MX2013013447A - Proteinas de fusion terapeuticas. - Google Patents
Proteinas de fusion terapeuticas.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a la construcción de una nueva clase de Inhibidores de Secreción Focalizada (TSIs), los cuales comprenden una proteasa no citotóxica, un péptido de transiocación y un péptido de porción de activación, en donde el péptido de porción de activación tiene un dominio N-terminal libre y un dominio C-terminal libre; a un precursor de proteína de fusión de cadena individual de los mismos, y a un método para activar dicho precursor de proteína de fusión de cadena individual.
Description
PROTEINAS DE FUSION TERAPEUTICAS
La presente invención se refiere a la construcción de una nueva clase de Inhibidores de secreción focalizada (TSIs), a un método para la activación de los mismos y al producto activado.
Proteasas no citotóxicas son un grupo bien reconocido de proteasas, las cuales actúan sobre células objetivo al incapacitar la función celular. De manera importante, las proteasas no citotóxicas no matan las células objetivo sobre las cuales actúan. Algunos de los mejores ejemplos conocidos de proteasas no citotóxicas incluyen neurotoxinas clostridiales (por ejemplo, neurotoxina de botilinum , la cual es comercializada bajo nombres tales como DysportMR, NeuroblocMR y BotoxMR) y proteasas de IgA.
Las proteasas no citotóxicas actúan al cortar proteolíticamente proteínas de transporte intracelular conocidas como proteínas SNARE (por ejemplo, SNAP-25, VA P o Syntaxin) - ver Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology" (Biología celular y molecular) (4a edición) John Wiley & Sons, INC. El acrónimo SNARE se deriva del término Soluble NSF Attachment Receptor (Receptor de unión de NSF soluble), donde NSF significa N-etilmaleimida-Sensitive Factor. Las proteínas SNARE son integrales a formación de vesículas intracelulares, y así a secreción de moléculas vía transporte de vesículas a partir de una célula. De acuerdo con esto, una vez entregada a una célula objetivo deseada, la proteasa no citotóxica es capaz de inhibir la secreción celular de la célula objetivo.
Las proteasas no citotóxicas pueden ser empleadas en sus formas naturales o substancialmente naturales (es decir, como holotoxinas, tal como es el caso con DysportMR, NeuroblocMR y BotoxMR), en cuyo caso la focalización de las proteasas a tipos de células específica se basa en (i) administración localizada de la proteasa y/o (ii) la capacidad de unión inherente de la proteasa natural. De manera alternativa, las proteasas no citotóxicas pueden ser empleadas en una forma re-focalizada en la cual la proteasa natural es modificada para incluir un ligando exógeno conocido como una Porción de focalización ™. La TM es seleccionada para proporcionar la especificidad de unión para una célula objetivo deseada y, como parte del proceso de re-focalización, la porción de unión natural de la proteasa no citotóxica puede ser removida.
El presente solicitante es pionero en el concepto y desarrollo de tecnología de re-focalización basada en neurotoxina clostridial, y las proteínas de fusión resultantes son conocidas como Inhibidores de secreción focalizad (TSIs).
El reemplazo de TM puede ser efectuado por técnicas de conjugación química convencionales, los cuales son bien conocidos para una persona experta. A este respecto, se hace referencia a Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate techniques (Técnicas de bioconjugado), Académica Press, y a Wong, S.S. (1 991 ), Chemistry of protein conjugation and cross-linking (Química de conjugación y reticulación de proteínas), CRC Press.
Sin embargo la conjugación química es con frecuencia imprecisa. Por ejemplo, siguiendo la conjugación, una TM puede unirse al resto del
conjugado en más de un sitio de unión. La conjugación química también es difícil de controlar. Por ejemplo, una TM puede unirse al resto de la toxina modificada en un sitio de unión sobre el componente de proteasa y/o sobre el componente de translocación. Esto es problemático cuando la unión a uno de dichos componentes (de preferencia en un solo sitio) es deseada para eficacia terapéutica. Así, la conjugación química resulta en una población mezclada de moléculas de toxina modificada, lo cual es indeseable.
Como una alternativa a conjugación química, el reemplazo de TM puede ser efectuado mediante preparación recombinante de una proteína de fusión de polipéptido de cadena simple la preparación de tales moléculas es descrita en WO98/07864. Sin embargo, los presentes inventores han identificado que la metodología de WO98/07864 no es adecuada para todos los tipos de TM.
Un sistema alternativo a ese de WO98/07864 es descrito en
WO2006/059093. De acuerdo con WO2006/059093, la TM es presentada centralmente (CP) dentro de la proteína de fusión de cadena simple, entre el componente de proteasa no citotoxica y el componente de dominio de translocación. Esto resulta en una proteína de fusión de cadena simple teniendo la siguiente estructura:
NH2 - [componente de proteasa] - [TM] - [componente de translocación] - COOH
Las proteínas de fusión antes descritas son activadas por tratamiento con una proteasa, la cual corta en un sitio ubicado en el
extremo C del componente de proteasa. Este proceso de activación resulta en una proteína de dos cadenas comprendiendo el componente de proteasa unido covalentemente (vía un enlace de disulfuro) al componente de translocación de la proteína de fusión. En el caso de WO2006/059093, la molécula de dos cadenas resultante tiene una TM que es unida a péptido vía su extremo C al extremo N del componente de dominio de translocación. De acuerdo con esto, la porción N-terminal de la TM está entonces libre para ínteractuar y unirse a un receptor deseado. Este arreglo es importante para la clase de TMs que requieren un extremo N libre o una porción N-terminal libre con el fin de unirse a su receptor.
A manera de ejemplo, siguiendo la activación proteolítica, WO2006/059093 proporciona polipéptidos teniendo la siguiente conformación de dos cadenas:
NH2-[componente de proteasa] [TM]-[com ponente de translocación]-COOH
En dicha conformación de dos cadenas, los componentes de TM y translocación son presentados en la forma de una proteína de fusión de cadena simple, en donde el extremo C de la TM es unido a péptido al extremo N del componente de translocación.
Los presentes inventores han encontrado que los sistemas descritos en WO98/07864 y WO2006/059093 no son óptimos para la presentación de todos los tipos de TM, y como tales, pueden resultar en
la producción de proteínas de fusión teniendo capacidad de unión indeseable/reducida por la célula objetivo pretendida.
Por lo tanto, existe la necesidad de un sistema alternativo o mejorado para construir TSIs.
La presente invención se dirige a uno o más de los problemas mencionados antes al proporcionar una proteína de fusión de polipéptido, de cadena simple, que comprende:
(a) Una proteasa no citotóxica o un fragmento de la misma, dicha proteasa o fragmento de proteasa es capaz de cortar una proteína del aparato de fusión exocítica de una célula objetivo;
(b) Una porción de focalización que es capaz de unirse a un sitio de unión en la célula objetivo, dicho sitio de unión es capaz de experimentar endocitosis para ser incorporada en un endosoma dentro de la célula objetivo;
(c) Un dominio de translocación que es capaz de translocar la proteasa o fragmento de proteasa desde dentro de un endosoma, a través de la membrana endosomal y en el citosol de la célula objetivo;
(d) Un primer sitio de corte de proteasa en dicho sitio, la proteína de fusión es cortable por una primera proteasa, en donde el primer sitio de corte de proteasa está ubicado entre la proteasa no citotóxica y el dominio de translocación;
(e) Un segundo sitio de corte de proteasa en dicho sitio la proteína de fusión es cortable por una segunda proteasa, en donde el segundo sitio de corte de proteasa está ubicado entre el dominio de translocación y la porción de focalización ; y
(f) Un enlace covalente entre la porción de focalización y el dominio de translocación, en donde el siguiente corte proteolítico en el segundo sitio de corte de proteasa, la porción de focalización permanece enlazada al dominio de translocación por dicho enlace covalente.
El sistema descrito en WO2006/059093 proporciona TSIs teniendo una TM con un extremo N que está libre para interactuar con un sitio de unión en una célula objetivo. Sin embargo, los presentes inventores han encontrado que el sistema descrito en WO2006/059093 no es adecuado para TMs que requieren tanto un dominio N-terminal libre como un dominio C-terminal libre con el fin de interactuar con un sitio de unión en una célula objetivo.
De esta manera, en contraste con WO206/059093, la presente invención proporciona un sistema para proporcionar TSIs, en donde el componente de TM tiene tanto un dominio N-terminal libre como un dominio C-terminal libre.
En una modalidad, la presente invención proporciona una proteína de fusión de cadena simple teniendo la siguiente orientación de extremo N a extremo C, en donde P 1 y P2 representan el primero y segundo sitios de corte de proteasa:
Nh 4oornponentecteproteasa]-P1]-IT^
Siguiendo el corte en el primer y segundo sitios de corte, dicha proteína de fusión de cadena simple asume la siguiente estructura tri-
cadena , en la cual la TM y componentes de translocación están enlazados covalentemente juntos, y en donde
A) el componente de proteasa está enlazado covalentemente al componente TM:
NhHc riporTentedeprOteasa]-pi]-
o B) el componente de proteasa es enlazado covalentemente componente de translocación :
NHz{a*Tiponen
En otra modalidad , la presente invención proporciona una proteína de fusión de cadena sim ple teniendo la siguiente orientación de extremo N a extremo C , en donde P 1 y P2 representan el primero y segundo sitios de corte de proteasa:
NH^componente de prOteasa] - i ] - [ componente e rar^ocaaány P2 - Wf\-OOO
Sig uiendo el corte en el primero y segundo sitios de corte, dicha proteína de fusión de cadena simple asume la siguiente estructura tri-
cadena, en la cual la TM y componentes de translocación están enlazados covalentemente juntos, y en donde
A) El componente de proteasa está enlazado covalentemente al componente de translocación:
NH^oomponente de proteasa] [componente de transbcabón] [TM]-COOH
I , _l
o B) el componente de proteasa está enlazado covalentemente al componente TM:
NH^componente de proteasa] [componente de transkxadón] [TM XOH
En otra modalidad, la presente invención proporciona una proteína de fusión de cadena simple teniendo la siguiente orientación de extremo N a extremo C, en donde P1 y P2 representan el primer y segundo sitios de corte de proteasa :
NH2fTM]-[P2]- [componente
Siguiendo el corte en el primero y segundo sitios, dicha proteína de fusión de cadena simple asume la siguiente estructura tri-cadena, en la cual la TM y los componentes de translocación están enlazados covalentemente juntos, y en donde
A) el componente de proteasa está enlazado covalentemente al componente de translocación:
NHbfTM] [componente de proteasa] [oomponente de translocactón}<XX)H
o B) el componente de proteasa está enlazado covalentemente al componente TM:
NHHTM] [oomponente de proteasa] [componente de transkxzbón C(X»H
I I
En uso, un polipéptido TSI de la presente invención se une a una célula objetivo, siendo facilitada la unión por TM. El componente de dominio de translocación efectúa entonces el transporte del componente de proteasa no citotóxico en el citosol de la célula objetivo. Una vez dentro, el componente de proteasa no citotóxico inhibe el proceso de fusión exocítica de la célula objetivo. De esta manera, al inactivar el aparato de fusión exocítica de la célula objetivo, el polipéptido de la presente invención inhibe la secreción del mismo. De acuerdo con esto, los polipéptidos TSI de la presente invención pueden ser usados para suprimir o tratar una variedad de condiciones o síntomas patofisiológicos que son enlazados a la secreción celular.
La proteasa no citotóxica
El componente biológicamente activo de los polipéptidos de TSI de a presente invención es una proteasa no citotóxica. Asi, una vez entregado en el citosol de una célula objetivo, el componente de proteasa no citotóxico efectúa corte de SNARE dentro de la célula objetivo deseada. Debido a que las proteínas SNARE son un componente esencial del proceso secretor dentro de las células mamíferas objetivo, la inactivación proteolítica de las mismas inhibe/suprime la secreción de dichas células objetivo.
Las proteasas no citotóxicas son una clase discreta de moléculas que no mata células; en su lugar, actúan al inhibir los procesos celulares diferentes de la síntesis de proteína. Las proteasas no citotóxicas son producidas por una variedad de organismos superiores (por ejemplo, plantas y animales) - un ejemplo de tal organismo superior es el escorpión brasileño. Además, las proteasas no citotóxicas son producidas por una variedad de microorganismos, notablemente bacterias, tales como Clostridium sp. y Neisseria sp.
Las neurotoxinas clostridiales representan un grupo principal de moléculas de toxinas no citotóxicas, y comprenden dos cadenas de polipéptidos unidos juntos por un enlace disulfuro. Las dos cadenas son llamadas la cadena pesada (cadena H), la cual tiene una masa molecular de aproximadamente 100 kDa, y la cadena ligera (cadena L), la cual tiene una masa molecular de aproximadamente 50 kDa. Es la cadena L, la cual posee una función de proteasa y exhibe alta especificidad de substrato para proteínas asociadas a membrana de
plasma y/o vesícula (SNARE) involucradas en el proceso exocítico (por ejemplo, sinaptobrevina, sintaxina, SNAP y/o VAMP). Estos substratos son componentes importantes de una maquinaria secretora de célula.
Neisseria sp. , muy notablemente de la especie N. gonorrhoeae, producen moléculas de toxinas no citotóxicas funcionalmente similares. Un ejemplo de tal proteasa no citotóxica es proteasa de IgA (ver W099/58571 ). Las proteasas de IgA similares son producidas por estreptococos, tal como Streptococcus pneumoniae.
De esta manera, en una modalidad la proteasa no citotóxica de la presente invención puede ser una proteasa de neurotoxina clostridial o una proteasa de IgA (ver, por ejemplo, WO 99/032272). Otro ejemplo de proteasas no citotóxicas es una proteasa de veneno de escorpión, tal como aquéllas del veneno del escorpión brasileño Tityus serrulatus, o la proteasa antareasa (ver, por ejemplo, WO 201 1 /022357).
La porción de focalización (TM)
El componente de la presente invención es responsable de unir el polipéptido de la presente invención a un Sitio de unión en una célula objetivo. De esta manera, el componente TM es un ligando a través del cual un polipéptido de a presente invención se une a una célula objetivo seleccionada.
En el contexto de la presente invención, la célula objetivo puede ser cualquier célula de mamífero (de preferencia humano). Así, la TM puede unirse a una célula no neuronal y/o a una célula neuronal.
El componente de TM de los polipéptidos de la presente invención
tiene tanto una porción N-terminal libre como una porción C-terminal libre. De esta manera, en una modalidad, la TM es capaz de interactuar con el sitio de unión (por ejemplo, un receptor o aceptor) sobre una célula objetivo vía una interacción entre una porción N-terminal de la porción de focalización y un dominio del sitio de unión. En otra modalidad, la TM es capaz de una interacción entre la porción C-terminal de la porción de focalización y un dominio de un sitio de unión. En otra modalidad, la TM es capaz de una interacción dual, en donde una porción N-terminal de la porción de focalización interactúa con un dominio del sitio de unión y una porción C-terminal de la porción de focalización interactúa con un dominio de un sitio de unión. En esta última modalidad, las porciones N- y C-terminales de la TM pueden unirse a los mismos o diferentes dominios de un sitio de unión, y/o puede unirse a dominios en diferentes sitios de unión.
Las TMs adecuadas para uso en los polipéptidos de la presente invención incluyen citocinas, factores de crecimiento, neuropéptidos, lectinas y anticuerpos - este término incluye anticuerpos monoclonales, andamios de unión de proteína, fragmentos de anticuerpos tales como Fab, F(ab) '2 , Fv, ScFv, y anticuerpos de cadena simple, tales como camélidos, etc.
En una modalidad, el componente de TM comprende o consiste de un ligando de péptido (por ejemplo, una hormona de péptido) que se une a un receptor presente en una célula objetivo. En una modalidad, el ligando de péptido tiene una secuencia de aminoácidos de 5-200 residuos de aminoácidos consecutivos. A manera de ejemplo, dicho
ligando de péptido consiste o comprende una secuencia de aminoácidos de 5-150 o 5-1 00 o 5-50 o 5-40 o 5-30 o 5-25 o 5-20 o 7-12 o aproximadamente 1 0 residuos de aminoácidos consecutivos.
El componente de TM comprende una porción N-terminal y una porción C-terminal. Cada una de dichas porciones comprende normalmente al menos 5, al menos 1 0, al menos 1 5, al menos 20 o al menos 25 residuos de aminoácidos consecutivos.
En una modalidad, la TM comprende o consiste de un ligando de péptido (o un análogo del mismo) que se une a un receptor seleccionado de MRGPRXi (por ejemplo, un receptor de péptido de Médula Adrenal Bovina (BAM)) , un receptor de péptido opioide, OPRMi u OPRD1 (por ejemplo, un receptor de péptido de beta-endorfina), BDKRB1 o BDKRB2 (por ejemplo, un receptor de péptido de bradicinina), OPRM 1 u OPRD1 (por ejemplo, un receptor de péptido de met- o leu-encefalina), OPRK1 (por ejemplo, un receptor de péptido de dinorfina), GALR1 , GALR2 o GALR3 (por ejemplo, un receptor de péptido de galanina), OPRL1 (por ejemplo, un receptor de péptido de nociceptina), y TACR1 , TACR2 o TACR3 (por ejemplo, un receptor de péptido de substancia P).
En una modalidad, la TM comprende o consiste de un ligando de péptido (o un análogo del mismo) seleccionado de un péptido de Médula Adrenal Bovina (BAM), un péptido opioide, un péptido de beta-endorfina, un péptido de bradicinina, un péptido de met- o leu-encefalina, un péptido de dinorfina, un péptido de galanina, un péptido de nociceptina, y un péptido de substancia P.
En una modalidad, la TM comprende o consiste de un péptido de
hormona liberadora de gonadotropina (GnRH). El GnRH es una hormona de péptido de 10 aminoácidos. Los aminoácidos N-terminales de GnRH tienen un papel en una activación de receptor, mientras que los aminoácidos C-terminales son requeridos para unión de alta afinidad al receptor GnRH (ver Flanagan, Millar & llling (1 997) Reviews of Reproduction (Revisiones de reproducción), 2, 1 1 3-120, la cual es incorporada aquí en su totalidad por referencia a la presente). La función de GnRH in vivo es actuar sobre receptores de GnRH ubicados sobre la glándula pituitaria anterior y para estimular la síntesis y liberación de gonadotropinas, tal como hormona luteinizante (LH) y hormona estimulante de folículos (FSH). La referencia a péptido GnRH abarca todos los fragmentos de unión funcional, variantes y análogos de los mismos. A manera de ejemplo, el término péptido GnRH abarca un péptido GnRH en el cual un aminoácido de cisteína (flanqueado por dos residuos de aminoácidos aquirales, tal como glicina y/o alanina) ha sido insertado como un aminoácido de reemplazo para posición 6 del péptido GnRH. GnRH también es conocida como Hormona Liberadora de Hormona Luteinizante (LH RH). Ejemplos adicionales incluyen péptidos GnRHI, péptidos GnRHI l y péptidos GnRHI l l , así como el polipéptido precursor de GnRH de 90 aminoácidos de longitud completa y truncamientos del mismo.
En una modalidad, la TM comprende o consiste de un péptido de factor liberador de corticotrofina (CRF). El CRF es una hormona de péptido hipotalámico de 41 aminoácidos que interactúa con receptores CRFi y CRF2. La función principal de CRF in vivo es para estimular la
liberación de ACTH a partir de los corticotropos dentro del lóbulo anterior de la pituitaria. La referencia a péptido de CRF abarca CRF de longitud completa, urocotrina 1 y urocortina 2 , así como todos los fragmentos de unión funciona les, varia ntes y análogos de los mismos.
En u na modalidad, la TM comprende o consiste de un péptido liberador de gastrina (GRP). El G RP es una hormona de péptido de 27 aminoácidos. El GRP regula funciones numerosas de los sistemas nervioso central y gastroi ntestinal , incluyendo liberación de hormonas gastrointestinales, contracción de células de múscu los suaves, y proliferación de células epiteliales y es u n mitógeno potente para tejidos neoplásticos. Referencia a péptido de GRP abarca todos los fragmentos de uniones funcionales, variantes y análogos de los mismos.
En una modalidad , la TM com prende o consiste de una neuromedina B . La neuromedina B es una hormona de péptido de 1 0 aminoácidos. La función de neuromed ina B actúa sobre receptores BBi in vivo y es un mitógeno potente y factor de crecimiento para pulmón normal y neoplástico y para tej ido epitelial gastrointesti nal . Referencia a péptido de neuromedina B abarca todos los fragmentos de uniones funcionales, variantes y análogos de los m ismos. Referencia a Neuromedina B abarca el péptido homólogo h umano, bombesina, e incluye longitud completa : bom besina - un péptido de 1 4 aminoácidos aislado original mente de la piel de u na rana - así como truncamientos y análogos de péptido del m ismo.
En una modalidad, la TM com prende o consiste de gastrina o colecistocinina (CC K) . Gastrina es una hormona de péptido de 1 7
aminoácidos, CCK es una hormona de péptido de 8 aminoácidos. Tanto la gastrina como colecistocinina actúan sobre receptores CCK1 y CCK2 in vivo principalmente dentro del sistema gastrointestinal y CNS para modular la secreción de enzimas pancreáticas y contracción de músculos suaves de la vesícula biliar y estómago, ansiedad, analgesia, excitación y actividad neuroléptica. Referencia a péptidos de gastrina y colecistocinina abarca todos los fragmentos de uniones funcionales, variantes y análogos de los mismos.
En una modalidad, una TM comprende o consiste de un péptido de somatostatina (SST). Ejemplos de TMs de péptido de SST adecuados incluyen SST de longitud completa y cortistatina (CST) . Así como truncamientos y análogos de péptido de las mismas, tal como BIM 23052, BIM 23056 o BIM23268; péptidos de octreótido, péptidos de lanreótido, BIM23027, CYN 154806, BI M23027, péptidos de vapreótido, péptidos de seglítido, y SOM230. Estas TMs se unen a receptor sst, tales como receptores ssti , sst2, s st3 , sst4 y ssts. SST y CST tienen alta homología estructural y se unen a todos los receptores de sst conocidos. La referencia a péptidos SST o CST abarca todos los fragmentos de uniones funcionales, variantes y análogos de los mismos.
En una modalidad, una TM comprende o consiste de un péptido de hormona liberadora de hormona de crecimiento (GNRH). GHRH también es conocido como factor liberador de hormona de crecimiento (GRF o GHRF) o somatocrinina. Péptidos de GHRH adecuados incluyen péptido de GHRH de longitud completa (1 -44), y truncamientos de los mismos, tal como GHRH ( 1 -27, 1 -28, 1 -29), GHRH (1 -37) y GHRH ( 1 -40, 1 -43)-
OH, así como análogos de péptido, tal como BI M 2801 1 o NC-9-96. Referencia a péptido GHRH abarca todos los fragmentos de uniones funcionales, variantes y análogos de los mismos.
En una modalidad, una TM comprende o consiste de un péptido de receptor activado de proteinasa (PAR), por ejemplo, PAR 1 . Los péptidos PAR representan un subtipo único de receptores acoplados a proteína G de receptor de 7-transmembranas ya que son proteolíticamente modificados para exponer un nuevo extremo N extracelular, la cual actúa como un ligando activador atado. Los agonistas PAR1 (tal como TFLLR) han sido identificados porque activan su receptor cognado. Referencia a un péptido PAR abarca todos los fragmentos de uniones funcionales, variantes y análogos de los mismos.
En una modalidad, una TM comprende o consiste de una hormona paratiroidea (PTH). PTH es un péptido que es liberado por la glándula paratiroidea y se une al receptor PTH-1 . Este receptor tiene una distribución esparcida, pero es particularmente abundante en tejidos objetivo de PTH, predominantemente el riñon y en hueso. Referencia a péptido PTH abarca todos los fragmentos de uniones funcionales, variantes y análogos de los mismos.
En una modalidad , una TM comprende o consiste de un péptido que se une a una célula secretora de moco, o a una célula neuronal que controla o dirige la secreción de moco. Por ejemplo, la TM se une a (a) células que secretan mucinas, tales como células calciformes epiteliales y células secretoras de moco de glándulas submucosales, (b) células que secretan componentes acuosos de mocos, tales como células Clara
y células serosas, y/o (c) células que controlan o dirigen la secreción de moco, tales como fibras C "sensorio-eferentes", o fibras de sistemas neurales NANC. Se hace mención particular a las siguientes TMs de péptido: VI P; agonistas de beta2 adrenoreceptor; péptido liberador de gastrina; y péptido relacionado a gene de calcitonina. Referencia a estas TMs de péptido abarca todos los fragmentos de uniones funcionales, variantes y análogos de los mismos. Así, TSIs de acuerdo con esta modalidad tienen aplicación terapéutica para tratar hipersecreción de moco, asma y/o enfermedad pulmonar obstructiva crónica.
En otra modalidad, la TM comprende o consiste de un péptido que se une a una célula endocrina. Se hace mención particular aquí a GHRH; hormona estimulante tiroidea (TSH); insulina, factor de crecimiento similar a insulina; hormona liberadora de TSH (protirelina); hormona liberadora de FSH/LH (gonadorelina); hormona liberadora de corticotrofina (CRH); y ACTH. Referencia a estas TMs de péptido abarca todos los fragmentos de uniones funcionales, variantes y análogos de los mismos. Así, TSIs de acuerdo con esta modalidad tienen aplicación terapéutica para tratar: neoplasia endocrina incluyendo MEN; tiroxicosis y otras enfermedades dependientes de las hipersecreciones de la tiroide; acromegalia, hiperprolactinemia, enfermedad de Cushing y otras enfermedades dependientes de hipersecreción de pituitaria anterior; hiperandrogenismo, anovulación crónica y otras enfermedades asociadas con síndrome ovárico poliquístico.
En otra modalidad, la TM comprende o consiste de un péptido que se une a una célula inflamatoria. Se hace mención particular aquí a TMs de péptido (i) para mastocitos, tal como el dominio C4 de IgE de Fe; (ii) para eosinófilos, tales como ligandos para el receptor de complemento C3a/C4a-R, antígenos reactivos hacia receptor de complemento CR4; (iii) para macrófagos y monocitos, tal como factor estimulante de macrófago, (iv) para neutrófilos, tal como un antígeno asociado con el receptor de complemento iC3b, o I L8. Referencia a estas TMs de péptido abarca todos los fragmentos de uniones funcionales, variantes y análogos de los mismos. Así, TSIs de acuerdo con esta modalidad tienen aplicación terapéutica para tratar alergias (rinitis alérgica estacional (fiebre del heno), conjuntivitis alérgica, rinitis vasomotora y alergia a alimentos), eosinofilia, asma, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso discoide, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, hemorroides, prurito, glomerulonefritos, hepatitis, pancreatitis, gastritis, vasculitis, miocarditis, psoriasis, eczema, fibrosis inducida por radiación crónica, cicatrización de pulmón y otros desórdenes fibróticos.
En otra modalidad, la TM comprende o consiste de un péptido que se une a una célula exócrina. Mención particular se hace ahí a péptido activador de adenil ciclasa de pituitaria (PACAP-38). Referencia a estas TMs de péptido abarca todos los fragmentos de uniones funcionales, variantes y análogos de los mismos. Así, TSIs de acuerdo con esta modalidad tienen aplicación terapéutica para tratar hipersecreción de moco a partir de células secretoras de moco ubicadas en el tracto
alimentario, en particular ubicadas en el colon.
En una modalidad adicional, la TM comprende o consiste de un péptido que se une a una célula inmunológica. Se hace mención aquí a los ligandos tales como fragmento de virus Epstein Barr/característica de superficie. Referencia a estas TMs de péptido abarca todos los fragmentos de uniones funcionales, variantes y análogos de los mismos. Así, TSIs de acuerdo con esta modalidad, tienen aplicación terapéutica para tratar miastenia gravis, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso discoide, transplante de órganos, transplante de tejido, transplante de fluido, enfermedad de Graves, tirotoxicosis, diabetes autoinmune, anemia hemolítica, púrpura trombocitopénica, neutropenia, hepatitis autoinmune crónica, gastritis autoinmune, anemia perniciosa, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Addison, síndrome de Sjogren, cirrosis biliar primaria, polimiositis, escleroderma, esclerosis sistémica, pénfigo vulgar, pénfigo bulloso, miocarditis, carditis reumática, glomerulonefritis (tipo Goodpasture), uveítis, orquitis, colitis ulcerativa, vasculitis, gastritis atrófica, anemia perniciosa, diabetes mellitus tipo 1 .
En una modalidad adicional, la TM comprende o consiste de un péptido que se une a una célula cardiovascular. Se hace mención aquí a trombina y TRAP (péptido de agonista de receptor de trombina), y ligandos que se unen a células endoteliales cardiovasculares, tales como anticuerpos de reconocimiento de antígeno de superficie GP1 b. Referencia a estas TMs de péptido abarca todos los fragmentos de uniones funcionales, variantes y análogos de los mismos. Así, TSIs de
acuerdo con esta modalidad tienen aplicación terapéutica para tratar condiciones cardiovasculares y/o hipertensión.
En una modalidad adicional, la TM comprende o consiste de un péptido que se une a una célula ósea. Se hace mención aquí a ligandos que se unen a osteoblastos para el tratamiento de una enfermedad seleccionada de osteopetrosis y osteoporosis incluyen calcitonina, y a ligandos que se unen a osteoclastos incluyendo factores de diferenciación de osteoclastos (por ejemplo, TRANCE, o RANKL u OPGL). Referencia estas TMs de péptido abarca todos los fragmentos de uniones funcionales, variantes y análogos de las mismas. De esta manera, TSIs de acuerdo con esta modalidad tienen aplicación terapéutica para tratar condiciones óseas.
Secuencias de unión de integrina lineal y cíclica representan un grupo adicional de TMs de péptido de la presente invención. Muchas integrinas reconocen la triple secuencia de péptido Arg-Gly-Asp (RGD) (Ruoslahti, 1996). El motivo RGD es encontrado en alrededor de 100 proteínas incluyendo fibronectina, tenascina, fibrinógeno y vitronectina. La interacción de RGD-integrina es explotada como un mecanismo conservado de entrada celular por muchos patógenos incluyendo coxsackievirus (Roivaninen et al., 191) y adenovirus (Mathias et al., 194). Las secuencias de péptido lineal y cíclico, PLAEIDGIEL y CPLAEIDGIELC, respectivamente, han sido mostradas por unir e internalizar DNA en células que expresan integrina aßß? (Schneider et al., 1999). Referencia a estas TMs de péptido abarca todos los fragmentos de uniones funcionales, variantes y análogos de los mismos.
Otras TMs de la presente invención incluyen aquéllas descubiertas por técnicas de despliegue de fagos, en particular aquéllas que enfocan y son internalizadas por células epiteliales de vías respiratorias humanas. Estas incluyen, THALWHT lineal y cíclica (Jost et a. , 2001 ); LEBP-1 (QPFMQCLCLIYDASC), LEBP-2 (RNVPPIFNDVYWIAF) y (LEBP-3 (VFRVRPWYQSTSQS) (Wu et al. , 2003); CDSAFVTVDWGRSMSLC (Florea et al. , 2003); SERSMNF, YGPHKF, PSGAARA, LPHKSMP, LQHKSMP (Writer et al, 2004); péptidos FSLSKPP, HSMQLST y STQAMFQ (Rahim et al. , 203). Referencia a estas TMs de péptido abarca todos los fragmentos de uniones funcionales, variantes y análogos de los mismos.
En una modalidad, la TM comprende o consiste de primera y segunda porciones (por ejemplo, dominios). En una modalidad, la primera y segunda porciones de la porción de focalización pueden derivarse del mismo ligando (por ejemplo, cualquiera de los ligandos de TM identificados antes). La primera y segunda porciones pueden unirse a los mismos o diferentes sitios en el mismo receptor. De manera alternativa, la primera y segunda porciones pueden unirse en sitios sobre diferentes receptores.
La primera y segunda porciones de la porción de focalización puede derivarse de diferentes ligandos (por ejemplo, cualquiera de los ligandos de TM antes identificados), los cuales pueden unirse a los mismos o diferentes receptores. De acuerdo con esto, la TM puede ser un híbrido de dos TMs. La primera y segunda porciones pueden unirse a la misma de diferentes sitios en el mismo receptor. De manera
alternativa, la primera y segunda porcioces pueden unirse a sitios en diferentes receptores.
La TM puede incluir además tercera y/o subsecuentes porciones de todavía TMs adicionales (por ejemplo , cualqu iera de los ligandos de TM antes identificados) .
En una moda lidad , la primera porción (por ejemplo, dominio) comprende o consiste de un ligando que se une vía una porción N-terminal libre (por ejemplo, un extremo N l ibre) a su receptor objetivo. Un ejemplo de tal ligando es un l igando que se une a un receptor opioide (por ejem plo, un liga ndo que se une a un receptor ORLi , tal como un péptido opioide) . Ejem plos adicionales de péptidos opioides incluyen nociceptina , dinorfina, beta-endorfina y encefalina. Otros ligandos de TM de péptido no opioide incluyen péptido BAM , galanina , substancia P, Gn RH , C RF, G RP , Neuromedina B, bombesina , gastrina, CCK, SST, CST y G HRH (así como truncamientos, variantes y análogos de los mismos) .
En otra modalidad (o la misma) , la segunda porción (por ejemplo, dominio) comprende o consiste de un ligando que se une vía una porción C-terminal libre (por ejemplo, un extremo C libre) a su receptor objetivo. Un ejemplo de tal ligando es un l igando que se une a un receptor de bradicinina (por ejemplo, un péptido de bradicinina) o a un receptor de substancia P (por ejemplo , un péptido de substancia P). Otros ligandos de TM de péptido incluyen péptido BAM , galanina, substancia P, GnRH , CRF, G RP, Neuromedian B, bom besina , gastrina, CCK, SST, CST y GHRH (así como truncamientos, variantes y análogos de los mismos).
A manera de ejemplo, el híbrido TM incluye una primera porción que comprende o consiste de un péptido de nociceptina y una segunda porción que comprende o consiste de un péptido de bradicinina (o un péptido de substancia P). En ejemplos adicionales, la primera porción comprende o consiste de un péptido de nociceptina y la segunda porción comprende o consiste de un péptido seleccionado de un péptido BAM, un péptido opioide, un péptido de beta-endorfina, un péptido de bradicinina, un péptido de encefalina, un péptido de dinorfina, un péptido de galanina y un péptido de substancia P.
En otro ejemplo, la TM híbrida incluye una primera porción que comprende o consiste de un péptido de dinorfina y una segunda porción que comprende o consiste de un péptido de bradicinina (o un péptido de substancia P). En ejemplos adicionales, la primera porción comprende o consiste de un péptido de endorfina y la segunda porción comprende o consiste de un péptido seleccionado de un péptido BAM, un péptido opioide, un péptido de beta-endorfina, un péptido de bradicinina, un péptido de encefalina, un péptido de nociceptina, un péptido de galanina, y un péptido de substancia P.
En otro ejemplo, la TM híbrida incluye una primera porción que comprende o consiste de un péptido de galanina y una segunda porción que comprende o consiste de un péptido de bradicinina (o un péptido de substancia P). En ejemplos adicionales, la primera porción comprende o consiste de un péptido de galanina y la segunda porción comprende o consiste de un péptido seleccionado de un péptido BAM, un péptido opioide, un péptido de beta-endorfina, un péptido de bradicinina, un
péptido de encefalina, un péptido de nociceptina, un péptido de dinorfina, y un péptido de substancia P.
En otro ejemplo, la TM híbrida incluye una primera porción que comprende o consiste de un péptido BAM y una segunda porción que comprende o consiste de un péptido de bradicinina (o un péptido de substancia P). En ejemplos adicionales, la primera porción comprende o consiste de un péptido BAM y la segunda porción comprende o consiste de un péptido seleccionado de un péptido opioide, un péptido de beta-endorfina, un péptido de bradicinina, un péptido de encefalina, un péptido de nociceptina, un péptido de dinorfina, un péptido de galanina, y un péptido de substancia P.
En otro ejemplo, la TM híbrida incluye una primera porción que comprende o consiste de un péptido de beta-endorfina y una segunda porción que comprende o consiste de un péptido de bradicinina (o un péptido de substancia P). En ejemplos adicionales, la primera porción comprende o consiste de un péptido de beta-endorfina y la segunda porción comprende o consiste de un péptido seleccionado de un péptido opioide, un péptido BAM, un péptido de bradicinina, un péptido de encefalina, un péptido de nociceptina, un péptido de dinorfina, un péptido de galanina y un péptido de substancia P.
En otro ejemplo, la TM híbrida incluye una primera porción que comprende o consiste de un péptido de encefalina (por ejemplo, leu o met-encefalina) y una segunda porción que comprende o consiste de un péptido de bradicinina (o un péptido de substancia P). En ejemplos adicionales, la primera porción comprende o consiste de un péptido de
encefalina y la segunda porción comprende o consiste de un péptido seleccionado de un péptido opioide, un péptido de beta-endorfina, un péptido de bradicinina, un péptido BAM , un péptido nociceptina, un péptido de dinorfina, un péptido de galanina y un péptido de substancia P.
En una modalidad, la TM comprende o consiste de primera y segunda porciones (por ejemplo, dominios) que son idénticas (o similares) y, en combinación, proporcionan interacción eficaz con el receptor sobre la célula objetivo. Adicionalmente (por ejemplo, tercera, y opcionalmente adicionales, etc) porciones idénticas/similares también pueden ser incluidas. Así, en esta modalidad, los polipéptidos de la presente invención comprenden una estructura de repetición (por ejemplo, TM-TM; TM-TM-TM etc) de la misma (o una similar) TM.
Ejemplos de tales estructuras de TM de repetición (por ejemplo, TM-TM; TM-TM-TM ; etc) son provistas por una TM seleccionada de un péptido opioide, un péptido de beta-endorfina, un péptido de bradicinina, un péptido BAM, un péptido de nociceptina, un péptido de dinorfina, un péptido de galanina, un péptido de encefalina, un péptido de substancia P, un péptido de GnRH , un péptido de CRF, un péptido de GRP, un péptido de Neuromedina B, un péptido de bombesina, un péptido de gastrina, un péptido de CCK, un péptido de SST, un péptido de CST, y un péptido de GH RH (así como truncamientos, variantes y análogos de los mismos).
En una modalidad, la primera un segunda (y/o subsecuentes) porciones de la TM son separadas por una secuencia separadora, por
ejemplo, una secuencia de péptido. En una modalidad, la primera y segunda (y/o subsecuentes) porciones pueden ser separadas por una secuencia de cuando mucho 40 o cuando mucho 35 o cuando mucho 30 o cuando mucho 25 o cuando mucho 20 o cuando mucho 15 o cuando mucho 10 o cuando mucho 5 residuos de aminoácidos. En una modalidad, la primera y segunda (y/o subsecuentes) porciones pueden ser separadas por una secuencia de 4, 3, 2, 1 o cero residuos de aminoácidos.
Las proteínas de fusión de la presente invención generalmente demuestran una afinidad de unión reducida (en la región de hasta 100 veces) para células objetivo cuando se comparan con la TM "libre" correspondiente (es decir, la TM aislada per se). Sin embargo, a pesar de esta observación , las proteínas de fusión de la presente invención demuestran sorprendentemente buena eficacia. Esto puede ser atribuido a dos características principales. Primero, el componente de proteasa no citotóxico es catalítico - así, el efecto terapéutico de unas cuantas de tales moléculas es amplificado rápidamente dentro de una célula objetivo. En segundo lugar, los receptores presentes en las células objetivo solo necesitan actuar como una puerta para entrada del terapéutico, y no necesariamente necesitan ser estimulados a un nivel requerido con el fin de lograr una respuesta farmacológica mediada por ligando-receptor. De acuerdo con esto, las proteínas de fusión de la presente invención pueden ser administradas en una dosificación que es menor que lo que sería empleado para otros tipos de moléculas terapéuticas, las cuales son administradas normalmente en altas
cantidades de microgramos a miligramos (incluso hasta cientos de miligramos). En contraste, las proteínas de fusión de la presente invención pueden ser administradas cuando mucho a dosificaciones menores, normalmente al menos 1 0 veces menores, y más normalmente a 100 veces menores.
El dominio de translocación
El componente de translocación de la presente invención permite la translocación de la proteasa no citotóxica (o fragmento de la misma) en la célula objetivo de manera que la expresión funcional de la actividad de proteasa ocurre dentro del citosol de la célula objetivo. El componente de translocación es de preferencia capaz de formar poros permeables a iones en membranas lipídicas (por ejemplo, membranas endosomales) bajo condiciones de bajo pH . El componente de translocación puede ser obtenido a partir de una fuente de proteína microbiana, por ejemplo, una fuente de proteína bacteriana o viral. De ahí, en una modalidad, el componente de translocación comprende o consiste de un dominio de translocación de una enzima, tal como una toxina bacteriana. En otra modalidad, el dominio de translocación comprende o consiste del dominio de translocación de una proteína viral. En una modalidad, el componente de translocación de la presente invención puede comprender o consistir de una cadena H de neurotoxina clostridial o un fragmento de la misma, tal como el dominio H (O un fragmento de translocación del mismo) de una neurotoxina clostridial.
El primero y segundo sitios de corte de proteasa
Los polipéptidos de la presente invención comprenden un primer sitio de corte de proteasa. El primer sitio de corte de proteasa permite el corte (por ejemplo, corte controlado) de la proteína de fusión en una posición entre el componente de proteasa no citotóxico y el resto de la proteína de fusión. Este evento de corte sirve para "activar" la estructura de cadena simple (dominio de translocación-proteasa no citotóxica), y resulta en la formación de una estructura di-cadena "activada", en la cual el componente de proteasa no citotóxica es enlazado covalentemente (por ejemplo, disulfuro-unido) al resto de la proteína de fusión.
Los polipéptidos de la presente invención también comprenden un segundo sitio corte de proteasa. El segundo sitio de corte de proteasa permite el corte (por ejemplo, corte controlado) de la proteína de fusión en una posición entre el componente de porción de focalización y el componente de dominio de translocación. Este evento de corte sirve para separar la estructura de cadena simple (dominio de translocación de TM), y resulta en la formación de una estructura di-cadena separada, en la cual el componente de TM está enlazado covalentemente (por ejemplo, disulfuro-unido) al componente de translocación de la proteína de fusión. Al hacerlo así, el ambiente estructural del componente de TM es cambiado de manera que es presentado en una conformación en la cual tanto las porciones N-terminales como C-terminales (por ejemplo, dominios), ya no son péptido-unidos al resto de la proteína de fusión y así son cada uno libremente de interactuar con (por ejemplo, se unen a)
diferentes dominios de unión en uno (o más) receptores.
Así, el corte proteolítico en cualquiera de los sitios de corte de proteasa primero o segundo convierte la proteína de fusión de polipéptido de cadena simple en un polipéptido di-cadena. En el caso de una reacción de corte en el primer sitio de corte de proteasa, el componente de proteasa no citotóxico permanece enlazado por un enlace covalente (por ejemplo, un enlace disulfuro) al componente de dominio de translocación y/o al componente de TM. Dicho enlace covalente puede ser indirecto, por ejemplo, vía una (o más) molécula separadora o enlazadora, la cual es enlazada por sí misma al componente de proteasa no citotóxico, el componente de TM y/o el componente de translocación. De manera similar, en el caso de una reacción de corte en el segundo sitio de corte de proteasa, el componente de dominio translocación permanece enlazado al componente de TM mediante un enlace covalente (por ejemplo, un enlace disulfuro). Dicho enlace covalente puede ser indirecto, por ejemplo, vía una (o más) molécula separadora o enlazadora, la cual es enlazada por sí misma al componente de translocación y/o la TM.
Donde las reacciones de corte ocurren tanto en el primero como segundo sitios de corte de proteasa, la proteína de fusión de polipéptido de cadena simple es convertida en un polipéptido tri-cadena.
Los primero y segundo sitios de corte de proteasa pueden ser introducidos (y/o cualquier secuencia de corte inherente removida) en el nivel de DNA mediante medios convencionales, tal como mediante mutagénesis de sitio-dirigido. La clasificación para confirmar la
presencia de secuencias de corte puede ser realizada manualmente o con la asistencia de programa de cómputo (por ejemplo, el programa apDraw por DNASTAR, Inc.).
Aunque cualquier sitio de corte de proteasa puede ser empleado para uso como el primer sitio de corte de proteasa y/o para uso como el segundo sitio de corte de proteasa en los polipéptidos de la presente invención, se prefieren los siguientes:
Enterocinasa (DDDDKJ.)
Factor Xa (IEGRJ./I DGRJ.)
TEV(virus de jaspeado de tabaco) (ENLYFQjG)
Trombina (LVPR|GS)
PreScission (LEVLFQJ.GP)
Ejemplos no limitantes adicionales incluyen sitio de corte de papaína vegetal, y sitio de corte de papaína de insecto, un sitio de corte de papaína de crustáceo, un sitio de corte de proteasa de rinovirus humano 3C, un sitio de corte de proteasa de enterovirus humano 3C, un sitio de corte de proteasa de virus de jaspeado de tabaco (TEV), un sitio de corte de virus de moteado de vena de tabaco (TVMV), un sitio de corte de subtilisina, un sitio de corte de hidroxilamina, o un sitio de corte de Caspasa 3.
También se encuentra abarcada por el término sitio de corte de proteasa una inteína, la cual es una secuencia de auto-corte. La reacción de auto-empalme es controlable, por ejemplo, al variar la
concentración de agente reductor presente. También abarcada por el término sitio de corte de proteasa se encuentra la secuencia de corte sobre la cual actúa una proteasa no citotóxica (por ejemplo una neurotoxina clostridial). Un ejemplo de tal sitio de corte es una secuencia de sitio de corte de proteína SNARE - ejemplos de secuencias de reconocimiento de sitio de corte natural para un rango de proteasas no citotóxicas son provistos hacia el final de la presente sección de descripción.
El primero y segundo sitio de corte pueden ser iguales o diferentes. El primero y segundo sitios de corte pueden ser cortados por (solamente) la misma o (solamente) por diferentes proteasas.
Como un aspecto separado de la presente invención, los sitios de corte/proteasa de corte antes mencionados pueden ser empleados por separado como un sitio de corte/proteasa "destructor" (discutido más adelante) debería ser incorporado en un polipéptido de la presente invención.
En una modalidad, en el polipéptido de cadena simple, el componente de proteasa no citotóxico y el componente de dominio de translocación están enlazados juntos por un enlace disulfuro. Así, el siguiente corte del primer sitio de corte de proteasa, el polipéptido asume una conformación di-cadena, en donde los componentes de proteasa y translocación permanecen enlazados juntos por el enlace disulfuro. Esta reacción de corte es referida generalmente como el paso de "activación" ya que resulta en el componente de proteasa no citotóxico teniendo actividad de proteasa incrementada (por ejemplo,
óptima).
En una modalidad, el componente de proteasa no citotóxico forma un enlace covalente con el componente de dominio de translocación de la proteína de fusión. Por ejemplo, en una modalidad el residuo de aminoácidos del componente de proteasa que forma el enlace covalente está ubicado dentro de los últimos 20, de preferencia dentro de los últimos 10 residuos de aminoácidos C-terminales del componente de proteasa. De manera similar, en una modalidad el residuo de aminoácido dentro del componente de translocación que forma la segunda parte del enlace covalente puede ubicarse dentro de los primeros 20, de preferencia dentro de los primeros 1 0 residuos de aminoácidos N-terminales del componente de translocación.
Los arreglos de unión covalente anterior tienen la ventaja de que los componentes de proteasa y translocacion están arreglados en una manera similar a aquélla para una proteasa no citotóxica natural (por ejemplo, una neurotoxina clostridial natural). A manera de comparación, refiriéndose a la secuencia de aminoácidos primaria para neurotoxina clostridial natural, los residuos de aminoácidos de cisteína respectivos están separados por entre 8 y 27 residuos de aminoácidos - tomado de Popoff, MR & Marvaud, J-C, 1999, Structural & genomic features of clostridial neurotoxins (Características estructurales y genómicas de neurotoxinas clostridiales) , Capítulo 9, en The Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins (Manual completo de toxinas de proteínas bacterianas)), Ed. Alouf & Freer:
11nformación a partir de cepas proteolíticas solamente
En una modalidad, el componente de proteasa no citotóxica y el primer componente de sitio de corte de proteasa de una proteína de fusión de cadena simple de la presente invención son separados por cuando mucho 30, 25, 20, 15 o 10 residuos de aminoácidos. En una modalidad, dichos dos componentes son separados dentro de la proteína de fusión de cadena simple por cuando mucho 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos. En otra modalidad, dichos dos componentes son separados dentro de la proteína de fusión de cadena simple por cero residuos de aminoácidos.
Así, en una modalidad, la proteasa no citotóxica y el primer sitio de corte de proteasa puede ser separado usando una primera secuencia separadora, siendo ubicada dicha secuencia separadora N-terminal al
primer sito de corte de proteasa y C-terminal al componente de proteasa no citotóxico. En una modalidad , la primera secuencia separadora puede comprender parte o todo el primer sitio de corte de proteasa, o puede ser parte del componente de proteasa no citotóxico.
En una modalidad, el componente de dominio de translocación (o
TM) y el primer componente de sitio de corte de proteasa de la proteína de fusión de cadena simple son separados por cuando mucho 30, 25, 20, 1 5 o 1 0 residuos de aminoácidos. En una modalidad, dichos dos componentes son separados dentro de la proteína de fusión de cadena simple por cuando mucho 5, 4, 3 2 o 1 residuos de aminoácidos. En otra modalidad, dichos dos componentes son separados dentro de la proteína de fusión de cadena simple por cero residuos de aminoácidos.
De esta manera, en una modalidad, el dominio de translocación (o TM) y el primer sitio de corte de proteasa pueden separarse por una segunda secuencia separadora, estando ubicada dicha secuencia separadora C-terminal al primer sitio de corte de proteasa y N-terminal del componente de dominio de translocación (o TM). La segunda secuencia separadora puede ser idéntica a o diferente de la primera secuencia separadora que separa la proteasa no citotóxica y el primer sitio de corte de proteasa. En una modalidad, la segunda secuencia separadora puede comprender parte o todo el segundo sitio de corte de proteasa, o puede ser parte del componente de dominio de translocación.
En una modalidad, el componente de dominio de translocación y el componente de segundo sitio de corte de proteasa de la proteína de
fusión de cadena simple son separados cuando mucho 30, 25, 20, 15 o 10 residuos de aminoácidos. En una modalidad, dichos dos componentes son separados dentro de la proteína de fusión de cadena simple por cuando mucho 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos. En otra modalidad , dichos dos componentes son separados dentro de la proteína de fusión de cadena simple por cero residuos de aminoácidos.
Así, en una modalidad, el dominio de translocación y el segundo sitio de corte de proteasa pueden separarse por una tercera secuencia separadora, estando ubicada dicha tercera secuencia separadora N-terminal o C-terminal al dominio de translocacion. La tercera secuencia separadora puede ser idéntica a (o diferente de) una o ambas de la primera y segunda secuencias separadoras. En una modalidad, la tercera secuencia separadora puede comprender parte o todo el segundo sitio de corte de proteasa, o puede ser parte del componente de dominio translocación.
En una modalidad, la porción de focalización y el segundo sitio de corte de proteasa están separados por cuando mucho 30, 25, 20, 15 o 10 residuos de aminoácidos. En una modalidad, dichos dos componentes son separados dentro de la proteína de fusión de cadena simple por cuando mucho 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos. En otra modalidad , dichos dos componentes son separados dentro de la proteína de fusión de cadena simple por cero residuos de aminoácidos.
Así, siguiendo el corte en el segundo sitio de corte de proteasa, un polipéptido es provisto con una porción de focalización que tiene un dominio N-terminal y un dominio C-terminal que están substancialmente
libres del resto del conjugado. Este arreglo facilita la interacción de los componentes N-terminal y C-terminal de la porción de focalizacion con un sitio de unión en una célula objetivo.
En una modalidad, la porción de focalizacion y el segundo sitio de corte de proteasa pueden separarse por una cuarta secuencia separadora, estando ubicada dicha cuarta secuencia separadora N-terminal o C-terminal de la porción de focalizacion. La cuarta secuencia separadora puede ser idéntica a (o diferente de) una, dos o todas las primera, segunda y tercera secuencias separadoras. En una modalidad, la cuarta secuencia separadora puede comprender parte o todo el segundo sitio de corte de proteasa, o puede ser parte del componente de dominio de translocación.
En una modalidad, la primera proteasa (por la cual el primer sitio de corte de proteasa es cortable) es igual que la segunda proteasa (por la cual el segundo sitio de corte de proteasa es cortable).
Así, en una modalidad, el tratamiento de la proteína de fusión de polipéptido de cadena simple con una proteasa simple puede resultar en el corte tanto del primero como segundo sitios de corte de proteasa.
Una variedad de diferentes moléculas separadoras pueden emplearse en cualquiera de las proteínas de fusión de la presente invención. Ejemplos de tales moléculas separadoras incluyen GS5, GS 10, GS 1 5, GS20, GS25 y Hx27.
El enlace covalente
Las proteínas de fusión de polipéptido de la presente invención
comprenden dos enlaces covalentes: el primero de tales enlaces está entre el componente de proteasa no citotóxica y el resto de la proteína de fusión; y el segundo de tales enlaces está entre la porción de focalizacion y el dominio de translocación. Siguiendo el corte proteolítico en el primero y segundo sitios de corte de proteasa (respectivos), dichos dos enlaces covalentes permanecen intactos. En una modalidad, los enlaces covalentes no son uniones de péptido (es decir, los enlaces covalentes son uniones no de péptido). Por ejemplo, en una modalidad, uno o ambos de dichos enlaces covalentes son uniones disulfuro.
Siguiendo el corte proteolítico en el segundo sitio de corte de proteasa, el enlace covalente permanece intacto. El corte en el segundo sitio de corte de proteasa tiene el efecto de exponer el extremo N (o extremo C) de la porción de focalizacion. Así, el corte en el segundo sitio de corte de proteasa produce una porción de focalizacion teniendo un extremo N libre y un extremo C libre.
De esta manera, siguiendo el corte en el segundo sitio de corte de proteasa el componente de porción de focalizacion ya no es parte de la misma cadena de polipéptido como el componente de dominio de translocación, ya que el enlace de péptido entre la porción de focalizacion y el dominio de translocación ha sido cortado. Sin embargo, la porción de focalizacion permanece unida al dominio de translocación debido a la presencia del enlace covalente.
El enlace covalente puede comprender cualquier enlace covalente capaz de formar o ser formado entre dos residuos de aminoácidos en
una cadena de polipéptido.
En una modalidad, el enlace covalente es un enlace disulfuro. Un enlace disulfuro puede ser formado entre cualquiera de los dos grupos tiol (es decir, -SH) presentes en el polipéptido. A manera de ejemplo, los enlaces disulfuro pueden formarse entre dos residuos de cisteina (o variantes funcionalmente equivalentes de los mismos) ubicados en una cadena de polipéptido.
Así, en una modalidad, un residuo de cisteina ubicado en el componente de dominio de translocación forma un enlace covalente con otro residuo de cisteina ubicado en el componente de porción de focalización. Tal enlace disulfuro permanece intacto siguiendo el corte en el segundo sitio de corte de proteasa.
Los residuos de aminoácidos ubicados en el componente de dominio de translocación y en el componente de porción de focalización que están unidos por el enlace covalente pueden estar presentes de manera natural en dichos componentes. Así, en una modalidad el enlace covalente se forma entre un residuo de aminoácidos presente de manera natural en el componente de dominio de translocación y un residuo de aminoácido presente de manera natural en el componente de porción de focalización. De manera alternativa, uno o ambos de dichos residuos de aminoácidos pueden ser introducidos en el componente de dominio de translocación y/o el componente de porción de focalización.
Los residuos de aminoácidos pueden ser introducidos como substituciones.
En una modalidad, el enlace covalente es un enlace disulfuro
formado entre un residuo de cisteína presente de manera natural en el componente de dominio de translocación y un residuo de cisteína presente de manera natural en el componente de porción de focalización. En una modalidad alternativa, un residuo de cisteína es introducido específicamente ya sea en el dominio de translocación o la porción de focalización, o ambos, con el fin de facilitar o permitir la formación de un enlace disulfuro entre estos dos componentes.
En una modalidad, uno o más residuos de cisteína son introducidos en T yo dominio de translocación. Cuando se hace así, el o los residuos de cisteína introducidos pueden ser flanqueados por dos residuos de aminoácidos aquirales pequeños (tales como glicina y/o alanina). El uso de tales residuos de aminoácidos evita la estructura terciaria inmediata y facilita la formación de unión disulfuro. Los pequeños residuos de aminoácidos aquirales pueden estar presentes de manera natural, o pueden ser introducidos en la TM y/o dominio de translocación.
En una modalidad, además del enlace covalente, se ubica entre el dominio de translocación y la porción de focalización un polipéptido corto (por ejemplo, 1 -20 o 1 -1 0, o 5-1 0 residuos de aminoácidos) que proporciona una estructura de polipéptido secundaria. Dicha estructura de polipéptido secundaria ayuda a posicionar el dominio de translocación y la porción de focalización, ayudando por ello (1 ) la formación del enlace covalente entre la TM y el dominio de translocación, y/o (2) posicionamiento de la TM, de manera que sus extremos C-terminal y N-terminal miran lejos del componente de
translocación.
Así, en una modalidad la estructura de polipéptido secundaria actúa para llevar parte de la porción de focalización hacia estrecha proximidad al dominio de translocación, haciendo por ello la formación del enlace covalente enérgicamente más favorable.
En una modalidad, un polipéptido capaz de formar una estructura de polipéptido secundaria como se describe antes, es una secuencia de polipéptido que contiene al menos un residuo de aminoácido "voluminoso", tal como un residuo de prolina.
Así, en u na modalidad, se ubica entre el dominio de translocación y la porción de focalización un polipéptido comprendiendo al menos un residuo de aminoácido voluminoso. Dicho residuo voluminoso ayuda a formar un doblez en la cadena de polipéptido, de manera que parte de la porción de focalización es llevada a una mayor proximidad con el dominio de translocación que lo que sería el caso de otra manera.
El enlace covalente correspondiente entre el componente de proteasa no citotóxico y el resto de la proteína de fusión (por ejemplo, el componente de translocación y/o el componente de TM) pueden formarse en la misma manera como se describe antes para el enlace covalente entre el componente de dominio de translocación y el componente de TM. Como se describe antes, una o más estructura secundaria y/o uno o más resido de aminoácido voluminoso puede introducirse.
En una modalidad, el enlace covalente entre el componente de proteasa no citotóxico y el resto de la proteína de fusión está entre el
componente de proteasa no citotóxico y el componente de dominio de translocación. En una modalidad, el enlace covalente entre el componente de proteasa no citotóxico y el componente de dominio de translocación emplea residuos de cisteína que ocurren de manera natural ubicados en los componentes respectivos, tal como por ejemplo, uno o más de los residuos de cisteína ilustrados antes en la sección de descripción. De manera alternativa, uno o más residuos de cisteína más apropiados pueden ser introducidos en los componentes respectivos.
La proteína de fusión puede comprender una o más etiquetas de purificación, las cuales son ubicadas N-terminal al componente de proteasa y/o C-terminal ai componente de translocación.
Aunque cualquier etiqueta de purificación puede ser empleada, se prefieren las siguientes:
His-etiqueta (por ejemplo, 6 x histidina), de preferencia como una etiqueta C-terminal y/o N-terminal
MBP-etiqueta (proteína de unión a maltosa), de preferencia como una etiqueta N-terminal
GST-etiqueta (glutationa-S-transferasa), de preferencia como una etiqueta N-terminal
His-MBP-etiqueta, de preferencia como una etiqueta N-terminal
GST-MPB-etiqueta, de preferencia como una etiqueta N-terminal
Tioredoxina-etiqueta, de preferencia como una etiqueta N-terminal
CBD-etiqueta (Dominio de Unión de Quitina), de preferencia como una etiqueta N-terminal.
Aplicaciones terapéuticas
El componente de T dirige la molécula terapéutica de inhibidor de secreción focalizada (TSI) de la presente invención a la célula objetivo deseada.
A manera de ejemplo, el uso de TMs descrito a lo largo de esta especificación (tal como un péptido opioide, un péptido de beta-endorfina, un péptido de bradicinina, un péptido BAM , un péptido de nociceptina, un péptido de dinorfina, un péptido de galanina, un péptido de encefalina, un péitod de substancia P), dirige la molécula terapéutica de inhibidor de secreción focalizada (TSI) de la presente invención a células sensibilizadoras de dolor (por ejemplo, aferentes sensoriales primarios). Las proteínas de fusión resultantes proporcionan así moléculas terapéuticas para suprimir el dolor - El solicitante se refiere a WO2006/059093, WO2007/1 38339 y W096/33273, cada una de las cuales es incorporada en su totalidad por referencia a la presente.
Las TMs descritas a lo largo de esta especificación pueden ser usadas para dirigir las moléculas de inhibidor de secreción focalizada (TSI) de la presente invención a células que promueven la inflamación neurogénica. De acuerdo con esto, las moléculas inhibidoras de secreción focalizada (TSI) de la presente invención proporcionan moléculas terapéuticas para suprimir inflamación neurogénica - el solicitante se refiere a WO201 0/1 38395, WO2010/138392, WO2010/1 382387, WO20101 38382 y WO2012/138379, cada una de las cuales es incorporada en su totalidad por referencia a la presente. Las TMs preferidas para uso en tales moléculas de TSI y terapias incluyen
TMs opioides, tales como nociceptina y dinorfina.
Las TMs descritas a lo largo de esta especificación pueden usarse para dirigir las moléculas de inhibidor de secreción focalizada (TSI) de la presente invención a células que promueven los desórdenes urogenitales-neurológicos, tal como vejiga sobre-activa. De acuerdo con esto, las moléculas de inhibidor de secreción focalizada (TSI) de la presente invención proporcionan moléculas terapéuticas para suprimir desórdenes urogenitales-neurológicos, tal como vejiga sobre-activa - El solicitante se refiere a WO201071 38393, WO20107138389, WO201 0/1 38384 y WO2010/1 38366, cada una de las cuales es incorporada en su totalidad por referencia a la presente. Las TMs preferidas para uso en tales molecúlas de TSI y terapias incluyen TMs opioides, tales como nociceptina y dinorfina.
Las TMs tales como péptido de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) , péptido CRF, péptido GRP, péptido de Neuromedina B, péptido de bombesina, péptido de gastrina, péptido CCK, péptido SST, péptido CST, y péptido GHRH pueden usarse para digirir las moléculas de TSI de la presente invención a células que promueven cáncer o en realidad a células cancerosas per se. De acuerdo con esto, las moléculas de inhibidor de secreción focalizada (TSI) de la presente invención proporcionan moléculas terapéuticas para suprimir condiciones neuroendócrinas tales como acromegalia y enfermedad de Cushing y para suprim ir cáncer (por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer renal, cáncer cerebral, cáncer de pecho, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer adrenal, cáncer esofágico,
linfoma, leucemia, leucemia aguda, cáncer de vejiga, cáncer de hueso, cáncer de intestino, cáncer cervical, leucemia linfocítica crónica, linfoma de Hodgkin, cáncer de hígado, cáncer de piel, cáncer orofaríngeo, mieloma, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer testicular, cáncer uterino o sarcoma de Kaposi - el solicitante se refiere a WO2009/150489, WO2009/1 50470 y WO2010/055358, cada una de las cuales es incorporada en su totalidad por referencia a la presente. Las TMs preferidas para uso en tales moléculas de TSI y terapias incluyen péptidos GHRH , péptidos SST y péptidos CST.
Sitios de corte destructivos
Los polipéptidos de la presente invención pueden ser modificados adicionalmente para reducir o prevenir los efectos laterales no deseados asociados con dispersión hacia áreas no focalizadas. De acuerdo con esta modalidad, el polipéptido comprende un sitio de corte destructivo. El sitio de corte destructivo es distinto del sitio de "activación" (es decir, formación di-cadena) y del segundo sitio de corte de proteasa (es decir, formación de una TM con dominios C-terminal y N-terminal). Dicho sitio de corte destructivo es cortable por una tercera proteasa y no por la primera o segunda proteasas. Más aún, cuando se corta así en el sitio de corte destructor por la tercera proteasa, el polipéptido de la invención tiene potencia reducida (por ejemplo, capacidad de unión reducida a la célula objetivo pretendida, actividad de translocación reducida y/o actividad de proteasa no citotóxica reducida). A manera de ejemplo, el solicitante se refiere a WO 201 0/094905 y WO 02/044199,
cada una de las cuales es incorporada aquí en su totalidad por referencia.
Así, de acuerdo con esta modalidad , la presente invención proporciona un polipéptido que puede ser inactivado controlablemente y/o destruido en un sitio fuera de sitio.
En una modalidad, el sitio de corte destructivo es reconocido y cortado por una tercera proteasa (es decir una proteasa destructiva) seleccionada de una proteasa circulante (por ejemplo, una proteasa extracelular, tal como un proteasa de suero o una proteasa de la cascada de coagulación sanguínea), una proteasa asociada con tejido (por ejemplo, una metaloproteasa de matriz (MMP), tal como un MMP de músculo) y una proteasa intracelular (de preferencia, una proteasa que está ausente de la célula objetivo). Así, en uso, si un polipéptido de la presente invención se volviera dispersado de su célula objetivo pretendida y/o fuera captado por una célula no objetivo, el polipéptido se volverá inactivado por corte del sitio de corte destructivo (mediante la tercera proteasa).
Las metaloproteasas de matriz (MMPs) son un grupo preferido de proteasas destructivas en el contexto de la presente invención. Dentro de este grupo, ADMA17 (EC 3.4.24.86, también conocido como TACE), es preferido y corta una variedad de proteínas de superficie celular, ancladas en membrana, para "despojarse" de los dominios extracelulares. MMPs preferidas adicionales incluyen adamalisinas, serralisina y astacinas. Otro grupo de proteasas destructivas preferidas es una proteasa de sangre de mamífero, tal como Trombina, Factor de
coagulación VI la , Factor de coagulación IXa, Factor de coagulación Xa, Factor de coagulación Xla, Factor de coagulación XI la, Calicreína, Proteína C y proteasa de serina asociada MBP.
De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de polipéptido descrita antes.
En un aspecto preferido de la presente invención, la secuencia de DNA es preparada como parte de un vector de DNA, en donde el vector comprende un promotor y terminador. La secuencia de DNA que codifica la proteína de fusión de polipéptido descrita antes está ubicada corriente abajo del promotor; el terminador está ubicado corriente debajo de la secuencia de ácido nucleico.
En una modalidad preferida, el vector tiene un promotor seleccionado de:
Promotor Agente de inducción Condición de inducción típica
tac (híbrido) I PTG 0.2 mM (0.05-2.0 mM)
AraBAD L-arabinosa 0.2% (0.002-0.4%)
Operador T7-lac IPTG 0.2 mM (0.05-2.0 mM)
La construcción de DNA de la presente invención es diseñada de preferencia in silico, y entonces sintetizada mediante técnicas de síntesis de DNA convencionales.
La información de secuencia de DNA antes mencionada es
modificada opciona lmente para derivación de codones de acuerdo con el sistema de expresión de célu la huésped final (por ejem plo, E. coli) que va a ser em pleado.
El esqueleto de DNA es clasificado de referencia para cualquier secuencia de ácido nucleico inherente, la cual cuando se transcribe y traduce produciría una secuencia de aminoácidos correspondiente al sitio de corte de proteasa codificado por la segunda secuencia codificadora de péptido. Esta clasificación puede ser realizada manualmente o con la ayuda de programa de cómputo (por ejemplo, el programa MapDraw por DNSTAR , I nc.)
De acuerdo con otra modalidad de la presente i nvención, se proporciona un método para preparar una proteína de fusión de polipéptido de cadena simple como se describe antes, com prendiendo expresar una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión descrita antes, o un vector de DNA como se describe antes, en una célula huésped .
De acuerdo con una modalidad adicional de la presente invención , se proporciona un método para preparar un agente no citotóxico, que comprende:
a . proporcionar una solución conteniendo u na proteína de fusión de polipéptido de cadena sim ple de la invención ;
b. adicionar a dicha sol ución una primera proteasa capaz de cortar el primer sitio de corte de proteasa y una segunda proteasa capaz de cortar el segundo sitio de corte de proteasa;
c. cortar el primer sitio de corte de proteasa y el segundo sitio de
corte de proteasa;
formando por ello una proteína de fusión tri-cadena.
En una modalidad, la primera proteasa y la segunda proteasa son adicionadas secuencialmente. En una modalidad alternativa, la segunda proteasa es adicionada antes de la primera proteasa. Todavía en otra modalidad, la primera proteasa y la segunda proteasa son adicionadas simultáneamente.
Este aspecto proporciona un polipépitdo tri-cadena. En más detalle, el polipéptido tri-cadena resultante normalmente tiene una estructura en donde:
a. La primera cadena comprende la proteasa no citotóxica, o un fragmento de la misma, dicha proteasa o fragmento de proteasa es capaz de cortar una proteína del aparato de fusión exocítico de una célula objetivo;
b. la segunda cadena comprende el dominio de translocación que es capaz de translocar la proteasa o fragmento de proteasa desde dentro de un endosoma, a través de la membrana endosomal y hacia el citosol de la célula objetivo;
c. la tercera cadena comprende la porción de focalización que es capaz de unión a un sitio de unión sobre la célula objetivo, dicho sitio de unión es capaz de experimentar endocitosis para ser incorporado en un endosoma dentro de la célula objetivo;
d. la primera y segunda cadenas son enlazadas a disulfuro juntas; y el segundo y tercer dominios son enlazados juntos mediante un enlace covalente no de péptido.
Entrega de polipéptido
De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una proteína de fusión de polipéptido de cadena simple como se describe antes, o un polipéptido no citotóxico como se describe antes, para usarse para tratar, prevenir o mejorar una condición médica.
En uso, la presente invención emplea una composición farmacéutica, comprendiendo un polipéptido, junto con al menos un componente seleccionado de un portador farmacéuticamente aceptable, excipiente, auxiliar, propulsor y/o sal.
Los polipéptidos de la presente invención pueden ser formulados para infusión oral, parenteral, continua, implante, inhalación o aplicación tópica. Las composiciones adecuadas para inyección pueden estar en la forma de soluciones, suspensiones o emulsiones, o polvos secos los cuales son disueltos o suspendidos en un vehículo adecuado antes de usarse.
Los medios de entrega local pueden incluir un aerosol, u otro atomizador (por ejemplo, un nebulizador) . A este respecto, una formulación de aerosol de un polipéptido permite la entrega a los pulmones y/u otros pasajes nasal y/o bronquial o de vías respiratorias. Una ruta preferida de administración es seleccionada de: inyección sistémica (por ejemplo, iv), laparoscópica y/o localizada (por ejemplo, inyección transesfenoidal directamente hacia una célula objetivo, tal como un tumor).
En el caso de formulaciones para inyección, es opcional incluir una substancia farmacéuticamente activa para asistir en la retención en
0 reducir la remoción del polipéptido desde el sitio de admi nistración. Un ejemplo de tal substancia farmacéuticamente activa es un vasoconstrictor, tal como adrenal ina . Tal formulación confiere la ventaja de aumentar el tiempo de residencia de polipéptido siguiendo la administración y asi aumentar y/o intensificar su efecto.
Los rangos de dosificación para administración de los polipéptidos de la presente invención son aquéllos para producir el efecto terapéutico deseado. Se apreciará que el rango de dosificación requerido depende de la naturaleza precisa del pol ipéptido o composición , la ruta de administración , la naturaleza de la formulación , la edad del paciente, la naturaleza, grado o severidad de la condición del paciente, contraindicaciones, si hay, y el juicio del médico encargado. Variaciones en estos n iveles de dosificación pueden ser ajustadas usando rutinas em píricas estándares para optim ización .
Las dosificaciones diarias adecuadas (por kg de peso de paciente) están ene I rango de 0.0001 -1 mg/kg , de preferencia 0.0001 -0.5 mg/kg, más preferiblemente 0.002-0.5 mg/kg y en particular de preferencia 0.004-0.5 mg/kg . La dosificación unitaria puede variar desde menos de
1 microgramo hasta 30 mg , pero normalmente estará en la región de 0.01 a 1 mg por dosis, la cual puede ser admin istrada diariamente o de preferencia con menos frecuencia , tal como semanalmente o cada seis meses. U n régimen de dosificación particularmente preferido se basa en 2.5 ng de polipéptido como la dosis 1 X. A este respecto, las dosificaciones preferidas están en el rango 1 X- 1 00X (es decir, 2.5-250 ng).
Las formas de dosificación de fluido son preparadas normalmente utilizando el polipéptido y un vehículo estéril libre de pirógeno. El polipéptido, dependiendo del vehículo y concentración usado, puede ser ya sea disuelto o suspendido en el vehículo. Para preparar soluciones, el polipéptido puede ser disuelto en el vehículo, haciéndose isotónica la solución si es necesario mediante la adición de cloruro de sodio y esterilizada por filtración a través de un filtro estéril usando técnicas asépticas antes de llenarse en viales estériles adecuados o ampolletas y sellado. De manera alternativa, si la estabilidad de solución es adecuada, la solución n sus recipientes sellados puede ser esterilizada mediante autoclave. Ventajosamente, los aditivos tales como agentes amortiguadores, solubilizantes, estabilizantes, conservadores o bactericidas, de suspensión o emulsificantes, y/o agentes anestésicos locales, pueden disolverse en el vehículo.
Los polvos secos, los cuales son disueltos o suspendidos en un vehículo adecuado antes del uso, pueden prepararse al llenar los ingredientes pre-esterilizados en un recipiente estéril usando una técnica aséptica en un área estéril. De manera alternativa, los ingredientes pueden ser disueltos en recipientes adecuados usando técnica aséptica en un área estéril. El producto es secado por congelación entonces y los recipientes son sellados asépticamente.
Las suspensiones parenterales, adecuadas para inyección transmuscular, subcutánea o intradérmica, son preparadas substancialmente en la misma manera, excepto que los componentes estériles son suspendidos en el vehículo estéril, en lugar de ser
disueltos y la esterilización no puede ser lograda por filtración. Los componentes pueden ser aislados en un estado estéril o de manera alternativa pueden ser esterilizados después del aislamiento, por ejemplo, mediante irradiación gamma.
Ventajosamente, un agente de suspensión por ejemplo, polivinilpirrolidona, es incluido en la composición o composiciones para facilitar la distribución uniforme de los componentes.
Sección de definiciones
Porción de focalización ™ significa cualquier estructura química que interactúa funcionalmente con un Sitio de unión para provocar una asociación física entre el polipéptido de la invención y la superficie de una célula objetivo. El término TM abarca cualquier molécula (es decir, una molécula que ocurre de manera natural, o una variante química/físicamente modificada de la misma) que es capaz de unirse a un Sitio de unión sobre la célula objetivo, dicho Sitio de unión es capaz de internalización (por ejemplo, formación de endosoma) - también referido como endocitosis mediada por receptor. La TM puede poseer una función de translocación de membrana endosomal, en cuyo caso componentes de Dominio de translocación y TM separados no necesitan estar presentes en un agente de la presente invención. A lo largo de la descripción precedente, las TMs específicas han sido descritas. La referencia a dichas TMs es meramente ejemplar, y la presente invención abarca todas las variantes y derivados de las mismas, los cuales retengan la capacidad de unión (es decir, focalización) básica de las
TMs ejemplificadas.
Como se menciona previamente, las TMs preferidas incluyen anticuerpos (por ejemplo, fragmentos de anticuerpos) y andamios de unión; en especial anticuerpos/fragmentos comercialmente disponibles y andamios diseñados para el propósito de unión (por ejemplo, específicamente) a células objetivo.
Los andamios de proteína representan una nueva generación de marcos de trabajo de unión universales para complementar el repertorio de expansión de anticuerpos monoclonales terapéuticos y derivados, tales como scFvs, moléculas Fab, dAbs (anticuerpos de dominio simple), camélidos, diacuerpos y minicuerpos, cada uno de los cuales puede emplearse como una TM de la presente invención. Los sistemas de andamio crean o modifican dominios de reconocimiento de proteína conocidos ya sea a través de la creación de novedosos andamios o modificación de dominios de unión de proteína conocidos. Tales andamios incluyen pero no están limitados a:
(i) andamios basados en proteína A - aficuerpos (Nord, K. et al 1997 "Binding proteins selected from combinatorial libraires of an alpha-helical bacterial receptor domain" (Proteínas de unión seleccionadas de genotecas combinatoriales de un dominio de receptor bacteriano alfa-helicoidal), Nat Biotechnol 1 5, 772-777) ;
(ii) andamios basados en lipocalina - anticalinas (Skerra 2008 "Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities" (Proteínas de unión alternativas: anticalinas -
aprovechamiento de la plasticidad estructural del bolsillo de ligando de lipocalina para diseñar novedosas actividades de unión), FEBS J. 275:277-83);
(iii) andamios basados en fibronectina - adnectina (Dineen et al 2008 "The Adnectin CT-322 is a novel VEGF receptor 2 inhibitor that decreases tumor burden in an orthotopic mouse model of pancreatic cáncer" (El Adnectin CT-322 es un novedosos inhibidor de receptor de VEGF 2 que disminuye la carga de tumor en un modelo de ratón ortotópico de cáncer pancreático), BMC Cáncer 8:352);
(iv) avímeros (Sl lverman et al 2005 "Multivalent avimer proteins evolved by exon shuffling of a family of human receptor domains" (Proteínas de avímero multivalentes evolucionadas por lanzadera de exones de una familia de dominios de receptores humanos). Nat Biotechnol 23: 1 556-61 );
(v) andamios basados en anquirina - darpinas (Zahnd et a 2006
"Selection and characterization of Her2 binding-designed ankyrin repeat proteins" (Selección y caracterización de proteínas de repetición de anquirina diseñadas con unión de Her2), J. Biol Chem . 281 :35167-75); y (vi) andamios de centirina - basados en un doblez de proteína que tiene homología estructural significativa a dominios de Ig con lazos que son análogos a CDRs. Los dominios de Ig son un módulo común en proteínas humanas y han sido aplicados ampliamente como proteínas de andamio alternativas. Cada una de las publicaciones de "andamio" anteriores es incorporada en la presente (en su totalidad) por referencia a las mismas.
Los andamios de unión pueden ser usados para focalizar tipos de células particulares vía interacción con proteínas de superficie celular específicas, receptores u otros epitopes de superficie celular, tales como grupos de azúcares. Tales andamios modificados pueden ser diseñados sobre polipéptidos basados en proteasa no citotóxica recombinante de la presente invención.
La TM de la presente invención se une (de preferencia une específicamente) a la célula objetivo en cuestión. El término "se une específicamente" de preferencia significa que una TM dada se une a la célula objetivo con una afinidad de unión (Ka) de 106 M"1 o mayor, de preferencia 107 M' 1 o mayor, más preferiblemente 1 08 M- 1 o mayor, y muy preferiblemente, 109 M 1 o mayor.
La referencia a TM en la presente especificación abarca fragmentos y variantes de los mismos, los cuales retienen la capacidad para unir a la célula objetivo en cuestión. A manera de ejemplo, una variante puede tener al menos 80%, de preferencia al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, y muy preferiblemente al menos 97 o al menos 99% de homología de secuencia de aminoácidos con la TM de referencia. Así , una variante puede incluir uno o más análogos de un aminoácido (por ejemplo, un aminoácido no natural), o un enlace substituido. Además, a manera de ejemplo, el término fragmento, cuando se usa en relación a una TM, significa un péptido que tiene al menos diez, de preferencia al menos veinte, más preferiblemente al menos treinta, y muy preferiblemente al menos cuarenta residuos de aminoácidos de la TM de referencia. El término fragmento también se
refiere a las variantes antes mencionadas. Así, a manera de ejemplo, un fragmento de la presente invención puede comprender una secuencia de péptido teniendo al menos 10, 20, 30 0 40 aminoácidos, en donde la secuencia de péptido tiene al menos 80% de homología de secuencia sobre una secuencia de péptido correspondiente (de contiguos) aminoácidos del péptido de referencia.
Es rutina confirmar que una TM se una a la célula objetivo seleccionada. Por ejemplo, un experimento de desplazamiento radioactivo simple puede emplearse en el cual tejido o células representativas de una célula objetivo en cuestión son expuestas a TM etiquetada (por ejemplo, tritiada) en la presencia de un exceso de TM no etiquetada. En tal experimento, las proporciones relativas de unión específica y no específica pueden ser valoradas, permitiendo por ello la confirmación de que la TM se une a la célula objetivo. Opcionalmente, el ensayo puede incluir uno o más antagonistas de unión, y el ensayo puede comprender adicionalmente observar una pérdida de unión de TM. Ejemplos de este tipo de experimento pueden encontrarse en Hulme, E.C. (1990), Receptor-binding studies, a brief outline (Estudios de unión de receptor, una breve reseña), pp. 303-31 1 , en Receptor Biochemistry, A Practical Approach (Bioquímica de receptores, una aproximación práctica), Ed. E.C. Hulme, Oxford University Press.
En el contexto de la presente invención, la referencia a una TM de péptido abarca análogos de péptido del mismo, siempre y cuando el análogo se una al mismo receptor que la TM de "referencia" correspondiente. Dichos análogos pueden incluir residuos sintéticos
tales como:
ß-Nal = ß-naftilalanina
ß-Pal = ß-piridilalanina
hArg(Bu) = N-guanidino-(butil)-homoarginina
hArg(Et)2 = N , N'-guanidino-(dimetil)-homoarg¡nina
hArg(CH2CF3) 2 = N, N'-guanidino-b¡s-(2,2,2-trifluoroetil)-homoarginina
Lys(Me) = Ne-met¡llisina
Lys(iPr) = Ne-isopropillisina
AmPhe = aminometilfenilalanina
AChxAla = aminociclohexilalanina
Abu = ácido a-aminobutírico
Tpo = 4-tiaprolina
MeLeu = N-metilleucina
Orn = ornitina
Nle = norleucina
Nva = norvalina
Trp(Br) = 5-bromo-triptófano
Trp(F) = 5-fluoro-triptófano
Trp(N 02) = 5-nitro-triptófano
Gaba = ácido ?-aminobutírico
Bmp = J-mercaptopropionilo
Ac = acetilo
Pen = pencilamina
Los polipéptidos de la presente invención pueden carecer de un dominio He o Hcc funcional de una neurotoxina clostridial. De acuerdo
con esto, dichos polipéptidos no son capaces de unirse a membranas sinaptosomales de rata (vía un componente de He clostridial) en ensayos de unión como se describe en Shone et al. (1985) Eur. J. Biochem. 151, 75-82. En una modalidad, los polipéptidos carecen de al menos 50 aminoácidos C-terminales de una holotoxina de neurotoxina clostridial. En otra modalidad, los polipéptidos carecen de al menos 100, 150, 200, 250, o 300 residuos de aminoácidos C-terminales de una holotoxina de neurotoxina clostridial. De manera alternativa, la actividad de unión He puede negarse/reducirse mediante mutagénesis -a manera de ejemplo, haciendo referencia a BoNT/A por conveniencia, modificación de una o dos mutaciones de residuos de aminoácidos (W1266 a L y Y1267 a F) en el bolsillo de unión de gangliósido provoca que la región He pierda su función de unión de receptor. Mutaciones análogas pueden hacerse a componentes de péptido clostridial no de serotipo A, por ejemplo, una construcción basada en botulinum B con mutaciones (W1262 a L y Y1263 a F) o botulinum E (W1224 a L y Y1225 a F). Otras mutaciones al sitio activo logran la misma ablación de actividad de unión de receptor He, por ejemplo, Y1267S en la toxina de botulinum tipo A y el residuo altamente conservado correspondiente en las demás neurotoxinas clostridiales. Detalles de estas y otras mutaciones se describen en Rummel et al (2004) (Molecular Microbiol. 51:631-634), la cual es incorporada aquí por referencia.
El péptido He de una neurotoxina clostridial natural comprende aproximadamente 400-440 residuos de aminoácidos, y consiste de dos dominios funcionalmente distintos de aproximadamente 25kDa cada uno,
a saber la región N-term inal (com únmente referida como el dominio o péptido H CN) y la región C-term inal (com únmente referida como el dominio o péptido Hcc) - Más aún , se ha documentado bien que la región C-terminal (Hcc) , la cual constituye los residuos de aminoácidos 160-200 C-terminales, es responsable de un ión de una neurotoxina clostridial a sus receptores de célu las naturales, a saber a terminales nerviosas en la unión neuromuscular. Así, la referencia a través de esta especificación a una cadena pesada clostridial que carece de un péptido (o dom in io) de He de cadena pesada funcional , de manera q ue la cadena pesada es incapaz de unirse a receptores de superficie celular a los cuales una neurotoxina clostridia l natural se une, significa que la cadena pesada clostridial sim plemente carece de un péptido de Hcc funcional . En otras palabras, la región de péptido de Hcc es ya sea parcial o completamente supri mido, o mod ificado de otra manera (por ejemplo, a través de tratam iento químico o proteolítico convencional) para inactivar su capacidad de unión natural para terminales nerviosas en la función neuromuscular.
Así, en una modalidad, un péptido de H N clostridial de la presente invención carece de parte de una porción de péptido C-term inal (Hcc) de una neurotoxina clostridial y así carece de la función de unión de He de neurotoxina clostridial natural . A manera de ejem plo , en una modalidad, el péptido de H clostridial C-term inalmente extend ido carece de los 40 residuos de am inoácidos C-termi nales , o los 60 residuos de aminoácidos C-terminales, o los 80 residuos de aminoácidos C-terminales, o los 100 residuos de am inoácidos C-terminales, o los 1 20 residuos de
aminoácidos C-terminales, o los 140 residuos de aminoácidos C-terminales, o los residuos de 150 aminoácidos C-terminales, o los 160 residuos de aminoácidos C-terminales de una cadena pesada de neurotoxina clostridial. En otra modalidad, el péptido de HN clostridial de la presente invención carece de la porción de péptido C-terminal (Hcc) de una neurotoxina clostridial y así carece de la función de unión de He de neurotoxina clostridial natural. A manera de ejemplo, en una modalidad, el péptido de HN clostridial carece de los 165 residuos de aminoácidos C-terminales, o los 170 residuos de aminoácidos C-terminales, o los 1 75 residuos de aminoácidos C-terminales, o los 180 residuos de aminoácidos C-terminales, o los 1 85 residuos de aminoácidos C-terminales, los 1 90 residuos de aminoácidos C-terminales, o los 1 95 residuos de aminoácidos C-terminales de una cadena pesada de neurotoxina clostridial. A manera de ejemplo adicional, el péptido de HN clostridial de la presente invención carece de una secuencia de referencia de Hcc clostridial seleccionada del grupo que consiste de:
Neurotoxina de botulinum tipo A - residuos de aminoácidos (Y1 1 1 1 -L1296)
Neurotoxina de botulinum tipo B - residuos de aminoácidos
(Y1098-E1291 )
Neurotoxina de botulinum tipo C - residuos de aminoácidos (Y1 1 12-E 1 291 )
Neurotoxina de botulinum tipo D - residuos de aminoácidos (Y1099-E1276)
Neurotoxina de botulinum tipo E - residuos de aminoácidos (Y1086-K1 252)
Neurotoxina de botulinum tipo F - residuos de aminoácidos (Y1 106-E1 274)
Neurotoxina de botulinum tipo G - residuos de aminoácidos
(Y1 106-E1297)
Neurotoxina de tétanos - residuos de aminoácidos (Y1 128-D1315) Las secuencias de referencia antes identificadas deberían ser consideradas una guía ya que pueden ocurrir variaciones ligeras de acuerdo con los sub-serotipos.
La proteasa de la presente invención abarca todas las proteasas no citotóxicas que son capaces de cortar una o más proteínas del aparato de fusión exocítica en células eucarióticas. La proteasa de la presente invención es de preferencia una proteasa bacteriana (o fragmento de la misma). Más preferiblemente, la proteasa bacteriana es seleccionada de los géneros Clostridium o Neisseria/Streptococcus (por ejemplo, una cadena L clostridial, o una proteasa de IgA neisserial de preferencia de N. gonorrhoeae o S. pneumoniae).
La presente invención también abarca proteasas nocitotóxicas variantes (es decir, variantes de moléculas de proteasa que ocurren de manera natural), siempre y cuando las proteasas variantes todavía demuestren la actividad de proteasa requerida. A manera de ejemplo, una variante puede tener al menos 70% , de preferencia al menos 80%, más preferiblemente al menos 90%, y muy preferiblemente al menos 95 o al menos 98% de homología de secuencia de aminoácidos con una
secuencia de proteasa de referencia. Así, el término variante incluye proteasas no citotóxicas teniendo actividad de endopeptidasa intensificada (o disminuida) - se hace mención particular aquí a Kcat/Km incrementada de mutantes de BoNT/A Q161A, E54A y K165L ver Ahmed, S.A. (2008) Protein J. DOI 10.1007/s10930-007-9118-8, la cual es incorporada por referencia a la misma. El término fragmento, cuando se usa en relación a una proteasa, normalmente significa un péptido teniendo al menos 150, de preferencia al menos 200, más preferiblemente al menos 250, y muy preferiblemente al menos 300 residuos de aminoácidos de la proteasa de referencia. Como con el componente de "fragmento" de TM (discutido antes), los "fragmentos" de proteasa de la presente invención abarcan fragmentos de proteasas variantes basadas en una secuencia de referencia.
La proteasa de la presente invención demuestra de preferencia una actividad de serina o metaloproteasa (por ejemplo, actividad de endopeptidasa). La proteasa es de preferencia específica para una proteína SNARE (por ejemplo, SNAP-25, sinaptobrevina/VAMP, o sintaxina).
Se hace mención particular a los dominios de proteasa de neurotoxinas, por ejemplo, los dominios de proteasa de neurotoxinas bacterianas. Así, la presente invención abarca el uso de dominios de neurotoxina, los cuales pueden ocurrir en la naturaleza, así como versiones recombinantemente preparadas de dichas neurotoxinas que ocurren de manera natural. Las neurotoxinas ejemplares son producidas mediante clostridios, y el término neurotoxina clostridial abarca
neurotoxinas producidas por C. tetani (TeNT) ; y por C. botulinum (BoNT) serotipos A-G, así como las neurotoxinas similares a BoNT estrechamente relacionadas producidas por C. barata y C. butyricum. Las abreviaturas antes mencionadas son usadas a través de la presente especificación . Por ejemplo , la nomenclatura BoNT/A denota la fuente de neurotoxina como BoNT (serotipo A) .
BoNTs com parten una estructura com ún , siendo proteínas dicadena de ~1 50 kDa , consistiendo de una cadena pesada (cadena H) de ~1 00 kDa un ida covalentemente por un enlace disulfuro simple a una cadena ligera (cadena L) de ~50 kDa . La cadena H consiste de dos dominios, cada uno de ~50 kDa . El domi nio C-terminal (He) es requerido para la unión neuronal de alta afinidad, m ientras que el dominio N-terminal (H N) es propuesto para ser involucrado en translocación de membrana . La cadena L es una metaloproteasa dependiente de cinc responsa ble del corte de la proteína SNARE de substrato.
El término fragmento de cadena L significa un componente de la cadena L de una neurotoxina, dicho fragmento dem uestra una actividad de metaloproteasa y es capaz de cortar proteol íticamente una proteína asociada a membra na de plasma y/o vesícula involucrada en exocitosis celular.
Ejem plos de secuencias de proteasa adecuadas (referencia) incluyen :
Neurotoxina de botulin um tipo A - residuos de am inoácidos ( 1 -448)
Neurotoxina de botulinum tipo B - residuos de aminoácidos (1- 440)
Neurotoxina de botulinum tipo C - residuos de aminoácidos (1- 441)
Neurotoxina de botulinum tipo D - residuos de aminoácidos (1- 445)
Neurotoxina de botulinum tipo E - residuos de aminoácidos (1- 422)
Neurotoxina de botulinum tipo F - residuos de aminoácidos (1-439)
Neurotoxina de botulinum tipo G - residuos de aminoácidos (1- 441)
Neurotoxina de tétanos - residuos de aminoácidos (1-457)
Proteasa de IgA - residuos de aminoácidos (1-959)*
*Polner, J. et al. (1987). Nature 325, pp. 458-462, la cual es incorporada aquí por referencia a la misma.
La secuencia de referencia antes identificada debería ser considerada una guía ya que pueden ocurrir variaciones ligeras de acuerdo con sub-serotipos. A manera de ejemplo, US 2007/0166332 (incorporada aquí por referencia) cita secuencias clostridiales ligeramente diferentes:
Neurotoxina de botulinum tipo A - residuos de aminoácidos (M1- K448)
Neurotoxina de botulinum tipo B - residuos de aminoácidos (M1-K441)
Neurotoxina de botulinum tipo C - residuos de aminoácidos (M1 - K449)
Neurotoxina de botulinum tipo D - residuos de aminoácidos (M1 - R445)
Neurotoxina de botulinum tipo E - residuos de aminoácidos (M1 - R422)
Neurotoxina de botulinum tipo F - residuos de aminoácidos (M1 - K439)
Neurotoxina de botulinum tipo G - residuos de aminoácidos (M1 -K446)
Neurotoxina de tétanos - residuos de aminoácidos (M 1 -A457) Una variedad de fragmentos de toxina clostridial comprendiendo la cadena ligera puede ser útil en aspectos de la presente invención con la condición de que estos fragmentos de cadena ligera pueden focalizar específicamente los componentes de núcleo del aparato de liberación de neurotransmisor y participa así en ejecutar el mecanismo celular global, por el cual una toxina clostridial corta proteolíticamente un substrato. Las cadenas ligeras de toxinas clostridiales son aproximadamente 420-460 aminoácidos de longitud y comprenden un dominio enzimático. La investigación ha mostrado que la longitud completa de una cadena ligera de toxina clostridial no es necesaria para la actividad enzimática del dominio enzimático. Como un ejemplo no limitante, los primeros ocho aminoácidos de la cadena ligera BoNT/A no son requeridos para actividad enzimática. Como otro ejemplo no limitante, los primeros ocho aminoácidos de la cadena ligera TeNT no son requeridos para actividad
enzimática. De igual manera, el término carboxilo de la cadena ligera no es necesario para actividad. Como un ejemplo no limitante, los últimos 32 aminoácidos de la cadena ligera de BoNT/A (residuos 417-448) no son requeridos para actividad enzimática. Como otro ejemplo no limitante, los últimos 31 aminoácidos de la cadena ligera de TeNT (residuos 427-457) no son requeridos para actividad enzimática. Así, aspectos de esta modalidad pueden incluir cadenas ligeras de toxina clostridial comprendiendo un dominio enzimático teniendo una longitud de, por ejemplo, al menos 350 aminoácidos, al menos 375 aminoácidos, al menos 400 aminoácidos, al menos 425 aminoácidos y al menos 450 aminoácidos. Otros aspectos de esta modalidad pueden incluir cadenas ligeras de toxina clostridial comprendiendo un dominio enzimático teniendo una longitud de, por ejemplo, cuando mucho 350 aminoácidos, cuando mucho 375 aminoácidos, cuando mucho 400 aminoácidos, cuando mucho 425 aminoácidos y cuando mucho 450 aminoácidos.
En una modalidad, la proteasa no citotóxica corta una proteína SNARE no neuronal, tal como una proteína SNAP-23. En una modalidad, la proteasa no citotóxica es una cadena L de toxina de botulinum modificada capaz de cortar SNAP-23. Un ejemplo de tal cadena L modificada es descrito por Chen y Barbieri, PNAS, vol. 106, no. 23, p91 80-91 84, 2009.
En una modalidad, la proteasa no citotóxica es una proteasa de BoNT/A, BoNT/C o BoNT/E, y el motivo de SNARE preferido es un motivo de SNAP (por ejemplo, SNAP 25). En otra modalidad, la proteasa no citotóxica es una proteasa de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F o
BoNT/G o neurotoxina de tétanos (TeNT), y el motivo de SNAR preferido es un motivo de VAMP. En otra modalidad, la proteasa no citotóxica es una proteasa de B0NT/C1 y el motivo de SNARE preferido es un motivo de sintaxina.
Los polipéptidos de la presente invención, especialmente el componente de proteasa del mismo, pueden ser PEGilados - esto puede ayudar a aumentar la estabilidad, por ejemplo, duración de acción del componente de proteasa. La PEGilación es particularmente preferida cuando la proteasa comprende una proteasa de BoNT/A, B o C1. La PEGilación de preferencia incluye la adición de PEG al extremo N del componente de proteasa. A manera de ejemplo, el extremo N de una proteasa puede extenderse con uno o más residuos de aminoácidos (por ejemplo, cisteína) , los cuales pueden ser iguales o diferentes. Uno o más de dichos residuos de aminoácidos pueden tener su propia molécula de PEG unida (por ejemplo, unida covalentemente) a los mismos. Un ejemplo de esta tecnología es descrito en WO2007/104567, el cual es incorporado en su totalidad por referencia.
Un Dominio de translocación es una molécula que permite la translocación de una proteasa en una célula objetivo de manera que una expresión funcional de actividad de proteasa ocurre dentro del citosol de la célula objetivo. Si cualquier molécula (por ejemplo, una proteína o péptido) posee la función de translocación requerida de la presente invención, puede confirmare mediante cualquiera de una variedad de ensayos convencionales.
Por ejemplo, Shone C. ( 1987) describe un ensayo in vitro que
emplea liposomas, los cuales son retados con una molécula de prueba. La presencia de la función de translocacion requerida es confirmada por liberación de los liposomas de K+ y/o NAD etiquetado, que puede monitorearse fácilmente [ver Shone C. (1 987) Eur. J. Biochem; vol. 167(1 ): pp. 175-1 80]. Un ejemplo adicional es provisto por Blaustein R. (1987); que describe un ensayo in vitro simple que emplea membranas bicapa de fosfolípido planas. Las membranas son retadas con una molécula de prueba y la función de translocación requerida es confirmada por un aumento en conductancia a través de dichas membranas [ver Blaustein (1987) FEBS Letts; vol. 226, no. 1 : pp. 1 15-120]. Metodología adicional para permitir la valoración de fusión de membrana y de esta manera identificación de Dominios de translocación adecuados para uso en la presente invención son provistos por Methods in Enzymology (métodos en enzimología) Vol. 220 y 221 , Membrane Fusión Techniques (Técnicas de fusión de membrana), Partes A y B, Academic Press 1993.
La presente invención también abarca varios dominios de translocación, siempre y cuando los dominios variantes todavía demuestren la actividad de translocación requerida. A manera de ejemplo, una variante puede tener al menos 70%, de preferencia al menos 80%, más preferiblemente al menos 90% , y muy preferiblemente al menos 95% o al menos 98% de homología de secuencia de aminoácidos con un dominio de translocación de referencia. El término fragmento, cuando se usa en relación a un dominio de translocación, significa un péptido teniendo al menos 20, de preferencia al menos 40,
más preferiblemente al menos 80, y muy preferiblemente al menos 100 residuos de aminoácidos del dominio de translocación de referencia. En el caso de un dominio de translocación clostridial, el fragmento de preferencia tiene al menos 100, de preferencia al menos 1 50, más preferiblemente al menos 200, y muy preferiblemente al menos 250 residuos de aminoácidos del dominio de translocación de referencia (por ejemplo, dominio de H N). Como con el componente de "fragmento" de TM (discutido antes), los "fragmentos" de translocación de la presente invención abarcan fragmentos de dominios de translocación variantes basados en las secuencias de referencia.
Está bien documentado que ciertos dominios de moléculas de toxina bacteriana son capaces de formar tales poros. También es conocido que ciertos dominios de translocación de proteínas de fusión de membrana viralmente expresadas son capaces de formar tales poros. Tales dominios pueden ser empleados en la presente invención.
El Dominio de transiocación puede ser de un origen clostridial, tal como el dominio de H N (O un componente funcional del mismo). H N significa una porción o fragmento de la cadena H de una neurotoxina clostridial aproximadamente equivalente a la mitad amino-terminal de la cadena H, o el dominio correspondiente a ese fragmento en la cadena H intacta. A este respecto, debería ser deseado remover la función de unión de células He, esto puede hacerse mediante supresión de la secuencia de aminoácidos de He o Hcc (ya sea al nivel de síntesis de DNA, o al nivel de post-síntesis mediante tratamiento con nucleasa o proteasa). De manera alternativa, la función de He puede inactivarse
mediante tratamiento químico o biológico.
Ejemplos de Dominios de translocación adecuados (referencia) incluyen:
Neurotoxina de botulinum tipo A - residuos de aminoácidos (449-871 )
Neurotoxina de botulinum tipo B - residuos de aminoácidos (441 - 858)
Neurotoxina de botulinum tipo C - residuos de aminoácidos (442- 866)
Neurotoxina de botulinum tipo D - residuos de aminoácidos (446- 862)
Neurotoxina de botulinum tipo E - residuos de aminoácidos (423- 845)
Neurotoxina de botulinum tipo F - residuos de aminoácidos (440-864)
Neurotoxina de botulinum tipo G - residuos de aminoácidos (442- 863)
Neurotoxina de tétanos - residuos de aminoácidos (458-879) La secuencia de referencia antes identificada debería considerarse una guía como variaciones ligeras puede ocurrir de acuerdo con sub-serotipos. A manera de ejem plo, US 2007/0166332 (incorporada aquí por referencia) cita secuencias clostridiales ligeramente diferentes:
Neurotoxina de botulinum tipo A - residuos de aminoácidos (A449-
Neurotoxina de botulinum tipo B - residuos de aminoácidos (A442- S858)
Neurotoxina de botulinum tipo C - residuos de aminoácidos (T450- N866)
Neurotoxina de botulinum tipo D - residuos de aminoácidos (D446- N862)
Neurotoxina de botulinum tipo E - residuos de aminoácidos (K423- K845)
Neurotoxina de botulinum tipo F - residuos de aminoácidos (A440-K864)
Neurotoxina de botulinum tipo G - residuos de aminoácidos (S447- S863)
Neurotoxina de tétanos - residuos de aminoácidos (S458-V879) En el contexto de la presente invención, una variedad de regiones de HN de toxina clostridial comprendiendo un dominio de translocación puede ser útil en aspectos de la presente invención con la condición de que estos fragmentos activos puedan facilitar la liberación de una proteasa no citotóxica (por ejemplo, una cadena L clostridial) de vesículas intracelulares en el citoplasma de la célula objetivo y así participar en ejecutar el mecanismo celular global por el cual una toxina clostridial corta proteolíticamente un substrato. Las regiones de H de las cadenas pesadas de toxinas clostridales son aproximadamente 410-430 aminoácidos de longitud y comprenden un dominio de translocación. La investigación ha mostrado que la longitud completa de una región de HN de una cadena pesada de toxina clostridial no es necesaria para la
actividad de translocación del dominio de translocación . Así , aspectos de esta modalidad pueden incluir reg iones de HN de toxina clostridial comprendiendo un dominio de translocación teniendo una longitud de, por ejemplo, al menos 350 aminoácidos , al menos 375 aminoácidos, al menos 400 am inoácidos y al menos 425 aminoácidos. Otros aspectos de esta modalidad pueden incluir reg iones de HN de toxina clostridial comprendiendo domi nio de translocación teniendo una longitud de, por ejemplo , cuando mucho 350 aminoácidos, cuando m ucho 375 aminoácidos, cuando mucho 400 am inoácidos y cuando mucho 425 aminoácidos.
Para detalles adicionales sobre la base genética de producción de toxina en Clostridium botulinum y C. reían/, nos referimos a Henderson et al ( 1 997) en The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis (Los clostridios: biología molecular y patogénesis) , Academic Press. El término H N abarca porciones de HN de neurotoxina q ue ocurren de manera natural y porciones de H N mod ificadas teniendo secuencias de aminoácidos que no ocurren en la naturaleza y/o residuos de aminoácidos sintéticos, siempre y cuando las porciones de H N modificadas todavía demuestren la función de translocación antes mencionada .
De manera alternativa , el Domin io de translocación puede ser de un origen no clostridial . Ejemplos de orígenes de Dominio de translocación no clostridial (referencia) incl uyen, pero no son restringidos a , el dominio de translocación de toxina de difteria [O' Keefe et al . , Proc. Nati . Acad . Sci. US ( 1 992) 89, 6202-6206; Silverman et al . ,
J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524-22532; y London, E. (1992) Biochem. Biophys, Acta, 1112, pp. 25-51], el dominio de translocación de exotoxina de Pseudomonas tipo A [Prior et al., Biochemistry (1992) 31, 3555-3559[, los dominios de translocación de toxina de ántrax [Blanke et al., Proc. Nati. Acad. Sci. US (196) 93, 8437-8442], una variedad de péptidos fusogénicos o hidrofóbicos de función de translocación [Plank et al. J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918-12924; y Wagner et al (1992) PNAS, 89, pp. 7934-7938], y péptidos anfifílicos [Murata et al (1992) Biochem., 31, pp. 1986-1992]. El Dominio de translocación puede reflejar el Dominio de translocación presente en una proteína que ocurre de manera natural, o puede incluir variaciones de aminoácidos siempre y cuando las variaciones no destruyan la capacidad de translocación del Dominio de translocación.
Ejemplos particulares de Dominios de translocación virales (referencia) adecuados para uso en la presente invención incluyen ciertos dominios de translocación de proteínas de fusión de membrana viralmente expresadas. Por ejemplo, Wagner et al. (1992) y Murta et al. (1992) describen la función de translocación (es decir, fusión de membrana y vesiculacion) de una variedad de péptidos fusogénicos y anfifílicos derivados de la región N-termínal de hemaglutinina de virus de influenza. Otras proteínas de fusión de membrana viralmente expresadas conocidas por tener la actividad de translocación deseada son un dominio de translocación de un péptido fusogénico de virus Semliki Forest (SFV), un dominio de translocación de glicoproteína G de virus de estomatitis vesicular (VSV), un dominio de translocación de
proteína F de virus SER y un dominio de translocación de glicoproteína de envoltura de virus espumoso. Proteínas Aspike viralmente codificadas tienen aplicación particular en el contexto de la presente invención, por ejemplo, la proteína E 1 de SFV y la proteína G de VSV.
El uso de los Dominios de translocación (referencia) incluye el uso de variantes de secuencia de los mismos. Una variante puede comprender una o más substituciones de ácidos nucleicos conservadores y/o supresiones o inserciones de ácidos nucleicos, con la condición de que la variante posee la función de translocación requerida. Una variante también puede comprender una o más substituciones de aminoácidos y/o supresiones o inserciones de aminoácidos, siempre y cuando la variante posea la función de translocación requerida.
Los polipéptidos de la presente invención pueden comprender además un dominio facilitador de translocación. Dicho dominio facilita la entrega de la proteasa no citotóxica en el citosol de la célula objetivo y se describen, por ejemplo, en WO 08/008803 y WO 08/008805, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia.
A manera de ejemplo, los dominios que facilitan la translocación adecuados incluyen un dominio de péptido fusogénico de virus envuelto, por ejemplo, dominios de péptido fusogénico adecuados incluyen dominio de péptido fusogénico de virus de influenza (por ejemplo, dominio de péptido fusogénico de virus de influenza A de 23 aminoácidos), dominio de péptido fusogénico de virus alfa (por ejemplo, dominio de péptido fusogénico de virus Semliki Forest de 26
aminoácidos), dominio de péptido fusogénico de vesiculovirus (por ejemplo, dominio de péptido fusogénico de virus de estomatitis vesicular de 21 aminoácidos), dominio de péptido fusogénico de respirovirus (por ejemplo, dominio de péptido fusogénico de virus Sendai de 25 aminoácidos), dominio de péptido fusogénico de morbilivirus (por ejemplo, dominio de péptido fusogénico de virus de moquillo canino de 25 aminoácidos), dominio de péptido fusogénico de avulavirus (por ejemplo, dominio de péptido fusogénico de virus de enfermedad de Newcastle de 25 aminoácidos) , dominio de péptido fusogénico de henipavirus (por ejemplo, dominio de péptido fusogénico de virus Hendra de 25 aminoácidos), dominio de péptido fusogénico de metapneumovirus (por ejemplo, dominio de péptido fusogénico de metapneumovirus humano de 25 aminoácidos) o dominio de péptido fusogénico de spumavirus tal como dominio de péptido fusogénico de virus espumoso de simio; o fragmentos o variantes de los mismos.
A manera de ejemplo adicional, un dominio facilitador de translocación puede comprender un dominio de HCN de toxina clostridial o un fragmento o variante del mismo. En más detalle, un dominio facilitador de translocación de HCN de toxina clostridial puede tener una longitud de al menos 200 aminoácidos, al menos 225 aminoácidos, al menos 250 aminoácidos, al menos 275 aminoácidos. A este respecto, un dominio facilitador de translocación de HCN de toxina clostridial de preferencia tiene una longitud de cuando mucho 200 aminoácidos, cuando mucho 225 aminoácidos, cuando mucho 250 aminoácidos, o cuando mucho 275 aminoácidos. Ejemplos específicos (referencia)
incluyen:
Neurotoxina de botulinum tipo A - residuos de aminoácidos (872- 1110)
Neurotoxina de botulinum tipo B - residuos de aminoácidos (859-1097)
Neurotoxina de botulinum tipo C - residuos de aminoácidos (867- 1111)
Neurotoxina de botulinum tipo D - residuos de aminoácidos (863- 1098)
Neurotoxina de botulinum tipo E - residuos de aminoácidos (846- 1085)
Neurotoxina de botulinum tipo F - residuos de aminoácidos (865- 1105)
Neurotoxina de botulinum tipo G - residuos de aminoácidos (864-1105)
Neurotoxina de tétanos - residuos de aminoácidos (880-1127) Las posiciones de secuencia anteriores pueden variar un poco de acuerdo con serotipo/sub-tipo, y ejemplos adicionales de dominios de
HCN clostridiales (referencia) adecuados incluyen:
Neurotoxina de botulinum tipo A - residuos de aminoácidos (874- 1110)
Neurotoxina de botulinum tipo B - residuos de aminoácidos (861- 1097)
Neurotoxina de botulinum tipo C - residuos de aminoácidos (869-1111)
Neurotoxina de botulinum tipo D - residuos de aminoácidos (865- 1098)
Neurotoxina de botulinum tipo E - residuos de aminoácidos (848- 1085)
Neurotoxina de botulinum tipo F - residuos de aminoácidos (867- 1105)
Neurotoxina de botulinum tipo G - residuos de aminoácidos (866- 1105)
Neurotoxina de tétanos - residuos de aminoácidos (882-1127) Cualquiera de los dominios facilitadores antes descritos puede ser combinado con cualquiera de los péptidos de dominio de translocación previamente descritos que son adecuados para uso en la presente invención. Así, a manera de ejemplo, un dominio facilitador no clostridial puede ser combinado con péptido de dominio de translocación no clostridial o con péptido de dominio de translocación clostridial. De manera alternativa, un dominio facilitador de translocación de HCN de toxina clostridial puede combinarse con un péptido de dominio de translocación no clostridial. De manera alternativa, un dominio facilitador de HCN de toxina clostridial puede combinarse o con un péptido de dominio de translocación clostridial, ejemplos del cual incluyen:
Neurotoxina de botulinum tipo A - residuos de aminoácidos (449- 1110)
Neurotoxina de botulinum tipo B - residuos de aminoácidos (442-1097)
Neurotoxina de botulinum tipo C - residuos de aminoácidos (450- 1 1 1 1 )
Neurotoxina de botulinum tipo D - residuos de aminoácidos (446- 1098)
Neurotoxina de botulinum tipo E - residuos de aminoácidos (423- 1085)
Neurotoxina de botulinum tipo F - residuos de aminoácidos (440- 1 105)
Neurotoxina de botulinum tipo G - residuos de aminoácidos (447-1 1 05)
Neurotoxina de tétanos - residuos de aminoácidos (458-1 127)
Homología de secuencias
Cualquiera de una variedad de métodos de alineación de secuencia pueden usarse para determinar porcentaje de identidad, incluyendo, sin limitación métodos globales, métodos locales y métodos híbridos, tales como, por ejemplo, métodos de aproximación de segmento. Los protocolos para determinar el porcentaje de identidad son procedimientos de rutina dentro del alcance de alguien experto en la técnica. Métodos globales alinean secuencias desde el inicio al final de la molécula y determinan la mejor alineación al añadir calificaciones de pares de residuos individuales y al imponer penalizaciones por hueco. Métodos no limitantes incluyen, por ejemplo, CLUSTAL w, ver por ejemplo, Julie D. Thompson et al. , CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Múltiple Sequence Alignment Through
Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice (CLASTAL W: Mejorando la sensibilidad de alineación de secuencias múltiples progresivas a través de ponderación de secuencias, penalizaciones por hueco específicas de posición y elección de matriz de peso), 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994); y refinamiento iterativo, ver, por ejemplo, Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Múltiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments (Mejora significativa en la precisión de alineaciones de secuencias de proteínas múltiples mediante refinamiento iterativo como es valorado por referencia a alineaciones estructurales), 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996). Métodos locales alinean secuencias al identificar uno o más motivos conservados compartidos por todas las secuencias de entrada. Métodos no limitantes incluyen, por ejemplo, Match-box, ver, por ejemplo, Eric Depiereux y Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences (Match-Box: Un algoritmo fundamentalmente nuevo para la alineación simultánea de varias secuencias de proteínas), 8(5) CABIOS 501 -509 (1992); muestreo de Gibbs, ver por ejemplo, C. E. Lawrence et al. , Detecting Subtle Sequence Signáis: A Gibbs Sampling Strategy for Múltiple Alignment, 262(51 31 ) Science 208-214 (1993) (Detectando señales de secuencias sutiles: Una estrategia de muestreo de Gibbs para alineación múltiple), 262(5131 ) Science 208-214 (1993); Align-M, ver, por ejemplo, Ivo Van Walle et al. , Align-M - A New Algorithm for Múltiple Alignment of Highiy Divergent Sequences (Align-M
- Un nuevo algoritmo para alineación múltiple de secuencias altamente divergentes), 20(9) Bioinformatics: 1428- 1435 (2004). De esta manera, el porcentaje de identidad de secuencia es determinado por métodos convencionales. Ver por ejemplo, Atlschul et al. , Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986 y Henikoff y Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. UA 89: 1091 5-19, 1992. Brevemente, dos secuencias de aminoácidos son alineadas para optimizar las calificaciones de alineación usando una penalización de abertura de hueco de 1 0, una penalización de extensión de hueco de 1 , y la matriz de calificación "blosum 62" de Henikoff y Henikoff.
Polipéptidos substancialmente homólogos son caracterizados como que tienen una o más substituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos. Estos cambios son de preferencia de una naturaleza menor, esto es substituciones de aminoácidos conservadores (ver a continuación) y otras substituciones que no afectan significativamente el plegamiento o activación del polipéptido; pequeñas supresiones, normalmente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; y pequeñas extensiones amino- o carboxilo-terminales, tal como un residuo de metionina amino-terminal, un pequeño péptido enlazador de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una etiqueta de afinidad.
Substituciones de aminoácidos conservadores
Básicos: arginina; Usina, histidina
Acidos: ácido glutámico; ácido aspártico
Polares: glutamina; asparagina
Hidrofóbicos leucina; isoleucina; valina
Aromáticos: fenilalanina; triptófano; tirosina
Pequeños: glicina; alanina; serina; treonina; metionina
Además de los 20 aminoácidos estándares, los aminoácidos no estándares (tales como, 4-hidroxiprolina, 6-N-metil Usina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina y a-metil serina) pueden substituirse por residuos de aminoácidos de los polipéptidos de la presente invención. Un número limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no son codificados por el código genético y aminoácidos no naturales pueden ser substituidos por residuos de aminoácidos de polipéptidos clostridiales. Los polipéptidos de la presente invención también pueden comprender residuos de aminoácidos que no ocurren de manera natural.
Los aminoácidos que no ocurren de manera natural incluyen, sin limitación, trans-3-metilprolina, 2,4-metano-prolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxi-prolina, N-metilglicina, alo-treonina, metil-treonina, hidroxi-etilcisteina, hidroxietilhomo-cisteína, nitro-glutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, ter-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenil-alanina, 4-azafenil-alanina y 4-fluorofenilalanina. Varios métodos son conocidos en la técnica para incorporar residuos de aminoácidos que no ocurren de manera natural. Por ejemplo, un sistema in vitro puede ser empleado, en donde mutaciones sin sentido son suprimidas usando tRNAs de supresores químicamente aminoacilados. Los métodos para sintetizar aminoácidos y aminoacilar tRNA son conocidos en la técnica. La transcripción y traducción de plásmidos conteniendo mutaciones sin sentido es
realizada en un sistema libre de células comprendiendo un extracto de E. coli y enzimas comercialmente disponibles y otros reactivos. Las proteínas son purificadas mediante cromatografía. Ver, por ejemplo, Robertson et al. , J. Am. Chem . Soc. 1 1 3:2722, 1991 ; Ellman et al. , Methods Enzymol. 202:301 , 1 991 ; Chung et al. , Science 259:806-9, 1993; y Chung et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. US 90: 1 0145-9, 1993). En un segundo método, la traducción es realizada en oocitos Xenopus mediante microinyección de mRNA mutado y tRNAs supresores químicamente aminoacilados (Turcatti et al. , J. Biol. Chem . 271 : 19991 -8, 1996). Dentro de un tercer método, las células de E. coli son cultivadas en la ausencia de un aminoácido natural que va a ser reemplazado (por ejemplo, fenilalanina) y en la presencia del o los aminoácidos que ocurren de manera no natural deseados (por ejemplo, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina o 4-fluorofenilalanina). El aminoácido que no ocurre de manera natural es incorporado en el polipéptido en lugar de su contraparte natural. Ver, Koide et al. , Biochem . 33:7470-6, 1 994. Los residuos de aminoácidos que ocurren de manera natural pueden convertirse a especies que no ocurren de manera natural mediante modificación química in vitro. La modificación química puede combinarse con mutagénesis de sitio dirigido para expandir adicionalmente el rango de las substituciones (Wynn y Richards, Protein Sci. 2: 395-403, 1 993).
Un número limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no son codificados por el código genético, aminoácidos que no ocurren de manera natural y aminoácidos no naturales pueden
ser substituidos por residuos de aminoácidos de polipéptidos de la presente invención.
Los aminoácidos esenciales en los polipéptidos de la presente invención pueden ser identificados de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica, tal como mutagénesis de sitio dirigido o mutagénesis de exploración de alanina (Cunningham y Wells, Science 244: 1081 -5, 1 989). Sitios de interacción biológica también pueden ser determinados mediante análisis físico de estructura, como es determinado por técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o etiquetado de fotoafinidad, en conjunción con mutación de aminoácidos de sitio de contacto putativo. Ver, por ejemplo, de Vos et al. , Science 255: 306-12, 1 992; Smith et al. , J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver et al. , FEBS Lett. 309:59-64, 1992. Las identidades de aminoácidos esenciales también pueden ser inferidas a partir de análisis de homologías con componentes relacionados (por ejemplo, los componentes de translocación o proteasa) de los polipéptidos de la presente invención.
Pueden hacerse substituciones de aminoácidos múltiples y probarse usando métodos conocidos de mutagénesis y clasificación, tales como aquéllos descritos por Reidhaar-Olson y Sauer (Science 241 :53-7, 1988) o Bowie y Sauer (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 2152-6, 1989). Brevemente, estos autores describen métodos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionar un polipéptido funcional y entonces secuenciar los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de substituciones
permisibles en cada posición. Otros métodos que pueden ser usados incluyen exhibición de fagos (por ejemplo, Lowman et al. , Biochem. 30 : 1 0832-7 , 1 991 ; Ladner et al. , patente estadounidense no. 5 , 223,409 ; Huse, publicación WI PO WO 92/06204) y mutagénesis de región-dirigida (Derrbyshire et al. , Gene 46: 1 45 , 1 986 ; Ner et al. , DNA 7 : 1 27 , 1 988) .
Breve descripción de los Ejemplos
Ejemplo 1 Creación de una proteína LHD que incorpora un polipéptido GnRH al extremo C del dominio H
Ejemplo 2 Creación de una proteína LHA que incorpora un polipéptido GnRH al extremo C del dominio HN
Ejemplo 3 Creación de una proteína LHD que incorpora un polipéptido GnRH al extremo C del dominio H N, donde dos diferentes sitios de reconocimiento de proteasa son incorporados
Ejemplo 4 Método de preparación de una proteína LHD que incorpora un polipéptido GnRH al extremo C del dominio H N
Ejemplo 5 Demostración de la presencia de ligando covalentemente unido por Western blotting
Ejemplo 6 Demostración de presencia de TM covalentemente unida por espectrometría de masa
Ejemplo 7 Valoración de la capacidad de unión de una proteína LHD que incorpora un polipéptido GnRH
Ejemplo 8 Valoración de la funcionalidad in vitro de una proteína LHD que incorpora un polipéptido GnRH
Ejemplo 9 Creación de una proteína LHD que incorpora una
dinorfina y un polipéptido de bradícinina al extremo C del dominio HN
Ejemplo 10 Creación de una proteína LHA que incorpora una beta-endorfina y un polipéptido de bradícinina al extremo C del dominio HN
Ejemplo 1 1 Creación de una proteína LHD que incorpora dos polipéptídos GHRH al extremo C del dominio HN
Ejemplo 12 Creación de una proteína LHD que incorpora un polipéptido GnRH al extremo C del dominio H N, separado por 5 aminoácidos desde el segundo sitio de activación de proteasa
Ejemplo 13 Creación de una proteína LHA que incorpora un péptido liberador de Gastrina al extremo C del dominio H N
Ejemplo 14 Método para tratar pacientes que sufren de cáncer de próstata
Ejemplo 15 Método para tratar pacientes que sufren de inflamación neurogénica
Ejemplo 16 Método para tratar pacientes que sufren de endometriosis
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 ilustra el análisis SDS-PAGE de muestras activadas
(eluidas en las fracciones de imidazol de 80 mM + 250 mM) del Ejemplo 4 en condiciones reductoras y no reductoras.
Breve descripción de las SEQ ID Nos
Todas las siguientes SEQ I D Nos pueden excluir algún residuo de
aminoácido de metionina inicial (o codón/secuencia de ácido nucleico N-terminal correspondiente).
SEQ I D 1 Secuencia de DNA de LHD-GnRH
SEQ ID 2 Secuencia de proteína de LHD-GnRH
SEQ I D 3 Secuencia de DNA de LHA-GnRH
SEQ I D 4 Secuencia de proteína de LHA-GnRH
SEQ I D 5 Secuencia de DNA de LHD-GnRH con dos sitios de proteasa diferentes
SEQ I D 6 Secuencia de proteína de LH D-GnRH con dos sitios de proteasa diferentes
SEQ I D 7 Secuencia de DNA de LHD que incorpora una dinorfina y un polipéptído de bradicinina al extremo C del dominio HN
SEQ I D 8 Secuencia de proteína de LH D que incorpora una dinorfina y un polipéptído de bradicinina al extremo C del dominio H N
SEQ I D 9 Secuencia de DNA de LHA que incorpora una beta-endorfina y un polipéptído de bradicinina al extremo C del dominio H N
SEQ ID 1 0 Secuencia de proteína de LHA que incorpora una beta-endorfina y un polipéptído de bradicinina al extremo C del dominio HN SEQ I D 1 1 Secuencia de DNA de LHD que incorpora dos polipéptidos de GHRH al extremo C del dominio H N
SEQ I D 12 Secuencia de proteína de LHD que incorpora dos polipéptidos de GHRH al extremo C del dominio HN
SEQ ID 1 3 Secuencia de DNA de LHD que incorpora GnRH al extremo C del dominio HN
SEQ I D 14 Secuencia de proteína de LH D que incorpora GnRH al extreme C del dominio H N
SEQ ID 15 Secuencia de DNA de LHA que incorpora un péptido liberador de Gastrina al extremo C del dominio H
SEQ ID 16 Secuencia de proteína de LHA que incorpora un péptido liberador de Gastrina al extremo C del dominio H
A continuación sigue la descripción de modalidades específicas de la invención, ilustradas por los Ejemplos.
Ejemplo 1 Creación de una proteína LHD que incorpora un polipéptido GnRH al extremo C del dominio H N
La secuencia primaria de una proteína quimérica construida por una fusión genética del fragmento L H N de BoNT/D y el péptido de 10 aminoácidos GnRH es revisada por la presencia de cadenas de aminoácidos que soportan parecido al sitio de reconocimiento prototípico para Factor Xa (I EGR). Como no se encontró tal cadena, se hace la elección de usar FXa como la proteasa tanto para activar la proteína de fusión en la unión LC-H N y también para cortar el enlace de péptido entre HN y la TM (GnRH).
El DNA optimizado para expresión de E. coli es obtenido comercialmente de Entelechon (Alemania) para codificar una proteína de fusión, la cual tiene la siguiente estructura, de extremo N a C:
• Etiqueta de purificación N-terminal de 10 His,
• Un separador de 10 aminoácidos de asparagina,
· LC de BoNT/D,
• Un enlazador inter-dominio con una secuencia primaria similar a la encontrada en BoNT/A, modificado para incorporar el tetrapéptido I EGR, el cual es un substrato para FXa,
• H N de BoNT/D modificado para incorporar una Cys C-terminal, « Un separador de Gly-Gly-Gly-Gy-Gly-Ser que incorpora una secuencia de péptido I EGR en el extremo C
• Un péptido de GnRH de 1 0 aminoácidos modificado para incorporar un residuo de Cys en la posición 6 en lugar de la Gly natural (QHWSYCLRPG).
El uso de codón de E. coli fue valorado por referencia a programas de cómputo tal como Graphical Codon Usage Analuyser (Geneart), y el % de contenido de GC y proporción de uso de codón valorado por referencia a tablas de uso de codones publicadas (por ejemplo, GenBank Reléase 143, Septiembre 1 3, 2004) para asegurar que la construcción no resulte en una pobre utilización de codón. El DNA fue incorporado en un vector de clonación estándar, por ejemplo, pCR4, antes de la transformación en huésped de E. coli. La integridad del DNA de ORF fue verificada mediante secuenciación. El ORF final es ilustrado como SEQ ID 1 y la secuencia de aminoácidos del producto de expresión es ilustrada en SEQ ID 2.
Ejemplo 2 Creación de una proteína LHA que incorpora un polipéptido GnRH al extremo C del dominio H N
La secuencia primaria de una proteína quimérica construida por
una fusión genética del fragmento LHN de BoNT/A y el péptido de 10 aminoácidos GnRH es revisada por la presencia de cadenas de aminoácidos que portan parecido al sitio de reconocimiento prototípico para Factor Xa (I EGR). Como no se encontró tal cadena, se hace la elección de usar FXa como la proteasa tanto para activar la proteína de fusión en la unión de LC- H N y también para cortar el enlace de péptido entre HN y TM (GnRH).
El DNA optimizado para expresión de E. coli es obtenido comercialmente de Entelechon (Alemania) para codificar una proteína de fusión, la cual tiene la siguiente estructura, desde el extremo N a C:
• Etiqueta de purificación N-terminal de 10 His,
• Un separador de 1 0 aminoácidos de asparagina,
• LC de BoNT/A,
• Un enlazador inter-dominio con una secuencia primaria similar a la encontrada en BoNT/A, modificado para incorporar el tetrapéptido
IEGR, el cual es un substrato para FXa,
• HN de BoNT/A modificado para incorporar una Cys C-terminal
• Un separador de Gly-Gly-Gly-Gly-Ser que incorpora una secuencia de péptido I EGR al extremo C
· Un péptido GnRH de 10 aminoácidos modificado para incorporar un residuo de Cys en la posición 6 en lugar de la Gly natural.
El uso de codón de E. coli fue valorado por referencia a programas de cómputo, tal como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), y el % de contenido de GC y proporción de uso de codones
valorado por referencia a tablas de uso de codones publicadas (por ejemplo, Gen Bank Reléase 143, Septiem bre 1 3, 2004) para asegurar que la construcción no resulte en pobre utilización de codones. El DNA fue incorporado en un vector de clonación estándar, por ejemplo pCR4, antes de la transformación en h uésped de E. coli. La integridad del DNA de ORF fue verificada por secuenciación. El ORF final es ilustrado como SEQ I D 3 y la secuencia de aminoácidos del producto de expresión es ilustrada en S EQ I D 4.
Ejem plo 3 Creación de una proteína LH D que incorpora un polipéptido Gn RH al extremo C del dominio HN , donde dos diferentes sitios de reconocim iento de proteasa son incorporados
La secuencia primaria de una proteína quimérica construida por una fusión genética del fragmento LHN de BoNT/D y el péptido de 1 0 aminoácidos Gn RH es revisado por la presencia de cadenas de aminoácidos que portan parecido al sitio de reconocimiento prototípico para Factor Xa (I EG R) y enterocinasa (DDDDK) . Como no se encontró tal cadena, se hace la elección de usar FXa como la proteasa para activar la proteína de fusión en la unión LC- H N y enterocinasa para cortar la unión de péptido entre HN y la TM (Gn RH) .
El DNA optimizado para expresión de E. coli es obtenido comercialmente de Entelechon (Aleman ia) para codificar una proteína de fusión , la cual tiene la sig uiente estructura , a partir del extremo N a C: • Etiqueta de purificación N-terminal de 1 0 H is,
· Un separador de 1 0 aminoácidos de asparag ina
• LC de BoNT/D
• Un enlazador inter-dominio con una secuencia primaria similar a la encontrada en BoNT/A, modificada para incorporar el tetrapéptido IEGR, el cual es un substrato para FXa,
· HN de BoNT/D modificado para incorporar una Cys C-terminal,
• Un separador de Gy-Gly-Gly-Gly-Ser que incorpora una secuencia de péptido DDDDK en el extremo C
• Un péptido de 10 aminoácidos GnRH modificado para incorporar un residuo Cys en la posición 6 en lugar de la Gly natural.
El uso de codón de E. coli fue valorado por referencia a programas de cómputo, tal como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), y el% de contenido de GC y proporción de uso de codón se valoró por referencia a tablas de uso de codones publicadas (por ejemplo, GenBank Reléase 143, Septiembre 13, 2004) para asegurar que la construcción no resulta en pobre utilización de codones. El DNA fue incorporado en un vector de clonación estándar, por ejemplo, pCR4, antes de la transformación en huésped de E. coli. La integridad del DNA de ORF fue verificada por secuenciación. El ORF final es ilustrado como SEQ ID 5 y la secuencia de aminoácidos del producto de expresión es ilustrada en SEQ ID 6.
Ejemplo 4 Método de preparación de una proteína LHD que incorpora un polipéptido GnRH al extremo C del dominio HN
El ORF creado en el Ejemplo 1 fue clonado en un vector de
expresión de E. coli (un vector de pET (Novagen) que ha sido modificado para asegurar la deficiencia de movilización) y se transformó en una cepa huésped de E. coli, muy comúnmente BL21 .
La expresión de la proteína de fusión LHD-GnRH es lograda usando el siguiente protocolo. Inocular 100 mi de TB modificado conteniendo 0.2% de glucosa y 1 00 µg/ml de ampicilina en un matraz de 250 mi con una colonia simple de la cepa de expresión LHD-GnRH. Hacer crecer el cultivo a 37°C , 225 rpm durante 16 horas. Inocular 2x1 1 de TB modificado conteniendo 0.2% de glucosa y 100 pg/ml de ampicilina en un matraz de 2x21 con 10 mi de cultivo durante la noche. Hacer crecer los cultivos a 37°C hasta que una OD600nm aproximada de 0.5 es alcanzada punto en el cual se reduce la temperatura a 16°C. Después de 1 hora inducir los cultivos con 1 mM I PTG y cultivar a 16°C durante has 16 horas adicionales. La centrifugación del cultivo produjo 35.2 g de pasta celular.
La purificación de la fusión de LHD-GnRH es lograda mediante cromatografía por afinidad . En detalle, un tubo Falcon conteniendo 25 mi de 50 mM HEPES pH 7.2, 200 mM NaCI y aproximadamente 10 g de pasta celular de E. coli BL21 es descongelado. Sonicar la pasta celular en hielo 30 segundos encendido, 30 segundos apagado durante 10 ciclos a una energía de 22 mieras asegurando que la muestra permanezca fría. Centrifugar las células Usadas a 1 8000 rpm, 4°C durante 30 minutos. Cargar el sobrenadante sobre una columna HisTrap HP Chelating (columna de 5 mi es suficiente) equilibrado con 50 mM HEPES pH 7.2 200 mM NaCI . Siguiendo la adición de 40 mM imidazol
para lavar la proteína unida no específica, la proteína de fusión fue eluida con un gradiente de etapas de 80 mM imidazol, 250 mM imidazol y 500 mM imidazol. Dializar la proteína de fusión eluida contra 51 de 50 mM HEPES pH 7.2 200 mM NaCI a 4°C durante la noche y medir la OD de la proteína de fusión dializada. Adicionar 10U de Factor Xa/mg de proteína de fusión e incubar a 25°C estático durante la noche. Cargar sobre una columna HisTrap HP Chelating (5 mi de columna es suficiente) equilibrada con 50 mM HEPES pH 7.2 200 mM NaCI. Lavar la columna a línea de base con 50 mM HEPES pH 7.2 200 mM NaCI. Usando un gradiente de pasos de 1 0 y 40 mM imidazol, lavar la proteína de unión no específica y eluir la proteína de fusión con 100 mM imidazol. Dializar la proteína de fusión eluida contra 51 de 25mM Tris, 200 mM NaCI pH 8.0 a 4°C durante la noche y concentrar la fusión a aproximadamente 2 mg/ml, tomar alícuotas de muestra y congelar a -20°C. Probar la proteína purificada usando OD, BCA y análisis de pureza.
Las muestras de la proteína activada son analizadas mediante SDS-PAGE tanto en condiciones reductoras como no reductoras. Las muestras eluidas en las fracciones de imidazol 80 mM y 250 mM son analizadas - ver la Figura 1 .
Ejemplo 5 Demostración de presencia de TM unida covalentemente mediante Western blotting
La presencia de la TM dentro de la proteína de fusión puede ser valorada mediante una variedad de métodos. Un método es usar
antisueros específicos para la TM y visualizar mediante SDS-PAGE y Western blotting. Los anticuerpos para TM pueden ser obtenidos comercialmente (por ejemplo, anticuerpos anti-GnRH están disponibles de Abcam (AB76560) o Novus Biologicals (H00002796-B01 ) o pueden ser elevados específicamente a una secuencia de péptido dada mediante un proveedor de servicios comercial.
Usando tales técnicas, la presencia de GnRH es confirmada por estar dentro de la longitud completa, la proteina de fusión activada cuando corrió bajo condiciones no reductoras, pero no está presente en el dominio de HN cuando se corre bajo condiciones reductoras.
Ejemplo 6 Demostración de la presencia de TM covalentemente unida por espectrometría de masa
La presencia de la TM dentro de la proteína de fusión puede valorarse mediante una variedad de métodos. Un método es el uso de espectrometría de masa para determinar la masa de proteína de fusión antes y después de la reducción.
Usando la proteína preparada de acuerdo con el Ejemplo 4, varias muestras de proteína no reducida y proteína reducida fueron extraídas de SDS-PAGE (ver Figura 1 ) y analizadas mediante espectrometría de masa (Intertek, Manchester).
La masa predicha de proteína de proteína de fusión no activada, no reducida, es 1 05271 Da. La masa observada para las muestras fue 105284 Da, una diferencia de solo 13 Da, la cual está dentro del error del equipo. Por lo tanto, la presencia del GnRH intacto en la proteína
de fusión no activada, no reducida es confirmada.
La masa predicha de proteína de fusión no reducida, activada, es 105271 Da. La masa observada para las muestras fue 105321 Da, una diferencia de solo 50 Da, la cual está dentro del error del equipo. Por lo tanto, la presencia del GnRH intacto en la proteína de fusión no reducida, activada, es confirmada.
Cuando las muestras reducidas de LC y dominio HN son valoradas, el dominio HN (el cual debería comprender HN + separador + sitio de activación) tiene una masa predicha de 49419 Da y una masa observada de 49421. Esto indica que el dominio HN reducido no retiene el péptido GnRH. Este resultado es completamente como se predice debido a que la proteólisis y reducción del enlace disulfuro liberará la secuencia de GnRH del extremo C del dominio HN.
Estos datos demuestran que el ligando GnRH es unido a la proteína de fusión antes de la activación y reducción, está unido a la proteína de fusión siguiendo la activación en la ausencia de agente reductor, pero está ausente del dominio H siguiendo la activación y reducción. Esto confirma que la proteína de fusión se ha activado correctamente en ambos sitios proteolíticos y que el ligando GnRH está unido al dominio H N a través del enlace disulfuro diseñado.
Ejemplo 7 Valoración de la capacidad de unión de una proteína LHD que incorpora un polipéptido GnRH
La proteína preparada de acuerdo con el Ejemplo 4 es valorada por funcionalidad de interacción de ligando-receptor usando uno de una variedad de ensayos adecuados. Por ejemplo, los ensayos de unión de ligando de receptor GnRHR de hormona liberadora de gonadotropina suministrados por Cisbio Bioassays es un ensayo de competencia que cuantifica la actividad de unión en una muestra (http://www. htrf.com/products/qpcr/binding/liqands/inserts/C1 TT1 GNRH.p df). De manera alternativa, un rango de ensayos de unión públicamente
disponibles son reportados en la l iteratura científica (por ejemplo, Christopher E . Heise, Susan K. Sullivan y Pau l D . Crowe, J Biomol Screen 2007 1 2 : 235; DOI : 10. 1 1 77/1 0870571 06297362). El uso de tales ensayos indica que la TM de GnRH es capaz de i nteractuar con el receptor objetivo.
Los datos indican que la TM de Gn RH es capaz de interactuar con el receptor objetivo.
Ejemplo 8 Valoración de la funcionalidad in vitro de una proteína LHD que incorpora un polipéptido G nR H
La proteína preparada de acuerdo con el Ejemplo 4 es valorada por su capacidad para cortar proteínas SNARE dentro de la célula objetivo. Brevemente, una l ínea de células alfa T3-1 (una línea de células gonadotrofas inmortalizada) q ue expresa altos niveles del receptor de hormona liberadora de gonadotrofina (GnRH) es incubado con un com puesto de la invención. 24 horas después el material celular es cosechado y las proteínas SNARE se analizaron por Western blotting . Los datos ind ican que la proteína de fusión comprendiendo la TM de GnRH es capaz de interactuar con el receptor objetivo, conduciendo a internalización y corte de proteínas SNARE intracelu lares.
Ejemplo 9 Creación de una prote ína LH D que incorpora una dinorfina y un polipéptido de bradicinina al extremo C del dominio H N
La secuencia primara de una proteína quimérica construida por una fusión genética del fragmento LHN de BoNT/D y los péptidos
dinorfina y bradicinina es revisada por la presencia de cadenas de aminoácidos que portan parecido al sitio de reconocimiento prototípico para Factor Xa (IEGR). Como no se encontró tal cadena, se hace la elección de usar FXa como la proteasa tanto para activar la proteína de fusión en la unión LC-HN y también cortar el enlace de péptido entre HN y el péptido de dinorfina. Un separador de 11 aminoácidos es construido entre los péptidos de dinorfina y bradicinina incorporando una Cys simple para facilitar unión de disulfuro a HN.
El DNA optimizado para expresión de E. coli es obtenido comerciaimente de Entelechon (Alemania) para codificar una proteína de fusión, la cual tiene la siguiente estructura, de extremo N a C:
• Etiqueta de purificación N-terminal de 10 His,
• Un separador de 10 aminoácidos de asparagina,
• La LC de BoNT/D,
• Un enlazador inter-dominio con una secuencia primaria similar a la encontrada en BoNT/A, modificada por incorporar el tetrapéptido IEGR, el cual es un substrato para FXa,
• El HN de BoNT/D modificado para incorporar una Cys C-terminal,
• Un separador de Gly-Gly-Gly-Gly-Ser que incorpora una secuencia de péptido IEGR en el extremo C
• Un péptido de dinorfina de 17 aminoácidos
• Un Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser de 11 aminoácidos
• Un péptido de bradicinina de 9 aminoácidos
El uso de codón de E. coli fue valorado por referencia a
programas de cómputo, tal como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), y el % de contenido de GC y proporción de uso de codón valorado por referencia a tablas de uso de codón publicadas (por ejemplo, GenBank Reléase 143 , Septiembre 1 3, 2004) para asegurar que la construcción no resulta en pobre util ización de codón . El DNA fue incorporado en un vector de clonación estándar, por ejemplo pCR4, antes de la transformación en huésped de E. coli. La integridad del DNA de ORF fue verificada mediante secuenciación . El ORF final es ilustrado como SEQ I D 7 y la secuencia de am inoácidos del producto de expresión es ilustrada en S EQ I D 8.
Ejemplo 10 Creación de u na proteína LHA q ue i ncorpora una beta-endorfina y un polipéptido de bradicini na al extremo C del dominio H N
La secuencia prima ria de u na proteí na quimérica construida por una fusión genética del fragmento L H N de BoNT/A y los péptidos de beta-endorfina y bradicinina es revisada por la presencia de cadenas de aminoácidos que portan parecido al sitio de reconocim iento prototípico para Factor Xa (I EG R) . Como no se encontró tal cadena, la elección se hace para usar FXa como la proteasa para tanto activar la proteína de fusión como la unión de LC-HN y también para cortar el enlace de péptido entre el H N y el péptido de beta-endorfina . Un separador de 1 1 aminoácidos es construido entre los péptidos de beta-endorfina y bradicinina incorporando una Cys simple para faci litar la unión disulfuro al H N .
El DNA optimizado para la expresión de E. coli es obtenido
comercialmente de Entelechon (Alemania) para codificar una proteína de fusión , la cual tiene la siguiente estructura , de extremo N a C :
• Etiqueta de purificación N-terminal de 1 0 H is,
• Un separador de 1 0 aminoácidos de asparagina ,
• La LC de BoNT/A,
• Un enlazador inter-dom inio con una secuencia primaria similar a la encontrada en BoNT/A, modificada por incorporar el tetrapéptido I EGR, el cual es u n substrato para FXa ,
• El H de BoNT/D modificado para incorporar una Cys C-terminal,
• Un separador de Gly-Gly-G ly-Gly-Ser que incorpora una secuencia de péptido I EG R en el extremo C
• Un péptido de beta-endorfina de 31 ami noácidos
• Un Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser de 1 1 aminoácidos
• Un péptido de bradicin ina de T am i noácidos
El uso de codón de E. coli fue valorado por referencia a programas de cóm puto , tal como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), y el % de contenido de GC y proporción de uso de codón valorado por referencia a tablas de uso de codón publicadas (por ejemplo, GenBank Reléase 143, Septiembre 1 3, 2004) para asegurar que la construcción no resulta en pobre util ización de codón . El DNA fue incorporado en un vector de clonación estándar, por ejem plo pCR4, antes de la transformación en huésped de E. coli. La integridad del DNA de ORF fue verificada mediante secuenciación . El ORF final es ilustrado como S EQ I D 9 y la secuencia de am inoácidos del producto de
expresión es ilustrada en SEQ I D 1 0.
Ejemplo 1 1 Creación de una proteína LHD que incorpora dos polipéptidos de GHRH al extremo C del dominio H
La secuencia primaria de una proteína quimérica construida por una fusión genética del fragmento de LHN de BoNT/D y dos péptidos GNRH es revisada por la presencia de cadenas de aminoácidos que portan parecido al sitio de reconocimiento prototípico para Factor Xa (I EGR). Como no se encontró tal cadena, se hace la elección de usar FXa como la proteasa para tanto activar la proteína de fusión en la unión LC-H N como para también cortar la unión de péptido entre el H N y el péptido GHRH . Un separador de 1 1 aminoácidos es construido entre los dos péptidos GHRH que incorporan una Cys simple para facilitar la unión disulfuro al H N - El DNA optimizado para la expresión de E. col¡ es obtenido comercialmente de Entelechon (Alemania) para codificar una proteína de fusión, la cual tiene la siguiente estructura, de extremo N a C:
• Etiqueta de purificación N-terminal de 1 0 His,
• Un separador de 1 0 aminoácidos de asparagina,
· La LC de BoNT/D,
• Un enlazador inter-dominio con una secuencia primaria similar a la encontrada en BoNT/A, modificada por incorporar el tetrapéptido IEGR, el cual es un substrato para FXa,
• El H N de BoNT/D modificado para incorporar una Cys C-terminal, · Un separador de Gly-Gly-Gly-Gly-Ser que incorpora una secuencia
de péptido IEGR en el extremo C
• Un péptido GHRH de 40 aminoácidos
• Un Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser de 11 aminoácidos
« Un péptido GHRH de 40 aminoácidos
El uso de codón de E. coli fue valorado por referencia a programas de cómputo, tal como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), y el % de contenido de GC y proporción de uso de codón valorado por referencia a tablas de uso de codón publicadas (por ejemplo, GenBank Reléase 143, Septiembre 13, 2004) para asegurar que la construcción no resulta en pobre utilización de codón. El DNA fue incorporado en un vector de clonación estándar, por ejemplo pCR4, antes de la transformación en huésped de E. coli. La integridad del DNA de ORF fue verificada mediante secuenciación. El ORF final es ilustrado como SEQ ID 11 y la secuencia de aminoácidos del producto de expresión es ilustrada en SEQ ID 12.
Ejemplo 12 Creación de una proteína LHD que incorpora un polipéptido GnRH al extremo C del dominio HN, separado por 5 aminoácidos del segundo sitio de activación de proteasa
La secuencia primaria de una proteína quimérica construida por una fusión genética del fragmento de LHN de BoNT/D y el péptido GnRH de 10 aminoácidos es revisada por la presencia de cadenas de aminoácidos que portan parecido al sitio de reconocimiento prototípico para Factor Xa (IEGR). Como no se encontró tal cadena, se hace la
elección de usar FXa como la proteasa para tanto activar la proteína de fusión en la unión LC-HN como para también cortar la unión de péptido entre el HN y el separador al extremo N de la T (GnRH).
El DNA optimizado para la expresión de E. coli es obtenido comercialmente de Entelechon (Alemania) para codificar una proteína de fusión, la cual tiene la siguiente estructura, de extremo N a C:
• Etiqueta de purificación N-terminal de 10 His,
• Un separador de 10 aminoácidos de asparagina,
• La LC de BoNT/D,
• Un enlazador inter-dominio con una secuencia primaria similar a la encontrada en BoNT/A, modificada por incorporar el tetrapéptido IEGR, el cual es un substrato para FXa,
• El HN de BoNT/D modificado para incorporar una Cys C-terminal,
• Un separador de Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-lle-Glu-Gly-Arg-Gly-Gly-Gly- Gly-Ser que incorpora una secuencia de péptido IEGR,
• Un péptido GHRH de 10 aminoácidos modificado para incorporar un residuo Cys en la posición 6 en lugar de la Gly natural (QHWSYCLRPG).
El uso de codón de E. coli fue valorado por referencia a programas de cómputo, tal como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), y el % de contenido de GC y proporción de uso de codón valorado por referencia a tablas de uso de codón publicadas (por ejemplo, GenBank Reléase 143, Septiembre 13, 2004) para asegurar que la construcción no resulta en pobre utilización de codón. El DNA fue incorporado en un vector de clonación estándar, por ejemplo pCR4,
antes de la transformación en huésped de E. coli. La integridad del DNA de ORF fue verificada mediante secuenciación. El ORF final es ilustrado como SEQ ID 1 3 y la secuencia de aminoácidos del producto de expresión es ilustrada en SEQ I D 1 4.
Ejemplo 13 Creación de una proteína LHA que incorpora un péptido liberador de gastrina al extremo C del dominio HN
La secuencia primaria de una proteína quimérica construida por una fusión genética del fragmento de LHN de BoNT/A y el péptido liberador de gastrina (GRP) es revisada por la presencia de cadenas de aminoácidos que portan parecido al sitio de reconocimiento prototípico para Factor Xa (I EGR) . Como no se encontró tal cadena, se hace la elección de usar FXa como la proteasa para tanto activar la proteína de fusión en la unción LC- HN como para también cortar la unión de péptido entre el HN y la TM (GRP).
El DNA optimizado para la expresión de E. coli es obtenido comercialmente de Entelechon (Alemania) para codificar una proteína de fusión, la cual tiene la siguiente estructura, de extremo N a C :
• Etiqueta de purificación N-terminal de 1 0 His,
· Un separador de 1 0 aminoácidos de asparagina,
• La LC de BoNT/A,
• Un enlazador inter-dominio con una secuencia primaria similar a la encontrada en BoNT/A, modificada por incorporar el tetrapéptido IEGR, el cual es un substrato para FXa,
· El HN de BoNT/A modificado para incorporar una Cys C-terminal,
• Un separador de Gly-G ly-Gly-Gly-Ser que incorpora una secuencia de péptido I EGR en el extremo C
• U n péptido li berador de gastrina de 28 aminoácidos modificado para incorporar un residuo de Cys en la posición 1 7 en lugar de la ARg natural y un resid uo de Gly adicional en el extremo C para reemplazar la necesidad de amidación C-terminal (VPLPAGGGTVLTKMYPCGN HWAVG H LMG)
El uso de codón de E. coli fue valorado por referencia a programas de cómputo, tal como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), y el % de conten ido de GC y proporción de uso de codón valorado por referencia a tablas de uso de codón publicadas (por ejemplo, Gen Bank Reléase 143, Septiembre 1 3, 2004) para asegurar que la construcción no resulta en pobre util ización de codón . El DNA fue incorporado en un vector de clonación estándar, por ejemplo pCR4, antes de la transformación en huésped de E. coli. La integridad del DNA de ORF fue verificada mediante secuenciación . El ORF final es ilustrado como SEQ I D 1 5 y la secuencia de aminoácidos del producto de expresión es ilustrada en SEQ I D 1 6.
Ejemplo 14 Método para tratar pacientes que sufren de cáncer de próstata
U n hombre de 56 años de edad que sufre de cáncer de próstata avanza a una situación en la cual la terapia de privación de andrógeno ya no es suficiente para controlar la enfermedad . El hom bre es tratado mediante administración loca l de una composición comprendiendo un
TSI de la presente invención (en este ejemplo específico, un TSI basado en TM de péptido GnRH) en la cercanía de la próstata. La condición del paciente es monitoreada y aproximadamente 2 meses después del tratamiento el médico nota una disminución en el tamaño del tumor indicando tratamiento exitoso con la composición comprendiendo una molécula de la invención.
Ejemplo 15 Método para tratar pacientes que sufren de inflamación neurogénica
Una mujer de 62 años de edad diagnosticada con artritis reumatoide se queja de rigidez de articulaciones e hinchazón. Un médico determina que la rigidez de articulaciones e hinchazón es debida a inflamación neurogénica crónica. La mujer es tratada mediante administración local de una composiciones comprendiendo un TSI de la presente invención (en este ejemplo, el TSI comprende una TM opioide -ejemplos paralelos son corridos con TSIs comprendiendo TMs de nociceptina o dinorfina) en la cercanía del área afectada. La condición del paciente es monitoreada y después de aproximadamente 1 -3 días después del tratamiento, la mujer indica si existe rigidez de articulaciones e hinchazón reducida. En chequeos de uno y tres meses, la mujer indica que continúa teniendo rigidez de articulaciones e hinchazón reducidas en el área tratada. Esta reducción en síntomas de inflamación neurogénica crónica indica un tratamiento exitoso con la composición comprendiendo una molécula de la invención.
Ejemplo 16 Método para tratar pacientes que sufren de endometriosis
Una mujer de 39 años de edad presenta dolor pélvico debido a endometriosis que no es tratada adecuadamente con medicamentos antiinflamatorios no esteroidales (NSAI DS) y anticonceptivos de estrógeno-progestina combinados. El médico administra una composición comprendiendo un TSI de la presente invención (en este ejemplo, el TSI comprende una TM opioide - ejemplos paralelos son corridos con TSIs comprendiendo TMs de nociceptina o dinorfina). La condición del paciente es monitoreada y después de aproximadamente 1 -3 días después del tratamiento, la mujer indica que existe dolor reducido. En chequeos de uno y tres meses, la mujer indica que continúa teniendo dolor reducido y tiene libertad de movimiento mejorada. Esta reducción en los síntomas asociados con endometriosis indica tratamiento exitoso con la composición comprendiendo una molécula de la invención.
Ejemplo 17 Método para tratar pacientes que sufren de vejiga sobre-activa
Un hombre de 58 años de edad se queja de urgencia urinaria incrementada. Un médico diagnostica al paciente con vejiga sobre-activa teniendo un componente neurológico que involucra actividad neuronal anormal. El hombre es tratado al inyectar uretroscópicamente una composición comprendiendo un TSI de la presente invención (en este ejemplo, la TSI comprende una TM opioide - ejemplos paralelos son corridos con TSIs comprendiendo TMs de nociceptina o dinorfina). Dependiendo de la ubicación de la actividad neuronal anormal, la toxina
puede ser administrada en, por ejemplo, el detrusor, el cuello de vejiga incluyendo los esfínteres uretrales externo e interno, el trígono, el domo de vejiga u otras áreas de la pared de vejiga, y/u otras áreas que rodean la vejiga, tales como la uretra, uréter, diafragma urogenital, músculos pélvicos inferiores, próstata, glándula bulbouretral, bulbo, crus o pene. La condición del paciente es monitoreada y después de aproximadamente 1 -3 días de tratamiento, y el hombre indica que tiene una urgencia reducida de orinar. En chequeos de uno y tres meses, el hombre indica que continúa teniendo una urgencia reducida para orinar. Esta reducción en un síntoma de vejiga sobre-activa indica tratamiento exitoso con la composición comprendiendo una molécula de la invención.
Ejemplo 18 Método para tratar pacientes que sufren de inflamación neurogénica
Una mujer de 62 años de edad diagnosticada con artritis reumatoide se queja de rigidez de articulaciones e hinchazón. Un médico determina que la rigidez de articulaciones e hinchazón se debe a inflamación neurogénica crónica. La mujer es tratada mediante administración local de una composición comprendiendo un TSI de la presente invención en la cercanía del área afectada (en este ejemplo, el TSI comprende una TM opioide - ejemplos paralelos son corridos con TSIs comprendiendo TMs de nociceptina o dinorfina). La condición del paciente es monitoreada y después de aproximadamente 1 -3 días después del tratamiento, la mujer indica que existe rigidez de
articulaciones e hinchazón reducidas. En chequeos de uno y tres meses, la mujer indica que continúa teniendo rigidez de articulaciones e hinchazón reducidas en el área tratada. Esta reducción en síntomas de inflamación neurogénica crónica indica el tratamiento exitoso con la composición comprendiendo una molécula de la invención. Un tipo similar de administración local de una proteina como se describe en la presente especificación puede usarse para tratar un paciente que sufre de inflamación neurogénica crónica asociada con cualquier monoartritis, oligoartritis o poliartritis, tales como, por ejemplo, osteoartritis, artritis idiopática juvenil, artritis séptica, una espondiloartropatía (incluyendo espondilitis anquilosante, artritis reactiva (síndrome de Reiter), artritis psoriáticas, artritis enteropáticas asociados con enfermedad de intestino inflamatorio, enfermedad de Whipple o enfermedad de Behcet), una sinovitis, gota, pseudogota, o enfermedad de Still, así como una bursitis, una fiebre reumática o una tenosinovitis. Además, la administración sistémica podría ser usada también para administrar una composición comprendiendo una molécula de la invención para tratar inflamación neurogénica crónica.
Claims (26)
1 . U na proteína de fusión de polipéptido de cadena simple, que comprende: (a) una proteasa no citotoxica capaz de cortar una proteína del aparato de fusión exocítico de una célula objetivo; (b) una porción de foca lización que es capaz de unión a un sitio de unión sobre la célula objetivo , d icho sitio de un ión es capaz de experimentar endocitosis para ser i ncorporado en un endosoma dentro de la célula objetivo; (c) un dominio de translocación que es capaz de translocar la proteasa desde dentro de u n endosoma, a través de la membrana endosomal y hacia el citosol de la célu la objetivo; (d) un primer sitio de corte de proteasa en d icho sitio la proteína de fusión es cortable por una primera proteasa , en donde el primer sitio de corte de proteasa está u bicado entre la proteasa no citotoxica y el dominio de translocación ; (e) un segundo sitio de corte de proteasa en dicho sitio la proteína de fusión es cortable por u na seg u nda proteasa, en donde el segundo sitio de corte de proteasa está ubicado entre el dom in io de translocación y la porción de focalización ; y (f) un enlace covalente entre la porción de focalización y el dominio de translocación , en donde sig uiendo el corte proteolítico en el segundo sitio de corte de proteasa , la porción de focalización permanece enlazada al dom inio de translocación por dicho enlace covalente.
2. La proteína de fusión de la reivindicación 1 , en donde el dominio de translocación está ubicado entre la proteasa no citotoxica y la porción de focalización.
3. La proteína de fusión de la reivindicación 1 , en donde la porción de focalización está ubicada entre la proteasa no citotoxica y el dominio de translocación; y en donde el primer sitio de corte de proteasa está ubicado adicionalmente entre la proteasa no citotoxica y la porción de focalización.
4. La proteína de fusión de cualquier reivindicación precedente, en donde la proteasa no citotoxica está ubicada en el extremo N de la proteína.
5. La proteína de fusión de cualquier reivindicación precedente, en donde el enlace covalente es un enlace disulfuro.
6. La proteína de fusión de cualquier reivindicación precedente, en donde se ubica entre el dominio de translocación y la porción de focalización, un polipéptido corto que proporciona una estructura de polipéptido secundaria, y en donde dicha estructura de polipéptido secundaria actúa para llevar parte de la porción de focalización hacia estrecha proximidad al dominio de translocación, haciendo por ello la formación del enlace covalente energéticamente más favorable.
7. La proteína de fusión de cualquier reivindicación precedente, en donde la porción de focalización comprende primero y segundo dominios, y en donde el primero y segundo dominios son separados por cuando mucho 1 0 residuos de aminoácidos, de preferencia por cuando mucho 5 residuos de aminoácidos, y más preferiblemente por cero residuos de aminoácidos.
8. La proteína de fusión de la reivindicación 7, en donde el primero y segundo dominios de la porción de focalización son derivados de ligandos a diferentes receptores.
9. La proteína de fusión de cualquier reivindicación precedente, en donde la porción de focalización es capaz de interactuar con el sitio de unión sobre la célula objetivo vía una interacción entre un dominio N-terminal de la porción de focalización y un dominio di sitio de unión y simultáneamente vía una interacción entre un dominio C-terminal de la porción de focalización y un dominio del sitio de unión.
10. La proteína de fusión de cualquier reivindicación precedente, en donde la porción de focalización comprende o consiste de un péptido seleccionado del grupo que consiste de: un péptido de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) , un péptido opioide, un péptido de beta-endorfina, un péptido de bradicinina, un péptido BAM, un péptido de nociceptina, un péptido de dinorfina, un péptido de galanina, un péptido de encefalina, un péptido de substancia P, un péptido de factor de liberación de corticotropina (CRF), un péptido de liberación de gastrina (GRP) , un péptido de Neuromedina B, un péptido de bombesina, un péptido de gastrina, un péptido de CCK, un péptido de somatostatina (ST), un péptido de cortistatina (CST), un péptido de hormona liberadora de hormona de crecimiento (GHRH), un péptido PAR, un péptido de hormona paratiroidea (PTH), un péptido vasointestinal (VI P), un péptido agonista de beta2 adrenoreceptor, un péptido liberador de gastrina, un péptido relacionado con gene de calcitonina, un péptido de hormona estimulante de tiroide (TSH), un péptido de insulina, un péptido de factor de crecimiento similar a insulina, un péptido de gonadorelina , un péptido de hormona liberadora de corticotrofina (CRH), un péptido de hormona adrenocorticotrópico (ACTH), un péptido activador de adenil ciclasa de pituitaria (PACAP).
1 1 . La proteína de fusión de cualquier reivindicación precedente, en donde la proteasa no citotóxica y el primer sito de corte de proteasa son separados por cuando mucho 10 residuos de aminoácidos, de preferencia por cuando mucho 5 residuos de aminoácidos, y más preferiblemente por cero residuos de aminoácidos.
12. La proteína de fusión de cualquier reivindicación precedente, en donde el dominio de translocación y el primer sitio de corte de proteasa son separados por cuando mucho 1 0 residuos de aminoácidos, de preferencia por cuando mucho 5 residuos de aminoácidos, y más preferiblemente por cero residuos de aminoácidos.
1 3. La proteína de fusión de cualquier reivindicación precedente, en donde el dom inio de translocación y el segundo sitio de corte de proteasa son separados por cuando mucho 10 residuos de aminoácidos, de preferencia por cuando mucho 5 residuos de aminoácidos, y más referiblemente por cero residuos de aminoácidos.
14. La proteína de fusión de cualquier reivindicación precedente, en donde la porción de focalización y el segundo sitio de corte de proteasa están separados por cuando mucho 1 0 residuos de aminoácidos, de preferencia por cuando mucho 5 residuos de aminoácidos, y más preferiblemente por cero residuos de aminoácidos.
1 5. La proteína de fusión de cualquier reivindicación precedente, en donde la primera proteasa y la seg unda proteasa son iguales.
1 6. La proteína de fusión de cualquier reivindicación precedente, en donde la proteasa no citotóxica es una cadena L de neurotoxina clostridial o u n fragmento de la m isma .
1 7. La proteína de fusión de cualquier reivindicación precedente, en donde el dom inio de translocación es un dominio H N de neurotoxina clostridial o u n fragmento del mismo.
1 8. La proteína de fusión de cualquier reivindicación precedente, en donde la proteína de fusión comprende una etiqueta de purificación .
1 9. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de polipéptido de acuerdo con cualquier reivindicación precedente.
20. Un vector de D NA, comprendiendo un promotor, una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 9, y un terminador; en donde dicha secuencia de ácido nucleico está ubicada corriente abajo del promotor; y en donde dicho terminador está ubicado corriente debajo de la secuencia de ácido nucleico.
21 . El filamento de DNA complementario de la secuencia de DNA de acuerdo con la reivind icación 1 9.
22. Un método para preparar una proteína de fusión de polipéptido de cadena simple de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -1 8, comprendiendo expresar una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 19, o un vector de DNA de acuerdo con la reivindicación 17, en una célula huésped.
23. Un método para preparar un agente no citotóxico que comprende: a. proporcionar una solución conteniendo una proteína de fusión de cadena simple de la invención ; b. adicionar a dicha solución una primera proteasa capaz de cortar el primer sitio de corte de proteasa y una segunda proteasa capaz de cortar el segundo sitio de corte de proteasa; y c. cortar el primer sitio de corte de proteasa y el segundo sitio de corte de proteasa; formando por ello una proteína de fusión tri-cadena.
24. Un polipéptido no citotóxico, obtenible mediante el método de la reivindicación 23, en donde el polipéptido es un polipéptido tri-cadena, y en donde: a. la primera cadena comprende la proteasa no citotóxica capaz de cortar una proteína del aparato de fusión exocítico de una célula objetivo; b. la segunda cadena comprende el dominio de translocación que es capaz de translocar la proteasa no citotóxcia desde dentro de un endosoma, a través de la membrana endosomal y hacia el citosol de la célula objetivo; c. la tercera cadena comprende la porción de focalización que es capaz de unión a un sitio de unión sobre la célula objetivo, dicho sitio de unión es capaz de experimentar endocitosis para ser incorporado en un endosoma dentro de la célula objetivo; d. la primera y segunda cadenas son enlazadas juntas por disulfuro; y el segundo y tercer dominios son enlazados juntos por un enlace covalente.
25. Una proteína de fusión de polipéptido de cadena simple de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -1 8 o un polipéptido no citotóxico de acuerdo con la reivindicación 24, para usarse para tratar, prevenir o mejorar una condición médica.
26. Una proteína de fusión de polipéptido de cadena simple para uso de acuerdo con la reivindicación 25 o un polipéptido no citotóxico para uso de acuerdo con la reivindicación 25, en donde la condición médica es seleccionada de dolor, inflamación neurogénica (crónica), condiciones urogenitales-neurológicas tales como vejiga sobre-activa, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de pecho o cáncer colorrectal.
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