ES2560853T3 - Anticuerpos monoclonales contra el amiloide beta truncado en N-11, composiciones, métodos y usos - Google Patents

Anticuerpos monoclonales contra el amiloide beta truncado en N-11, composiciones, métodos y usos Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente los péptidos Aß11-x obtenidos tras la escisión de la proteína APP por parte de BACE-1 en Glu11 sin reactividad cruzada para otros fragmentos de APP, en donde el anticuerpo monoclonal reconoce específicamente los primeros 5 a 7 aminoácidos del sitio de escisión de la ß- secretasa_11, es decir, Seq ID Nº:1 y Seq ID Nº:2 o los primeros 5 a 7 aminoácidos de ratón del sitio de escisión de la ß-secretasa_11, es decir, Seq ID Nº:3 y Seq ID Nº:4 como inmunógenos.

Description

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anticuerpo monoclonal JRF/cAβ40/10 o el anticuerpo monoclonal JRF/cAβ42/12 tal como se caracteriza antes en esta memoria.
Los anticuerpos monoclonales de la presente invención también pueden utilizarse en sistemas de ensayo distintos de los métodos sándwich, por ejemplo, métodos competitivos y nefelometría. En los métodos competitivos, antígenos en las disoluciones de ensayo e inmunógenos marcados se hacen reaccionar competitivamente con los anticuerpos, seguido de la separación de los inmunógenos (F) que no han reaccionado marcados de los inmunógenos (B) marcados unidos a los anticuerpos (separación B/F). A continuación, se mide la cantidad marcada de cualquiera de B o F para determinar la cantidad de inmunógeno en la disolución de ensayo. Estos métodos de reacción incluyen métodos en fase líquida, en los que los anticuerpos solubles se utilizan como los anticuerpos y polietilenglicol y los segundos anticuerpos frente a los anticuerpos arriba mencionados se utilizan para la separación B/F, y los métodos de solidificación en los que se utilizan anticuerpos solidificados como los primeros anticuerpos, o anticuerpos solubles se utilizan como los primeros anticuerpos y anticuerpos solidificados se utilizan como los segundos anticuerpos.
En nefelometría, se mide la cantidad de los precipitados insolubles producidos como resultado de la reacción antígeno-anticuerpo en geles o disoluciones. Incluso cuando la cantidad de antígenos es escasa, y los precipitados se obtienen sólo en pequeñas cantidades, se usa adecuadamente nefelometría láser utilizando dispersión de láser.
En un aspecto adicional, la invención está dirigida a un método para tratar y prevenir afecciones caracterizadas por la formación de placas que contienen proteína beta-amiloide en seres humanos, método que comprende administrar, preferiblemente de manera periférica, a un ser humano en necesidad de dicho tratamiento una cantidad terapéutica
o profilácticamente eficaz de un anticuerpo monoclonal humanizado de acuerdo con la invención o un fragmento inmunológicamente reactivo del mismo, anticuerpo que se une específicamente a uno o más epítopos presentes en los primeros 5 a 7 aminoácidos de la sitio de escisión β-secretasa_11 del péptido Aβ humano o de ratón. En otro aspecto, la invención está dirigida a un método para inhibir la formación de placas amiloides y para borrar las placas amiloides en los seres humanos, método que comprende administrar a un sujeto humano en necesidad de esa inhibición una cantidad eficaz de un anticuerpo humanizado que secuestra el péptido Aβ a partir de su forma circulante en la sangre e induce un eflujo del cerebro, así como un aclaramiento de Aβ alterado en el plasma y el cerebro. En aspectos adicionales, la invención se dirige a anticuerpos humanizados de este tipo, incluyendo porciones inmunológicamente eficaces de los mismos, y a métodos para su preparación.
Por "anticuerpo humanizado" se quiere dar a entender un anticuerpo que está compuesto parcial o totalmente de secuencias de aminoácidos derivadas de una línea germinal de un anticuerpo humano alterando la secuencia de un anticuerpo que tiene regiones determinantes de la complementariedad (CDR) no humanas. Las "CDRs" se definen como las secuencias de aminoácidos de la región determinante de complementariedad de un anticuerpo que son las regiones hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina. Véase, p. ej., Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 4ª Ed., Departamento de Salud y Servicios Humanos, Institutos Nacionales de Salud (1987) de Estados Unidos. Existen tres CDRs (o regiones CDR) de cadena pesada y de cadena ligera en la parte variable de una inmunoglobulina. Así, "CDRs", tal como se utilizan en esta memoria, se refieren a las tres CDRs de cadena pesada o a las tres CDRs de cadena ligera (o CDRs tanto de cadena ligera como de cadena pesada, si es apropiado).
La alteración más simple puede consistir simplemente en sustituir la región constante de un anticuerpo humano por la región constante murina, dando así como resultado una quimera humana/murina que puede tener una inmunogenicidad suficientemente baja como para que sea aceptable para uso farmacéutico.
Preferiblemente, sin embargo, la región variable del anticuerpo e incluso la CDR se humaniza también por técnicas que son ahora bien conocidas en la técnica. Las regiones marco de las regiones variables son sustituidas por las regiones marco humanas correspondientes, dejando la CDR no humana sustancialmente intacta, o incluso reemplazando la CDR por secuencias derivadas de un genoma humano. Anticuerpos totalmente humanos se producen en ratones modificados genéticamente, cuyos sistemas inmunes han sido alterados para que correspondan a sistemas inmunes humanos. Como se mencionó anteriormente, es suficiente para uso en los métodos de la invención, emplear un fragmento inmunológicamente específico del anticuerpo, incluyendo los fragmentos que representan formas de cadena sencilla. Un anticuerpo humanizado se refiere nuevamente a un anticuerpo que comprende un marco humano, al menos una CDR de un anticuerpo no humano, y en el que cualquier región constante presente es sustancialmente idéntica a una región constante de inmunoglobulina humana, es decir, al menos aproximadamente 85 90%, preferiblemente al menos 95% idéntica. Por lo tanto, todas las partes de un anticuerpo humanizado, excepto posiblemente las CDRs, son sustancialmente idénticas a partes correspondientes de una o más secuencias de inmunoglobulina humana
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Milstein (8). Los hibridomas se sembraron en placas de 30 x 96 pocillos y se rastrearon después de 10 días en un ELISA directo en cuanto a péptido hAβ_11 de 6 AA acoplado a BSA y se confirmaron en péptido Aβ11-40 no acoplado. Células positivas en Aβ_11-40 libre se subclonaron inmediatamente y clones positivos se congelaron en nitrógeno líquido.
Todos los hibridomas se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con suero de ternera fetal al 10% (Hyclone, Europa), suplemento de hibridoma ESG al 2,5% (Elscolab, Kruibeke, Bélgica), HT al 2% (Sigma, EE.UU.), piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 2 mM y penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (50 mg/ml). Todos los productos estaban comercialmente disponibles y se adquirieron de Life-Technologies (Paisley, Reino Unido). Las células se incubaron en una incubadora de aire humidificado con 8% de CO2.
Selección de anticuerpos mediante ELISA
El rastreo ELISA utilizado para la detección de anticuerpos anti-Aβ_11 era un ELISA directo con 1 µg/ml de Aβ11-40 humano/de ratón libre o péptido Aβ_11 humano/de ratón acoplado a BSA recubierto durante una noche a 4ºC en placas de microtitulación de 96 pocillos de alta unión y de fondo en U NUNC (Life Technologies) en 50 µl/pocillo de tampón de recubrimiento (Tris10 mM, NaCl 10 mM y NaN3 10 mM, pH 8,5). Al día siguiente, las placas se recubrieron con 85 µl/pocillo de caseína al 0,1% en PBS durante 60 min a 37 ºC para reducir la unión no específica. A continuación, se añadieron 50 µl de sobrenadante de hibridoma y se incubaron durante 1 h a 37 ºC. Después del lavado, los anticuerpos monoclonales unidos se detectaron con 50 µl/pocillo de Ig anti-ratón de oveja conjugada con peroxidasa de rábano picante durante 1 h a 37 ºC (Amersham Pharmacia-Biotech). Los dos reactivos se diluyeron en caseína/PBS al 0,1%. Las placas se lavaron y se añadieron como sustrato 50 µl de una disolución de 3,5,3',5'tetrametil-bencidina 0,42 mM, H2O2 al 0,003% (vol./vol.) en ácido cítrico 100 mM e hidrógeno-fosfato disódico 100 mM (pH 4,3). La reacción se dejó que prosiguiera durante un máximo de 15 min en un agitador de placas a temperatura ambiente, después de lo cual el desarrollo de color se detuvo con H2SO4 2 N, 50 µl/pocillo y las placas se leyeron en un lector de placas de microtitulación a 450 nm (Thermomax, Molecular Devices). La reactividad cruzada de los anticuerpos monoclonales seleccionados con péptido Aβ1-40 libre humano de tamaño completo se sometió a ensayo en un ELISA directo, idéntico al ensayo de rastreo, excepto que se utilizó péptido Aβ1-40 libre humano de tamaño completo en lugar de hAβ_11 (6AA) acoplado a BSA. En una segunda confirmación de ELISA, los cultivos positivos seleccionados se volvieron a someter a ensayo en péptido Aβ11-40 libre humano.
ELISA de sándwich para la detección de amiloide β
El ELISA para la medición de diluciones estándares de hAβ(1-40) o hAβ(11-40) (American Peptide Company) se realizó como sigue: En síntesis, anticuerpos monoclonales JRF/AβN/25, J&JPRD/hAβ11/1 y J&JPRD/hAβ11/2 se recubrieron a razón de 5 µg/ml durante una noche a 4 ºC en placas de microtitulación de 96 pocillos de alta unión y de fondo plano NUNC en 100 µl/pocillo de tampón de recubrimiento. Al día siguiente, las placas se recubrieron con 125 µl/pocillo de caseína al 0,1% en PBS durante 30 min a 37 ºC para reducir la unión no específica y se incubaron con 100 µI/pocillo de muestras de dilución de péptido hAβ(1-40) o hAβ(11-40) durante 90 min a 37 ºC. Las placas se lavaron, seguido por una incubación con 100 µl/pocillo de JRF/cAβ40/10-HRPO marcado con HRP. Las placas se lavaron y se añadieron como sustrato 100 µl de una disolución de 3,5,3',5'-tetrametil-bencidina 0,42 mM, H2O2 al 0,003% (vol./vol.) en ácido cítrico 100 mM e hidrógeno-fosfato disódico 100 mM (pH 4,3). La reacción se dejó que prosiguiera durante un máximo de 15 min en un agitador de placas a TA, después de lo cual el desarrollo de color se detuvo con H2SO4 2 N, 50 µl/pocillo y las placas se leyeron en un lector de placas de microtitulación a 450 nm (Thermomax, Molecular Dynamics).
Inmunodetección de APP CTF
Para la inmunodetección de fragmentos CTF (RESTOS), células HEK, transfectadas establemente con APPswe humano y BACE1 humano, fueron cultivadas en matraces de 75 cm2 (Life Technologies, Paisley, Reino Unido) hasta confluencia y las células fueron posteriormente lisadas y se tratadas mediante ultrasonidos en Tris 50 mM: pH = 7,0, NaCl 0,15 M, Triton X-100 al 1% y un cóctel inhibidor de proteasa comercialmente disponible (Roche, Boehringer Mannheim, Alemania). Lisados brutos se centrifugaron a 10.000 g a 4 ºC durante 10 min para separar los núcleos y desechos. Lisados celulares aclarados se normalizaron en cuanto al contenido de proteínas y las muestras se desnaturalizaron a 95 ºC en tampón 2x Tricine Laemmli durante 5 min y se cargaron en geles de gradiente de Tris Tricina SDS al 10-20% precolados (NOVEX, Invitrogen, Groningen, Países Bajos) y se transfirieron semi-secos a membranas de nilón Hybond-ECL de 0,22 µm (APB) durante 45 min a 1,5 mA por cm2. Se utilizó una escalera de proteínas de bajo peso molecular como patrón de peso molecular (patrón MagicMark Western, Invitrogen). Las membranas fueron bloqueadas con leche desnatada en polvo al 10% (p/v) (BioRad) en PBS durante 1 hora. Seguidamente se incubaron con el anticuerpo monoclonal apropiado a razón de 5 µg/ml durante una noche a 4 ºC
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El ELISA para la medición de Aβ1-40/42 y el Aβ11-40 truncado en muestras de CSF se realizó como sigue: En síntesis, anticuerpos monoclonales J&JPRD/hAβ11/1 o los anticuerpos monoclonales Aβx-40 y Aβx-42 específicos (Vandermeeren M., et al. 2001; Pype S., et al. 2003) JRF/cAβ40/10 y J&JPRD/hAβ42/26 se recubrieron a razón de 5 µg/ml durante una noche a 4 ºC en placas de microtitulación de 96 pocillos de alta unión y de fondo plano NUNC en 100 µl/pocillo de tampón de recubrimiento. Al día siguiente, las placas se recubrieron con 150 µl/pocillo de caseína al 0,1% en PBS durante 30 min a 37 ºC para reducir la unión no específica y se incubaron con 100 µI/pocillo de muestras de CSF diluidas en tampón PBS durante 90 min a 37 ºC. Las placas se lavaron, seguido por una incubación con 100 µl/pocillo de JRF/AβN/25-HRPO o JRF/cAβ40/28-HRPO marcado con HRP. Las placas se lavaron y se añadieron como sustrato 100 µl de una disolución de 3,5,3',5'-tetrametil-bencidina 0,42 mM, H2O2 al 0,003% (vol./vol.) en ácido cítrico 100 mM e hidrógeno-fosfato disódico 100 mM (pH 4,3). La reacción se dejó que prosiguiera durante un máximo de 15 min en un agitador de placas a TA, después de lo cual el desarrollo de color se detuvo con H2SO4 2 N, 50 µl/pocillo y las placas se leyeron en un lector de placas de microtitulación a 450 nm (Thermomax, Molecular Dynamics).
Utilizando los anticuerpos monoclonales de acuerdo con la presente invención, la isoforma 11-40 beta-amiloide truncada se pudo detectar cuantitativamente (ng/ml ± ET) en muestras de CSF (n = 6) de controles humanos n-AD, perros Beagle y cobayas.
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Conclusión
De un total de más de 30.000 hibridomas, los autores de la invención seleccionaron dos clones de hibridoma diferentes que reconocen específicamente el extremo N libre del péptido Aβ11-40 humano. Estos anticuerpos monoclonales son negativos en Aβ1-40 humano de tamaño completo. Para evaluar la especificidad de los anticuerpos, éstos se purificaron en cromatografía de afinidad de proteína G y se utilizaron en un ELISA tipo sándwich con los mAbs (anticuerpos monoclonales) cAβ40 y cAβ42 anti-humanos específicos. JRF/AβN/25 se utilizó como un anticuerpo monoclonal específico para Aβ1-40 en combinación con JRF/cAβ40/10-HRPO como anticuerpo de detección. Este último reconoce específicamente la parte C-terminal de Aβ y, por consiguiente, puede ser utilizado como anticuerpo de detección tanto con JRF/AβN/25 como con los anticuerpos J&JPRD/hAβ11/1 y J&JPRD/hAβ11/2 específicos para los péptidos Aβ11-x. La Figura 2A confirma que JRF/AβN/25 reacciona específicamente con Aβ1-40 sin reactividad cruzada con Aβ11-40. A partir de las Figuras 2B y 2C se puede ver que los anticuerpos J&JPRD/hAβ11/1 y J&JPRD/hAβ11/2 reconocen específicamente hAβ11-40 sin reacción cruzada con Aβ1-40 humano.
La capacidad de los anticuerpos de acuerdo con la invención para marcar específicamente a los péptidos Aβ11-x en una muestra biológica se demostró en una transferencia Western en un extracto de membrana de células HEK transfectadas establemente con APP humana y BACE1 humana (Fig. 3) así como en rodajas de cerebro de placas amiloides de pacientes con AD (Tabla 3). Por consiguiente, el uso de estos anticuerpos en combinación con anticuerpos monoclonales cAβ40 anti-humano y cAβ42 anti-humano específicos en ELISAs tipo sándwich proporcionó ensayos sensibles para detectar específicamente péptidos Aβ11-x humanos en diferentes muestras biológicas, incluyendo fluidos biológicos y homogeneizados de cerebro.
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609.
20 Tabla 1
Inmunización/sangrado
Fecha Ratón Inyectado
Cebado
23/01/2002 23/01/2002 23/01/2002 1 2 3 100 µg 100 µg 100 µg
Refuerzo 1
06/02/2002 06/02/2002 06/02/2002 1 2 3 100 µg 100 µg 100 µg
Sangrado 1
20/02/2002 20/02/2002 20/02/2002 1 2 3
Refuerzo 2
27/02/2002 27/02/2002 27/02/2002 1 2 3 100 µg 100 µg 100 µg
Sangrado 2
08/03/2002 08/03/2002 08/03/2002 1 2 3
Refuerzo final
11/03/2002 11/03/2002 1 2 100 µg 100 µg Ratón con ascites 1 Ratón con ascites 1 Sin ascites, sin título 1
Bazo congelado
Ratón FECHA Células de bazo
hAβ_11(6aa)106células
2 14/03/2002 105.106/vial (4 viales)
FUSIÓN
Ratón FECHA Células de bazo
hAβ_11(6aa) 30 pl.
1 15/03/2002 655.106
2 fusiones, cada una con 325*106 células de bazo
15

Claims (1)

  1. imagen1
ES03798156.0T 2002-09-27 2003-09-09 Anticuerpos monoclonales contra el amiloide beta truncado en N-11, composiciones, métodos y usos Expired - Lifetime ES2560853T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
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