JP6362576B2 - 癌の抑制 - Google Patents

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Description

本発明は癌の抑制に関する。
癌は、体内で異常な様式で分裂し、浸潤し、そして生存する細胞で構成される。癌は、細胞内のＤＮＡに対する変化が細胞分裂及び細胞生存に関連する他のプロセスの制御に影響を与える場合に発生する。癌性腫瘍が増殖するにつれ、それらはそれらの周囲の体組織に浸潤する。これは体に対して有害である。なぜなら、それは、周囲の正常組織を損傷し、生理学的応答に対して有意な効果を有するからである。また、癌は体の他の部分に広がり、二次腫瘍に発生しうる。癌の評価を、種々のテスト（ＣＴスキャン、ＭＲＩ画像、ＰＥＴスキャン、結合ＰＥＴ−ＣＴスキャン、及び超音波テストを含む）を使用して試みることができる。一般的に、癌がより早期に検出され、確認されるほど、患者についての全体的な予後はより良好である。
様々な処置が、癌と診断された患者について利用可能である。これらは、種々の外科的介入、放射線療法、化学療法、及びホルモン治療を含む。これらの処置は、単独で使用してもよいが、しかし、最も一般にはそれらは互いに組み合わせて使用される。治療の組み合わせの使用は、一般に複数の治療介入を要求する特定の癌（例えば乳癌など）と診断される癌の型に依存的である。癌を処置するために、生物学的産物を利用して開発中である種々の新たな治療的アプローチがある（抗体、免疫療法、及びワクチン接種技術を含む）。追加の処置アプローチ（血管新生を遮断するよう設計された新規治療法の使用を含む）が開発中である。新規アプローチ（遺伝子治療の使用を含む）も潜在的な治療法として研究されている。しかし、新たな癌治療の開発のための多大の科学的努力及び莫大な財政的な注力にもかかわらず、多くの患者での予後は極めて不良なままである。
乳癌は英国において最もよく見られる癌であり、毎年、４４，０００人以上の女性がこの型の癌と診断される。世界中で、１００万人以上の女性が毎年乳癌と診断される。英国において、患者の約８０%が５年間又はより長く生存する。
肺癌は英国において２番目によく見られる癌であり、３７，０００を超える人々が英国において２００３年に肺癌と診断された。肺癌と診断された患者について、わずか約２０%が診断後少なくとも１年間にわたり生存し、わずか約６%が診断後５年間又はより長く生きる。
結腸直腸癌は全体で３番目によく見られる癌型であり、それは２番目に多く女性に罹患する（乳癌に続く）。３５，０００人をわずかに超える人々が、英国において２００３年に結腸直腸癌と診断された。イングランド及びウェールズにおいて腸癌及び直腸癌と診断された人々の内、４６%がその診断後に少なくとも５年間生存する。
膵臓癌は西欧諸国において４番目に最もよく見られる癌による死亡原因であり、７０００を超える症例が英国において毎年診断される。治療の進歩にもかかわらず、膵臓癌と診断された人々のわずか３〜４%が５年間又はより長く生存し、成功した治療的介入は、患者のわずか１５%に適用可能である外科手術に限定される。
腎臓癌は全体で９番目に最もよく見られる癌型であり、英国において毎年７０００を超える新たな症例が診断され、３５００人超が死亡している。腎臓癌の新たな約２０８，５００症例が、世界において毎年診断されており、全ての癌のわずか２%未満を占める。それは女性よりも男性においてよく見られ、男女比は１．５：１である。腎臓癌患者の３０%が、最初の診断で進行性腎細胞癌の徴候を示し、転移がこの時点で患者の１５〜２５%において検出される。
癌は、大幅に増えることが予測される世界的な問題を表わす。２０００年に、悪性腫瘍が、世界中で報告されたあらゆる原因の５６００万近くの死亡の１２パーセントに関与した。一部の国々において、死亡の４分の１以上が癌に起因しうる。２０００年、５３０万の男性及び４７０万の女性が悪性腫瘍を発生し、全体で６２０万人がこの疾患で死亡した。癌の率は２０２０年にはさらに５０%増加（１５００万の新たな症例）しうることが予測されている（WHO World Cancer Report (IARC, Ed B. W. Stewart and P. Kleihues, 2003)）。
大多数の癌について、オートクラインシグナル伝達（ホルモンが受容体に結合し、それを産生する細胞型の機能に影響を与えるホルモン作用の機序と定義される）及び／又はパラクラインシグナル伝達（エンドクライン又はエンドクライン様細胞から放出されたホルモンが近くの細胞上の受容体に結合し、その機能に影響を与えるホルモン作用の機序と定義される）が、疾患状態の発生において重要な役割を果たすと考えられる。所与の癌について、複数のオートクラインシグナル伝達ループが、癌状態の発生及び維持に関与しうる。オートクラインシグナル伝達は、細胞分裂のための刺激を与えることに加え、細胞生存作用を増強し、細胞をアポトーシス及びネクローシスの機構から保護し、癌細胞の転移能を増加させることができる。
従って、当技術分野において、癌に特異的に対応することが可能である新たな治療法／治療薬のニーズがある。このニーズは本発明により対応され、それによって上記の問題の１つ又は複数が解決される。
より詳細には、本発明の第１の局面は、癌の抑制に使用するためのポリペプチドであって、ここでポリペプチドは以下：
（ｉ）非細胞傷害性プロテアーゼ（そのプロテアーゼは癌細胞においてＳＮＡＲＥタンパク質を切断することが可能である）；
（ｉｉ）癌細胞上の結合部位に結合することが可能である標的成分（ＴＭ）（その結合部位がエンドサイトーシスを受けて、癌細胞内のエンドソーム中に取り込まれることが可能であり、それにおいて前記癌細胞が前記ＳＮＡＲＥタンパク質を発現する）及び
（ｉｉｉ）エンドソームから（内の）プロテアーゼを、エンドソーム膜を通過して、癌細胞の細胞質中にトランスロケーションさせることが可能であるトランスロケーションドメインを含み；
ただし、癌細胞が神経内分泌腫瘍細胞ではなく；
そしてポリペプチドがクロストリジウム神経毒素（ホロ毒素）分子ではない、ポリペプチドを提供する。
本発明のポリペプチドは、天然クロストリジウム神経毒素分子（クロストリジウムホロ毒素としても公知）ではない。クロストリジウムホロ毒素は、ヒトに対する公知の最も致死的な神経毒素の１つであり、そのため、これ自体、治療用分子として大きな制限を有する。また、癌に関連して、クロストリジウムホロ毒素は、例えば神経筋接合部への望まない部位外標的化（即ち、非癌細胞の標的化）に関連する。
使用において、本発明のポリペプチドは癌細胞に結合する。その後、トランスロケーション成分が、癌細胞の細胞質中へのプロテアーゼ成分の輸送に影響を与える。最後に、一旦内部に入ると、プロテアーゼは、癌細胞の細胞質中に存在するＳＮＡＲＥタンパク質を切断することにより、癌細胞の細胞外融合プロセスを阻害する。このように、癌細胞の細胞外融合機構を不活性化することにより、本発明のポリペプチドは、それからの分泌（例、ＴＮＦ−アルファ、アセチルコリン、線維芽細胞増殖因子、ガストリン放出ペプチド、インターロイキン−６、ＶＥＧＦ及び／又はオートクライン可動性因子）を阻害する。したがって、前記分泌ペプチドが、例えば、オートクライン又はパラクラインシグナル伝達に関与する場合、本発明のポリペプチドは、オートクライン／パラクラインループが本来なら癌細胞に与える可能性のあるシグナル伝達駆動を低下させる。したがって、本発明のポリペプチドは、癌を抑制又は処置することが可能である。
第１の局面は、また、癌を抑制するための対応する方法を包含し、前記方法は、治療有効量の本発明のポリペプチドを患者に投与することを含む。本発明は、それにより、癌、例えば腎臓、乳房、肺、膵臓、及び結腸直腸（例、結腸）などを処置するための効果的な手段を提供する。
本発明のポリペプチドは、それらが単一の治療分子を使用して標的癌細胞からの複数のオートクライン及びパラクラインペプチドの分泌を阻害する可能性を有する点で、他の治療法とは異なる利点を提供する。これは、代替オートクラインシグナル伝達経路に切り替える又はそれを使用することにより特定の治療計画に適応する癌の能力を有意に低下させる。このように、本発明は、複数の経路を同時に遮断することにより、より有効な治療を提供する。
本発明の主な標的細胞は、癌細胞、例えば、１つ又は複数のホルモン（又は他の生物活性分子）を分泌する癌細胞であり、それは一旦分泌されると、受容体に結合し、前記癌細胞の機能に影響を与える。本発明により標的化される癌細胞の例は、以下：乳房、肺、膵臓、結腸直腸（例、結腸）、副腎、食道、リンパ腫（例、Ｂ細胞；マンテル細胞）、白血病（例、多発性骨髄腫）、急性白血病、膀胱、骨、脳腫瘍、腸、子宮頸部、慢性リンパ性白血病、ホジキンリンパ腫、腎臓、肝臓、皮膚（例、基底、扁平、メラノーマ）、中咽頭、ミエローマ、前立腺（例、柔組織肉腫）、胃、睾丸、及び子宮を含む。
一実施態様において、本発明の標的細胞は、ＳＮＡＲＥタンパク質発現のレベルが非所望である癌細胞である。
例えば、非所望のＳＮＡＲＥ発現は、ＳＮＡＲＥタンパク質の発現が、非癌性状態である場合に同じ（又は非常に類似の）細胞型と比較した場合にアップレギュレーションされる場合に生じうる。一実施態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質をコードするｍＲＮＡは、標的癌細胞においてアップレギュレーションされる。別の（又は同じ）実施態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質の細胞タンパク質濃度が（も）標的癌細胞において増加する。ＳＮＡＲＥのｍＲＮＡ又はタンパク質レベルを測定する場合、「１」の値を、健常な個人の非癌性細胞におけるＳＮＡＲＥのｍＲＮＡ又はタンパク質濃度に割り当ててもよく、その細胞は本来なら対象の癌細胞の細胞型と同じである（又は非常に類似している）。この値は「基礎発現レベル」と記載されうるが、典型的には、いくつかの細胞（同じ又は非常に類似の型の）から及び／又は異なる健常な個人から得られる発現レベル値の平均である。例えば、健常な個人における肺細胞（例、神経外胚葉肺細胞、又は肺上皮細胞）を、小細胞肺癌細胞との比較のために使用してもよい。このように、本発明に関連するアップレギュレーションは、ＳＮＡＲＥのｍＲＮＡ又はタンパク質レベルが、健常な個人における非癌性状態での同じ細胞型と比較した場合に「１より大きい」ことを意味する。一実施態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質又はｍＲＮＡレベルが、２又は３倍より大きく、あるいは４又は５倍より大きく、あるいは６又は７倍より大きくアップレギュレーションされる。別の実施態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質又はｍＲＮＡレベルが、８又は９倍より大きく、あるいは１０又は１２倍より大きく、あるいは１５又は２０倍より大きくアップレギュレーションされる。別の実施態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質又はｍＲＮＡレベルが、４０又は５０倍より大きく、あるいは６０又は７０倍より大きく、あるいは９０又は１００倍より大きくアップレギュレーションされる。
あるいは、非所望のＳＮＡＲＥ発現が、癌細胞におけるＳＮＡＲＥのｍＲＮＡ及び／又はタンパク質発現のレベルが、対応する同一の又は非常に類似の非癌性細胞型のものと比較した場合に実質的に正常である（即ち、実質的に同じである）場合に生じうる。このシナリオにおいて、しかし、例えば、患者が［前立腺癌、膀胱癌、又は子宮頸癌］に羅患している場合、より低い又は正常なレベルのＳＮＡＲＥタンパク質発現でさえ、機能がパラクライン又はオートクラインであるこの型の癌細胞からの分泌を支持しうるが、そこで癌に関連して、ＳＮＡＲＥタンパク質が非所望の分泌を支持している。このシナリオにおいて、本発明のポリペプチドは、前記癌細胞からの分泌を抑制することが可能であり、それにより当技術分野におけるこのニーズに対応する。
この点において、本発明者らは、広範な癌細胞型における非所望のＳＮＡＲＥ発現を同定している。これらのデータを、図３〜４７中のボックスプロットとして提示する。まとめると、本発明者らは以下を確認している：非所望のＳＮＡＲＥ発現、例えばＳＮＡＰ−２５、シンタキシン（例、シンタキシン−１ａ、シンタキシン−２）及びＶＡＭＰ（例、ＶＡＭＰ−１）などが、小細胞肺癌細胞（例、正常な肺細胞と比較した場合）において観察される；非所望のＳＮＡＲＥ発現、例えばＳＮＡＰ−２５、シンタキシン（例、シンタキシン−２）、ＶＡＭＰ（例、ＶＡＭＰ−１、ＶＡＭＰ−２、ＶＡＭＰ−３）などが、肺カルチノイド細胞において観察される；非所望のＳＮＡＲＥ発現、例えばＳＮＡＰ−２５、シンタキシン（例、シンタキシン−２）、ＶＡＭＰ（例、ＶＡＭＰ−１、ＶＡＭＰ−２）などが、肺カルチノイド細胞（例、正常な肺細胞と比較した場合）において観察される；非所望のＳＮＡＲＥ発現、例えばＳＮＡＰ−２５、シンタキシン（例、シンタキシン−２、シンタキシン−３）、及びＶＡＭＰ（例、ＶＡＭＰ−１、ＶＡＭＰ−３）などが、膀胱癌細胞において観察される；非所望のＳＮＡＲＥ発現、例えばＳＮＡＰ−２５、シンタキシン（例、シンタキシン−１ａ）、及びＶＡＭＰ（例、ＶＡＭＰ−２）などが、乳癌細胞において観察される；非所望のＳＮＡＲＥ発現、例えばＳＮＡＰ−２５、シンタキシン（例、シンタキシン−１ａ、シンタキシン−１ｂ、シンタキシン−２、シンタキシン−３）、及びＶＡＭＰ（例、ＶＡＭＰ−１、ＶＡＭＰ−２、及びＶＡＭＰ−３）などが、膵臓腺癌細胞（例、正常な膵臓細胞と比較した場合）において観察される；非所望のＳＮＡＲＥ発現、例えばＳＮＡＰ−２５、シンタキシン（例、シンタキシン−１ａ、シンタキシン−１ｂ、シンタキシン−３）、及びＶＡＭＰ（例、ＶＡＭＰ−２、ＶＡＭＰ−３）などが、前立腺癌細胞（例、良性の前立腺細胞と比較した場合）において観察される；非所望のＳＮＡＲＥ発現、例えばＳＮＡＰ−２５、シンタキシン（例、シンタキシン−２）、及びＶＡＭＰ（例、ＶＡＭＰ−３）などが、子宮頸部癌細胞（例、正常な子宮頸部細胞と比較した場合）において観察される；非所望のＳＮＡＲＥ発現、例えばシンタキシン（例、シンタキシン３）及びＶＡＭＰ（例、ＶＡＭＰ−１、ＶＡＭＰ−２、ＶＡＭＰ−３）などが、Ｂ細胞白血病細胞（例、正常なＢ細胞リンパ球と比較した場合）において観察される；非所望のＳＮＡＲＥ発現、例えばシンタキシン（例、シンタキシン−１ａ、シンタキシン３）及びＶＡＭＰ（例、ＶＡＭＰ−１）などが、卵巣癌細胞（例、正常な卵巣細胞と比較した場合）において観察される（例、アップレギュレーションされる）；非所望のＳＮＡＲＥ発現、例えばＳＮＡＰ−２５及びＶＡＭＰ（例、ＶＡＭＰ−１、ＶＡＭＰ−２、及びＶＡＭＰ−３）などが、胃腸（ＧＩ）カルチノイド細胞（例、正常なＧＩ細胞と比較した場合）において観察される；ならびに非所望のＳＮＡＲＥ発現、例えばＳＮＡＰ−２５、シンタキシン（例、シンタキシン−１ａ、シンタキシン−２）及びＶＡＭＰ（例、ＶＡＭＰ−３）などが、頭頸部癌細胞（例、正常な頭頸部細胞と比較した場合）において観察される（例、アップレギュレーションされる）。また、本発明者らは以下を特定している：非所望のＳＮＡＲＥ発現、例えばＳＮＡＰ−２５及びＶＡＭＰ（例、ＶＡＭＰ−２）などが、結腸癌細胞において観察される；非所望のＳＮＡＲＥ発現、例えばＳＮＡＰ−２５などが、副腎癌細胞において観察される；非所望のＳＮＡＲＥ発現、例えばシンタキシン（例、シンタキシン−２）などが、皮膚（例、メラノーマ）癌細胞において観察される；非所望のＳＮＡＲＥ発現、例えばシンタキシン（例、シンタキシン−３）などが、白血病（例、多発性メラノーマ）癌細胞において観察される；非所望のＳＮＡＲＥ発現、例えばシンタキシン（例、シンタキシン−１ａ）及びＶＡＭＰ（例、ＶＡＭＰ−１）などが、肺腺癌細胞において観察される；非所望のＳＮＡＲＥ発現、例えばＶＡＭＰ（例、ＶＡＭＰ−１）などが、肝臓癌細胞において観察される；非所望のＳＮＡＲＥ発現、例えばＶＡＭＰ（例、ＶＡＭＰ−２）などが、食道癌細胞において観察される；ならびに非所望のＳＮＡＲＥ発現、例えばＶＡＭＰ（例、ＶＡＭＰ−３）などが、リンパ腫癌細胞（例、Ｂ細胞リンパ腫及びマンテル細胞）において観察される。
本発明のポリペプチドの「生物活性」成分が、非細胞傷害性プロテアーゼにより提供される。この異なる群のプロテアーゼは、ＳＮＡＲＥタンパク質として公知の細胞内輸送タンパク質（例、ＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰ、又はシンタキシン）をタンパク質分解的に切断することにより作用する。Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology" (4th edition) John Wiley & Sons, Inc.を参照のこと。頭字語ＳＮＡＲＥは可溶性ＮＳＦ付着受容体という用語に由来し、ここでＮＳＦはＮ−エチルマレイミド感受性因子を意味する。ＳＮＡＲＥタンパク質は、細胞内小胞形成、ひいては小胞輸送を介した細胞からの分子の分泌に不可欠である。したがって、一旦所望の標的細胞に送達されると、非細胞傷害性プロテアーゼは標的細胞からの細胞分泌を阻害することが可能である。
非細胞傷害性プロテアーゼは、細胞を殺さない別のクラス分子である；代わりに、それらは、タンパク質合成以外の細胞プロセスを阻害することにより作用する。非細胞傷害性プロテアーゼは、より大きな毒性分子の部分として、種々の植物により及び種々の微生物（例えばクロストリジウム属及びナイセリア属など）により産生される。
クロストリジウム神経毒素は非細胞傷害性毒素分子の主な群を表わし、ジスルフィド結合により互いに連結された２つのポリペプチド鎖を含む。２本の鎖は、重鎖（Ｈ鎖）（分子量約１００kDaを有する）及び軽鎖（Ｌ鎖）（分子量約５０kDaを有する）と名付けられる。プロテアーゼ機能を持ち、細胞外プロセスに関与する小胞及び／又は原形質膜関連（ＳＮＡＲＥ）タンパク質（例、シナプトブレビン、シンタキシン、又はＳＮＡＰ−２５）について高い基質特異性を示すのがＬ鎖である。これらの基質は神経分泌機構の重要な成分である。
ナイセリア属（最も重要なものはＮ． ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ種由来）及びストレプトコッカス属（最も重要なものはＳ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ種由来）は、機能的に類似の非細胞傷害性毒素分子を産生する。そのような非細胞傷害性プロテアーゼの例は、ＩｇＡプロテアーゼである（ＷＯ９９／５８５７１を参照のこと。それはその全体がその参照により本明細書により組み入れられる）。このように、本発明の非細胞傷害性プロテアーゼは、好ましくは、クロストリジウム神経毒素プロテアーゼ又はＩｇＡプロテアーゼである。
ここで本発明の標的成分（ＴＭ）の成分を見ると、本発明のポリペプチドを癌細胞に結合させるのがこの成分である。ＴＭは好ましくはペプチドである。
ＴＭは癌細胞上の結合部位に結合し、それにより他の細胞と比べ、この種の標的細胞にポリペプチドが選択性を示す。例として、胃癌において、ＴＭは、好ましくは、胃の他の細胞、例えば体において癌性ではない細胞及び／又は他の非癌性（又は癌性）細胞に優先して胃癌細胞に結合する。この点において、本発明の好ましいＴＭの実施態様は、抗体（例、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆｖ、ＳｃＦｖなど、及び抗体ドメインペプチド）、ならびに結合スキャフォールドを含み、それらは以下に定義する受容体に結合する。したがって、本発明のポリペプチドは、市販の抗体又は結合スキャフォールドを含みうるが、それらは対象の標的細胞又は受容体に対する特異的な結合を達成するように設計されている。あるいは、好ましいＴＭは、ペプチドリガンド、例えばサイトカイン、増殖因子、神経ペプチド、及びレクチンなどを含む。
本発明のＴＭは、癌細胞上の受容体に結合する。例として、本発明のＴＭは、以下：成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ、別名ＧＨＲＦ／ＧＲＦ）受容体；インスリン様増殖因子受容体（例、ＩＧＦ−１受容体）；コルチコトロピン放出因子受容体（例、ＣＲＨＲ−２）；ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）受容体；ボンベシンペプチド（ＢＢ）受容体、例えばＢＲＳ−１、ＢＲＳ−２、又はＢＲＳ−３など；成長ホルモン（ＧＨ）受容体；インターロイキン受容体（例、ＩＬ８ＲＡ又はＩＬ１３ＲＡ１）；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体；アセチルコリン（ＡＣＨ）受容体；ソマトスタチン（ＳＳＴ）受容体、例えばＳＳＴ１、ＳＳＴ２、ＳＳＴ３、ＳＳＴ４、又はＳＳＴ５など；コルチスタチン（ＣＳＴ）受容体；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体、例えばＣＸＣＲ４など；ニューロピリン受容体；ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）受容体；ＶＩＰ−グルカゴン−ＧＲＦ−セクレチンスーパーファミリー受容体、例えばＰＡＣ（例、ＰＡＣ１）受容体又は血管作用性腸ペプチドＶＰＡＣ受容体（例、ＶＰＡＣ−１又はＶＰＡＣ−２）受容体；あるいはＥｒｂＢファミリーメンバー受容体、例えばＥＧＦ受容体などからなる群より選択される癌細胞上の受容体に結合する。これらの受容体の全てが、癌細胞において過剰発現される。
本発明の一実施態様において、ＴＭは、以下：ＦＬＴ、例えばＦＬＴ１、ＦＬＴ４、ＦＬＴ３など、ＢＲＳ、例えばＢＲＳ３など；ＣＨＲＮ、例えばＣＨＲＮＡ１、ＣＨＲＮＤ、又はＣＨＲＮＥなど；ＥＰＨＡ、例えばＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２など；ＥＦＮ、例えばＥＦＮＢ３、ＥＦＮＡ１、ＥＦＮＢ２、ＥＦＮＡ３、ＥＦＮＢ１など；ＥｒｂＢ、例えばＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ４など；ＤＬＫ１、ＤＬＬ３、ＦＧＦ、例えばＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ２など；ＧＲＰＲ；ＧＮＲＨＲ；ＧＲＰＲ；ＧｎＲＨＲ；ＪＡＧ、例えばＪＡＧ１（ＣＤ３３９）又はＪＡＧ２など、ＩＦＧＲ、例えばＩＧＦ１Ｒなど；白血病阻害因子受容体（ＬＩＦＲ）；ＮＭＢＲ；ＮＯＴＣＨＲ、例えばＮＯＴＣＨ３又はＮＯＴＣＨ４など；ＶＩＰＲ、例えばＶＩＰＲ１など；ＶＥＧＦＲ、例えばＶＥＧＦＲ２など；ＳＳＴＲ、例えばＳＳＴＲ１など；ＮＭＢＲ；あるいはＰＤＧＦＲ、例えばＰＤＧＦＲＡ又はＰＤＧＦＲＢなどからなる群より選択される癌細胞上の受容体に結合する。これらの受容体の全てが、癌細胞において過剰発現される。
一実施態様において、ＴＭは以下：アドレノメデュリン（ＡＤＭ）ペプチド、ＡＭペプチド、オートクライン可動性因子（ＡＭＦ）ペプチド、アンフィレグリンペプチド、ＡＰＲＩＬ（増殖誘導リガンド）ペプチド、アルテミンペプチド、ベータセルリンペプチド、ボンベシンペプチド、カルシトニン受容体（ＣＴＲ）結合ペプチド、ＥｒｂＢペプチド、例えばＥＧＦペプチドなど、エンドセリンペプチド、エリスロポエチンペプチド（ＥＰＯ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ペプチド、例えばＦＧＦ−５ペプチド、ＦＧＦ−１８ペプチド、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ８、又はＦＧＦ１７ペプチドなど、ろ胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）ペプチド、ガストリンペプチド、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ペプチド、グレリン（ＧＨＲＬ）ペプチド、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）ペプチド、顆粒球コロニー刺激性因子（Ｇ−ＣＳＦ）ペプチド、成長ホルモン（ＧＨ）ペプチド、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）ペプチド、肝細胞増殖因子／分散因子（ＨＧＦ／ＳＦ）ペプチド、インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１アルファペプチド、ＩＬ−６ペプチド、ＩＬ−８ペプチド、又はＩＬ−１０ペプチドなど、ＩＧＦ−１ペプチド、ストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）ペプチド、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）ペプチド、プロエピセリン（ｐｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉｎ）／グラニュリンペプチド、レプチン（ＬＥＰ）ペプチド、ＬＩＦペプチド、アルファ−メラノトロピンペプチド、ＭＧＳＡ／ＧＲＯ−アルファ、ベータ、又はガンマペプチド、ＮＲＧ−１アルファペプチド、オキシトシンペプチド、オステオポンチン（ＯＰＮ）ペプチド、ニューレグリン−１ペプチド、ＰＡＣＡＰペプチド、ＰＤＧＦペプチド、例えばＰＤＧＦ−アルファペプチド、ＰＤＧＦ−ベータペプチド、ＰＤＧＦ−Ｃペプチド、又はＰＤＧＦ−Ｄペプチド、プロラクチンペプチド、ＳＣＦペプチド、ソマトスタチンペプチド、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ペプチド、例えばＴＮＦ−アルファペプチドなど、ＴＧＦ−ベータペプチド、ＴＧＦ−ベータ１ペプチド、ＶＥＧＦペプチド、例えばＶＥＧＦ−Ｃペプチド又はＶＥＧＦ−Ｄペプチドなど、バソプレッシンペプチド、ＶＩＰペプチド、アンギオポエチンペプチド、例えばアンギオポエチン−１ペプチド又はアンギオポエチン−２ペプチドなど、Ｂ−ＣＬＬペプチド、ＢＣＧＦ−１２ＫＤペプチド、ＢＡＦＦペプチド、ガラニンペプチド、ＧＤＮＦペプチド、ＧｎＲＨペプチド、ＩＧＦ−ＩＩペプチド、ＬＨペプチド、ニューロトロフィンペプチド、サブスタンスＰペプチド、又はＴＧＦ−アルファペプチド；ならびにその切断物及びペプチドアナログより選択される。
一実施態様において、本発明のＴＭは、レプチン受容体に結合する。そのようなＴＭの適した例は、以下：レプチンペプチド、例えば全長レプチンペプチド（例、ペプチン１６７）など、ならびにその切断物又はペプチドアナログ、例えばレプチン２２−１６７、レプチン７０−９５、及びレプチン１１６−１２２などを含む。
別の実施態様において、本発明のＴＭは、グレリン受容体に結合する。この点における適したＴＭの例は、以下：グレリンペプチド、例えば全長グレリン（例、グレリン１１７）ならびにその切断物又はペプチドアナログ、例えばグレリン２４−１１７、及びグレリン５２−１１７；［Ｔｒｐ３，Ａｒｇ５］−グレリン（１−５）、ｄｅｓ−Ｇｌｎ−グレリン、コルチスタチン−８、Ｈｉｓ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２、成長ホルモン放出ペプチド（例、ＧＨＲＰ−６）、又はヘキサレリンを含む。
一実施態様において、本発明のＴＭは、ソマトスタチン（ＳＳＴ）受容体に結合する。例として、適したＴＭは、以下：ＳＳＴペプチド及びコルチスタチン（ＣＳＴ）ペプチド、ならびにそのペプチドアナログ、例えばＤ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−ＮＨ２（ＢＩＭ ２３０５２）、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｎａｌ−ＮＨ２（ＢＩＭ ２３０５６）又はｃ［Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−ＮＨ２（ＢＩＭ−２３２６８）などを含む。さらなる例は、ＳＳＴペプチド、例えばＳＳＴ−１４及びＳＳＴ−２８；ならびにペプチド及びペプチドアナログ、例えばオクトレオチド、ランレオチド、ＢＩＭ２３０２７、バプレオチド、セグリチド、及びＳＯＭ２３０を含む。これらのＴＭは、ＳＳＴ受容体、特にｓｓｔ１、ｓｓｔ２、ｓｓｔ３、ｓｓｔ４、及びｓｓｔ５受容体に対する結合についての好ましいＴＭである。
別の実施態様において、本発明のＴＭは、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）受容体に結合する。ＧｎＲＨは、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）としても公知である。適したＧｎＲＨ受容体ＴＭの例は、以下：ＧｎＲＨＩペプチド、ＧｎＲＨＩＩペプチド及びＧｎＲＨＩＩＩペプチド、例えば全長９２アミノ酸ＧｎＲＨ前駆体ポリペプチド及びその切断物、例えばデカペプチド：ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ ＣＯＮＨ２を含む。
一実施態様において、本発明のＴＭは、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）受容体に結合する。適した例は、例えばＩＧＦ−１ペプチド及びＩＧＦ−２ペプチドを含む。
一実施態様において、本発明のＴＭは、ＶＩＰ−グルカゴン−ＧＲＦ−セクレチンスーパーファミリー受容体、例えばＰＡＣ（例、ＰＡＣ１）又はＶＰＡＣ（例、ＶＰＡＣ−１又はＶＰＡＣ−２）受容体などに結合する。そのようなＴＭの適した例は、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（ＰＡＣＡＰ）、血管作用性腸ペプチド（ＶＩＰ）、ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。
一実施態様において、ＴＭは、ＶＩＰペプチド（ＶＩＰ−１及びＶＩＰ−２ペプチドを含む）、例えばＶＩＰ（１−２８）、又はその切断物もしくはペプチドアナログを含む。これらのＴＭは、ＶＰＡＣ−１に対する選択的な結合を示す。あるいは、ＶＰＡＣ２に対する選択的な結合を示すＴＭ、例えばｍＲＯＭなど（Yu et al., Peptides 27 (6) p1359-66 (2006)を参照のこと。それはその参照により本明細書により組み入れられる）を用いてもよい。別の実施態様において、ＴＭは、ＰＡＣＡＰペプチド、例えば、ＰＡＣＡＰ（１−３８）もしくはＰＡＣＡＰ（１−２７）、又はその切断物もしくはペプチドアナログでありうる。これらのＴＭは、ＰＡＣ（例、ＰＡＣ−１）受容体への結合のための好ましいＴＭである。
一実施態様において、本発明のＴＭは、インターロイキン受容体に結合する。適したＴＭの例は以下：ＩＬ−１ペプチド（例、ＩＬ−１α、ＩＬ−β、ＩＬ−１８ペプチド）及びその切断物又はペプチドアナログ、ＩＬ−２ペプチド（例、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３ペプチド）及びその切断物又はペプチドアナログ、ＩＬ−６及びＩＬ−８ペプチドならびにその切断物又はペプチドアナログ、ならびにＩＬ−１７ペプチド（例、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｃペプチド）及びその切断物又はペプチドアナログを含む。
別の実施態様において、本発明のＴＭは、ＮＧＦ受容体に結合する。適したＴＭの例は、全長ＮＧＦ、及びその切断物又はペプチドアナログを含む。
一実施態様において、本発明のＴＭは、血管作用性上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体に結合する。適したＴＭの例は以下：ＶＥＧＦペプチド（例、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、又はＶＥＧＦ−Ｅ及び関連するスプライスバリアント）及びその切断物又はペプチドアナログ、ならびに胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）及びその切断物又はペプチドアナログを含む。
別の実施態様において、本発明のＴＭは、ＥｒｂＢ受容体に結合する。例として、ＴＭは、以下：ＥＧＦペプチド、形質転換増殖因子−α（ＴＧＦ−α）ペプチド、ＥＧＦ及びＴＧＦ−αのキメラ、アンフィレグリンペプチド、ベータセルリンペプチド、エピジェン（ｅｐｉｇｅｎ）ペプチド、エピレグリンペプチド、ヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）ペプチド、ニューレグリン（ＮＲＧ）ペプチド、例えばＮＲＧ１α、ＮＲＧ１β、ＮＲＧ２α、ＮＲＧ２β、ＮＲＧ３、ＮＲＧ４など及びニューロレグリン（ｎｅｕｒｏｒｅｇｕｌｉｎ）スプライスバリアント、トモレグリン（ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ）１及び２ペプチド、ニューログリカン（ｎｅｕｒｏｇｌｙｃａｎ）−Ｃペプチド、ｌｉｎ−３ペプチド、静脈ペプチド、ｇｕｒｋｅｎペプチド類、ｓｐｉｔｚペプチド、又はｋｅｒｅｎペプチド；ならびにその切断物及びペプチドアナログより選択される。４クラスのＥｒｂＢ受容体（ＥｒｂＢ１、ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３、及びｅｒｂＢ４と名付けられる）があり、それらはＨＥＲ受容体ともいわれる。これらの受容体の多くのバリアントが存在し、それらは選択的スプライシング及び／又は全長受容体の切断に起因する（例、ＥＧＦＲ ｖ１の翻訳はａａ５４３で開始する；ａａ５２１−６０３のＥＧＦＲ ｖＩＩ欠失；ａａ６−２７３のＥＧＦＲ ｖＩＩＩ欠失；ａａ６−２７３及び４０９−５２０のＥＧＦＲｖＩＩＩ／Δ１２−１３欠失；ａａ９５９−１０３０のＥＧＦＲ ｖＩＶ欠失；残基９５８でのＥＧＦＲ ｖＶ切断；６−２７３のＥＧＦＲ ＴＤＭ／２−７直列重複；６６４−１０３０のＥＧＦＲ ＴＤＭ／１８−２５直列重複；６６４−１０１４のＥＧＦＲ−ＴＤＭ／１８−２６直列重複）。また、４つのＥｒｂＢ４受容体アイソフォームがあり、ｅｒｂＢ４ ＪＭ−ａ、ｅｒｂＢ４ ＪＭ−ｂ、ｅｒｂＢ４ ＣＹＴ−１、及びｅｒｂＢ４ ＣＹＴ−１と呼ばれる。
好ましいＴＭは、ＥｒｂＢ受容体（例、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４）及びそのスプライスバリアント、特にＥｒｂＢ１受容体に結合する。ＥｒｂＢ ＴＭは、また、６システインＥＧＦモジュール内の４番目と５番目のシステインの間でのスプライス部位を有するＥＧＦモチーフを含むタンパク質を含みうるが、そこでこのモジュールは、潜在的なリガンドの膜貫通領域に近接して位置する。例えば、光受容体間マトリックスプロテオグリカン−２（ＩＭＰ−２）、メプリン（ＭＥＰ）１α、ＭＥＰ１β、ムチン（ＭＵＣ）３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１２、及びＭＵＣ１７、ならびにＴノットスキャフォールドを有するタンパク質、例えばポテトカルボキシペプチダーゼ阻害剤、及びＥｒｂＢ受容体に対する抗体、例えばセツキシマブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ、トラスツズマブ、又はＥＭＤ７２０００。さらなる例は、以下：異なるＥｒｂＢリガンドのドメイン（ループ配列及び／又は連結アミノ酸）のスワッピングにより生成されるキメラ、例えばＢループ配列が昆虫（ショウジョウバエ）ＥｒｂＢリガンド中に存在するものにより置換されている哺乳動物ＥｒｂＢ受容体リガンド、ＥＧＦのＣループ配列がＴＧＦα（４４−５０）のものにより置換されているＥｒｂＢリガンド、１つ又は複数のドメインがＴＧＦα中の対応する配列により置換されており、ＥＧＦ／ＴＧＦαキメラ（例、Ｅ３Ｔ、Ｔ３Ｅ、Ｅ４Ｔ、Ｔ４Ｅ、Ｔ３Ｅ４Ｔ、Ｔ６Ｅ、及びＥ３Ｔ４Ｅ）を作製するＥＧＦリガンド、及びＮ末端ＴＧＦα配列（ＷＳＨＦＮＤ）又はニューレグリン配列（ＳＨＬＶＫ）を使用し、最初のシステイン残基（ＮＳＤＳＥ）のＮ末端ＥＧＦ配列Ｃ末端が置換されているＥＧＦキメラ、Ｔ１Ｅ、及びビレグリン（ｂｉｒｅｇｕｌｉｎ）を含む。さらなるキメラは、ドメインが、別のタンパク質、例えば血液凝固、神経発生、又は細胞接着タンパク質（例、Ｎｏｔｃｈ ３、Ｄｅｌｔａ １、ＥＭＲ１、Ｆ４／８０、ＥＭＲ３、及びＥＭＲ４受容体）などのＥＧＦ様ドメインにより置換されているＥＧＦを含む。
別の実施態様において、本発明のＴＭは、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）受容体に結合する。ＧＨＲＨは、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ又はＧＨＲＦ）又はソマトクリニンとしても公知である。本発明の適したＴＭの例は、以下：全長ＧＨＲＨ（１−４４）ペプチド、及びその切断物又はペプチドアナログ、例えば
Figure 0006362576
Figure 0006362576

を含む。
さらなる実施態様において、ＴＭは、ボンベシン受容体（例、ＢＲＳ−１、ＢＲＳ−２、又はＢＲＳ−３）に結合する。ボンベシン受容体に結合する本発明で使用するためのＴＭは、以下：ボンベシン−カエルの皮膚から最初に単離された１４アミノ酸ペプチド（ｐＧｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ２）；及び哺乳動物における２つの公知のホモログ、即ち、ニューロメジンＢ、及びガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、例えばブタＧＲＰ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ２、及びヒトＧＲＰ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ２を含む。追加のＴＭは、対応するボンベシン、ニューロメジンＢ、及びＧＲＰ切断物ならびにそのペプチドアナログを含む。
一実施態様において、癌細胞は、肺癌細胞（例、小細胞肺癌細胞、非小細胞肺癌細胞、又はカルチノイド肺癌細胞）である。本発明者らは、非所望のＳＮＡＲＥ発現が肺癌細胞において観察されることを確認している。この実施態様において、ＴＭリガンドは、肺癌細胞上の受容体、例えば以下：エリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体、ＶＥＧＦ受容体、例えばＶＥＧＦ−３受容体など、ＥｒｂＢ受容体、例えばＥＧＦ受容体など、ＥｒｂＢ２又は３受容体、ＧＲＰ受容体、ＥＴ（Ａ）受容体、ＣＣＫ受容体、例えばＣＣＫ−Ａ又はＣＣＫ−Ｂ受容体など、ＦＬＴ受容体、例えばＦＬＴ３又はＦＬＴ４受容体など、ＣＨＲＮＤ受容体、ＥＰＨＡ受容体、例えばＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ４、又はＥＰＨＡ５受容体など、ＥＦＮＡ受容体、例えばＥＦＮＡ３又はＥＦＮＢ３受容体など、ＤＬＫ１受容体、ＦＧＦ受容体、例えばＦＧＦ１受容体など、又はＪＡＧ受容体、例えばＪＡＧ１（ＣＤ３３９）又はＪＡＧ２受容体などより選択される受容体に結合する。この実施態様における好ましいＴＭは、前記受容体に対する対応する天然リガンド、ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。例は以下：エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＶＥＧＦ、例えばＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃなど、アセチルコリン、エフリンペプチド、例えばエフリン−Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、又はＡ５など、プロニューレグリンペプチド、例えばプロニューレグリン−２など、ニューレグリンペプチド、例えばニューレグリン又はＮＴＡＫなど、ＥＧＦ、ＴＧＦ、例えばＴＧＦ−ベータなど、ＧＲＰ、ボンベシン様ペプチド、エンドセリン、ＰＧＦ、ＴＮＦ、例えばＴＮＦ−アルファなど、ＩＬ、例えばＩＬ−６、ＩＬ−８など、オキシトシン、バソプレッシン、ＮＲＧ、例えばＮＲＧ−１アルファなど、ブラジキニン、ＨＧＦ、ＧＨＲＨ、ＦＧＦ、例えばｂＦＧＦ、ａＦＧＦ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＮＯＴＣＨペプチドリガンド、ＦＬＴ３サイトカイン、又はガストリンなど；ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。
別の実施態様において、癌細胞は、膀胱癌細胞である。本発明者らは、非所望のＳＮＡＲＥ発現が膀胱癌細胞において観察されることを確認している。この実施態様において、ＴＭリガンドは、膀胱癌細胞上の受容体、例えば以下：ＩＧＦ受容体、例えばＩＧＦ１受容体など、Ｇ−ＣＳＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、例えばＶＥＧＦ−２受容体など、ＥｒｂＢ受容体、例えばＥＧＦ受容体など、ＨＧＦ受容体、又はＦＧＦ受容体、例えば高／低親和性ｂＦＧＦ受容体などより選択される受容体に結合する。この実施態様における好ましいＴＭは、前記受容体に対する対応する天然リガンド、ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。例は以下：Ｇ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＩＧＦ、例えばＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２など、アンフィレグリン、ベータセルリン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＥｒｂＢ、例えばＥＧＦなど、ＴＧＦ、例えばＴＧＦ−アルファなど、ＩＬ、例えばＩＬ−６など、グラニュリンペプチド、例えばグラニュリン−４など、又はＦＧＦ、例えばｂＦＧＦなど；ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。
一実施態様において、癌細胞は、乳癌細胞である。本発明者らは、非所望のＳＮＡＲＥ発現が乳癌細胞において観察されることを確認している。この実施態様において、ＴＭリガンドは、乳癌細胞上の受容体、例えば以下：ＩＧＦ受容体、例えばＩＧＦ１受容体など、ＶＩＰ受容体、例えばＶＩＰＲ−１など、ＧＲＰ受容体、ＮＭＢ受容体、ＣＸＣ受容体、例えばＣＸＣＲ４など、ＴＮＦ受容体、例えばＴＮＦ受容体１又は２など、ＶＥＧＦ受容体、例えばＶＥＧＦＲ−２又はＶＥＧＦＲ−３など、ニューロピリン受容体、例えばＮＲＰ−１又はＮＲＰ−２など、インテグリン受容体、例えばインテグリン受容体アルファ９ベータ１など、ＯＢ受容体、ＥＴ受容体、例えばＥＴ−ＲＡ又はＥＴ−ＲＢなど、エリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）、ＴＧＦ−ベータ受容体、ＡＭＦ受容体、又はプロラクチン受容体より選択される受容体に結合する。この実施態様における好ましいＴＭは、前記受容体に対する対応する天然リガンド、ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。例は以下：ＴＮＦ、例えばＴＮＦ−アルファなど、ＶＥＧＦ、例えばＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃなど、ＩＬ、例えばＩＬ−６など、アンフィレグリン、レプチン、エンドセリン、例えばＥＴ−１、ＥＴ−２、ＥＴ−３など、ＦＧＦ、例えばＦＧＦ−２など、ＧＨＲＨ、グラニュリンペプチド、例えばグラニュリン−４など、エリスロポエチン、ニューロメジンペプチド、例えばＧＲＰニューロメジンＣ、ニューロメジンＢなど、オートクライン可動性因子（ＡＭＦ）、プロラクチン、成長ホルモン、例えばｈＧＨなど、ＩＧＦ、例えばＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２など、ＶＩＰペプチド、又はＰＡＣＡＰペプチド、例えばＰＡＣＡＰ−２７又はＰＡＣＡＰ−３８など；ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。
一実施態様において、癌細胞は、膵臓癌細胞である。本発明者らは、非所望のＳＮＡＲＥ発現が膵臓腺癌細胞において観察されることを確認している。この実施態様において、ＴＭリガンドは、膵臓癌細胞上の受容体、例えば以下：ＶＩＰ受容体、例えばＶＩＰ１受容体など、ＶＥＧＦ受容体、例えばＶＥＧＦ−１又はＶＥＧＦ２受容体など、ＳＳＴ受容体、例えばＳＳＴ１受容体など、ＣＨＲＮ受容体、例えばＣＨＲＮＧ、ＣＨＲＮＥ、ＣＨＲＮＡ１、又はＣＨＲＮＤなど、ＩＧＦ受容体、例えばＩＧＦ１Ｒなど、ＢＲＳ受容体、例えばＢＲＳ３など、ＧｎＲＨ受容体、ＧＲＰ受容体、ＮＭＢ受容体、１型成長因子受容体、ＥｒｂＢ受容体、例えばＥＧＦＲなど、ＣＣＫ受容体、例えばＣＣＫＢ又はＣＣＫＣなど、ＰＤＧＦ受容体、例えばＰＤＧＦ−アルファなど、ＡＤＭ受容体、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）受容体、例えばＦＧＦＲ２ｂ、Ｉ型ＦＧＦ受容体、ＧｎＲＨ受容体、ＧＦＲアルファ３／ＲＥＴ受容体、又はＧＤＮＦ受容体より選択される受容体に結合する。この実施態様における好ましいＴＭは、前記受容体に対する対応する天然リガンド、ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。例は以下：ＥｒｂＢ、例えばＥＧＦなど、ＴＧＦ、例えばＴＧＦ−アルファなど、ガストリン、ＰＤＧＦ、アドレノメデュリン、ＶＥＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、例えばＦＧＦ−５又はＦＧＦ（ａ／ｂ）など、ＶＩＰ、ＳＳＴペプチド、例えばＳＳＴ−１４又はＳＳＴ−２８など、アセチルコリン、ニューロメジンペプチド、例えばＧＲＰニューロメジンＣ、ニューロメジンＢなど、ＰＡＣＡＰペプチド、例えばＰＡＣＡＰ−２７又はＰＡＣＡＰ−３８など、ＩＬ、例えばＩＬ−１ａなど、ＧｎＲＨ、ボンベシン、アルテミン、ＧＤＮＦ、あるいはＩＧＦ、例えばＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２など；ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。
一実施態様において、癌細胞は、前立腺癌細胞である。本発明者らは、非所望のＳＮＡＲＥ発現が前立腺癌細胞において観察されることを確認している。この実施態様において、ＴＭリガンドは、前立腺癌細胞上の受容体、例えば以下：ＣＨＲＮ、例えばＣＨＲＮＧ又はＣＨＲＮＥ受容体など、ＩＧＦ受容体、例えばＩＧＦ１受容体など、ＶＩＰ受容体、例えばＶＩＰ１受容体など、ＣＴ受容体、ＥｒｂＢ受容体、例えばＥＧＦＲ（ＭＲ２）など、［ｐ７５（ＮＴＲ）］又はＴｒｋＡ受容体、ＣＣ受容体、例えばＣＣＲ２など、ＦＧＦ受容体、例えばＦＧＦＲ１〜４など、ＫＧＦ受容体、ＦＳＨ受容体、ＧＨＳ受容体、例えばＧＨＳ−Ｒ １ａなど、ＣＸＣ受容体、例えばＣＸＣＲ２など、ＶＰＡＣ、あるいはＰＡＣ受容体、例えばＶＰＡＣ１又はＰＡＣ１など、ＣＲＬ受容体、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体、あるいはＧＨ受容体より選択される受容体に結合する。この実施態様における好ましいＴＭは、前記受容体に対する対応する天然リガンド、ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。例は以下：カルシトニン（ＣＴ）、ＴＧＦ、例えばＴＧＦ−アルファなど、アドレノメデュリン、アセチルコリン、プロラクチン、ＩＬ、例えばＩＬ−６又はＩＬ−８など、ＮＧＦ、ＰＤＦ、ＭＣＰ、例えばＭＣＰ−１など、ソマトスタチン、ＦＧＦ、例えばＦＧＦ１（酸性ＦＧＦ）、ＦＧＦ２（塩基性ＦＧＦ）、ＦＧＦ６、又はＦＧＦ８など、ＥＰＯ、ＶＥＧＦ、ＫＧＦ、ＦＳＨ、グレリン、ＦＧＦ１７、ＴＮＦ、例えばＴＮＦ−アルファなど、ＶＩＰ、ＰＡＣＡＰペプチド、例えばＰＡＣＡＰ−２７又はＰＡＣＡＰ−３８など、ＡＭ、ＨＧＦ、ＧＨ、ＧＭ−ＣＳＦ、あるいはＩＧＦ、例えばＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２など；ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。
一実施態様において、癌細胞は、子宮頸部癌又は子宮癌細胞である。本発明者らは、非所望のＳＮＡＲＥ発現が子宮頸部癌細胞において観察されることを確認している。この実施態様において、ＴＭリガンドは、子宮頸部癌又は子宮癌細胞上の受容体、例えば以下：ＥＰＨＡ受容体、例えばＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ３受容体など、ＰＤＧＦ受容体、例えばＰＤＧＦＲＡなど、ＥＦＮＡ受容体、例えばＥＦＮＡ１など、ＳＳＴ受容体、例えばＳＳＴＲ１など、ＥｒｂＢ受容体、例えばＥＧＦＲなど、ＦＬＴ受容体、例えばＦＬＴ−１受容体など、ＦＬＫ受容体、例えばＦＬＫ−１受容体など、ＶＥＧＦ受容体、例えばＶＥＧＦＲ−３など、ＥＴ受容体、例えばＥＴ（Ａ）Ｒなど、ＩＧＦ受容体、例えばＩＧＦ−１Ｒなど、又はＬＩＦ受容体、例えばＬＩＦＲなどより選択される受容体に結合する。この実施態様における好ましいＴＭは、前記受容体に対する対応する天然リガンド、ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。例は以下：ＥｒｂＢ、例えばＥＧＦなど、ＴＧＦ、例えばＴＧＦ−アルファなど、Ｇ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦペプチド、例えばＰＤＧＦＡ又はＰＤＧＦＣなど、ＳＳＴペプチド、例えばＳＳＴ−１４又はＳＳＴ−２８など、ＩＧＦ、例えばＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２など、エフリンペプチド、例えばエフリン−Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ５又はＡ５など、ＶＥＧＦ、例えばＶＥＧＦ−Ｃ又はＶＥＧＦ−Ｄなど、グラニュリンペプチド、例えばグラニュリン−４など、エンドセリン、例えばＥＴ−１など、あるいはＩＬ、例えばＩＬ−６又はＩＬ−１；ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。
一実施態様において、癌細胞は、白血病癌細胞である。本発明者らは、非所望のＳＮＡＲＥ発現が白血病細胞において観察されることを確認している。この実施態様において、ＴＭリガンドは、白血病細胞上の受容体、例えば以下：ＦＬＴ受容体、例えばＦＬＴ１又は３受容体など、ＦＧＦ受容体、例えばＦＧＦＲ１、２又は３など、ＥＦＮ受容体、例えばＥＦＮＢ１又はＥＦＮＢ３受容体など、ＪＡＧ受容体、例えばＪＡＧ１（ｃｄ３３９）受容体など、ＰＤＧＦ受容体、例えばＰＤＧＦＲＡ又はＢなど、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＮＯＴＣＨ受容体、例えばＮＯＴＣＨ３又は４受容体など、ＥＰＨＡ受容体、例えばＥＰＨＡ７受容体など、ＬＩＦ受容体、ＥＦＮ受容体、例えばＥＦＮＡ１又は３受容体など、ＤＬＬ受容体、例えばＤＬＬ３受容体など、ＥｒｂＢ受容体、例えばＥｒｂＢ２又は３受容体など、ＫＤＲ受容体、ＧＨＳ受容体、例えば１ａ型ＧＨＳ−Ｒなど、ＩＬ受容体、例えばＩＩ型ＩＬ−１受容体など、あるいはＩＧＦ受容体、例えばＩＧＦ１Ｒなどより選択される受容体に結合する。この実施態様における好ましいＴＭは、前記受容体に対する対応する天然リガンド、ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。例は以下：ＩＧＦ、例えばＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２など、ＶＥＧＦペプチド、例えばＶＥＧＦＢなど、グレリン、ＡＰＲＩＬ、プロニューレグリンペプチド、例えばプロニューレグリン−２など、ニューレグリンペプチド、ＮＴＡＫ、ＦＧＦ、例えばｂＦＧＦ、ａＦＧＦ又はＦＧＦ−１など、ＮＯＴＣＨペプチド、例えばＮＯＴＣＨ１、２又は３など、ＰＧＦペプチド、ＰＤＧＦペプチド、例えばＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ又はＰＤＧＦＤなど、エフリンペプチド、例えばエフリン−Ａ（１−５）など、ＬＩＦ、ＧＰ３０リガンド、エリスロポエチン、ＪＡＧペプチド、例えばＪＡＧ−１又はＪＡＧ−２など、Ｄｅｌｔａ−１、ＩＬ、例えばＩＬ１−アルファなど、あるいはＧＭ−ＣＳＦ；ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。
一実施態様において、癌細胞は、卵巣癌細胞である。本発明者らは、非所望のＳＮＡＲＥ発現が卵巣癌細胞において観察されることを確認している。この実施態様において、ＴＭリガンドは、卵巣癌細胞上の受容体、例えば以下：ＥｒｂＢ受容体、例えばＥｒｂＢ２、３又は４受容体など、ＦＧＦ受容体、例えばＦＧＦＲ３など、ＪＡＧ受容体、例えばＪＡＧ２受容体など、ＥＰＨ受容体、例えばＥＰＨＡ１又は２受容体など、ＩＧＦ受容体、例えばＩＧＦ１Ｒなど、ＧＲＰ受容体、ＥＦＮ受容体、例えばＥＦＮＢ３など、Ａ１又はＢ２受容体、あるいはＧＮＲＨ受容体より選択される受容体に結合する。この実施態様における好ましいＴＭは、前記受容体に対する対応する天然リガンド、ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。例は以下：ＮＲＧペプチド、例えばＮＲＧ−２又はＮＲＧ−３など、あるいはヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子ペプチド；ニューレグリンペプチド、ＧＰ３０ペプチド、ＮＯＴＣＨペプチド、グラニュリンペプチド、例えばグラニュリン−４など、エフリン−Ａペプチド、例えばエフリンＡ１〜Ａ５など、ＩＧＦペプチド、例えばＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２、ＮＴＡＫ、ＧＲＰ、あるいはＧｎＲＨなど；ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。
一実施態様において、癌細胞は、骨癌細胞である。本発明者らは、非所望のＳＮＡＲＥ発現が骨癌細胞において観察されることを確認している。この実施態様において、ＴＭリガンドは、骨癌細胞上の受容体、例えば以下：ＩＧＦ受容体、例えばＩＧＦ−ＩＲなど、ＧＨＲＨ受容体、又はＦＧＦ受容体、例えばｂＦＧＦ受容体などより選択される受容体に結合する。この実施態様における好ましいＴＭは、前記受容体に対する対応する天然リガンド、ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。例は以下：ＰＤＧＦ、例えばＰＤＧＦ−アルファ又はＰＤＧＦ−ベータなど、ＴＧＦ、例えばＴＧＦベータ１など、ＩＧＦ、例えばＩＧＦ−１など、ＧＨＲＨ、ＦＧＦ、例えばｂＦＧＦなど、Ｇ−ＣＳＦ、又はＩＬ、例えばＩＬ−６など；ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。
一実施態様において、癌細胞は、脳癌細胞である。本発明者らは、非所望のＳＮＡＲＥ発現が脳癌細胞において観察されることを確認している。この実施態様において、ＴＭリガンドは、脳癌細胞上の受容体、例えば以下：ＥＰＯ受容体、受容体７８kDa糖タンパク質（ｇｐ７８）、ＥｒｂＢ受容体、例えばＥＧＦＲなど、ＰＤＧＦ受容体、例えばＰＤＧＦＲ−アルファなど、ＣＲＬ受容体、例えばＣＲＬＲ／ＲＡＭＰ２又はＣＲＬＲ／ＲＡＭＰ３など、ニューロピリン受容体、例えばＮＲＰ−１又はＮＲＰ−２など、ＣＸＣ受容体、例えばＣＸＣＲ４など、ＶＥＧＦＲ、例えばＶＥＧＦＲ−１など、ＩＧＦＲ、例えばＩＧＦ１Ｒなど、ＧＤＮＦ受容体、例えばＧＤＮＦＲ−アルファ１など、又はＭＥＴ受容体より選択される受容体に結合する。この実施態様における好ましいＴＭは、前記受容体に対する対応する天然リガンド、ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。例は以下：エリスロポエチン（ＥＰＯ）ペプチド、ＩＧＦペプチド、オートクライン可動性因子（ＡＭＦ）ペプチド、ＧＤＮＦペプチド、ＨＢ−ＥＧＦペプチド、ＴＧＦペプチド、例えばＴＧＦ−アルファなど、ＰＤＧＦペプチド、例えばＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ又はＰＤＧＦ−Ｄなど、ニューレグリンペプチド、例えばニューレグリン−１など、アドレノメデュリン、ＩＬペプチド、例えばＩＬ−６など、分散因子／肝細胞増殖因子（ＳＦ／ＨＧＦ）ペプチド、グラニュリンペプチド、例えばグラニュリン−４など、ＶＥＧＦペプチド、例えばＶＥＧＦ−Ａなど、あるいはＴＧＦペプチド、例えばＴＧＦベータ１又はＴＧＦベータ２など；ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。
一実施態様において、癌細胞は、結腸直腸癌細胞である。本発明者らは、非所望のＳＮＡＲＥ発現が結腸直腸癌細胞において観察されることを確認している。この実施態様において、ＴＭリガンドは、結腸直腸癌細胞上の受容体、例えば以下：ＩＧＦ受容体、例えばＩＧＦ−Ｒ１など、ＥｒｂＢ受容体、例えばＥＧＦＲなど、ＧＲＰ受容体、ＩＬ受容体、例えばＩＬ６−Ｒなど、ＣＣＫ受容体、例えばＣＣＫ−Ｂ受容体など、又はプロラクチン受容体より選択される受容体に結合する。この実施態様における好ましいＴＭは、前記受容体に対する対応する天然リガンド、ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。例は以下：ＦＧＦ、例えばＦＧＦ１８など、ＩＧＦ、例えばＩＧＦ−１など、ＴＧＦ、例えばＴＧＦ−アルファなど、ＧＲＰ、ＩＬ、例えばＩＬ６など、ＥｒｂＢ、例えばＥＧＦなど、ガストリン、又はプロラクチン；ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。
一実施態様において、癌細胞は、肝臓癌細胞である。本発明者らは、非所望のＳＮＡＲＥ発現が肝臓癌細胞において観察されることを確認している。この実施態様において、ＴＭリガンドは、肝臓癌細胞上の受容体、例えば以下：ＴｒｋＡ（ＮＧＦ）受容体、ＩＧＦ受容体、例えばＩＧＦ−ＩＲなど、ＨＧＦ受容体、例えばＨＧＦ−Ｍｅｔ受容体など、ｃ−ｍｅｔ受容体、ｇｐ７８受容体、あるいはＥｒｂＢ受容体、例えばＥＧＦＲなどより選択される受容体に結合する。この実施態様における好ましいＴＭは、前記受容体に対する対応する天然リガンド、ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。例は以下：ＮＧＦ、ＩＬ、例えばＩＬ−６又はＩＬ−８など、ＩＧＦ、例えばＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２など、ＨＧＦ、ＳＦ／ＨＧＦ、ヘパトポエチン（ＨＰＯ）、ＡＭＦ、ＴＧＦ、例えばＴＧＦ−ベータ又はＴＧＦ−アルファなど、ＬＩＦ又はＰＤＧＦ；ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。
一実施態様において、癌細胞は、皮膚癌細胞である。本発明者らは、非所望のＳＮＡＲＥ発現が皮膚癌細胞において観察されることを確認している。この実施態様において、ＴＭリガンドは、皮膚（例、基底、メラノーマ、扁平）癌細胞上の受容体、例えば以下：ＦＧＦ受容体、例えばＦＧＦＲ−１など、ｃ−ｋｉｔ受容体、ＶＥＧＦ受容体、例えばＶＥＧＦＲ−２など、ｃ−Ｍｅｔ受容体、又はメラノコルチン受容体、例えばメラノコルチン−１受容体などより選択される受容体に結合する。この実施態様における好ましいＴＭは、前記受容体に対する対応する天然リガンド、ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。例は以下：ＩＬ、例えばＩＬ８又はＩＬ−１０など、ＦＧＦ、例えばｂＦＧＦなど、ＳＣＦ、ＶＥＧＦ、例えばＶＥＧＦ−Ａなど、ＥｒｂＢ、例えばＥＧＦなど、ＥＰＯ、オステオポンチン（ＯＰＮ）、ＴＧＦ、例えばＴＧＦ−ベータなど、ＭＧＳＡ／ＧＲＯ、例えばＭＧＳＡ／ＧＲＯアルファ、ベータ又はガンマなど、ＨＧＦ／ＳＦ、アルファ−メラノトロピン、アンフィレグリン、あるいはＡＭＦ；ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。
一実施態様において、癌細胞は、カポジ肉腫癌細胞である。本発明者らは、非所望のＳＮＡＲＥ発現がカポジ肉腫癌細胞において観察されることを確認している。この実施態様において、ＴＭリガンドは、カポジ肉腫細胞上の受容体、例えば以下：ＰＤＧＦ受容体、例えばＰＤＧＦＲＡなど、ｃ−ｋｉｔ受容体、ＴＧＦ−ベータ受容体、例えばＴＧＦＲ−１など、エンドセリン受容体、例えばＥＴＡ−Ｒなど、ケモカイン受容体、例えばＣＸＣＲ３又はＣＣＲＬ２など、ＶＥＧＦ受容体、例えばＶＥＧＦＲ−２など、ＩＧＦ受容体、例えばＩＧＦ−ＩＲなど、あるいはアンギオポエチン受容体、例えばＴＩＥ２などより選択される受容体に結合する。この実施態様における好ましいＴＭは、前記受容体に対する対応する天然リガンド、ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。例は以下：ＰＤＧＦａ、ＩＧＦ−１、Ａｎｇ２、ＩＬ、例えばＩＬ６など、ＶＥＧＦ、例えばＶＥＧＦ−Ａなど、エンドセリン−１、ＴＧＦ、例えばＴＧＦ−ベータなど、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ８／１４；ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。
一実施態様において、癌細胞は、腎臓癌細胞である。この実施態様において、ＴＭリガンドは、腎臓癌細胞上の受容体、例えば以下：ＩＧＦ受容体、例えばＩＧＦ−ＩＲなど、ＶＥＧＦ受容体、ＣＸＣ受容体、又はＥｒｂＢ受容体、例えばＥＧＦＲなどより選択される受容体に結合する。この実施態様における好ましいＴＭは、前記受容体に対する対応する天然リガンド、ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。例は以下：ＩＬ、例えばＩＬ−６又はＩＬ−８など、ＩＧＦ、例えばＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２など、ＴＧＦ、例えばＴＧＦ−ベータ又はＴＧＦ−アルファなど、ＶＥＧＦ、例えばＶＥＧＦ−Ａなど、ケモカイン、例えばＣＸＣＬ１２など；ならびにその切断物及びペプチドアナログを含む。
上の実施態様には特定の癌が記載されており、それにおいて本発明者らは非所望のＳＮＡＲＥ発現（例、アップレギュレーションされたＳＮＡＲＥ発現）を実証している。本発明は、しかし、前記の特定の癌型に限定されず、ＳＮＡＲＥ発現が生じる全ての癌型を包含する。
癌細胞における上記の非所望のＳＮＡＲＥ発現（例、アップレギュレーション）は、場合により、対象の癌細胞上に存在する１つ又は複数の特定の受容体型のアップレギュレーションに関連しうる。この点において、本発明者らは、特定の受容体型を同定しており（上で詳述する）、それは、非所望のＳＮＡＲＥ発現が観察される（例、アップレギュレーションされる）同じ細胞においてアップレギュレーションされる。
ポリペプチド調製
本発明のポリペプチドは、３つの主な成分：「生物活性」（即ち、非細胞傷害性プロテアーゼ）；ＴＭ；及びトランスロケーションドメインを含む。そのような融合タンパク質の調製に関連する一般的な技術は、しばしば、再標的化された毒性技術といわれる。例示として、本発明者らは以下；ＷＯ９４／２１３００；ＷＯ９６／３３２７３；ＷＯ９８／０７８６４；ＷＯ００／１０５９８；ＷＯ０１／２１２１３；ＷＯ０６／０５９０９３；ＷＯ００／６２８１４；ＷＯ００／０４９２６；ＷＯ９３／１５７６６；ＷＯ００／６１１９２；及びＷＯ９９／５８５７１を参照する。これらの刊行物の全てが、その参照により本明細書において組み入れられる。
より詳細には、本発明のＴＭ成分を、本発明のプロテアーゼ成分又はトランスロケーション成分のいずれかに融合させてもよい。前記融合体は、好ましくは、共有結合（例えば、直接的な共有結合又はスペーサー／リンカー分子を介する）による。プロテアーゼ成分及びトランスロケーション成分は、好ましくは、共有結合（例えば、直接的な共有結合又はスペーサー／リンカー分子を介する）を介して互いに連結される。適したスペーサー／連結分子は、当技術分野において周知であり、典型的には、５〜４０、好ましくは１０〜３０のアミノ酸残基長のアミノ酸ベース配列を含む。
使用において、ポリペプチドは二本鎖立体構造を有し、それにおいてプロテアーゼ成分及びトランスロケーション成分は、好ましくは、ジスルフィド結合を介して互いに連結される。
本発明のポリペプチドは、従来の化学結合技術により調製してもよく、それは当業者に周知である。例として、Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press、及びWong, S.S. (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press, Nagy et al., PNAS 95 p1794-99 (1998)を参照のこと。本発明のポリペプチドに合成ＴＭを結合させるためのさらなる詳細な方法が、例えば、ＥＰ０２５７７４２に提供される。上記結合に関する刊行物は、その参照により本明細書において組み入れられる。
あるいは、ポリペプチドを、単一のポリペプチド融合タンパク質のリコンビナント調製により調製してもよい（例えば、ＷＯ９８／０７８６４を参照のこと）。この技術はインビボでの細菌のメカニズムに基づき、それにより天然クロストリジウム神経毒素（即ち、ホロ毒素）が調製され、以下：
ＮＨ２−［プロテアーゼ成分］−［トランスロケーション成分］−［ＴＭ］−ＣＯＯＨ
の「単純化」構造配置を有する融合タンパク質が得られる。
ＷＯ９８／０７８６４に従って、ＴＭを融合タンパク質のＣ末端に向かって位置付ける。融合タンパク質を、次に、プロテアーゼを用いた処置により活性化させ、それはプロテアーゼ成分とトランスロケーション成分の間の部位で切断する。二本鎖タンパク質をこのように産生し、トランスロケーション成分とＴＭを含む別の単一ポリペプチド鎖に（ジスルフィド架橋を介して）共有結合された単一ポリペプチド鎖としてプロテアーゼ成分を含む。
あるいは、ＷＯ０６／０５９０９３に従い、融合タンパク質のＴＭ成分は、線形融合タンパク質配列の中央に向かい、プロテアーゼ切断部位とトランスロケーション成分の間に位置付けられる。これによって、ＴＭがトランスロケーションドメインに付着されるが（即ち、天然クロストリジウムホロ毒素と生じる際）、この場合において２つの成分は、天然ホロ毒素に対する順番と逆転する。続くプロテアーゼ切断部位での切断によって、ＴＭのＮ末端部分が露出され、二本鎖ポリペプチド融合タンパク質が提供される。
上記のプロテアーゼ切断配列を、従来の手段により、例えば部位特異的突然変異誘発により、ＤＮＡレベルで導入してもよい（及び／又は任意の固有の切断配列を除去してもよい）。切断配列の存在を確認するためのスクリーニングを、手作業で又はコンピューターソフトウェア（例、DNASTAR, Inc.によるMapDrawプログラム）の補助により実施してもよい。任意のプロテアーゼ切断部位を用いてもよいが（即ち、クロストリジウム、又は非クロストリジウム）、以下：
エンテロキナーゼ （ＤＤＤＤＫ↓）
第Ｘａ因子 （ＩＥＧＲ↓／ＩＤＧＲ↓）
ＴＥＶ（タバコエッチウイルス） （ＥＮＬＹＦＱ↓Ｇ）
トロンビン （ＬＶＰＲ↓ＧＳ）
ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ （ＬＥＶＬＦＱ↓ＧＰ）
が好ましい。
追加のプロテアーゼ切断部位は、非細胞傷害性プロテアーゼにより、例えばクロストリジウム神経毒素により切断される認識配列を含む。これらは、非細胞傷害性プロテアーゼ、例えばクロストリジウム神経毒素などにより切断されるＳＮＡＲＥ（例、ＳＮＡＰ−２５、シンタキシン、ＶＡＭＰ）タンパク質認識配列を含む。特定の例がＵＳ２００７／０１６６３３２で提供されており、それはその全体がその参照により本明細書により組み入れられる。
また、プロテアーゼ切断部位という用語にはインテインが包含され、それは自己切断配列である。自己スプライシング反応は、例えば、存在する還元剤の濃度を変動させることにより制御可能である。上記の「活性化」切断部位は、また、本発明のポリペプチド中に組み入れられる場合、「破壊的」切断部位（以下で考察する）として用いてもよい。
好ましい実施態様において、本発明の融合タンパク質は、１つ又は複数のＮ末端及び／又はＣ末端に位置付けられる精製タグを含みうる。任意の精製タグを用いてもよいが、以下：
Ｈｉｓタグ（例、６×ヒスチジン）、好ましくはＣ末端及び／又はＮ末端タグとして
ＭＢＰタグ（マルトース結合タンパク質）、好ましくはＮ末端タグとして
ＧＳＴタグ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、好ましくはＮ末端タグとして
Ｈｉｓ−ＭＢＰタグ、好ましくはＮ末端タグとして
ＧＳＴ−ＭＢＰタグ、好ましくはＮ末端タグとして
チオレドキシンタグ、好ましくはＮ末端タグとして
ＣＢＤタグ（キチン結合ドメイン）、好ましくはＮ末端タグとして
が好ましい。
１つ又は複数のペプチドスペーサー／リンカー分子を融合タンパク質に含めてもよい。例えば、ペプチドスペーサーを、精製タグと融合タンパク質分子の残りの間に用いてもよい。
このように、本発明の第３の局面は、上に記載するポリペプチド（即ち、本発明の第２の局面）をコードする核酸（例、ＤＮＡ）配列を提供する。
前記核酸を、ベクターの形態（例えばプラスミドなど）で含めてもよく、それは、場合により、１つ又は複数の複製起点、核酸組込み部位、プロモーター、ターミネーター、及びリボソーム結合部位を含みうる。
本発明は、また、上に記載する核酸配列（即ち、本発明の第３の局面）を宿主細胞において、特にＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させるための方法を含む。
本発明は、また、本発明のポリペプチドを活性化させるための方法を含み、前記方法は、ポリペプチドを、このポリペプチドを、非細胞傷害性プロテアーゼ成分とトランスロケーション成分の間に位置付けられる認識部位（切断部位）で切断するプロテアーゼと接触させ、それによりポリペプチドを二本鎖ポリペプチドに変換することを含み、ここで非細胞傷害性プロテアーゼ成分及びトランスロケーション成分をジスルフィド結合により互いに連結させる。好ましい実施態様において、認識部位は、天然クロストリジウム神経毒素及び／又は天然ＩｇＡプロテアーゼに対して天然ではない。
本発明のポリペプチドをさらに改変し、非標的化部位への分散に関連する不要な副作用を低下又は予防してもよい。この実施態様によれば、ポリペプチドは破壊的切断部位を含む。破壊的切断部位は「活性化」部位（即ち、二本鎖形成）とは異なり、第２のプロテアーゼ（非細胞傷害性プロテアーゼではない）により切断可能である。さらに、破壊的切断部位で第２のプロテアーゼによりそのように切断された場合、ポリペプチドは低下した効力を有する（例、意図される標的細胞に対する低下した結合能力、低下したトランスロケーション活性、及び／又は低下した非細胞傷害性プロテアーゼ活性）。補完に、本発明の「破壊的」切断部位のいずれかを、別々に、本発明のポリペプチド中の「活性化」部位として用いてもよい。
このように、この実施態様に従い、本発明は、部位外の位置で制御可能に不活性化及び／又は破壊されうるポリペプチドを提供する。
好ましい実施態様において、破壊的切断部位は、循環プロテアーゼ（例、細胞外プロテアーゼ、例えば血清プロテアーゼ又は血液凝固カスケードのプロテアーゼなど）、組織関連プロテアーゼ（例、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、例えば筋肉のＭＭＰなど）、及び細胞内プロテアーゼ（好ましくは標的細胞に存在しないプロテアーゼ）より選択される第２のプロテアーゼ（即ち、破壊的プロテアーゼ）により認識及び切断される。
このように、使用において、本発明のポリペプチドがその意図する標的細胞から離れて分散される及び／又は非標的細胞により取り込まれる場合、ポリペプチドは、破壊的切断部位の（第２のプロテアーゼによる）切断により不活性化される。
一実施態様において、破壊的切断部位は、部位外の細胞型内に存在する第２のプロテアーゼにより認識及び切断される。この実施態様において、部位外の細胞及び標的細胞は、好ましくは、異なる細胞型である。あるいは（又はさらに）、破壊的切断部位は、部位外の位置に（例、標的細胞より遠位に）存在する第２のプロテアーゼにより認識及び切断される。したがって、破壊的切断が細胞外で生じる場合、標的細胞及び部位外の細胞は、同じ又は異なる細胞型のいずれかでありうる。この点において、標的細胞及び部位外の細胞は、各々、本発明の同じポリペプチドが結合する受容体を持ちうる。
本発明の破壊的切断部位は、ポリペプチドが部位外の位置中にある又はそこにある場合、ポリペプチドの不活性化／破壊を提供する。この点において、破壊的切断部位での切断は、ポリペプチドの効力を最小限にする（同じ破壊的切断部位を欠く、又は同じ破壊的切断部位を有するが、非切断形態の同一のポリペプチドと比較した場合）。例として、低下した効力は以下：低下した結合（哺乳動物細胞受容体に対する）及び／又は低下したトランスロケーション（細胞質の方向に哺乳動物細胞のエンドソーム膜を横断する）、及び／又は低下したＳＮＡＲＥタンパク質切断を含む。
本発明に関連して破壊的切断部位を選択する場合、破壊的切断部位は、その製造プロセスの部分として本発明のポリペプチドの翻訳後修飾のために別々に使用されうる任意のプロテアーゼのための基質ではないことが好ましい。この点において、本発明の非細胞傷害性プロテアーゼは、典型的に、プロテアーゼ活性化事象を用いる（別々の「活性化」プロテアーゼ切断部位を介し、それは、本発明の破壊的切断部位とは構造的に異なる）。活性化切断部位の目的は、非細胞傷害性プロテアーゼと本発明のポリペプチドのトランスロケーション成分又は結合成分の間でのペプチド結合を切断することであり、それにより「活性化」二本鎖ポリペプチドを提供し、それにおいて前記の２つの成分がジスルフィド結合を介して互いに連結される。
このように、本発明のポリペプチドの破壊的切断部位が、「活性化」切断部位及び続くジスルフィド結合形成に悪影響を与えないようにするために、前者は、好ましくは、本発明のポリペプチド中に、「活性化」切断部位から少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、より好ましくは少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０（近接）アミノ酸残基離れた位置で導入される。
破壊的切断部位及び活性化切断部位は、好ましくは、ポリペプチドの天然成分に関して外因性である（即ち、操作されている／人工である）。換言すると、前記の切断部位は、好ましくは、ポリペプチドの対応する天然成分に固有ではない。例として、ＢｏＮＴ／Ａ Ｌ鎖又はＨ鎖に（それぞれ）基づくプロテアーゼ成分又はトランスロケーション成分を本発明に従って操作し、切断部位を含めてもよい。前記の切断部位は、しかし、対応するＢｏＮＴ天然Ｌ鎖又はＨ鎖に存在しないであろう。同様に、ポリペプチドの標的成分を操作し、プロテアーゼ切断部位を含む場合、前記の切断部位は、対応する標的成分の対応する天然配列に存在しないであろう。
本発明の好ましい実施態様において、破壊的切断部位及び「活性化」切断部位は、同じプロテアーゼにより切断されない。一実施態様において、２つの切断部位は、少なくとも１つ、より好ましくは少なくとも２つ、特に好ましくは少なくとも３つ、最も好ましくは少なくとも４つのそれぞれの認識配列内の許容されるアミノ酸が異なる点で、互いに異なる。
例として、クロストリジウムＬ鎖とＨＮ成分の間に第Ｘａ因子「活性化」部位を含むポリペプチドキメラの場合において、第Ｘａ因子の部位以外の部位である破壊的切断部位を用いることが好ましく、それはＬ鎖及び／又はＨＮ成分及び／又はＴＭ成分の別の場所に挿入してもよい。このシナリオにおいて、ポリペプチドを改変し、Ｌ鎖とＨＮ成分（例えば、エンテロキナーゼ切断部位）の間に代替「活性化」部位を収容してもよく、その場合において、別々の第Ｘａ因子切断部位を、破壊的切断部位としてポリペプチド中の他の場所に組み入れてもよい。あるいは、Ｌ鎖とＨＮ成分の間の既存の第Ｘａ因子「活性化」部位が保持されうるが、代替切断部位、例えばトロンビン切断部位などを破壊的切断部位として組み入れてもよい。
切断部位の包含のための本発明の成分のいずれかの一次配列内で適した部位を同定する場合、挿入される提案された切断部位と密接に一致する一次配列を選択することが好ましい。そのようにすることにより、最小の構造変化をポリペプチド中に導入する。例として、切断部位は、典型的に、少なくとも３つの近接するアミノ酸残基を含む。このように、好ましい実施態様において、（正確な位置において）少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのアミノ酸残基（新たな切断部位を導入するために必要である）を既に持つ、切断部位を選択する。例として、一実施態様において、カスパーゼ３切断部位（ＤＭＱＤ）を導入してもよい。この点において、好ましい挿入位置を同定し、それは以下：例えば、Ｄｘｘｘ、ｘＭｘｘ、ｘｘＱｘ、ｘｘｘＤ、ＤＭｘｘ、ＤｘＱｘ、ＤｘｘＤ、ｘＭＱｘ、ｘＭｘＤ、ｘｘＱＤ、ＤＭＱｘ、ｘＭＱＤ、ＤｘＱＤ、及びＤＭｘＤより選択される一次配列を既に含む。
同様に、切断部位を表面露出領域中に導入することが好ましい。表面露出領域内で、既存のループ領域が好ましい。
本発明の好ましい実施態様において、破壊的切断部位が、以下の位置の１つ又は複数に導入され、それはＢｏＮＴ／Ａの一次アミノ酸配列に基づく。挿入位置を、ＢｏＮＴ／Ａを参照することにより（便宜上）同定し、代替プロテアーゼドメイン及び／又はトランスロケーションドメインの一次アミノ酸配列を、前記のＢｏＮＴ／Ａ位置と容易に並べることができる。
プロテアーゼ成分について、以下：２７−３１、５６−６３、７３−７５、７８−８１、９９−１０５、１２０−１２４、１３７−１４４、１６１−１６５、１６９−１７３、１８７−１９４、２０２−２１４、２３７−２４１、２４３−２５０、３００−３０４、３２３−３３５、３７５−３８２、３９１−４００、及び４１３−４２３の位置の１つ又は複数が好ましい。上のナンバリングは、好ましくは、本発明のプロテアーゼ成分のＮ末端から開始する。
好ましい実施態様において、破壊的切断部位は、プロテアーゼ成分のＮ末端から８アミノ酸残基より大きい、好ましくは１０アミノ酸残基より大きい、より好ましくは２５アミノ酸残基より大きい、特に好ましくは５０アミノ酸残基より大きい位置に位置付けられる。同様に、好ましい実施態様において、破壊的切断部位は、プロテアーゼ成分のＣ末端から２０アミノ酸残基より大きい、好ましくは３０アミノ酸残基より大きい、より好ましくは４０アミノ酸残基より大きい、特に好ましくは５０アミノ酸残基より大きい位置に位置付けられる。
トランスロケーション成分について、以下：４７４−４７９、４８３−４９５、５０７−５４３、５５７−５６７、５７６−５８０、６１８−６３１、６４３−６５０、６６９−６７７、７５１−７６７、８２３−８３４、８４５−８５９の位置の１つ又は複数が好ましい。上のナンバリングは、好ましくは、本発明のトランスロケーションドメイン成分のＮ末端についての開始位置４４９、及びトランスロケーションドメイン成分のＣ末端についての終末位置８７１を認める。
好ましい実施態様において、破壊的切断部位は、トランスロケーション成分のＮ末端から１０アミノ酸残基より大きい、好ましくは２５アミノ酸残基より大きい、より好ましくは４０アミノ酸残基より大きい、特に好ましくは５０アミノ酸残基より大きい位置に位置付けられる。同様に、好ましい実施態様において、破壊的切断部位は、トランスロケーション成分のＣ末端から１０アミノ酸残基より大きい、好ましくは２５アミノ酸残基より大きい、より好ましくは４０アミノ酸残基より大きい、特に好ましくは５０アミノ酸残基より大きい位置に位置付けられる。
好ましい実施態様において、破壊的切断部位は、ＴＭ成分のＮ末端から１０アミノ酸残基より大きい、好ましくは２５アミノ酸残基より大きい、より好ましくは４０アミノ酸残基より大きい、特に好ましくは５０アミノ酸残基より大きい位置に位置付けられる。同様に、好ましい実施態様において、破壊的切断部位は、ＴＭ成分のＣ末端から１０アミノ酸残基より大きい、好ましくは２５アミノ酸残基より大きい、より好ましくは４０アミノ酸残基より大きい、特に好ましくは５０アミノ酸残基より大きい位置に位置付けられる。
本発明のポリペプチドは、１つ又は複数の（例、２、３、４、５又はそれ以上の）破壊的プロテアーゼ切断部位を含みうる。複数の破壊的切断部位が含まれる場合、各切断部位は同じである又は異なりうる。この点において、複数の破壊的切断部位の使用は、改善された部位外の不活性化を提供する。同様に、２つ又はそれ以上の破壊的切断部位の使用は、追加の設計柔軟性を提供する。
破壊的切断部位を、ポリペプチドの以下：非細胞傷害性プロテアーゼ成分；トランスロケーション成分；標的成分；又はスペーサーペプチド（存在する場合）の成分のいずれかに操作してもよい。この点において、破壊的切断部位を選び、ポリペプチドの効力に対する有害効果を最小にし（例えば、標的／結合領域及び／又はトランスロケーションドメインに対する、及び／又は非細胞傷害性プロテアーゼドメインに対する最小の効果を有することによる）、一方でポリペプチドがその標的部位／標的細胞から離れると不安定になるようにする。
好ましい破壊的切断部位（及び対応する第２のプロテアーゼ）を真下の表に列挙する。列挙された切断部位は単に例示的であり、本発明を限定することを意図しない。
Figure 0006362576
Figure 0006362576
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、本発明に関連する破壊的プロテアーゼの好ましい群である。この群内で、ＡＤＡＭ１７（ＥＣ３．４．２４．８６、ＴＡＣＥとしても公知）が好ましく、種々の膜固定細胞表面タンパク質を切断し、細胞外ドメインを「排出」する。追加の好ましいＭＭＰは、アダマリシン（ａｄａｍａｌｙｓｉｎｓ）、セラリシン（ｓｅｒｒａｌｙｓｉｎｓ）、及びアスタシンを含む。
好ましい破壊的プロテアーゼの別の群は、哺乳動物の血中プロテアーゼ、例えばトロンビン、凝固第ＶＩＩａ因子、凝固第ＩＸａ因子、凝固第Ｘａ因子、凝固第ＸＩａ因子、凝固第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、プロテインＣ、及びＭＢＰ関連セリンプロテアーゼなどである。
本発明の一実施態様において、前記の破壊的切断部位は、少なくとも３つ又は４つ、好ましくは５つ又は６つ、より好ましくは６つ又は７つ、特に好ましくは少なくとも８つの近接アミノ酸残基を含む。この点において、認識配列が長くなるほど（近接アミノ酸残基に関して）、破壊的部位の非特異的切断が意図されない第２のプロテアーゼを介して生じる可能性は低くなる。
本発明の破壊的切断部位が、プロテアーゼ成分及び／又は標的成分中にならびに／あるいはトランスロケーション成分及び／又はスペーサーペプチド中に導入されることが好ましい。これらの４つの成分の内、プロテアーゼ成分が好ましい。したがって、ポリペプチドは、非細胞傷害性プロテアーゼならびに／あるいは結合及び／又はトランスロケーション成分の直接的な破壊により迅速に不活性化されうる。
ポリペプチド送達
使用において、本発明では、医薬的組成物（ポリペプチドを含む）を、医薬的に許容可能な担体、賦形剤、アジュバント、噴霧剤、及び／又は塩より選択される少なくとも１つの成分と一緒に用いる。
本発明のポリペプチドは、経口、非経口、連続注入、インプラント、吸入、又は局所適用のために製剤化されうる。注射のために適した組成物は、溶液、懸濁剤又は乳剤、あるいは乾燥粉末（使用前に適した賦形剤中に溶解又は懸濁される）の形態でありうる。
局所的な送達手段は、エアゾル、又は他のスプレー（例、ネブライザー）を含みうる。この点において、ポリペプチドのエアゾル製剤は、肺ならびに／あるいは他の鼻及び／又は気管支又は気道通路への送達を可能にする。
好ましい投与経路は以下：全身、腹腔鏡及び／又は局所注射（例、腫瘍中への直接注射）より選択される。
注射用製剤の場合において、投与部位での保持を補助する又は投与部位からのポリペプチドの除去を低下させるために医薬的に活性な物質を任意に含んでいてもよい。そのような医薬的に活性な物質の１例は、血管収縮剤（例えばアドレナリンなど）である。そのような製剤は、投与後のポリペプチドの滞留時間を延長させ、ひいてはその効果を増加及び／又は増強するという利点を付与する。
本発明のポリペプチドの投与のための投与量範囲は、所望の治療的効果を得るためのものである。要求される投与量範囲は、ポリペプチド又は組成物の正確な性質、投与の経路、製剤の性質、患者の年齢、患者の状態の性質、程度、又は重症度、禁忌（ある場合）、及び担当医の判断に依存することが理解されるであろう。これらの投与量レベルの変更は、最適化のための標準的で経験的なルーチンを使用して調整することができる。
適した１日投与量（患者の体重１kg当たり）は、０．０００１−１mg/kg、好ましくは０．０００１−０．５mg/kg、より好ましくは０．００２−０．５mg/kg、特に好ましくは０．００４−０．５mg/kgの範囲である。単位投与量は１マイクログラム未満〜３０mgまで変更できるが、しかし、典型的には、０．０１〜１mg/１回用量の範囲であり、それは毎日又は好ましくはより少ない頻度（例えば週１回又は６ヶ月毎）で投与してもよい。
特に好ましい投与計画は、２．５ngのポリペプチド（１×用量として）に基づく。この点において、好ましい投与量は１×−１００×（即ち、２．５−２５０ng）の範囲である。
液体投与形態は、典型的には、ポリペプチド及びパイロジェンフリー滅菌賦形剤を使用して調製する。ポリペプチドは、使用される賦形剤及び濃度に依存し、賦形剤中に溶解又は懸濁することができる。溶液を調製する際、ポリペプチドを賦形剤中に溶解させることができ、溶液は、必要な場合、塩化ナトリウムの添加により等張にし、滅菌フィルターによりろ過して滅菌し、適した滅菌バイアル又はアンプル中に充填し、密封する。あるいは、溶液が適度に安定である場合、その密封容器中の溶液をオートクレーブにより滅菌してもよい。有利には、添加剤、例えば緩衝剤、可溶化剤、安定化剤、保存剤又は殺菌剤、懸濁剤又は乳化剤及び／又は局所麻酔剤などを賦形剤中に溶解してもよい。
適した賦形剤中に、使用前に溶解又は懸濁する、乾燥粉末は、事前に滅菌された成分を滅菌容器中に、滅菌場所において無菌操作で充填することにより調製してもよい。あるいは、成分を、適した容器中に、滅菌場所において無菌操作で溶解させてもよい。製造物を次に凍結乾燥させ、容器を無菌的に密封する。
非経口懸濁剤は、筋肉内、皮下、又は皮内注射のために適しており、滅菌成分が、溶解される代わりに、滅菌賦形剤中に懸濁され、滅菌がろ過により実施することができないことを除き、実質的に同じ様式で調製される。成分を滅菌状態で単離してもよく、又は、代わりに、それを、単離後に、例えば、ガンマ線照射により滅菌してもよい。
懸濁剤、例えば、ポリビニルピロリドンを組成物中に含め、成分の均一な分布を促進させることが効果的である。
本発明に従った投与では、種々の送達技術（マイクロ粒子カプセル化、ウイルス送達システム、又は高圧エアロゾル衝突を含む）を利用してもよい。
定義のセクション
標的成分（ＴＭ）は、結合部位と機能的に相互作用し、本発明のポリペプチドと標的細胞の表面の間に物理的会合を起こす任意の化学的構造を意味する。本発明に関連して、標的細胞は、癌性細胞、例えば、それにおいてオートクライン刺激が増殖、生存、転移能又は血管新生を駆動させるものである。ＴＭという用語は、標的細胞上の結合部位に結合することが可能である任意の分子（即ち、天然分子、又は化学的／物理的に修飾されたそのバリアント）を包含し、その結合部位は内在化（例、エンドソーム形成）が可能であり、受容体媒介性エンドサイトーシスともいわれる。ＴＭはエンドソーム膜トランスロケーション機能を持ちうるが、その場合において別々のＴＭ及びトランスロケーションドメイン成分が、本発明の薬剤中に存在する必要はない。先の記載を通して、特定のＴＭが記載されている。前記ＴＭの参照は単に例示的であり、本発明は全てのバリアント及びその派生物を包含し、それは例示されたＴＭの基本的な結合（即ち、標的化）能力を保持する。
一実施態様において、本発明の癌細胞標的は、成長ホルモンを分泌しない癌細胞でありうる（即ち、有意な又は検出可能な成長ホルモンがそれから分泌されない）。
先に述べたとおり、好ましいＴＭは、抗体（例、抗体フラグメント）及び結合スキャフォールド；特に、（例、特異的に）癌細胞に結合する目的のために設計された市販の抗体／フラグメント及びスキャフォールドを含む。
タンパク質スキャフォールドは、治療的モノクローナル抗体及び派生物（例えばｓｃＦｖｓ、Ｆａｂ分子、ｄＡｂ（単一ドメイン抗体）、ダイアボディ、及びミニボディなど）の増大するレパートリーを補完するための普遍的な結合フレームワークの新たな生成を表わし、その各々を本発明のＴＭとして用いてもよい。スキャフォールドシステムは、公知のタンパク質認識ドメインを、新規スキャフォールドの作製又は公知のタンパク質結合ドメインの改変のいずれかを通じて作製又は改変する。そのようなスキャフォールドは、限定はされないが、以下：
（ｉ）プロテインＡベーススキャフォールド−アフィボディ（Nord, K. et al 1997 "Binding proteins selected from combinatorial libraries of an alpha-helical bacterial receptor domain". Nat Biotechnol 15, 772-777）；
（ｉｉ）リポカリンベーススキャフォールド−アンチカリン（Skerra 2008 "Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities". FEBS J. 275: 2677-83）；
（ｉｉｉ）フィブロネクチンベーススキャフォールド−アデネクチン（Dineen et al 2008 "The Adnectin CT-322 is a novel VEGF receptor 2 inhibitor that decreases tumor burden in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer". BMC Cancer 8: 352）；
（ｉｖ）アビマー（Silverman et al 2005 "Multivalent avimer proteins evolved by exon shuffling of a family of human receptor domains". Nat Biotechnol 23:1556-61）；
（ｖ）アンキリンベーススキャフォールド−ダルピン（Zahnd et al 2006 "Selection and characterization of Her2 binding-designed ankyrin repeat proteins". J Biol Chem. 281: 35167-75）；及び
（ｖｉ）センチリンスキャフォールド−ＣＤＲと類似のループを持つＩｇドメインと有意な構造相同性を有するタンパク質折り畳みに基づく。Ｉｇドメインはヒトタンパク質における共通のモジュールであり、代替スキャフォールドタンパク質として広く適用されている。上の「スキャフォールド」の刊行物の各々が、（その全体が）その参照により本明細書により組み入れられる
を含む。
結合スキャフォールドを使用し、特定の細胞型を、特定の細胞表面タンパク質、受容体又は他の細胞表面エピトープ（例えば糖類など）との相互作用を介して標的化することができる。そのような改変スキャフォールドを、本発明のリコンビナント非細胞傷害性プロテアーゼベースのポリペプチド上で操作し、目的の特定の癌細胞型を標的化することができる。
本発明のＴＭは、対象の標的細胞に結合する（好ましくは特異的に結合する）。「特異的に結合する」という用語は、好ましくは、所与のＴＭが、標的細胞に、１０６M-1又はそれより大きい、好ましくは１０７M-1又はそれより大きい、より好ましくは１０８M-1又はそれより大きい、最も好ましくは１０９M-1又はそれより大きい結合親和性（Ｋａ）で結合することを意味する。
本明細書におけるＴＭの参照は、そのフラグメント及びバリアントを包含し、それは対象の標的に結合する能力を保持する。例として、バリアントは、参照ＴＭと少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、より好ましくは少なくとも９５%、最も好ましくは少なくとも９７%又は少なくとも９９%のアミノ酸配列の相同性を有しうる。このように、バリアントは、アミノ酸（例、天然ではないアミノ酸）の１つ又は複数のアナログ、又は置換結合を含みうる。また、例として、フラグメントという用語は、ＴＭに関して使用される場合、参照ＴＭの少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも３０、最も好ましくは少なくとも４０アミノ酸残基を有するペプチドを意味する。フラグメントという用語は、また、上記のバリアントに関する。このように、例として、本発明のフラグメントは、少なくとも１０、２０、３０、又は４０のアミノ酸を有するペプチド配列を含みうるが、それにおいてペプチド配列は、参照ペプチドの（近接する）アミノ酸の対応するペプチド配列に対し少なくとも８０%配列相同性を有する。
例として、ＥｒｂＢペプチドＴＭを改変し、改善された特性（例えば増加した安定性など）を有するムテインＥｒｂＢリガンドを生成してもよい。例として、ＥｒｂＢ ＴＭムテインは、アミノ酸改変、例えば位置４６又は４７のバリン残基（ＥＧＦＶａｌ４６又は４７）などを有するＥｒｂＢペプチドを含み、それらは細胞プロテアーゼに対する安定性を付与する。ＥｒｂＢ ＴＭは、また、欠失されたアミノ酸又は挿入された追加のアミノ酸を有しうる。これは、限定はされないが、２つのＣ末端アミノ酸の欠失及び位置５１の中性アミノ酸置換を有するＥＧＦ（特にＥＧＦ５１Ｇｌｎ５１；ＵＳ２００２００９８１７８Ａ１を参照のこと）、及びアミノ酸が欠失したＥＧＦ（例、ｒＥＧＦ２−４８；ｒＥＧＦ３−４８及びｒＥＧＦ４−４８）を含む。ＥｒｂＢ ＴＭのフラグメントは、ＴＧＦαのフラグメントを含みうるが、それは予測されたβターン領域（例、配列Ａｃ−Ｃ−Ｈ−Ｓ−Ｇ−Ｙ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｒ−Ｃ−Ｏ−ＯＭｅのペプチド）、ＥＧＦのフラグメント、例えば［Ａｌａ２０］ＥＧＦ（１４−３１）、及びペプチドＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ又はＧＥ１１を含む。上の特許明細書の全てが、その参照により本明細書において組み入れられる。
さらなる例として、ソマトスタチン（ＳＳＴ）及びコルチスタチン（ＣＳＴ）が高い構造的相同性を有し、全ての公知のＳＳＴ受容体に結合する。全長ＳＳＴは以下のアミノ酸配列：
Figure 0006362576
を有する。
全長ＣＳＴは以下のアミノ酸配列：
Figure 0006362576
を有する。
これらのＴＭの参照は、以下のそのフラグメント（及び対応するバリアント）：
Figure 0006362576
を含む。
上の配列に関して、そこでは（Ｐ又はＧ）代替物が与えられ、ＰがＣＳＴ ＴＭの場合において好ましいのに対し、ＧがＳＳＴ ＴＭの場合において好ましい。そこでは（Ｒ又はＫ）代替物が与えられ、ＲがＣＳＴ ＴＭの場合において好ましいのに対し、ＫがＳＳＴ ＴＭの場合において好ましい。そこでは（Ｓ又はＴ）代替物が与えられ、ＳがＣＳＴ ＴＭの場合において好ましいのに対し、ＴがＳＳＴ ＴＭの場合において好ましい。
好ましいフラグメントは、少なくとも７つ又は少なくとも１０のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも１４又は少なくとも１７のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも２８又は２９のアミノ酸残基を含む。例として、好ましい配列は以下：
Figure 0006362576
を含む。
ＴＭは、より長いアミノ酸配列、例えば少なくとも３０又は３５アミノ酸残基、あるいは少なくとも４０又は４５アミノ酸残基を含みうる（ＴＭが正常ＧＨ分泌細胞、好ましくは正常ＧＨ分泌細胞上のＳＳＴ又はＣＳＴ受容体に結合できる限り）。この点において、ＴＭは、好ましくは、全長ＳＳＴ又はＣＳＴのフラグメントであるが、少なくともコア配列「ＮＦＦＷＫＴＦ」又は上で定義する一次アミノ酸配列の１つを含む。
ＴＭが選択された標的細胞に結合することを確認することはルーチンである。例えば、単純な放射性置換実験を用いてもよく、それにおいて成長ホルモン分泌細胞を代表する組織又は細胞を、標識された（例、トリチウム標識された）ＴＭに、過剰な非標識ＴＭの存在において暴露させる。そのような実験において、非特異的結合及び特異的結合の相対的な割合を評価してもよく、それによりＴＭが標的細胞に結合することの確認が可能になる。場合により、アッセイは１つ又は複数の結合アンタゴニストを含みうるが、アッセイは、さらに、ＴＭ結合の喪失の観測を含みうる。この型の実験の例は、Hulme, E.C. (1990), Receptor-binding studies, a brief outline, pp.303-311, In Receptor biochemistry, A Practical Approach, Ed.E.C.Hulme, Oxford University Pressに見出すことができる。
本発明に関連して、ペプチドＴＭ（例、ＧＨＲＨペプチド、又はレプチンペプチド）の参照は、そのペプチドアナログを包含する（アナログが、対応する「参照」ＴＭと同じ受容体に結合する限り）。前記アナログは、例えば以下：
β−Ｎａｌ＝β−ナフチルアラニン
β−Ｐａｌ＝β−ピリジルアラニン
ｈＡｒｇ（Ｂｕ）＝Ｎ−グアニジノ−（ブチル）−ホモアルギニン
ｈＡｒｇ（Ｅｔ）２＝Ｎ，Ｎ’−グアニジノ−（ジメチル）−ホモアルギニン
ｈＡｒｇ（ＣＨ２ＣＦ３）２＝Ｎ，Ｎ’−グアニジノ−ビス−（２，２，２−トリフルオロエチル）−ホモアルギニン
ｈＡｒｇ（ＣＨ３，ヘキシル）＝Ｎ，Ｎ’−グアニジノ−（メチル，ヘキシル）−ホモアルギニン
Ｌｙｓ（Ｍｅ）＝Ｎｅ−メチルリシン
Ｌｙｓ（ｉＰｒ）＝Ｎｅ−イソプロピルリシン
ＡｍＰｈｅ＝アミノメチルフェニルアラニン
ＡＣｈｘＡｌａ＝アミノシクロヘキシルアラニン
Ａｂｕ＝α−アミノ酪酸
Ｔｐｏ＝４−チアプロリン
ＭｅＬｅｕ＝Ｎ−メチルロイシン
Ｏｒｎ＝オルニチン
Ｎｌｅ＝ノルロイシン
Ｎｖａ＝ノルバリン
Ｔｒｐ（Ｂｒ）＝５−ブロモ−トリプトファン
Ｔｒｐ（Ｆ）＝５−フルオロ−トリプトファン
Ｔｒｐ（Ｎ０２）＝５−ニトロ−トリプトファン
Ｇａｂａ＝γ−アミノ酪酸
Ｂｍｐ＝Ｊ−メルカプトプロピオニル
ＡＣ＝アセチル
Ｐｅｎ−ペニシラミン（ｐｅｎｃｉｌｌａｍｉｎｅ）
の合成残基を含みうる。
例として、上のペプチドアナログの局面が、特定のペプチドＴＭ、例えばＳＳＴペプチド、ＧＨＲＨペプチド、ボンベシンペプチド、ＧｎＲＨペプチド、及びグレリンペプチドなどを参照してより詳細に記載されるが、同じ原理が本発明の全てのＴＭに適用される。
ソマトスタチンアナログを、本発明を実施するために使用することができ、限定はされないが、以下の刊行物に記載されるものを含み、それらは参照により本明細書により組み入れられる：Van Binst, G. et al. Peptide Research 5: 8 (1992); Horvath, A. et al. Abstract, "Conformations of Somatostatin Analogs Having Antitumor Activity", 22nd European peptide Symposium, September 13-19,1992, Interlaken, Switzerland；ＵＳ５，５０６，３３９；ＥＰ０３６３５８９；ＵＳ４，９０４，６４２；ＵＳ４，８７１，７１７；ＵＳ４，７２５，５７７；ＵＳ４，６８４，６２０；ＵＳ４，６５０，７８７；ＵＳ４，５８５，７５５；ＵＳ４，７２５，５７７；ＵＳ４，５２２，８１３；ＵＳ４，３６９，１７９；ＵＳ４，３６０，５１６；ＵＳ４，３２８，２１４；ＵＳ４，３１６，８９０；ＵＳ４，３１０，５１８；ＵＳ４，２９１，０２２；ＵＳ４，２３８，４８１；ＵＳ４，２３５，８８６；ＵＳ４，２１１，６９３；ＵＳ４，１９０，６４８；ＵＳ４，１４６，６１２；ＵＳ４，１３３，７８２；ＵＳ５，５０６，３３９；ＵＳ４，２６１，８８５；ＵＳ４，２８２，１４３；ＵＳ４，１９０，５７５；ＵＳ５，５５２，５２０；ＥＰ０３８９１８０；ＥＰ０５０５６８０；ＵＳ４，６０３，１２０；ＥＰ００３０９２０；ＵＳ４，８５３，３７１；ＷＯ９０／１２８１１；ＷＯ９７／０１５７９；ＷＯ９１／１８０１６；ＷＯ９８／０８５２９及びＷＯ９８／０８５２８；ＷＯ／００７５１８６及びＷＯ００／０６１８５；ＷＯ９９／５６７６９；ならびにＦＲ２，５２２，６５５。これらの刊行物の各々が、その全体がその参照により組み入れられる。
アナログを合成するための方法が十分に示されており、例えば、上で引用される特許により例示される通りである。例えば、Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−ＮＨ２の合成は、ＥＰ０３９５４１７Ａ１の実施例１に記載されるプロトコールに従うことにより達成することができる。同様に、置換Ｎ末端を有する合成アナログを、例えば、ＷＯ８８／０２７５６、ＥＰ０３２９２９５、及びＵＳ５，２４０，５６１に記載されるプロトコールに従うことにより達成することができる。
線形ＳＳＴアナログの使用も本発明の範囲内に含まれ、例えば以下：
Figure 0006362576
である。
１つ又は複数の化学成分、例えば、糖誘導体、モノ又はポリヒドロキシ（Ｃ２−１２）アルキル、モノ又はポリヒドロキシ（Ｃ２−１２）アシル基、あるいはピペラジン誘導体を、ＳＳＴアナログに（例、Ｎ末端アミノ酸に）結合させることができる。ＷＯ８８／０２７５６、ＥＰ０３２９２９５、及びＵＳ５，２４０，５６１を参照のこと。
ＧＨＲＨペプチドアナログのデータは１９９０年代までさかのぼり、「標準的アンタゴニスト」［Ａｃ−Ｔｙｒ’，Ｄ−Ａｒｇ２ｊｈＧＨ−ＲＨ（１−２９）Ｎｈａを含む。米国特許第４，６５９，６９３号には、ＧＨ−ＲＨ（１−２９）配列の位置２における特定のＮ，Ｎ’−ジアルキル−オメガ−グアニジノアルファ−アミノアシル残基を含むＧＨ−ＲＨアンタゴニストアナログが開示される。追加の例を、ＷＯ９１／１６９２３、ＵＳ５，５５０，２１２、ＵＳ５，９４２，４８９、ＵＳ６，０５７，４２２ ＵＳ５，９４２，４８９、ＵＳ６，０５７，４２２、ＷＯ９６／０３２１２６、ＷＯ９６／０２２７８２、ＷＯ９６／０１６７０７、ＷＯ９４／０１１３９７、ＷＯ９４／０１１３９６に提供し、その各々がその参照により本明細書において組み入れられる。
本発明における使用のために適したボンベシンアナログの例は、以下：Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（コードネームＢＩＭ−２６２１８）、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＮＨ２（コードネームＢＩＭ−２６１８７）；Ｄ−Ｃｐａ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−φ［ＣＨ２ＮＨ］−Ｐｈｅ−ＮＨ２（コードネームＢＩＭ−２６１５９）、及びＤ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−φ［ＣＨ２ＮＨ］−Ｃｐａ−ＮＨ２（コードネームＢＩＭ−２６１８９）；Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｎ−メチル−Ｄ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−メチルエステル、及びＤ−Ｆｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−メチルエステルを含むＴＭを含む。
ボンベシンアナログは、天然の構造的に関連するペプチド、即ち、ボンベシン、ニューロメディンＢ、ニューロメディンＣ、リトリン、及びＧＲＰに由来するペプチドを含む。これらの天然ＴＭペプチドの関連アミノ酸配列を以下：
ボンベシン（最後の１０ａａ’ｓ）：Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ２
ニューロメジンＢ：Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−ＮＨ２
ニューロメジンＣ：Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ２
リトリン：ｐＧｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−ＮＨ２
ヒトＧＲＰ（最後の１０ａａ’ｓ）：Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ２
に列挙する。
本発明における使用のために適したアナログは、米国特許出願シリアル番号５０２，４３８（１９９０年３月３０日出願）、米国特許出願シリアル番号３９７，１６９（１９８９年８月２１日出願）、米国特許出願シリアル番号３７６，５５５（１９８９年７月７日出願）、米国特許出願シリアル番号３９４，７２７（１９８９年８月１６日出願）、米国特許出願シリアル番号３１７，９４１（１９８９年３月２日出願）、米国特許出願シリアル番号２８２，３２８（１９８８年１２月９日出願）、米国特許出願シリアル番号２５７，９９８（１９８８年１０月１４日出願）、米国特許出願シリアル番号２４８，７７１（１９８８年９月２３日出願）、米国特許出願シリアル番号２０７，７５９（１９８８年６月１６日出願）、米国特許出願シリアル番号２０４，１７１（１９８８年６月８日出願）、米国特許出願シリアル番号１７３，３１１（１９８８年３月２５日出願）、米国特許出願シリアル番号１００，５７１（１９８７年９月２４日出願）；及び米国特許出願シリアル番号５２０，２２５（１９９０年５月９日出願）、米国特許出願シリアル番号４４０，０３９（１９８９年１１月２１日出願）に記載されている。全てのこれらの出願が、参照により、本明細書により組み入れられる。ボンベシンアナログは、また、Zachary et al., Proc. Nat. Aca. Sci. 82: 7616 (1985); Heimbrook et al., "Synthetic Peptides: Approaches to Biological Problems", UCLA Symposium on Mol. and Cell.Biol. New Series, Vol. 86, ed. Tarnand Kaiser; Heinz-Erian et al., Am. J. Physiol. G439 (1986); Martinez et al., J. Med. Chem. 28: 1874 (1985); Gargosky et al., Biochem. J. 247: 427 (1987); Dubreuil et al. , Drug Design and Delivery, Vol 2: 49, Harwood Academic Publishers, GB (1987); Heikkila et al., J. Biol. Chem. 262: 16456 (1987); Caranikas et al. , J. Med. Chem. 25: 1313 (1982); Saeed et al., Peptides 10: 597 (1989); Rosell et al., Trends in Pharmacological Sciences 3: 211 (1982); Lundberg et al., Proc. Nat. Aca. Sci. 80: 1120, (1983); Engberg et al., Nature 293:222 (1984); Mizrahi et al., Euro. J. Pharma. 82: 101 (1982); Leander et al., Nature 294: 467 (1981); Woll et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 155: 359 (1988); Rivier et al., Biochem. 17: 1766 (1978); Cuttitta et al., Cancer Surveys 4: 707 (1985); Aumelas et al., Int. J. Peptide Res. 30: 596 (1987)に記載されている；その全てが、また、参照により、本明細書により組み入れられる。
アナログは、従来の技術、例えばＷＯ９２／２０３６３及びＥＰ０７３７６９１に記載されるものなどにより調製することができる。追加のボンベシンアナログが、例えば、ＷＯ８９／０２８９７、ＷＯ９１／１７１８１、ＷＯ９０／０３９８０、及びＷＯ９１／０２７４６に記載されており、その全てがその参照により本明細書において組み入れられる。
本発明のＴＭとしての使用のために適したグレリンアナログの例は、以下：
Figure 0006362576
Figure 0006362576

０−（２−メチルアリル）ベンゾフェノン（ｂｅｎｚｏｐｈｏｎｏｎｅ）オキシム、（Ｒ）−２−アミノ−３−（ｌＨ−インドール−３−イル）−ｌ−（４−フェニルピペリジン−１−イル）プロパン−１−オン、Ｎ−（（Ｒ）−１−（（Ｒ）−１−（（Ｓ）−３−（ｌＨ−インドール−３−イル）−１−オキソ−１−（４−フェニルピペリジン−１−イル）プロパン−２−イルアミノ）−６−アミノ−１−オキソヘキサン−２−イルアミノ）−３−ヒドロキシ−１−オキソプロパン−２−イル）ベンズアミド、（Ｓ）−Ｎ−（（Ｓ）−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−オキソ−１−（４−フェニルピペリジン−１−イル）プロパン−２−イル）−６−アセトアミド−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−（ベンジルオキシ）プロパンアミド）ヘキサンアミド、（Ｓ）−Ｎ−（（Ｒ）−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−オキソ−１−（４−フェニルピペリジン−１−イル）プロパン−２−イル）−２−（（Ｓ）−２−アセトアミド−３−（ベンジルオキシ）プロパンアミド）−６−アミノヘキサンアミド、（Ｒ）−Ｎ−（３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−（４−（２−メトキシフェニル）ピペリジン−１−イル）−１−オキソプロパン−２−イル）−４−アミノブタンアミド、（Ｒ）−Ｎ−（３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−（４−（２−メトキシフェニル）ピペリジン−１−イル）−１−オキソプロパン−２−イル）−２−アミノ−２−メチルプロパンアミド、メチル３−（ｐ−トリルカルバモイル）−２−ナフトエ酸、エチル３−（４−（２−メトキシフェニル）ピペリジン−１−カルボニル）−２−ナフトエ酸、３−（２−メトキシフェニルカルバモイル）−２−ナフトエ酸、（Ｓ）−２，４−ジアミノ−Ｎ−（（Ｒ）−３−（ナフタレン−２−イルメトキシ）−１−オキソ−１−（４−フェニルピペリジン−１−イル）プロパン−２−イル）ブタンアミド、ナフタレン−２，３−ジイルビス（（４−（２−メトキシフェニル）ピペラジン−１−イル）メタノン）、（Ｒ）−２−アミノ−Ｎ−（３−（ベンジルオキシ）−１−オキソ−１−（４−フェニルピペラジン−１−イル）プロパン−２−イル）−２−メチルプロパンアミド、又は（Ｒ）−２−アミノ−３−（ベンジルオキシ）−１−（４−フェニルピペラジン−１−イル）プロパン−１−オンを含む。
本発明におけるＴＭとしての使用のために適したＧｎＲＨアナログの例は、例えば、ＥＰ１７１４７７、ＷＯ９６／０３３７２９、ＷＯ９２／０２２３２２、ＷＯ９２／０１３８８３、及びＷＯ９１／０５５６３から公知のものを含み、その各々がその参照により本明細書において組み入れられる。特定の例は以下：
Figure 0006362576
を含む。
本発明のポリペプチドは、クロストリジウム神経毒素の機能的なＨＣドメインを欠く。したがって、前記ポリペプチドは、Shone et al.(1985) Eur. J. Biochem. 151, 75-82に記載される通り、結合アッセイにおいてラットシナプトソーム膜に（クロストリジウムＨＣ成分を介して）結合することはできない。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、好ましくは、クロストリジウム神経毒素ホロ毒素の最後の５０のＣ末端アミノ酸を欠く。別の実施態様において、ポリペプチドは、好ましくは、クロストリジウム神経毒素ホロ毒素の最後の１００、好ましくは最後の１５０、より好ましくは最後の２００、特に好ましくは最後の２５０、最も好ましくは最後の３００のＣ末端アミノ酸残基を欠く。あるいは、ＨＣ結合活性は、突然変異誘発により無効／低下させてもよい。例として、便宜上ＢｏＮＴ／Ａを参照し、ガングリオシド結合ポケット中の１つ又は２つのアミノ酸残基の突然変異（Ｗ１２６６からＬ及びＹ１２６７からＦ）の改変によって、ＨＣ領域はその受容体結合機能を失う。類似の突然変異を、非血清型Ａクロストリジウムペプチド成分に対して行ってもよい（例、突然変異（Ｗ１２６２からＬ及びＹ１２６３からＦ）を有するボツリヌスＢ又はボツリヌスＥ（Ｗ１２２４からＬ及びＹ１２２５からＦ）に基づく構築物）。活性部位に対する他の突然変異は、ＨＣ受容体結合活性の同じ消失を達成する（例、ボツリヌスＡ型毒素におけるＹ１２６７Ｓ及び他のクロストリジウム神経毒素における対応する高度に保存された残基）。これ及び他の突然変異の詳細がRummel et al (2004) (Molecular Microbiol. 51: 631-634)に記載されており、それは、その参照により、本明細書により組み入れられる。
別の実施態様において、本発明のポリペプチドは、クロストリジウム神経毒素の機能的なＨＣドメインを欠き、また、任意の機能的に等価なＴＭを欠く。したがって、前記のポリペプチドは、クロストリジウム神経毒素の天然の結合機能を欠き、Shone et al.(1985) Eur. J. Biochem. 151, 75-82に記載される通り、結合アッセイにおいてラットシナプトソーム膜に（クロストリジウムＨＣ成分を介して又は任意の機能的に等価なＴＭを介して）結合することはできない。
天然クロストリジウム神経毒素のＨＣペプチドは、約４００〜４４０アミノ酸残基を含み、各々が約２５kDaの２つの機能的に異なるドメイン、即ち、Ｎ末端領域（一般にＨＣＮペプチド又はドメインといわれる）及びＣ末端領域（一般にＨＣＣペプチド又はドメインといわれる）からなる。この事実は、以下の刊行物により確認され、その各々が、その全体が、その参照により本明細書において組み入れられる：Umland TC (1997) Nat. Struct. Biol. 4: 788-792; Herreros J (2000) Biochem. J. 347: 199-204; Halpern J (1993) J. Biol. Chem. 268: 15, pp.11188-11192; Rummel A (2007) PNAS 104: 359-364; Lacey DB (1998) Nat. Struct. Biol. 5: 898-902; Knapp (1998) Am. Cryst. Assoc. Abstract Papers 25: 90; Swaminathan and Eswaramoorthy (2000) Nat. Struct. Biol. 7: 1751-1759;及びRummel A (2004) Mol. Microbiol. 51(3), 631-643。さらに、Ｃ末端領域（ＨＣＣ）は、Ｃ末端１６０−２００アミノ酸残基を構成し、クロストリジウム神経毒素のその天然細胞受容体に対する、即ち、神経筋接合部の神経末端に対する結合に関与することが十分に示されている。この事実は、また、上の刊行物により確認される。このように、本明細書全体を通して、重鎖が、天然クロストリジウム神経毒素が結合する細胞表面受容体への結合が不可能であるような機能的な重鎖ＨＣペプチド（又はドメイン）を欠くクロストリジウム重鎖の参照は、クロストリジウム重鎖が機能的なＨＣＣペプチドを単純に欠くことを意味する。換言すると、ＨＣＣペプチド領域は部分的又は全体的のいずれかで欠失している、又はそうでなければ可変されており（例、従来の化学的又はタンパク質分解的処理を通じて）、神経筋接合部の神経末端についてのその天然結合能力を不活性化する。
このように、一実施態様において、本発明のクロストリジウムＨＮペプチドは、クロストリジウム神経毒素のＣ末端ペプチド部分（ＨＣＣ）の部分を欠き、ひいては天然クロストリジウム神経毒素のＨＣ結合機能を欠く。例として、一実施態様において、Ｃ末端に伸長するクロストリジウムＨＮペプチドは、クロストリジウム神経毒素重鎖のＣ末端４０アミノ酸残基、又はＣ末端６０アミノ酸残基、又はＣ末端８０アミノ酸残基、又はＣ末端１００アミノ酸残基、又はＣ末端１２０アミノ酸残基、又はＣ末端１４０アミノ酸残基、又はＣ末端１５０アミノ酸残基、又はＣ末端１６０アミノ酸残基を欠く。別の実施態様において、本発明のクロストリジウムＨＮペプチドは、クロストリジウム神経毒素のＣ末端ペプチド部分（ＨＣＣ）の全体を欠き、ひいては天然クロストリジウム神経毒素のＨＣ結合機能を欠く。例として、一実施態様において、クロストリジウムＨＮペプチドは、クロストリジウム神経毒素重鎖のＣ末端１６５アミノ酸残基、又はＣ末端１７０アミノ酸残基、又はＣ末端１７５アミノ酸残基、又はＣ末端１８０アミノ酸残基、又はＣ末端１８５アミノ酸残基、又はＣ末端１９０アミノ酸残基、又はＣ末端１９５アミノ酸残基を欠く。さらなる例として、本発明のクロストリジウムＨＮペプチドは、以下：
ボツリヌスＡ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｙ１１１１−Ｌ１２９６）
ボツリヌスＢ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｙ１０９８−Ｅ１２９１）
ボツリヌスＣ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｙ１１１２−Ｅ１２９１）
ボツリヌスＤ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｙ１０９９−Ｅ１２７６）
ボツリヌスＥ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｙ１０８６−Ｋ１２５２）
ボツリヌスＦ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｙ１１０６−Ｅ１２７４）
ボツリヌスＧ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｙ１１０６−Ｅ１２９７）
破傷風神経毒素−アミノ酸残基（Ｙ１１２８−Ｄ１３１５）
からなる群より選択されるクロストリジウムＨＣＣ参照配列を欠く。
上で特定する参照配列は、ガイドとして考えるべきである。なぜなら、わずかな変動が血清亜型に従って生じうるからである。
本発明のプロテアーゼは、真核細胞において細胞外融合機構の１つ又は複数のタンパク質を切断することが可能である全ての非細胞傷害性プロテアーゼを包含する。
本発明のプロテアーゼは、好ましくは、細菌プロテアーゼ（又はそのフラグメント）である。より好ましくは、細菌プロテアーゼは、クロストリジウム属又はナイセリア属／ストレプトコッカス属より選択される（例、クロストリジウムのＬ鎖、又は好ましくはＮ． ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ又はＳ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのナイセリアのＩｇＡプロテアーゼ）。
本発明は、また、バリアント非細胞傷害性プロテアーゼ（即ち、天然プロテアーゼ分子のバリアント）を包含する（バリアントプロテアーゼが依然として必要なプロテアーゼ活性を示す限り）。例として、バリアントは、参照プロテアーゼ配列と少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、より好ましくは少なくとも９０%、最も好ましくは少なくとも９５%又は少なくとも９８%のアミノ酸相同性を有しうる。このように、バリアントという用語は、増強された（又は減少した）エンドペプチダーゼ活性を有する非細胞傷害性プロテアーゼを含む。特に、本明細書では、ＢｏＮＴ／Ａ突然変異体Ｑ１６１Ａ、Ｅ５４Ａ、及びＫ１６５Ｌの増加したＫｃａｔ／Ｋｍに言及する。Ahmed, S.A.(2008) Protein J. DOI 10.1007/s10930-007-9118-8を参照のこと。それは、その参照により組み入れられる。フラグメントという用語は、プロテアーゼに関連して使用される場合、典型的には、参照プロテアーゼの少なくとも１５０、好ましくは少なくとも２００、より好ましくは少なくとも２５０、最も好ましくは少なくとも３００のアミノ酸残基を有するペプチドを意味する。ＴＭ「フラグメント」成分（上で考察する）に関して、本発明のプロテアーゼ「フラグメント」は、参照配列に基づくバリアントプロテアーゼのフラグメントを包含する。
本発明のプロテアーゼは、好ましくは、セリン又はメタロプロテイナーゼ活性（例、エンドペプチダーゼ活性）を示す。プロテアーゼは、好ましくは、ＳＮＡＲＥタンパク質（例、ＳＮＡＰ−２５、シナプトブレビン／ＶＡＭＰ、又はシンタキシン）に特異的である。
特に、神経毒素のプロテアーゼドメイン、例えば細菌の神経毒素のプロテアーゼドメインに言及する。このように、本発明は、神経毒素ドメイン（天然において生じる）、ならびに前記の天然神経毒素のリコンビナント調製バージョンの使用を包含する。
例示的な神経毒素はクロストリジウムにより産生され、クロストリジウム神経毒素という用語は、Ｃ． ｔｅｔａｎｉ（ＴｅＮＴ）により、及びＣ． ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ（ＢｏＮＴ）血清型Ａ−Ｇにより産生される神経毒素、ならびにＣ． ｂａｒａｔｉｉ及びＣ． ｂｕｔｙｒｉｃｕｍにより産生される密接に関連するＢｏＮＴ様神経毒素を包含する。上記の略語が本明細書を通して使用される。例えば、命名ＢｏＮＴ／Ａは、ＢｏＮＴ（血清型Ａ）としての神経毒素の起源を表示する。対応する命名法を他のＢｏＮＴ血清型に適用する。
ＢｏＮＴは最も強力な公知の毒素であり、マウスについての半数致死量（ＬＤ５０）の値は、血清型に依存して０．５〜５ng/kgの範囲である。ＢｏＮＴが胃腸管において吸収され、全身循環に入った後、コリン作動性神経末端のシナプス前膜に結合し、それらの神経伝達物質アセチルコリンの放出を妨害する。ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｆ、及びＢｏＮＴ／Ｇは、シナプトブレビン／小胞関連膜タンパク質（ＶＡＭＰ）を切断する；ＢｏＮＴ／Ｃ、ＢｏＮＴ／Ａ、及びＢｏＮＴ／Ｅは、２５kDaのシナプトソーム関連タンパク質（ＳＮＡＰ−２５）を切断する；及びＢｏＮＴ／Ｃはシンタキシンを切断する。
ＢｏＮＴは共通の構造を共有し、〜１５０kDaの二本鎖タンパク質であり、単一のジスルフィド結合により〜５０kDaの軽鎖（Ｌ鎖）に共有結合的に連結された〜１００kDaの重鎖（Ｈ鎖）からなる。Ｈ鎖は２つのドメインからなり、各々が〜５０kDaである。Ｃ末端ドメイン（ＨＣ）が高親和性神経結合のために要求されるのに対し、Ｎ末端ドメイン（ＨＮ）が膜トランスロケーションに関与することが提案されている。Ｌ鎖は、基質ＳＮＡＲＥタンパク質の切断に関与する亜鉛依存的メタロプロテイナーゼである。
Ｌ鎖フラグメントという用語は、神経毒素のＬ鎖の成分を意味し、そのフラグメントはメタロプロテイナーゼ活性を示し、細胞エキソサイトーシスに関与する小胞及び／又は原形質膜関連タンパク質をタンパク質分解的に切断することが可能である。
適したプロテアーゼ（参照）配列の例は、以下：
ボツリヌスＡ型神経毒素−アミノ酸残基（１−４４８）
ボツリヌスＢ型神経毒素−アミノ酸残基（１−４４０）
ボツリヌスＣ型神経毒素−アミノ酸残基（１−４４１）
ボツリヌスＤ型神経毒素−アミノ酸残基（１−４４５）
ボツリヌスＥ型神経毒素−アミノ酸残基（１−４２２）
ボツリヌスＦ型神経毒素−アミノ酸残基（１−４３９）
ボツリヌスＧ型神経毒素−アミノ酸残基（１−４４１）
破傷風神経毒素−アミノ酸残基（１−４５７）
ＩｇＡプロテアーゼ−アミノ酸残基（１−９５９）＊
を含む。
＊Pohlner, J. et al.(1987). Nature 325, pp.458-462、それは、その参照により、本明細書により組み入れられる。
上で特定する参照配列は、ガイドとして考えるべきである。なぜなら、わずかな変動が血清亜型に従って生じうるからである。例として、ＵＳ２００７／０１６６３３２（その参照により本明細書により組み入れられる）では、わずかに異なるクロストリジウム配列：
ボツリヌスＡ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｍ１−Ｋ４４８）
ボツリヌスＢ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｍ１−Ｋ４４１）
ボツリヌスＣ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｍ１−Ｋ４４９）
ボツリヌスＤ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｍ１−Ｒ４４５）
ボツリヌスＥ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｍ１−Ｒ４２２）
ボツリヌスＦ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｍ１−Ｋ４３９）
ボツリヌスＧ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｍ１−Ｋ４４６）
破傷風神経毒素−アミノ酸残基（Ｍ１−Ａ４５７）
が引用される。
軽鎖を含む種々のクロストリジウム毒素フラグメントが、本発明の局面において有用でありうる（ただしこれらの軽鎖フラグメントが、神経伝達物質放出機構のコア成分を特異的に標的化することができ、ひいては全細胞機構の実行に関与し、それによりクロストリジウム毒素がタンパク質分解的に基質を切断する）。クロストリジウム毒素の軽鎖は、約４２０−４６０アミノ酸長であり、酵素ドメインを含む。研究では、クロストリジウム毒素軽鎖の全長が、酵素ドメインの酵素活性のために必要ではないことが示されている。非限定的な例として、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖の最初の８つのアミノ酸は、酵素活性のために要求されない。
別の非限定的な例として、ＴｅＮＴ軽鎖の最初の８つのアミノ酸は、酵素活性のために要求されない。同じように、軽鎖のカルボキシ末端は、活性のために必要ではない。非限定的な例として、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖の最後の３２つのアミノ酸（残基４１７−４４８）は、酵素活性のために要求されない。別の非限定的な例として、ＴｅＮＴ軽鎖の最後の３１つのアミノ酸（残基４２７−４５７）は、酵素活性のために要求されない。このように、この実施態様の局面は、例えば、少なくとも３５０アミノ酸、少なくとも３７５アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸、少なくとも４２５アミノ酸、少なくとも４５０アミノ酸の長さを有する酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素軽鎖を含みうる。この実施態様の他の局面は、例えば、最大で３５０アミノ酸、最大で３７５アミノ酸、最大で４００アミノ酸、最大で４２５アミノ酸、最大で４５０アミノ酸の長さを有する酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素軽鎖を含みうる。
本発明のポリペプチド、特にそのプロテアーゼ成分は、ペグ化されうる。これは、安定性、例えば、プロテアーゼ成分の作用の持続時間を延長させることに役立つ可能性がある。ペグ化は、プロテアーゼがＢｏＮＴ／Ａ、Ｂ、又はＣ１プロテアーゼを含む場合に特に好ましい。ペグ化は、好ましくは、プロテアーゼ成分のＮ末端に対するＰＥＧの付加を含む。例として、プロテアーゼのＮ末端は、１つ又は複数のアミノ酸（システイン）残基を用いて伸長してもよいが、それらは同じである又は異なりうる。前記アミノ酸残基の１つ又は複数は、それに結合した（例、共有結合的に結合した）それ自体のＰＥＧ分子を有しうる。この技術の例がＷＯ２００７／１０４５６７に記載されており、それは、その全体が、その参照により組み入れられる。
トランスロケーションドメインは、標的細胞中へのプロテアーゼのトランスロケーションを可能にする分子であり、プロテアーゼ活性の機能的な発現が標的細胞の細胞質内で生じるようにする。任意の分子（例、タンパク質又はペプチド）が本発明の必要なトランスロケーション機能を持つか否かは、多くの従来のアッセイのいずれか１つにより確認されうる。
例えば、Shone C. (1987)には、リポソーム（テスト分子を用いて攻撃される）を用いたインビトロでのアッセイが記載されている。必要なトランスロケーション機能の存在は、リポソームからのＫ＋及び／又は標識ＮＡＤの放出により確認され、それらは容易にモニターされうる［Shone C. (1987) Eur. J. Biochem; vol. 167(1): pp.175-180を参照のこと］。
さらなる例が、Blaustein R. (1987)により提供され、それは、平面リン脂質二重膜を用いた単純なインビトロアッセイが記載される。膜を、テスト分子を用いて攻撃し、必要なトランスロケーション機能を、前記膜間の伝導率の増加により確認する［Blaustein (1987) FEBS Letts; vol. 226, no. 1: pp.115-120を参照のこと］。
膜融合の評価を可能にする方法、それによる本発明における使用のために適したトランスロケーションドメインの同定が、Methods in Enzymology Vol 220 and 221, Membrane Fusion Techniques, Parts A and B, Academic Press 1993により提供される。
本発明は、また、バリアントトランスロケーションドメインを包含する（バリアントドメインが、依然として必要なトランスロケーション活性を示す限り）。例として、バリアントは、参照トランスロケーションドメインと少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、より好ましくは少なくとも９０%、最も好ましくは少なくとも９５%又は少なくとも９８%のアミノ酸配列の相同性を有しうる。フラグメントという用語は、トランスロケーションドメインに関連して使用される場合、参照トランスロケーションドメインの少なくとも２０、好ましくは少なくとも４０、より好ましくは少なくとも８０、最も好ましくは少なくとも１００のアミノ酸残基を有するペプチドを意味する。クロストリジウムトランスロケーションドメインの場合において、フラグメントは、好ましくは、参照トランスロケーションドメイン（例、ＨＮドメイン）の少なくとも１００、好ましくは少なくとも１５０、より好ましくは少なくとも２００、最も好ましくは少なくとも２５０のアミノ酸残基を有する。ＴＭ「フラグメント」成分（上で考察する）に関して、本発明のトランスロケーション「フラグメント」は、参照配列に基づくバリアントトランスロケーションドメインのフラグメントを包含する。
トランスロケーションドメインは、好ましくは、低ｐＨの条件下で脂質膜中でのイオン透過性孔の形成が可能である。好ましくは、エンドソーム膜内で孔形成が可能であるタンパク質分子のそれらの部分だけを使用することが見出されている。
トランスロケーションドメインを、微生物タンパク質源から、特に細菌又はウイルスタンパク質源から得ることができる。故に、一実施態様において、トランスロケーションドメインは、酵素のトランスロケーションドメイン、例えば細菌毒素又はウイルスタンパク質などである。
細菌毒素分子の特定のドメインが、そのような孔を形成することが可能であることが十分に示されている。ウイルス発現された膜融合タンパク質の特定のトランスロケーションドメインが、そのような孔を形成することが可能であることも公知である。そのようなドメインを、本発明において用いてもよい。
トランスロケーションドメインは、クロストリジウム由来であり、例えばＨＮドメイン（又はその機能的な成分）などでありうる。ＨＮは、Ｈ鎖のアミノ末端半分とおよそ等価であるクロストリジウム神経毒素のＨ鎖の部分又はフラグメント、あるいはインタクトなＨ鎖中のそのフラグメントに対応するドメインを意味する。Ｈ鎖は、Ｈ鎖のＨＣ成分の天然結合機能を欠く。この点において、ＨＣ機能は、ＨＣアミノ酸配列の欠失により（ＤＮＡ合成レベルで、又はヌクレアーゼもしくはプロテアーゼ処理による合成後レベルで）除去されうる。あるいは、ＨＣ機能は、化学的又は生物学的処理により不活性化されうる。このように、Ｈ鎖は、天然クロストリジウム神経毒素（即ち、ホロ毒素）が結合する、標的細胞上の結合部位に結合することが不可能である。
適した（参照）トランスロケーションドメインの例は、以下：
ボツリヌスＡ型神経毒素−アミノ酸残基（４４９−８７１）
ボツリヌスＢ型神経毒素−アミノ酸残基（４４１−８５８）
ボツリヌスＣ型神経毒素−アミノ酸残基（４４２−８６６）
ボツリヌスＤ型神経毒素−アミノ酸残基（４４６−８６２）
ボツリヌスＥ型神経毒素−アミノ酸残基（４２３−８４５）
ボツリヌスＦ型神経毒素−アミノ酸残基（４４０−８６４）
ボツリヌスＧ型神経毒素−アミノ酸残基（４４２−８６３）
破傷風神経毒素−アミノ酸残基（４５８−８７９）
を含む。
上で特定する参照配列は、ガイドとして考えるべきである。なぜなら、わずかな変動が血清亜型に従って生じうるからである。例として、ＵＳ２００７／０１６６３３２（その参照により本明細書により組み入れられる）では、わずかに異なるクロストリジウム配列：
ボツリヌスＡ型神経毒素−アミノ酸残基（Ａ４４９−Ｋ８７１）
ボツリヌスＢ型神経毒素−アミノ酸残基（Ａ４４２−Ｓ８５８）
ボツリヌスＣ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｔ４５０−Ｎ８６６）
ボツリヌスＤ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｄ４４６−Ｎ８６２）
ボツリヌスＥ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｋ４２３−Ｋ８４５）
ボツリヌスＦ型神経毒素−アミノ酸残基（Ａ４４０−Ｋ８６４）
ボツリヌスＧ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｓ４４７−Ｓ８６３）
破傷風神経毒素−アミノ酸残基（Ｓ４５８−Ｖ８７９）
が引用される。
本発明に関連して、トランスロケーションドメインを含む種々のクロストリジウム毒素ＨＮ領域が、本発明の局面において有用でありうる（ただしこれらの活性フラグメントが、標的細胞の細胞内小胞から細胞質中に非細胞傷害性プロテアーゼ（例、クロストリジウムＬ鎖）の放出を促進することができ、ひいては全細胞機能の実行に関与し、それによりクロストリジウム毒素がタンパク質分解的に基質を切断する）。クロストリジウム毒素の重鎖からのＨＮ領域は、約４１０−４３０アミノ酸長であり、トランスロケーションドメインを含む。研究では、クロストリジウム毒素重鎖からのＨＮ領域の全長が、トランスロケーションドメインのトランスロケーション活性のために必要ではないことが示されている。このように、この実施態様の局面は、例えば、少なくとも３５０アミノ酸、少なくとも３７５アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸、少なくとも４２５アミノ酸の長さを有するトランスロケーションドメインを含むクロストリジウム毒素ＨＮ領域を含みうる。この実施態様の他の局面は、例えば、最大で３５０アミノ酸、最大で３７５アミノ酸、最大で４００アミノ酸、最大で４２５アミノ酸の長さを有するトランスロケーションドメインを含むクロストリジウム毒素ＨＮ領域を含みうる。
クロストリジウム・ボツリナム及びＣ． ｔｅｔａｎｉにおける毒素産生の遺伝的基礎に関するさらなる詳細について、本発明者らは、Henderson et al (1997) in The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic pressを参照する。
ＨＮという用語は、天然の神経毒素ＨＮ部分、及び天然において生じないアミノ酸配列及び／又は合成アミノ酸残基を有する改変ＨＮ部分を包含する（改変ＨＮ部分が、依然として、上記のトランスロケーション機能を示す限り）。
あるいは、トランスロケーションドメインは、非クロストリジウム由来でありうる。非クロストリジウム（参照）トランスロケーションドメインの起源の例は、制限はされないが、ジフテリア毒素のトランスロケーションドメイン［O=Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 6202-6206; Silverman et al., J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524-22532;及びLondon, E. (1992) Biochem. Biophys. Acta., 1112, pp.25-51］、シュードモナス外毒素Ａ型のトランスロケーションドメイン［Prior et al. Biochemistry (1992) 31, 3555-3559］、炭疽毒素のトランスロケーションドメイン［Blanke et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 8437-8442］、トランスロケーション機能の種々の融合ペプチド又は疎水性ペプチド［Plank et al. J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918-12924；及びWagner et al (1992) PNAS, 89, pp.7934-7938］、及び両親媒性ペプチド［Murata et al (1992) Biochem., 31, pp.1986-1992］を含む。トランスロケーションドメインは、天然タンパク質中に存在するトランスロケーションドメインを反映し、又は、アミノ酸変異を含みうる（変異がトランスロケーションドメインのトランスロケーション能力を破壊しない限り）。
本発明における使用のために適したウイルス（参照）トランスロケーションドメインの特定の例は、ウイルス発現された膜融合タンパク質の特定のトランスロケーションドメインを含む。例えば、Wagner et al.(1992)及びMurata et al.(1992)には、インフルエンザウイルス赤血球凝集素のＮ末端領域に由来する多くの融合ペプチド及び両親媒性ペプチドのトランスロケーション（即ち、膜融合及び小胞化）機能が記載されている。所望のトランスロケーション能力を有することが公知である他のウイルス発現された膜融合タンパク質は、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）の融合ペプチドのトランスロケーションドメイン、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）糖タンパク質Ｇのトランスロケーションドメイン、ＳＥＲウイルスＦタンパク質のトランスロケーションドメイン、及び泡沫状ウイルス外被糖タンパク質のトランスロケーションドメインである。ウイルスによりコードされるＡｓｐｉｋｅタンパク質は、本発明に関連する特定の適用を有する（例えば、ＳＦＶのＥ１タンパク質及びＶＳＶのＧタンパク質のＧタンパク質）。
表（下）に列挙される（参照）トランスロケーションドメインの使用は、その配列バリアントの使用を含む。バリアントは、１つ又は複数の保存的核酸置換及び／又は核酸欠失もしくは挿入を含みうる（ただしバリアントが、必要なトランスロケーション機能を持つ）。バリアントは、また、１つ又は複数のアミノ酸置換及び／又はアミノ酸欠失もしくは挿入を含みうる（バリアントが、必要なトランスロケーション機能を持つ限り）。
Figure 0006362576
本発明のポリペプチドは、さらに、トランスロケーション促進ドメインを含みうる。前記ドメインは、標的細胞の細胞質中への非細胞傷害性プロテアーゼの送達を促進させ、例えば、ＷＯ０８／００８８０３及びＷＯ０８／００８８０５に記載され、その各々がその参照により本明細書において組み入れられる。
例として、適したトランスロケーション促進ドメインは、外被を持つウイルス融合ペプチドドメインを含み、例えば、適した融合ペプチドドメインは以下：インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン（例、２３アミノ酸のインフルエンザＡ型ウイルス融合ペプチドドメイン）、アルファウイルス融合ペプチドドメイン（例、２６アミノ酸のセムリキ森林ウイルス融合ペプチドドメイン）、ベジクロウイルス融合ペプチドドメイン（例、２１アミノ酸の水疱性口内炎ウイルス融合ペプチドドメイン）、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン（例、２５アミノ酸のセンダイウイルス融合ペプチドドメイン）、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン（例、２５アミノ酸のイヌジステンパーウイルス融合ペプチドドメイン）、アブラウイルス融合ペプチドドメイン（例、２５アミノ酸のニューキャッスル疾患ウイルス融合ペプチドドメイン）、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン（例、２５アミノ酸のヘンドラウイルス融合ペプチドドメイン）、メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン（例、２５アミノ酸のヒトメタニューモウイルス融合ペプチドドメイン）又はスプーマウイルス融合ペプチドドメイン、例えばサル泡沫状ウイルス融合ペプチドドメインなど；あるいはそのフラグメント又はバリアントを含む。
さらなる例として、トランスロケーション促進ドメインは、クロストリジウム毒素ＨＣＮドメイン又はそのフラグメントもしくはバリアントを含みうる。より詳細には、クロストリジウム毒素ＨＣＮトランスロケーション促進ドメインは、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２５アミノ酸、少なくとも２５０アミノ酸、少なくとも２７５アミノ酸の長さを有しうる。この点において、クロストリジウム毒素ＨＣＮトランスロケーション促進ドメインは、好ましくは、最大で２００アミノ酸、最大で２２５アミノ酸、最大で２５０アミノ酸、又は最大で２７５アミノ酸の長さを有する。特定の（参照）例は、以下：
ボツリヌスＡ型神経毒素−アミノ酸残基（８７２−１１１０）
ボツリヌスＢ型神経毒素−アミノ酸残基（８５９−１０９７）
ボツリヌスＣ型神経毒素−アミノ酸残基（８６７−１１１１）
ボツリヌスＤ型神経毒素−アミノ酸残基（８６３−１０９８）
ボツリヌスＥ型神経毒素−アミノ酸残基（８４６−１０８５）
ボツリヌスＦ型神経毒素−アミノ酸残基（８６５−１１０５）
ボツリヌスＧ型神経毒素−アミノ酸残基（８６４−１１０５）
破傷風神経毒素−アミノ酸残基（８８０−１１２７）
を含む。
上の配列位置は、血清型／亜型に従って少し変動しうるが、適した（参照）クロストリジウム毒素ＨＣＮドメインのさらなる例は、以下：
ボツリヌスＡ型神経毒素−アミノ酸残基（８７４−１１１０）
ボツリヌスＢ型神経毒素−アミノ酸残基（８６１−１０９７）
ボツリヌスＣ型神経毒素−アミノ酸残基（８６９−１１１１）
ボツリヌスＤ型神経毒素−アミノ酸残基（８６５−１０９８）
ボツリヌスＥ型神経毒素−アミノ酸残基（８４８−１０８５）
ボツリヌスＦ型神経毒素−アミノ酸残基（８６７−１１０５）
ボツリヌスＧ型神経毒素−アミノ酸残基（８６６−１１０５）
破傷風神経毒素−アミノ酸残基（８８２−１１２７）
を含む。
上に記載する促進ドメインのいずれかを、本発明における使用のために適する、先に記載したトランスロケーションドメインペプチドのいずれかと組み合わせてもよい。このように、例として、非クロストリジウム促進ドメインを、非クロストリジウムトランスロケーションドメインペプチドと又はクロストリジウムトランスロケーションドメインペプチドと組み合わせてもよい。あるいは、クロストリジウム毒素ＨＣＮトランスロケーション促進ドメインを、非クロストリジウムトランスロケーションドメインペプチドと組み合わせてもよい。あるいは、クロストリジウム毒素ＨＣＮ促進ドメインをクロストリジウムトランスロケーションドメインペプチドと組み合わせてもよく、その例は以下：
ボツリヌスＡ型神経毒素−アミノ酸残基（４４９−１１１０）
ボツリヌスＢ型神経毒素−アミノ酸残基（４４２−１０９７）
ボツリヌスＣ型神経毒素−アミノ酸残基（４５０−１１１１）
ボツリヌスＤ型神経毒素−アミノ酸残基（４４６−１０９８）
ボツリヌスＥ型神経毒素−アミノ酸残基（４２３−１０８５）
ボツリヌスＦ型神経毒素−アミノ酸残基（４４０−１１０５）
ボツリヌスＧ型神経毒素−アミノ酸残基（４４７−１１０５）
破傷風型神経毒素−アミノ酸残基（４５８−１１２７）
を含む。
配列相同性：
種々の配列アラインメント方法のいずれかを使用し、同一性率を決定することができる。限定はされないが、包括的方法、局所的方法、及びハイブリッド方法、例えばセグメントアプローチ方法などを含む。同一性率を決定するためのプロトコールは、当業者の範囲内のルーチン手順である。包括的方法では、分子の開始から終末までの配列を整列させ、個々の残基対のスコアを加えることにより、ギャップペナルティを課すことにより最善のアラインメントを決定する。非限定的な方法は、以下を含む：例、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ、例、Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)を参照のこと；及び反復改良、例、Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein.Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996)を参照のこと。局所的方法では、入力配列の全てにより共有される１つ又は複数の保存モチーフを同定することにより配列を整列させる。非限定的な方法は、以下を含む：例、Ｍａｔｃｈ−ｂｏｘ、例、Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501 -509 (1992)を参照のこと；Ｇｉｂｂｓ ｓａｍｐｌｉｎｇ、例、C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214 (1993)を参照のこと；Ａｌｉｇｎ−Ｍ、例、Ivo Van Walle et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics:1428-1435 (2004)を参照のこと。
このように、配列同一性率を、従来の方法により決定する。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986及びHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-19, 1992を参照のこと。簡単には、２つのアミノ酸配列を整列させ、ギャップ開始ペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ１、及びHenikoff and Henikoff (ibid.)の「ｂｌｏｓｕｍ６２」スコアリングマトリクスを使用し、以下に示す通りにアラインメントスコアを最適化する（アミノ酸を標準的な１文字コードにより示す）。
配列同一性を決定するためのアラインメントスコア
Figure 0006362576
同一性率を、次に、以下：
Figure 0006362576
の通りに算出する。
実質的に相同なポリペプチドは、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有するとして特徴付けられる。これらの変化は、好ましくは、小さな性質であり、それは保存的アミノ酸置換（以下を参照のこと）及びポリペプチドの折り畳み又は活性に有意な影響を与えない他の置換である；小さな欠失、典型的には１〜約３０アミノ酸；及び小さなアミノ又はカルボキシ末端伸長、例えばアミノ末端メチオニン残基、小さなリンカーペプチド（約２０〜２５残基まで）、又は親和性タグなどである。
保存的アミノ酸置換
塩基性： アルギニン
リシン
ヒスチジン
酸性： グルタミン酸
アスパラギン酸
極性： グルタミン
アスパラギン
疎水性： ロイシン
イソロイシン
バリン
芳香族： フェニルアラニン
トリプトファン
チロシン
小型： グリシン
アラニン
セリン
スレオニン
メチオニン
２０の標準アミノ酸に加えて、非標準アミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン、６−Ｎ−メチルリシン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン、及びα−メチルセリンなど）を、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基に置換してもよい。限定された数の非保存的アミノ酸、遺伝コードによりコードされないアミノ酸、及び天然ではないアミノ酸を、クロストリジウムのポリペプチドアミノ酸残基に置換してもよい。本発明のポリペプチドは、また、非天然アミノ酸残基を含みうる。
非天然アミノ酸は、限定はされないが、以下：trans−３−メチルプロリン、２，４−メタノ−プロリン、cis−４−ヒドロキシプロリン、trans−４−ヒドロキシ−プロリン、Ｎ−メチルグリシン、アロ−トレオニン、メチル−トレオニン、ヒドロキシ−エチルシステイン、ヒドロキシエチルホモ−システイン、ニトロ−グルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニル−アラニン、４−アザフェニル−アラニン、及び４−フルオロフェニルアラニンを含む。非天然アミノ酸残基をタンパク質中に取り込むためのいくつかの方法が、当技術分野において、公知である。例えば、インビトロのシステムを用いることができ、それにおいてナンセンス突然変異が、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを使用して抑制される。アミノ酸を合成し、ｔＲＮＡをアミノアシル化するための方法が、当技術分野において公知である。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写及び翻訳を、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｓ３０抽出物ならびに市販の酵素及び他の試薬を含む無細胞システムにおいて行う。タンパク質をクロマトグラフィーにより精製する。例えば、Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol. 202: 301, 1991; Chung et al., Science 259: 806-9, 1993；及びChung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145-9, 1993を参照のこと。第２の方法において、翻訳は、ゼノパス卵母細胞において、突然変異ｍＲＮＡ及び化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡのマイクロインジェクションにより行う（Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271: 19991-8, 1996）。第３の方法内で、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞を、置換されるべき天然アミノ酸（例、フェニルアラニン）の非存在において及び所望の非天然アミノ酸（例、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、又は４−フルオロフェニルアラニン）の存在において培養する。非天然アミノ酸が、その天然アミノ酸の代わりにポリペプチド中に組み入れられる。Koide et al., Biochem. 33: 7470-6, 1994を参照のこと。天然アミノ酸残基を、インビトロ化学修飾により、非天然種に変換することができる。化学修飾を部位特異的突然変異誘発と組み合わせ、置換の範囲をさらに拡大することができる（Wynn and Richards, Protein Sci. 2: 395-403, 1993）。
限定された数の非保存的アミノ酸、遺伝コードによりコードされないアミノ酸、非天然アミノ酸、及び天然ではないアミノ酸を、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基について置換してもよい。
本発明のポリペプチド中の必須アミノ酸を、当技術分野において公知の手順、例えば部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発（Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989）などに従って同定することができる。生物学的相互作用の部位は、また、構造の物理的分析により例えば核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光学的親和性標識（推定接触部位アミノ酸の突然変異誘発と併用）などの技術により決定することができる。例えば、de Vos et al., Science 255: 306-12, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992を参照のこと。必須アミノ酸の同一性は、また、本発明のポリペプチドの関連成分（例、トランスロケーション成分又はプロテアーゼ成分）との相同性の分析から推測することができる。
複数のアミノ酸置換を作製し、突然変異誘発及びスクリーニングの公知の方法、例えばReidhaar-Olson and Sauer(Science 241: 53-7, 1988)又はBowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-6, 1989)により開示されるものなどを使用してテストすることができる。簡単には、これらの著者は、ポリペプチド中の２つ又はそれ以上の位置を同時にランダム化し、機能的ポリペプチドについて選択し、次に突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定し、各位置での許容可能な置換のスペクトルを決定するための方法を開示する。使用することができる他の方法は、ファージディスプレイ（例、Lowman et al., Biochem. 30: 10832-7, 1991; Ladner et al.，米国特許第５，２２３，４０９号；Huse, WIPO Publication WO 92/06204）及び領域特異的突然変異誘発（Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988）を含む。
複数のアミノ酸置換を作製し、突然変異誘発及びスクリーニングの公知の方法、例えばReidhaar-Olson and Sauer(Science 241: 53-7, 1988)又はBowie and Sauer(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-6, 1989)により開示されるものなどを使用してテストすることができる。簡単には、これらの著者は、ポリペプチド中の２つ又はそれ以上の位置を同時にランダム化し、機能的ポリペプチドについて選択し、次に突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定し、各位置での許容可能な置換のスペクトルを決定するための方法を開示する。使用することができる他の方法は、ファージディスプレイ（例、Lowman et al., Biochem. 30: 10832-7, 1991; Ladner et al.，米国特許第５，２２３，４０９号；Huse, WIPO Publication WO 92/06204）及び領域特異的突然変異誘発（Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988）を含む。
ここで本発明の局面及び／又は実施態様を例示する図の簡単な説明を以下に示す。
ＬＨＮ／Ｄ−ＣＴ−ＣＳＴ２８融合タンパク質の精製：実施例３に概説する方法を使用し、ＬＨＮ／Ｄ−ＣＴ−ＣＳＴ２８融合タンパク質をＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ＤＥ３）細胞から精製した。簡単には、以下の細胞破壊から得られた可溶生産物を、ニッケル荷電親和性捕捉カラムにアプライした。結合タンパク質を、２００mMイミダゾールを用いて溶出し、エンテロキナーゼを用いて処理し、融合タンパク質を活性化させ、次に第２のニッケル荷電親和性捕捉カラムに再アプライした。精製操作から得られたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。レーン１：第１のニッケルキレートＳｅｐｈａｒｏｓｅカラム溶出物、レーン２：非還元条件下での第２のニッケルキレートＳｅｐｈａｒｏｓｅカラム溶出物、レーン３：還元条件下での第２のニッケルキレートＳｅｐｈａｒｏｓｅカラム溶出物、レーン４：分子量マーカー（kDa）。 ＬＨＮ／Ａ−ＣＴ−ＳＳＴ１４融合タンパク質の精製：実施例３に概説する方法を使用し、ＬＨＮ／Ａ−ＣＴ−ＳＳＴ１４融合タンパク質をＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ＤＥ３）細胞から精製した。簡単には、以下の細胞破壊から得られた可溶生産物を、ニッケル荷電親和性捕捉カラムにアプライした。結合タンパク質を、２００mMイミダゾールを用いて溶出し、第Ｘａ因子を用いて処理し、融合タンパク質を活性化させ、次に第２のニッケル荷電親和性捕捉カラムに再アプライした。精製操作から得られたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。レーン１：第１のニッケルキレートＳｅｐｈａｒｏｓｅカラム溶出物、レーン２：分子量マーカー（kDa）、レーン３−４：非還元条件下での第２のニッケルキレートＳｅｐｈａｒｏｓｅカラム溶出物、レーン５−６：還元条件下での第２のニッケルキレートＳｅｐｈａｒｏｓｅカラム溶出物。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示すボックスプロット：正常組織と原発性癌組織の間でのＳＮＡＲＥ発現における差の統計的分析を、Oncomineアルゴリズム（Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, USA）及び遺伝子マイクロアレイ分析ツールを使用して実施した。ＳＮＡＲＥ ｍＲＮＡ発現を、それぞれの試験における全ての他の遺伝子の発現の中央値と比較し、それについて標準化された発現値を得た。分析結果（Ｐ＜０．０５）が得られた試験だけを例示する。より詳細には、図３−１０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＳＮＡＰ−２５発現プロファイルを例示する。図１１−１６は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−１発現プロファイルを例示する。図１７−２０は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−２発現プロファイルを例示する。図２１−２４は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるシンタキシン−３発現プロファイルを例示する。図２５−３２は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−１発現プロファイルを例示する。図３３−３８は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−２発現プロファイルを例示する。図３９−４５は、異なる癌細胞対非癌細胞におけるＶＡＭＰ−３発現プロファイルを例示する。全ての場合において、データは、癌細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質のアップレギュレーションを例示する。図４６は、診断から５年後での再発性の浸潤性乳管癌を伴う患者と再発のない患者の間でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。図４７は、転移事象が診断から５年後に生じた乳癌患者対転移のない患者でのシンタキシン−１ｍＲＮＡ発現レベルにおける統計的有意差を例示する。データをボックス−プロット形態（説明については図３を参照のこと）で及び／又はヒストグラムとして提示し、そこでは各バーは、各患者組織サンプルにおける標準化された遺伝子発現レベルを表す。 ウエスタンブロット解析による腎細胞癌株における細胞表面受容体及びＳＮＡＲＥタンパク質発現のプロファイリング：インビトロで増殖する８つのヒト腎細胞癌（ＲＣＣ）株からのタンパク質抽出物を、標準的なＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（レーン３−１０）中で調製した。ラット脊髄ニューロン及び後根神経節の一次培養物から調製されたタンパク質抽出物を、コントロールとして含めた。タンパク質を１０%ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、電気泳動的にニトロセルロース膜にトランスファーした。膜のブロッキング後、一次抗血清を使用し、各々の特定タンパク質をプローブした。検出は、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗種ＩｇＧにより可能であった。検出された受容体タンパク質は、ＥｒｂＢ受容体（上皮増殖因子受容体、ＥＧＦ）及び成長ホルモン放出ホルモン受容体（ＧＨＲＨＲ）であった。テストされたＳＮＡＲＥタンパク質は、ＳＮＡＰ−２５、シンタキシン−２、及びシンタキシン−３であった。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をタンパク質添加コントロールとして使用した。 ＥＧＦ−ＬＨＡ融合体を用いた２４時間の処置後でのウエスタンブロット解析による腎細胞癌株におけるＳＮＡＰ−２５タンパク質切断の検出：図４９は、多くのＥＧＦリガンド融合タンパク分子を用いた７８６−０ヒトＲＣＣ細胞の２４時間処置の効果を示す。より詳細には、ＥＧＦ−ＬＨＡ（用量１〜１００nM）が切断ＳＮＡＰ−２５種を生成したのに対し、コントロール分子、特にＥＧＦ−ＬＨＢ（非ＳＮＡＰ−２５標的化）、触媒的に不活性な形態のＥＧＦ−ＬＨＡ、ＥＧＦ−ＬＨ−ＤＥ−Ａ（以下、本明細書で「ＥＧＦ−０」という）及び「遊離」ＥＧＦリガンドは生成しなかった。示した濃度はnMである。 ＥＧＦ−ＬＨＡ融合体による腎細胞癌株のインビトロ増殖の阻害：細胞培養容器中に播種された７８６−０細胞を、２５nMのＥＧＦリガンド融合タンパク質を用いた処理から２４及び４８時間に事前に定められた領域においてカウントした。 ＥＧＦ−ＬＨＡ融合体による腎細胞癌株からのＦＧＦ−２分泌の阻害：ＥＧＦリガンド融合タンパク質を用いて２４時間にわたり処理された７８６−０細胞からの培養培地を、線維芽細胞増殖因子２について標準的な方法により分析した。より詳細には、ＥＧＦ−ＬＨＡ（用量１〜５０nM）が培養培地中に存在するＦＧＦ−２レベルの用量依存的な減少を示したのに対し、コントロール分子、特に触媒的に不活性な形態のＥＧＦ−ＬＨＡ（ＥＧＦ−０）及び「遊離」ＥＧＦリガンドはそのような用量依存的減少は示さなかった。示した濃度はnMである。 ＥＧＦ−ＬＨＡ融合体によるＡ４９８腎細胞癌株のインビトロ増殖の阻害図５２は、４８時間後のＡ４９８細胞株の細胞増殖に対するＥＧＦリガンド融合タンパク質（ＥＧＦｖ３−ＬＨＡ、３００nM）の効果を示す。細胞を、テトラゾリウム塩ＷＳＴを使用し、標準的プロトコールに従って染色した。非リガンド分子ＬＨＡをコントロールとして含んだ。 ＥＧＦ−ＬＨＡ融合体によるＡＣＨＮ腎細胞癌株のインビトロ増殖の阻害図５３は、４８時間後のＡＣＨＮ細胞株の細胞増殖に対するＥＧＦリガンド融合タンパク質（ＥＧＦｖ３−ＬＨＡ、３００nM）の効果を示す。細胞を、テトラゾリウム塩ＷＳＴを使用し、標準的プロトコールに従って染色した。非リガンド分子ＬＨＡをコントロールとして含んだ。 ＥＧＦ−ＬＨＡ融合体による小細胞肺癌細胞株ＤＭＳ−５３からのガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）のインビトロ分泌の阻害：図５４は、２４時間にわたる処理後のＤＭＳ−５３細胞株からのＧＲＰ分泌に対するＥＧＦリガンド融合タンパク質（ＥＧＦｖ３−ＬＨＡ、１５０nM）の効果を示す。細胞から除去された培地を、融合タンパク質の除去から４８時間後に分析した。触媒的に不活性な形態のＥＧＦ−ＬＨＡ（ＥＧＦ−０）をコントロールとして含み、シクロヘキシミドを一般的なタンパク合成阻害剤として含んだ。
命名
ＳＳＴ ソマトスタチン
ＴＧＦ（Ａ） 形質転換増殖因子（アルファ）
ＧＨＲＬ グレリン
ＬＥＰ レプチン
ＥＴ（Ａ） エンドセリン−１
ＦＬＴ 血管内皮増殖因子受容体
ＣＨＲＮ（Ｄ） アセチルコリン受容体（サブユニットデルタ）
ＥＰＨＡ エフリンＡ型受容体
ＥＦＮＡ エフリン−Ａ
ＤＬＫ１ デルタ様タンパク質１
ＪＡＧ ジャギドタンパク質
ＮＲＧ ニューレグリン
Ｇ−ＣＳＦ 顆粒球コロニー刺激因子
ＡＭＦ オートクライン可動性因子
ＮＭＢ ニューロメジン−Ｂ
ＣＣＫ コレシストキニン
ＰＤＧＦ 血小板由来増殖因子
ＡＤＭ アドレノメデュリン
ＧＤＮＦ グリア細胞株由来の神経栄養因子
ＴｒｋＡ 高親和性神経成長因子
ＦＳＨ ろ胞刺激ホルモン
ＣＸＣＲ Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体
ＣＲＬＲ カルシトニン受容体様受容体
ＰＤＦ 前立腺分化因子
ＭＣＰ 単球走化性タンパク質
ＫＧＦ ケラチノサイト増殖因子
ＦＬＫ１ 血管内皮増殖因子受容体２
ＰＤＧＦＲ 血小板由来増殖因子受容体
ＮＯＴＣＨ 神経原性遺伝子座ｎｏｔｃｈホモログタンパク質
ＤＬＬ デルタ様タンパク質
ＧＨＳ 成長ホルモン分泌促進物質
ｃ−ＭＥＴ 肝細胞増殖因子
ｃ−ｋｉｔ マスト／幹細胞増殖因子
ＭＧＳＡ／ＧＲＯ メラノーマ増殖刺激活性／増殖関連遺伝子
ＢＣＧＦ Ｂ細胞増殖因子
ＧｎＲＨ ゴナドトロピン放出ホルモン受容体
Ａｎｇ−２ アンギオポエチン−２
ＦＧＦ 線維芽細胞増殖因子
ＥｒｂＢ 上皮増殖因子受容体ファミリーメンバー
ＶＩＰＲ 血管作用性腸ポリペプチド受容体
ＢＲＳ ボンベシン受容体サブタイプ
ＧＲＰ ガストリン放出ペプチド
ＬＩＦ 白血病阻害因子
ＧＨＲＨ 成長ホルモン放出ホルモン
ＩＧＦ インスリン様増殖因子
ＣＲＨＲ−２ コルチコトロピン放出因子受容体２
ＢＢ ボンベシン
ＧＨ 成長ホルモン
ＩＬ インターロイキン
ＶＥＧＦ 血管内皮増殖因子
ＡＣＨ アセチルコリン
ＣＳＴ コルチスタチン
ＶＰＡＣ 血管作用性腸ペプチド受容体
ＧＲＰＲ ガストリン放出ペプチド受容体
ＣＴＲ カルシトニン結合受容体
ＥＰＯ エリスロポエチン
ＨＢ−ＥＧＦ ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子
ＨＧＦ／ＳＦ 肝細胞増殖因子／分散因子
ＳＤＦ−１ 間質細胞由来因子１
ＣＸＣＬ１２ ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（ＳＤＦ−１）
ＴＮＦ 腫瘍壊死因子
ＰＧＦ 胎盤増殖因子
Ｇｒａｎ４ グラニュリン４
ＴＩＥ２ アンギオポエチン受容体２
ＬＨ 黄体形成ホルモン
ＣＣＬ ＣＣケモカインリガンド
ＮＴ ニューロトロフィン
ＮＴＡＫ ニューレグリン２
ＢＡＦＦ Ｂ細胞活性化因子
ＧＭ−ＣＳＦ 顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子
ＮＧＦ 神経成長因子
ＰＡＣＡＰ 脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド
ＯＢ レプチン
ＮＲＰ ニューロピリン受容体
実施例のまとめ
実施例１ ＬＨＡ骨格コンストラクトの調製
実施例２ ＬＨＤ−ＣＴ−ＣＳＴ２８の構築
実施例３ ＬＨＤ−ＣＴ−ＣＳＴ２８融合タンパク質の発現及び精製
実施例４ ＬＨＡ−ＣＰ−ＥＧＦの構築
実施例５ ＬＨＡ−ＣＰ−ＥＧＦ融合タンパク質の発現及び精製
実施例６ ＧｎＲＨ ＴＭへのＬＨＮ／Ａの化学的コンジュゲーション
実施例７ 結腸直腸癌を処置するための方法
実施例８ 乳癌を処置するための方法
実施例９ 前立腺癌を処置するための方法
実施例１０ 肺カルチノイド腫瘍を処置するための方法
実施例１１ 膀胱癌を処置するための方法
実施例１２ 小細胞肺癌を処置するための方法
実施例１３ 前立腺癌を処置するための方法
実施例１４ 子宮頸癌を処置するための方法
実施例１５ 白血病を処置するための方法
実施例１６ 小細胞肺癌を処置するための方法
実施例１７ 膵臓癌を処置するための方法
実施例１８ 転移性骨癌を処置するための方法
実施例１９ 脳における転移性小細胞肺癌を処置するための方法
実施例２０ 腸癌を処置するための方法
実施例２１ 慢性リンパ性白血病を処置するための方法
実施例２２ 肝臓癌を処置するための方法
実施例２３ ホジキンリンパ腫を処置するための方法
実施例２４ 腎臓癌を処置するための方法
実施例２５ 皮膚癌を処置するための方法
実施例２６ 中咽頭癌を処置するための方法
実施例２７ ミエローマ癌を処置するための方法
実施例２８ 柔組織肉腫癌を処置するための方法
実施例２９ 胃癌を処置するための方法
実施例３０ 睾丸癌を処置するための方法
実施例３１ 子宮癌を処置するための方法
実施例３２ カポジ肉腫を処置するための方法
実施例３３ 原発性脳癌を処置するための方法
実施例３４ 直腸癌を処置するための方法
実施例３５ 本発明のポリペプチドを用いたインビトロで培養された腎臓癌細胞株の処理後での増殖変化、細胞分泌の阻害、同時ＳＮＡＲＥ切断の評価
配列番号のまとめ
最初のＭｅｔアミノ酸残基又は対応する最初のコドンを以下の配列番号のいずれかに示す場合、前記残基／コドンが最適である。
１．ＬＨＮ／ＡのＤＮＡ配列
２．ＬＨＮ／ＢのＤＮＡ配列
３．ＬＨＮ／ＣのＤＮＡ配列
４．ＬＨＮ／ＤのＤＮＡ配列
５．ＣＴ−ＣＳＴ２８リンカーのＤＮＡ配列
６．ＬＨＤ−ＣＴ−ＣＳＴ２８融合体のＤＮＡ配列
７．ＬＨＤ−ＣＴ−ＣＳＴ２８融合体のタンパク質配列
８．ＣＰ−ＥＧＦリンカーのＤＮＡ配列
９．ＬＨＡ−ＣＰ−ＥＧＦ融合体のＤＮＡ配列
１０．ＬＨＡ−ＣＰ−ＥＧＦ融合体のタンパク質配列
１１．ＬＨＮ／Ａのタンパク質配列
１２．ＬＨＮ／Ｂのタンパク質配列
１３．ＬＨＮ／Ｃのタンパク質配列
１４．ＬＨＮ／Ｄのタンパク質配列
１５．合成ＧｎＲＨペプチド
１６．ＬＨＢ−ＣＴ−ＳＳＴ２８融合体のタンパク質配列
１７．ＬＨＡ−ＣＰ−ＳＳＴ２８融合体のタンパク質配列
１８．ＬＨＤ−ＣＴ−ＥＧＦ融合体のタンパク質配列
１９．ＬＨＤ−ＣＴ−ＶＩＰ融合体のタンパク質配列
２０．ＬＨＣ−ＣＴ−ＩＧＦ１融合体のタンパク質配列
２１．ＬＨＤ−ＣＴ−ＩＧＦ１融合体のタンパク質配列
２２．ＬＨＣ−ＣＴ−ＶＩＰ融合体のタンパク質配列
２３．ＬＨＣ−ＣＴ−ＧｎＲＨ融合体のタンパク質配列
２４．ＬＨＤ−ＣＴ−ＧｎＲＨ融合体のタンパク質配列
２５．ＬＨＤ−ＣＴ−ＧＲＰ融合体のタンパク質配列
２６．ＬＨＢ−ＣＴ−ＧＲＰ融合体のタンパク質配列
２７．ＬＨＣ−ＣＴ−ＬＩＦ融合体のタンパク質配列
２８．ＬＨＢ−ＣＰ−ＬＩＦ融合体のタンパク質配列
２９．ＬＨＣ−ＣＴ−ＦＧＦ１融合体のタンパク質配列
３０．ＬＨＡ−ＣＰ−ＦＧＦ１融合体のタンパク質配列
３１．ＬＨＡ−ＣＴ−ＦＧＦ９融合体のタンパク質配列
３２．ＬＨＣ−ＣＰ−ＦＧＦ９融合体のタンパク質配列
３３．ＩｇＡ−ＨＮｔｅｔ−ＣＴ−ＳＳＴ１４融合体のタンパク質配列
３４．ＩｇＡ−ＨＮｔｅｔ−ＣＰ−ＳＳＴ１４融合体のタンパク質配列
３５．ＬＨＡ−ＣＴ−ＳＳＴ１４融合体のタンパク質配列
３６．ＬＨＡ−ＣＴ−ＥＧＦｖ３融合体のタンパク質配列
３７．ＬＨＥ−ＣＴ−ＩＬ６融合体のタンパク質配列
３８．ＬＨＢ−ＣＴ−ＩＬ８融合体のタンパク質配列
３９．ＬＨＦ−ＣＰ−ＧＲＡＮ４融合体のタンパク質配列
４０．ＬＨＤ−ＣＰ−ＴＧＦａ融合体のタンパク質配列
４１．ＬＨＤ−ＣＰ−ＴＧＦｂ融合体のタンパク質配列
４２．ＬＨＢ−ＣＴ−ＴＮＦａ融合体のタンパク質配列
４３．ＬＨＤ−ＣＴ−ＳＤＦ１融合体のタンパク質配列
４４．ＬＨＣ−ＣＴ−ＶＥＧＦ融合体のタンパク質配列
実施例
実施例１．ＬＨＮ／Ａ骨格コンストラクトの調製
以下の手順によって、マルチドメインタンパク質発現のための発現骨格としての使用のためのクローンを作製する。この実施例は血清型Ａベースのクローン（配列番号１）の調製に基づくが、手順及び方法は、全てのＬＨＮ血清型、例えば血清型Ｂ（配列番号２）、血清型Ｃ（配列番号３）、及び血清型Ｄ（配列番号４）ならびに他のプロテアーゼ又はトランスロケーションドメインに、合成のための適切な公開配列を使用することにより等しく適用可能である。
クローニングベクター及び発現ベクターの調製
ｐＣＲ ４（Invitrogen）は、ベクター内での制限配列の欠如及び簡単な構築物確認のための隣接するシークエンシングプライマーサイトに起因して選ばれた、選ばれた標準的なクローニングベクターである。発現ベクターはｐＥＴ（Novagen）発現ベクターに基づき、それは改変され、構築物の挿入のためのマルチクローニングサイトＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ−ＰｓｔＩ−ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩを含み、発現ベクターのフラグメントを除去し、非可動性プラスミドを作製し、種々の異なる融合タグを挿入し、精製の選択肢を増加させ、ベクター骨格中の既存のＸｂａＩ部位を除去し、サブクローニングを単純化する。
ＬＣ／Ａの調製
ＤＮＡ配列を、ＬＣ／Ａアミノ酸配列（無料で利用可能なデータベースソース、例えばＧｅｎＢａｎｋ（受入番号Ｐ１０８４５）などから、種々の逆翻訳ソフトウェアツール（例えば、Backtranslation tool v2.0(Entelechon)）の１つを使用して得られる）の戻し翻訳により設計する。ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ認識配列を配列のそれぞれ５’及び３’末端に組み入れ、正確なリーディングフレームを維持する。ＤＮＡ配列を、戻し翻訳の間に組み入れられた制限酵素切断配列についてスクリーニングする（ソフトウェア、例えばSeqBuilder, DNASTAR Inc.などを使用する）。クローニングシステムにより要求されるものに共通して見出される任意の切断配列を、提案されたコード配列からBacktranslationツールにより除去し、共通のＥ． ｃｏｌｉコドン使用が維持されるようにする。Ｅ． ｃｏｌｉコドン使用を、ソフトウェアプログラム、例えばGraphical Codon Usage Analyser(GeneArt)などの参照により評価し、%ＧＣ含量及びコドン使用率を、公開されたコドン使用表（例えば、GenBank Release 143、２００４年９月１３日）の参照により評価する。ＬＣ／Ａオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むこの最適化されたＤＮＡ配列を、次に、受託合成し（例えば、Entelechon、GeneArt、又はSigma-Genosysにより）、ｐＣＲ ４ベクターに入れて提供する。
ＨＮ／Ａインサートの調製
ＤＮＡ配列を、ＨＮ／Ａアミノ酸配列（無料で利用可能なデータベースソース、例えばＧｅｎＢａｎｋ（受入番号Ｐ１０８４５）などから、種々の逆翻訳ソフトウェアツール（例えば、Back translation tool v2.0(Entelechon)）の１つを使用して得られる）の戻し翻訳により設計する。ＰｓｔＩ制限配列をＮ末端に加え、ＸｂａＩ−終止コドン−ＨｉｎｄＩＩＩをＣ末端に加え、正確なリーディングフレームが維持されるようにする。ＤＮＡ配列を、戻し翻訳の間に組み入れられた制限酵素切断配列についてスクリーニングする（ソフトウェア、例えばSeqBuilder, DNASTAR Inc.などを使用する）。クローニングシステムにより要供されるものに共通して見出される任意の配列を、Backtranslationツールにより、提案されたコード配列から除去し、共通のＥ． ｃｏｌｉコドン使用が維持されるようにする。Ｅ． ｃｏｌｉコドン使用を、ソフトウェアプログラム、例えばGraphical Codon Usage Analyser(GeneArt)などの参照により評価し、%ＧＣ含量及びコドン使用率を、公開されたコドン使用表（例えば、GenBank Release 143、２００４年９月１３日）の参照により評価する。この最適化されたＤＮＡ配列を、次に、受託合成し（例えば、Entelechon、GeneArt、又はSigma-Genosysによる）、ｐＣＲ ４ベクターに入れて提供する。
インタードメイン（ＬＣ−ＨＮリンカー）の調製
ＬＣ−ＨＮリンカーを、最初の原理から、鋳型としてのリンカーについての既存の配列情報を使用して設計することができる。例えば、血清型Ａリンカー（この場合において、ＬＣとＨＮの間のジスルフィド架橋のシステインの間に存在するインタードメインポリペプチド領域として定義される）は、配列ＶＲＧＩＩＰＦＫＴＫＳＬＤＥＧＹＮＫＡＬＮＤＬを有する。この配列情報は、利用可能なデータベースソース、例えばＧｅｎＢａｎｋなど（受入番号Ｐ１０８４５）から無料で利用可能である。特定のプロテアーゼ切断部位の生成のために、第Ｘａ因子についての天然認識配列を、改変配列ＶＤＧＩＩＴＳＫＴＫＳＬＩＥＧＲＮＫＡＬＮＬＱ中で使用することができ、あるいはエンテロキナーゼ認識配列を活性化ループ中に挿入し、配列ＶＤＧＩＩＴＳＫＴＫＳＤＤＤＤＫＮＫＡＬＮＬＱを生成する。種々の逆翻訳ソフトウェアツール（例えばBacktranslation tool v2.0(Entelechon））の１つを使用し、リンカー領域をコードするＤＮＡ配列を決定する。ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ及びＰｓｔＩ／ＸｂａＩ／終止コドン／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素配列を、いずれかの末端に、正確なリーディングフレームで組み入れる。ＤＮＡ配列を、戻し翻訳の間に組み入れられた制限酵素切断配列についてスクリーニングする（ソフトウェア、例えばSeqBuilder, DNASTAR Inc.などを使用する）。クローニングシステムにより要供されるものに共通して見出される任意の配列を、Backtranslationツールにより、提案されたコード配列から除去し、共通のＥ． ｃｏｌｉコドン使用が維持されるようにする。Ｅ． ｃｏｌｉコドン使用を、ソフトウェアプログラム、例えばGraphical Codon Usage Analyser(GeneArt)などの参照により評価し、%ＧＣ含量及びコドン使用率を、公開されたコドン使用表（例えば、GenBank Release 143、２００４年９月１３日）の参照により評価する。この最適化されたＤＮＡ配列を、次に、受託合成し（例えば、Entelechon、GeneArt、又はSigma-Genosysによる）、ｐＣＲ ４ベクターに入れて提供する。
骨格クローンの組み立て及び確認
小さなサイズであるため、活性化リンカーを、２段階プロセスを使用して移さなければならない。ｐＣＲ−４リンカーベクターをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩの組み合わせ制限酵素を用いて切断し、切断されたリンカーベクターは、次に、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ制限酵素切断されたＬＣ ＤＮＡのためのレシピエントとして用いる。一旦、ＬＣをコードするＤＮＡをリンカーＤＮＡの上流に挿入すると、ＬＣリンカーＤＮＡフラグメントの全体を次に単離し、ｐＥＴ発現ベクターＭＣＳに移すことができる。ＬＣリンカーを、ｐＣＲ ４クローニングベクターから、ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ制限酵素消化により切り出す。ｐＥＴ発現ベクターを、同じ酵素を用いて消化するが、しかし、また、再環状化を予防するための追加措置として、南極ホスファターゼを用いて処理する。ＬＣリンカー及びｐＥＴベクター骨格をゲル精製し、精製されたインサート及びベクター骨格を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して一緒にライゲーションする。産物を、ＴＯＰ１０細胞を用いて形質転換し、それを、次に、ＬＣリンカーについて、ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ制限消化によりスクリーニングする。プロセスを、次に、ｐＥＴ−ＬＣリンカー構築物のＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位中へのＨＮ挿入のために繰り返す。
制限酵素を用いたスクリーニングは、最終的な骨格が正確であることを保証するために十分である。なぜなら、全ての成分が、合成の間に既に配列決定され、確認されているからである。しかし、骨格中への一部の成分のサブクローニングの間に（そこでは類似のサイズのフラグメントが除去され、挿入されている）、正確な挿入を確認するための小さな領域の配列決定が要求される。
実施例２．ＬＨＮ／Ｄ−ＣＴ−ＣＳＴ２８の構築
以下の手順によって、マルチドメイン融合体発現のための発現構築物としての使用のためのクローンが作製され、そこでは標的成分（ＴＭ）が、トランスロケーションドメインのＣ末端に提示される。この実施例は、ＬＨＮ／Ｄ−ＣＴ−ＣＳＴ２８融合体（配列番号６）の調製に基づくが、手順及び方法は、他のプロテアーゼ、トランスロケーション及びＴＭ融合体（ここでＴＭはトランスロケーションドメインのＣ末端である）に等しく適用可能である。この実施例において、隣接する１５アミノ酸のグリシン−セリンスペーサーをインタードメイン配列中に操作し、リガンドをその受容体へ接近し易くするが、しかし、他のスペーサーも適用可能である。
スペーサー−ＣＳＴ２８インサートの調製
ＨＮドメインのＣ末端でのＣＳＴ２８配列の提示のために、ＤＮＡ配列を、スペーサー領域及び標的成分（ＴＭ）領域に隣接するように設計し、骨格クローン（配列番号４）中への組み入れを可能にする。ＤＮＡ配列を、ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ−ＰｓｔＩ−ＸｂａＩ−スペーサー−ＣＳＴ２８−終止コドン−ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号５）として配列させることができる。ＤＮＡ配列を、種々の逆翻訳ソフトウェアツール（例えば、EditSeq best E. coli reverse translation(DNASTAR Inc.）、又はBacktranslation tool v2.0(Entelechon)）の１つを使用して設計することができる。一旦、ＴＭ ＤＮＡが設計されると、好ましいスペーサーをコードするために要求される追加のＤＮＡが、インシリコで作製される。正確なリーディングフレームがスペーサー、ＴＭ、及び制限配列について維持されること、塩基ＴＣ（ＤＡＭメチル化をもたらしうる）がＸｂａＩ配列により先行されないようにすることが好ましい。ＤＮＡ配列を、取り込まれた制限配列についてスクリーニングし、任意の追加の配列を手動で残りの配列から除去し、共通のＥ． ｃｏｌｉコドン使用が維持されるようにする。Ｅ． ｃｏｌｉコドン使用を、ソフトウェアプログラム、例えばGraphical Codon Usage Analyser(GeneArt)などの参照により評価し、%ＧＣ含量及びコドン使用率を、公開されたコドン使用表（例えば、GenBank Release 143、２００４年９月１３日）の参照により評価する。この最適化されたＤＮＡ配列を、次に、受託合成し（例えば、Entelechon、GeneArt、又はSigma-Genosysによる）、ｐＣＲ ４ベクターに入れて提供する。
骨格クローンの組み立て及び確認
骨格構築物（配列番号４）及び新たに合成されたＣＳＴ２８ ＴＭ（配列番号５）をコードするｐＣＲ ４−スペーサー−ＴＭベクターを使用してＬＨＮ／Ｄ−ＣＴ−ＣＳＴ２８構築物（配列番号６）を作製するために、１又は２段階方法を使用することができる；典型的には、２段階方法を、ＴＭ ＤＮＡが１００塩基対未満である場合に使用する。１段階方法を使用し、ＴＭを、ｐＣＲ ４−スペーサー−ＴＭベクターを、ＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を用いて切断し、ＤＮＡフラグメントをコードするＴＭを、同様に切断されたｐＥＴ骨格構築物中に挿入することにより、骨格構築物中に直接的に挿入することができる。２段階方法を使用し、ＬＨＮドメインを、骨格クローンから、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩを使用して切除し、同様に消化されたｐＣＲ ４−スペーサー−ＴＭベクター中にライゲーションする。これによってｐＣＲ ４中にＬＨＮ−スペーサー−ＴＭ ＯＲＦが作製され、それは、同様に切断されたｐＥＴ発現構築物中への続くライゲーションのために、ベクターから制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを使用して切除することができる。最終的な構築物は、ＬＣ−リンカー−ＨＮ−スペーサー−ＣＳＴ２８ ＤＮＡ（配列番号６）を含み、それは配列番号７に例示される配列を含む融合タンパク質をもたらす。
実施例３．ＬＨＮ／Ｄ−ＣＴ−ＣＳＴ２８融合タンパク質の発現及び精製
この実施例は、ＨＮドメイン（配列番号７）のカルボキシ末端にＣＳＴ２８ ＴＭポリペプチドを組み入れるＬＨＮ／Ｄタンパク質の調製に基づき、そこでｐＥＴ発現ベクターＯＲＦは、また、ヒスチジン精製タグをコードする。これらの手順及び方法は、配列番号１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２９、３１、３３、３５、３６、３７、３８、４２、４３又は４４に示す融合タンパク質配列に等しく適用可能である。必要に応じて、活性化酵素を、各配列内のプロテアーゼ活性化部位と適合するように選択すべきである。
ＬＨＮ／Ｄ−ＣＴ−ＣＳＴ２８の発現
ＬＨＮ／Ｄ−ＣＴ−ＣＳＴ２８タンパク質の発現を、以下のプロトコールを使用して達成する。２５０mlフラスコ中、０．２%グルコサミン及び３０μg/mlカナマイシンを含む１００mlの改変ＴＢに、ＬＨＮ／Ｄ−ＣＴ−ＣＳＴ２８発現株からの単一コロニーを植菌する。培養物を３７℃、２２５rpmで１６時間にわたり増殖させる。２Ｌフラスコ中、０．２%グルコサミン及び３０μg/mlカナマイシンを含む１Ｌの改変ＴＢに、１０mlの一晩培養物を入れる。培養物を、３７℃で、ＯＤ６００nmが約０．５に達するまで増殖させ、その時点で温度を１６℃まで低下させる。１時間後、培養物を１mM ＩＰＴＧを用いて誘導させ、１６℃でさらに１６時間にわたり増殖させる。
ＬＨＮ／Ｄ−ＣＴ−ＣＳＴ２８タンパク質の精製
３５mlの５０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２００mM ＮａＣｌ、及び約１０gのＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞ペーストを含むファルコンチューブを解凍する。サンプルが冷たいまま細胞ペーストをホモジナイズする（２０psi）。溶解させた細胞を１８，０００rpm、４℃で３０分間にわたりスピンする。上清を、５０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２００mM ＮａＣｌを用いて平衡化された０．１Ｍ ＮｉＳＯ４荷電キレートカラム（２０−３０mlカラムが十分である）上に添加する。１０、４０、及び１００mMイミダゾールの段階勾配を使用し、非特異的な結合タンパク質を洗い流し、融合タンパク質を、２００mMイミダゾールを用いて溶出する。溶出された融合タンパク質を、５Lの５０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２００mM ＮａＣｌに対して４℃で一晩透析し、ＯＤ２８０nmを測定し、タンパク質濃度を確立する。融合タンパク質１ｍｇ当たり３．２μlのエンテロキナーゼ（New England Biolabs）を加え、静置で、一晩２５℃でインキュベートする。５０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２００mM ＮａＣｌを用いて平衡化された０．１M ＮｉＳＯ４荷電キレートカラム（２０−３０mlカラムが十分である）上に添加する。カラムを、ベースラインまで、５０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２００mM ＮａＣｌを用いて洗浄する。１０、４０、及び１００mMイミダゾールの段階勾配を使用し、非特異的な結合タンパク質を洗い流し、融合タンパク質を、２００mMイミダゾールを用いて溶出する。溶出された融合タンパク質を、５Lの５０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１５０mM ＮａＣｌに対して、４℃で一晩透析し、融合体を約２mg/mlの濃度にし、サンプルを分注し、−２０℃で凍結する。精製されたタンパク質を、ＯＤ２８０、ＢＣＡ、及び純度分析を使用してテストする。図１及び２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析されるこの方法に従って融合タンパク質の精製を示す。
実施例４．ＬＨＮ／Ａ−ＣＰ−ＥＧＦの構築
以下の手順によって、マルチドメイン融合体発現のための発現構築物としての使用のためのクローンが作製され、そこでは標的成分（ＴＭ）が、プロテアーゼとトランスロケーションドメインの間で中央に提示される。この実施例は、ＬＨＮ／Ａ−ＣＰ−ＥＧＦ融合体（配列番号９）の調製に基づくが、手順及び方法は、他のプロテアーゼ、トランスロケーション及びＴＭ融合体（ここでＴＭはトランスロケーションドメインのＮ末端である）に等しく適用可能である。この実施例において、隣接するヘリカルスペーサーをインタードメイン配列中に操作し、リガンドがその受容体へ接近し易くするが、しかし、他のスペーサーも適用可能である。
スペーサー−ヒトＥＧＦインサートの調製
ＬＣ−ＨＮインタードメインポリペプチドリンカー領域は、ＬＣとＨＮの間のジスルフィド架橋のシステインの間に存在する。プロテアーゼ切断部位、スペーサー、及び標的成分（ＴＭ）領域の活性化ループ中への挿入のために、種々の逆翻訳ソフトウェアツール（例えばBacktranslation tool v2.0(Entelechon)）の１つを使用し、リンカー領域をコードするＤＮＡ配列を決定する。ＨＮドメインのＮ末端でのＴＭ配列の中央提示のために、ＤＮＡ配列を、スペーサー及び標的成分（ＴＭ）領域のために設計し、骨格クローン（配列番号１）中への組み入れを可能にする。ＤＮＡ配列を、ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ−スペーサー−プロテアーゼ活性化部位−ＥＧＦ−スペーサー−ＰｓｔＩ−ＸｂａＩ−終止コドン−ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号８）として配列させることができる。一旦、ＴＭ ＤＮＡが設計されると、好ましいスペーサーをコードするために要求される追加のＤＮＡが、インシリコで作製される。正確なリーディングフレームがスペーサー、ＴＭ、及び制限配列について維持されること、塩基ＴＣ（ＤＡＭメチル化をもたらしうる）がＸｂａＩ配列より先行されないようにすることが好ましい。ＤＮＡ配列を、取り込まれた制限配列についてスクリーニングし、任意の追加の部位を手動で残りの配列から除去し、共通のＥ． ｃｏｌｉコドン使用が維持されるようにする。Ｅ． ｃｏｌｉコドン使用を、ソフトウェアプログラム、例えばGraphical Codon Usage Analyser(GeneArt)などの参照により評価し、%ＧＣ含量及びコドン使用率を、公開されたコドン使用表（例えば、GenBank Release 143、２００４年９月１３日）の参照により評価する。この最適化されたＤＮＡ配列を、次に、受託合成し（例えば、Entelechon、GeneArt、又はSigma-Genosysによる）、ｐＣＲ ４ベクターに入れて提供する。
骨格クローンの組み立て及び確認
骨格構築物（配列番号１）及び新たに合成されたＥＧＦ ＴＭ（配列番号８）をコードするｐＣＲ ４−スペーサー−活性化部位−ＴＭ−スペーサーベクターを使用してＬＣ−スペーサー−活性化部位−ＥＧＦ−スペーサー−ＨＮ構築物（配列番号９）を作製するために、１又は２段階方法を使用することができる；典型的には、２段階方法を、ＴＭ ＤＮＡが１００塩基対未満である場合に使用する。１段階方法を使用し、ＴＭリンカー領域を、ｐＣＲ ４−スペーサー−活性化部位−ＴＭ−スペーサーベクターを、ＳａｌＩ及びＰｓｔＩ制限酵素を用いて切断し、ＤＮＡフラグメントをコードするＴＭを、同様に切断されたｐＥＴ骨格構築物中に挿入することにより、骨格構築物中に直接的に挿入することができる。２段階方法を使用し、ＬＣドメインを、骨格クローンから、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩを使用して切除し、同様に消化されたｐＣＲ ４−スペーサー−活性化部位−ＴＭ−スペーサーベクター中にライゲーションする。これによってｐＣＲ ４中にＬＣ−スペーサー−活性化部位−ＴＭ−スペーサーＯＲＦが作製され、それは、同様のｐＥＴ発現構築物中への続くライゲーションのために、ベクターから制限酵素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩを使用して切除することができる。最終的な構築物は、ＬＣ−スペーサー−活性化部位−ＥＧＦ−スペーサー−ＨＮ ＤＮＡ（配列番号９）を含み、それは配列番号１０に例示される配列を含む融合タンパク質をもたらす。
実施例５．ＬＨＮ／Ａ−ＣＰ−ＥＧＦ融合タンパク質の発現及び精製
この実施例は、インタードメインリンカー領域（配列番号１０）中にＥＧＦ ＴＭポリペプチドを組み入れるＬＨＮ／Ａタンパク質の調製に基づき、そこでｐＥＴ発現ベクターＯＲＦは、また、ヒスチジン精製タグをコードする。これらの手順及び方法は、配列番号１７、２８、３０、３２、３４、３９、４０、又は４１に示す他の融合タンパク質に等しく適用可能である。必要に応じて、活性化酵素を、各配列内のプロテアーゼ活性化部位と適合するように選択すべきである。
ＬＨＮ／Ａ−ＣＰ−ＥＧＦの発現
ＬＨＮ／Ａ−ＣＰ−ＥＧＦタンパク質の発現を、以下のプロトコールを使用して達成する。２５０mlフラスコ中、０．２%グルコサミン及び３０μg/mlカナマイシンを含む１００mlの改変ＴＢに、ＬＨＡ−ＣＰ−ＥＧＦ発現株からの単一コロニーを植菌する。培養物を３７℃、２２５rpmで１６時間にわたり増殖させる。２Lフラスコ中、０．２%グルコサミン及び３０μg/mlカナマイシンを含む１Lの改変ＴＢに、１０mlの一晩培養物を入れる。培養物を、３７℃で、ＯＤ６００nmが約０．５に達するまで増殖させ、その時点で温度を１６℃まで低下させる。１時間後、培養物を１mM ＩＰＴＧを用いて誘導させ、１６℃でさらに１６時間にわたり増殖させる。
ＬＨＮ／Ａ−ＣＰ−ＥＧＦタンパク質の精製
３５mlの５０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２００mM ＮａＣｌ、及び約１０gのＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞ペーストを含むファルコンチューブを解凍する。サンプルが冷たいまま細胞ペーストをホモジナイズ（２０psi）する。溶解させた細胞を１８，０００rpm、４℃で３０分間にわたりスピンする。上清を、５０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２００mM ＮａＣｌを用いて平衡化された０．１Ｍ ＮｉＳＯ４荷電キレートカラム（２０−３０mlカラムが十分である）上に添加する。１０、４０、及び１００mMイミダゾールの段階勾配を使用し、非特異的な結合タンパク質を洗い流し、融合タンパク質を、２００mMイミダゾールを用いて溶出する。溶出された融合タンパク質を、５Lの５０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２００mM ＮａＣｌに対して４℃で一晩透析し、ＯＤ２８０を測定し、タンパク質濃度を確立する。融合タンパク質１mg当たり３．２μlのエンテロキナーゼ（New England Biolabs）を加え、静置で、一晩２５℃でインキュベートする。５０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２００mM ＮａＣｌを用いて平衡化された０．１M ＮｉＳＯ４荷電キレートカラム（２０−３０mlカラムが十分である）上に添加する。カラムを、ベースラインまで、５０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２００mM ＮａＣｌを用いて洗浄する。１０、４０、及び１００mMイミダゾールの段階勾配を使用し、非特異的な結合タンパク質を洗い流し、融合タンパク質を、２００mMイミダゾールを用いて溶出する。溶出された融合タンパク質を、５Lの５０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）１５０mM ＮａＣｌに対して、４℃で一晩透析し、融合体を約２mg/mlの濃度にし、サンプルを分注し、−２０℃で凍結する。精製されたタンパク質を、ＯＤ２８０、ＢＣＡ、及び純度分析を使用してテストする。
実施例６．ＧｎＲＨ ＴＭへのＬＨＮ／Ａの化学的コンジュゲート
以下の手順によって、ＬＨＮ／Ａアミノ酸配列（配列番号１１）を含む化学的コンジュゲート分子（実施例３に概説される作製方法を使用して配列番号１から調製される）、及び化学的に合成されたＧｎＲＨペプチド（配列番号１５）が作製される。しかし、手順及び方法は、他のプロテアーゼ／トランスロケーションドメインタンパク質（例えばアミノ酸配列、配列番号１２、１３、及び１４を含むものなど）に対する他のペプチドのコンジュゲートのために等しく適用可能である。
ＬＨＮ／Ａタンパク質は、５０mM Ｈｅｐｅｓ １５０mM塩からＰＢＳＥ（１００mM １４．２g ＮＡ２ＨＰＯ４、１００mM ５．８５g ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡＮａ２ １M ＨＣｌでｐＨ７．５）中に、Bio-rad PD10カラムを使用して緩衝液交換した。これは、ＰＤ１０カラムを通じて１カラム容積のＰＢＳＥを洗浄することにより行われ、タンパク質を次に、液滴がＰＤ１０カラムの末端に存在しなくなるまでカラムに加えた。８mlのＰＢＳＥを次に加えた。０．５mlの分画を回収する。回収された分画を、Ａ２８０を読み取り測定し、タンパク質を含む分画をプールする。濃度１．５５mg/mlのＬＨＮ／Ａを緩衝液交換段階から得て、これを使用して、以下の反応を準備した：
Figure 0006362576
サンプルを、室温で、３時間にわたり、別のＰＤ１０カラムをＰＢＳＥへの緩衝液交換に進める前に転倒させて、分画を含むタンパク質をプールする。最終濃度２５mM ＤＴＴを次に加え、タンパク質を誘導体化させ、次にサンプルを室温で１０分間にわたり放置した。Ａ２８０及びＡ３４３を読み取り、ＳＰＤＰ：ＬＨＮ／Ａ相互作用と反応の比率を算出し、それらは誘導体化比率１〜３の間であり、ペプチドコンジュゲーションのために使用された。ＳＰＤＰ試薬は、ＬＨＮ／Ａの一級アミンに、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを介して結合し、生じたスルフヒドリル反応部分が、合成されたペプチド上の遊離システイン上の遊離ＳＨ基とジスルフィド結合を形成する。この場合において、ペプチド配列は、ペプチド内に含まれるシステインを用いて合成されコンジュゲーションを可能にしたＧｎＲＨであり、ＧｎＲＨの残りのＮ末端及びＣ末端は、その受容体（配列番号１５）と相互作用する。ＳＰＤＰ誘導体化ＬＨＮ／Ａを４倍過剰のＧｎＲＨリガンドと混合し、反応を次に室温で９０分間にわたり転倒させながら放置した。過剰のＧｎＲＨを次にどちらかのＰＤ１０カラムを使用して除去し、ＬＨＮ／Ａ−ＧｎＲＨコンジュゲート分子を残す。
実施例７ − 結腸直腸癌を処置するための方法
６２歳の男性が、病期ＩＩ期の結腸直腸癌を呈する。転移を低下及び／又は予防するために、彼は、本発明のポリペプチド（例、ボツリヌスＡ型神経毒素プロテアーゼ及びトランスロケーションドメインならびにＶＩＰペプチド）の直接注射を受ける。４週間以内に、腫瘍の有意な収縮が、他の場所での転移の出現なく観察される。処置は、場合により、化学療法との組み合わせで実施され、２ヶ月後に繰り返され、４週間後に、腫瘍は、通常の検出ツール（結腸内視鏡検査、ＣＴスキャン、ＰＥＴスキャンなど）を用いてもはや観察されず、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のレベルは正常に戻った。
実施例８ − 乳癌を処置するための方法
６１歳の女性が、病期ＩＩ期の乳癌を呈する。転移を処置及び／又は予防するために、彼女は、本発明のポリペプチド（例、ボツリヌスＣ型神経毒素プロテアーゼ、ボツリヌスＣ型神経毒素トランスロケーションドメイン、及びＧｎＲＨペプチド）のＩＶ注射を受け、場合により、化学療法と組み合わせる。４週間以内に、腫瘍の有意な収縮が、他の場所での転移の出現なく観察される。処置を２ヶ月後に繰り返し、６週間後に、腫瘍は、通常の検出ツール（ＭＲＩ、超音波、乳房特異的ポジトロン放出断層撮影、マンモグラフィー、シンチグラフィーなど）を用いてもはや観察されない。
実施例９ − 前立腺癌を処置するための方法
７７歳の男性が、病期ＩＩ期の前立腺癌を呈する。転移を処置及び／又は予防するために、彼は、本発明のポリペプチド（例、ボツリヌスＣ型神経毒素プロテアーゼ、ボツリヌスＣ型神経毒素トランスロケーションドメイン、及びＩＧＦ−１ペプチド）の静脈内注射を受け、場合により、ホルモン治療と組み合わせる。４週間以内に、腫瘍の有意な収縮が、他の場所での転移の出現なく観察される。処置を２ヶ月後に繰り返し、８週間後に、腫瘍は、通常の検出ツール（Ｘ線、ProstaScintスキャン、ＭＲＩ、経直腸的超音波断層法、ＣＴスキャンなど）を用いてもはや観察されず、ＰＳＡのレベルは正常に戻った。
実施例１０ − 肺カルチノイド腫瘍を処置するための方法
６６歳の女性が、肺カルチノイド腫瘍を呈する。転移を処置及び／又は予防するために、彼女は、本発明のポリペプチド（例、ボツリヌスＡ型神経毒素プロテアーゼ、ボツリヌスＡ型神経毒素トランスロケーションドメイン、及びｂＦＧＦ−１ペプチド）のＩＶ注射を受け、場合により、化学療法と組み合わせる。４週間以内に、腫瘍のサイズにおける有意な減少が、他の場所での転移の出現なく観察される。処置を１ヶ月後に繰り返し、４週間後に、腫瘍は、通常の検出ツール（Ｘ線、ＣＴスキャン、気管支鏡検査など）を用いて、又は、この癌について推奨される通常の血液テストを使用してもはや観察されない。
実施例１１ − 膀胱癌を処置するための方法
５６歳の男性が、病期ＩＩ期の膀胱癌を呈する。転移を処置及び／又は予防するために、彼は、本発明のポリペプチドの直接注射を受け（例、ＩｇＡプロテアーゼ、破傷風神経毒素トランスロケーションドメイン、及びＩＧＦ−１ペプチド）、場合により、化学療法と組み合わせる。２週間以内に、腫瘍の有意な収縮が、他の場所での転移の出現なく観察される。処置を２ヶ月後に繰り返し、４週間後に、腫瘍は、通常の検出ツール（結腸内視鏡検査、ＣＴスキャン、ＰＥＴスキャンなど）を用いてもはや観察されない。
実施例１２ − 小細胞肺癌を処置するための方法
７９歳の男性が、病期Ｉ期の小細胞肺癌と診断される。転移を処置及び／又は予防するために、彼は、本発明のポリペプチド（例、ボツリヌスＡ型神経毒素プロテアーゼ、ボツリヌスＡ型神経毒素トランスロケーションドメイン、及びニューレグリンＥＲＢＢ３ペプチド）の注射を受け、場合により、化学療法と組み合わせる。３週間以内に、腫瘍のサイズにおける有意な減少が、他の場所での転移の出現なく観察される。処置を２ヶ月後に繰り返し、５週間後に、腫瘍は、通常の検出ツール（Ｘ線、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、ＰＥＴスキャニング、放射性核種画像、気管支鏡検査など）を用いて、又は、この癌について推奨される通常の血液テストを使用してもはや観察されない。
実施例１３ − 前立腺癌を処置するための方法
７２歳の男性が、病期ＩＩ期の前立腺癌と診断される。転移を処置及び／又は予防するために、彼は、本発明のポリペプチド（例、ボツリヌスＤ型神経毒素プロテアーゼ、ボツリヌスＣ型神経毒素トランスロケーションドメイン、ＧＳ２０リンカー、及びＩＧＦ−１ペプチド）の静脈内注射を受け、場合により、アンドロゲン除去処置と組み合わせる。１０日以内に、腫瘍の有意な収縮が、他の場所での転移の出現なく観察される。処置を２ヶ月後に繰り返し、５週間後に、腫瘍は、通常の検出ツール（Ｘ線、ProstaScintスキャン、ＭＲＩ、経直腸的超音波断層法、ＣＴスキャンなど）を用いてもはや観察されず、ＰＳＡのレベルは正常に戻った。
実施例１４ − 子宮頸癌を処置するための方法
６０歳の女性が、限局期の子宮頸癌と診断され、外科手術で処置される。処置の効果を改善させ、転移を予防するために、彼女は、本発明のポリペプチド（例、ボツリヌスＤ型神経毒素プロテアーゼ、ボツリヌスＤ型神経毒素トランスロケーションドメイン、ＧＳ２０リンカー、及びソマトスタチン１４ペプチド）の静脈内注射を受ける。６週間以内に、腫瘍の再出現は観察されない。処置を３ヶ月後に繰り返し、８週間後に、腫瘍は、通常の検出ツール（Ｘ線、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、ＰＥＴスキャニング、放射性核種画像、気管支鏡検査など）を用いて、又は、この癌について推奨される通常の血液テストを使用してもはや観察されない。
実施例１５ − 白血病を処置するための方法
４２歳の男性が、病期ＩＩ期のヘアリー細胞白血病と診断される。転移を処置及び／又は予防するために、彼は、本発明のポリペプチド（例、ボツリヌスＤ型神経毒素プロテアーゼ、ボツリヌスＤ型神経毒素トランスロケーションドメイン、ＧＳ２０リンカー、及びＦＧＦ−１ペプチド）の静脈内注射を受け、場合により、化学療法と組み合わせる。１０日以内に、腫瘍組織量における有意な低下が、転移の出現なく観察される。処置を１ヶ月後に繰り返し、３週間後に、腫瘍は、通常の検出ツール（ＭＲＩ、全血球数など）を用いてもはや観察されない。
実施例１６ − 小細胞肺癌を処置するための方法
５６歳の男性が、進展期の小細胞肺癌と診断される。他の場所での転移を処置及び／又は予防するために、彼は、本発明のポリペプチド（例、ボツリヌスＤ型神経毒素プロテアーゼ、ボツリヌスＣ型神経毒素トランスロケーションドメイン、及びＥＧＦペプチド）の静脈内注射を受け、場合により、化学療法及び放射線治療と組み合わせる。３週間以内に、腫瘍の有意な収縮及び転移のサイズにおける減少が、他の場所での新たな転移の出現なく観察される。処置を２ヶ月及び５ヶ月後に２回繰り返す。患者は１１ヶ月後に死亡し、この型の処置及びこの病期の疾患での予測よりも６ヶ月遅かった。
実施例１７ − 膵臓癌を処置するための方法
４８歳の女性が、進行期の膵臓癌と診断される。彼女は、本発明のポリペプチド（例、ボツリヌスＤ型神経毒素プロテアーゼ、ボツリヌスＣ型神経毒素トランスロケーションドメイン、及びＥＧＦペプチド）の静脈内注射を受け、場合により、化学療法剤ゲムシタビンと組み合わせる。３週間以内に、原発性腫瘍増殖における有意な低下及び転移のサイズにおける減少が、他の場所での新たな転移の出現なく観察される。処置を２ヶ月及び５ヶ月後に２回繰り返す。患者は１２ヶ月後に死亡し、この型の処置及びこの病期の疾患での予測よりも６ヶ月遅かった。
実施例１８ − 転移性骨癌を処置するための方法
７１歳の男性が、病期ＩＶ期の前立腺癌と診断される。彼の骨における転移性増殖を処置するために、彼は、本発明のポリペプチド（例、ボツリヌスＤ型神経毒素プロテアーゼ、ボツリヌスＤ型神経毒素トランスロケーションドメイン、及びＴＧＦ−ベータペプチド）の静脈内注射を受け、場合により、外部ビーム照射プラスホルモン治療と組み合わせる。４週間以内に、転移部位での腫瘍の有意な収縮が、他の場所での転移の出現なく観察される。処置を２ヶ月及び４ヶ月後に繰り返す。６ヶ月後、腫瘍組織量における検出可能な増加は、通常の検出ツール（Ｘ線、ProstaScintスキャン、ＭＲＩ、ＣＴスキャンなど）を用いてもはや観察されない。
実施例１９ − 脳における転移性小細胞肺癌を処置するための方法
６５歳の男性が、進行期の小細胞肺癌と診断され、複数の脳転移も呈する。処置するために、本発明のポリペプチド（例、ボツリヌスＡ型神経毒素プロテアーゼ、ボツリヌスＡ型神経毒素トランスロケーションドメイン、及びＳＤＦ−１ペプチド）が、彼の脳中に、対流強化輸送により送達され、場合により、化学療法及び全脳照射と組み合わせる。４週間以内に、転移性腫瘍部位の有意な収縮が、他の場所での転移の出現なく観察される。処置を２ヶ月後に繰り返し、８週間後に、転移性腫瘍は、通常の検出ツール（Ｘ線、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、ＰＥＴスキャニング、放射性核種画像など）を用いて、又は、この癌について推奨される通常の血液テストを使用してもはや観察されない。
実施例２０ − 腸癌を処置するための方法
７６歳の男性が、病期ＩＩ期の小腸癌と診断される。転移を処置及び／又は予防するために、彼は、本発明のポリペプチド（例、ボツリヌスＡ型神経毒素プロテアーゼ及びトランスロケーションドメイン、ならびにＥＧＦペプチド）の直接注射を受け、場合により、化学療法と組み合わせる。４週間以内に、腫瘍の有意な収縮が、他の場所での転移の出現なく観察され、その後外科手術が可能となり、腫瘍を除去する。
実施例２１ − 慢性リンパ性白血病を処置するための方法
５４歳の男性が、再発性の慢性リンパ性白血病と診断される。処置するために、彼は、本発明のポリペプチド（例、ボツリヌスＢ型神経毒素プロテアーゼ、ボツリヌスＢ型神経毒素トランスロケーションドメイン、及びＬＩＦ−１ペプチド）の静脈内注射を受け、場合により、化学療法と組み合わせる。２週間以内に、患者の血液中での腫瘍細胞数における有意な低下が観察され、それは、患者の血液の顕微鏡検査及びフローサイトメトリー分析により決定された通り、長期間にわたり安定なままである。
実施例２２ − 肝臓癌を処置するための方法
５５歳の女性が、病期ＩＶ期の肝臓癌と診断される。処置するために、彼女は、本発明のポリペプチド（例、ボツリヌスＤ型神経毒素プロテアーゼ、ボツリヌスＤ型神経毒素トランスロケーションドメイン、及びＴＧＦ−アルファペプチド）の静脈内注射を受け、場合により、化学療法と組み合わせる。２週間以内に、腫瘍の有意な収縮が、ＰＥＴ−ＣＴ画像試験で、血液中のアルファ−フェトプロテインの減少（処置前に上昇していた）と共に観察される。
実施例２３ − ホジキンリンパ腫を処置するための方法
２４歳の男性が、病期ＩＶＡ期のホジキンリンパ腫と診断される。処置するために、彼は、本発明のポリペプチド（例、ボツリヌスＢ型神経毒素プロテアーゼ、ボツリヌスＢ型神経毒素トランスロケーションドメイン、及びＶＥＧＦペプチド）の反復静脈内注射を受け、場合により、化学療法と組み合わせる。２週間以内に、腫瘍容積及び腫瘍血流における有意な低下が、通常の検出ツール（ＭＲＩ、ＣＴスキャン）を使用して観察され、２ヶ月以内に完全寛解に至る。
実施例２４ − 腎臓癌を処置するための方法
５４歳の男性が、進行性の腎細胞癌と診断される。処置するために、彼は、本発明のポリペプチド（例、ボツリヌスＡ型神経毒素プロテアーゼ、ボツリヌスＣ型神経毒素トランスロケーションドメイン、及びＶＥＧＦペプチド）の静脈内投与を受け、場合により、抗血管新生治療薬スニチニブ（小分子チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ））と組み合わせる。１４日以内に、ＴＫＩ単独で予測されるものを超える及び上回る腫瘍の有意な収縮が、通常の検出ツール（ＣＴ、ＭＲＩスキャン、血液テスト）を使用して観察される。
実施例２５ − 皮膚癌を処置するための方法
３１歳の女性が、顔面のメラノーマと診断される。処置するために、彼女は、本発明のポリペプチド（例、ボツリヌスＤ型神経毒素プロテアーゼ、ボツリヌスＣ型神経毒素トランスロケーションドメイン、ＧＳ２０リンカー、及びＶＥＧＦペプチド）の直接注射を受け、場合により、化学療法及び免疫療法と組み合わせる。２１日以内に、化学療法及び免疫療法単独で予測されるものを超える及び上回る腫瘍の有意な収縮が観察され、極めて小規模の腫瘍が残るが外科的切除することができる。
実施例２６ − 中咽頭癌を処置するための方法
６３歳の男性が、病期ＩＩＩ期の頭頸部癌と診断される。処置するために、彼は、本発明のポリペプチド（例、ボツリヌスＤ型神経毒素プロテアーゼ、ボツリヌスＤ型神経毒素トランスロケーションドメイン、及びＴＧＦ−アルファペプチド）の静脈内注射を受け、場合により、放射線療法及び化学療法と組み合わせる。４週間以内に、患者の食物を嚥下する力における有意な改善が明らかであり、それは、組み合わせ治療単独で予測されうるよりも長く維持される。
実施例２７ − ミエローマ癌を処置するための方法
７３歳の女性が、溶骨性骨病変及び高カルシウム血症に関連する多発性ミエローマと診断され、標準的な化学療法を用いて処置される。処置の効果を改善させるために、彼女は、本発明のポリペプチド（例、ボツリヌスＤ型神経毒素プロテアーゼ、ボツリヌスＣ型神経毒素トランスロケーションドメイン、及びＩＬ−６ペプチド）の静脈内注射を受ける。４週間以内に、骨病変のサイズ及び高カルシウム血症の重症度における有意な低下が、他の場所での新たな病変の出現なしに、通常の検出ツール（ＭＲＩ、Ｘ線、血液テスト）を使用して観察される。
実施例２８ − 柔組織肉腫癌を処置するための方法
５１歳の女性が、脚の線維肉腫と診断され、外科的切除前に腫瘍サイズを低下させるため放射線治療を用いて処置される。放射線処置の効果を改善させるために、彼女は、本発明のポリペプチド（例、ボツリヌスＤ型神経毒素プロテアーゼ、ボツリヌスＣ型神経毒素トランスロケーションドメイン、ＧＳ２０リンカー、及びｂＦＧＦペプチド）の静脈内注射を受ける。１４日以内に、放射線治療単独で予測されるものを超える及び上回る腫瘍の有意な収縮が観察され、断端陰性で外科的切除を可能にする。
実施例２９ − 胃癌を処置するための方法
８４歳の男性が、進行性胃癌と診断され、外科的切除を受けることができず、放射線治療を用いて処置され、腫瘍に関連する閉塞を取り除く。処置の効果を改善させるために、彼は、本発明のポリペプチド（例、ボツリヌスＡ型神経毒素プロテアーゼ、ボツリヌスＡ型神経毒素トランスロケーションドメイン、ＧＳ２０リンカー、及びＧＲＰペプチド）の複数回の直接注射を受ける。５日以内に、腫瘍の有意な収縮が、通常の検出ツール（胃カメラ検査及びＣＴスキャン）を用いて観察される。処置を１ヶ月後に繰り返し、４ヶ月後に、腫瘍の閉塞は再発していない。
実施例３０ − 睾丸癌を処置するための方法
３２歳の男性が、病期Ｉ期のセミノーマ癌と診断される。再発を処置及び／又は予防するために、彼は、本発明のポリペプチド（例、ボツリヌスＤ型神経毒素プロテアーゼ、ボツリヌスＣ型神経毒素トランスロケーションドメイン、ＧＳ２０リンカー、及びＶＥＧＦペプチド）の静脈内注射を受け、場合により、化学療法と組み合わせる。１４日以内に、腫瘍の有意な収縮が観察される。処置を１ヶ月後に繰り返し、６週間後に、腫瘍は、通常の検出ツール（血液テスト及びＣＴスキャン）を用いてもはや観察されない。
実施例３１ − 子宮癌を処置するための方法
７６歳の女性が、病期ＩＩＡ期の子宮内膜癌と診断され、通常の化学療法及び放射線療法を用いて処置される。処置の効果を改善させ、転移を予防するために、彼女は、本発明のポリペプチド（例、ボツリヌスＡ型神経毒素プロテアーゼ及びトランスロケーションドメイン、ならびにＥＧＦペプチド）の直接注射を受ける。６週間以内に、腫瘍の有意な収縮が、子宮鏡検査による子宮腔の直接目視で、他の場所での転移の出現なく観察される。
実施例３２ − カポジ肉腫を処置するための方法
４８歳の男性が後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）と診断され、複数のカポジ肉腫病変を呈する。処置するために、彼は、本発明のポリペプチド（例、ボツリヌスＡ型神経毒素プロテアーゼ、ボツリヌスＡ型神経毒素トランスロケーションドメイン、及びＩＬ−６ペプチド）の静脈内注射を受け、場合により、インターフェロンアルファと組み合わせる。３週間以内に、病変サイズにおける有意な低下が、他の場所での新たな病変の出現なく観察される。処置を１ヶ月及び３ヶ月後に２回繰り返し、それらはカポジ肉腫の進行を効果的に止める。
実施例３３ − 原発性脳癌を処置するための方法
４５歳の女性が、神経膠芽腫と診断される。さらなる転移を処置及び／又は予防するために、彼女は、本発明のポリペプチド（例、ボツリヌスＣ型神経毒素プロテアーゼ、ボツリヌスＣ型神経毒素トランスロケーションドメイン、及びＶＥＧＦペプチド）の頭蓋内適用を受け、場合により、化学療法と組み合わせる。４週間以内に、腫瘍のサイズにおける有意な減少が、他の場所での転移の出現なく観察される。処置を１ヶ月後に繰り返し、４週間後に、腫瘍は、通常の検出ツール（Ｘ線、ＣＴスキャンなど）を用いてもはや観察されない。
実施例３４ − 直腸癌を処置するための方法
７７歳の男性が、病期ＩＩ期の直腸癌と診断され、本発明のポリペプチド（例、ボツリヌスＡ型神経毒素プロテアーゼ及び抗ＥＧＦＲ抗体Ｆ（ａｂ）’２フラグメント）を用いて処置され、場合により、放射線療法及び外科手術と組み合わせる。彼はポリペプチドの局所注射を受け（例、分割放射線照射の標準的計画より３日前）、２週間以内に、腫瘍の有意な収縮が観察され、それは完全な外科的切除を可能にする。１２ヶ月後、腫瘍の再発は、通常の検出ツール（結腸内視鏡検査、ＣＴスキャン、ＰＥＴスキャンなど）を用いて観察されず、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のレベルは正常に戻った。
実施例３５ − 本発明のポリペプチドを用いたインビトロで培養された腎臓癌細胞株の処理後の増殖変化、細胞分泌の阻害、同時ＳＮＡＲＥ切断の評価
方法：
増殖分析：
適した腎臓癌細胞株（例えば、Ａ４９８、ＡＣＨＮ、又は７８６−０）の１０００個の細胞を含む適切な容積を、９６ウェル細胞培養プレートのウェル中に、１０%ウシ胎児血清が添加された適した増殖培地中に播種し、３７℃で、加湿雰囲気（５% ＣＯ２）中でインキュベートする。細胞を一晩付着させ、その後、ＥＧＦリガンドＬＨＡ分子（例えばＣ末端提示ＥＧＦリガンドを有するＬＨＡ分子など）を用いた処理を開始する。２４時間後、処理培地を除去し、細胞単層を洗浄し、微量のＬＨＡ−ＥＧＦを除去し、新鮮培地を細胞に添加する。さらに２４時間後、従来の比色増殖アッセイ（細胞酵素によるホルマザンへのテトラゾリウム塩ＷＳＴ-Ｉの切断の決定に基づく）を実施する。具体的には、ＷＳＴ−１を培養培地に加え、その４時間後、４４０nmでの光学密度を各処理について決定する。図５０〜５２は、ＥＧＦ−ＬＨＡ融合体による腎臓細胞癌株からのインビトロ増殖の阻害を示す。
細胞分泌分析：
適した腎臓癌細胞株（例えば、７８６−０、Ａ４９８、又はＡＣＨＮ）の１０，０００個の細胞を、２４ウェルプレートのウェルにおいて１０%ウシ胎児血清を含む適切な培養培地中に播種する。プレートを一晩インキュベーター中で、３７℃で、加湿雰囲気中（５% ＣＯ２）でインキュベートし、細胞を付着させる。細胞培養物を次に本発明の適切なポリペプチドを用いて処理し、それは目的の細胞上の特定の受容体を標的化する（上に詳述される細胞株について、適切な分子はＥＧＦリガンドＬＨＡでありうる。なぜなら、これらの３つの細胞株は全てＥＧＦ受容体を発現するからである。図４８）。２４時間後、処理培地を除去し、細胞単層に新鮮培養培地を再供給し、２４〜４８時間後に、培養培地のサンプルを新しいマイクロチューブに除去し、それを続いて１５００rpmで５分間にわたりスピンし、浮遊細胞を除去する。結果として得られる上清を新しいチューブに除去し、一定分量を次に、酵素結合免疫吸着アッセイ又はＥＬＩＳＡによる特定の分析物（例えば、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ−アルファ）の定量化のために使用する（図５３）。小細胞肺癌細胞株からの分泌（ＧＲＰ）の阻害の分析の例を、図５４に提供する。
本発明のポリペプチドの細胞取り込みに起因するＳＮＡＲＥ切断を検出するためのウエスタンブロット分析：
細胞培養物を、上で詳述する通りに、ポリペプチドを用いて、処理し細胞分泌物を分析する。続くＥＬＩＳＡ分析のための培養培地の除去後、各ウェル中の細胞単層を３回、リン酸緩衝食塩水を用いて洗浄し、タンパク質抽出物を標準的なＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中で細胞溶解することにより調製する。細胞タンパク質を１２% ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、電気泳動的にニトロセルロース膜にトランスファーする。膜のブロッキング後、一次抗血清を使用し、目的のＳＮＡＲＥタンパク質をプローブする。全長及び／又は切断形態の検出は、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗種ＩｇＧにより可能になる。ＬＨＡ−ＥＧＦ分子を用いた腎細胞株７８６−０の処理の場合において、ＳＮＡＲＥ ＳＮＡＰ−２５の切断が観察される（図４９を参照のこと）。
Figure 0006362576
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Claims (10)

  1. 患者における癌細胞からのオートクライン分泌の阻害による癌の抑制又は処置に使用するための、ポリペプチドを含む医薬であって、ここで該ポリペプチドは以下:
    (i)該癌細胞において発現されるSNAREタンパク質を切断することが可能である、非細胞傷害性プロテアーゼ;
    (ii)該癌細胞上の結合部位に結合することが可能である標的成分(TM)(その結合部位がエンドサイトーシスを受けて、該癌細胞内のエンドソーム中に取り込まれることが可能である); 及び
    (iii)エンドソーム内からのプロテアーゼを、エンドソーム膜を通過して、該癌細胞の細胞質中にトランスロケーションさせることが可能であるトランスロケーションドメイン
    を含み;
    ここで、該ポリペプチドが神経筋接合部の神経末端に対してクロストリジウム神経毒素を結合させることができるクロストリジウム神経毒素Hccドメインの天然の結合機能を欠き、
    ただし、該癌細胞が神経内分泌腫瘍細胞ではなく;
    そして該ポリペプチドが天然のクロストリジウム神経毒素分子(ホロ毒素)ではない、医薬。
  2. 該癌細胞のSNAREタンパク質の発現が、非癌状態である同じ細胞型の細胞におけるSNAREタンパク質の発現と比較して、アップレギュレートされている、請求項1記載の医薬。
  3. 該癌が以下: 肺癌、腎臓癌、脳癌、乳癌、膵臓癌、結腸直腸癌、副腎癌、食道癌、リンパ腫、白血病、多発性ミエローマ、急性白血病、膀胱癌、骨癌、腸癌、子宮頸癌、慢性リンパ性白血病、ホジキンリンパ腫、肝臓癌、皮膚癌、中咽頭癌、ミエローマ、前立腺癌、前立腺軟組織肉腫、胃癌、睾丸癌、子宮癌、又はカポジ肉腫からなる群より選択される、請求項1又は2記載の医薬。
  4. 該癌細胞が以下: 肺癌細胞、腎臓癌細胞、脳癌細胞、乳癌細胞、膵臓癌細胞、結腸直腸癌細胞、副腎癌細胞、食道癌細胞、リンパ腫癌細胞、白血病癌細胞、多発性ミエローマ癌細胞、急性白血病癌細胞、膀胱癌細胞、骨癌細胞、腸癌細胞、子宮頸癌細胞、慢性リンパ性白血病細胞、ホジキンリンパ腫細胞、肝臓癌細胞、メラノーマ皮膚癌細胞、中咽頭癌細胞、ミエローマ細胞、前立腺癌細胞、軟組織肉腫細胞、胃癌細胞、睾丸癌細胞、子宮癌細胞、又はカポジ肉腫癌細胞からなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか一項記載の医薬。
  5. 該TMが以下: ErbB受容体; EGF受容体; 成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)受容体; インスリン様増殖因子受容体(IGFR); ガストリン放出ペプチド(GRP)受容体; ボンベシンペプチド(BB)受容体; 成長ホルモン(GH)受容体; 血管内皮増殖因子(VEGF)受容体; アセチルコリン(ACH)受容体; ソマトスタチン(SST)受容体; コルチスタチン(CST)受容体; ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体; CXCR4; ニューロピリン受容体; ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)受容体; VIP-グルカゴン-GRF-セクレチンスーパーファミリー受容体; PAC受容体; VPAC受容体; FLT受容体; CHRN受容体; EPH受容体; EPHA受容体; EFN受容体; DLK1受容体、DLL3受容体、FGF受容体; JAG受容体; LIF受容体; NMB受容体; NOTCH受容体; PDGF受容体; c-kit受容体; TGF受容体; エンドセリン受容体; ケモカイン受容体; 又はアンギオポエチン受容体を含む群より選択される受容体に結合する、請求項1〜4のいずれか一項記載の医薬。
  6. 該TMが以下: ErbBペプチド、EGFペプチド、アドレノメデュリン(ADM)ペプチド、AMペプチド、オートクライン可動性因子(AMF)ペプチド、アンフィレグリンペプチド、APRILペプチド、アルテミンペプチド、ベータセルリンペプチド、ボンベシンペプチド、CTRペプチド、エンドセリンペプチド、エリスロポエチンペプチド、FGFペプチド、FSHペプチド、ガストリンペプチド、ガストリン放出ペプチド(GRP)、GDNFペプチド、グレリンペプチド、GHRHペプチド、G-CSFペプチド、成長ホルモンペプチド、HB-EGFペプチド、肝細胞増殖因子(HGF)ペプチド、ILペプチド、ケラチノサイト増殖因子ペプチド、レプチンペプチド、LIFペプチド、アルファ-メラノトロピンペプチド、MGSA/GROペプチド、NRGペプチド、オキシトシンペプチド、オステオポンチン(OPN)ペプチド、ニューレグリン-1ペプチド、VIP又はPACAPペプチド、PDGFペプチド、プロラクチンペプチド、SCFペプチド、ソマトスタチン(SST)ペプチド、コルチスタチン(CST)ペプチド、TNFペプチド、TGFペプチド、VEGFペプチド、バソプレッシンペプチド、アンギオポエチンペプチド、B-CLLペプチド、BCGF-12KDペプチド、BAFFペプチド、ガラニンペプチド、GDNFペプチド、GnRHペプチド、IGF-IIペプチド、LHペプチド、ニューロトロフィン(NT)ペプチド、サブスタンスPペプチド、TGF-アルファペプチド; IGFペプチド、アンギオポエチンペプチド、CXCペプチド、CCLペプチド、又は請求項5において定義する受容体に結合する抗体もしくは抗体フラグメントを含む群より選択される、請求項1〜5のいずれか一項記載の医薬。
  7. 該非細胞傷害性プロテアーゼがクロストリジウム神経毒素L鎖又はIgAプロテアーゼを含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の医薬。
  8. 該トランスロケーションドメインがクロストリジウム神経毒素トランスロケーションドメインを含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の医薬。
  9. 該SNAREタンパク質が該癌細胞からのオートクライン分泌に関与する、請求項1〜8のいずれか一項記載の医薬。
  10. 該ポリペプチドが、配列番号7、10、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、又は44のいずれか1つと少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の医薬。
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