo, que es igualmente alto en todos los tipos de ganglios.
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Vector de expresión viral del virus del herpes simple (HSV) que comprende por lo menos:
a) un promotor activo selectivamente en neuronas aferentes de la vejiga seleccionado de entre un promotor de la familia génica de TRP y un promotor de CGRP,
b) un casete de transcripción que comprende una secuencia de nucleótidos unida funcionalmente a dicho promotor, en el que dicha secuencia de nucleótidos silencia o inhibe la transducción de la señal de neurotransmisor en una célula postsináptica cuando se transcribe, y
c) una secuencia de expresión a largo plazo, en el que dicha secuencia de expresión a largo plazo es una LTE y un aislador de ADN del genoma de HSV-1 y en el que dicho casete de transcripción está colocado entre la LTE y el aislador de ADN.
2. Vector de expresión viral según la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de nucleótidos silencia o inhibe la neurotransmisión o la transmisión sináptica de neuronas aferentes cuando se transcribe mediante la alteración del complejo SNARE y/o el complejo ribosómico y/o mediante la activación de receptores de GABA(A), y/o mediante la inducción de una ablación de neuronas dirigida de manera condicional.
3. Vector de expresión viral según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho promotor de la familia génica de TRP es el promotor de TRPV1 de SEC ID N°: 1 o TRPM8 de SEC ID N°:2, o en el que dicho promotor de CGRP presenta la secuencia de SEC ID N°: 3 o SEC ID N°: 4.
4. Vector de expresión viral según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho vector de HSV es un vector de HSV-1 o un vector de HSV-2, más preferentemente un vector viral defectuoso derivado de HSV, tal como un vector de HSV recombinante o un vector de HSV de amplicón.
5. Vector de expresión viral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha por lo menos una secuencia de nucleótidos se transcribe en una secuencia de nucleótidos no codificante que inhibe la síntesis de por lo menos una proteína seleccionada de entre VAMP, SNAP-25 y sintaxina, preferentemente en el que dicha secuencia de nucleótidos no codificante se selecciona de entre ARN antisentido (ARNas), ARN de horquilla pequeño (ARNhp), o microARN (miARN), más preferentemente un ARN antisentido (ARNas).
6. Vector de expresión viral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha por lo menos una secuencia de nucleótidos codifica una neurotoxina bacteriana de tipo natural o modificada que altera el complejo SNARE o un fragmento activo de la misma, o una proteína GAD67 de tipo natural o modificada o un fragmento activo de la misma, o una proteína de inactivación de ribosomas (RIP) de tipo natural o modificada o un fragmento activo de la misma, o una nitrorreductasa (NTR) de tipo natural o modificada o un fragmento activo de la misma.
7. Vector de expresión viral según la reivindicación 6, en el que dicho fragmento activo de la neurotoxina bacteriana de tipo natural o modificada es la cadena ligera de dicha neurotoxina bacteriana, preferentemente en el que dicha neurotoxina bacteriana es la neurotoxina de Clostridium botulinum de cualquier serotipo o la neurotoxina tetánica de Clostridium tetani.
8. Vector de expresión viral según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, en el que dicho vector de expresión viral comprende una neurotoxina bacteriana modificada y un dominio de péptido señal seleccionado de entre el péptido señal de sintaxina 1a (BoNTA-STX) de SEC ID N°: 28 o (BoNTB-s Tx ) de SEC ID N°: 30 y el péptido señal de VAMP2 (BoNTC-VAMP) de SEC ID N°: 32.
9. Vector de expresión viral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende por lo menos:
a) una secuencia de nucleótidos que codifica una neurotoxina de tipo natural o modificada de Clostridium tetani o botulinum o un fragmento activo de la misma; y/o
b) una secuencia de nucleótidos cuyos transcritos inhiben la síntesis de la proteína VAMP, SNAP-25 y/o sintaxina; y/o
c) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína GAD67 de tipo natural o modificada o un fragmento activo de la misma; y/o
d) una secuencia de nucleótidos que codifica una RIP de tipo natural o modificada o un fragmento activo de la misma; y/o
e) una secuencia de nucleótidos que codifica una NTR de tipo natural o modificada o un fragmento activo de la misma.
10. Vector de expresión viral según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que i. una dicha secuencia de expresión a largo plazo está unida funcionalmente a dos casetes de transcripción según la reivindicación 1; o
ii. dos secuencias de expresión a largo plazo están ambas unidas funcionalmente a un dicho casete de transcripción según la reivindicación 1; y en el que:
a) un casete de transcripción según la reivindicación 1 alberga una secuencia de nucleótidos codificante según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, y el segundo casete de transcripción según la reivindicación 1 alberga una secuencia de nucleótidos que se transcribe en un nucleótido no codificante según la reivindicación 5; o
b) ambos casetes de transcripción según la reivindicación 1 albergan una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de nucleótidos no codificante según la reivindicación 5; o
c) ambos casetes de transcripción según la reivindicación 1 albergan una secuencia de nucleótidos que codifica una neurotoxina de tipo natural o modificada de Clostridium tetani y/o botulinum o un fragmento activo de la misma; o una proteína GAD67 de tipo natural o modificada o un fragmento activo de la misma; o una RIP de tipo natural o modificada o un fragmento activo de la misma; o una NTR de tipo natural o modificada o un fragmento activo de la misma.
11. Composición que comprende el vector de expresión viral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para la utilización como un medicamento.
12. Composición farmacéutica que comprende por lo menos un vector de expresión viral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
13. Composición farmacéutica según la reivindicación 12 que comprende:
a) por lo menos un vector de expresión viral como se define en la reivindicación 5; y/o
b) por lo menos un vector de expresión viral como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8;
y/o
c) por lo menos un vector de expresión viral como se define en la reivindicación 9 o 10,
para la utilización simultánea, separada o escalonada para tratar la hiperactividad neurógena del detrusor.
14. Composición farmacéutica que comprende por lo menos un vector de expresión viral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para la utilización para el tratamiento de la hiperactividad neurógena del detrusor.
15. Kit que comprende por lo menos un vector de expresión viral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o la composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, y un sistema de estimulación eléctrica que comprende unos electrodos que deben implantarse sobre las raíces anteriores sacras, tales como S2-S3-S4, para aplicar unos trenes de impulsos de estimulación intermitentes con el fin de lograr una contracción del músculo detrusor sostenida con intervalos de relajación del esfínter uretral que permiten que la orina fluya.
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