CN103649317B - 治疗性融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及构建一种新种类的靶向分泌抑制剂(TSIs)，其包含无细胞毒性蛋白酶、易位肽和靶向部分肽，其中所述靶向部分肽具有游离的N端结构域和游离的C端结构域；本发明还涉及其单链融合蛋白前体，以及激活所述单链融合蛋白前体的方法。

Description

治疗性融合蛋白
本发明涉及构建一种新种类的靶向分泌抑制剂(Targeted SecretionInhibitors，TSIs)，涉及其激活方法以及激活产物。
无细胞毒性蛋白酶是一组公认的蛋白酶，其通过破坏细胞功能而作用在靶细胞上。重要的是，无细胞毒性蛋白酶在其作用时不会杀死靶细胞。无细胞毒性蛋白的一些已知最好的实例包括梭菌神经毒素(例如，肉毒菌神经毒素，其以诸如DysportTM，NeufoblocTM和BotoXTM的名称市售)和IgA蛋白酶。
无细胞毒性蛋白酶通过蛋白水解-切割已知为SNARE蛋白的细胞内转运蛋白(例如SNAP-25，VAMP，或突触融合蛋白)作用-参见Gerald K(2002)″Cell and Molecular Biology(细胞和分子生物学)”(第4版)JohnWiley&Sons，Inc.。简称SNARE是来源于术语可溶NSF附着受体(SolubleNSF Attachment Receptor)，其中NSF意指N-乙基马来酰亚胺-敏感因子(N-ethylmaleimide-Sensitive Factor)。SNARE蛋白是细胞内囊泡形成所必需的，并且因此通过囊泡转运从细胞分泌分子。因此，一旦被递送到需要的靶细胞，该无细胞毒性蛋白酶就能够抑制由所述靶细胞的细胞分泌。
无细胞毒性蛋白酶可以以其天然的或基本上天然的形式(即，作为全毒素，如在使用DysportTM，NeuroblocTM和BotoxTM的情形中)使用，在该情形中，该蛋白酶靶向特定的细胞型取决于:(i)局部施用蛋白酶和/或(ii)天然蛋白酶的固有的结合能力。备选地，无细胞毒性蛋白酶可以以重新靶向的形式(re-targeted form)使用，其中天然蛋白酶被修饰以包含已知为靶向部分(Targeting Moiety，TM)的外源配体。选择TM以提供对需要的靶细胞的结合特异性，并且作为重新靶向过程的一部分，可以去除无细胞毒性蛋白酶的天然结合部分。
本申请人率先提出了这样的观念并且开发了基于梭菌神经毒素的重新靶向技术，并且所产生的融合蛋白称为靶向分泌抑制剂(TSIs)。
TM置换可以通过技术人员公知的常规化学缀合技术实现。在这一点上，提及Hermanson，G.T.(1996)，Bioconjugate techniques(生物缀合技术)，Academic Press，和Wong，S.S.(1991)，Chemistry of protein conjugationand cross-linking(蛋白缀合和交联化学)，CRC Press。
然而，化学缀合通常是不精确的。例如，缀合后，TM可能在不止一个连接位点与缀合物的其余部分连接。化学缀合也难以控制。例如，TM可以在蛋白酶成分上的连接位点和/或在易位成分上的连接位点与修饰的毒素的其余部分连接。当为治疗功效需要仅与所述成分中的一个连接(优选在单个位点连接)时，这将成为问题。因此，化学缀合导致不理想的修饰毒素分子的混合群体。
作为化学缀合的备选方案，TM置换可以通过重组制备单链多肽融合蛋白而实现。此类分子的制备记述在WO98/07864中。然而，本发明人已经鉴定了WO98/07864的方法并不适用于所有类型的TM。
WO98/07864的系统的备选系统记述在WO2006/059093中。依据WO2006/059093，TM存在于单链融合蛋白的中间(centrally-presented，CP)，位于无细胞毒性蛋白酶成分和易位结构域成分之间。这形成具有下述结构的单链融合蛋白：
NH2-[蛋白酶成分]-[TM]-[易位成分]-COOH
上述融合蛋白通过用在位于所述蛋白酶成分C端的位点切割的蛋白酶处理而激活。这一激活过程产生二链蛋白，其包含与融合蛋白的易位成分共价连接(通过二硫键连接)的蛋白酶成分。在WO2006/059093的情形中，产生的二链分子的TM通过其C端与易位结构域成分的N端的肽键结合。因此，该TM的N端则是游离的，从而与需要的受体相互作用和结合。这种排列对于需要游离的N端或游离的N端部分来结合其受体的TM种类是重要的。
例如，在蛋白水解激活后，WO2006/059093提供具有下述二链构象的多肽：
在所述二链构象中，TM和易位成分以单链融合蛋白的形式存在，其中TM的C端与易位成分的N端以肽键结合。
本发明人已经发现WO98/07864与WO2006/059093中所述的系统不是对所有类型的TM呈递都是最理想的，并且因此可能导致产生具有针对目的靶细胞不理想/减少的结合能力的融合蛋白。
因此，需要一种用于构建TSIs的备选的或改善的系统。
本发明通过提供一种单链多肽融合蛋白而解决了一种或多种上述问题，所述单链多肽融合蛋白包含：
(a)无细胞毒性蛋白酶或其片段，该蛋白酶或蛋白酶片段能够切割靶细胞的胞吐融合器(exocytic fusion apparatus)的蛋白；
(b)靶向部分，其能够结合在靶细胞上的结合位点，所述结合位点能够进行胞吞作用从而被引入到靶细胞内的内体中；
(c)易位结构域，其能够将所述蛋白酶或蛋白酶片段从内体内易位穿过内体膜并且进入靶细胞的细胞质中；
(d)第一蛋白酶切割位点，在该位点融合蛋白被第一蛋白酶切割，其中所述第一蛋白酶切割位点位于所述无细胞毒性蛋白酶与所述易位结构域之间；
(e)第二蛋白酶切割位点，在该位点融合蛋白被第二蛋白酶切割，其中所述第二蛋白酶切割位点位于所述易位结构域与所述靶向部分之间；和
(f)在所述靶向部分与所述易位结构域之间的共价键，其中在第二蛋白酶切割位点的蛋白水解切割之后，所述靶向部分通过所述共价键保持连接至所述易位结构域。
WO2006/059093所述的系统提供的TSIs具有这样的TM，其N端是游离的，从而与靶细胞上的结合位点相互作用。然而，本发明人已经发现WO2006/059093所述的系统不适合用于需要游离的N端结构域和游离的C端结构域二者以与靶细胞上的结合位点相互作用的TMs。
因此，与WO2006/059093相比，本发明提供了一种提供TSIs的系统，其中TM成分具有游离的N端结构域和游离的C端结构域二者。
在一个实施方案中，本发明提供具有下述N端到C端方向的单链融合蛋白，其中P1和P2表示第一和第二蛋白酶切割位点：
NH2-[蛋白酶成分]-[P1]-[TM]-[P2]-[易位成分]-COOH
在所述第一和第二切割位点切割后，所述单链融合蛋白采用下述三链结构，其中TM和易位成分共价连接在一起，并且其中
A)所述蛋白酶成分与所述TM成分共价连接：
或者B)所述蛋白酶成分与所述易位成分共价连接：
在另一个实施方案中，本发明提供具有下述N端到C端方向的单链融合蛋白，其中P1和P2表示第一和第二蛋白酶切割位点：
NH2-[蛋白酶成分]-[P1]-[易位成分]-[P2]-[TM]-COOH
在所述第一和第二切割位点切割后，所述单链融合蛋白采用下述三链结构，其中TM和易位成分共价连接在一起，并且其中
A)所述蛋白酶成分与所述易位成分共价连接：
或者B)所述蛋白酶成分与所述TM成分共价连接：
在另一个实施方案中，本发明提供具有下述N端到C端方向的单链融合蛋白，其中P1和P2表示第一和第二蛋白酶切割位点：
NH2-[TM]-[P2]-[蛋白酶成分]-[P1]-[易位成分]-COOH
在所述第一和第二切割位点切割后，所述单链融合蛋白采用下述三链结构，其中TM和易位成分共价连接在一起，并且其中
A)所述蛋白酶成分与所述易位成分共价连接：
或者B)所述蛋白酶成分与所述TM成分共价连接：
在使用时，本发明的多肽TSI与靶细胞结合，该结合由TM促成。然而，所述易位结构域成分使得所述无细胞毒性蛋白酶成分转运到靶细胞的细胞质内。一旦进入，所述无细胞毒性蛋白酶成分抑制靶细胞的胞吐融合过程。因此，通过使靶细胞的胞吐融合器失活，本发明的多肽抑制由靶细胞产生的分泌。因此，本发明的TSI多肽可以用来抑制或治疗多种与细胞分泌相联系的病理生理病症或症状。
无细胞毒性蛋白酶
本发明的TSI多肽的生物活性成分是无细胞毒性蛋白酶。因此，一旦被递送到靶细胞的细胞质中，所述无细胞毒性蛋白酶成分在需要的靶细胞中实施SNARE切割。由于SNARE蛋白是哺乳动物靶细胞中分泌过程的重要成分，所以其蛋白水解失活抑制/阻抑从所述靶细胞的分泌。
无细胞毒性蛋白酶是一类独立的不杀死细胞的分子；相反，其通过抑制细胞过程而不是抑制蛋白合成而起作用。无细胞毒性蛋白酶由多种高等生物体(例如，植物和动物)产生，所述高等生物体的一个实例是巴西蝎子(Brazilian scorpion)。另外，无细胞毒性蛋白酶由多种微生物产生，特别是细菌如梭菌(Clostridium sp.)和奈瑟球菌(Neisseria sp.)。
梭菌神经毒素代表一大组无细胞毒性毒素分子，并且包含通过二硫键连接在一起的两条多肽链。这两条链称为重链(H-链)和轻链(L-链)，重链具有约100kDa的分子量，轻链具有约50kDa的分子量。正是L-链具有蛋白酶功能并且表现出针对参与胞吐过程的囊泡和/或质膜相关(SNARE)蛋白(例如，小突触泡蛋白(synaptobrevin)，突触融合蛋白(syntaxin)，SNAP和/或VAMP)的高底物特异性。这些底物是细胞分泌机制的重要成分。
奈瑟球菌，尤其是来自淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeae)物种，产生功能类似的无细胞毒性毒素分子。这样的无细胞毒性蛋白酶的实例是IgA蛋白酶(参见WO99/58571)。类似的IgA蛋白酶由链球菌(streptococci)如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)产生。
因此，在一个实施方案中，本发明的无细胞毒性蛋白酶可以是梭菌神经毒素蛋白酶或IgA蛋白酶(参见，例如，WO99/032272)。无细胞毒性蛋白酶的另一个实例是蝎子毒蛋白酶，诸如来自巴西蝎子巴西钳蝎(Tityusserrulatus)的毒液的蛋白酶，或蛋白酶antarease(参见，例如，WO2011/022357)。
靶向部分(TM)
本发明的TM成分负责本发明的多肽与靶细胞上的结合位点的结合。因此，TM成分是一种配体，通过它本发明的多肽与选定的靶细胞结合。
在本发明的情形中，所述靶细胞可以似乎任何哺乳动物(优选人)细胞。因此，TM可以结合非神经元细胞和/或神经元细胞。
本发明的多肽的TM成分具有游离的N端部分和游离的C端部分二者。因此，在一个实施方案中，TM能够通过靶向部分的N端部分与结合位点结构域之间的相互作用与靶细胞上的结合位点(例如，受体或接纳体)相互作用。在另一个实施方案中，TM能够进行靶向部分的C端部分与结合位点结构域之间的相互作用。在另一个实施方案中，TM能够进行双重作用，其中靶向部分的N端部分与结合位点结构域相互作用，并且靶向部分的C端部分与结合位点结构域相互作用。在后一种实施方案中，TM的N端部分和C端部分可以结合相同或不同的结合位点结构域，和/或可以结合不同结合位点上的结构域。
用于本发明的多肽的适合的TMs包括细胞毒素，生长因子，神经肽，凝集素和抗体-该术语包括单克隆抗体，蛋白结合支架，抗体片段如Fab，F(ab)’2，Fv，ScFv和单链抗体如骆驼科动物的(camelids)那些等等。
在一个实施方案中，TM成分包括与靶细胞上存在的受体结合的肽配体(例如，肽激素)或由与靶细胞上存在的受体结合的肽配体(例如，肽激素)组成。在一个实施方案中，所述肽配体具有5-200个连续氨基酸残基的氨基酸序列。例如，所述肽配体由5-150或5-100或5-50或5-40或5-30或5-25或5-20或7-12个或约10个连续的氨基酸残基的氨基酸序列组成或包含5-150或5-100或5-50或5-40或5-30或5-25或5-20或7-12个或约10个连续的氨基酸残基的氨基酸序列。
TM成分包含N端部分和C端部分。所述部分中的每一个典型地包含至少5个、至少10个、至少15个、至少20个或至少25个连续的氨基酸残基。
在一个实施方案中，TM包含肽配体(或其类似物)或由肽配体(或其类似物)组成，所述肽配体(或其类似物)结合选自下列各项的受体：MRGPRX1(例如，牛肾上腺髓质(BAM)肽受体)，阿片样肽受体，OPRM1或OPRD1(例如，β-内啡肽肽受体)，BDKRB1或BDKRB2(例如，缓激肽肽受体)，OPRM1或OPRD1（例如，met-或leu-脑啡肽肽受体)，OPRK1(例如，强啡肽肽受体)，GALR1，GALR2或GALR3(例如，甘丙肽肽受体)，OPRL1(例如，伤害感受肽肽受体)和TACR1，TACR2或TACR3(例如，P物质肽受体)。
在一个实施方案中，TM包含肽配体(或其类似物)或由肽配体(或其类似物)组成，所述肽配体(或其类似物)选自牛肾上腺髓质(BAM)肽，阿片样肽，β-内啡肽，缓激肽，met-或leu-脑啡肽，强啡肽，甘丙肽，伤害感受肽和P物质肽。
在一个实施方案中，TM包含促性腺素释放素(GnRH)肽或由促性腺素释放素(GnRH)肽组成。GnRH为10个氨基酸的肽激素。GnRH的N端氨基酸在受体激活过程中起作用，而C端氨基酸是与GnRH受体高亲和力结合所需要的(参见，Flanagan，Millar&Illing(1997)Reviews ofReproduction，2，113-120，其通过引用完全引入本文)。GnRH的体内功能时作用在位于前叶垂体上的GnRH受体并且刺激促性腺素(如促黄体素(LH)和促卵泡激素(FSH))的合成和释放。提及GnRH肽包括其所有的功能结合片段、变体和类似物。例如，术语GnRH肽包括这样的GnRH肽，其中已经插入半胱氨酸氨基酸(在其侧翼连接两个无手性的氨基酸残基，如甘氨酸和/或丙氨酸)作为GnRH肽位置6的置换氨基酸。GnRH还称为促黄体激素释放激素(LHRH)。其他的实例包括GnRHI肽、GnRHII肽和GnRHIII肽、以及全长92个氨基酸的GnRH前体多肽及其截短体。
在一个实施方案中，TM包含促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)肽。CRF是41个氨基酸的下丘脑肽激素，其与CRF1和CRF2受体相互作用。CRF在体内的主要功能是刺激从脑垂体前叶内的促肾上腺皮质素细胞释放ACTH。提及CRF肽包括全长CRF，尿皮质素1(urocortin1)和尿皮质素2(urocortin2)，及其所有功能结合片段、变体和类似物。
在一个实施方案中，TM包含胃泌素释放肽(GRP)或由胃泌素释放肽(GRP)组成。GRP是一种27个氨基酸的肽激素。GRP调节多种胃肠和中枢神经系统功能，包括释放胃肠激素，平滑肌细胞收缩和上皮细胞增殖，并且是肿瘤组织的有力的促分裂原。提及GRP肽包括其所有的功能结合片段、变体和类似物。
在一个实施方案中，TM包含神经调节肽B或由神经调节肽B组成。神经调节肽B是一种10个氨基酸的肽激素。神经调节肽B的功能是在体内作用在BB1受体上，并且是正常的和肿瘤的肺和胃肠上皮组织的有力的分裂原和生长因子。提及神经调节肽B包括其所有的功能结合片段、变体和类似物。提及神经调节肽B包括人同系物肽，铃蟾肽，并且包括全长：铃蟾肽----一种最初从青蛙皮肤中分离的14个氨基酸的肽----及其截短体和肽类似物。
在一个实施方案中，TM包含胃泌素或胆囊收缩素(CCK)或由胃泌素或胆囊收缩素(CCK)组成。胃泌素是一种17个氨基酸的肽激素。CCK是一种8个氨基酸的肽激素。胃泌素和胆囊收缩素在体内作用主要在胃肠系统和CNS内的CCK1和CCK2受体上，从而调节胰腺酶分泌和胆囊和胃的平滑肌收缩、焦虑、镇痛、唤醒和神经安定活动。提及胃泌素和胆囊收缩素肽包括其所有的功能结合片段、变体和类似物。
在一个实施方案中，TM包含促生长素抑制素(SST)肽或由促生长素抑制素(SST)组成。适当的SST肽TMs的实例包括全长SST和皮质抑素(cortistatin，CST)，以及其截短体和肽类似物，诸如BIM23052，BIM23056或BIM23268；奥曲肽，兰瑞肽，BIM23027，CYN154806，BIM23027，伐普肽，司格列肽和SOM230。这些TMs结合sst受体，诸如sst1，sst2，sst3，sst4和sst5受体。SST和CST具有高结构同源性，并且结合所有已知的sst受体。提及SST或CST肽包括其所有的功能结合片段、变体和类似物。
在一个实施方案中，TM包含生长激素释放激素(GHRH)肽或由生长激素释放激素(GHRH)肽组成。GHRH还称为生长素释放因子(GRF或GHRF)或生长素释放肽。适当的GHRH肽包括全长GHRH(1-44)肽，及其截短体，如GHRH(1-27，1-28，1-29)，GHRH(1-37)和GHRH(1-40，1-43)-OH，以及肽类似物，如BIM28011或NC-9-96。提及GHRH肽包括其所有的功能结合片段、变体和类似物。
在一个实施方案中，TM包含蛋白酶激活的受体(PAR)肽例如PAR1或由蛋白酶激活的受体(PAR)肽例如PARl组成。PAR肽表示一种独特的7-跨膜受体G-蛋白-偶联受体亚型，原因在于其被蛋白水解修饰而暴露新的胞外N端，该胞外N端作用为系留激活配体(tethered activating ligand)。已经鉴定了PAR1激动剂(如TFLLR)，其激活其同源受体。提及PAR肽包括其所有的功能结合片段、变体和类似物。
在一个实施方案中，TM包含甲状旁腺激素(PTH)或由甲状旁腺激素(PTH)组成。PTH是一种由甲状旁腺释放的肽并且与PTH-1受体结合。该受体具有广泛的分布，但是在PTH靶组织中(主要是肾和骨骼中)特别丰富。提及PTH肽包括其所有的功能结合片段、变体和类似物。
在一个实施方案中，TM包含与黏液分泌细胞或控制或指导黏液分泌的神经元细胞结合的肽或由与黏液分泌细胞或控制或指导黏液分泌的神经元细胞结合的肽组成。例如，TM结合：(a)分泌黏蛋白的细胞，诸如上皮杯形细胞和粘膜下腺黏液分泌细胞，(b)分泌黏液的水性成分的细胞，诸如克拉拉细胞(Clara cells)和浆液细胞，和/或(c)控制或指导黏液分泌的细胞，诸如“感觉传出”C-纤维，或NANC神经系统纤维。特别提及下述肽TMs：VIP；β2肾上腺素受体激动剂；胃泌素释放肽；和降钙素基因相关肽。提及这些肽TMs包括其所有的功能结合片段、变体和类似物。因此，根据这一实施方案的TSIs在治疗黏液分泌过多、哮喘和/或慢性闭塞性肺病中具有治疗用途。
在另一个实施方案中，TM包含与内分泌细胞结合的肽或由与内分泌细胞结合的肽组成。此处特别提及的是GHRH；促甲状腺素(TSH)；胰岛素，胰岛素样生长因子；TSH释放激素(普罗瑞林(protirelin))；FSH/LH释放激素(戈那瑞林(gonadorelin))；促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)；和ACTH。提及这些肽TMs包括其所有的功能结合片段、变体和类似物。因此，根据这一实施方案的TSIs在治疗下述中具有治疗用途：内分泌腺肿瘤形成(endocrine neoplasia)，包括MEN；甲状腺毒症(thyrotoxicosis)及其他依赖于甲状腺的高分泌的疾病；肢端肥大症(acromegaly)，高催乳素血症(hyperprolactinaemia)，库欣病(Cushings disease)和其他依赖于垂体前叶分泌过多的疾病；雄激素增多症(hyperandrogenism)，持续无排卵(chronic anovulation)和与多囊卵巢综合征相关的其他疾病。
在另一个实施方案中，TM包含与炎性细胞结合的肽或由与炎性细胞结合的肽组成。此处特别提及的是用于下述的TMs肽：(i)肥大细胞，诸如Fc IgE的C4结构域；(ii)嗜酸性粒细胞，诸如针对C3a/C4a-R补体受体的配体，针对CR4补体受体反应性的抗原；(iii)巨噬细胞和单核细胞，诸如巨噬细胞刺激因子，(iV)嗜中性粒细胞，诸如与iC3b补体受体或IL8相关的抗原。提及这些肽TMs包括其所有的功能结合片段、变体和类似物。因此，根据这一实施方案的TSIs具有用于治疗下述各项的治疗用途：变态反应(季节性变应性鼻炎(seasonal allergic rhinitis)(花粉热(hayfever))，变应性结膜炎(allergic conjunctivitis))，血管运动性鼻炎(vasomotorrhinitis)和食物过敏)，嗜酸性细胞增多症(eosinophilia)，哮喘(asthma)，类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)，系统性红斑狼疮(systemic lupuserythematosus)，盘状红斑狼疮(discoid lupus erythematosus)，溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)，局限性肠炎(Crohn′s disease)，痔疮(haemorrhoids)，搔痒症(pruritus)，肾小球肾炎(glomerulonephritis)，肝炎(hepatitis)，胰腺炎(pancreatitis)，胃炎(gastritis)，脉管炎(vasculitis)，心肌炎(myocarditis)，银屑病(psoriasis)，湿疹(eczema)，慢性辐射诱发的纤维变性(chronic radiation-induced fibrosis)，肺瘢痕化(lung scarring)和其他纤维化病症。
在另一个实施方案中，TM包含与外分泌细胞结合的肽或由与外分泌细胞结合的肽组成。此处特别提及垂体腺苷环化酶激活肽(PACAP-38)。提及这些肽TMs包括其所有的功能结合片段、变体和类似物。因此，根据这一实施方案的TSIs具有用于治疗由位于消化道中(特别是位于结肠中)的黏液分泌细胞的黏液分泌过多症的治疗用途。
在另一个实施方案中，TM包含与免疫细胞结合的肽或由与免疫细胞结合的肽组成。此处提及配体，如埃巴病毒(Epstein Barr virus)片段/表面特征。提及这些肽TMs包括其所有的功能结合片段、变体和类似物。因此，根据这一实施方案的TSIs具有用于治疗下述各项的治疗用途：重症肌无力(myasthenia gravis)，类风湿关节炎，系统性红斑狼疮，盘状红斑狼疮，器官移植(organ transplant)，组织移植(tissue transplant)，流体移植(fluid transplant)，格雷夫斯病(Graves disease)，甲状腺毒症(thyrotoxicosis)，自身免疫型糖尿病(autoimmune diabetes)，溶血性贫血(haemolytic anaemia)，血小板减少性紫癜(thrombocytopenic purpura)，嗜中性白细胞减少症(neutropenia)，慢性自身免疫性肝炎(chronicautoimmune hepatitis)，自身免疫性胃炎(autoimmune gastritis)，恶性贫血(pernicious anaemia)，桥本甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)，艾迪生病(Addison′s disease)，舍格伦综合征(Sjogren′s syndrome)，原发性胆汁性肝硬变(primary biliary cirrhosis)，多肌炎(polymyositis)，硬皮病(scleroderma)，系统性硬化病(systemic sclerosis)，寻常天疱疮(pemphigusvulgaris)，大疱性类天疱疮(bullous pemphigoid)，心肌炎(myocarditis)，风湿性全心炎(rheumatic carditis)，肾小球肾炎(古德帕斯丘型)(glomerulonephritis(Goodpasture type))，葡萄膜炎(uveitis)，睾丸炎(orchitis)，溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)，脉管炎，萎缩性胃炎(atrophicgastritis)，恶性贫血，1型糖尿病。
在另一个实施方案中，TM包含与心血管细胞结合的肽或由与心血管细胞结合的肽组成。此处提及凝血酶和TRAP(凝血酶受体激动性肽)，以及与心血管内皮细胞结合的配体，诸如GPlb表面抗原识别抗体。提及这些肽TMs包括其所有的功能结合片段、变体和类似物。因此，根据这一实施方案的TSIs具有用于治疗心血管病症和/或高血压的治疗用途。
在另一个实施方案中，TM包含与骨细胞结合的肽或由与骨细胞结合的肽组成。此处提及与成骨细胞结合的配体，其用于治疗选自骨硬化症(osteopetrosis)和骨质疏松症(osteoporosis)的疾病，该配体包括降钙素，并且提及与破骨细胞结合的配体，包括破骨细胞分化因子(例如，TRANCE，或RANKL或OPGL)。提及这些肽TMs包括其所有的功能结合片段、变体和类似物。因此，根据这一实施方案的TSIs具有用于治疗骨骼病症的治疗用途。
线性和环形的整联蛋白结合序列代表另一组本发明的肽TMs。多种整联蛋白识别三联体Arg-Gly-Asp(RGD)肽序列(Ruoslahti，1996)。发现RGD基序存在于超过100种蛋白中，包括纤连蛋白，生腱蛋白，纤维蛋白原和玻连蛋白。RGD-整联蛋白相互作用是包括柯萨奇病毒(Roivaninen等，1991)和腺病毒(Mathias等，1994)的多种病原体进入细胞的保守机制。所述线性和环形肽序列，分别为PLAEIDGIEL和CPLAEIDGIELC，已经显示出在表达α9β1整联蛋白的细胞中结合DNA并且使DNA内在化(Schneider等，1999)。提及这些肽TMs包括其所有的功能结合片段、变体和类似物。
本发明的其他TMs包括通过噬菌体展示技术发现的那些，特别是靶向并且被人呼吸道上皮细胞内在化的那些。这些包括：线性和环形的THALWHT(Jost等，2001)；LEBP-1(QPFMQCLCLIYDASC)，LEBP-2(RNVPPIFNDVYWIAF)和LEBP-3(VFRVRPWYQSTSQS)(Wu等，2003)；CDSAFVTVDWGRSMSLC(Florea等，2003)；SERSMNF，YGLPHKF，PSGAARA，LPHKSMP，LQHKSMP(Writer等，2004)；FSLSKPP，HSMQLST和STQAMFQ肽(Rahim等，2003)。提及这些肽TMs包括其所有的功能结合片段、变体和类似物。
在一个实施方案中，TM包含第一和第二部分(例如结构域)或由第一和第二部分(例如结构域)组成。在一个实施方案中，靶向部分的第一和第二部分可以来源于相同的配体(例如，上文鉴定的TM配体中的任一种)。所述第一和第二部分可以与相同受体上的相同或不同的位点结合。备选地，所述第一和第二部分可以与不同受体上的位点结合。
靶向部分的第一和第二部分可以来源于不同的配体(例如，上文鉴定的TM配体中的任一种)，其可以结合相同或不同的受体，因此，TM可以是两个TMs的杂化体。所述第一和第二部分可以与相同受体上的相同或不同的位点结合。备选地，所述第一和第二部分可以与不同受体上的位点结合。
TM还可以包括来自其他TMs(例如，上文鉴定的TM配体中的任一种)的第三和/或以后的部分(subsequent portion)。
在一个实施方案中，第一部分(例如结构域)包含下述或由下述组成：通过游离的N端部分(例如游离的N端)与其靶受体结合的配体。这样的配体的一个实例是与阿片类受体结合的配体(例如，与ORL1受体结合的配体，如阿片类肽)。阿片类肽的其他实例包括伤害感受肽，强啡肽，β-内啡肽和脑啡肽。其他非阿片样肽TM配体包括BAM，甘丙肽，P物质，GnRH，CRF，GRP，神经调节肽B，铃蟾肽，胃泌素，CCK，SST，CST和GHRH肽(及其截短体、变体和类似物)。
在另一个(或相同的)实施方案中，第二部分(例如结构域)包含下述或由下述组成：通过游离的C端部分(例如游离的C端)与其靶受体结合的配体。这样的配体的一个实例是与缓激肽受体结合的配体(例如缓激肽)或与P物质受体结合的配体(例如P物质肽)。其他的肽TM配体包括BAM，甘丙肽，P物质，GnRH，CRF，GRP，神经调节肽B，铃蟾肽，胃泌素，CCK，SST，CST和GHRH肽(及其截短体、变体和类似物)。
例如，杂化TM包括第一部分和第二部分，其中第一部分包含伤害感受肽或由伤害感受肽组成，第二部分包含缓激肽(或P物质肽)或由缓激肽(或P物质肽)组成。在其他实例中，第一部分包含伤害感受肽或由伤害感受肽组成，第二部分包含选自下述的肽或由选自下述的肽组成：BAM肽，阿片类肽，β-内啡肽，缓激肽，脑啡肽，强啡肽，甘丙肽和P物质肽。
在另一个实例中，杂化TM包括第一部分和第二部分，其中第一部分包含强啡肽或由强啡肽组成，第二部分包含缓激肽(或P物质肽)或由缓激肽(或P物质肽)组成。在其他实例中，第一部分包含强啡肽或由强啡肽组成，第二部分包含选自下述的肽或由选自下述的肽组成：BAM肽，阿片类肽，β-内啡肽，缓激肽，脑啡肽，伤害感受肽，甘丙肽和P物质肽。
在另一个实例中，杂化TM包括第一部分和第二部分，其中第一部分包含甘丙肽或由甘丙肽组成，第二部分包含缓激肽(或P物质肽)或由缓激肽(或P物质肽)组成。在其他实例中，第一部分包含甘丙肽或由甘丙肽组成，第二部分包含选自下述的肽或由选自下述的肽组成：BAM肽，阿片类肽，β-内啡肽，缓激肽，脑啡肽，伤害感受肽，强啡肽和P物质肽。
在另一个实例中，杂化TM包括第一部分和第二部分，其中第一部分包含BAM肽或由BAM肽组成，第二部分包含缓激肽(或P物质肽)或由缓激肽(或P物质肽)组成。在其他实例中，第一部分包含BAM肽或由BAM肽组成，第二部分包含选自下述的肽或由选自下述的肽组成：阿片类肽，β-内啡肽，缓激肽，脑啡肽，伤害感受肽，强啡肽，甘丙肽和P物质肽。
在另一个实例中，杂化TM包括第一部分和第二部分，其中第一部分包含β-内啡肽或由β-内啡肽组成，第二部分包含缓激肽(或P物质肽)或由缓激肽(或P物质肽)组成。在其他实例中，第一部分包含β-内啡肽或由β-内啡肽组成，第二部分包含选自下述的肽或由选自下述的肽组成：阿片类肽，BAM肽，缓激肽，脑啡肽，伤害感受肽，强啡肽，甘丙肽和P物质肽。
在另一个实例中，杂化TM包括第一部分和第二部分，其中第一部分包含脑啡肽(例如leu-或met-脑啡肽)或由脑啡肽(例如leu-或met-脑啡肽)组成，第二部分包含缓激肽(或P物质肽)或由缓激肽(或P物质肽)组成。在其他实例中，第一部分包含脑啡肽或由脑啡肽组成，第二部分包含选自下述的肽或由选自下述的肽组成：阿片类肽，β-内啡肽，缓激肽，BAM肽，伤害感受肽，强啡肽，甘丙肽和P物质肽。
在一个实施方案中，TM包含第一和第二部分(例如结构域)或由第一和第二部分(例如结构域)组成，所述第一和第二部分是相同的(或类似的)，并且二者组合提供与靶细胞上的受体的有效相互作用。还可以包含其他相同的/相似的部分(例如，第三相同的/相似的部分，以及任选另外的相同的/相似的部分，等等)。因此，在这一实施方案中，本发明的多肽包含相同(或相似的)TM的重复结构(例如TM-TM；TM-TM-TM等)。
此类重复的TM结构(例如TM-TM；TM-TM-TM；等等)的实例由选自下述的TM提供：阿片类肽，β-内啡肽，缓激肽，BAM肽，伤害感受肽，强啡肽，甘丙肽，脑啡肽，P物质肽，GnRH肽，CRF肽，GRP肽，神经调节肽B肽，铃蟾肽，胃泌素肽，CCK肽，SST肽，CST肽和GHRH肽(及其截短体、变体和类似物)。
在一个实施方案中，TM的第一和第二(和/或以后的)部分通过间隔区序列(例如，肽序列)隔开。在一个实施方案中，第一和第二(和/或以后的)部分可以间隔至多40个或至多35个或至多30个或至多25个或至多20个或至多15个或至多10个、至多5个氨基酸残基的序列。在一个实施方案中，第一和第二(和/或以后的)部分可以通过4，3，2，1或0个氨基酸残基的序列隔开。
当与相对应的‘游离的’TM(即，分离的TM本身)相比较时，本发明的融合蛋白通常表现出减少的针对靶细胞的结合亲和力(在多至100倍的区域内)。然而，尽管有这样的观察，本发明的融合蛋白令人惊讶地表现出良好的功效。这可以归因于两个主要特征。第一，无细胞毒性蛋白酶成分有催化性-因此，一些这样的分子的治疗作用在靶细胞内迅速放大。第二，靶细胞上存在的受体仅需要作用为治疗剂进入的入口，不必要被刺激到获得配体-受体介导的药理学反应所需要的水平。因此，本发明的融合蛋白可以比其他类型的治疗性分子所用的剂量低的剂量施用，其他类型的治疗性分子典型地以高的微克至毫克(甚至多至数百毫克)的量度施用。相比之下，本发明的融合蛋白可以以低得多的剂量施用，典型地至少低10倍，更典型地低100倍的剂量施用。
易位结构域
本发明的易位成分允许无细胞毒性蛋白酶(或其片段)易位到靶细胞内，从而使蛋白酶活性的功能性表达发生在靶细胞的细胞质中。所述易位成分优选能够在低pH条件下在脂质膜(例如内体膜)中形成离子通透的孔。所述易位成分可以获自微生物蛋白来源，例如，细菌或病毒蛋白来源。因此，在一个实施方案中，所述易位成分包含下述或由下述组成：酶的易位结构域，诸如细菌毒素。在另一个实施方案中，所述易位结构域包含下述或由下述组成：病毒蛋白的易位结构域。在一个实施方案中，本发明的易位成分可以包含下述或由下述组成：梭菌神经毒素H链或其片段，如梭菌神经毒素的HN结构域(或其易位片段)。
第一和第二蛋白酶切割位点
本发明的多肽包含第一蛋白酶切割位点。所述第一蛋白酶切割位点允许融合蛋白在无细胞毒性蛋白酶成分与所述融合蛋白的其余部分之间的位置切割(例如，可控的切割)。该切割事件起作用‘激活’单链(无细胞毒性蛋白酶-易位结构域)结构，并且导致形成‘激活的’二链结构，其中所述无细胞毒性蛋白酶成分与融合蛋白的其余部分共价连接(例如，二硫键连接)。
本发明的多肽还包含第二蛋白酶切割位点。所述第二蛋白酶切割位点允许融合蛋白在靶向部分成分和易位结构域成分之间的位置切割(例如，可控的切割)。该切割事件起作用分离单链(TM-易位结构域)结构，并且导致形成分开的二链结构，其中TM成分与融合蛋白的易位成分共价连接(例如，二硫键连接)。这样做时，TM成分的结构环境改变，以使其变得以这样的构象存在：其中N端和C端部分(例如结构域)都不再与融合蛋白的其余部分肽键结合，并且因此每一个都能够自由地与一个(或多个)受体上的不同结合结构域相互作用(例如，结合)。
因此，在第一或第二蛋白酶切割位点的蛋白水解切割使单链多肽融合蛋白转变为二链多肽。在第一蛋白酶切割位点的切割反应的情形中，无细胞毒性蛋白酶成分保持通过共价键(例如，二硫键)与易位结构域成分和/或TM成分连接。所述共价连接可以是间接的，例如，通过一个(或多个)间隔区或接头分子连接，所述间隔区或接头分子本身与无细胞毒性蛋白酶成分、TM成分和/或易位成分连接。类似地，在第二蛋白酶切割位点的切割反应的情形中，易位结构域成分保持通过共价键(例如，二硫键)与TM成分连接。所述共价键可以是间接的，例如，通过一个(或多个)间隔区或接头分子连接，所述间隔区或接头分子本身与易位成分和/或TM连接。
当切割反应在第一和第二蛋白酶切割位点二者发生时，单链多肽融合蛋白转变成三链多肽。
第一和第二蛋白酶切割位点可以通过常规方式，诸如通过位点定向诱变在DNA水平上引入(和/或去除任何固有的切割序列)。验证切割序列的存在的筛选可以手工进行或在计算机软件(例如，DNASTAR，Inc.的MapDraw程序)的辅助下进行。
尽管可以使用任意的蛋白酶切割位点来用作本发明的多肽中的第一蛋白酶切割位点和/或用作第二蛋白酶切割位点，但是下述是优选的：
其他非限制性的实例包括植物木瓜蛋白酶切割位点，和昆虫木瓜蛋白酶切割位点，甲壳类木瓜蛋白酶切割位点，人鼻病毒3C蛋白酶切割位点，人肠病毒3C蛋白酶切割位点，烟草蚀斑病毒(TEV)蛋白酶切割位点，烟草脉状病毒(Tobacco Vein Mottling Virus，TVMV)切割位点，枯草杆菌蛋白酶切割位点，羟胺切割位点，或胱天蛋白酶3切割位点。
术语蛋白酶切割位点还包括内蛋白(intein)，其为一种自切割序列。自剪接反应是可控的，例如，通过改变存在的还原剂的浓度而进行控制。术语蛋白酶切割位点还包括无细胞毒性蛋白酶(例如，梭菌神经毒素)作用的切割序列。这样的切割位点的实例是SNARE蛋白切割位点序列-在本描述部分的结束时提供用于一定范围的无细胞毒性蛋白酶的天然切割位点识别序列的实例。
第一和第二切割位点可以是相同的或不同的。第一和第二切割位点可以(仅)被相同的或(仅)被不同的蛋白酶切割。
作为本发明的一个独立的方面，上述切割位点/切割蛋白酶可以单独用作“破坏性”切割位点/蛋白酶(下文讨论的)，如果后者被引入到本发明的多肽中。
在一个实施方案中，在单链多肽中，无细胞毒性蛋白酶成分和易位结构域成分通过二硫键连接在一起。因此，在切割第一蛋白酶切割位点后，所述多肽采用二链构象，其中蛋白酶和易位成分通过二硫键保持连接在一起。该切割反应通常称为“激活”步骤，因为其产生具有增加的(例如，最佳的)蛋白酶活性的无细胞毒性蛋白酶成分。
在一个实施方案中，所述无细胞毒性蛋白酶成分与融合蛋白的易位结构域成分形成共价键。例如，在一个实施方案中，蛋白酶成分形成共价键的氨基酸残基位于所述蛋白酶成分的最后20个C端氨基酸残基内，优选最后10个C端氨基酸残基内。类似地，在一个实施方案中，易位成分中形成共价键的第二部分的氨基酸残基可以位于所述易位成分的前20个N端氨基酸残基内，优选前10个N端氨基酸残基内.
上述共价键排列具有这样的优点：蛋白酶和易位成分以与关于天然无细胞毒性蛋白酶(例如，天然的梭菌神经毒素)相似的方式排列。通过比较，参考关于天然梭菌神经毒素的一级氨基酸序列，各个半胱氨酸氨基酸残基间隔8-27个氨基酸残基-摘自Popoff，MR&Marvaud，J-C，1999，Structural&genomic features of clostridial neurotoxins(梭菌神经毒素的结构和基因组特征)，第9章，在The Comprehensive Sourcebook ofBacterial Protein Toxins.Ed.Alouf&Freer中：
1仅来自蛋白水解株的信息
在一个实施方案中，本发明的单链融合蛋白的无细胞毒性蛋白酶成分和第一蛋白酶切割位点成分通过至多30，25，20，15或10氨基酸残基隔开。在一个实施方案中，所述两种成分在单链融合蛋白内通过至多5，4，3，2或1个氨基酸残基隔开。在另一个实施方案中，所述两种成分在单链融合蛋白内通过0个氨基酸残基隔开。
因此，在一个实施方案中，所述无细胞毒性蛋白酶和所述蛋白酶切割位点可以使用第一间隔序列隔开，所述第一间隔序列位于所述第一蛋白酶切割位点的N端和所述无细胞毒性蛋白酶成分的C端。在一个实施方案中，所述第一间隔序列可以包含部分或全部的第一蛋白酶切割位点，或者可以是无细胞毒性蛋白酶成分的一部分。
在一个实施方案中，单链融合蛋白的易位结构域(或TM)成分与第一蛋白酶切割位点成分通过至多30，25，20，15或10个氨基酸残基隔开。在一个实施方案中，所述两种成分在单链融合蛋白内通过至多5，4，3，2或1个氨基酸残基隔开。在另一个实施方案中，所述两种成分在单链融合蛋白内通过0个氨基酸残基隔开。
因此，在一个实施方案中，所述易位结构域(或TM)和所述第一蛋白酶切割位点可以通过第二间隔序列隔开，所述第二间隔序列位于所述第一蛋白酶切割位点的C端和所述易位结构域(或TM)成分的N端。所述第二间隔序列可以与隔开所述无细胞毒性蛋白酶和所述第一蛋白酶切割位点的第一间隔序列相同或不同。在一个实施方案中，所述第二间隔序列可以包含部分或全部的第二蛋白酶切割位点，或者可以是易位结构域成分的一部分。
在一个实施方案中，单链融合蛋白的易位结构域成分与第二蛋白酶切割位点成分隔开至多30，25，20，15或10个氨基酸残基。在一个实施方案中，所述两种成分在单链融合蛋白内通过至多5，4，3，2或1个氨基酸残基隔开。在另一个实施方案中，所述两种成分在单链融合蛋白内通过0个氨基酸残基隔开。
因此，在一个实施方案中，所述易位结构域和所述第二蛋白酶切割位点可以通过第三间隔序列隔开，所述第三间隔序列位于所述易位结构域的N端或C端。所述第三间隔序列可以与第一和第二间隔序列中的一个或两个相同(或不同)。在一个实施方案中，所述第三间隔序列可以包含部分或全部的第二蛋白酶切割位点，或者可以是易位结构域成分的一部分。
在一个实施方案中，所述靶向部分与所述第二蛋白酶切割位点通过至多30，25，20，15或10个氨基酸残基隔开。在一个实施方案中，所述两种成分在单链融合蛋白内通过至多5，4，3，2或1个氨基酸残基隔开。在另一个实施方案中，所述两种成分在单链融合蛋白内通过0个氨基酸残基隔开。
因此，在第二蛋白酶切割位点切割后，多肽提供有这样的靶向部分：其具有基本上与缀合物的其余部分游离的N端结构域和C端结构域。这种排列有助于靶向部分的N端和C端成分与靶细胞上的结合位点的相互作用。
在一个实施方案中，所述靶向部分和所述第二蛋白酶切割位点可以通过第四间隔序列隔开，所述第四间隔序列位于靶向部分的N端或C端。第四间隔序列可以与第一、第二和第三间隔序列中的一个、两个或全部三个相同(或不同)。在一个实施方案中，所述第四间隔序列可以包含部分或全部的第二蛋白酶切割位点，或者可以是易位结构域成分的一部分。
在一个实施方案中，第一蛋白酶(通过其能够切割所述第一蛋白酶切割位点)与第二蛋白酶(通过其能够切割所述第二蛋白酶切割位点)相同。
因此，在一个实施方案中，用单种蛋白酶处理单链多肽融合蛋白可以引起所述第一和第二蛋白酶切割位点二者的切割。
多种不同的间隔分子可以用在本发明的任一种融合蛋白中。此类间隔分子的实例包括GS5，GS10，GS15，GS20，GS25和Hx27。
共价键
本发明的多肽融合蛋白包含两个共价键：第一这样的键位于无细胞毒性蛋白酶成分与所述融合蛋白的其余部分之间；第二个这样的键位于靶向部分与易位结构域之间。在(相应)第一和第二蛋白酶切割位点处蛋白水解切割后，所述两个共价键保持完好。在一个实施方案中，所述共价键不是肽键(即，所述共价键是非肽键)。例如，在一个实施方案中，所述共价键中的一个或二者都是二硫键。
在第二蛋白酶切割位点蛋白水解切割后，共价键保持完好。在第二蛋白酶切割位点的切割具有使靶向部分的N端(或C端)暴露的作用。因此，在第二蛋白酶切割位点的切割产生具有游离的N端和游离的C端的靶向部分。
因此，在第二蛋白酶切割位点切割后，由于在靶向部分与易位结构域之间的肽键已被切割，所述靶向部分成分不再如所述易位结构域成分一样是同一多肽链的一部分。然而，由于存在共价键，所述靶向部分保持与所述易位结构域连接。
共价键可以包括在多肽链的两个氨基酸残基之间能够形成的或已形成的任意的共价键。
在一个实施方案中，共价键是二硫键。共价键可以在多肽中存在的任意两个硫醇(即，-SH)基团之间形成。例如，二硫键可以在位于多肽链的两个半胱氨酸残基(或其功能等价变体)之间形成。
因此，在一个实施方案中，位于易位结构域成分的半胱氨酸残基与位于靶向部分成分的另一个半胱氨酸残基形成共价键。这样的二硫键在第二蛋白酶切割位点切割后保持完好。
位于易位结构域成分和位于靶向部分成分中的通过共价键连接的氨基酸残基可以是天然存在于所述成分中的。因此，在一个实施方案中，共价键在天然存在于所述易位结构域成分的氨基酸残基与天然存在于所述靶向部分成分中的氨基酸残基之间形成。备选地，所述氨基酸残基中的一个或二者都可以引入到所述易位结构域成分和/或所述靶向部分成分中。氨基酸残基可以作为置换引入。
在一个实施方案中，共价键是在天然存在于所述易位结构域成分的半胱氨酸残基与天然存在于所述靶向部分成分中的半胱氨酸残基之间形成的二硫键。在备选的实施方案中，为了促使或允许在易位结构域和靶向部分这两种成分之间形成二硫键，向所述易位结构域或所述靶向部分或者二者中特异性引入半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，在TM和/或易位结构域中引入一个或多个半胱氨酸残基。当这样结合时，引入的半胱氨酸残基可以在其侧翼连接两个小的非手性氨基酸残基(如甘氨酸和/或丙氨酸)。使用这样的氨基酸残基避免直接的三级结构(immediate tertiary structure)，并且促使二硫键形成。所述小的非手性氨基酸残基可以是天然存在的，或可以是引入到TM和/或易位结构域中的。
在一个实施方案中，除了共价键，在所述易位结构域和所述靶向部分之间存在短的多肽(例如1-20个或1-10个或5-10个氨基酸残基)，所述短的多肽提供二级多肽结构。所述二级多肽结构帮助所述易位结构域和所述靶向部分的定位，由此辅助：(1)TM与所述易位结构域之间的共价键的形成，和/或(2)定位TM以使其C端和N端末端朝向远离所述易位成分。
因此，在一个实施方案中，二级多肽结构起作用使得所述靶向部分的一部分与所述易位结构域紧密接近，由此使得能量上更有利的共价键形成。
在一个实施方案中，能够形成上述二级多肽结构的多肽是含有至少一个“大体积”氨基酸残基(如脯氨酸残基)的多肽序列。
因此，在一个实施方案中，在易位结构域和靶向部分之间位于包含至少一个大体积氨基酸残基的多肽。所述大体积残基辅助在多肽链中形成弯曲，以使所述靶向部分的一部分比不含大体积氨基酸残基的情形更紧密地接近所述易位结构域。
在所述无细胞毒性蛋白酶成分与所述融合蛋白的其余部分(例如，易位成分和/或TM成分)之间的相应的共价键可以以如上述关于在易位结构域成分与TM成分之间的共价键相同的方式形成。如上述，可以引入一个或多个二级结构和/或一个或多个大体积氨基酸残基。
在一个实施方案中，在无细胞毒性蛋白酶成分与融合蛋白的其余部分之间的共价连接位于所述无细胞毒性蛋白酶成分与所述易位结构域成分之间。在一个实施方案中，在所述无细胞毒性蛋白酶成分与所述易位结构域成分之间的共价键利用位于各个成分上的天然存在的半胱氨酸残基即，诸如例如在之前的描述部分中示例的一个或多个半胱氨酸残基。备选地，可以向各个成分中引入一个或多个适当的半胱氨酸残基。
融合蛋白可以包含一个或多个纯化标签，其位于蛋白酶成分的N端和/或易位成分的C端。
尽管可以使用任意的纯化标签，但是下述是优选的：
His-标签(例如6×组氨酸)，优选作为C-端和/或N-端标签
MBP-标签(麦芽糖结合蛋白)，优选作为N-端标签
GST-标签(谷胱甘肽-S-转移酶)，优选作为N-端标签
His-MBP-标签，优选作为N-端标签
GST-MBP-标签，优选作为N-端标签
硫氧还蛋白-标签，优选作为N-端标签
CBD-标签(壳多糖结合结构域)，优选作为N-端标签。
治疗用途
TM成分引导本发明的靶向分泌抑制剂(TSI)治疗性分子进入需要的靶细胞。
例如，使用在整个说明书中描述的TMs(诸如阿片类肽，β-内啡肽，缓激肽，BAM肽，伤害感受肽，强啡肽，甘丙肽，脑啡肽，P物质肽)引导本发明的靶向分泌抑制剂(TSI)治疗性分子进入疼痛感觉细胞(例如，初级感觉传入(primary sensory afferent))。因此，产生的融合蛋白提供用于抑制疼痛的治疗性分子-申请人提及WO2006/059093，WO2007/138339和WO96/33273，每份申请通过引用完全引入本文。
在整个说明书中所述的TMs可以用来引导本发明的靶向分泌抑制剂(TSI)分子进入促进神经原性炎症的细胞中。因此，本发明的靶向分泌抑制剂(TSI)分子提供用于抑制神经原性炎症的治疗性分子-申请人提及WO2010/138395，WO2010/138392，WO2010/138387，WO2010138382和WO2010/138379，每份申请通过引用完全引入本文。用在所述TSI分子和治疗中的优选的TMs包括阿片样TMs如伤害感受肽和强啡肽。
在整个说明书中所述的TMs可以用于引导本发明的靶向分泌抑制剂(TSI)分子进入促进泌尿生殖-神经病症(如活动过度的膀胱)的细胞中。因此，本发明的靶向分泌抑制剂(TSI)分子提供用于抑制泌尿生殖-神经病症(如活动过度的膀胱)的治疗性分子-申请人提及WO2010/138393，WO2010/138389，WO2010/138384和WO2010/138366，每份申请通过引用完全引入本文。用在所述TSI分子和治疗中的优选的TMs包括阿片样TMs如伤害感受肽和强啡肽。
TMs，如促性腺素释放素(GnRH)肽、CRF肽、GRP肽、神经调节肽B肽、铃蟾肽、胃泌素肽、CCK肽、SST肽、CST肽和GHRH肽可以用于将本发明的TSI分子引入到促进癌症的细胞中或实际上本身是癌细胞的细胞中。因此，本发明的靶向分泌抑制剂(TSI)分子提供用于抑制神经内分泌病症(诸如肢端肥大症和库欣病)和用于抑制癌症(例如肺癌、肾癌、脑癌、乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌、肾上腺癌、食道癌、淋巴瘤、白血病、急性白血病、膀胱癌、骨癌、肠癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)、肝癌、皮肤癌、口咽癌(oropharyngealcancer)、骨髓瘤、前列腺癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌或卡波西肉瘤(Kaposisarcoma))的治疗性分子-申请人提及WO2009/150489，WO2009/150470和WO2010/055358，每份申请通过引用完全引入本文。用在所述TSI分子和治疗中的优选的TMs包括GHRH肽、SST肽和CST肽。
破坏性切割位点
本发明的多肽可以进一步被修饰以减少或防止与扩散到非靶向区域中相关的不需要的副作用。根据这一实施方案，所述多肽包含破坏性切割位点。所述破坏性切割位点不同于‘激活’位点(即，二链形成)和第二蛋白酶切割位点(即，形成具有游离的C端和N端结构域的TM)。所述破坏性切割位点可被第三蛋白酶切割，并且不被第一和第二蛋白酶切割。此外，当这样通过第三蛋白酶在所述破坏性切割位点切割时，本发明的多肽具有减小的功效(例如，减小的与目的靶细胞的结合能力，减小的易位活性和/或减小的无细胞毒性蛋白酶活性)。例如，申请人提及WO2010/094905和WO02/044199，每份申请通过引用完全引入本文。
因此，根据这一实施方案，本发明提供可以在非位点区域(off-sitelocation)被可控地失活和/或破坏的多肽。
在一个实施方案中，所述破坏性切割位点被第三蛋白酶(即，破坏性蛋白酶)识别并切割，所述第三蛋白酶选自循环蛋白酶(例如，细胞外蛋白酶，如血清蛋白酶或凝血级联的蛋白酶)，组织相关的蛋白酶(例如，基质金属蛋白酶(MMP)，如肌肉的MMP)，和细胞内蛋白酶(优选靶细胞中不存在的蛋白酶)。因此，在使用时，如果本发明的多肽远离其目的靶细胞分散时和/或被非靶细胞摄取时，所述多肽将通过破坏切割位点的切割(被第三蛋白酶切割)而失活。
在本发明的情形中，基质金属蛋白酶(MMPs)是一组优选的破坏性蛋白酶。在该组内，优选ADAM17(EC3.4.24.86，也称为TACE)，其切割多种膜锚定的细胞表面蛋白，从而“脱落”细胞外结构域。另外，优选的MMPs包括蛇毒蛋白酶、沙雷氏菌溶素(serralysins)和虾红素。另一组有段的破坏性蛋白酶是哺乳动物血液蛋白酶，诸如凝血酶、凝血因子VIIa、凝血因子IXa、凝血因子Xa、凝血因子XIa、凝血因子XIIa、激肽释放酶、蛋白质C和MBP-相关的丝氨酸蛋白酶。
按照本发明的第二方面，提供编码上述多肽融合蛋白的核酸序列。
在本发明的优选方面中，DNA序列制备为DNA载体的一部分，其中所述载体包含启动子和终止子。编码上述多肽融合蛋白的DNA序列位于启动子的下游；终止子位于所述核酸序列的下游。
在优选的实施方案中，载体具有选自下述的启动子：
本发明的DNA构建体优选在计算机上(in silico)设计，任何通过常规的DNA合成技术合成。
上文提及的DNA序列信息任选地按照要用的最终宿主细胞(例如大肠杆菌(E.Coli))表达系统进行密码子偏好性修饰。
优选针对任意的固有核酸序列筛选DNA主链，其在转录和翻译时将产生与由第二肽编码序列所编码的蛋白酶切割位点相对应的氨基酸序列。这一筛选可以手工进行或在计算机软件(例如DNASTAR，Inc.的MapDraw程序)辅助下进行。
按照本发明的另一个实施方案，提供用于制备上述单链多肽融合蛋白的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达编码上述融合蛋白的核酸序列或上述DNA载体。
按照本发明的另一个实施方案，提供制备无细胞毒性试剂的方法，所述方法包括：
a.提供包含本发明的单链多肽融合蛋白的溶液；
b.向所述溶液中添加能够切割第一蛋白酶切割位点的第一蛋白酶和能够切割第二蛋白酶切割位点的第二蛋白酶；
c.切割所述第一蛋白酶切割位点和所述第二蛋白酶切割位点；
由此形成三链融合蛋白。
在一个实施方案中，第一蛋白酶和第二蛋白酶顺序加入。在一个备选实施方案中，第二蛋白酶在第一蛋白酶之前加入。在另一个实施方案中，第一蛋白酶和第二蛋白酶同时加入。
本方面提供一种三链多肽。更详细地，产生的三链多肽典型地具有下述结构，其中：
a.第一链包含无细胞毒性蛋白酶或其片段，所述蛋白酶或蛋白酶片段能够切割靶细胞的胞吐融合器的蛋白；
b.第二链包含易位结构域，其能够将所述蛋白酶或蛋白酶片段从内体内易位穿过内体膜并且进入靶细胞的细胞质中；
c.第三链包含靶向部分，其能够结合在靶细胞上的结合位点，所述结合位点能够进行胞吞作用从而被引入到靶细胞内的内体中；
d.第一链和第二链二硫键连接在一起；并且第二链和第三链通过非肽共价键连接在一起。
多肽递送
按照本发明的另一方面，提供上述单链多肽融合蛋白，或上述无细胞毒性多肽，其用于治疗、预防或改善医学病症。
在使用中，本发明利用药物组合物，其包含多肽以及选自药用载体、赋形剂、辅药、推进剂和/或盐的至少一种成分。
本发明的多肽可以配制用于口服、肠胃外、连续输注、植入、吸入或局部应用。适用于注射的组合物可以采取溶液、混悬液或乳液的形式，或采用在使用前溶解或悬浮在适当的赋形剂(vehicle)中的干粉形式。
局部递送方式可以包括气雾剂或其他喷雾剂(例如，喷雾器)。在这一点上，多肽的气雾剂制剂允许递送至肺和/或其他鼻和/或支气管或气道通路。优选的施用途径选自：系统性(例如静脉内(iv))、腹腔镜的和/或局部注射(例如，直接经蝶骨注射到靶细胞如肿瘤中)。
在注射用制剂的情形中，其任选地包含辅助所述多肽保持在施用位点或减少所述多肽从施用位点的去除的药用活性物质。这样的药用活性物质的一个实例是血管收缩剂如肾上腺素。这样的制剂赋予这样的优点：增加多肽在施用后的滞留时间并且因此增加和/或提高其作用。
施用本发明的多肽的剂量范围是产生所需要的治疗作用的那些范围。应该理解，所需要的剂量范围取决于多肽或组合物的精确性质、施用途径、制剂的性质、患者年龄、患者病症的性质、程度或严重性、禁忌症(如果有一些的话)和主治医师的判断。可以使用标准的最优化经验途径调节这些剂量水平中的变化。
适当的日常剂量(每kg患者体重)在0.0001-1mg/kg的范围内，优选0.0001-0.5mg/kg，更优选0.002-0.5mg/kg，并且特别优选0.004-0.5mg/kg。单位剂量可以从少于1微克到30mg变化，但是典型地将在0.01至1mg/剂量的区域内，其可以每日施用或优选较不频繁地施用，诸如每周或六个月一次。特别优选的给药方案是基于2.5ng多肽作为1X剂量。在这一点上，优选的剂量是在1X-100X(即2.5-250ng)的范围内。
流体剂型典型地使用多肽和不含致热原的无菌赋形剂制备。取决于赋形剂和所用的浓度，所述多肽可以溶解或者混悬在所述赋形剂中。在制备溶液时，所述多肽可以溶解在赋形剂中，如果需要，通过加入氯化钠使所述溶液等渗，并且在填装到适当的无菌小瓶或安瓿中进行密封之前通过无菌滤器过滤而灭菌。备选地，如果溶液稳定性是足够的，则在其密封容器中的溶液可以通过高压灭菌进行灭菌。有利的添加剂，如缓冲剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂或杀菌剂、混悬剂或乳化剂和/或局部麻醉剂可以溶解在赋形剂中。
可以通过使用消毒领域中的无菌技术将预先灭菌的成分填装到无菌容器中而制备干粉剂，其在使用前溶解或悬浮在适当的赋形剂中。备选地，所述成分可以使用消毒领域中的无菌技术溶解在适当的容器中。然后将该产品冷冻干燥，并将容器无菌密封。
以基本上相同的方式制备适于肌内、皮下或皮内注射的肠胃外混悬液，不同在于无菌成分是悬浮在无菌赋形剂中而不是溶解在其中，并且灭菌不能通过过滤实现。成分可以在无菌状态分离，或者备选地，其可以在分离后灭菌，例如，通过γ照射灭菌。
有利地，在组合物中包含混悬剂，例如聚乙烯吡咯烷酮，以促进成分的均匀分布。
定义部分
靶向部分(TM)意指任意这样的化学结构：其在功能上与结合位点相互作用，以引起本发明的多肽与靶细胞表面的物理缔合。该术语TM包括能够与靶细胞上的结合位点结合的任意分子(即，天然存在的分子，或其化学/物理修饰的变体)，所述结合位点能够内在化(例如，形成内体)----也称为受体介导的胞吞作用。TM可以具有内体膜易位功能，在该情形中，本发明的试剂中不需要存在分离的TM和易位结构域成分。在之前的描述中，已经描述了具体的TMs。提及所述TMs仅是示例性的，并且本发明包括其所有的变体和衍生物，其保留示例的TMs的基本结合(即靶向)能力。
如前文提及，优选的TMs包括抗体(例如抗体片段)和结合支架；特别是设计用于(例如，特异性)结合靶细胞目的的商购的抗体/片段和支架。
蛋白支架代表新一代通用结合框架，从而补充治疗性单克隆抗体和衍生物的扩展成员库，所述单克隆抗体衍生物如scFvs，Fab分子，dAbs(单链抗体)，骆驼科动物的(camelids)，双抗体和小抗体(minibodies)，每一种都可以用作本发明的TM。支架系统通过产生新型支架或修饰已知的蛋白结合结构域而产生或修饰已知的蛋白识别结构域。此类支架包括，但不限于：
(i)基于蛋白质A的支架-亲和体(Nord，K.等，1997“Bindingproteins selected from combinatorial libraries of an alpha-helical bacterialreceptor domain(选自α螺旋细菌受体结构域的组合文库的结合蛋白)”.Nat Biotechnol(自然生物技术)15，772-777)；
(ii)基于脂质运载蛋白的支架-anticalins(Skerra2008“Alternativebinding proteins：anticalins-harnessing the structural plasticity of thelipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities(备选的结合蛋白：anticalins-利用脂质运载蛋白配体口袋的结构可塑性改造新型结合活性)”.FEBS J.275：2677-83)；
(iii)基于纤连蛋白的支架-adnectin(Dineen等，2008“The AdnectinCT-322is a novel VEGF receptor2inhibitor that decreases tumor burden inan orthotopic mouse model of pancreatic cancer(Adnectin CT-322是一种新型的VEGF受体2抑制剂，其在胰腺癌直向小鼠模型中降低肿瘤负担)”.BMC Cancer8：352)；
(iv)avimers(Silverman等，2005“Multivalent avimer proteins evolvedby exon shuffling of a family of human receptor domains(通过人受体结构域家族的外显子移位进化的多聚体avimer蛋白)”.Nat Biotechnol(自然生物技术)23：1556-61)；
(v)基于锚蛋白的支架-darpins(Zahnd等，2006“Selection andcharacterization of Her2binding-designed ankyrin repeat proteins(Her2结合-设计的锚蛋白重复蛋白的选择和表征)”.J Biol Chem.281：35167-75)；和
(vi)centyrin支架-基于与Ig结构域具有显著的结构同源性的蛋白折叠，其具有与CDRs类似的环。Ig结构域是人蛋白中的共有模块，并且已经被广泛地用作备选的支架蛋白。上述每一个‘支架’公布通过引用(完全)引入本文。
结合支架可以用于通过与特定的细胞表面蛋白、受体或其他细胞表面表位如糖基相互作用而靶向特定的细胞类型。此类修饰的支架可以改造到本发明的基于重组无细胞毒性蛋白酶的多肽上。
本发明的TM结合(优选特异性结合)讨论的靶细胞。术语“特异性结合”优选意指给定的TM以106M-1以上、优选107M-1以上、更优选108M-1以上或最优选109M-1以上的结合亲和力(Ka)与靶细胞结合。
在本说明书中提及TM包括其片段和变体，其保留与讨论的靶细胞结合的能力。例如，变体可以与参比TM具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少97或至少99％的氨基酸序列同源性。因此，变体可以包含一个或多个氨基酸类似物(例如，非天然氨基酸)或置换的键。此外，例如，术语片段，当关于TM使用时，意指具有至少10个、优选至少20个、更优选至少30个、最优选至少40个参比TM的氨基酸残基的肽。术语片段还涉及上文提及的变体。因此，例如，本发明的片段可以包含具有至少10，20，30或40个氨基酸的肽序列，其中所述肽序列与相对应的参比肽(连续的)氨基酸肽序列具有至少80％的序列同源性。
验证TM与所选的靶细胞的结合是常规的。例如，可以使用简单的放射活性置换实验，其中在存在过量的未标记的TM的条件下，将代表讨论的靶细胞的组织或细胞暴露于标记的(例如，氚化的)TM。在这样的实验中，可以评估非特异性和特异性结合的相对比例，由此允许验证TM与靶细胞的结合。任选地，所述测定可以包括一种或多种结合拮抗剂，并且所述测定可以进一步包括观察TM结合的丧失。这种类型的实验的实例可见于Hulme，E.C.(1990)，Receptor-binding studies，a brief outline(受体结合研究，简明大纲)，pp.303-311，在Receptor biochemistry(受体生物化学)中，A Practical Approach，Ed.E.C.Hulme，Oxford University Press。
在本发明的情形中，提及肽TM包括其肽类似物，只要所述类似物与相对应的‘参比’TM结合相同的受体。所述类似物可以包含合成的残基，如：
β-Nal=β-萘基丙氨酸
β-Pal=β-吡啶基丙氨酸
hArg(Bu)=N-胍基-(丁基)-高精氨酸
hArg(Et)2=N，N′-胍基-(二甲基)-高精氨酸
hArg(CH2CF3)2=N，N’-胍基-二-(2，2，2，-三氟乙基)-高精氨酸
hArg(CH3，hexyl)=N，N’-胍基-(甲基，己基)-高精氨酸
Lys(Me)=Ne-甲基赖氨酸
Lys(iPr)=Ne-异丙基赖氨酸
AmPhe=氨基甲基苯丙氨酸
AChxAla=氨基环己基丙氨酸
Abu=α-氨基丁酸
Tpo=4-硫代脯氨酸(thiaproline)
MeLeu=N-甲基亮氨酸
Orn=鸟氨酸
Nle-正亮氨酸
Nva=正缬氨酸
Trp(Br)=5-溴-色氨酸
Trp(F)=5-氟-色氨酸
Trp(NO2)=5-硝基-色氨酸
Gaba=γ-氨基丁酸
Bmp=J-巯丙酰
Ac=乙酰
Pen-青霉胺
本发明的多肽可以缺乏梭菌神经毒素的功能性HC或HCC结构域。因此，在Shone等(1985)Eur.J.Biochem.(欧洲生物化学杂志)151，75-82所述的结合测定中，所述多肽不能结合大鼠突触膜(通过梭菌HC成分结合)。在一个实施方案中，所述多肽缺乏梭菌神经毒素全毒素的最后50个C端氨基酸。在另一个实施方案中，所述多肽缺乏梭菌神经毒素全毒素的最后100，150，200，250或300个C端氨基酸残基。备选地，HC结合活性可以通过诱变被消除/减少-例如，便利地提及BoNT/A，修饰神经节苷脂结合口袋中的一个或两个氨基酸残基突变(W1266突变为L和Y1267突变为F)使得HC区失去其受体结合功能。可以对非血清型A梭菌肽成分进行类似的突变，例如，基于具有突变(W1262突变为L和Y1263突变为F)的肉毒菌毒素B或肉毒菌毒素E(W1224突变为L和Y1225突变为F)的构建体。对活性位点的其他突变实现同样的HC受体结合活性消除，例如，在肉毒菌毒素A型毒素中和在其他梭菌神经毒素中相对应的高度保守的残基的Y1267S。这种和其他突变的详情记述在Rummel等(2004)(Molecular Microbiol.(分子微生物学)51：631-634)，其通过引用引入本文。
天然梭菌神经毒素的HC肽包含大约400-440个氨基酸残基，并且由两个每个约25kDa的功能独特的结构域组成，即，N端区域(通常称为HCN肽或结构域)和C端区域(通常称为HCC肽或结构域)。此外，已经充分证明组成C端160-200个氨基酸残基的C端区域(HCC)负责梭菌神经毒素与其天然细胞受体(即，神经肌肉接头的神经末梢)的结合。因此，在本说明书中提及缺乏功能性重链HC肽(或结构域)以使该重链不能结合天然梭菌神经毒素结合的细胞表面受体的梭菌重链，意指该梭菌重链仅是缺乏功能性HCC肽。换言之，HCC肽区域部分或完全缺失，或者另外被修饰(例如，通过常规的化学或蛋白水解处理)以使其在神经肌肉接头处对神经末梢的天然结合能力失活。
因此，在一个实施方案中，本发明的梭菌HN肽缺乏梭菌神经毒素的C端肽部分(HCC)的一部分，并且因此缺乏天然梭菌神经毒素的HC结合功能。例如，在一个实施方案中，C-端延伸的梭菌HN肽缺乏梭菌神经毒素重链的C端40个氨基酸残基，或C端60个氨基酸残基，或C端80个氨基酸残基，或C端100个氨基酸残基，或C端120个氨基酸残基，或C端140个氨基酸残基，或C端150个氨基酸残基，或C端160个氨基酸残基。在另一个实施方案中，本发明的梭菌HN肽缺乏梭菌神经毒素的完整的C端肽部分(HCC)，因此缺乏天然梭菌神经毒素的HC结合功能。例如，在一个实施方案中，梭菌HN肽缺乏梭菌神经毒素重链的C端165个氨基酸残基，或C端170个氨基酸残基，或C端175个氨基酸残基，或C端180个氨基酸残基，或C端185个氨基酸残基，或C端190个氨基酸残基，或C端195个氨基酸残基。进一步举例来看，本发明的梭菌HN肽缺乏选自由下列各项组成的组的梭菌HCC参比序列：
A型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(Y1111-L1296)
B型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(Y1098-E1291)
C型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(Y1112-E1291)
D型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(Y1099-E1276)
E型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(Y1086-K1252)
F型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(Y1106-E1274)
G型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(Y1106-E1297)
破伤风神经毒素       -氨基酸残基(Y1128-D1315)。
由于依据血清亚型可以发生微小的变异，所以上述鉴定的参比序列应该被视为指导。
本发明的蛋白酶包括能够切割真核细胞中胞吐融合器的一种或多种蛋白的所有无细胞毒性蛋白酶。本发明的蛋白酶优选是细菌蛋白酶(或其片段)。根优选，所述细菌蛋白酶选自梭菌属(Clostridium)或奈瑟球菌属(Neisseria)/链球菌属(Streptococcus)(例如，梭菌L链，或奈瑟球菌属IgA蛋白酶，优选来自淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeae)或肺炎链球菌(S.pneumoniae))。
本发明还包括变异的无细胞毒性蛋白酶(即，天然存在的蛋白酶分子的变体)，只要所述变异的蛋白酶仍然表现出必要的蛋白酶活性即可。例如，变体可以与参比蛋白酶序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、最优选至少95或至少98％的氨基酸序列同源性。因此，术语变体包括具有提高的(或降低的)内肽酶活性的无细胞毒性蛋白酶-此处特别提及的是BoNT/A突变体Q161A，E54A和K165L的增加的Kcat/Km，参见Ahmed，S.A.(2008)Protein J.(蛋白质杂志)DOI10.1007/s10930-007-9118-8，其通过引用引入本文。术语片段，当与蛋白酶联系使用时，典型地意指具有参比蛋白酶的至少150个、优选至少200个、更优选至少250个、最优选至少300个氨基酸残基的肽。如TM‘片段’成分(上文所讨论)，本发明的蛋白酶‘片段’包括基于参比序列的变异的蛋白酶的片段。
本发明的蛋白酶优选表现出丝氨酸或金属蛋白酶活性(例如，内肽酶活性)。所述蛋白酶优选是对SNARE蛋白(例如SNAP-25、小突触泡蛋白/VAMP或突触融合蛋白)特异性的。
特别提及神经毒素的蛋白酶结构域，例如，细菌神经毒素的蛋白酶结构域。因此，本发明包括神经毒素结构域的应用，所述神经结构域是天然存在的以及所述天然存在的神经毒素的重组制备版本。示例性的神经毒素由梭菌产生，并且术语梭菌神经毒素包括由破伤风梭菌(C.tetani)(TeNT)和由肉毒梭菌(C.botulinum)(BoNT)血清型A-G产生的神经毒素，以及由巴氏梭菌(C.baratii)和酪酸梭菌(C.butyricum)产生的紧密相关的BoNT-样神经毒素。上文提及的缩写在整个说明书中使用。例如，命名BoNT/A表示作为BoNT(血清型A)的神经毒素来源。
BoNTs享有共有结构，其为～150kDa的二链蛋白，该二链蛋白由通过单个二硫键与～50kDa的轻链(L-链)共价连接的～100kDa的重链(H-链)组成。H-链由两个结构域(每个～50kDa)组成。C端结构域(HC)是高亲和神经元结合所需要的，而提议N端结构域(HN)参与膜易位。L-链是负责切割底物SNARE蛋白的锌依赖性金属蛋白酶。
术语L-链片段意指神经毒素的L-链成分，该片段表现出金属蛋白酶活性，并且能够蛋白水解切割参与细胞胞吐作用的囊泡和/或质膜相关的蛋白。
适当的蛋白酶(参比)序列的实例包括：
A型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(1-448)
B型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(1-440)
C型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(1-441)
D型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(1-445)
E型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(1-422)
F型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(1-439)
G型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(1-441)
破伤风神经毒素       -氨基酸残基(1-457)
IgA蛋白酶            -氨基酸残基(1-959)*
*Pohlner，J.等(1987).Nature(自然)325，pp.458-462，其通过引用引入本文。
由于依据血清亚型可以发生微小的变异，所以上述鉴定的参比序列应该被视为指导。例如，US2007/0166332(通过引用引入本文)引用了略微不同的梭菌序列：
A型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(M1-K448)
B型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(M1-K441)
C型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(M1-K449)
D型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(M1-R445)
E型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(M1-R422)
F型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(M1-K439)
G型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(M1-K446)
破伤风神经毒素       -氨基酸残基(M1-A457)
多种包含轻链的梭菌毒素片段可以用在本发明的各个方面中，条件是这些轻链片段可以特异性靶向神经递质释放器的核心成分，并且因此参与行使整个细胞机制，由此梭菌毒素蛋白水解切割底物。梭菌毒素的轻链长度约为420-460个氨基酸，并且包含酶结构域。已有研究表明，完整长度的梭菌毒素轻链不是酶结构域的酶活性必需的。作为非限制性的实例，BoNT/A轻链的前八个氨基酸不是酶活性必需的。作为另一个非限制的实例，TeNT轻链的前八个氨基酸不是酶活性必需的。同样地，轻链的羧基端不是活性必需的。作为非限制性的实例，BoNT/A轻链的最后32个氨基酸(残基417-448)不是酶活性必需的。作为另一个非限制的实例，TeNT轻链的最后31个氨基酸(残基427-457)不是酶活性必需的。因此，本实施方案的各个方面可以包括这样的梭菌毒素轻链：其包含长度为例如至少350个氨基酸、至少375个氨基酸、至少400个氨基酸、至少425个氨基酸和至少450个氨基酸的酶结构域。本实施方案的其他各方面可以包括这样的梭菌毒素轻链：其包含长度为例如至多350个氨基酸、至多375个氨基酸、至多400个氨基酸、至多425个氨基酸和至多450个氨基酸的酶结构域。
在一个实施方案中，所述无细胞毒性蛋白酶切割非神经元SNARE蛋白，诸如SNAP-23蛋白。在一个实施方案中，所述无细胞毒性蛋白酶是能够切割SNAP-23的修饰的肉毒菌毒素L链。这样的修饰的L-链的实例由Chen和Barbieri，PNAS，vol.106，no.23，p9180-9184，2009描述。
在一个实施方案中，所述无细胞毒性蛋白酶是BoNT/A，BoNT/C或BoNT/E蛋白酶，并且优选的SNARE基序是SNAP(例如SNAP25)基序。在另一个实施方案中，所述无细胞毒性蛋白酶是BoNT/B，BoNT/D，BoNT/F或BoNT/G或破伤风神经毒素(TeNT)蛋白酶，并且优选的SNARE基序是VAMP基序。在另一个实施方案中，所述无细胞毒性蛋白酶是BoNT/C1蛋白酶，并且优选的SNARE基序是突触融合蛋白基序。
本发明的多肽，特别是其蛋白酶成分，可以被PEG化-这可以帮助提高稳定性，例如，蛋白酶成分作用的持久性。当蛋白酶包含BoNT/A，B或C1蛋白酶时，PEG化是特别优选的。PEG化优选包括向蛋白酶成分的N端添加PEG。例如，蛋白酶的N端可以延伸一个或多个氨基酸(例如半胱氨酸)残基，其可以是相同的或不同的。所述氨基酸残基中的一个或多个可以在其上连接(例如共价连接)其自己的PEG分子。这种技术的实例记述在WO2007/104567中，其通过引用完全引入本文。
易位结构域是允许蛋白酶易位进入靶细胞从而使得在所述靶细胞的细胞质中发生蛋白酶活性的功能表达的分子。任何分子(例如蛋白或肽)是否具有本发明必要的易位功能可以通过多种常规测定中的任一种进行验证。
例如，Shone C.(1987)描述了使用脂质体的体外测定，所述脂质体用测试分子进行攻击。必要的易位功能的存在通过从所述脂质体释放K+和/或标记的NAD进行验证，可以容易地检测K+和/或标记的NAD的释放[参见Shone C.(1987)Eur.J.Biochem(欧洲生物化学杂志)；vol.167(1)：pp.175-180]。Blaustein R.(1987)提供了另一个实例，其描述了一种使用平面磷脂双层膜的简单体外测定。该膜用测试分析攻击，并且必要的易位功能通过穿过该膜的电导的增加进行验证[参见Blaustein(1987)FEBS Letts；vol.226，no.1：pp.115-120]。允许评估膜融合并且因此鉴定适用于本发明的易位结构域的另外的方法由Methods in Enzymology(酶学方法)Vol220和221，Membrane Fusion Techniques(膜融合技术)，Parts A和B，AcademicPress1993提供。
本发明还包括变异的易位结构域，只要所述变异的结构域仍然表现出必要的易位活性即可。例如，变体可以与参比易位结构域具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％或至少98％的氨基酸序列同源性。术语片段，当联系易位结构域使用时，意指具有参比易位结构域的至少20个、优选至少40个、更优选至少80个、最优选至少100个氨基酸残基的肽。在梭菌易位结构域的情形中，该片段优选具有参比易位结构域的至少100个、优选至少150个、更优选至少200个、最优选至少250个氨基酸残基(例如，HN结构域)。如TM‘片段’成分(上文所讨论)，本发明的易位‘片段’包括基于参比序列的变异的易位结构域的片段。
充分文件证明了细菌毒素分子的某些结构域能够形成这样的孔。还已知病毒表达的膜融合蛋白的某些易位结构域能够形成这样的孔。此类结构域可以用在本发明中。
易位结构域可以是梭菌来源的，诸如HN结构域(或其功能成分)。HN意指大约等价于H-链的氨基端的一半的梭菌神经毒素的H-链的一部分或片段，或与完整H-链中的所述片段相对应的结构域。在这一点上，如果需要去除HC细胞-结合功能，这可以通过删除HC或HCC氨基酸序列(在DNA合成水平，或在合成后水平，通过核酸酶或的蛋白酶处理进行)而进行。备选地，HC功能可以通过化学或生物处理而失活。
适当的(参比)易位结构域的实例包括：
A型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(449-871)
B型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(441-858)
C型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(442-866)
D型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(446-862)
E型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(423-845)
F型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(440-864)
G型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(442-863)
破伤风神经毒素       -氨基酸残基(458-879)
由于依据血清亚型可以发生微小的变异，所以上述鉴定的参比序列应该被视为指导。例如，US2007/0166332(通过引用引入本文)引用了略微不同的梭菌序列：
A型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(A449-K871)
B型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(A442-S858)
C型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(T450-N866)
D型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(D446-N862)
E型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(K423-K845)
F型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(A440-K864)
G型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(S447-S863)
破伤风神经毒素       -氨基酸残基(S458-V879)
在本发明的情形中，多种包含易位结构域的梭菌毒素HN区域可以用在本发明的各个方面中，条件是这些活性片段可以促进无细胞毒性蛋白酶(例如，梭菌L-链)从细胞内囊泡释放到靶细胞的细胞质中，并且因此参与行使完整的细胞机制，由此梭菌毒素蛋白水解切割底物。来自梭菌毒素的重链的HN区域长度约为410-430个氨基酸，并且包含易位结构域。已有研究表明来自梭菌毒素重链的完整长度的HN区域不是易位结构域的易位活性所必需的。因此，该实施方案的各个方面可以包括这样的梭菌毒素HN区域：其包含长度为例如至少350个氨基酸、至少375个氨基酸、至少400个氨基酸和至少425个氨基酸的易位结构域。本实施方案的其他各方面可以包括这样的梭菌毒素HN区域：其包含长度为例如至多350个氨基酸、至多375个氨基酸、至多400个氨基酸和至多425个氨基酸的易位结构域。
关于在肉毒梭菌和破伤风梭菌中的毒素生产的遗传基础的进一步的详情，我们提及Henderson等(1997)在The Clostridia：Molecular Biologyand Pathogenesis(梭菌：分子生物学和致病机制)，Academic press中。术语HN包括天然存在的神经毒素HN部分，和具有不天然存在的和/或合成的氨基酸残基的氨基酸序列的修饰的HN部分，只要所述修饰的HN部分仍然表现出上文提及的易位功能即可。
备选地，易位结构域可以是非梭菌来源的。非梭菌(参比)易位结构域来源的实例包括，但不限于，白喉毒素的易位结构域[O’Keefe等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)(1992)89，6202-6206；Silverman等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)(1993)269，22524-22532；和London，E.(1992)Biochem.Biophys.Acta.，1112，pp.25-51]，假单胞菌属(Pseudomonas)A型外毒素的易位结构域[Prior等，Biochemistry(生物化学)(1992)31，3555-3559]，炭疽毒素的易位结构域[Blanke等Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)(1996)93，8437-8442]，多种易位功能的融合的或疏水的肽[Plank等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)(1994)269，12918-12924；和Wagner等，(1992)PNAS，89，pp.7934-7938]，和两亲性肽[Murata等，(1992)Biochem.(生物化学)，31，pp.1986-1992]。所述易位结构域可以反映天然存在的蛋白中存在的易位结构域，或者可以包括氨基酸变异，只要所述变异不破坏所述易位结构域的易位能力即可。
适用于本发明的病毒(参比)易位结构域的特定的实例包括病毒表达的膜融合蛋白的某些易位结构域。例如，Wagner等(1992)和Murata等(1992)记述了多种来源于流感病毒凝血素N端区域的融合和两亲性肽的易位(即，膜融合和囊泡化)功能。其他已知具有易位活性的病毒表达的膜融合蛋白是西门利克森林病毒(Semliki Forest Virus，SFV)的融合肽的易位结构域，水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)糖蛋白G的易位结构域，SER病毒F蛋白的易位结构域和泡沫病毒(Foamy virus)包膜糖蛋白的易位结构域。病毒编码的Aspike蛋白在本发明的情形中具有特别的应用，例如，SFV的E1蛋白和VSV的G蛋白的G蛋白。
(参比)易位结构域的应用包括其序列变体的应用。变体可以包含一个或多个保守核酸置换和/或核酸缺失或插入，条件是所述变体具有必要的易位功能。变体还可以包含一个或多个氨基酸置换和/或氨基酸缺失或插入，只要所述变体具有必要的易位功能即可。
本发明的多肽可以进一步包含易位促进结构域。所述结构域促进无细胞毒性蛋白酶递送到靶细胞的细胞质中，并且例如，在WO08/008803和WO08/008805中描述，每份申请通过引用引入本文。
例如，适当的易位促进结构域包括包膜的病毒融合肽结构域，例如，适当的融合肽结构域包括流感病毒融合肽结构域(例如，23个氨基酸的A型流感病毒融合肽结构域)，甲病毒属(alphavirus)融合肽结构域(例如，26个氨基酸的西门利克森林病毒融合肽结构域)，水疱病毒属(vesiculovirus)融合肽结构域(例如，21个氨基酸的水疱性口炎病毒融合肽结构域)，呼吸系病毒(respirovirus)融合肽结构域(例如，25个氨基酸的仙台病毒(Sendai virus)融合肽结构域)，morbiliivirus融合肽结构域(例如，25个氨基酸的犬瘟热病毒(Canine distemper virus)融合肽结构域)，新城疫病毒属(avulavirus)融合肽结构域(例如，25个氨基酸的新城疫病毒(Newcastle disease virus)融合肽结构域)，亨尼帕病毒属(henipavirus)融合肽结构域(例如，25个氨基酸的Hendra病毒融合肽结构域)，变性肺病毒(metapneumovirus)融合肽结构域(例如，25个氨基酸的人变性肺病毒融合肽结构域)或泡沫病毒属(spumavirus)融合肽结构域如猴泡沫病毒(simian foamy virus)融合肽结构域；或其片段或变体。
进一步举例来说，易位促进结构域可以包含梭菌毒素HCN结构域或其片段或变体。更详细来说，梭菌毒素HCN易位促进结构域可以具有至少200个氨基酸、至少225个氨基酸、至少250个氨基酸、至少275个氨基酸的长度。在这一点上，梭菌毒素HCN易位促进结构域优选具有至多200个氨基酸、至多225个氨基酸、至多250个氨基酸或至多275个氨基酸的长度。具体的(参比)实例包括：
A型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(872-1110)
B型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(859-1097)
C型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(867-1111)
D型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(863-1098)
E型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(846-1085)
F型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(865-1105)
G型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(864-1105)
破伤风神经毒素       -氨基酸残基(880-1127)
依据血清型/亚型，上述序列可以略微变化。并且适当的(参比)梭菌毒素HCN结构域的其他实例包括：
A型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(874-1110)
B型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(861-1097)
C型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(869-1111)
D型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(865-1098)
E型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(848-1085)
F型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(867-1105)
G型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(866-1105)
破伤风神经毒素       -氨基酸残基(882-1127)
任意上述促进结构域可以与任意前述的适用于本发明的易位结构域组合。因此，例如，非梭菌促进结构域可以与非梭菌易位结构域肽组合或与梭菌易位结构域肽组合。备选地，梭菌毒素HCN易位促进结构域可以与非梭菌易位结构域肽组合。备选地，梭菌毒素HCN促进结构域可以与梭菌易位结构域肽组合，其实例包括：
A型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(449-1110)
B型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(442-1097)
C型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(450-1111)
D型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(446-1098)
E型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(423-1085)
F型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(440-1105)
G型肉毒菌毒素神经毒素-氨基酸残基(447-1105)
破伤风神经毒素       -氨基酸残基(458-1127)
序列同源性
多种序列比对方法中的任一种可以用来确定同一性百分数，包括，但不限于，整体方法、局部方法和杂化方法，诸如例如，区段方法。确定同一性百分数的流程是在本领域技术人员能力范围内的常规步骤。整体方法从分子的开头到末尾对序列进行比对，并且通过加合各个残基对的得分和通过减去(imposing)缺口罚分确定最佳比对。非限制性方法包括，例如，CLUSTAL W，参见，例如，Julie D.Thompson等，CLUSTAL W：Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence AlignmentThrough Sequence Weighting(通过序列权重提高进展性多序列比对的灵敏性)，Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice(位置-特异性缺口罚分和权重矩阵选择)，22(22)Nucleic Acids Research(核酸研究)4673-4680(1994)；和迭代细化，参见例如，Osamu Gotoh，SignificantImprovement in Accuracy of Multiple Protein(多蛋白准确性的显著提高).Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference toStructural Alignments(通过参考结构比对进行评估的通过迭代细化的序列比对)，264(4)J.Mol.Biol.823-838(1996)。局部方法通过鉴定所有输入的序列共有的一个或多个保守基序来比对序列。非限制性的方法包括，例如，Local methods align sequences by identifying one or more conserved motifsshared bv all of the input sequences.Non-limiting methods include，例如，Match-box，参见，例如Eric Depiereux和Ernest Feytmans，Match-Box：AFundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of SeveralProtein Sequences(Match-Box：用于多种蛋白序列的同时比对的基础新算法)，8(5)CABIOS501-509(1992)；Gibbs取样，参见例如，C.E.Lawrence等，Detecting Subtle Sequence Signals：A Gibbs Sampling Strategy forMultiple Alignment(检测微小的序列信号：用于多重比对的Gibbs取样策略)，262(5131)Science(科学)208-214(1993)；Align-M，参见例如，IvoVan WaIIe等，Align-M-A New Algorithm for Multiple Alignment of HighlyDivergent Sequences(比对-M-A：用于高度发散的序列的新算法)，20(9)Bioinformatics(生物信息学)：1428-1435(2004)。因此，序列同一性百分数通过常规方法确定。参见，例如，Altschul等，Bull.Math.Bio.48：603-16，1986和Henikoff与Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学 院学报)89：10915-19，1992。简言之，使用缺口开放罚分10、缺口延伸罚分1和Henikoff和Henikoff的“blosum62”评分矩阵来比对两种氨基酸序列，从而最优化比对得分。
基本上同源的多肽特征在于具有一个或多个氨基酸置换、缺失或添加。这些变化优选是次要性质，即，保守氨基酸置换(见下文)和不显著影响多肽的折叠或活性的其他置换；小的缺失，典型地1至约30个氨基端的缺失；和小的氨基端或羧基端延伸，诸如氨基端甲硫氨酸残基，至多约20-25个残基的小接头肽，或亲和标签。
保守氨基酸置换
碱性的：精氨酸；赖氨酸；组氨酸
酸性的：谷氨酸；天冬氨酸；
极性的：谷氨酰胺；天冬酰胺
疏水性的：亮氨酸；异亮氨酸；缬氨酸
芳香的：苯丙氨酸；色氨酸；酪氨酸
小的：甘氨酸；丙氨酸；丝氨酸；苏氨酸；甲硫氨酸
除了20种标准氨基酸，非标准氨基酸(如4-羟基脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以置换本发明的多肽的氨基酸残基。少量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以置换梭菌多肽氨基酸残基。本发明的多肽还可以包含非天然存在的氨基酸残基。
非天然存在的氨基酸包括，但不限于，反式-3-甲基脯氨酸，2，4-亚甲基-脯氨酸，顺-4-羟基脯氨酸，反式-4-羟基-脯氨酸，N-甲基甘氨酸，别-苏氨酸，甲基-苏氨酸，羟基-乙基半胱氨酸，羟基乙基高-半胱氨酸，硝基-谷氨酰胺，高谷氨酰胺，哌可酸，叔-亮氨酸，正缬氨酸，2-氮杂苯丙氨酸，3-氮杂苯基-丙氨酸，4-氮杂苯基-丙氨酸，和4-氟苯基丙氨酸。一些用于在蛋白中结合非天然存在的氨基酸残基的方法在本领域中是已知的。例如，可以使用体外系统，其中使用化学氨酰化的抑制剂tRNAs抑制无义突变。用于合成氨基酸并且氨酰化tRNA的方法在本领域中是已知的。含有无义突变的质粒的转录和翻译在包含大肠杆菌S30提取物和商购的酶和其他试剂的无细胞系统中进行。通过层析纯化蛋白。例如，参见，Robertson等，J.Am.Chem.Soc.(美国化学学会学报)113：2722，1991；Ellman等，Methods Enzymol.(酶学方法)202：301，1991；Chung等，Science (科学)259：806-9，1993；和Chung等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美 国国家科学院学报)90：10145-9，1993)。在第二种方法中，通过显微注射突变的mRNA和化学氨酰化的抑制剂tRNAs在爪蟾属(Xenopus)卵母细胞中进行翻译(Turcatti等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)271：19991-8，1996)。在第三种方法中，在不存在要被置换的天然氨基酸(例如，苯丙氨酸)和存在所需要的非天然存在的氨基酸(例如，2-氮杂苯丙氨酸，3-氮杂苯丙氨酸，4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的条件下培养大肠杆菌细胞。非天然存在的氨基酸在其天然副本所在的位置结合到多肽中。参见，Koide等，Biochem.33：7470-6，1994。天然存在的氨基酸残基可以通过体外化学修饰被转化为非天然存在的种类。化学修饰可以与位点定向诱变组合以进一步扩展置换的范围(Wynn和Richards，Protein Sci.(蛋白质科学)2：395-403，1993)。
少量非保守氨基酸、不通过遗传密码编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸和非天然氨基酸可以置换本发明的多肽的氨基酸残基。
本发明的多肽中的必需氨基酸可以按照本领域已知的方法鉴定，诸如位点定向诱变或丙氨酸-扫描诱变(Cunningham和Wells，Science(科学) 244：1081-5，1989)。生物相互作用的位点还可以通过物理结构分析确定，如通过诸如核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和标记的技术，结合推定的结合位点氨基酸的突变来确定。例如，参见de Vos等，Science(科学) 255：306-12，1992；Smith等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)224：899-904，1992；Wlodaver等，FEBS Lett.309：59-64，1992。必需氨基酸的性质还可以通过本发明多肽的相关成分(例如，易位或蛋白酶成分)的同源性分析推导出来。
可以使用已知的诱变和筛选方法，诸如Reidhaar-Olson和Sauer(Science(科学)241：53-7，1988)或Bowie和Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci. USA(美国国家科学院学报)86：2152-6，1989)所公开的那些，进行和检测多个氨基酸置换。简言之，这些作者公开了同时随机化多肽中的两个以上的位置，选择功能性多肽，然后测序诱变的多肽，从而确定在每个位置允许的置换的范围。可以使用的其他方法包括噬菌体展示(例如，Lowman等，Biochem.30：10832-7，1991；Ladner等，美国专利号5,223,409；Huse，WIPO公布WO92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等，Gene(基 因)46：145，1986；Ner等，DNA7：127，1988)。
可以使用已知的诱变和筛选方法，诸如Reidhaar-Olson和Sauer(Science(科学)241：53-7，1988)或Bowie和Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci. USA(美国国家科学院学报)86：2152-6，1989)所公开的那些，进行和检测多个氨基酸置换。简言之，这些作者公开了同时随机化多肽中的两个以上的位置，选择功能性多肽，然后测序诱变的多肽，从而确定在每个位置允许的置换的范围。可以使用的其他方法包括噬菌体展示(例如，Lowman等，Biochem.30：10832-7，1991；Ladner等，美国专利号5,223,409；Huse，WIPO公布WO92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等，Gene(基 因)46：145，1986；Ner等，DNA7：127，1988)。
实施例概述
实施例1  产生在HN结构域的C端加入GnRH多肽的LHD蛋白
实施例2  产生在HN结构域的C端加入GnRH多肽的LHA蛋白
实施例3  产生在HN结构域的C端加入GnRH多肽的LHD蛋白，其中加入了两个不同的蛋白酶识别位点
实施例4  制备在HN结构域的C端加入GnRH多肽的LHD蛋白的方法
实施例5  通过蛋白质印迹证实共价连接的配体的存在
实施例6  通过质谱证实共价连接的TM的存在
实施例7  评估加入GnRH多肽的LHD蛋白的结合能力
实施例8  评估加入GnRH多肽的LHD蛋白的体外功能性
实施例9  产生在HN结构域的C端加入强啡肽和缓激肽多肽的LHD蛋白
实施例10  产生在HN结构域的C端加入β-内啡肽和缓激肽多肽的LHA蛋白
实施例11  产生在HN结构域的C端加入两个GHRH多肽的LHD蛋白
实施例12  产生在HN结构域的C端加入GnRH多肽(与第二蛋白酶激活位点间隔5个氨基酸)的LHD蛋白
实施例13  产生在HN结构域的C端加入胃泌素释放肽的LHA蛋白
实施例14  治疗患有前列腺癌的患者的方法
实施例15  治疗患有神经原性炎症的患者的方法
实施例16  治疗患有子宫内膜异位症(endometriosis)的患者的方法
附图简述
图1示例实施例4的激活样品(洗脱在80mM+250mM咪唑级分中)在还原和非还原条件下的SDS-PAGE分析。
SEQ ID NOs概述
下述所有的SEQ ID Nos可不包括任何起始的甲硫氨酸氨基酸残基(或相对应的N端核酸密码子/序列)
SEQ ID1  LHD-GnRH的DNA序列
SEQ ID2  LHD-GnRH的蛋白序列
SEQ ID3  LHA-GnRH的DNA序列
SEQ ID4  LHA-GnRH的蛋白序列
SEQ ID5  具有两个不同的蛋白酶位点的LHD-GnRH的DNA序列
SEQ ID6  具有两个不同的蛋白酶位点的LHD-GnRH的蛋白序列
SEQ ID7  在HN结构域的C端加入强啡肽和缓激肽多肽的LHD的DNA序列
SEQ ID8  在HN结构域的C端加入强啡肽和缓激肽多肽的LHD的蛋白序列
SEQ ID9  在HN结构域C端加入β-内啡肽和缓激肽多肽的LHA的DNA序列
SEQ ID10  在HN结构域C端加入β-内啡肽和缓激肽多肽的LHA的蛋白序列
SEQ ID11  在HN结构域的C端加入两个GHRH多肽的LHD的DNA序列
SEQ ID12  在HN结构域的C端加入两个GHRH多肽的LHD的蛋白序列
SEQ ID13  在HN结构域的C端加入GnRH的LHD的DNA序列
SEQ ID14  在HN结构域的C端加入GnRH的LHD的蛋白序列
SEQ ID15  在HN结构域的C端加入胃泌素释放肽的LHA的DNA序列
SEQ ID16  在HN结构域的C端加入胃泌素释放肽的LHA的蛋白序列
现在是通过实施例示例本发明的具体实施方案的描述。
实施例l产生在HN结构域的C端加入GnRH多肽的LHD蛋白
检查通过遗传融合BoNT/D的LHN片段与10个氨基酸的肽GnRH构建的嵌合蛋白的一级序列是否存在携带与关于因子Xa的典型识别位点(IEGR)的相似性的氨基酸链。由于不存在这样的链，选择利用FXa作为在LC-HN接合处激活该融合蛋白并且还切割HN与TM(GnRH)之间的肽键的蛋白酶。
关于大肠杆菌表达最优化的DNA从Entelechon(德国)商购获得，其编码具有下述从N-到C端的结构的融合蛋白：
·10个His N-端纯化标签，
·10个天冬酰胺氨基酸间隔区，
·BoNT/D的LC，
·结构域间接头，其一级序列与BoNT/A中存在的一级序列相似，修饰该接头以加入作为FXa的底物的四肽IEGR，
·BoNT/D的HN，对其进行修饰以加入C-端Cys，
·Gly-Gly-Gly-Gly-Ser间隔区，其在C端加入IEGR肽序列
·10个氨基酸的GnRH肽，对其进行修饰以在位置6加入Cys残基替代天然的Gly(QHWSYCLRPG)。
参考软件程序如Graphical Codon Usage Analyser(Geneart)评估大肠杆菌密码子应用，并且参考公布的密码子应用表(例如，GenBank Release143，2004年9月13日)评估％GC含量和密码子利用率，从而确保构建没有导致差的密码子应用。将该DNA结合到标准的克隆载体中，例如pCR4中，然后转化到大肠杆菌宿主中。通过测序检验ORF DNA的完整性。最终的ORF如SEQ ID1所示，并且表达产物的氨基酸序列显示在SEQ ID2中。
实施例2产生在HN结构域的C端加入GnRH多肽的LHA蛋白
检查通过遗传融合BoNT/A的LHN片段与10个氨基酸的肽GnRH构建的嵌合蛋白的一级序列是否存在携带与关于因子Xa的典型识别位点(IEGR)的相似性的氨基酸链。由于不存在这样的链，选择利用FXa作为在LC-HN接合处激活该融合蛋白并且还切割HN与TM(GnRH)之间的肽键的蛋白酶。
关于大肠杆菌表达最优化的DNA从Entelechon(德国)商购获得，其编码具有下述从N-到C端的结构的融合蛋白：
·10个His N-端纯化标签，
·10个天冬酰胺氨基酸间隔区，
·BoNT/A的LC，
·结构域间接头，其一级序列与BoNT/A中存在的一级序列相似，修饰该接头以加入作为FXa的底物的四肽IEGR，
·BoNT/A的HN，对其进行修饰以加入C-端Cys，
·Gly-Gly-Gly-Gly-Ser间隔区，其在C端加入IEGR肽序列
·10个氨基酸的GnRH肽，对其进行修饰以在位置6加入Cys残基替代天然的Gly。
参考软件程序如Graphical Codon Usage Analyser(Geneart)评估大肠杆菌密码子应用，并且参考公布的密码子应用表(例如，GenBank Release143，2004年9月13日)评估％GC含量和密码子利用率，从而确保构建没有导致差的密码子应用。将该DNA结合到标准的克隆载体中，例如pCR4中，然后转化到大肠杆菌宿主中。通过测序检验ORF DNA的完整性。最终的ORF如SEQ ID3所示，并且表达产物的氨基酸序列显示在SEQ ID4中。
实施例3产生在HN结构域的C端加入GnRH多肽的LHD蛋白，其中加入了两个不同的蛋白酶识别位点
检查通过遗传融合BoNT/D的LHN片段与10个氨基酸的肽GnRH构建的嵌合蛋白的一级序列是否存在携带与关于因子Xa的典型识别位点(IEGR)和肠激酶的典型识别位点(DDDDK)的相似性的氨基酸链。由于不存在这样的链，选择利用FXa作为在LC-HN接合处激活该融合蛋白的蛋白酶并且选择肠激酶切割HN与TM(GnRH)之间的肽键。
关于大肠杆菌表达最优化的DNA从Entelechon(德国)商购获得，其编码具有下述从N-到C端的结构的融合蛋白：
·10个His N-端纯化标签，
·10个天冬酰胺氨基酸间隔区，
·BoNT/D的LC，
·结构域间接头，其一级序列与BoNT/A中存在的一级序列相似，修
饰该接头以加入作为FXa的底物的四肽IEGR，
·BoNT/D的HN，对其进行修饰以加入C-端Cys，
·Gly-Gly-Gly-Gly-Ser间隔区，其在C端加入DDDDK肽序列
·10个氨基酸的GnRH肽，对其进行修饰以在位置6加入Cys残基替代天然的Gly。
参考软件程序如Graphical Codon Usage Analyser(Geneart)评估大肠杆菌密码子应用，并且参考公布的密码子应用表(例如，GenBank Release143，2004年9月13日)评估％GC含量和密码子利用率，从而确保构建没有导致差的密码子应用。将该DNA结合到标准的克隆载体中，例如pCR4中，然后转化到大肠杆菌宿主中。通过测序检验ORF DNA的完整性。最终的ORF如SEQ ID5所示，并且表达产物的氨基酸序列显示在SEQ ID6中。
实施例4制备在HN结构域的C端加入GnRH多肽的LHD蛋白的方法
将实施例1中产生的ORF克隆到大肠杆菌表达载体(pET(Novagen)载体，其已被修饰以确保动员缺陷(mobilisation deficiency))，并且转化到大肠杆菌宿主菌株(最通常是BL21)中。
使用下述流程实现LHD-GnRH融合蛋白的表达。用来自LHD-GnRH表达菌株的单克隆接种250ml烧瓶中的100ml改良的TB(含有0.2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素)。培养物在37℃，225rpm生长16小时。用10ml过夜培养物接种2x2L烧瓶中的2x1L改良的TB(含有0.2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素)。培养物在37℃生长直至达到约0.5的OD600nm，在该点降低温度至16℃。1小时后，用1mM IPTG诱导该培养物并且在16℃再生长16小时。离心培养物产生35.2g细胞糊状物。
通过亲和层析实现LHD-GnRH融合体的纯化。详细来说，将含有25ml50mM HEPES pH7.2200mM NaCl和大约10g大肠杆菌BL21细胞糊状物的falcon管解冻。在冰上超声处理该细胞糊状物，以22microns的动力30秒超声，30秒间歇，共10个循环，确保样品保持冷却。以18000rpm，4℃离心裂解的细胞30分钟。将上清液上样到用50mM HEPES pH7.2200mM NaCl平衡的HisTrap HP螯合柱(5ml柱足够)上。加入40mM咪唑洗掉非特异性结合的蛋白后，用80m咪唑、250mM咪唑和500mM咪唑的梯度步骤洗脱融合蛋白。将洗脱的融合蛋白针对5L50mM HEPESpH7.2200mM NaCl在4℃透析过夜，并且测量透析的融合蛋白的OD。加入10U因子Xa/mg融合蛋白，并且在25℃静置温育过夜。上样到用50mM HEPES pH7.2200mM NaCl平衡的HisTrap HP螯合柱(5ml柱足够)上。用50mM HEPES pH7.2200mM NaCl洗涤柱至基线。使用10和40mM咪唑的梯度步骤，洗掉非特异性结合的蛋白，并且用100mM咪唑洗脱融合蛋白。将洗脱的融合蛋白针对5L25mM Tris，200mM NaCl，pH8.0在4℃透析过夜，并且将该融合体浓缩至约2mg/ml，整分样品并且冷冻在-20℃。使用OD、BCA和纯度分析检测纯化的蛋白。
激活的蛋白的样品通过还原和非还原条件下的SDS-PAGE进行分析。分析洗脱在80mM和250mM咪唑中的样品-参见图1。
实施例5通过蛋白质印迹证实共价连接的TM的存在
TM在融合蛋白内的存在可以通过多种方法评估。一种方法是利用针对TM的特异性抗血清并且通过SDS-PAGE和蛋白质印迹显现。针对TM的抗体可以商购获得(例如，抗-GnRH抗体可获自Abcam(AB76560)或Novus Biologicals(H00002796-B01)，或者可以由商业服务供应商针对给定的肽序列特异性产生。
使用这样的技术，证实当在非还原条件下运行时，GnRH存在于全长的、激活的融合蛋白内，而当在还原条件下运行时，其不存在于HN结构域上。
实施例6通过质谱证实共价连接的TM的存在
TM在融合蛋白内的存在可以通过多种方法评估。一种方法是利用质谱来确定还原之前和之后的融合蛋白质量。
使用根据实施例4制备的蛋白，从SDS-PAGE(图1)提取多份非还原的和还原蛋白的样品，并且通过质谱(Intertek，Manchester)分析。
未激活的、非还原融合蛋白的预测质量为105271Da。关于所述样品观察到的质量为105284Da，仅存在13Da的差异，这是在实验误差内的。因此，证实在未激活的、非还原的融合蛋白内存在完整的GnRH。
激活的、非还原的融合蛋白的预测质量为105271Da。关于所述样品观察到的质量为105321Da，仅存在50Da的差异，这是在实验误差内的。因此，证实在激活的、非还原的融合蛋白内存在完整的GnRH。
当评估LC和HN结构域的还原样品时，HN结构域(其应该包含HN+间隔区+激活位点)具有49419Da的预测质量和49421的观察质量。这表明还原的HN结构域不保留GnRH肽。该结果完全与预测相同，原因在于蛋白水解和二硫键的还原将从HN结构域的C端释放GnRH序列。
这些数据证明，在激活和还原之前，GnRH配体连接在该融合蛋白上，在不存在还原剂的条件下在激活后连接在该融合蛋白上，但是在激活和还原后不存在在HN结构域上。这证实了所述融合蛋白在两个蛋白水解位点被正确地激活，并且GnRH配体通过改造的二硫键连接至HN结构域。
实施例7评估加入GnRH多肽的LHD蛋白的结合能力
使用多种适当的测定中的一种来评估按照实施例4制备的蛋白的配体-受体相互作用功能性。例如，由Cisbio Bioassays提供的促性腺素释放素GnRHR受体配体结合测定是一种竞争性测定，其量化样品中的结合活性
(http：//www.htrf.com/products/gpcr/binding/ligands/inserts/C1TTlGNRH.pdf)。备选地，在科学文献中报道了多种公众可用的结合测定(例如，Christopher E.Heise，Susan K.Sullivan和Paul D.Crowe，J Biomol Screen200712：235；DOI：10.1177/1087057106297362)。利用所述测定表明GnRHTM能够与靶受体相互作用。
这些数据表明GnRH TM能够与靶受体相互作用。
实施例8评估加入GnRH多肽的LHD蛋白的体外功能性
评估按照实施例4制备的蛋白在靶细胞内切割SNARE蛋白的能力。简言之，将表达高水平的促性腺素释放素(GnRH)受体的αT3-1细胞系(一种无限增殖的促性腺激素细胞系)用本发明的化合物温育。24小时后，收集细胞物质，并且通过蛋白质印迹分析SNARE蛋白。数据表明包含GnRH TM的融合蛋白能够与靶受体相互作用，这引起细胞内SNARE蛋白的内在化和切割。
实施例9产生在HN结构域的C端加入强啡肽和缓激肽多肽的LHD蛋白
检查通过遗传融合BoNT/D的LHN片段与肽强啡肽和缓激肽构建的嵌合蛋白的一级序列是否存在携带与关于因子Xa的典型识别位点(IEGR)的相似性的氨基酸链。由于不存在这样的链，选择利用FXa作为在LC-HN接合处激活该融合蛋白并且还切割HN与强啡肽之间的肽键的蛋白酶。在强啡肽和缓激肽之间构建11个氨基酸的间隔区，其加入单个Cys以促进与HN的二硫键结合。
关于大肠杆菌表达最优化的DNA从Entelechon(德国)商购获得，其编码具有下述从N-到C端的结构的融合蛋白：
·10个His N-端纯化标签，
·10个天冬酰胺氨基酸间隔区，
·BoNT/D的LC，
·结构域间接头，其一级序列与BoNT/A中存在的一级序列相似，修饰该接头以加入作为FXa的底物的四肽IEGR，
·BoNT/D的HN，对其进行修饰以加入C-端Cys，
·Gly-Gly-Gly-Gly-Ser间隔区，其在C端加入IEGR肽序列
·17个氨基酸的强啡肽
·11个氨基酸的Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser
·9个氨基酸的缓激肽。
参考软件程序如Graphical Codon Usage Analyser(Geneart)评估大肠杆菌密码子应用，并且参考公布的密码子应用表(例如，GenBank Release143，2004年9月13日)评估％GC含量和密码子利用率，从而确保构建没有导致差的密码子应用。将该DNA结合到标准的克隆载体中，例如pCR4中，然后转化到大肠杆菌宿主中。通过测序检验ORF DNA的完整性。最终的ORF如SEQ ID7所示，并且表达产物的氨基酸序列显示在SEQ ID8中。
实施例10产生在HN结构域的C端加入β-内啡肽和缓激肽多肽的LHA蛋白
检查通过遗传融合BoNT/A的LHN片段与肽β-内啡肽和缓激肽构建的嵌合蛋白的一级序列是否存在携带与关于因子Xa的典型识别位点(IEGR)的相似性的氨基酸链。由于不存在这样的链，选择利用FXa作为在LC-HN接合处激活该融合蛋白并且还切割HN与β-内啡肽之间的肽键的蛋白酶。在β-内啡肽和缓激肽之间构建11个氨基酸的间隔区，其加入单个Cys以促进与HN的二硫键结合。
关于大肠杆菌表达最优化的DNA从Entelechon(德国)商购获得，其编码具有下述从N-到C端的结构的融合蛋白：
·10个His N-端纯化标签，
·10个天冬酰胺氨基酸间隔区，
·BoNT/A的LC，
·结构域间接头，其一级序列与BoNT/A中存在的一级序列相似，修饰该接头以加入作为FXa的底物的四肽IEGR，
·BoNT/A的HN，对其进行修饰以加入C-端Cys，
·Gly-Gly-Gly-Gly-Ser间隔区，其在C端加入IEGR肽序列
·31个氨基酸的β-内啡肽
·11个氨基酸的Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser
·9个氨基酸的缓激肽。
参考软件程序如Graphical Codon Usage Analyser(Geneart)评估大肠杆菌密码子应用，并且参考公布的密码子应用表(例如，GenBank Release143，2004年9月13日)评估％GC含量和密码子利用率，从而确保构建没有导致差的密码子应用。将该DNA结合到标准的克隆载体中，例如pCR4中，然后转化到大肠杆菌宿主中。通过测序检验ORF DNA的完整性。最终的ORF如SEQ ID9所示，并且表达产物的氨基酸序列显示在SEQ ID10中。
实施例11产生在HN结构域的C端加入两个GHRH多肽的LHD蛋白
检查通过遗传融合BoNT/D的LHN片段与两个GHRH肽构建的嵌合蛋白的一级序列是否存在携带与关于因子Xa的典型识别位点(IEGR)的相似性的氨基酸链。由于不存在这样的链，选择利用FXa作为在LC-HN接合处激活该融合蛋白并且还切割HN与GHRH肽之间的肽键的蛋白酶。在两个GHRH肽之间构建11个氨基酸的间隔区，其加入单个Cys以促进与HN的二硫键结合。
关于大肠杆菌表达最优化的DNA从Entelechon(德国)商购获得，其编码具有下述从N-到C端的结构的融合蛋白：
·10个His N-端纯化标签，
·10个天冬酰胺氨基酸间隔区，
·BoNT/D的LC，
·结构域间接头，其一级序列与BoNT/A中存在的一级序列相似，修饰该接头以加入作为FXa的底物的四肽IEGR，
·BoNT/D的HN，对其进行修饰以加入C-端Cys，
·Gly-Gly-Gly-Gly-Ser间隔区，其在C端加入IEGR肽序列
·40个氨基酸的GHRH肽
·11个氨基酸的Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser
·40个氨基酸的GHRH肽
参考软件程序如Graphical Codon Usage Analyser(Geneart)评估大肠杆菌密码子应用，并且参考公布的密码子应用表(例如，GenBank Release143，2004年9月13日)评估％GC含量和密码子利用率，从而确保构建没有导致差的密码子应用。将该DNA结合到标准的克隆载体中，例如pCR4中，然后转化到大肠杆菌宿主中。通过测序检验ORF DNA的完整性。最终的ORF如SEQ ID11所示，并且表达产物的氨基酸序列显示在SEQ ID12中。
实施例12产生在HN结构域的C端加入GnRH多肽(与第二蛋白酶激活位点间隔5个氨基酸)的LHD蛋白
检查通过遗传融合BoNT/D的LHN片段与10个氨基酸的肽GnRH构建的嵌合蛋白的一级序列是否存在携带与关于因子Xa的典型识别位点(IEGR)的相似性的氨基酸链。由于不存在这样的链，选择利用FXa作为在LC-HN接合处激活该融合蛋白并且还切割HN与TM(GnRH)的N端的间隔区之间的肽键的蛋白酶。
关于大肠杆菌表达最优化的DNA从Entelechon(德国)商购获得，其编码具有下述从N-到C端的结构的融合蛋白：
·10个His N-端纯化标签，
·10个天冬酰胺氨基酸间隔区，
·BoNT/D的LC，
·结构域间接头，其一级序列与BoNT/A中存在的一级序列相似，修饰该接头以加入作为FXa的底物的四肽IEGR，
·BoNT/D的HN，对其进行修饰以加入C-端Cys，
·Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Ile-Glu-Gly-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser间隔区，其加入IEGR肽序列
·10个氨基酸的GnRH肽，对其进行修饰以在位置6加入Cys残基替代天然的Gly(QHWSYCLRPG)。
参考软件程序如Graphical Codon Usage Analyser(Geneart)评估大肠杆菌密码子应用，并且参考公布的密码子应用表(例如，GenBank Release143，2004年9月13日)评估％GC含量和密码子利用率，从而确保构建没有导致差的密码子应用。将该DNA结合到标准的克隆载体中，例如pCR4中，然后转化到大肠杆菌宿主中。通过测序检验ORF DNA的完整性。最终的ORF如SEQ ID13所示，并且表达产物的氨基酸序列显示在SEQ ID14中。
实施例13产生在HN结构域的C端加入胃泌素释放肽的LHA蛋白
检查通过遗传融合BoNT/A的LHN片段与27个氨基酸的胃泌素释放肽(GRP)构建的嵌合蛋白的一级序列是否存在携带与关于因子Xa的典型识别位点(IEGR)的相似性的氨基酸链。由于不存在这样的链，选择利用FXa作为在LC-HN接合处激活该融合蛋白并且还切割HN与TM(GRP)之间的肽键的蛋白酶。
关于大肠杆菌表达最优化的DNA从Entelechon(德国)商购获得，其编码具有下述从N-到C端的结构的融合蛋白：
·10个His N-端纯化标签，
·10个天冬酰胺氨基酸间隔区，
·BoNT/A的LC，
·结构域间接头，其一级序列与BoNT/A中存在的一级序列相似，修饰该接头以加入作为FXa的底物的四肽IEGR，
·BoNT/A的HN，对其进行修饰以加入C-端Cys，
·Gly-Gly-Gly-Gly-Ser间隔区，其在C端加入IEGR肽序列
·28个氨基酸的胃泌素释放肽，对其进行修饰以在位置17加入Cys残基替代天然的Arg，并在C端加入另外的Gly残基以替代对C端酰胺化的需求(VPLPAGGGTVLTKMYPCGNHWAVGHLMG)。
参考软件程序如Graphical Codon Usage Analyser(Geneart)评估大肠杆菌密码子应用，并且参考公布的密码子应用表(例如，GenBank Release143，2004年9月13日)评估％GC含量和密码子利用率，从而确保构建没有导致差的密码子应用。将该DNA结合到标准的克隆载体中，例如pCR4中，然后转化到大肠杆菌宿主中。通过测序检验ORF DNA的完整性。最终的ORF如SEQ ID15所示，并且表达产物的氨基酸序列显示在SEQ ID16中。
实施例14治疗患有前列腺癌的患者的方法
一名56岁的男子患有前列腺癌，并且进展到这样的情况：其中雄激素去势治疗不再足以控制该疾病。该男子通过将包含本发明的TSI的组合物(在该具体的实施例中，基于GnRH肽TM的TSI)局部施用到前列腺周围进行治疗。监控患者的状况，并且在治疗后约2个月，医师注意到肿瘤尺寸减小，这表明使用包含本发明的分子的组合物的成功治疗。
实施例15治疗患有神经原性炎症的患者的方法
一名诊断患有类风湿性关节炎的62岁的女子抱怨关节僵硬和肿胀。医师确定关节僵硬和肿胀是由于慢性神经原性炎症导致。该女子通过在受影响区域的周围局部施用包含本发明的TSI(在本实施例中，所述TSI包含阿片样TM-平行实施例使用包含伤害感受肽或强啡肽TMs的TSIs进行)的组合物进行治疗。监测患者的状况，并且在治疗后约1-3天，该女子表示关节僵硬和肿胀减轻。在一月和三月检查时，该女子表示她在治疗的区域继续具有减轻的关节僵硬和肿胀。这种慢性神经原性炎症症状的减轻表示使用包含本发明的分子的组合物的成功治疗。
实施例16治疗患有子宫内膜异位症(endometriosis)的患者的方法
一名39岁的女子表示具有由于子宫内膜异位症导致的骨盆疼痛，使用非类固醇类抗炎药物(NSAIDS)和加入的雌激素-孕酮避孕药不能充分治疗该骨盆疼痛。医师施用包含本发明的TSI的组合物(在本实施例中，所述TSI包含阿片样TM-平行实施例使用包含伤害感受肽或强啡肽TMs的TSIs进行)。监测患者的状况，并且在治疗后约1-3天，该女子表示疼痛减轻。在一月和三月检查时，该女子表示她继续具有减轻的疼痛并且具有提高的运动自由度。这种与子宫内膜异位症相关的症状的减轻表示使用包含本发明的分子的组合物的成功治疗。
实施例17治疗含有膀胱活动过度的患者的方法
一名58岁的男子抱怨增加的尿急。医师诊断该患者患有具有涉及异常神经元活动的神经成分的膀胱活动过度。该男子通过尿道镜注射包含本发明的TSI的组合物(在本实施例中，所述TSI包含阿片样TM-平行实施例使用包含伤害感受肽或强啡肽TMs的TSIs进行)进行治疗。取决于异常神经元活动的位置，可以将毒素施用至例如，逼尿肌中，包括外部和内部尿道括约肌的膀胱颈中，三角区中，膀胱顶或膀胱壁的其他区域，和/或围绕膀胱的其他区域，诸如尿道，输尿管，泌尿生殖膈，下骨盆肌(lowerpelvic muscles)，前列腺，尿道球腺，生殖球，阴茎脚(crus)或阴茎。监测患者的状况，并且在治疗后约1-3天，该男子表示排尿紧急感减轻。在一月和三月检查时，该男子表示他继续具有减轻的排尿紧急感。这种膀胱活动过度症状的减轻表示使用包含本发明的分子的组合物的成功治疗。
实施例18治疗患有神经原性炎症的患者的方法
一名诊断患有类风湿性关节炎的62岁的女子抱怨关节僵硬和肿胀。医师确定关节僵硬和肿胀是由于慢性神经原性炎症导致。该女子通过在受影响区域的周围局部施用包含本发明的TSI(在本实施例中，所述TSI包含阿片样TM-平行实施例使用包含伤害感受肽或强啡肽TMs的TSIs进行)的组合物进行治疗。监测患者的状况，并且在治疗后约1-3天，该女子表示关节僵硬和肿胀减轻。在一月和三月检查时，该女子表示她在治疗的区域继续具有减轻的关节僵硬和肿胀。这种慢性神经原性炎症症状的减轻表示使用包含本发明的分子的组合物的成功治疗。本说明书所公开的蛋白的类似类型的局部施用可以用来治疗患有与下述任何相关的慢性神经原性炎症的患者：单关节炎(monoarthritis)，少数关节关节炎(oligoarthritis)，或多关节炎(polyarthritis)，诸如例如，骨关节炎(osteoarthritis)，青少年特发性的关节炎(juvenile idiopathic arthritis)，脓毒性关节炎(septic arthritis)，脊椎关节病(spondyloarthropathy)(包括强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)，反应性关节炎(reactive arthritis)(莱特尔综合征(Reiter′s syndrome))，银屑病关节炎(psoriatic arthritis)，与炎性肠病(inflammatory bowel disease)相关的肠病性关节炎(enteropathic arthritis)、惠普尔病(Whipple disease)或贝赫切特病(Behcetdisease))，滑膜炎(synovitis)，痛风(gout)，假性痛风(pseudogout)，或斯蒂尔病(Still′s disease)，以及滑囊炎(bursitis)，风湿热(rheumaticfever)，或腱鞘炎(tenosynovitis)。另外，全身施用也可以用来施用包含本发明的分子的组合来治疗慢性神经原性炎症。
SEQ ID1
atgcatcaccatcaccatcaccatcaccatcatgggagctCGAACAAtAACAACAATAACAATAACAAtAACggatccatgacgtggccagttaaggatttcaactactcagatcctgtaaatgacaacgatattctgtaccttcgcattccacaaaataaactgatcaccacaccagtcaaagcattcatgattactcaaaacatttgggtcattccagaacgcttttctagtgacacaaatccgagtttatctaaacctccgcgtccgacgtccaaatatcagagctattacgatccctcatatctcagtacggacgaacaaaaagatactttccttaaaggtatcattaaactgtttaagcgtattaatgagcgcgatatcgggaaaaagttgattaattatcttgttgtgggttccccgttcatgggcgatagctctacccccgaagacacttttgattttacccgtcatacgacaaacatcgcggtagagaagtttgagaacggatcgtggaaagtcacaaacatcattacacctagcgtcttaatttttggtccgctgccaaacatcttagattatacagccagcctgactttgcaggggcaacagtcgaatccgagtttcgaaggttttggtaccctgagcattctgaaagttgccccggaatttctgctcactttttcagatgtcaccagcaaccagagctcagcagtattaggaaagtcaattttttgcatggacccggttattgcactgatgcacgaactgacgcactctctgcatcaactgtatgggatcaacatccccagtgacaaacgtattcgtccccaggtgtctgaaggatttttctcacaggatgggccgaacgtccagttcgaagagttgtatactttcggaggcctggacgtagagatcattccccagattgagcgcagtcagctgcgtgagaaggcattgggccattataaggatattgcaaaacgcctgaataacattaacaaaacgattccatcttcgtggatctcgaatattgataaatataagaaaatttttagcgagaaatataattttgataaagataatacaggtaactttgtggttaacattgacaaattcaactccctttacagtgatttgacgaatgtaatgagcgaagttgtgtatagttcccaatacaacgttaagaatcgtacccattacttctctcgtcactacctgccggttttcgcgaacatccttgacgataatatttacactattcgtgacggctttaacttgaccaacaagggcttcaatattgaaaattcaggccagaacattgaacgcaacccggccttgcagaaactgtcgagtgaatccgtggttgacctgtttaccaaagtctgcgtcgacggcatcattacctccaaaactaaatctctgatagaaggtagaaacaaagcgctgaacctgcagtgtattaaagtgaaaaacaatcggctgccttatgtagcagataaagatagcattagtcaggagattttcgaaaataaaattatcactgacgaaaccaatgttcagaattattcagataaattttcactggacgaaagcatcttagatggccaagttccgattaacccggaaattgttgatccgttactgccgaacgtgaatatggaaccgttaaacctccctggcgaagagatcgtattttatgatgacattacgaaatatgtggactaccttaattcttattactatttggaaagccagaaactgtccaataacgtggaaaacattactctgaccacaagcgtggaagaggctttaggctactcaaataagatttataccttcctcccgtcgctggcggaaaaagtaaataaaggtgtgcaggctggtctgttcctcaactgggcgaatgaagttgtcgaagactttaccacgaatattatgaaaaaggataccctggataaaatctccgacgtctcggttattatcccatatattggccctgcgttaaatatcggtaatagtgcgctgcgggggaattttaaccaggcctttgctaccgcgggcgtcgcgttcctcctggagggctttcctgaatttactatcccggcgctcggtgtttttacattttactcttccatccaggagcgtgagaaaattatcaaaaccatcgaaaactgcctggagcagcgggtgaaacgctggaaagattcttatcaatggatggtgtcaaactggttatctcgcatcacgacccaattcaaccatattaattaccagatgtatgatagtctgtcgtaccaagctgacgccattaaagccaaaattgatctggaatataaaaagtactctggtagcgataaggagaacatcaaaagccaggtggagaaccttaagaatagtctggatgtgaaaatctctgaagctatgaataacattaacaaattcattcgtgaatgttcggtgacgtacctgttcaagaatatgctgccaaaagttattgatgaactgaataaatttgatctgcgtaccaaaaccgaacttatcaacctcatcgactcccacaacattatccttgtgggcgaagtggatcgtctgaaggccaaagtaaacgagagctttgaaaatacgatgccgtttaatattttttcatataccaataactccttgctgaaagatatcatcaatgaatatttcaaTCTAGAaTGTggcggtggcggtagcATCGAAGGTCGTcagcactggtcctattgcctgcgccctggttgataa
SEQ ID2
MHHHHHHHHHHGSSNNNNNNNNNNGSMTWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLSSESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSLIEGRNKALNLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLECGGGGSIEGRQHWSYCLRPG
SEQ ID3
atgcatcaccatcaccatcaccatcaccatcatgggagctCGAACAAtAACAACAATAACAATAACAAtAACggatccatggagttcgttaacaaacagttcaactataaagacccagttaacggtgttgacattgcttacatcaaaatcccgaacgctggccagatgcagccggtaaaggcattcaaaatccacaacaaaatctgggttatcccggaacgtgatacctttactaacccggaagaaggtgacctgaacccgccaccggaagcgaaacaggtgccggtatcttactatgactccacctacctgtctaccgataacgaaaaggacaactacctgaaaggtgttactaaactgttcgagcgtatttactccaccgacctgggccgtatgctgctgactagcatcgttcgcggtatcccgttctggggcggttctaccatcgataccgaactgaaagtaatcgacactaactgcatcaacgttattcagccggacggttcctatcgttccgaagaactgaacctggtgatcatcggcccgtctgctgatatcatccagttcgagtgtaagagctttggtcacgaagttctgaacctcacccgtaacggctacggttccactcagtacatccgtttctctccggacttcaccttcggttttgaagaatccctggaagtagacacgaacccactgctgggcgctggtaaattcgcaactgatcctgcggttaccctggctcacgaactgattcatgcaggccaccgcctgtacggtatcgccatcaatccgaaccgtgtcttcaaagttaacaccaacgcgtattacgagatgtccggtctggaagttagcttcgaagaactgcgtacttttggcggtcacgacgctaaattcatcgactctctgcaagaaaacgagttccgtctgtactactataacaagttcaaagatatcgcatccaccctgaacaaagcgaaatccatcgtgggtaccactgcttctctccagtacatgaagaacgtttttaaagaaaaatacctgctcagcgaagacacctccggcaaattctctgtagacaagttgaaattcgataaactttacaaaatgctgactgaaatttacaccgaagacaacttcgttaagttctttaaagttctgaaccgcaaaacctatctgaacttcgacaaggcagtattcaaaatcaacatcgtgccgaaagttaactacactatctacgatggtttcaacctgcgtaacaccaacctggctgctaattttaacggccagaacacggaaatcaacaacatgaacttcacaaaactgaaaaacttcactggtctgttcgagttttacaagctgctgtgcgtcgacggcatcattacctccaaaactaaatctctgatagaaggtagaaacaaagcgctgaacgacctctgtatcaaggttaacaactgggatttattcttcagcccgagtgaagacaacttcaccaacgacctgaacaaaggtgaagaaatcacctcagatactaacatcgaagcagccgaagaaaacatctcgctggacctgatccagcagtactacctgacctttaatttcgacaacgagccggaaaacatttctatcgaaaacctgagctctgatatcatcggccagctggaactgatgccgaacatcgaacgtttcccaaacggtaaaaagtacgagctggacaaatataccatgttccactacctgcgcgcgcaggaatttgaacacggcaaatcccgtatcgcactgactaactccgttaacgaagctctgctcaacccgtcccgtgtatacaccttcttctctagcgactacgtgaaaaaggtcaacaaagcgactgaagctgcaatgttcttgggttgggttgaacagcttgtttatgattttaccgacgagacgtccgaagtatctactaccgacaaaattgcggatatcactatcatcatcccgtacatcggtccggctctgaacattggcaacatgctgtacaaagacgacttcgttggcgcactgatcttctccggtgcggtgatcctgctggagttcatcccggaaatcgccatcccggtactgggcacctttgctctggtttcttacattgcaaacaaggttctgactgtacaaaccatcgacaacgcgctgagcaaacgtaacgaaaaatgggatgaagtttacaaatatatcgtgaccaactggctggctaaggttaatactcagatcgacctcatccgcaaaaaaatgaaagaagcactggaaaaccaggcggaagctaccaaggcaatcattaactaccagtacaaccagtacaccgaggaagaaaaaaacaacatcaacttcaacatcgacgatctgtcctctaaactgaacgaatccatcaacaaagctatgatcaacatcaacaagttcctgaaccagtgctctgtaagctatctgatgaactccatgatcccgtacggtgttaaacgtctggaggacttcgatgcgtctctgaaagacgccctgctgaaatacatttacgacaaccgtggcactctgatcggtcaggttgatcgtctgaaggacaaagtgaacaataccttatcgaccgacatcccttttcagctcagtaaatatgtcgataaccaacgccttttgtccactTGTggcggtggcggtagcATCGAAGGTCGTcagcactggtcctattgcctgcgccctggttgataa
SEQ ID4
MHHHHHHHHHHGSSNNNNNNNNNNGSMEFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSLIEGRNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTCGGGGSIEGRQHWSYCLRPG
SEQ ID5
atgcatcaccatcaccatcaccatcaccatcatgggagctCGAACAAtAACAACAATAACAATAACAAtAACggatccatgacgtggccagttaaggatttcaactactcagatcctgtaaatgacaacgatattctgtaccttcgcattccacaaaataaactgatcaccacaccagtcaaagcattcatgattactcaaaacatttgggtcattccagaacgcttttctagtgacacaaatccgagtttatctaaacctccgcgtccgacgtccaaatatcagagctattacgatccctcatatctcagtacggacgaacaaaaagatactttccttaaaggtatcattaaactgtttaagcgtattaatgagcgcgatatcgggaaaaagttgattaattatcttgttgtgggttccccgttcatgggcgatagctctacccccgaagacacttttgattttacccgtcatacgacaaacatcgcggtagagaagtttgagaacggatcgtggaaagtcacaaacatcattacacctagcgtcttaatttttggtccgctgccaaacatcttagattatacagccagcctgactttgcaggggcaacagtcgaatccgagtttcgaaggttttggtaccctgagcattctgaaagttgccccggaatttctgctcactttttcagatgtcaccagcaaccagagctcagcagtattaggaaagtcaattttttgcatggacccggttattgcactgatgcacgaactgacgcactctctgcatcaactgtatgggatcaacatccccagtgacaaacgtattcgtccccaggtgtctgaaggatttttctcacaggatgggccgaacgtccagttcgaagagttgtatactttcggaggcctggacgtagagatcattccccagattgagcgcagtcagctgcgtgagaaggcattgggccattataaggatattgcaaaacgcctgaataacattaacaaaacgattccatcttcgtggatctcgaatattgataaatataagaaaatttttagcgagaaatataattttgataaagataatacaggtaactttgtggttaacattgacaaattcaactccctttacagtgatttgacgaatgtaatgagcgaagttgtgtatagttcccaatacaacgttaagaatcgtacccattacttctctcgtcactacctgccggttttcgcgaacatccttgacgataatatttacactattcgtgacggctttaacttgaccaacaagggcttcaatattgaaaattcaggccagaacattgaacgcaacccggccttgcagaaactgtcgagtgaatccgtggttgacctgtttaccaaagtctgcgtcgacggcatcattacctccaaaactaaatctctgatagaaggtagaaacaaagcgctgaacctgcagtgtattaaagtgaaaaacaatcggctgccttatgtagcagataaagatagcattagtcaggagattttcgaaaataaaattatcactgacgaaaccaatgttcagaattattcagataaattttcactggacgaaagcatcttagatggccaagttccgattaacccggaaattgttgatccgttactgccgaacgtgaatatggaaccgttaaacctccctggcgaagagatcgtattttatgatgacattacgaaatatgtggactaccttaattcttattactatttggaaagccagaaactgtccaataacgtggaaaacattactctgaccacaagcgtggaagaggctttaggctactcaaataagatttataccttcctcccgtcgctggcggaaaaagtaaataaaggtgtgcaggctggtctgttcctcaactgggcgaatgaagttgtcgaagactttaccacgaatattatgaaaaaggataccctggataaaatctccgacgtctcggttattatcccatatattggccctgcgttaaatatcggtaatagtgcgctgcgggggaattttaaccaggcctttgctaccgcgggcgtcgcgttcctcctggagggctttcctgaatttactatcccggcgctcggtgtttttacattttactcttccatccaggagcgtgagaaaattatcaaaaccatcgaaaactgcctggagcagcgggtgaaacgctggaaagattcttatcaatggatggtgtcaaactggttatctcgcatcacgacccaattcaaccatattaattaccagatgtatgatagtctgtcgtaccaagctgacgccattaaagccaaaattgatctggaatataaaaagtactctggtagcgataaggagaacatcaaaagccaggtggagaaccttaagaatagtctggatgtgaaaatctctgaagctatgaataacattaacaaattcattcgtgaatgttcggtgacgtacctgttcaagaatatgctgccaaaagttattgatgaactgaataaatttgatctgcgtaccaaaaccgaacttatcaacctcatcgactcccacaacattatccttgtgggcgaagtggatcgtctgaaggccaaagtaaacgagagctttgaaaatacgatgccgtttaatattttttcatataccaataactccttgctgaaagatatcatcaatgaatatttcaaTCTAGAaTGTggcggtggcggtagcGACGATGACGATAAAcagcactggtcctattgcctgcgccctggttgataa
SEQ ID6
MHHHHHHHHHHGSSNNNNNNNNNNGSMTWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLSSESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSLIEGRNKALNLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLECGGGGSDDDDKQHWSYCLRPG
SEQ ID7
atgcatcaccatcaccatcaccatcaccatcatgggagctCGAACAAtAACAACAATAACAATAACAAtAACggatccatgacgtggccagttaaggatttcaactactcagatcctgtaaatgacaacgatattctgtaccttcgcattccacaaaataaactgatcaccacaccagtcaaagcattcatgattactcaaaacatttgggtcattccagaacgcttttctagtgacacaaatccgagtttatctaaacctccgcgtccgacgtccaaatatcagagctattacgatccctcatatctcagtacggacgaacaaaaagatactttccttaaaggtatcattaaactgtttaagcgtattaatgagcgcgatatcgggaaaaagttgattaattatcttgttgtgggttccccgttcatgggcgatagctctacccccgaagacacttttgattttacccgtcatacgacaaacatcgcggtagagaagtttgagaacggatcgtggaaagtcacaaacatcattacacctagcgtcttaatttttggtccgctgccaaacatcttagattatacagccagcctgactttgcaggggcaacagtcgaatccgagtttcgaaggttttggtaccctgagcattctgaaagttgccccggaatttctgctcactttttcagatgtcaccagcaaccagagctcagcagtattaggaaagtcaattttttgcatggacccggttattgcactgatgcacgaactgacgcactctctgcatcaactgtatgggatcaacatccccagtgacaaacgtattcgtccccaggtgtctgaaggatttttctcacaggatgggccgaacgtccagttcgaagagttgtatactttcggaggcctggacgtagagatcattccccagattgagcgcagtcagctgcgtgagaaggcattgggccattataaggatattgcaaaacgcctgaataacattaacaaaacgattccatcttcgtggatctcgaatattgataaatataagaaaatttttagcgagaaatataattttgataaagataatacaggtaactttgtggttaacattgacaaattcaactccctttacagtgatttgacgaatgtaatgagcgaagttgtgtatagttcccaatacaacgttaagaatcgtacccattacttctctcgtcactacctgccggttttcgcgaacatccttgacgataatatttacactattcgtgacggctttaacttgaccaacaagggcttcaatattgaaaattcaggccagaacattgaacgcaacccggccttgcagaaactgtcgagtgaatccgtggttgacctgtttaccaaagtctgcgtcgacggcatcattacctccaaaactaaatctctgatagaaggtagaaacaaagcgctgaacctgcagtgtattaaagtgaaaaacaatcggctgccttatgtagcagataaagatagcattagtcaggagattttcgaaaataaaattatcactgacgaaaccaatgttcagaattattcagataaattttcactggacgaaagcatcttagatggccaagttccgattaacccggaaattgttgatccgttactgccgaacgtgaatatggaaccgttaaacctccctggcgaagagatcgtattttatgatgacattacgaaatatgtggactaccttaattcttattactatttggaaagccagaaactgtccaataacgtggaaaacattactctgaccacaagcgtggaagaggctttaggctactcaaataagatttataccttcctcccgtcgctggcggaaaaagtaaataaaggtgtgcaggctggtctgttcctcaactgggcgaatgaagttgtcgaagactttaccacgaatattatgaaaaaggataccctggataaaatctccgacgtctcggttattatcccatatattggccctgcgttaaatatcggtaatagtgcgctgcgggggaattttaaccaggcctttgctaccgcgggcgtcgcgttcctcctggagggctttcctgaatttactatcccggcgctcggtgtttttacattttactcttccatccaggagcgtgagaaaattatcaaaaccatcgaaaactgcctggagcagcgggtgaaacgctggaaagattcttatcaatggatggtgtcaaactggttatctcgcatcacgacccaattcaaccatattaattaccagatgtatgatagtctgtcgtaccaagctgacgccattaaagccaaaattgatctggaatataaaaagtactctggtagcgataaggagaacatcaaaagccaggtggagaaccttaagaatagtctggatgtgaaaatctctgaagctatgaataacattaacaaattcattcgtgaatgttcggtgacgtacctgttcaagaatatgctgccaaaagttattgatgaactgaataaatttgatctgcgtaccaaaaccgaacttatcaacctcatcgactcccacaacattatccttgtgggcgaagtggatcgtctgaaggccaaagtaaacgagagctttgaaaatacgatgccgtttaatattttttcatataccaataactccttgctgaaagatatcatcaatgaatatttcaaTCTAGAaTGTggcggtggcggtagcATCGAAGGTCGTTATGGAGGTTTTTTGAGAAGGATACGACCAAAATTAAAGTGGGATAATCAAggcggtgggggtagtTGCggcggtggcggttcgcgtccgccgggtttctctccgttccgttgataa
SEQ ID8
MHHHHHHHHHHGSSNNNNNNNNNNGSMTWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLSSESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSLIEGRNKALNLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLECGGGGSIEGRYGGFLRRIRPKLKWDNQGGGGSCGGGGSRPPGFSPFR
SEQ ID9
atgcatcaccatcaccatcaccatcaccatcatgggagctCGAACAAtAACAACAATAACAATAACAAtAACggatccatggagttcgttaacaaacagttcaactataaagacccagttaacggtgttgacattgcttacatcaaaatcccgaacgctggccagatgcagccggtaaaggcattcaaaatccacaacaaaatctgggttatcccggaacgtgatacctttactaacccggaagaaggtgacctgaacccgccaccggaagcgaaacaggtgccggtatcttactatgactccacctacctgtctaccgataacgaaaaggacaactacctgaaaggtgttactaaactgttcgagcgtatttactccaccgacctgggccgtatgctgctgactagcatcgttcgcggtatcccgttctggggcggttctaccatcgataccgaactgaaagtaatcgacactaactgcatcaacgttattcagccggacggttcctatcgttccgaagaactgaacctggtgatcatcggcccgtctgctgatatcatccagttcgagtgtaagagctttggtcacgaagttctgaacctcacccgtaacggctacggttccactcagtacatccgtttctctccggacttcaccttcggttttgaagaatccctggaagtagacacgaacccactgctgggcgctggtaaattcgcaactgatcctgcggttaccctggctcacgaactgattcatgcaggccaccgcctgtacggtatcgccatcaatccgaaccgtgtcttcaaagttaacaccaacgcgtattacgagatgtccggtctggaagttagcttcgaagaactgcgtacttttggcggtcacgacgctaaattcatcgactctctgcaagaaaacgagttccgtctgtactactataacaagttcaaagatatcgcatccaccctgaacaaagcgaaatccatcgtgggtaccactgcttctctccagtacatgaagaacgtttttaaagaaaaatacctgctcagcgaagacacctccggcaaattctctgtagacaagttgaaattcgataaactttacaaaatgctgactgaaatttacaccgaagacaacttcgttaagttctttaaagttctgaaccgcaaaacctatctgaacttcgacaaggcagtattcaaaatcaacatcgtgccgaaagttaactacactatctacgatggtttcaacctgcgtaacaccaacctggctgctaattttaacggccagaacacggaaatcaacaacatgaacttcacaaaactgaaaaacttcactggtctgttcgagttttacaagctgctgtgcgtcgacggcatcattacctccaaaactaaatctctgatagaaggtagaaacaaagcgctgaacgacctctgtatcaaggttaacaactgggatttattcttcagcccgagtgaagacaacttcaccaacgacctgaacaaaggtgaagaaatcacctcagatactaacatcgaagcagccgaagaaaacatctcgctggacctgatccagcagtactacctgacctttaatttcgacaacgagccggaaaacatttctatcgaaaacctgagctctgatatcatcggccagctggaactgatgccgaacatcgaacgtttcccaaacggtaaaaagtacgagctggacaaatataccatgttccactacctgcgcgcgcaggaatttgaacacggcaaatcccgtatcgcactgactaactccgttaacgaagctctgctcaacccgtcccgtgtatacaccttcttctctagcgactacgtgaaaaaggtcaacaaagcgactgaagctgcaatgttcttgggttgggttgaacagcttgtttatgattttaccgacgagacgtccgaagtatctactaccgacaaaattgcggatatcactatcatcatcccgtacatcggtccggctctgaacattggcaacatgctgtacaaagacgacttcgttggcgcactgatcttctccggtgcggtgatcctgctggagttcatcccggaaatcgccatcccggtactgggcacctttgctctggtttcttacattgcaaacaaggttctgactgtacaaaccatcgacaacgcgctgagcaaacgtaacgaaaaatgggatgaagtttacaaatatatcgtgaccaactggctggctaaggttaatactcagatcgacctcatccgcaaaaaaatgaaagaagcactggaaaaccaggcggaagctaccaaggcaatcattaactaccagtacaaccagtacaccgaggaagaaaaaaacaacatcaacttcaacatcgacgatctgtcctctaaactgaacgaatccatcaacaaagctatgatcaacatcaacaagttcctgaaccagtgctctgtaagctatctgatgaactccatgatcccgtacggtgttaaacgtctggaggacttcgatgcgtctctgaaagacgccctgctgaaatacatttacgacaaccgtggcactctgatcggtcaggttgatcgtctgaaggacaaagtgaacaataccttatcgaccgacatcccttttcagctcagtaaatatgtcgataaccaacgccttttgtccactTGTggcggtggcggtagcATCGAAGGTCGTTACGGTGGTTTCATGACCTCTGAAAAATCTCAGACCCCGCTGGTTACCCTGTTCAAAAACGCTATCATCAAAAACGCTTACAAAAAAGGTGAAggcggtgggggtagtTGCggcggtggcggttcgcgtccgccgggtttctctccgttccgttgataa
SEQ ID10
MHHHHHHHHHHGSSNNNNNNNNNNGSMEFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSLIEGRNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDI PFQLSKYVDNQRLLSTCGGGGSIEGRYGGFMTSEKSQTPLVTLFKNAIIKNAYKKGEGGGGSCGGGGSRPPGFSPFR
SEQ ID11
atgcatcaccatcaccatcaccatcaccatcatgggagctCGAACAAtAACAACAATAACAATAACAAtAACggatccatgacgtggccagttaaggatttcaactactcagatcctgtaaatgacaacgatattctgtaccttcgcattccacaaaataaactgatcaccacaccagtcaaagcattcatgattactcaaaacatttgggtcattccagaacgcttttctagtgacacaaatccgagtttatctaaacctccgcgtccgacgtccaaatatcagagctattacgatccctcatatctcagtacggacgaacaaaaagatactttccttaaaggtatcattaaactgtttaagcgtattaatgagcgcgatatcgggaaaaagttgattaattatcttgttgtgggttccccgttcatgggcgatagctctacccccgaagacacttttgattttacccgtcatacgacaaacatcgcggtagagaagtttgagaacggatcgtggaaagtcacaaacatcattacacctagcgtcttaatttttggtccgctgccaaacatcttagattatacagccagcctgactttgcaggggcaacagtcgaatccgagtttcgaaggttttggtaccctgagcattctgaaagttgccccggaatttctgctcactttttcagatgtcaccagcaaccagagctcagcagtattaggaaagtcaattttttgcatggacccggttattgcactgatgcacgaactgacgcactctctgcatcaactgtatgggatcaacatccccagtgacaaacgtattcgtccccaggtgtctgaaggatttttctcacaggatgggccgaacgtccagttcgaagagttgtatactttcggaggcctggacgtagagatcattccccagattgagcgcagtcagctgcgtgagaaggcattgggccattataaggatattgcaaaacgcctgaataacattaacaaaacgattccatcttcgtggatctcgaatattgataaatataagaaaatttttagcgagaaatataattttgataaagataatacaggtaactttgtggttaacattgacaaattcaactccctttacagtgatttgacgaatgtaatgagcgaagttgtgtatagttcccaatacaacgttaagaatcgtacccattacttctctcgtcactacctgccggttttcgcgaacatccttgacgataatatttacactattcgtgacggctttaacttgaccaacaagggcttcaatattgaaaattcaggccagaacattgaacgcaacccggccttgcagaaactgtcgagtgaatccgtggttgacctgtttaccaaagtctgcgtcgacggcatcattacctccaaaactaaatctctgatagaaggtagaaacaaagcgctgaacctgcagtgtattaaagtgaaaaacaatcggctgccttatgtagcagataaagatagcattagtcaggagattttcgaaaataaaattatcactgacgaaaccaatgttcagaattattcagataaattttcactggacgaaagcatcttagatggccaagttccgattaacccggaaattgttgatccgttactgccgaacgtgaatatggaaccgttaaacctccctggcgaagagatcgtattttatgatgacattacgaaatatgtggactaccttaattcttattactatttggaaagccagaaactgtccaataacgtggaaaacattactctgaccacaagcgtggaagaggctttaggctactcaaataagatttataccttcctcccgtcgctggcggaaaaagtaaataaaggtgtgcaggctggtctgttcctcaactgggcgaatgaagttgtcgaagactttaccacgaatattatgaaaaaggataccctggataaaatctccgacgtctcggttattatcccatatattggccctgcgttaaatatcggtaatagtgcgctgcgggggaattttaaccaggcctttgctaccgcgggcgtcgcgttcctcctggagggctttcctgaatttactatcccggcgctcggtgtttttacattttactcttccatccaggagcgtgagaaaattatcaaaaccatcgaaaactgcctggagcagcgggtgaaacgctggaaagattcttatcaatggatggtgtcaaactggttatctcgcatcacgacccaattcaaccatattaattaccagatgtatgatagtctgtcgtaccaagctgacgccattaaagccaaaattgatctggaatataaaaagtactctggtagcgataaggagaacatcaaaagccaggtggagaaccttaagaatagtctggatgtgaaaatctctgaagctatgaataacattaacaaattcattcgtgaatgttcggtgacgtacctgttcaagaatatgctgccaaaagttattgatgaactgaataaatttgatctgcgtaccaaaaccgaacttatcaacctcatcgactcccacaacattatccttgtgggcgaagtggatcgtctgaaggccaaagtaaacgagagctttgaaaatacgatgccgtttaatattttttcatataccaataactccttgctgaaagatatcatcaatgaatatttcaaTCTAGAaTGTggcggtggcggtagcATCGAAGGTCGTCACGTGGATGCGATCTTCACTCAGTCTTACCGTAAAGTTCTGGCGCAGCTGAGCGCTCGTAAACTGCTGCAGGATATCCTGAACCGTCAGCAGGGTGAACGTAACCAGGAACAGGGCGCTggcggtgggggtagtTGCggcggtggcggttcgCACGTGGATGCGATCTTCACTCAGTCTTACCGTAAAGTTCTGGCGCAGCTGAGCGCTCGTAAACTGCTGCAGGATATCCTGAACCGTCAGCAGGGTGAACGTAACCAGGAACAGGGCGCTtgataa
SEQ ID12
MHHHHHHHHHHGSSNNNNNNNNNNGSMTWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGI IKLFKRINERDIGKKLINYLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLSSESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSLIEGRNKALNLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLECGGGGSIEGRHVDAIFTQSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGAGGGGSCGGGGSHVDAIFTQSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA
SEQ ID13
atgcatcaccatcaccatcaccatcaccatcatgggagctCGAACAAtAACAACAATAACAATAACAAtAACggatccatgacgtggccagttaaggatttcaactactcagatcctgtaaatgacaacgatattctgtaccttcgcattccacaaaataaactgatcaccacaccagtcaaagcattcatgattactcaaaacatttgggtcattccagaacgcttttctagtgacacaaatccgagtttatctaaacctccgcgtccgacgtccaaatatcagagctattacgatccctcatatctcagtacggacgaacaaaaagatactttccttaaaggtatcattaaactgtttaagcgtattaatgagcgcgatatcgggaaaaagttgattaattatcttgttgtgggttccccgttcatgggcgatagctctacccccgaagacacttttgattttacccgtcatacgacaaacatcgcggtagagaagtttgagaacggatcgtggaaagtcacaaacatcattacacctagcgtcttaatttttggtccgctgccaaacatcttagattatacagccagcctgactttgcaggggcaacagtcgaatccgagtttcgaaggttttggtaccctgagcattctgaaagttgccccggaatttctgctcactttttcagatgtcaccagcaaccagagctcagcagtattaggaaagtcaattttttgcatggacccggttattgcactgatgcacgaactgacgcactctctgcatcaactgtatgggatcaacatccccagtgacaaacgtattcgtccccaggtgtctgaaggatttttctcacaggatgggccgaacgtccagttcgaagagttgtatactttcggaggcctggacgtagagatcattccccagattgagcgcagtcagctgcgtgagaaggcattgggccattataaggatattgcaaaacgcctgaataacattaacaaaacgattccatcttcgtggatctcgaatattgataaatataagaaaatttttagcgagaaatataattttgataaagataatacaggtaactttgtggttaacattgacaaattcaactccctttacagtgatttgacgaatgtaatgagcgaagttgtgtatagttcccaatacaacgttaagaatcgtacccattacttctctcgtcactacctgccggttttcgcgaacatccttgacgataatatttacactattcgtgacggctttaacttgaccaacaagggcttcaatattgaaaattcaggccagaacattgaacgcaacccggccttgcagaaactgtcgagtgaatccgtggttgacctgtttaccaaagtctgcgtcgacggcatcattacctccaaaactaaatctctgatagaaggtagaaacaaagcgctgaacctgcagtgtattaaagtgaaaaacaatcggctgccttatgtagcagataaagatagcattagtcaggagattttcgaaaataaaattatcactgacgaaaccaatgttcagaattattcagataaattttcactggacgaaagcatcttagatggccaagttccgattaacccggaaattgttgatccgttactgccgaacgtgaatatggaaccgttaaacctccctggcgaagagatcgtattttatgatgacattacgaaatatgtggactaccttaattcttattactatttggaaagccagaaactgtccaataacgtggaaaacattactctgaccacaagcgtggaagaggctttaggctactcaaataagatttataccttcctcccgtcgctggcggaaaaagtaaataaaggtgtgcaggctggtctgttcctcaactgggcgaatgaagttgtcgaagactttaccacgaatattatgaaaaaggataccctggataaaatctccgacgtctcggttattatcccatatattggccctgcgttaaatatcggtaatagtgcgctgcgggggaattttaaccaggcctttgctaccgcgggcgtcgcgttcctcctggagggctttcctgaatttactatcccggcgctcggtgtttttacattttactcttccatccaggagcgtgagaaaattatcaaaaccatcgaaaactgcctggagcagcgggtgaaacgctggaaagattcttatcaatggatggtgtcaaactggttatctcgcatcacgacccaattcaaccatattaattaccagatgtatgatagtctgtcgtaccaagctgacgccattaaagccaaaattgatctggaatataaaaagtactctggtagcgataaggagaacatcaaaagccaggtggagaaccttaagaatagtctggatgtgaaaatctctgaagctatgaataacattaacaaattcattcgtgaatgttcggtgacgtacctgttcaagaatatgctgccaaaagttattgatgaactgaataaatttgatctgcgtaccaaaaccgaacttatcaacctcatcgactcccacaacattatccttgtgggcgaagtggatcgtctgaaggccaaagtaaacgagagctttgaaaatacgatgccgtttaatattttttcatataccaataactccttgctgaaagatatcatcaatgaatatttcaaTCTAGAaTGTGGTGGCGGTGGCTCTGGTGGCGGCGGTTCTATTGAAGGTCGCGGTGGCGGTGGCTCTGGTGGCGGCGGTTCTcagcactggtcctattgcctgcgccctggttgataa
SEQ ID14
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SEQ ID15
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SEQ ID16
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Claims (33)

1.单链多肽融合蛋白，其包含：
(a)无细胞毒性蛋白酶，其能够切割靶细胞的胞吐融合器的蛋白；
(b)靶向部分，其能够结合靶细胞上的结合位点，所述结合位点能够进行胞吞作用从而被引入到所述靶细胞内的内体中；
(c)易位结构域，其能够将所述蛋白酶从内体中易位穿过内体膜并且进入所述靶细胞的细胞质中；
(d)第一蛋白酶切割位点，在所述位点所述融合蛋白能够被第一蛋白酶切割，其中所述第一蛋白酶切割位点位于所述无细胞毒性蛋白酶与所述易位结构域之间；
(e)第二蛋白酶切割位点，在所述位点所述融合蛋白能够被第二蛋白酶切割，其中所述第二蛋白酶切割位点位于所述易位结构域与所述靶向部分之间；和
(f)在所述靶向部分与所述易位结构域之间的共价键，其中在第二蛋白酶切割位点的蛋白水解切割之后，所述靶向部分通过所述共价键保持连接至所述易位结构域；
其中在所述第一和第二切割位点切割后，所述靶向部分能够通过所述靶向部分的N端结构域与所述结合位点的结构域之间的相互作用同时通过所述靶向部分的C端结构域与所述结合位点的结构域之间的相互作用与靶细胞上的结合位点相互作用。
2.权利要求1的融合蛋白，其中所述易位结构域位于所述无细胞毒性蛋白酶与所述靶向部分之间。
3.权利要求1的融合蛋白，其中所述靶向部分位于所述无细胞毒性蛋白酶与所述易位结构域之间；并且其中所述第一蛋白酶切割位点进一步位于所述无细胞毒性蛋白酶与所述靶向部分之间。
4.权利要求1-3中任一项的融合蛋白，其中所述无细胞毒性蛋白酶位于所述单链多肽融合蛋白的N端。
5.权利要求1-3中任一项的融合蛋白，其中所述共价键是二硫键。
6.权利要求1-3中任一项的融合蛋白，其中存在位于所述易位结构域与所述靶向部分之间的提供二级多肽结构的短多肽，并且其中所述二级多肽结构起作用使得所述靶向部分的一部分与所述易位结构域紧密接近，由此使能量上更有利的共价键形成。
7.权利要求1-3中任一项的融合蛋白，其中所述靶向部分包含第一和第二结构域，并且其中所述第一和第二结构域由至多10个氨基酸残基隔开。
8.权利要求7的融合蛋白，其中所述第一和第二结构域由至多5个氨基酸残基隔开。
9.权利要求7的融合蛋白，其中所述第一和第二结构域由0个氨基酸残基隔开。
10.权利要求7的融合蛋白，其中所述靶向部分的第一和第二结构域来源于针对不同受体的配体。
11.权利要求1-3中任一项的融合蛋白，其中所述靶向部分包含肽或由肽组成，所述肽选自由下列组成的组：促性腺素释放素(GnRH)肽，阿片样肽，β-内啡肽，缓激肽，BAM肽，伤害感受肽，强啡肽，甘丙肽，脑啡肽，P物质肽，促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)肽，胃泌素释放肽(GRP)，神经调节肽B肽，铃蟾肽，胃泌素肽，CCK肽，促生长素抑制素(SST)肽，皮质抑素(CST)肽，生长激素释放激素(GHRH)肽，PAR肽，甲状旁腺素(PTH)肽，血管活性肠肽(VIP)，β2肾上腺素受体激动性肽，胃泌素释放肽，降钙素基因相关肽，促甲状腺素(TSH)肽，胰岛素肽，胰岛素样生长因子肽，戈那瑞林肽，促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)肽，促肾上腺皮质素(ACTH)肽，垂体腺苷环化酶激活肽(PACAP)。
12.权利要求1-3中任一项的融合蛋白，其中所述无细胞毒性蛋白酶与所述第一蛋白酶切割位点由至多10个氨基酸残基隔开。
13.权利要求12的融合蛋白，其中所述无细胞毒性蛋白酶与所述第一蛋白酶切割位点由至多5个氨基酸残基隔开。
14.权利要求12的融合蛋白，其中所述无细胞毒性蛋白酶与所述第一蛋白酶切割位点由0个氨基酸残基隔开。
15.权利要求1-3中任一项的融合蛋白，其中所述易位结构域与所述第一蛋白酶切割位点由至多10个氨基酸残基隔开。
16.权利要求15的融合蛋白，其中所述易位结构域与所述第一蛋白酶切割位点由至多5个氨基酸残基隔开。
17.权利要求15的融合蛋白，其中所述易位结构域与所述第一蛋白酶切割位点由0个氨基酸残基隔开。
18.权利要求1-3中任一项的融合蛋白，其中所述易位结构域与所述第二蛋白酶切割位点由至多10个氨基酸残基隔开。
19.权利要求18的融合蛋白，其中所述易位结构域与所述第二蛋白酶切割位点由至多5个氨基酸残基隔开。
20.权利要求18的融合蛋白，其中所述易位结构域与所述第二蛋白酶切割位点由0个氨基酸残基隔开。
21.权利要求1-3中任一项的融合蛋白，其中所述靶向部分与所述第二蛋白酶切割位点由至多10个氨基酸残基隔开。
22.权利要求21的融合蛋白，其中所述靶向部分与所述第二蛋白酶切割位点由至多5个氨基酸残基隔开。
23.权利要求21的融合蛋白，其中所述靶向部分与所述第二蛋白酶切割位点由0个氨基酸残基隔开。
24.权利要求1-3中任一项的融合蛋白，其中所述第一蛋白酶与所述第二蛋白酶相同。
25.权利要求1-3中任一项的融合蛋白，其中所述无细胞毒性蛋白酶是梭菌神经毒素L-链。
26.权利要求1-3中任一项的融合蛋白，其中所述易位结构域是梭菌神经毒素HN结构域。
27.权利要求1-3中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含纯化标签。
28.编码权利要求1-27中任一项所述的多肽融合蛋白的核酸序列。
29.DNA载体，其包含启动子，权利要求28的核酸序列，和终止子；其中所述核酸序列位于所述启动子的下游；并且其中所述终止子位于所述核酸序列的下游。
30.权利要求28所述的DNA序列的互补DNA链。
31.制备权利要求1-27中任一项所述的单链多肽融合蛋白的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达权利要求28所述的核酸序列或权利要求29所述的DNA载体。
32.制备无细胞毒性剂的方法，所述方法包括：
a.提供包含权利要求1-27中任一项所述的单链多肽融合蛋白的溶液；
b.向所述溶液中添加能够切割第一蛋白酶切割位点的第一蛋白酶和能够切割第二蛋白酶切割位点的第二蛋白酶；和
c.切割所述第一蛋白酶切割位点和所述第二蛋白酶切割位点；
由此形成三链融合蛋白。
33.能够通过权利要求32的方法获得的无细胞毒性多肽，其中所述多肽是三链多肽，并且其中：
a.第一链包含无细胞毒性蛋白酶，所述无细胞毒性蛋白酶能够切割靶细胞的胞吐融合器的蛋白；
b.第二链包含易位结构域，其能够将所述无细胞毒性蛋白酶从内体内易位穿过内体膜并且进入靶细胞的细胞质中；
c.第三链包含靶向部分，其能够结合在靶细胞上的结合位点，所述结合位点能够进行胞吞作用从而被引入到所述靶细胞内的内体中；
d.第一链和第二链被二硫键连接在一起；并且第二链和第三链通过共价键连接在一起。
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