JP2017149719A - Ｎ−１１短縮化アミロイド−ベータモノクローナル抗体、組成物、方法および使用 - Google Patents

Abstract

【課題】有力な診断マーカーであるアミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドのＡβ１１−ｘを、再現性があり、又一貫した様式で流体サンプル中の大変低濃度で検出することができて、更に前記Ａβ１１−ｘペプチドとサンプル中に存在し得るβ−アミロイド前駆体タンパク質の他の断片とを識別が可能である検出法。及び、治療用製剤、投与およびデバイスを含む該抗体の作成・使用法の提供。
【解決手段】Ａβ１１−ｘペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体。
【選択図】図３

Description

本発明は、少なくともヒトのアミロイド−ベータ １１Ｎ−末端部位、すなわちＡβ１
１−ｘペプチドに特異的な抗体、その特定部分またはバリアントに関する。さらに治療用
製剤、投与およびデバイスを含む該抗体の作成および使用法を提供する。

本発明の背景
本発明は一般にβ−アミロイド前駆体タンパク質のプロセッシングをモニタリングする
ための方法および組成物に関する。より詳細には本発明はアルツハイマー病および他のベ
ータ−アミロイド関連疾患の診断、予後および治療に対する応答をモニタリングするため
のそのような方法および組成物の使用、ならびにアルツハイマー病およおよび他のベータ
−アミロイド関連疾患の処置法として、受動免疫において開示された抗体の使用に関する
。

アルツハイマー病（ＡＤ）は、次第に深い精神的衰退、そして最終的には死を導く記憶
、認知、推理、判断および感情的安定性の進行的喪失を臨床的な特徴とする変性的脳障害
である。ＡＤは老人の進行的な精神機能不全（痴呆）の大変よくある原因であり、そして
米国では４番目に多い死亡の医学的原因を表すと考えられている。ＡＤは世界中の種およ
び民族群で観察され、そして現在および将来の主たる公衆衛生の問題を提示する。この疾
患には現在、米国だけで約２〜３百万人の個体が罹患していると予想される。ＡＤは現時
点では治癒できない。ＡＤを効果的に防止する、またはその症状および過程を逆転する処
置は現在、知られていない。

ＡＤ個体の脳は、老人性（またはアミロイド）斑、アミロイド血管障害（血管のアミロ
イド沈着）および神経原線維変化（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅ）と
名付けられた特徴的損傷を表す。これら損傷の大多数、特にアミロイド斑および神経原線
維変化は、一般にＡＤ患者の記憶および認知機能に重要なヒトの脳の幾つかの領域で見い
だされる。より限定された解剖学的分布では、より少ない数のこれら損傷が臨床的にはＡ
Ｄではない最高齢のヒトの脳でも見いだされる。アミロイド斑およびアミロイド血管障害
は、２１トリソミー（ダウン症候群）、びまん性レヴィー小体病およびオランダ型のアミ
ロイドーシスがある遺伝性脳出血（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）の個体の能でも特徴的である。

アミロイド斑の主成分は、β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の切断により生
成される種々のアミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドである。過去には斑およびもつれ（
ｔａｎｇｌｅ）が原因であるのか、またはアルツハイマー病の結果であるのかについて重
要な科学的論争があったが、現在の知見はアミロイド斑が原因となる前駆体または因子で
あることを示す。特にＡβペプチドの生成はアミロイド前駆体タンパク質（正常にプロセ
ッシングされた時、Ａβペプチドを生成しないタンパク質）をコードする遺伝子の突然変
異から生じ得ることが見いだされた。家族性、若年性アルツハイマー病を引き起こすアミ
ロイド前駆体タンパク質遺伝子中の突然変異の同定は、アミロイド代謝がこの疾患の基に
ある病理プロセスの中心的出来事である強力な証拠である。現在、ＡＰＰタンパク質の正
常（非病原性）なプロセッシングは、タンパク質内のＡβペプチド領域のアミノ酸１６と
１７との間を切断する「アルファ−セクレターゼ」による切断を介して起こると考えられ
ている。さらに病原性プロセッシングの一部は、前駆体タンパク質内のＡβペプチド領域
のアミノ末端で切断する「ベータ−セクレターゼ」を介しても起こると考えられている。

最近、ＢＡＣＥ−１がＡＰＰの＋１部位での切断に必要な主要なβ−セクレターゼであ
り、そしてＢＡＣＥ−１の過剰発現はＡβの＋１１部位でのさらなる切断をもたらし、よ
り短いＡβ１１−４０およびＡβ１１−４２断片（今後Ａβ１１−ｘペプチドと言う）を
生成することが示された。これらのＡβペプチドはラットの初代ニューロン細胞培養のコ
ンディショニングした培地中およびマウスＮ２ａ細胞で検出され、それらがニューロンで
生成される正常なＡＰＰ切断産物であることを示唆している（非特許文献、１、２、３）
。重要なことは、より短いこれらのＡβ断片が主な種のＡＤ脳および正常な加齢した脳で
も生化学的分析により（非特許文献４）、ならびにＡＤ病のダウン症候群の脳でも免疫組
織化学的実験で（非特許文献５）同定された点である。この出来事はアルツハイマー病の
病因におけるＡβ１１−４０／４２の役割、特にＧｌｕ１１から始まるＡβ種がＡβの１
位で始まるものよりも不溶性であることを示す事実の点から再評価を要する。

ＡＤおよび他のＡβ−関連疾患の基にあるメカニズムを理解するためになされた進歩に
もかかわらず、疾患（１つまたは複数）を診断および処置するための方法および組成物を
開発する必要性が存在する。すなわちアミロイド前駆体タンパク質の細胞性プロセッシン
グをモニタリングする能力は、アルツハイマー病の診断、予後および治療的管理に重要な
価値があるだろう。特に血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）等のような容易に得られる患者のサン
プル中に検出可能な診断マーカーをスクリーニングし、そして評価するための侵襲性が最
も少なく反復可能な手順を同定することが望ましい。非特許文献６に記載されているよう
なポリクローナル抗体は、生物サンプル中の種々のＡβペプチドを検出するために有用で
あるが、各バッチのポリクローナル抗体は異なるという事実を仮定すると、これらの抗体
は容易に得られる患者のサンプル中に、検出可能な診断マーカーをスクリーニングし、そ
して評価するための再現性のある手順を行うための道具を提供しない。さらにポリクロー
ナル抗体を使用した非特異的結合は典型により高く、そしてウエスタンブロッティングに
おける精度は典型的にはより低い。

アルツハイマー病に関して多数の有力な診断マーカーが提案されてきた。中でも本発明
で特に興味深いのは、ＡＰＰタンパク質のベータ−セクレターゼ切断後に得られるＡβ前
駆体タンパク質のより短いカルボキシ末端断片である。これらのマーカーはそれら自体で
、および／または他の診断マーカーおよび手順と組み合わせて有用である。好ましくは診
断マーカーは、ＣＳＦ、血液、血漿、血清、尿のような体液中、組織等で検出できるので
、侵襲性が最少な診断手順を利用することができる。

Ａβ１１−ｘ検出用の特異的アッセイは、再現性があり、しかも一貫した様式で流体サ
ンプル中のＡβ１１−ｘを大変低濃度で検出でき、ならびにＡβ１１−ｘペプチドとサン
プル中に存在し得るＡＰＰの他の断片とを識別できるべきである。

本発明のこれらのおよび他の観点を本明細書により詳細に記載する。
［参考文献］

Ｇｏｕｒａｓ，Ｇ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，７１（１９９８）１９２０−１９２５ Ｗａｎｇ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１（１９９６）３１８９４−３１９０２ Ｖａｎｄｅｒｍｅｅｒｅｍ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．３１５（２００１）１４５−１４８ Ｎａｓｌｕｎｄ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１（１９９４）８３７８−８３８２ Ｉｗａｓｔｕｂｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４９（１９９６）１８２３−１８３０ Ｓａｉｄ Ｔ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２１５（１９９６），１７３−１７６

図１Ａ：β−セクレターゼ １１切断部位の最初の５〜７個のヒトのアミノ酸、すなわちＥＶＨＨＱ−Ｃ（ヒトＡβ １１（５ＡＡ）−配列番号１）およびＥＶＨＨＱＫＩ−Ｃ（ヒトＡβ １１（７ＡＡ）−配列番号２）、またはβ−セクレターゼ １１切断部位の最初の５〜７個のマウスのアミノ酸、すなわちＥＶＲＨＱ−Ｃ（マウスＡβ １１（５ＡＡ）−配列番号３）およびＥＶＲＨＱＫＬ−Ｃ（マウスＡβ １１（７ＡＡ）−配列番号４）を免疫原として注射したマウスの血清力価。使用したコーティング抗原は、２．０μｇ／ｍｌのｈＡβ（１１−４０）（アメリカンペプチドカンパニー）であった。 捕捉抗体として精製したモノクローナル抗体ＪＲＦ／ＡβＮ／２５、Ｊ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／１およびＪ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／２を、そして検出抗体としてＪＲＦ／ｃＡβ４０／１０−ＨＲＰＯを使用したサンドイッチＥＬＩＳＡ。抗体の組み合わせは、ヒトＡβ１−４０およびヒトＡβ１１−４０（アメリカンペプチドカンパニー）との反応性について評価する。Ａ：ＪＲＦ／ＡβＮ／２５とＪＲＦ／ｃＡβ４０／１０−ＨＲＰＯとの組み合わせは、ｈＡβ１１−４０に対する交差反応無しでヒトＡβ１−４０と特異的に反応する（Ａβ１−４０検出に関する陽性対照）。 捕捉抗体として精製したモノクローナル抗体ＪＲＦ／ＡβＮ／２５、Ｊ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／１およびＪ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／２を、そして検出抗体としてＪＲＦ／ｃＡβ４０／１０−ＨＲＰＯを使用したサンドイッチＥＬＩＳＡ。抗体の組み合わせは、ヒトＡβ１−４０およびヒトＡβ１１−４０（アメリカンペプチドカンパニー）との反応性について評価する。Ｂ：Ｊ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／１とＪＲＦ／ｃＡβ４０／１０−ＨＲＰＯとの組み合わせは、ヒトＡβ１−４０に対する交差反応無しでｈＡβ１１−４０と特異的に反応する。 捕捉抗体として精製したモノクローナル抗体ＪＲＦ／ＡβＮ／２５、Ｊ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／１およびＪ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／２を、そして検出抗体としてＪＲＦ／ｃＡβ４０／１０−ＨＲＰＯを使用したサンドイッチＥＬＩＳＡ。抗体の組み合わせは、ヒトＡβ１−４０およびヒトＡβ１１−４０（アメリカンペプチドカンパニー）との反応性について評価する。Ｃ：Ｊ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／２とＪＲＦ／ｃＡβ４０／１０−ＨＲＰＯとの組み合わせは、ヒトＡβ１−４０に対する交差反応無しでｈＡβ１１−４０と特異的に反応する。 Ｊ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／１と、ヒトＡＰＰｓｗｅおよびヒトＢＡＣＥ１で安定にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞の膜抽出物中のＡＰＰのβ１１−切断ＣＴＦ断片との特異的反応を示すウエスタンブロッティング。Ｃ６／６．１はＡＰＰのＣ末端に向けられ、そしてＡＰＰのβ１およびβ１１−切断ＣＴＦ断片の両方と反応する。

発明の要約
本発明は、Ｇｌｕ１１でＢＡＣＥ−１によりＡＰＰタンパク質の切断後に得られる、よ
り短いＡβペプチド、すなわちＡβペプチド断片Ａβ１１−４０およびＡβ１１−４２（
今後Ａβ１１−ｘペプチドとも言う）を特異的に認識するモノクローナル抗体を提供する
。本発明はさらにモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞、ならびに抗体およ
びハイブリドーマ細胞の生産法；および抗体を使用した競合法またはサンドイッチ法によ
るＡβペプチドのイムノアッセイを提供する。

特に本発明は、免疫原としてβ−セクレターゼ １１切断部位の最初の５〜７個のヒト
のアミノ酸、すなわちＥＶＨＨＱ−Ｃ（ヒトＡβ １１（６ＡＡ）−配列番号１）および
ＥＶＨＨＱＫＩ−Ｃ（ヒトＡβ １１（８ＡＡ）−配列番号２）を使用して、あるいはβ
−セクレターゼ １１切断部位の最初の５〜７個のマウスのアミノ酸、すなわちＥＶＲＨ
Ｑ−Ｃ（マウスＡβ １１（６ＡＡ）−配列番号３）およびＥＶＲＨＱＫＩ−Ｃ（マウス
Ａβ １１（８ＡＡ）−配列番号４）を使用して調製されるモノクローナル抗体を提供す
る。該抗体は他のＡＰＰ断片との交差反応性無しに、Ａβ１１−ｘペプチドと特異的に反
応し、したがってアルツハイマー病の病因におけるＡβ１１−ｘの役割を究明するイムノ
アッセイにおいて有用である。

より具体的な態様では、モノクローナル抗体はヒトＡβ １１（６ＡＡ）免疫原に対し
て反応性であり、そして２００２年８月１９日にベルギーの細菌のカルチャーコレクショ
ンに寄託番号ＬＭＢＰ５８９６ＣＢおよびＬＭＢＰ５８９７ＣＢでそれぞれ寄託されたハ
イブリドーマ細胞Ｊ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／１およびＪ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／２に
より発現される。このように本発明のモノクローナル抗体を発現する前記ハイブリドーマ
細胞を提供することは本発明のさらなる態様である。

本発明のさらなる観点では、本発明の抗体は、β−アミロイド関連疾患をモニタリング
するための生物学的サンプルおよびＡＰＰの細胞内プロセッシングをモニタリングするた
めの細胞培養に由来するコンディショニングした培地を含め、存在し得る場合はどこでも
Ａβ１１−ｘペプチドを検出するための通例の免疫学的技術に使用される。適切な免疫学
的技術は当業者には周知であり、そして例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット分析、競
合またはサンドイッチイムノアッセイ等を含み、免疫学的技法はすべて抗原−抗体免疫複
合体の形成に依存することは周知であるので、ここでアッセイの目的に、抗体は例えば放
射性、酵素または蛍光標識で検出可能に標識されることができ、あるいは抗体は不溶性担
体に固定化されることができる。

また本発明はアルツハイマー病、ダウン症候群、ＨＣＨＷＡ−Ｄ、脳のアミロイド血管
障害または他のβ−アミロイド関連疾患を処置、防止または反転させるために；臨床的ま
たは未だ病状が現れていないアルツハイマー病、ダウン症候群、ＨＣＨＷＡ−Ｄまたは脳
のアミロイド血管障害における認知低下を処置、防止または反転させるために；あるいは
ヒトにおけるアミロイド斑の形成または毒性の可溶性Ａβ種の効果を抑制するための薬剤
の製造に本発明のヒト化抗体の使用も含む。

詳細な説明
本発明は、Ｇｌｕ１１でＢＡＣＥ−１によるＡＰＰタンパク質の切断後に得られる、よ
り短いＡβペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体を提供する。本発明の抗体は
、ヒトＡβのβ−セクレターゼ １１切断部位の最初の５〜７個のアミノ酸上、またはマ
ウスＡβのβ−セクレターゼ １１切断部位の最初の５〜７個のアミノ酸上に存在する１
以上のエピトープに対して特異性を有する。

特に本発明は、免疫原としてβ−セクレターゼ １１切断部位の最初の５〜７個のヒト
のアミノ酸、すなわちＥＶＨＨＱ−Ｃ（ヒトＡβ １１（６ＡＡ）−配列番号１）および
ＥＶＨＨＱＫＩ−Ｃ（ヒトＡβ １１（８ＡＡ）−配列番号２）を使用して、あるいはβ
−セクレターゼ １１切断部位の最初の５〜７個のマウスのアミノ酸、すなわちＥＶＲＨ
Ｑ−Ｃ（マウスＡβ １１（６ＡＡ）−配列番号３）およびＥＶＲＨＱＫＩ−Ｃ（マウス
Ａβ １１（８ＡＡ）−配列番号４）からなるペプチドを使用して調製されるモノクロー
ナル抗体を提供する。

前記ペプチドは、アミノ酸が成長している鎖に順次加えられる周知なメリフィールド固
相合成技術（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：
２１４９−２１３６）のような当該技術分野で知られている方法により調製生成すること
ができる。アミノ酸配列は上で説明したＡβ断片の配列に基づくものでよく、または自然
に存在するか、もしくは操作した変異体配列を利用してもよい。免疫原として使用するた
めに、このように得られたペプチドはそれ自体を使用することができ、または適切な免疫
を活性化する天然もしくは合成の担体、例えばウシ、ウサギおよびヒトのような哺乳動物
のマレイミド活性化血清アルブミン、およびウシ、ウサギ、ヒトおよびヤギのような哺乳
動物のチログロブリン、および鍵穴カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、または他の適当な
タンパク質担体、例えばスチレンポリマー、アクリル酸ポリマー、ビニルポリマーおよび
プロピレンポリマーを含む合成ポリマー担体に結合することかできる。免疫感作の詳細な
説明は実施例に見いだすことができる。

いったん十分量の免疫原が得られれば、Ａβ１１−ｘペプチドに特異的なポリクローナ
ル抗体は、インビトロまたはインビボの技術を含む技術を使用した様々な方法で生産する
ことができる。インビトロの技術には、免疫原に対するリンパ球の暴露が関与し、一方、
インビボの技術には免疫原の適当な脊椎動物宿主への注射が必要である。適当な脊椎動物
宿主は非ヒトであり、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ等を含む。免疫原は予め定
めたスケジュールに従い動物に注射され、そして動物は周期的に採血され、向上した力価
および特異性を有する連続的な出血を得る。注射は筋肉内、腹腔内、皮下等に行うことが
でき、そしてフロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバントのような
アジュバントを抗体生産能を高めるために与えてもよい。血清力価レベルをスクリーニン
グする方法には、典型的には標準的なＥＬＩＳＡまたはＲＩＡアッセイを含む。例えばＥ
ＬＩＳＡスクリーニング形式では、Ａβ１１−ｘペプチドもしくは担体（ＢＳＡのような
）にカップリングしたＡβ１１−ｘペプチドのいずれかをコーティングした固相（例えば
マイクロプレートの底）に血清を加え、次いで検出可能な標識、例えば酵素、好ましくは
西洋ワサビペルオキシダーゼもしくは放射性同位体、例えば¹²⁵Ｉに結合した抗−免疫グ
ロブリン抗体（例えば免疫感作がマウスで行われる時、抗−マウス免疫グロブリン抗体、
例えばヒツジ−抗マウス免疫グロブリン（Ｉｇ）を使用する）を加える。

所望により、モノクローナル抗体は当業者により十分理解されている技術を使用して、
ちょうど記載した方法により所望する免疫原で超免疫化したマウスのような脊椎動物宿主
から調製することができる。都合よく高力価抗体を示す脊椎動物宿主を、所望の免疫原で
免疫感作した動物から選択する。典型的には最終免疫感作から２〜５日、好ましくは４日
後に、脾臓またはリンパ節をそれらから集め、そして中に含まれる抗体生産細胞を不死化
する。不死化の様式は重要ではない。現在、最も多い技術はミエローマ細胞融合パートナ
ーとの融合である。融合手順は当該技術分野で既知の方法、例えばＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ
Ｍｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））に従
い行うことができる。他の技術にはＥＢＶ形質転換、裸のＤＮＡ、例えば癌遺伝子、レト
ロウイルス等を用いた形質転換、または細胞株の安定な維持およびモノクローナル抗体の
生産を提供する任意の他の方法を含む。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびセンダ
イウイルスを含む融合促進物質も使用することができる。特にＰＥＧが好ましく使用され
る。ミエローマ細胞の例には、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０およびＡＰ−１を含み、
ＳＰ２／０細胞が好ましく使用される。

ヒトＡβのβ−セクレターゼ １１切断部位の最初の５〜７個のアミノ酸上、またはマ
ウスＡβのβ−セクレターゼ １１切断部位の最初の５〜７個のアミノ酸上に見いだされ
るエピトープに対して特異的なモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、最初に
例えばＢａｌｂ／ｃマウスのようなハイブリドーマを生産できる動物を、フロイントアジ
ュバント中の所望する免疫原の初回腹腔内注射により免疫感作し、続いて２週間毎に追加
免疫注射することにより最も効果的に生産される。引き続き単離した脾臓の融合は、当業
者により一般的に知られている技術、好ましくはＳＰ２／０細胞を使用して、Ｋｏｈｌｅ
ｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎの改良手順（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，２９２
−２９５（１９７６））により行うことができる。どれがＡβ１１−ｘペプチドに特異的
な抗体を生産しているかを決定するためのハイブリドーマのスクリーニングは、標準的な
ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡアッセイのいずれかで今までに記載したように行うことができる
。所望のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマの選択および育種は通常、１０〜
２０％のウシ胎児血清および例えばＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミ
ジン）、またはＥＳＧハイブリドーマサプリメントのような他の成分を補充した動物に関
する培地（例えばダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはイーグルの最少必須
培地（ＭＥＭ））中で行う。したがって本発明の１つの態様は、２００２年８月１９日に
ベルギーの細菌のカルチャーコレクションに寄託番号ＬＭＢＰ５８９６ＣＢおよびＬＭＢ
Ｐ５８９７ＣＢでそれぞれ寄託されたハイブリドーマ細胞Ｊ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／１
およびＪ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／２を提供する。

抗−Ａβ１１−ｘモノクローナル抗体の選択および精製は、塩沈殿、アルコール沈殿、
等電点沈殿、電気泳動、イオン交換物質（例えばＤＥＡＥ）での吸着および脱着、超遠心
、ゲル濾過、および抗原結合固相およびプロテインＡもしくはプロテインＧアフィニティ
クロマトグラフィーを含む特異的なイムノアフィニティ分離技術のようなポリクローナル
抗体の通常の分離および精製に順じて行う。適当なタンパク質精製技術は、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８２，Ｄｅｕｔｃｈｅｒ，ｅｄ．，アカデ
ミック出版社、サンディエゴ，１９９０に記載され、この開示は引用により本明細書に編
入する。

このように本発明の目的は前記ハイブリドーマ細胞により発現される単離されたモノク
ローナル抗体を提供することであり、該抗体はＡβ１１−ｘペプチドを特異的に認識する
ことができる。好ましくはこれらの単離されたモノクローナル抗体は、２００２年８月１
９日にベルギーの細菌のカルチャーコレクションに寄託番号ＬＭＢＰ５８９６ＣＢおよび
ＬＭＢＰ５８９７ＣＢでそれぞれ寄託されたハイブリドーマ細胞Ｊ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１
１／１およびＪ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／２により発現される。

本発明の抗体は、β−アミロイド関連疾患をモニタリングするための生物学的サンプル
、およびＡＰＰの細胞内プロセッシングをモニタリングするための細胞培養から得たコン
ディショニングした培地を含め、存在する場合はどこでもＡβ１１−ｘペプチドを検出す
るために通例の免疫学的技術で使用される。適当な免疫学的技術は当業者には周知であり
、そして例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット分析、競合もしくはサンドイッチイムノ
アッセイ等を含み、免疫学的技術はすべて抗原−抗体免疫複合体の形成に依存することは
周知であるので、ここでアッセイの目的に、抗体は例えば放射性、酵素、発光または蛍光
標識で検出可能に標識されることができ、あるいは抗体は不溶性担体に固定化されること
ができる。このように本発明の目的はサンプル中のＡβ１１−ｘペプチドの測定または検
出のためのイムノアッセイを提供することであり、この方法はサンプルをＡβ１１−ｘペ
プチドに対する抗体と本発明に従い接触させ、そして抗体とＡβ１１−ｘペプチドとの間
に免疫複合体が形成されるかどうかを決定することを含んでなる。これらの方法は組織サ
ンプルまたは体液サンプルのいずれかで行うことができ、そして一般に個体の身体に由来
するサンプルを得；該サンプルを造影に有効量の検出可能に標識された抗体と本発明に従
い接触させ；そして標識を検出してサンプル中のＡβ１１−ｘペプチドの存在を確立する
ことを含んでなる。

本発明の抗体を使用した測定法は、特に限定されない。抗原の量、特に測定される溶液
中のＡβ１１−ｘペプチドの量に対応する抗体、抗原または抗原−抗体複合体の量が化学
的または物理的手段により検出され、そして既知の量の抗原を含有する標準溶液の使用に
より調製された標準曲線から算出される限り任意の測定法を使用することができる。例え
ば比濁法、競合法、免疫測定法およびサンドイッチ法が適当に使用される。感度および特
異性に関して、以下に記載するサンドイッチ法を使用することが特に好ましい。

標識物質を使用する測定法では、放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質等が標識剤
として使用される。放射性同位体の例には、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³Ｈおよび¹⁴Ｃを含む。酵素
は通常、次いで検出可能な反応を触媒する適切な基質との結合により検出可能とされる。
それらの例には例えばベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、アルカリホ
スファターゼ、ペルオキシダーゼおよびマレイン酸デヒドロゲナーゼ、好ましくは西洋ワ
サビペルオキシダーゼを含む。発光物質には例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ル
シフェリン、エクオリルおよびルシフェラーゼを含む。さらにアビジン−ビオチン系も、
本発明の抗体および免疫原を標識するために使用することができる。

免疫原または抗体が不溶性である時、通常、タンパク質または酵素の不溶化または固定
化に使用する物理的吸着または化学的結合のいずれかを使用することができる。担体の例
にはアガロース、デキストランおよびセルロースのような不溶性多糖、ポリスチレン、ポ
リアクリルアミドおよびシリコンポリマーのような合成樹脂、およびガラスを含む。

サンドイッチ法では、試験溶液を不溶化した抗−Ａβ１１−ｘペプチド抗体（第１反応
）と反応させ、さらに標識した抗−Ａβ１１−ｘペプチド抗体と反応させ（第２反応）、
そして次に不溶化担体中の標識剤の活性をアッセイし、これにより試験溶液中のＡβ１１
−ｘペプチドの量を決定することができる。第１反応および第２反応は、同時または順次
に行うことができる。

β−アミロイド関連疾患を診断するためのさらなる態様では、組織、体液、例えばＣＳ
Ｆ、血液、血漿、血清、尿等を含む生物学的サンプルが含まれ、そして適当量の第１抗体
と接触させて免疫複合体を形成する。接触には典型的にはサンプルを、第１抗体でコーテ
ィングした固体マトリックスに加えることを含む。サンプルと第１抗体との接触から生成
した複合体は、溶出によりサンプルから分離する。しかし他の回収法を使用することもで
きる。回収した複合体は、抗原上の抗原決定基に向けられ、そして複合体中の抗原に結合
することができる少なくとも１つの第２抗体と接触させる。第２抗体が向けられる抗原決
定基は、抗原実体のマルチエピトープ性により第１抗体が向けられる抗原決定基と同じで
あることができる。第１または第２抗体のいずれかを、上記の任意の標識を使用して検出
可能にすることができる。好適な態様では、第２抗体を検出可能とする。第１および第２
抗体に結合した抗原からなる複合体に結合した検出可能な抗体の存在は、技術的に知られ
ている技法を使用して容易に検出することができる。生物学的サンプルで得られた結果を
、対照サンプルで得られた結果と比較することにより、変化したＡβ１１−ｘペプチドレ
ベルの存在が測定される。

したがって本発明の目的は、固体マトリックスにコーティングされた第１抗体（今後コ
ーティング抗体と言う）が、Ａβ１１−ｘペプチドおよび完全長のＡβ４０またはＡβ４
２を認識する抗体からなり、そして第２抗体（これは検出可能にされている）が、Ａβ１
１−ｘペプチドを特異的に認識するサンドイッチアッセイを提供することである。好まし
くはコーティング抗体はヒトのＡβ１１−ｘペプチドおよび完全長のヒトＡβ４０または
Ａβ４２を認識し、より好ましい態様では、コーティング抗体はＡβ１１−４０および完
全長のＡβ４０を特異的に認識するモノクローナル抗体ＪＲＦ／ｃＡβ４０／１０からな
り、該モノクローナル抗体は配列番号５のアミノ酸配列を有する少なくとも１つの重鎖可
変領域、および／または配列番号６のアミノ酸配列を有する少なくとも１つの軽鎖可変領
域を含んでなることを特徴とし（今後モノクローナル抗体ＪＲＦ／ｃＡβ４０／１０と言
う）、あるいはコーティング抗体はＡβ１１−４２および完全長のＡβ４２を特異的に認
識するモノクローナル抗体ＪＲＦ／ｃＡβ４２／１２からなり、該モノクローナル抗体は
配列番号７のアミノ酸配列を有する少なくとも１つの重鎖可変領域、および／または配列
番号８のアミノ酸配列を有する少なくとも１つの軽鎖可変領域を含んでなることを特徴と
する（今後モノクローナル抗体ＪＲＦ／ｃＡβ４２／１２と言う）。したがって好適な態
様では、第２抗体は２００２年８月１９日にベルギーの細菌のカルチャーコレクションに
寄託番号ＬＭＢＰ５８９６ＣＢおよびＬＭＢＰ５８９７ＣＢでそれぞれ寄託されたハイブ
リドーマ細胞Ｊ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／１またはＪ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／２により
発現されるモノクローナル抗体の１つである。また本発明の目的は、完全長Ａβ４０また
はＡβ４２に対するＡβ１１−ｘペプチドの比率を決定するためのサンドイッチアッセイ
を提供することである。この態様では、完全長Ａβ４０およびＡβ４２の両方を認識する
が、Ａβ１１−ｘペプチドとは交差反応を示さないさらなる第２抗体も使用する。好まし
くはこのさらなる第２抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を有する少なくとも１つの重鎖
可変領域、および／または配列番号１０のアミノ酸配列を有する少なくとも１つの軽鎖可
変領域を含んでなることを特徴とするＪＲＦ／ＡβＮ２５からなる。したがって本発明の
１つの目的は、コーティング抗体が例えば２００２年８月１９日にベルギーの細菌のカル
チャーコレクションに寄託番号ＬＭＢＰ５８９６ＣＢおよびＬＭＢＰ５８９７ＣＢでそれ
ぞれ寄託されたハイブリドーマ細胞Ｊ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／１またはＪ＆ＪＰＲＤ／
ｈＡβ１１／２により発現されるモノクローナル抗体のような、Ａβ１１−ｘペプチドを
特異的に認識するが、完全長Ａβ４０またはＡβ４２ペプチドに交差反応性を示さない抗
体を、例えばこれまでに特性付けたようなＪＲＦ／ｃＡβ４２／１２またはＪＲＦ／ｃＡ
β４０／１０のようなＡβ１１−４０またはＡβ１１−４２を特異的に認識する第２抗体
と組み合わせてなる、サンドイッチアッセイを提供することである。具体的な態様では、
コーティング抗体はＪ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／１からなり、そして第２抗体はＡβ１１
−４２および完全長Ａβ４２を特異的に認識するＪＲＦ／ｃＡβ４２／２６からなり、該
モノクローナル抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を有する少なくとも１つの重鎖可変
領域、および／または配列番号１２のアミノ酸配列を有する少なくとも１つの軽鎖可変領
域を含んでなることを特徴とする（今後モノクローナル抗体ＪＲＦ／ｃＡβ４２／２６と
言う）。

完全長Ａβ４０またはＡβ４２に対するＡβ１１−ｘペプチドの比率を測定するための
別のサンドイッチアッセイでは、コーティング抗体はＡβ１１−ｘペプチド、好ましくは
ヒトのＡβ１１−ｘペプチドを特異的に認識する抗体、およびペプチドＡβ１１−４０ま
たはＡβ１１−４２、好ましくはヒトのＡβ１１−４０またはヒトのＡβ１１−４２を特
異的に認識する、検出可能にされた第２抗体からなる。この別のサンドイッチアッセイで
は、コーティング抗体は２００２年８月１９日にベルギーの細菌のカルチャーコレクショ
ンに寄託番号ＬＭＢＰ５８９６ＣＢおよびＬＭＢＰ５８９７ＣＢでそれぞれ寄託されたハ
イブリドーマ細胞Ｊ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／１またはＪ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／２に
より発現されるモノクローナル抗体の１つからなり、そして第２の検出可能に標識された
抗体は、これまでに特性付けたモノクローナル抗体ＪＲＦ／ｃＡβ４０／１０またはモノ
クローナル抗体ＪＲＦ／ｃＡβ４２／１２のいずれかからなる。

本発明のモノクローナル抗体は、サンドイッチ法以外のアッセイ系、例えば競合法およ
び比濁法にも使用することができる。競合法では、試験溶液中の抗原および標識免疫原を
抗体と競合的に反応させ、続いて未反応の標識免疫原（Ｆ）を抗体に結合した標識免疫原
（Ｂ）から分離する（Ｂ／Ｆ分離）。次いでＢまたはＦの標識量を測定して、試験溶液中
の免疫原の量を決定する。これらの反応法には液相法（これは抗体として可溶性抗体が使
用され、そしてポリエチレングリコールおよび上に挙げた抗体に対する第２抗体がＢ／Ｆ
分離に使用される）、および固体化法（これは第１抗体として固体化された抗体を使用す
るか、または第１抗体として可溶性抗体を使用し、そして第２抗体として固体化された抗
体を使用する）を含む。

比濁法には抗体−抗原反応の結果としてゲルまたは溶液中に生成される不溶性沈殿物の
量を測定する。たとえ抗原の量がわずかであり、そして得られた沈殿物が少量のみであっ
ても、レーザー散乱を使用したレーザー比濁計が適切に使用される。

さらなる観点では、本発明はヒトにおけるベータ−アミロイドタンパク質を含有する斑
の形成を特徴とする状態を処置し、そして防止するための方法を対象とし、この方法はそ
のような処置が必要なヒトに治療に、または予防に有効量の本発明のヒト化モノクローナ
ル抗体またはその免疫学的に反応性の断片を投与、好ましくは末梢的に投与することを含
んでなり、この抗体はヒトまたはマウスＡβペプチドのβセクレターゼ １１切断部位の
最初の５〜７個のアミノ酸上に存在する１以上のエピトープに特異的に結合する。別の観
点では、本発明はアミロイド斑の形成を阻害し、そしてヒトのアミロイド斑を取り除く（
ｃｌｅａｒ）方法を対象とし、この方法はそのような阻害が必要なヒト個体に、Ａβペプ
チドがその循環から血中に形成されることを封鎖し、そして脳から流出ならびに血漿およ
び脳における改変Ａβの排出を誘導する有効量のヒト化抗体を投与することを含んでなる
。さらなる観点では、本発明はその免疫学的に効果的な部分を含むそのようなヒト化抗体
、およびそれらの調製法を対象とする。

「ヒト化抗体」とは、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗体の配列を改変する
ことによるヒト抗体生殖細胞系に由来するアミノ酸配列の一部または全部からなる抗体を
意味する。"ＣＤＲ"は免疫グロブリン重および軽鎖の超可変性領域である抗体の相補性決
定領域のアミノ酸配列と定める。例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、免疫学的に興味深
いタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第４版、米国保健福祉省、国立衛生研究所（１
９８７）を参照にされたい。免疫グロブリンの可変部分には３つの重鎖および３つの軽鎖
ＣＤＲ（またはＣＤＲ領域）がある。すなわち本明細書で使用する"ＣＤＲ"は、３つすべ
ての重鎖ＣＤＲまたは３つすべての軽鎖ＣＤＲ（または適当ならば軽および重鎖ＣＤＲの
両方）を指す。

最も単純なそのような改変は、マウス定常領域に代えて単にヒト抗体の定常領域を使用
することであり、これにより製薬学的使用に許容され得る十分に低い免疫原性を有するこ
とができるヒト／マウスキメラを生じる。

しかし好ましくは、抗体の可変領域およびさらにＣＤＲも、今では当該技術分野で周知
である技術によりヒト化される。可変領域の骨格領域は、対応するヒトの骨格領域により
置換され非ヒトＣＤＲを実質的に完全なままとするか、またはさらにＣＤＲをもヒトゲノ
ムに由来する配列に置き換える。完全なヒト抗体は、免疫系が対応するヒト免疫系に改変
された遺伝的に修飾されたマウスで生産される。上に述べたように本発明の方法での使用
については、単鎖形を表す断片を含め、抗体の免疫学的に特異的な断片を使用することで
十分である。

ヒト化抗体は、再度、ヒト骨格、非ヒト抗体に由来する少なくとも１つのＣＤＲを含ん
でなる抗体を称し、そしてここで存在する任意の定常領域はヒト免疫グロブリンの定常領
域と実質的に同一であり、すなわち少なくとも約８５、９０％、好ましくは少なくとも９
５％同一である。したがってヒト化抗体のすべての部分（恐らくＣＤＲを除く）は、１以
上の天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分に実質的に同一である。例えばヒト化
免疫グロブリンは、典型的にはキメラマウス可変領域／ヒト定常領域抗体を包含しない。

ヒト化抗体は、ヒトの治療に使用するために非ヒトおよびキメラ抗体よりも少なくとも
３つの潜在的な利点を有する：
１）エフェクター部分がヒトであるので、ヒト免疫系の他の部分ともより良く相互反応す
ることができる（例えば、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞傷害（Ａ
ＤＣＣ）により、標的細胞をより効率的に破壊する）。
２）ヒトの免疫系はヒト化抗体の骨格またはＣ領域を外来とは認識しないはずなので、そ
のような注射された抗体に対する抗体応答は、全部が外来の非ヒト抗体または部分的に外
来のキメラ抗体に対するよりも低いはずである。
３）注射された非ヒト抗体は、ヒトの循環においてヒト抗体の半減期よりもはるかに短い
半減期を有すると報告されてきた。注射されたヒト化抗体は自然に存在するヒト抗体と本
質的に同一の半減期を有し、与える用量をより少なく、そして頻度を低くできる。

ベータ−アミロイドタンパク質を含む斑の形成を特徴とする状態を処置または防止する
ための方法で抗体（免疫学的に反応性の断片を含む）は、臨床的もしくは症状発現前のア
ルツハイマー病、ダウン症候群、または臨床的もしくは症状発現前のアミロイド血管症の
ようなＡβ−関連症状または病状の危険性があるか、それらを現す個体に標準的な投与技
術を使用して、好ましくは末梢に（すなわち中枢神経系による投与によるものではない）
、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻内、頬内、舌下または座薬投与により投
与される。抗体は脳室系、脊髄液または脳の実質に直接投与してもよく、そしてこれらの
位置へ向ける技術は当該技術分野では周知であるが、これらのより複雑な手法を利用する
必要はない。本発明の抗体は末梢循環系に依る、より単純な技術により投与する時に効果
的である。本発明の利点には、たとえ中枢神経系自体に直接提供されなくても、抗体がそ
の有利な効果を発揮する能力を含む。実際に本明細書では血液脳関門をわたる抗体の量が
＜０．１％の血漿レベルであり、しかも本発明の抗体は末梢循環中のＡβを封鎖し、なら
びにＣＮＳおよび血漿の可溶性Ａβ排出を改変する能力を発揮することが証明された。

投与用の製薬学的組成物は、選択された投与様式に適するように計画され、そして分散
剤、バッファー、表面活性剤、保存剤、可溶化剤、張性調節剤、安定化剤等のような製薬
学的に許容され得る賦形剤が適切に使用される。レミングトンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇ
ｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、マック出版社、イー
ストン、ペンシルバニア州、最新版（引用により本明細書に編入する）は、一般的に熟練
者に知られている製剤技術の概論を提供する。

本発明の抗体の溶解性を改変すること、例えばそれらをリポソームにカプセル化するこ
とにより、または極性基をブロッキングすることによりさらに親油性にすることは特に有
用である。

静脈内または腹腔内または皮下注射による末梢全身送達が好適である。そのような注射
に適当な賦形剤は簡単である。しかしさらに、投与は鼻用エーロゾルまたは座薬により粘
膜を通して行うこともできる。そのような投与様式に適当な製剤は周知であり、そして典
型的には膜を通る輸送を促進する表面活性剤を含む。そのような表面活性剤はしばしばス
テロイドに由来するか、またはＮ−［１−（２，３−ジオレオイル）プロピル−Ｎ，Ｎ，
Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）のようなカチオン性脂質、または
コレステロールヘミスクシネート、ホスファチジルグリセロール等のような種々の化合物
である。

製剤中のヒト化抗体の濃度は、わずか約０．１％から１５または２０重量％まで、そし
て主に流体容量、粘度等に基づき選択した特定の投与様式に従い選択される。このように
注射用の典型的な製薬学的組成物は、リン酸緩衝化塩水の１ｍＬの滅菌緩衝水および１〜
１００ｍｇの本発明のヒト化抗体を含むように作成することができる。製剤は製剤を作成
した後に滅菌濾過することができ、あるいは微生物学的に許容され得るように作成するこ
とができる。静脈内注入用の典型的組成物は、滅菌リンゲル溶液のような２５０ｍＬもの
容量、およびｍｌあたり１〜１００ｍｇ以上の抗体濃度を有することができる。

本発明の治療薬は、貯蔵のために凍結または凍結乾燥し、そして使用前に適切な滅菌担
体中に再構成することができる。凍結乾燥および再構成は程度が変動する抗体活性の損失
を導く可能性がある（例えば通例の免疫グロブリンでは、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よりも
大きな活性の損失を有する傾向がある）。投薬用量は補正するために調整されなければな
らないかもしれない。製剤のｐＨは抗体の安定性（化学的および物理的）と投与する時の
患者の満足のバランスを取るように選択される。

一般に、４から８の間のｐＨで耐容される。

前記の方法はヒト化抗体のようなタンパク質の投与に最も便利かつ最も適切であると思
われるが、適切に適合させることにより経皮的投与および経口投与のような他の投与技術
も、適切な製剤が設計されれば採用することができる。

加えて、生分解性フィルムおよびマトリックス、または浸透圧ミニポンプ、またはデキ
ストランビーズ、アルギネートまたはコラーゲンに基づく送達系を使用した放出制御製剤
を使用することも望ましい。

まとめると製剤は本発明の抗体を投与するために利用可能であり、そして当該技術分野
で周知であり、そして種々な選択肢から選ぶことができる。典型的な投薬用量レベルは、
標準的な臨床的技術を使用して至適化することができ、そして投与様式および患者の状態
に依存するだろう。

本発明はさらに上記方法に使用することができるキットを提供する。１つの態様では、
キットは本発明の抗体、好ましくは精製された抗体、より好ましくはモノクローナル抗体
、さらに一層好ましくは２００２年８月１９日にベルギーの細菌のカルチャーコレクショ
ンに寄託番号ＬＭＢＰ５８９６ＣＢおよびＬＭＢＰ５８９７ＣＢでそれぞれ寄託されたハ
イブリドーマ細胞Ｊ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／１およびＪ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／２に
より発現される単離されたモノクローナル抗体を１以上の容器に含んでなる。具体的な態
様では本発明のキットは、キットに含まれる抗体と特異的に免疫反応性であるエピトープ
を含んでなる実質的に単離されたポリペプチドを含む。さらなる態様では、このエピトー
プは免疫原としてβ−セクレターゼ １１切断部位の最初の５〜７個のヒトのアミノ酸、
すなわちＥＶＨＨＱ−Ｃ（ヒトＡβ １１（６ＡＡ）−配列番号１）およびＥＶＨＨＱＫ
Ｉ−Ｃ（ヒトＡβ １１（８ＡＡ）−および配列番号２）、またはβ−セクレターゼ １
１切断部位の最初の５〜７個のマウスのアミノ酸、すなわちＥＶＲＨＱ−Ｃ（マウスＡβ
１１（６ＡＡ）−配列番号３）およびＥＶＲＨＱＫＬ−Ｃ（マウスＡβ １１（８ＡＡ
）−配列番号４）からなる群から選択される。好ましくは本発明のキットはサンドイッチ
アッセイに使用され、そしてさらに目的のポリペプチドとは特異的に反応しないコーティ
ング抗体を含んでなり、具体的な態様では、このコーティング抗体はＡβ１１−ｘペプチ
ドおよび完全長のＡβ４０またはＡβ４２を認識し、好ましくはこのコーティング抗体は
ヒトＡβ１１−ｘペプチドおよび完全長のヒトＡβ４０またはＡβ４２を認識し、さらに
好適な態様では、このコーティング抗体はＡβ１１−４０および完全長のＡβ４０を特異
的に認識するモノクローナル抗体ＪＲＦ／ｃＡβ４０／１０（すでに特性付けしたような
）からなるか、またはコーティング抗体はＡβ１１−４２および完全長のＡβ４２を特異
的に認識するモノクローナル抗体ＪＲＦ／ｃＡβ４２／１２（すでに特性付けしたような
）からなる。本発明による別のサンドイッチアッセイでは、キットはＡβ１１−ｘペプチ
ド、好ましくはヒトのＡβ１１−ｘペプチドを特異的に認識するコーティング抗体、およ
びさらにＡβ４０またはＡβ４２のＣ−末端、好ましくはヒトＡβ４０またはＡβ４２の
Ｃ−末端に特異的な抗体を含んでなる。より好適な態様ではキットは、コーティング抗体
として２００２年８月１９日にベルギーの細菌のカルチャーコレクションに寄託番号ＬＭ
ＢＰ５８９６ＣＢおよびＬＭＢＰ５８９７ＣＢでそれぞれ寄託されたハイブリドーマ細胞
Ｊ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／１およびＪ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／２により発現される単
離されたモノクローナル抗体、およびさらなる抗体としてモノクローナル抗体ＪＲＦ／ｃ
Ａβ４０／１０（これまでに特性付けしたような）およびモノクローナル抗体ＪＲＦ／ｃ
Ａβ４２／１２（これまでに特性付けしたような）を含んでなり、後者は検出可能な標識
、物質に連結されている。

本発明の別の態様では、本発明のキットは抗体の目的とするポリペプチドへの結合を検
出するための手段を含む（例えば抗体は蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物または発光
化合物のような検出可能物質、あるいは第１抗体を認識する第２抗体を検出可能な物質に
結合することができる）。特にキットはＡβ１１−ｘペプチドへの抗体の結合を検出する
ための、好ましくはβ−セクレターゼ １１切断部位の最初の５〜７個のヒトのアミノ酸
、すなわちＥＶＨＨＱ−Ｃ（ヒトＡβ １１（６ＡＡ）−配列番号１）およびＥＶＨＨＱ
ＫＩ−Ｃ（ヒトＡβ １１（８ＡＡ）−および配列番号２）、またはβ−セクレターゼ
１１切断部位の最初の５〜７個のマウスのアミノ酸、すなわちＥＶＲＨＱ−Ｃ（マウスＡ
β １１（６ＡＡ）−配列番号３）およびＥＶＲＨＱＫＬ−Ｃ（マウスＡβ １１（８Ａ
Ａ）−配列番号４）からなる群から選択されるエピトープとの結合を検出するための手段
を含む。前記サンドイッチアッセイでは、検出可能な物質に結合した抗体は、コーティン
グ抗体ではない。

さらなる態様では、本発明は組織、体液、例えばＣＳＦ、血液、血漿、血清、尿等を含
む生物学的サンプルのスクリーニングに使用するための診断キットを含む。該生物学的サ
ンプルはＡｂ１１−ｘペプチドを含む。この診断キットはＡｂ１１−ｘペプチドと、特に
β−セクレターゼ １１切断部位の最初の５〜７個のヒトのアミノ酸、すなわちＥＶＨＨ
Ｑ−Ｃ（ヒトＡβ １１（６ＡＡ）−配列番号１）およびＥＶＨＨＱＫＩ−Ｃ（ヒトＡβ
１１（８ＡＡ）−および配列番号２）、またはβ−セクレターゼ １１切断部位の最初
の５〜７個のマウスのアミノ酸、すなわちＥＶＲＨＱ−Ｃ（マウスＡβ １１（６ＡＡ）
−配列番号３）およびＥＶＲＨＱＫＬ−Ｃ（マウスＡβ １１（８ＡＡ）−配列番号４）
からなる群から選択されるエピトープと特異的に免疫反応性の実質的に単離された抗体、
および抗体の免疫原への結合を検出する手段を含む。１つの態様では、抗体が固体支持体
に結合している。具体的な態様では、抗体はモノクローナル抗体、特に２００２年８月１
９日にベルギーの細菌のカルチャーコレクションに寄託番号ＬＭＢＰ５８９６ＣＢおよび
ＬＭＢＰ５８９７ＣＢでそれぞれ寄託されたハイブリドーマ細胞Ｊ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１
１／１およびＪ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／２により発現されるモノクローナル抗体である
ことができる。

キットの検出手段には第２の標識されたモノクローナル抗体を含むことができ、好まし
くはこの第２の標識されたモノクローナル抗体は、ＪＲＦ／ｃＡβ４０／１０またはＪＲ
Ｆ／ｃＡβ４２／１２からなり、ここでＪＲＦ／ｃＡβ４０／１０との前記固定化モノク
ローナル抗体の組み合わせはＡβ１−４０との交差反応無しでＡβ１１−４０を特異的に
認識し、そしてここでＪＲＦ／ｃＡβ４２／１２との前記固定化モノクローナル抗体の組
み合わせはＡβ１−４２との交差反応無しでＡβ１１−４２を特異的に認識する。あるい
は、または加えて、検出手段は標識された競合抗原を含んでなることができる。

上記アッセイにおける固体表面試薬は、タンパク質材料をポリマー性ビーズ、浸漬棒、
９６ウェルプレートまたはフィルター材料のような固体支持体材料に結合させるために知
られている技術により調製される。これらの結合法は一般にタンパク質の支持体への非特
異的吸着、または典型的には遊離アミノ基を介するタンパク質の、固体支持体上の化学的
な反応性基、例えば活性化カルボキシル、ヒドロキシルまたはアルデヒド基への共有結合
を含む。あるいはストレプトアビジンをコートしたプレートをビオチン化抗原（１つまた
は複数）との結合に使用することができる。

このように本発明はこの診断法を行うためのアッセイ系またはキットを提供する。この
キットは一般に本発明に従い表面に結合した抗体を含む支持体、および抗体と免疫原との
結合を検出するためのレポーターである標識された抗体を含む。

本発明は以下の実験の詳細を参照にすることによりより良く理解されるであろうが、当
業者にはこれらが添付する特許請求の範囲でより詳細に記載するような本発明の単なる具
体的説明であることは明らかであろう。さらに本出願を通して、種々の刊行物が引用され
ている。これら刊行物の開示は引用により本出願に編入して、本発明が係わる技術分野の
状況をより完全に説明する。

実験
材料および方法
モノクローナル抗体の作成
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、完全フロイントアジュバント中の４種のペプチドで初回免疫し
た。最初の２つの合成ペプチドはβ−セクレターゼ １１切断部位の最初の５〜７個のヒ
トのアミノ酸（ＡＡ）からなった：ＥＶＨＨＱ（ＫＩ）−Ｃ（ヒトＡβ １１（６〜８Ａ
Ａ））。免疫感作用の他の２つのペプチドは、マウスＡβ １１ＡＡ配列を含んだ；ＥＶ
ＲＨＨＱ（ＫＬ）−Ｃ。すべてのペプチドは、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）のＩｍｊｅｃｔ
Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍｃＫＬＨ／ＢＳＡキットのような市販され
ているキットを使用して、製造元（ピアス、ロックフォード、イリノイ州）の使用説明に
従いペプチドをＣＯＯＨ−末端システイン残基を介してマレイミド活性化ｍｃ（鍵穴カサ
ガイ：Ｍｅｇａｔｈｕｒａ ｃｒｅｎｕｌａｔａ）ＫＬＨに、またはマレイミド活性化ウ
シ血清アルブミンにカップリングすることにより調製した。マウスは２週間毎に１００μ
ｇのＫＬＨにカップリングしたペプチドで、最初は完全そして続いて不完全フロイントア
ジュバント中で追加免疫した。

すべてのマウスの脾臓を単離し、そしてヒトのＡβ １１（６ＡＡ）ペプチドで免疫感
作したマウスの１つの脾臓を除き、液体窒素中で凍結した。選択したマウスは最高の血清
力価を示し、したがって融合に選択した。融合または脾臓摘出の４日前に、すべてのマウ
スは塩水中のｍｃＫＬＨにカップリングされた１００μｇのＡβ １１ペプチドで腹腔内
に追加免疫された。マウスの脾臓細胞をＳＰ２／０細胞とＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌ
ｓｔｅｉｎ（８）の改良手順により融合した。ハイブリドーマは３０ｘ９６ウェルプレー
トにまき、そして１０日後にＢＳＡがカップリングした６ＡＡのｈＡβ １１ペプチドで
直接的ＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、そしてカップリングしていないＡβ１１−４
０ペプチドで確認した。遊離ｈＡβ １１−４０について陽性細胞を直ちにサブクローン
化し、そして陽性クローンを液体窒素中で凍結した。

すべてのハイブリドーマは、１０％ウシ胎児血清（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、
ヨーロッパ）、２．５％ＥＳＧハイブリドーマサプリメント（エルスコラボ（Ｅｌｓｃｏ
ｌａｂ）、クルイベーク、ベルギー）、２％ＨＴ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、米国）、１ｍ
Ｍ ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸およびペニシリン（１００Ｕ／ｍ
ｌ）およびストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）を補充したダルベッコの改良イーグル
培地で成長させた。すべての製品は市販されており、そしてライフ−テクノロジーズ（Ｌ
ｉｆｅ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ペーズリー、英国）から購入した。細胞は加湿し
た８％ＣＯ２エアーインキュベーター中でインキュベーションした。

ＥＬＩＳＡ抗体の選択
抗−Ａβ １１抗体の検出に使用したスクリーニングＥＬＩＳＡは、１μｇ／ｍｌの遊
離ヒト／マウスＡβ１１−４０またはＢＳＡがカップリングしたヒト／マウスＡβ １１
ペプチドを４℃にて一晩、５０μｌ／ウェルのコーティングバッファー（１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ、１０ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＮａＮ３、ｐＨ８．５）中でＮＵＮＣ（ライ
フテクノロジーズ）のＵ底高結合９６ウェルマイクロタイタープレートにコーティングし
た直接ＥＬＩＳＡであった。翌日、プレートは８５μｌ／ウェルの０．１％カゼイン（Ｐ
ＢＳ中）で３７℃で６０分間コーティングされて非特異的結合を減少させた。ついで５０
μｌのハイブリドーマ上清を加え、そして３７℃で１時間、インキュベーションした。洗
浄後、結合したモノクローナル抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した５０μｌ
／ウェルのヒツジ−抗−マウスＩｇで３７℃で１時間、検出した（アマシャム−ファルマ
シア バイオテック）。両試薬は０．１％カゼイン／ＰＢＳで希釈した。プレートを洗浄
し、そして５０μｌの０．４２ｍＭ ３，５，３'，５'−テトラメチル−ベンジジン、０
．００３（容量／容量）％Ｈ２Ｏ２の溶液（１００ｍＭのクエン酸および１００ｍＭリン
酸水素二ナトリウム（ｐＨ４．３）中）を基質として加えた。反応は室温でプレート振盪
機上で最大１５分間進め、その後、発色を２Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄、５０μｌ／ウェルで止め、そ
してプレートをマイクロタイタープレートリーダー上で４５０ｎｍにて読んだ（Ｔｈｅｒ
ｍｏｍａｘ、モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）。選択した
モノクローナル抗体と完全サイズのヒト遊離Ａβ１−４０ペプチドとの交差反応性は、ス
クリーニングアッセイと同一の直接的ＥＬＩＳＡで試験したが、ただし完全サイズの遊離
ヒトＡβ１−４０ペプチドをＢＳＡにカップリングしたｈＡβ １１（６ＡＡ）ペプチド
の代わりに使用した。第２の確認ＥＬＩＳＡでは、選択した陽性カルチャーを遊離ヒトＡ
β１１−４０ペプチドで再試験した。

アミロイドβ検出のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ
ｈＡβ（１−４０）またはｈＡβ（１１−４０）標準希釈（アメリカンペプチドカン
パニー：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ）の測定用のＥＬＩＳＡは
、以下のように行った：簡単に説明すると、モノクローナル抗体ＪＲＦ／ＡβＮ／２５、
Ｊ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβＮ１１／１およびＪ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβＮ１１／２を、５μｇ／ｍ
ｌで４℃にて一晩、１００μｌ／ウェルのコーティングバッファー中でＮＵＮＣ平底高結
合９６ウェルマイクロタイタープレートにコーティングした。翌日、プレートは１２５μ
ｌ／ウェルの０．１％カゼイン（ＰＢＳ中）で３７℃で３０分間オーバーコーティングさ
れて非特異的結合を減少させ、そして１００μｌ／ウェルのｈＡβ（１−４０）またはｈ
Ａβ（１１−４０）ペプチド希釈サンプルと３７℃で９０分間、インキュベーションした
。プレートを洗浄した後、１００μｌ／ウェルのＨＲＰ標識化ＪＲＦ／ｃＡβ４０／１０
−ＨＲＰＯとインキュベーションした。プレートを洗浄し、そして１００μｌの０．４２
ｍＭ ３，５，３'，５'−テトラメチル−ベンジジン、０．００３（容量／容量）％Ｈ２
Ｏ２の溶液（１００ｍＭのクエン酸および１００ｍＭリン酸水素二ナトリウム（ｐＨ４．
３）中）を基質として加えた。反応はＲＴでプレート振盪機上にて最大１５分間進め、そ
の後、発色を２Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄、５０μｌ／ウェルで止め、そしてプレートをマイクロタイ
タープレートリーダー上で４５０ｎｍにて読んだ（Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ、モレキュラーダ
イナミックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ））。

ＡＰＰ ＣＴＦの免疫検出
ＣＴＦ（ＳＴＵＢＳ）断片の免疫検出には、ヒトＡＰＰｓｗｅおよびヒトＢＡＣＥ１で
安定にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞を、７５ｃｍ²フラスコ（ライフテクノロジー
ズ、ペーズリー、英国）中でコンフルエンスになるまで成長させ、そして続いて細胞を溶
菌させ、そして５０ｍＭ Ｔｒｉｓ：ｐＨ＝７．０、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒ
ｉｔｏｎＸ−１００および市販のプロテアーゼ−インヒビター−カクテル（ロッシュ（Ｒ
ｏｃｈｅ）、ベーリンガーマンハイム、独国）中で超音波処理した。粗溶菌液を４℃で１
００００ｇにて１０分間遠心して核および屑を除いた。清澄化した細胞ライセートをタン
パク質含量について標準化し、そしてサンプルを９５℃にて２ｘトリシンレムリー（Ｔｒ
ｉｃｉｎｅ Ｌａｅｍｍｌｉ）バッファー中で５分間変性させ、そしてプレキャストの１
０〜２０％ＴｒｉｓＴｒｉｃｉｎｅＳＤＳ勾配ゲル（ＮＯＮＥＸ、インビトロジェン（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、グロニンゲン、オランダ）にのせ、そして０．２２μｍのＨｙｂ
ｏｎｄ−ＥＣＬナイロン膜（ＡＰＢ）に１．５ｍＡ／ｃｍ²で４５分間、セミドライブロ
ッテングした。低分子量タンパク質のラダーを分子量標準（ＭａｇｉｃＭａｒｋ Ｗｅｓ
ｔｅｒｎ標準、インビトロジェン）として使用した。膜は１０（重量／容量）％の無脂肪
ドライミルク（バイオラッド：ＢｉｏＲａｄ）（ＰＢＳ中）で１時間ブロックした。次い
で膜を適切な５μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体と４℃で一晩インキュベーションした（
ＡＰＰのＣ末端エピトープに対するモノクローナル抗体Ｃ１／６．１は、オレンジベルグ
、Ｎａｔｈａｎ Ｓ．Ｋｌｉｎｅ研究所のＭａｔｈｅｗｓ博士の好意により得られた）。
次いで膜はバッファーを５回変えながらＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で５分間洗浄し
、ＨＲＰ結合ヤギ抗−マウス（シグマ）１：２０００希釈物と室温（ＲＴ）で１時間イン
キュベーションした。洗浄後、目的バンドは製造元（ロッシュ、ベーリンガーマンハイム
、独国）の使用説明に従い化学発光により視覚化した。スキャンはＬｕｍｉ−Ｉｍａｇｅ
ｒ（ロッシュ、ベーリンガーマンハイム、独国）で取った。

ＡＤ患者の脳切片におけるＡＰＰの免疫検出
脳切片は１０（重量／容量）％の無脂肪−乾燥ミルク（バイオラッド）（ＰＢＳ中）で
１時間ブロックした。次いで切片を５μｇ／ｍｌの適切なモノクローナル抗体と４℃で一
晩インキュベーションした。次いで膜はバッファーを５回変えながらＰＢＳ−０．１％Ｔ
ｗｅｅｎ２０で室温（ＲＴ）にて５分間洗浄し、ＨＲＰ結合ヤギ抗−マウス（シグマ）１
：２０００希釈物と室温（ＲＴ）で１時間インキュベーションした。洗浄後、目的バンド
は製造元（ロッシュ、ベーリンガーマンハイム、独国）の使用説明に従い化学発光により
視覚化した。スキャンはＬｕｍｉ−Ｉｍａｇｅｒ（ロッシュ、ベーリンガーマンハイム、
独国）で取った。

結果および考察
「融合マウス」の選択
４種のｍｃＫＬＨをカップリングしたペプチドのパネルをマウスに注射した。各ペプチ
ドについて、３種のマウスを免疫感作した。１回目の追加免疫感作後、各マウスから採血
し、そして血清を単離し、そして直接コーティングしたＢＳＡ−ヒトＡβ（６ＡＡ）ＥＬ
ＩＳＡで試験した。ｈＡβ １１（６ＡＡ）で免疫感作したマウスの免疫感作プロトコー
ルは、注射したすべてのマウスについて同一であり、そして表１に示す。図１．ａでは、
ＫＬＨ ｈＡβ１１（６ＡＡ）（配列番号１）で免疫感作したマウス１が、遊離のヒトＡ
β１１−４０ペプチドに関して大変高い血清力価を示すことが明らかに証明された。この
理由から、ｈＡβ １１（６ＡＡ）で免疫感作したマウス１を融合に選択した。

ｈＡβ１１（６ａａ）の融合、脾臓１
この高免疫感作マウスの多数の脾臓細胞により（全部で６．５×１０⁸の脾臓細胞）、
融合手順は半数の脾臓細胞で２回行った。すべての細胞は、ＥＳＧを補充した培地に播種
し、そして３０×９６のハイブリドーマプレートを１０日後にスクリーニングした。

これらのハイブリドーマの中から、６５のカルチャーウェルがＢＳＡをカップリングし
たペプチドでのスクリーニングＥＬＩＳＡアッセイで明らかな陽性シグナルを最初に示し
た。これらの陽性上清をＩｇＧ特異的ＥＬＩＳＡで遊離ペプチドについて試験した。わず
か５つのカルチャーが陽性と確認され、すなわち最初の陽性ウェルの１０％未満であった
。これらすべてのカルチャーは完全長のヒトＡβ１−４０には陰性であり、ｈＡβ１１−
４０／４２の末端にある（ｅｎｄ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）ＡＡに対する反応性を示した。

カルチャーは直ちにクローン化し、そして母のカルチャーを凍結した。これら５つのう
ち、２９Ｂ５（Ｊ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／１）および５Ｃ４（Ｊ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１
１／２）と命名された２つのハイブリドーマは成功裏にクローン化され、そして液体窒素
中に凍結した。これら２つのハイブリドーマから４種のサブクローンをそれぞれ培養し、
そして凍結した。表２では陽性のサブクローンをまとめる。

非ＡＤのヒト対照、ビーグル犬およびモルモットのＣＳＦサンプル中のＡβ１−４０／４
２および短縮化Ａβ１１−４０の決定
ＣＳＦサンプル中のＡβ１−４０／４２および短縮化Ａβ１１−４０の測定に関するＥ
ＬＩＳＡは以下のように行った：簡単に説明すると、モノクローナル抗体Ｊ＆ＪＰＲＤ／
ｈＡβ１１／１または特異的Ａβｘ−４０およびＡβｘ−４２モノクローナル抗体（Ｖａ
ｎｄｅｒｍｅｅｒｅｎ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｐｙｐｅ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．
，２００３）ＪＲＦ／ｃＡβ４０／１０およびＪＲＦ／ｃＡβ４２／２６を、５μｇ／ｍ
ｌで４℃にて一晩、１００μｌ／ウェルのコーティングバッファー中でＮＵＮＣ平底高結
合９６ウェルマイクロタイタープレートにコーティングした。翌日、プレートは１５０μ
ｌ／ウェルの０．１％カゼイン（ＰＢＳ中）で３７℃で３０分間オーバーコーティングさ
れて非特異的結合を減少させ、そして１００μｌ／ウェルのＰＢＳバッファーで希釈した
ＣＳＦサンプルと３７℃で９０分間、インキュベーションした。プレートを洗浄した後、
１００μｌ／ウェルのＨＲＰ標識化ＪＲＦ／ＡβＮ／２５−ＨＲＰＯまたはＪＲＦ／ｃＡ
β４０／２８−ＨＲＰＯとインキュベーションした。プレートを洗浄し、そして１００μ
ｌの０．４２ｍＭ ３，５，３'，５'−テトラメチル−ベンジジン、０．００３（容量／
容量）％Ｈ₂Ｏ₂の溶液（１００ｍＭのクエン酸および１００ｍＭリン酸水素二ナトリウム
（ｐＨ４．３）中）を基質として加えた。反応はＲＴでプレート振盪機上にて最大１５分
間進め、その後、発色を２Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄、５０μｌ／ウェルで止め、そしてプレートをマ
イクロタイタープレートリーダー上で４５０ｎｍにて読んだ（Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ、モレ
キュラーダイナミックス）。

本発明のモノクローナル抗体を使用して、短縮化１１−４０ベータ−アミロイドのアイ
ソフォームを非ＡＤのヒト対照、ビーグル犬およびモルモットのＣＳＦサンプル（ｎ＝６
）で定量的に検出することができた（ｎｇ±標準偏差）。

結論
全部で３０，０００以上のハイブリドーマの中から、我々はヒトＡβ１１−４０ペプチ
ドの遊離Ｎ−末端を特異的に認識する２つの異なるハイブリドーマクローンを選択した。
これらのモノクローナル抗体は、完全サイズのヒトＡβ１−４０では陰性である。抗体の
特異性を評価するために、抗体をプロテインＧアフィニティクロマトグラフィーで精製し
、そして特異的抗−ヒトｃＡβ４０およびｃＡβ４２ｍＡｂを用いたサンドイッチＥＬＩ
ＳＡに使用した。検出抗体としてＪＲＦ／ｃＡβ４０／１０−ＨＲＰＯと組み合わせて、
ＪＲＦ／ＡβＮ／２５をＡβ１−４０の特異的モノクローナル抗体として使用した。検出
抗体はＡβのＣ末端部を特異的に認識し、したがって検出抗体としてＪＲＦ／ＡβＮ／２
５およびＪ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／１およびＪ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／２（Ａβ１１
−ｘペプチドに特異的な抗体）の両方と一緒に使用することができる。図２Ａでは、ＪＲ
Ｆ／ＡβＮ／２５がＡβ１１−４０との交差反応性無しでＡβ１−４０と特異的に反応す
ることが確認される。図２Ｂおよび２Ｃからは、抗体Ｊ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／１およ
びＪ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／２がヒトＡβ１−４０に対する交差反応無しでｈＡβ１１
−４０を特異的に認識することが分かる。

生物学的サンプル中のＡβ１１−ｘペプチドを特異的に標識するための本発明の抗体の
能力は、ヒトＡＰＰおよびヒトＢＡＣＥ１で安定にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞の
膜抽出物でのウエスタンブロット（図３）、ならびにＡＤ患者のアミロイド斑中の脳切片
で証明された（表３）。したがってサンドイッチＥＬＩＳＡにおいてこれら抗体を特異的
な抗−ヒトｃＡβ４０および抗−ヒトｃＡβ４２モノクローナル抗体と組み合わせて使用
することにより、生物学的流体および脳のホモジネートを含む種々の生物学的サンプル中
のヒトＡβ１１−ｘペプチドを特異的に検出する感受性のあるアッセイが得られる。

表１ ＥＶＨＨＱ−Ｃ（ヒトＡβ １１（５ＡＡ）−配列番号１）を注射したマウスに
関する免疫感作手順および脾臓回収および融合のスケジュール表
表３ ＡＤ患者の脳切片中のＡβ１１−ｘペプチドの特異的検出を示すウエスタンブロ
ッティングの結果

以下に本発明の主な特徴と態様を列挙する。

１． Ａβ１１−ｘペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体。

２． β−セクレターゼ １１切断部位の最初の５〜７個のヒトのアミノ酸、すなわち配
列番号１および配列番号２、またはβ−セクレターゼ １１切断部位の最初の５〜７個の
マウスのアミノ酸、すなわち配列番号３および配列番号４を免疫原として特異的に認識す
る、１．に記載のモノクローナル抗体。

３． 検出可能に標識された１．または２．に記載の抗体。

４． 検出可能な標識が、放射性標識、酵素標識、発光標識または蛍光標識である、３．
に記載の抗体。

５． 担体に固定化されている、１．ないし４．のいずれか１項に記載の抗体。

６． ２００２年８月１９日にベルギーの細菌のカルチャーコレクションに寄託番号ＬＭ
ＢＰ５８９６ＣＢおよびＬＭＢＰ５８９７ＣＢでそれぞれ寄託されたハイブリドーマ細胞
Ｊ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／１およびＪ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／２により発現される、
１．ないし５．のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。

７． ２００２年８月１９日にベルギーの細菌のカルチャーコレクションに寄託番号ＬＭ
ＢＰ５８９６ＣＢおよびＬＭＢＰ５８９７ＣＢでそれぞれ寄託されたハイブリドーマ細胞
Ｊ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／１およびＪ＆ＪＰＲＤ／ｈＡβ１１／２。

８． サンプル中のＡβ１１−ｘペプチドを測定または検出するためのイムノアッセイ法
であって、サンプルを１．ないし３．のいずれか１項に記載のＡβ１１−ｘペプチドに対
する抗体と接触させ、そして免疫複合体が抗体とＡβ１１−ｘペプチドとの間に形成され
るかどうかを決定することを含んでなる上記方法。

９． 組織サンプル中にＡβ１１−ｘペプチドの存在を検出する方法であって：
個体の身体から組織サンプルを得；
組織サンプルを造影に有効な量の検出可能に標識された３．または４．に記載の抗体と
接触させ；そして
標識を検出して組織サンプル中のＡβ１１−ｘペプチドの存在を確立する、
ことを含んでなる上記方法。

１０． 検出可能に標識された抗体が７．に記載の少なくとも１つのハイブリドーマ細胞
により発現される、９．に記載の方法。

１１． 体液サンプル中にＡβ１１−ｘペプチドの存在を検出する方法であって：
個体の身体から体液サンプルを得；
体液サンプルを造影に有効な量の検出可能に標識された３．または４．に記載の抗体と
接触させ；そして
標識を検出して体液サンプル中のＡβ１１−ｘペプチドの存在を確立する、
ことを含んでなる上記方法。

１２． 検出可能に標識された抗体が７．に記載の少なくとも１つのハイブリドーマ細胞
により発現される、１０．に記載の方法。

１３． ９．または１０．に記載の方法における１．ないし６．のいずれか１項に記載の
モノクローナル抗体の使用。

１４． β−アミロイド関連疾患を診断するための１．ないし６．のいずれかに記載の抗
体の使用。

１５． １．ないし６．のいずれかに記載の抗体および製薬学的に許容され得る担体を含
んでなる診断用組成物。

１６． ２．ないし５．のいずれかに記載の抗体および抗体の担体手段を含んでなる、β
−アミロイド関連疾患を診断するためのイムノアッセイキット。

Claims (1)

1. Ａβ１１−ｘペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体。

Images