ES2556880T3 - Procedimiento no proteolítico de determinación de analitos en estructuras queratinizadas - Google Patents

Procedimiento no proteolítico de determinación de analitos en estructuras queratinizadas Download PDF

Info

Publication number
ES2556880T3
ES2556880T3 ES13170392.8T ES13170392T ES2556880T3 ES 2556880 T3 ES2556880 T3 ES 2556880T3 ES 13170392 T ES13170392 T ES 13170392T ES 2556880 T3 ES2556880 T3 ES 2556880T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
sample
analyte
keratinized
hair
metabolite
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES13170392.8T
Other languages
English (en)
Inventor
Virginia Hill
Mohammad Atefi
Michael I. Schaffer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Psychemedics Corp
Original Assignee
Psychemedics Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Psychemedics Corp filed Critical Psychemedics Corp
Application granted granted Critical
Publication of ES2556880T3 publication Critical patent/ES2556880T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/9486—Analgesics, e.g. opiates, aspirine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

Un procedimiento de determinación de la presencia de un analito en una muestra de estructura queratinizada de un sujeto, que comprende: (a) proporcionar una muestra de estructura queratinizada lavada opcionalmente; (b) poner en contacto la muestra queratinizada con una solución acuosa de un agente reductor que comprende ditiotreitol (DTT) o ditioeritritol (DTE) para dar como resultado una solución de ensayo, en la que la etapa de contacto se realiza a un pH de entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 10,5, y (c) determinar si el analito está presente en la solución de ensayo, en el que el procedimiento no comprende poner en contacto la muestra de estructura queratinizada con una enzima proteolítica o en la que el procedimiento no comprende escindir proteolíticamente la muestra de estructura queratinizada.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
DESCRIPCION
Procedimiento no proteolttico de determinacion de analitos en estructuras queratinizadas Campo de la tecnica
La presente divulgacion se refiere a materiales y procedimientos para determinar la presencia y la cantidad de uno o mas analitos de interes en estructuras no queratinizadas de un sujeto y, mas particularmente, a materiales y procedimientos para lo mismo que no requieren procesamiento proteolftico de las estructuras queratinizadas.
Antecedentes
La presente divulgacion se refiere a un procedimiento analftico mejorado que permite la liberacion relativamente rapida y el analisis directo de analitos, incluidos analitos organicos, tales como ciertas drogas o metabolitos de las mismas, presentes en el pelo y en otras estructuras queratinizadas, por ejemplo las unas de los dedos de los pies y las unas de los dedos de las manos. El procedimiento permite la deteccion selectiva de dichos analitos sin que afecte a la estructura de los analitos y sin que sea perjudicial para las sondas de analitos, por ejemplo anticuerpos, ARN/ADN y sondas de bioreceptores, que se pueden usar para detectar el analito. Por ejemplo, en algunas realizaciones se puede anadir directamente una sonda de analito a una estructura queratinizada que se sospecha que contiene uno o mas analitos y que se ha tratado como se describe en el presente documento. De este modo, se puede evaluar la identidad de uno o mas analitos, asf como la extension y la duracion del consumo del uno o mas analitos por un sujeto.
El analisis del pelo y otras estructuras queratinizadas tiene ciertas ventajas sobre las tecnicas de analisis de orina, sangre y fluidos orales para la deteccion de analitos de interes. Estas incluyen facilidad de manipulacion y almacenamiento, una amplia ventana de deteccion, y correlacion de la presencia y la cantidad de farmaco con el tiempo de uso y la dosis ingerida. Se sabe que las tecnicas en orina, sangre y fluidos orales son desventajosos en cuanto a que la duracion y la intensidad de uso o de exposicion no se pueden determinar. Estas tecnicas pueden, como mucho, proporcionar informacion a corto plazo concerniente a los analitos ingeridos. Ademas, tambien hay problemas con la interpretacion de estos resultados. Por ejemplo, la deteccion de un nivel bajo de la droga ingerida o del metabolito de la droga ingerida en orina podna significar que un sujeto ha ingerido una cantidad pequena de la droga muy recientemente o una cantidad mayor varios dfas antes. Por tanto, normalmente, el uso cronico de una droga no se puede determinar con estos procedimientos sin repetir las pruebas.
En respuesta a los problemas de establecer un procedimiento fiable y preciso que mida la duracion y la intensidad de los analitos de interes, los trabajos realizados por el Dr. Werner A. Baumgartner, como se indica en Radioimmunoassay of Hair for Determining Opiate Abuse Histories", J. Nucl Med 20:749-752 (1979), determinaron que los historiales de exposicion prolongada a drogas se pueden obtener mediante el analisis de vello corporal de mairnfero, ya que estas sustancias quedan “atrapadas” dentro de las fibras de cabello individuales durante la smtesis de las fibras. A este respecto, se demostro que actuaba como una grabadora, es decir, los historiales de exposicion pasada se pueden evaluar mediante un analisis seccional de las muestras de pelo. Por ejemplo, se encontro que la morfina, una vez que esta en la circulacion sangumea, encuentra su camino hacia el cabello a medida que el pelo se sintetiza.
Se ha determinado que varias sustancias qmmicas, incluidas las drogas, quedan atrapadas por el pelo durante su smtesis, estas sustancias quedan "encerradas" en el pelo durante esencialmente el tiempo en el que esta presente el vello en el cuerpo. Se descubrio que esto era cierto para el cabello de la cabeza y el vello corporal, asf como para otras estructuras queratinizadas tales como las unas de los dedos de la mano; vease Suzuki et al., Forensic Sci. International, 24:9-16, 1984. Estas sustancias atrapadas no se pueden eliminar del pelo y anteriormente se pensaba que solo se liberaban completamente despues de la destruccion completa, o caso completa de la fibra de pelo.
Procedimientos previos de extraccion de un analito procedente del cabello incluyen someter el cabello a soluciones calientes de metanol, o incubacion del cabello durante horas (normalmente durante la noche) en un medio alcalino o acido; Yegles, et al., en: Analytical and Practical Aspects of Drug Testing in Hair, CRC Press, 2007, pp. 73 - 94; Jurado, C. en: Analytical and Practical Aspects of Drug Testing in Hair, CRC Press, 2007, pp. 95-125; Cheze, M. et al. en: Analytical and Practical Aspects of Drug Testing in Hair, CRC Press, 2007, pp. 163 - 185). Procedimientos anteriores tambien han incluido el uso de ultrasonidos o de un mortero y martinete junto con un disolvente para ayudar a la extraccion.
Los procedimientos de extraccion de disolvente pueden sufrir varios problemas para determinar con precision la presencia y la cantidad de una analito ingerido. Uno de estos problemas es que los procedimientos de extraccion de disolvente con frecuencia solo extraen una pequena fraccion desconocida y variable del analito total presente en la muestra de pelo. Otra desventaja es que diferentes analitos pueden requerir diferentes disolventes o diferentes tiempos y temperaturas para la extraccion. Ademas, para el analisis mediante inmunoensayo, se tienen que evaporar los disolventes y muchos de los disolventes son toxicos y peligrosos.
Otros procedimientos previos usaron una combinacion de tratamientos proteolfticos y reductores para digerir completamente y reducir las estructuras queratinizadas con el fin de liberar el uno o mas analitos. Vease, por
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
ejemplo, las patentes de EE.UU. 5.466.579; 5.324.642; 6.022.693; 6.582.924; y 6.949.344, que proporcionan ejemplos de procedimientos de deteccion para ensayos de deteccion selectiva y confirmatorios para analitos de interes, incluyendo procedimientos de inmunoensayo tales como procedimientos radioinmunoensayo y de inmunoensayo enzimatico. Dichos procedimientos de tratamiento proteolftico y reductor combinados, aunque eficientes, son relativamente caros debido a los costes de la enzima proteolftica, que tambien pueden interferir en los posteriores ensayos de deteccion de analitos mediante escision proteolftica de las sondas de deteccion de analitos tales como antibioticos, evitando de este modo el uso de ciertas tecnicas analfticas muy sensibles o requiriendo el uso de etapas intermedias de neutralizacion, separacion o purificacion de proteasas.
Por tanto, existe la necesidad de un procedimiento de deteccion de analitos eficiente y relativamente barato que pueda liberar rapida y completamente analitos de estructuras queratinizadas del cuerpo, tal como pelo, unas de las manos y unas de los pies, y que pueda permitir la determinacion directa de la identidad de los analitos y su duracion de uso en un sujeto sin que destruya ni interfiera con los analitos de interes y/o las sondas de deteccion de analitos, tales como procedimientos de inmunoensayos. En el documento US 6 949 344 describe procedimientos para el analisis directo de estructuras queratinizadas, por ejemplo pelo. Los procedimientos comprenden el uso de una enzima proteolftica. Nielen et al. (Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences & Applications (2006) 830:126134) y Ahrens et al. (Fresenius Journal of Analytical Chemistry (1992) 344:559-560) describen procedimientos para detectar determinadas drogas en el pelo. Tambien, Gratacos-Cubarsi et al. (Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences & Applications (2006) 834:14-25) describen procedimientos para analizar el pelo para monitorizacion de drogas veterinarias en la produccion de ganado. Gleixner (Fleischwirt-schaft (1997), 77(12):1108- 1110) describe la extraccion de hormonas esteroides de pelo pulverizado. No obstante, los procedimientos descritos en dichos documentos difieren de la materia sujeto de la presente invencion, entre otros en las condiciones de pH y el tipo de agente reductor usado.
Sumario
La invencion se puede definir en las reivindicaciones adjuntas.
De acuerdo con una realizacion de la invencion se proporciona un procedimiento para determinar la presencia de un analito en una muestra de estructura queratinizada de un sujeto, comprendiendo el procedimiento: (a) proporcionar una muestra de estructura queratinizada lavada opcionalmente; (b) poner en contacto la muestra queratinizada con una solucion acuosa de un agente reductor que comprende ditiotreitol (DTT) o ditioeritritol (DTE) para dar una solucion de ensayo, en la que la etapa de contacto se realiza a un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 0,5 y (c) determinar si el analito esta presente en la solucion de ensayo, en la que el procedimiento no comprende poner en contacto la muestra de estructura queratinizada con una enzima proteolftica o en la que el procedimiento no comprende escindir proteolfticamente la muestra de estructura queratinizada.
Las estructuras queratinizadas como el pelo con macroensamblajes complejos de cadenas polipeptfdicas de queratina que estan reticuladas con numerosos puentes disulfuro, tanto intramolecularmente como intermolecularmente, para proporcionar la rigidez y la fuerza de la estructura final. Por ejemplo, el pelo esta compuesto de cadenas polipeptfdicas de queratina enrolladas en superhelice que se ensamblan para formar una “protofibrilla”; despues, un conjunto de protofibrillas se agrupan en un cftculo alrededor de dos o mas protofibrillas para formar un cable de multiples hebras conocido como "microfibrilla”; cientos de estas microfibrillas en conjunto dan como resultado un haz fibroso que se denomina “macrofibrilla”. Las microfibrillas forman las capas de la corteza (o el cuerpo principal) de la fibra de pelo.
Un analito de interes puede quedar atrapado en las estructuras queratinizadas de un sujeto a medida que estas estructuras crecen. En los procedimientos anteriores para detectar analitos incluidos en dichas estructuras se usaron procedimientos proteolfticos y reductores para digerir completamente y degradar la estructura queratinizada, escindiendo la estructura proteinacea de la queratina (p. ej., rompiendo los enlaces amida (enlace peptfdico) en la queratina) y reduciendo los puentes disulfuro intra e intermoleculares a sulfhidrilos, lo que da como resultado el estiramiento, desenrollado y rotura peptfdica de estas macroestructuras proteicas complejas. Sorprendentemente, los presentes inventores han descubierto que dicha escision proteolftica de la estructura queratinizada no es necesaria para liberar los analitos incluidos y que el tratamiento de la estructura queratinizada con un agente reductor tal como ditiotreitol ("DTT") en ausencia de una enzima proteolftica es suficiente para liberar los analitos de un modo cuantitativo en comparacion con los procedimientos anteriores. Por tanto, los inventores han descubierto que la sinergia descrita anteriormente entre un agente reductor tal como DTT y una enzima proteo lftica, en el que cada agente facilito la penetracion adicional y la actividad del otro agente en la estructura del pelo, aunque util, no es necesario para liberar los analitos de interes. El procedimiento resultante es tanto rentable como eficaz en el tiempo respecto a los procedimientos anteriores, al tiempo que proporciona una deteccion sensible de uno o mas analitos de interes. Ademas, el procedimiento resultante se puede usar en ensayos tanto de deteccion selectiva como confirmatorios para analitos de interes y, a modo de ejemplo, tambien es compatible con el inmunoensayo.
De acuerdo con esto, en el presente documento se proporciona para determinar la presencia de un analito en una muestra de estructura queratinizada de un sujeto, que comprende:
(a) proporcionar una muestra de estructura queratinizada lavada opcionalmente;
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
(b) poner en contacto la muestra queratinizada con una solucion acuosa de un agente redactor, en el que el contacto no escinde proteolfticamente la estructura queratinizada, para dar lugar a una solucion de ensayo; y
(c) determinar si el analito esta presente en la solucion de ensayo de la etapa (b).
El procedimiento puede comprender ademas determinar la cantidad del analito en la solucion de ensayo, si esta presente el analito. En algunas realizaciones, el procedimiento puede comprender ademas desactivar el agente reductor residual presente en la solucion de ensayo de la etapa (b) antes de la etapa (c), en la que la desactivacion no escinde proteolfticamente la estructura queratinizada, para dar como resultado una solucion de ensayo desactivada, y determinar si el analito esta presente en la solucion de ensayo desactivada. En algunas realizaciones, el procedimiento puede comprender ademas purificar la solucion de ensayo de la etapa (b) para separar la muestra queratinizada residual de la solucion de ensayo, en el que la purificacion no escinde proteolfticamente la estructura queratinizada, para dar como resultado una solucion de ensayo desactivada, y determinar si el analito esta presente en la solucion de ensayo desactivada.
Tambien se proporciona un procedimiento para determinar la presencia de un analito en una muestra de estructura queratinizada de un sujeto, en el que el procedimiento consiste esencialmente en:
(a) proporcionar una muestra de estructura queratinizada lavada opcionalmente;
(b) poner en contacto la muestra queratinizada con una solucion acuosa de un agente redactor en una solucion de ensayo;
(c) desactivar el agente reductor residual en la solucion de ensayo de (b) para dar como resultado una solucion de ensayo desactivada;
(d) purificar la solucion de ensayo desactivada de la etapa (c) para eliminar la muestra queratinizada residual y para dar como resultado una solucion de ensayo desactivada purificada; y
(e) determinar si el analito esta presente en la solucion de ensayo desactivada purificada de la etapa (d). En algunas realizaciones, el procedimiento puede comprender ademas determinar la cantidad del analito en la solucion de ensayo desactivada purificada, si esta presente el analito.
Tambien se proporciona un procedimiento para determinar la presencia de un analito en una muestra de estructura queratinizada de un sujeto, que comprende:
(a) proporcionar una muestra de estructura queratinizada lavada opcionalmente;
(b) poner en contacto la muestra queratinizada con una solucion acuosa de un agente redactor en una solucion de ensayo; y
(c) determinar si el analito esta presente en la solucion de ensayo,
en el que el procedimiento no comprende poner en contacto la muestra de estructura queratinizada con una enzima proteolftica. El procedimiento puede comprender, ademas, determinar la cantidad del analito en la muestra de ensayo, si el analito esta presente, y/o desactivar el agente reductor residual en la solucion de ensayo y/o purificar la solucion de ensayo para eliminar la muestra queratinizada residual.
Tambien se proporciona un procedimiento para determinar la presencia de un analito en una muestra de estructura queratinizada de un sujeto, que comprende:
(a) proporcionar una muestra de estructura queratinizada lavada opcionalmente;
(b) poner en contacto la muestra queratinizada con una solucion acuosa de un agente redactor en una solucion de ensayo; y
(c) determinar si el analito esta presente en la solucion de ensayo,
en el que el procedimiento no comprende escindir proteolfticamente la muestra de estructura queratinizada. El procedimiento puede comprender, ademas, determinar la cantidad del analito en la muestra de ensayo, si el analito esta presente, y/o desactivar el agente reductor residual en la solucion de ensayo y/o purificar la solucion de ensayo para eliminar la muestra queratinizada residual.
Tambien se proporciona un procedimiento para determinar la presencia de un analito en una muestra de estructura queratinizada de un sujeto, que comprende:
(a) proporcionar una muestra de estructura queratinizada lavada opcionalmente;
(b) tratar la muestra de estructura queratinizada de un modo tal que se reduzcan los puentes disulfuro presentes en la muestra de estructura queratinizada pero que no se escindan los enlaces pepftdicos en la muestra, para dar como resultado una solucion de ensayo; y
(c) determinar si el analito esta presente en la solucion de ensayo. El procedimiento puede incluid, ademas, determinar la cantidad del analito en la muestra de ensayo, si el analito esta presente, y/o desactivar el agente reductor residual en la solucion de ensayo y/o purificar la solucion de ensayo para eliminar la muestra queratinizada residual.
En cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el agente reductor puede comprender DTT o DTE.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
En cualquiera de los procedimientos, la etapa de desactivacion puede comprender poner en contacto la solucion de ensayo con una solucion acuosa de una sal metalica, en la que el cation metalico de la sal se selecciona del grupo que consiste en Cu++, Zn++, Mn++, Fe+++, Fe++, Pb++, Cd++, Hg++, Ag++, As+++ y Co++.
En cualquiera de los procedimientos, la etapa de purificacion puede comprender separar, filtrar o centrifugar la solucion de ensayo.
En cualquiera de los procedimientos, se puede determinar que el analito esta presente o no usando un inmunoensayo espedfico del analito; y en cualquiera de los procedimientos, el inmunoensayo espedfico del analito puede incluir usar un anticuerpo espedfico del analito. En algunas realizaciones, el inmunoensayo es un radioinmunoensayo. En algunas realizaciones, el inmunoensayo es un inmunoensayo enzimatico.
En algunas realizaciones del procedimiento se determina que un analito esta presente o no usando una tecnica de espectrometna de masas.
En algunas realizaciones se determina que un analito esta presente o no usando una tecnica cromatografica.
En algunas realizaciones de los procedimientos, el pH al cual se realiza la etapa de contacto o la etapa de tratamiento es de entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 10,5, por ejemplo el pH al cual se realiza la etapa de contacto o la etapa de tratamiento es de entre aproximadamente 5 a aproximadamente 8,8 y aproximadamente 10,5.
En algunas realizaciones del procedimiento del procedimiento, la temperatura a la cual se realiza la etapa de contacto o de tratamiento es entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 40 °C.
En algunas realizaciones del procedimiento, la etapa de contacto o de tratamiento se produce durante un periodo de tiempo de aproximadamente 0,5 horas a aproximadamente 12 horas, por ejemplo durante un periodo de tiempo de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 horas o durante un periodo de tiempo de aproximadamente 2 horas.
En algunas realizaciones, el analito es una droga o metabolito de la misma, un medicamento de prescripcion o metabolito del mismo, un analgesico o metabolito del mismo, un nutriente o un analito endogeno o una sal de cualquiera de los anteriores.
Una droga o metabolito del mismo se puede seleccionar del grupo que consiste en: cocama, benzoilecgonina, cocaetileno, norcocama, PCP, anfetamina, metanfetamina, cannabinoide, THC, carboxi-THD, heroma, codema, morfina, 6-monoacetilmorfina (MAM), oxicodona, 3,4-metilendoxianfetamina (MDA) y 3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA).
Una muestra de estructura queratinizada puede comprender pelo, una una de los dedos de las manos o una una de los dedos de los pies.
En algunas realizaciones, la muestra de estructura queratinizada, por ejemplo, muestra de cabello, se lava.
En algunas realizaciones, la droga o metabolito de la misma, el medicamento de prescripcion o metabolito del mismo, el analgesico o metabolito del mismo es un opioide, cannabinoide, AlNE, esteroide, anfetamina, benzodiacepina, barbiturico, tridclico o efedrina, o metabolito de los mismos.
A menos que se defina otra cosa, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que un experto en la tecnica a la que la presente divulgacion pertenece entiende habitualmente. En caso de conflicto, la presente especificacion, incluidas las definiciones, tendra prioridad.
Otras caractensticas y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada y a partir de las reivindicaciones.
Breve descripcion de las figuras
La invencion esta definida por las reivindicaciones adjuntas.
Las FIG. 1 y 2 demuestran vistas transversales de pelo para demostrar como resulta la macroestructura compleja a partir del ensamblaje de una serie de estructuras mas pequenas (alfa helices de queratina; protofibrillas enrolladas en superhelice, microfibrillas y microfibrillas), todas las cuales se reticulan extensamente con puentes disulfuro.
Descripcion detallada
En el presente documento se proporcionan procedimientos que permiten la liberacion rapida de uno o mas analitos del pelo de la cabeza o del vello del cuerpo u otras estructuras queratinizadas de un individuo (que previamente ha inferido uno o mas de los analitos), seguido de la identificacion del uno o mas analitos mediante tecnicas analfticas conocidas, incluyendo, por ejemplo, ensayos de receptores altamente sensibles, inmunoensayos o tecnicas instrumentales tales como espectrometna de masas o espectrometna de absorcion atomica. La liberacion del uno o
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
mas analitos en una solucion reductora del interior de la estructura queratinizada se produce sin danar al analito y sin producir efectos daninos sobre la sonda de deteccion del analito usada despues (p. ej., un anticuerpo). Los procedimientos tambien permiten la deteccion de patrones de uso pasados en un sujeto durante periodos extendidos de tiempo sin realizar pruebas repetidas segun sea necesario en procedimientos de ensayo convencionales que miden el contenido del analito en muestras de sangre, orina o fluidos orales. Como se ha sabido previamente, la cantidad de analito atrapado en el pelo del mismo individuo es directamente proporcional a la cantidad de analito ingerido y un analisis transversal de una muestra de pelo puede proporcionar informacion sobre el uso historico.
En los procedimientos, primero se recoge una muestra de estructura queratinizada, por ejemplo pelo, del sujeto, por ejemplo un sujeto que puede haber ingerido un analito concreto o se sospecha que lo ha hecho. Como se usa en el presente documento, el termino "analito” hace referencia a cualquier compuesto, producido de forma endogena o introducido de forma exogena en un sujeto.
Por tanto, en algunas realizaciones se puede introducir un analito en el sujeto de forma exogena, es decir que normalmente no esta presente en el sujeto sino que se introduce mediante un procedimiento exogeno, tal como mediante inhalacion, administracion parenteral (p. ej., vfas i.v., transdermica, subcutanea o i.m.) o ingestion (p. ej., vfas oral, bucal o transmucosa). Como se usa en el presente documento, un metabolito o producto de degradacion de un analito introducido de forma exogena es un analito exogeno de interes, a pesar del hecho de que se fabrique de forma endogena in vivo en un sujeto, porque derivo de un analito introducido de forma exogena.
En algunas realizaciones, un analito de interes puede ser una droga, un medicamento de prescripcion, un analgesico, un compuesto organico, un nutriente, un metal, una sustancia qmmica toxica, un pesticida o un metabolito o producto de degradacion de los mismos introducidos de forma exogena. Ejemplos de drogas, analgesicos o medicamentos de prescripcion o metabolitos de los mismos incluyen un opioide, cannabinoide, AINE, esteroide, anfetamina, benzodiacepina, barbiturico, tridclico o efedrina, o metabolito de los mismos.
Ejemplos espedficos incluyen: cocama, (y los metabolitos benzoilecgonina, cocaetileno y norcocama), opioides y metabolitos de los mismos (morfina, heroma, 6-monoacetilmorfina, diacetilmorfina, codema, oxicodona, hidrocodona, hidromorfona, oximorfona y metadona), cannabinoides, fenciclidina (PCP), anfetaminas, metanfetaminas, MDMA (extasis, metilendioximetanfetamina), MDA (metilendioxianfetamina), marihuana (y THC y metabolitos carboxi-THC), propoxifeno, meperidina, benzodiazepinas, carisoprodol, tramadol, fentanilo, buprenorfina, naltrexona, tridclicos, nicotina (y su metabolito cotinina), eve (metilendioxi-etilafentamina), flunitrazepam, acido lisergico (LSD), digoxina, metilfenidato, acetaminofen, salicilatos, fluoxetina, sertralina, dextrometorfano, efedrina, fenetilaminas, pseudoefedrina y sinefrina. Los pesticidas incluyen, entre otros, paration, malation, clorpirifos, diazinon, diclorvos y tetraclorvinfos.
En otras realizaciones se produce de forma endogena un analito de interes, por ejemplo en una cantidad que se correlaciona con la presencia o ausencia de un estado de enfermedad o un estado metabolico de un sujeto. Ejemplos de analitos endogenos incluyen esteres de acido graso (p. ej., como marcadores de consumo de alcohol); cromo (p. ej., como medida de la tolerancia a la glucosa y la diabetes de tipo 2); glucosa (p. ej., como medida de la tolerancia a la glucosa y la diabetes de tipo 2); y grupos glicosilo (p. ej., como medida de la hiperglucemia cronica).
La muestra queratinizada puede tener un tamano variable desde aproximadamente 4 a aproximadamente 16 mg por ml de solucion de agente reductor, por ejemplo de aproximadamente 5 a aproximadamente 12 mg, de aproximadamente 6 a aproximadamente l0 mg, de aproximadamente 7 a aproximadamente 15 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 10 mg o de aproximadamente 8 a aproximadamente 14 mg por ml de solucion de agente reductor. La muestra se puede lavar primero mediante procedimientos conocidos para eliminar analitos o contaminantes que se pueden haber depositado sobre la superficie mediante contacto externo mas que mediante consumo real.
La muestra de estructura queratinizado se trata despues para liberar analitos atrapados. Es importante el hecho de que el procedimiento de tratamiento de la estructura queratinizada no incluye poner en contacto la estructura queratinizada con una o mas enzimas proteolfticas, tal como papama, quemopapama y proteinasa K. Por tanto, el procedimiento de tratamiento no escinde proteolfticamente los enlaces peptfdicos (amida) en la estructura, por ejemplo no los escinde sustancialmente. En algunas realizaciones, el procedimiento reduce, por ejemplo reduce sustancialmente los enlaces disulfuro presentes en la muestra de estructura queratinizada pero no escinde los enlaces peptfdicos (p. ej., no los escinde sustancialmente) en la muestra. Normalmente, el procedimiento de tratamiento comprende una etapa de reduccion, una etapa de desactivacion opcional y una etapa de purificacion opcional (p. ej., separacion, filtracion o centrifugacion).
En la etapa de reduccion, la muestra se pone en contacto con una solucion de un agente reductor (solucion reductora), tal como ditiotreitol ("DTT"), para reducir los puentes disulfuro inter e intramoleculares en la macroestructura de queratina, de modo que se libere el analito atrapado. En algunas realizaciones, la muestra de estructura queratinizada se puede poner en contacto con una solucion de reduccion que consiste en, esencialmente, el agente reductor, o se puede poner en contacto con una solucion de reduccion que no comprende una enzima proteolttica. En algunas realizaciones, la etapa de contacto no tiene como resultado la rotura sustancial de los enlaces de estructura peptfdica (es decir, enlaces amida) en las cadenas polipeptfdicas de queratina.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Despues de la puesta en contacto con la solucion de reduccion, la muestra de estructura queratinizada reducida se puede tratar opcionalmente para desactivar el agente reductor residual. Como con la etapa de contacto, la etapa de desactivacion se realiza en ausencia de una enzima proteolttica (p. ej., en una solucion que consiste esencialmente en el agente de desactivacion o en una solucion que no comprende una enzima proteolftica).
Con el fin de determinar la presencia y, opcionalmente, la concentracion de uno o mas analitos, se puede obtener una muestra de ensayo de la muestra de estructura queratinizada, bien despues de la etapa de contacto con la solucion de reduccion o bien despues de la etapa de desactivacion opcional. La muestra se puede obtener directamente, despues de la etapa de desactivacion opcional o despues de una etapa de purificacion opcional (p. ej., separacion, centrifugacion o filtracion).
El agente reductor para la inclusion en la solucion de reduccion puede ser cualquier agente reductor capaz de reducir los enlaces disulfuro en las estructuras queratinizadas. Ejemplos tfpicos incluyen DTT (2,3.dihidroxibutano- 1,4-ditiol) o su isomero DTE (2,3-dihidroxibutano-1,4-ditiol), tioglicolato, cistema, sulfitos, bisulfitos, sulfuros, bisulfuros o TCEP (fr/s(2-carboxietil)fosfina), o formas salinas de cualquiera de los anteriores. TCPE puede ser particularmente util en los ensayos realizados a intervalos de pH menores, por ejemplo de 5,5 a aproximadamente 8.
Normalmente, la concentracion del agente reductor en solucion acuosa durante la etapa de contacto es de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 g/l, por ejemplo de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 2 a aproximadamente 14, de aproximadamente 5 a aproximadamente 15, de aproximadamente 10 a aproximadamente 18, de aproximadamente 3 a aproximadamente 12, de aproximadamente 4 a aproximadamente 8 g/l. Como reconocena el experto en la tecnica, la cantidad de agente reductor puede variar segun la duracion del tiempo de reaccion y la metodologfa de deteccion que se va a usar.
En algunas realizaciones, los procedimientos se pueden realizar a la temperatura ambiente o cercana a ella o a un pH casi neutro. Por ejemplo, el procedimiento se puede realizar a una temperatura de entre aproximadamente 20 °C y 60 °C (p. ej., aproximadamente 20, 25, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, o 60 °C) y a un pH de entre aproximadamente pH 5 y aproximadamente 10,5. En algunas realizaciones, el pH del procedimiento esta entre aproximadamente 8,8 y 9,7 (p. ej., 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,45, 9,5, 9,55, 9,6, 9,65) y el procedimiento se produce a una temperatura de aproximadamente 37 °C. En otras realizaciones, por ejemplo cuando un analito de interes o un metabolito o producto de degradacion del mismo es sensible a pH basicos, se puede usar un pH menor, por ejemplo entre aproximadamente 5 a aproximadamente 8,7 (p ej., aproximadamente 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2, 8,4, 8,6, o 8,7). Un experto en la tecnica puede determinar facilmente las condiciones de reaccion adecuadas, incluyendo la temperatura de reaccion, el tiempo y el pH. Para informacion adicional, veanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N° 5.466.579; 5.324.642; 6.022.693; 6.582.924; y 6.949.344, que trata los procedimientos para conservar la estructura qmmica de un analito de interes (p. ej., metabolitos de la heroma, cocama) realizando los ensayos a pH menores.
El DTT y el DTE son particularmente utiles como agentes reductores. Se ha descubierto que el uso de DTT o DTE en los procedimientos descritos tiene como resultado la liberacion de los analitos atrapados dentro de un periodo de tiempo relativamente corto (dependiendo de la cantidad y el tipo de la muestra queratinizada) por ejemplo en de aproximadamente 0,5 a aproximadamente cuatro horas o de aproximadamente 1 hora a aproximadamente cuatro horas o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 horas o de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2,5 horas. En ciertas realizaciones, el tratamiento durante aproximadamente 2 horas es suficiente, por ejemplo para aproximadamente 5 - 15 mg de muestra queratinizada tal como pelo.
Una vez que se han liberado el uno o mas analitos en la mezcla de solucion, el agente reductor activo residual se puede desactivar opcionalmente mediante procedimientos conocidos para los expertos en la tecnica, incluyendo simplemente esperar un periodo de tiempo suficiente para que se produzca de forma natural la desactivacion. Normalmente, este periodo de tiempo es de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 horas despues del contacto inicial del agente reductor con la muestra queratinizada, dependiendo de la concentracion y la cantidad de agente reductor usado, el pH, la temperatura, el tamano de la muestra etc.
Como alternativa, como saben los expertos en la tecnica, el agente reductor residual se puede desactivar con la adicion de ciertos iones metalicos, normalmente en forma de sales metalicas, a la solucion de reduccion. La adicion de cantidades bajas, por ejemplo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,0 g/l en la solucion de muestra final de dichas sales metalicas, a la solucion de reduccion despues de ponerlas en contacto con la muestra puede acelerar significativamente el tiempo en el que la muestra reducida se puede someter al procedimiento de deteccion del analito, ya que no es necesario esperar que el agente reductor se desactive por sf mismo. Los mas eficaces son ciertas sales metalicas que no precipitan en la solucion despues de unirse qmmicamente al agente reductor y desactivarlo, tal como dTt o DTE. Puede ser util evitar la precipitacion en la solucion de reduccion porque dicha precipitacion podna dar lugar a una perdida de analito mediante adsorcion en el precipitado o atrapamiento en el mismo o podna producir interferencias mediante obstruccion con partfculas de procedimientos de lectura optica.
En ciertas realizaciones, la precipitacion tambien se evita manteniendo el pH de la solucion de reduccion de aproximadamente 6 a aproximadamente 8 y lo mas preferentemente a aproximadamente 7. Un modo mediante el cual se puede realizar es mediante la adicion de BIS-TRIS uno molar para mantener el pH en aproximadamente 7.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Un pH de aproximadamente 7 tambien es un pH util para la realizacion de ciertos procedimientos de deteccion de analitos, tales como radioinmunoensayo (RIA) o inmunoensayo enzimatico.
Ademas de las sales de Cu++ (p. ej., sulfato de cobre) como se describe en las patentes de EE.UU. N° 5.466.579 y 5.324.642, las sales de Zn++ (p. ej., sulfato de cinc y nitrado de cinc); Mn++ (p. ej., sulfato de manganeso): Fe+++ (p. ej., sulfato ferrico y cloruro ferrico); y Fe++ (p. ej., sulfato ferroso) son eficaces. Tambien son sales de Pb++ (p. ej., acetato de plomo y nitrato de plomo); Cd++ (p. ej., cloruro de calcio); Hg++ (p. ej., cloruro mercurico); Ag++ (p. ej., nitrato de plata): y Co++ (p. ej., cloruro de cobalto). Veanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 6.022.693 y 6.350.582.
En ciertas realizaciones se puede usar una sal de arsenito, tal como arsenito sodico (NaASO2), para eliminar el agente reductor residual (p. ej., DTT o DTE) mediante la formacion de un compuesto precipitable. Normalmente, a 1 ml de solucion con pelo digerido se anaden 100 microlitros de una solucion de 10 mg/ml de arsenito sodico (concentracion final de aproximadamente 10 g/l) para efectuar la desactivacion del agente reductor. No obstante, no se prefiere el arsenito porque se puede desarrollar un precipitado, de modo que potencialmente se adsorbe o atrapa el analito. Normalmente, se pueden anadir de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1 mg (p. ej., aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o 1 mg) de una sal metalica en solucion a aproximadamente 0,8 a aproximadamente 1,6 ml (p. ej., aproximadamente 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 o 1,6 ml) de la solucion de reduccion en un periodo de tiempo desde aproximadamente 1 a aproximadamente 5 (p. ej., aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 o 5) horas despues de poner en contacto la muestra con la solucion de reduccion. Normalmente, la desactivacion se completa rapidamente, por ejemplo en menos de aproximadamente 30 minutos, tal como en menos de aproximadamente 20 minutos, menos de aproximadamente 10 minutos, menos de aproximadamente 5 minutos o menos de aproximadamente 2 minutos.
Una vez que el tratamiento de la muestra se ha completado, la solucion con la muestra queratinizada reducida se puede someter a analisis directo mediante procedimientos de deteccion de analitos reconocidos, incluidos ensayos de receptores, procedimientos analtticos basados en protemas, tales como inmunoensayos incluidos radioinmunoensayos (RIA) o inmunoensayo enzimatico (EIA) y/o procedimientos instrumentales tales como tecnicas cromatograficas de espectroscopia de masas o absorcion atomica. Por tanto, sorprendentemente se ha descubierto que el agente reductor puede destruir los puentes disulfuro de la queratina pero no destruye las protemas IgG (anticuerpos) usadas en un inmunoensayo.
En determinadas realizaciones se pueden usar procedimientos para confirmar los resultados positivos obtenidos en los procedimientos de inmunoensayo. Dado que estos procedimientos no se basan en protemas, la etapa de desactivacion del agente de reduccion no es necesaria. La velocidad y la suavidad del procedimiento de tratamiento y la capacidad para cuantificar la eficiencia mediante la inclusion de un “contaminante”, es decir la inclusion d e una cantidad conocida del analito deuterado, hace del procedimiento de tratamiento divulgado en el presente documento tambien el procedimiento de eleccion para procedimientos de analisis instrumental, tales como cromatograffa de gases, cromatograffa de lfquidos y espectrometna de masas.
El procedimiento se puede usar para detectar el uso y el uso previo de cualquier analito de interes descrito previamente, incluyendo drogas tales como cocama, morfina/heroma y otros opioides, cannabinoides, marihuana, fenciclidina o “PCP”, metacualona y anfetaminas. Ademas, el procedimiento puede ser eficaz para determinar antes del uso de farmacos tales como digoxina, metadona y benzodiazepinas. Se contempla que cualquier analito, en particular cualquier analito organico, presente en la circulacion sangumea de un individuo que se transfiere al pelo durante su smtesis se puede extraer y analizar de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento.
En ciertas realizaciones se puede usar un detergente para ayudar a la liberacion de uno o mas analitos de interes. Ciertos compuestos detergentes biologicos utiles para solubilizar los componentes de la membrana biologica ayudan a la liberacion de los analitos a un pH relativamente bajo sin interferir en la reduccion o posterior deteccion de analitos. Estos detergentes biologicos pueden ayudar al tratamiento de una muestra queratinizada a un pH en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 10,5. Detergentes adecuados incluyen detergentes de acidos biliares, tales como acido glicocolico, acido colico, acido taurocolico, acido desoxicolico, acido glicodesoxicolico, acido taurodesoxicolico y sales de los mismos, incluidas las sales de sodio. Otros detergentes para usar en los procedimientos son sulfobetamas, tales como los Zwittergents® y betamas, tales como Empigen bB (N-dodecil-N,N- dimetilglicina) (todos disponibles en Calbiochem Corp., La Jolla, CA). Otros detergentes incluyen alquilglucosidos, incluidos hexil-beta-D-glucopiranosido, heptil-beta-D-glucopiranosido, octil-beta-D-glucopiranosido, nonil-beta-D- glucopiranosido, decil-beta-D-glucopiranosido, dodecil-beta-D-glucopiranosido y octil-beta-D-tioglucopiranosido (OSGP). Las mezclas de alquilglucosidos, tales como el producto ELUGENT® (Calbiochem), tambien son eficaces.
Particularmente preferidos son los acidos biliares acido colico y acido glicocolico, que ayudan en la digestion del pelo a un pH en el intervalo de aproximadamente 6,3 a aproximadamente 8. Los desoxicolatos tales como el acido desoxicolico y acido glicodesoxicolico son eficaces en la adicion en la digestion del pelo a un pH superior a aproximadamente 7.
5
10
15
20
25
30
35
40
Los detergentes se pueden usar en el panel estandar de la industria de cinco drogas para las drogas mas frecuentes en Estados Unidos, es decir marihuana, cocama, fenciclidina, metanfetamina y opioides, se pueden medir usando los procedimientos descritos en el presente documento. Por tanto, no afectan a ninguno de los analitos o anticuerpos implicados en el panel de cinco drogas y no tienen como resultado falsos negativos o positivos. Los detergentes concretos mas eficaces para usar en el panel de cinco drogas son colato, desoxicolato, acido colico, acido desoxicolico, octil-beta-D-glucopiranosido y octil-beta-D-tioglucopiranosido. Los detergentes de acidos biliares, alquilglucosidos, sulfobetamas y betamas se prefieren cuando se realizan un panel que incluye cocama, opioides, fenciclidina, anfetaminas y aminas simpaticomimeticas. En un panel unicamente para cocama, los detergentes preferidos son acido colico, Zwittergents®, alquilglucoides y N-dodecil-N,N-dimetilglicina.
En la practica, el detergente biologico se mezcla con la solucion reductora acuosa antes del contacto de la solucion con la muestra queratinizada a un intervalo de temperaturas de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 °C. Normalmente se anaden 1-2 mg de detergente biologico a aproximadamente 1 ml de la solucion de reduccion.
Informacion adicional sobre los procedimientos descritos en el presente documento, incluido el uso de detergentes biologicos, resinas de intercambio ionico (p. ej., para eliminar sustancias de interferencia) y variacion de los intervalos de pH para la digestion, se puede encontrar en las patentes de EE.UU. N° 6.022.693 y 6.350.582.
Los beneficios a obtener de los procedimientos divulgados en el presente documento son muchos, incluidos una determinacion rapida, precisa y barata de la exposicion anterior a un analito concreto. El procedimiento puede proporcionar un registro del consumo, o falta de consumo, durante periodos de tiempo muy largos. Mediante la eliminacion de todas las etapas de tratamiento proteolttico se reducen los gastos de un procedimiento proteolttico y ciertas interferencias con agentes de deteccion de analitos biologicos. Sorprendentemente, no se requiere una interaccion sinergica entre una enzima proteolftica y un agente reductor para la difusion de cada agente en la estructura del pelo para una liberacion eficiente de los analitos de interes. Ademas, la recogida de pelo es menos intrusiva y menos ffsicamente repulsiva que la recoleccion de sangre o de orina y las muestras no se pueden alterar ni sustituir, ni tampoco la deteccion se puede evadir mediante abstencion a corto placo o “lavado” (ingesta excesiva de fluidos) antes de unas pruebas programadas, por ejemplo pruebas previas a un empleo o exploracion ffsica anual. Las muestras se pueden almacenar indefinidamente sin refrigeracion. Por ultimo, los procedimientos facilitan la deteccion selectiva y los ensayos confirmatorios para detectar un analito de interes.
Los ejemplos, que no pertenecen a la invencion, son unicamente para fines ilustrativos.
Ejemplos
Ejemplo I: Radioinmunoensayos de digestos no proteoliticos de muestras de pelo
A 8 mg de muestras de pelo en tubos de ensayo se anadieron 1,6 ml de ditiotreitol al 6 % (pH 9,5) y las muestras se incubaron a 37°C durante 2 horas. Las muestras se neutralizaron despues con 140 ul de Bis Tris 1,0 M (pH 7) que contienen sulfato de cobre pentahidrato al 6 %, se mezclaron y se centrifugaron. Se obtuvieron muestras de sobrenadantes para detectar cocama, opioides, PCP, anfetaminas y cannabinoides.
Los radioinmunoensayos se realizaron combinando almuotas de las muestras con drogas marcadas con I125 y un anticuerpo primario dirigido contra la droga. La droga marcada y no marcada en la muestra compiten por los sitios de union sobre el anticuerpo primario. Despues de la incubacion se anadio un segundo anticuerpo dirigido contra el anticuerpo primario para precipitar la droga unida al anticuerpo. Despues de centrifugar y decantar los sobrenadantes lfquidos, con un contador gamma se contaron las fracciones unidas precipitadas.
Ejemplo de resultados de cocama
Resultados de EM con muestras lavadas; ng/10 mg de pelo**
Porcentaje Resultado de RIA comparativo* COC BE CE NOR
NEGATIVO (Bo)
100
Valor de corte (5 ng/10 mg de pelo)
53,9
Muestra pos. 59498
12,5 12 31,6 13 6,3 1,1
Muestra pos. 59501
22,3 23 12,7 0,7 0 0
(continuacion)
Resultados de EM con muestras lavadas; ng/10 mg de pelo**
Porcentaje Resultado de RIA comparativo* COC BE CE NOR
Muestra pos. 59571
27,8 29 9,4 1,3 0 0,3
Muestra neg. 59718
97,5 97,4
Muestra neg. 59708
91,3 94,9
Muestra neg. 58714
94,6 94,5
menos 50 % control (2,5 ng/10 mg de pelo)
61,5
mas 50 % control (7,5 ng/10 mg de pelo)
44
*Resultado de RIA comparativo usando procedimientos descritos en las patentes de EE.UU. 5.324.642 y 6.350.582. **EM = cuantificacion por espectroscopia de masas de la droga presente en la muestra. COC = cocama; BE=benzoilecgonina; cE=cocaetileno; NOR=norcocama
Nota: Explicacion del porcentaje de B/Bo para los ensayos RIA - El valor negativo (Bo) de 100 % es el valor para el tubo de referencia que no contiene analito en la muestra y exhibe la union maxima del anticuerpo al marcador 5 radiactivo. Las muestras desconocidas se expresan como porcentaje de Bo negativo, denominado “porcentaje B/Bo." Las concentraciones de analito en las muestras vanan inversamente con los valores del porcentaje de B/Bo. Una muestra positiva es una que contiene droga igual o mayor al calibrador de corte y, por tanto, un porcentaje de B/Bo igual o inferior al calibrador de corte.
Ejemplo de resultados de opioides
Resultados de EM con muestras lavadas; ng/10 mg de pelo**
Porcentaje Resultado de RIA comparativo* Codema Morfina MAM Oxicodona
NEGATIVO (Bo)
100
Valor de corte (2 ng/10 mg de pelo)
65
Muestra pos. 59028
30,1 32,8 0,8 7,9 7,8 0,3
Muestra pos. 58641
15,7 9,6 3,6 48,8 85,4 0,8
Muestra pos. 58714
24,3 23,6 4,3 21,3 5,4 0
Muestra neg. 59051
92,8 96
Muestra neg. 59498
98,2 98,2
(continuacion)
Resultados de EM con muestras lavadas; ng/10 mg de pelo**
Porcentaje Resultado de RIA comparativo* Codema Morfina MAM Oxicodona
Muestra neg. 53429
93,6 92,5
menos 50 % control (1 ng/10mg de pelo)
72,9
mas 50 % control (3 ng/10mg de pelo)
53,8
*Resultado de RIA comparativo usando procedimientos descritos en las patentes de EE.UU. 5.324.642 y 6.350.582. **EM = cuantificacion por espectroscopia de masas de la droga presente en la muestra. MAM= 6- monoacetilmorfina
Ejemplo de resultados para pcp
Resultados de EM con muestras lavadas**
Porcentaje Resultado de RIA comparativo* PCP
NEGATIVO (Bo)
100 ng/10 mg de pelo
Valor de corte (3 ng/10 mg de pelo)
59
Muestra pos. 53155
20,2 21,6 22,4
Muestra pos. 53429
17,5 20,1 22,6
Muestra pos. 53151
28,9 25,8 7,6
Muestra neg. 59718
97,3
Muestra neg. 59740
95,7
Muestra neg. 59666
95,5
menos 50 % control (1,5 ng/10mg de pelo)
72,9
mas 50 % control (4,5 ng/10mg de pelo)
49,4
*Resultado de RIA comparativo usando procedimientos descritos en las patentes de EE.UU. 5.324.642 y 6.350.582. **EM = cuantificacion por espectroscopia de masas de la droga presente en la muestra. PCP = fenciclidina
Ejemplo de resultados para anfetaminas
Resultados de EM con muestras lavadas; ng/10 mg de pelo**
Porcentaje Resultado de RIA comparativo MET AMP MDMA MDA MDEA
NEGATIVO (Bo)
100
Valor de corte (5 ng/10 mg de pelo)
56,4
Muestra pos. 59708
8,1 8,9 2,6 0 214 6,7 0
Muestra pos. 59714
16,5 15,4 26,9 3,8 0 0 0
Muestra pos. 59718
36,6 55,5 6,7 0,7 0 0 0
Muestra neg. 59501
93,1 96,8
Muestra neg. 59571
90,8 90
Muestra neg. 59028
95,8 94,9
menos 50 % control (2,5 ng/10mg de pelo)
60,3
mas 50 % control (7,5 ng/10mg de pelo)
47,4
*Resultado de RIA comparativo usando procedimientos descritos en las patentes de EE.UU. 5.324.642 y 6.350.582. **EM = cuantificacion por espectroscopia de masas de la droga presente en la muestra. MET= metanfetamina; AMP= anfetamina; MDA=3,4-metilendioxianfetamina; MDMA=3,4- metilendioximetanfetamina
Ejemplo II: Inmunoensayo enzimaticos de digestos no proteoliticos de muestras de pelo usando microplacas revestidas con anticuerpo disponibles comercialmente
5 A 8 mg de muestras de pelo en tubos de ensayo se anadieron 0,8 ml de ditiotreitol al 1,5 % (pH 9,5) y las muestras se incubaron a 37°C durante 2 horas. Las muestras se neutralizaron despues con 70 ul de Bis Tris 1,0 M (pH 7) que contienen 1,25 % de cinc, se mezclaron y se centrifugaron. Se obtuvieron muestras de sobrenadantes para detectar PCP (fenciclidina) en una microplaca revestida co anticuerpos. Despues de 1 hora de incubacion de la muestra en los pocillos, los pocillos se variaron y se lavaron una vez antes de la adicion de HRP-antigeno y continuaron el 10 procedimiento descrito por el proveedor (Cozart Industries).
Ejemplo de resultados para pcp
Resultados de EM**
Porcentaje PCP
ng/10 mg de pelo
NEGATIVO (Bo)
100
Valor de corte (3 ng/10 mg de pelo)
63,0
Muestra pos. 53155
51,1 22,4
Muestra pos. 53429
53,6 22,6
Muestra pos. 53151
55,2 7,6
Muestra neg. 42647
101,1
Muestra neg. 42650
99,4
Muestra neg. 42665
99,8
Muestra neg. 42677
101,6
menos 50 % control (1,5 ng/10mg de pelo)
78,6
mas 100 % control (6 ng/10 mg de pelo)
53,2
**EM = cuantificacion por espectroscopia de masas de la droga presente en la muestra, PCP= fenciclidina
Ejemplo III: Analisis instrumental de la digestion no proteolitica de pH bajo de muestras de pelo
A 12 mg de pelo en los tubos de ensayo se anadieron 1,2 ml de una solucion Bis-Tris 1,0 M (pH 5,5) que contiene 12 5 % de ditiotreitol y 0,2 % de acido colico. Las muestras se incuban durante la noche (8 - 12 horas) a 37°C con
agitacion a 120 oscilaciones/minuto. Los sobrenadantes de estas muestras digeridas se analizan despues de la limpieza/extraccion para los posteriores procedimientos analtticos (p. ej., EM).
Ejemplo IV: Demostracion de que el agente reductor (p. ej., DTT) es el ingrediente activo en los digestos
Para demostrar que el DTT es el ingrediente activo en los procedimientos de digestion no proteolftica descritos en el 10 presente documento se puso en contacto un almuota de una muestra de pelo positiva para codema con una solucion tamponada con Tris a un pH de 9,5 (sin DTT) y otro almuota de la muestra se puso en contacto con la solucion a un pH de 9,5 que contiene 6 gramos de DTT/l. La solucion a pH de 9,5 sin DTT recupero 2,36 ng de codema por 10 mg de pelo, mientras que la solucion a pH de 9,5 que contiene DTT recupero 19,34 ng de codema por 10 mg de pelo.

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento de determinacion de la presencia de un analito en una muestra de estructura queratinizada de un sujeto, que comprende:
    (a) proporcionar una muestra de estructura queratinizada lavada opcionalmente;
    (b) poner en contacto la muestra queratinizada con una solucion acuosa de un agente reductor que comprende ditiotreitol (DTT) o ditioeritritol (DTE) para dar como resultado una solucion de ensayo,
    en la que la etapa de contacto se realiza a un pH de entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 10,5, y
    (c) determinar si el analito esta presente en la solucion de ensayo,
    en el que el procedimiento no comprende poner en contacto la muestra de estructura queratinizada con una enzima proteolftica o en la que el procedimiento no comprende escindir proteoltticamente la muestra de estructura queratinizada.
  2. 2. El procedimiento de la reivindicacion 1 que ademas comprende determinar la cantidad del analito en la muestra de ensayo, si esta presente el analito.
  3. 3. El procedimiento de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2 que ademas comprende desactivar el agente reductor residual en la solucion de ensayo.
  4. 4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que ademas comprende purificar la solucion de ensayo eliminar la muestra queratinizada residual.
  5. 5. El procedimiento de la reivindicacion 3, en el que la etapa de desactivacion comprende poner en contacto la solucion de ensayo con una solucion acuosa de una sal metalica, en el que el cation metalico de la sal esta seleccionado del grupo que consiste en Cu++, Zn++, Mn++, Fe+++, Fe++, Pb++, Cd++, Hg++, Ag++, As+++ y Co++.
  6. 6. El procedimiento de la reivindicacion 4, en el que la etapa de purificacion comprende separar, filtrar o centrifugar la solucion de ensayo.
  7. 7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que se determina que el analito esta presente o no usando un inmunoensayo espedfico del analito, una tecnica de espectrometna de masas o una tecnica cromatografica.
  8. 8. El procedimiento de la reivindicacion 7, en el que el inmunoensayo espedfico del analito comprende usar un anticuerpo espedfico del analito.
  9. 9. El procedimiento de la reivindicacion 7, en el que el inmunoensayo es un radioinmunoensayo o un inmunoensayo enzimatico.
  10. 10. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el pH al cual se realiza la etapa de contacto o la etapa de tratamiento esta entre aproximadamente 8,8 y aproximadamente 10,5.
  11. 11. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la temperatura a la cual se realiza la etapa de contacto o la etapa de tratamiento esta entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 40 °C.
  12. 12. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa de contacto o de tratamiento se produce durante un periodo de tiempo de aproximadamente 0,5 horas a aproximadamente 12 horas, durante un periodo de tiempo de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 horas o durante un periodo de tiempo de aproximadamente 2 horas.
  13. 13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el analito es una droga o metabolito de la misma, un medicamento de prescripcion o metabolito del mismo, un analgesico o metabolito del mismo, un nutriente o un analito endogeno, o una forma de sal de cualquiera de los anteriores.
  14. 14. El procedimiento de la reivindicacion 13, en el que la droga o metabolito de la misma esta seleccionada del grupo que consiste en: cocama, benzoilecgonina, cocaetileno, norcocama, PCP, anfetamina, metanfetamina, cannabinoide, THC, carboxi-THD, heroma, codema, morfina, 6-monoacetilmorfina (MAM), oxicodona, 3,4- metilendioxianfetamina (MDA) y 3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA), o
    en el que la droga o metabolito de la misma, el medicamento de prescripcion o metabolito del mismo, o el analgesico o metabolito del mismo es un opioide, cannabinoide, AINE, esteroide, anfetamina, benzodiacepina, barbiturico, tridclico o efedrina, o metabolito de los mismos.
  15. 15. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la muestra de estructura queratinizada comprende cabello, una una de los dedos de la mano o una una de los dedos del pie, opcionalmente en el que la estructura queratinizada comprende cabello y la muestra de cabello es lavada.
ES13170392.8T 2008-04-29 2009-04-29 Procedimiento no proteolítico de determinación de analitos en estructuras queratinizadas Active ES2556880T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12/111,914 US8084215B2 (en) 2008-04-29 2008-04-29 Non-proteolytic method for the determination of analytes in keratinized structures
US111914 2008-04-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2556880T3 true ES2556880T3 (es) 2016-01-20

Family

ID=40749835

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES09739654T Active ES2430941T3 (es) 2008-04-29 2009-04-29 Procedimiento no proteolítico de determinación de analitos en estructuras queratinizadas
ES13170392.8T Active ES2556880T3 (es) 2008-04-29 2009-04-29 Procedimiento no proteolítico de determinación de analitos en estructuras queratinizadas

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES09739654T Active ES2430941T3 (es) 2008-04-29 2009-04-29 Procedimiento no proteolítico de determinación de analitos en estructuras queratinizadas

Country Status (11)

Country Link
US (3) US8084215B2 (es)
EP (2) EP2283367B1 (es)
JP (1) JP5405561B2 (es)
CN (1) CN102077093B (es)
BR (1) BRPI0911863B1 (es)
CA (1) CA2723161C (es)
ES (2) ES2430941T3 (es)
HK (2) HK1154654A1 (es)
HU (1) HUE026327T2 (es)
PL (2) PL2637026T3 (es)
WO (1) WO2009134852A1 (es)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2281204B1 (en) * 2008-04-29 2014-01-08 Psychemedics Corporation Solid phase multi-analyte assay for drugs of abuse and their metabolites
US8084215B2 (en) * 2008-04-29 2011-12-27 Psychemedics Corporation Non-proteolytic method for the determination of analytes in keratinized structures
WO2012153773A1 (ja) * 2011-05-09 2012-11-15 積水メディカル株式会社 可溶性ｌｒ１１の免疫学的測定方法
WO2013123236A1 (en) * 2012-02-14 2013-08-22 Purdue Pharma L.P. Systems and methods to quantify analytes in keratinized samples
BR112014032907A2 (pt) * 2012-06-28 2017-06-27 Psychemedics Corp detecção de analitos em amostras de lavagem de cabelo
WO2014117089A1 (en) 2013-01-25 2014-07-31 Case Western Reserve University Compositions and methods for the treatment of pervasive development disorders
ITPI20130026A1 (it) * 2013-04-06 2014-10-07 Univ Pisa Metodo e dispositivo per analisi di droghe d'abuso su materiale cheratinico
US8986939B1 (en) 2013-08-28 2015-03-24 Psychemedics Corporation Integrity testing of hair samples
CN104422607A (zh) * 2013-09-05 2015-03-18 杭州优玛达生物科技有限公司 一种毛发的前处理方法
CN103592400B (zh) * 2013-09-24 2015-07-29 广州正孚检测技术有限公司 毛发中阿片类物质的提取和检测方法
CN110044670B (zh) * 2019-03-27 2022-08-09 广州金域司法鉴定技术有限公司 毛发中毒品提取试剂盒、提取方法和检测方法
CN110987548A (zh) * 2019-10-11 2020-04-10 广州万孚生物技术股份有限公司 毛发中毒品检测方法、前处理试剂与试剂盒
JP2024510109A (ja) 2021-02-19 2024-03-06 インペリアル・カレッジ・イノベーションズ・リミテッド 妊娠中の対象に使用するためのラクトバチルス・クリスパタス組成物
CN115236230B (zh) * 2022-07-21 2024-01-19 司法鉴定科学研究院 一种毛发中野生乌羽玉致幻成分麦司卡林的检测方法

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6582924B1 (en) 1987-12-28 2003-06-24 Psychemedics Corporation Hair analysis method
US6949344B1 (en) 1987-12-28 2005-09-27 Psychemical Corporation Hair analysis method
US6022693A (en) 1987-12-28 2000-02-08 Psychemedics Corporation Hair analysis method
US5466579A (en) 1987-12-28 1995-11-14 Psychemedics Corporation Hair analysis method
US5324642A (en) 1987-12-28 1994-06-28 Psychemedics Corporation Ligand assays of enzymatic hair digests
US4956467A (en) 1988-04-01 1990-09-11 American Cyanamid Company Nucleophilic tertiary organophosphines
JP2837921B2 (ja) 1990-05-22 1998-12-16 サイケメディクス コーポレイション 毛髪分析法
DE19504198A1 (de) 1995-02-09 1996-08-14 Behringwerke Ag Kompetitiver Immuntest unter Verwendung komplexierter Analytderivate
US6231982B1 (en) 1997-12-10 2001-05-15 Dade Behring Inc. Particle reagents having reduced matrix effects and containing an aldehyde-reactive functional group
WO1999042838A1 (en) 1998-02-18 1999-08-26 Dade Behring Inc. Chemiluminescent compositions for use in detection of multiple analytes
US7297554B2 (en) 1998-11-18 2007-11-20 Microdiagnostics, Inc. Immunoassay system
ES2370232T3 (es) 2000-05-04 2011-12-13 Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh Procedimiento para la detección de múltiples analitos.
US7083925B2 (en) 2002-01-11 2006-08-01 Schnabel Robert D Method of parentage testing in North American bison, Bison bison and domestic cattle using microsatellite loci
WO2005017485A2 (en) 2003-05-22 2005-02-24 Agdia, Inc. Multiplex enzyme-linked immunosorbent assay for detecting multiple analytes
EP1718410B1 (en) * 2004-01-28 2013-01-09 Bamburgh Marrsh LLC Specimen sample collection device and test system
EP1769092A4 (en) 2004-06-29 2008-08-06 Europ Nickel Plc IMPROVED LIXIVIATION OF BASE METALS
US20060166376A1 (en) 2005-01-21 2006-07-27 Craig Alan R Compositions for use as a signal generation component and methods of using same
US7629129B1 (en) 2005-04-26 2009-12-08 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Hair follicle bulb as a biodosimeter
US8084215B2 (en) 2008-04-29 2011-12-27 Psychemedics Corporation Non-proteolytic method for the determination of analytes in keratinized structures

Also Published As

Publication number Publication date
EP2637026B1 (en) 2015-09-30
US8329417B2 (en) 2012-12-11
CN102077093B (zh) 2015-03-25
WO2009134852A1 (en) 2009-11-05
HK1188629A1 (zh) 2014-05-09
CN102077093A (zh) 2011-05-25
BRPI0911863B1 (pt) 2023-11-28
PL2283367T3 (pl) 2013-12-31
PL2637026T3 (pl) 2016-03-31
ES2430941T3 (es) 2013-11-22
BRPI0911863A2 (pt) 2015-10-13
US20120094309A1 (en) 2012-04-19
HK1154654A1 (en) 2012-04-27
CA2723161A1 (en) 2009-11-05
EP2283367B1 (en) 2013-06-12
EP2283367A1 (en) 2011-02-16
HUE026327T2 (en) 2016-06-28
JP5405561B2 (ja) 2014-02-05
EP2637026A1 (en) 2013-09-11
US20110104714A1 (en) 2011-05-05
US8435747B2 (en) 2013-05-07
US20090269791A1 (en) 2009-10-29
US8084215B2 (en) 2011-12-27
JP2011519047A (ja) 2011-06-30
CA2723161C (en) 2016-09-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2556880T3 (es) Procedimiento no proteolítico de determinación de analitos en estructuras queratinizadas
ES2244051T3 (es) Deteccion de parasitos transmitidos por el agua utilizando electroquimioluminiscencia.
CA2092917C (en) Hair analysis method
WO1994018561A1 (en) Hair analysis method
US6350582B1 (en) Hair analysis method
JPH02504188A (ja) 複数分析の免疫検定用毛細管装置
ES2452473T3 (es) Ensayo de múltiples analitos en fase sólida para fármacos psicóticos y sus metabolitos
BR102018076467A2 (pt) Detecção de antígeno de trichinella
Edrissian et al. Application of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to identification of Anopheles mosquito bloodmeals
US20140004534A1 (en) Detection of analytes in hair wash samples
CA2004068C (en) Hair analysis method
Moody Immunoassays in forensic toxicology
DSC-MOR SERATEC® Drug Screen MOR
CA1340709C (en) Hair analysis method