BRPI0911863B1

BRPI0911863B1 - Método para determinar a presença de um analito em uma amostra de estrutura queratinizada de um indivíduo

Info

Publication number: BRPI0911863B1
Application number: BRPI0911863-2A
Authority: BR
Inventors: Virginia Hill; Mohammad Atefi; Michael I. Schaffer
Original assignee: Psychemedics Corporation
Priority date: 2008-04-29
Filing date: 2009-04-29
Publication date: 2023-11-28
Also published as: US20090269791A1; US8329417B2; PL2637026T3; US8435747B2; JP5405561B2; EP2637026A1; ES2430941T3; EP2283367A1; HK1154654A1; HUE026327T2; WO2009134852A1; CN102077093A; JP2011519047A; CA2723161C; US20110104714A1; BRPI0911863A2; CN102077093B; US20120094309A1; CA2723161A1; ES2556880T3

Abstract

MÉTODO PARA DETERMINAR A PRESENÇA DE UM ANALITO EM UMA AMOSTRA DE ESTRUTURA QUERATINIZADA DE UM INDIVÍDUO. Métodos que permitem a liberação rápida de um ou mais analitos a partir de cabelos da cabeça ou corpo ou outras estruturas queratinizadas de um indivíduo (que possa ter anteriormente ingerido um ou mais dos analitos) são fornecidos. Os métodos podem incluir contactar a estrutura queratinizada com um agente redutor, mas não com um agente proteolítico. Os métodos podem incluir ainda a identificação e quantificação do um ou mais analitos pelas técnicas analiticas conhecidas tais como imunoensaios. Os métodos descritos não danificam o analito e não causam efeitos nocivos em uma sonda de detecção de analito subsequentemente usada (por exemplo, um anticorpo)

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO RELACIONADO

[0001] Estes pedidos reivindicam prioridade para o Pedido de Patente U.S. Serial No. 12/111.914, depositado em 29 de abril de 2008, os conteúdos inteiros dos quais são por meio deste incorporados por referência.

CAMPO TÉCNICO

[0002] Esta divulgação diz respeito aos materiais e métodos para determinar a presença e quantidade de um ou mais analitos de interesse em estruturas queratinizadas de um paciente, e mais particularmente aos materiais e métodos para os mesmos que não requerem processamento proteolítico das estruturas queratinizadas.

FUNDAMENTO

[0003] Esta divulgação diz respeito a um método analítico melhorado que permite a liberação relativamente rápida e análise direta de analitos, incluindo analitos orgânicos, tais como certas drogas de abuso ou metabólitos destas, presentes no cabelo e outras estruturas queratinizadas, por exemplo, unhas das mãos e unhas dos pés. O método permite a detecção sensível de tais analitos sem afetar a estrutura dos analitos e sem ser prejudiciais para as sondas de analito, por exemplo, sondas de anticorpo, RNA/DNA e bio-receptor, que podem ser usadas para detectar o analito. Por exemplo, em algumas formas de realização, uma sonda de analito pode ser adicionada diretamente a uma estrutura queratinizada que é suspeita conter um ou mais analitos e que foi tratada como aqui descrito. Deste modo, a identidade do um ou mais analitos assim como o grau e duração de consumo do um ou mais analitos por um paciente podem ser avaliados.

[0004] A análise de cabelo e outras estruturas queratinizadas tem certas vantagens em relação às técnicas de análise de urina, sangue ou fluido oral para a detecção de analitos de interesse. Estes incluem facilidade de manuseio e armazenagem, uma janela ampla de detecção, e correlação da presença e quantidade de droga com o tempo de uso e dose ingerida. As técnicas de urina, sangue, e fluido oral são conhecidas serem desvantajosas em que a duração e intensidade de uso ou exposição não podem ser averiguadas. Estas técnicas podem, na melhor das hipóteses, fornecer informação de curta duração com respeito aos analitos ingeridos. Além disso, existem também problemas com a interpretação de tais resultados. Por exemplo, a detecção de um nível baixo de droga ingerida ou metabólito de droga na urina significaria que um paciente ingeriu uma pequena quantidade da droga muito recentemente ou uma quantidade maior vários dias antecipadamente. Assim, o uso de droga crônico tipicamente não pode ser determinado com estes métodos sem testes repetidos.

[0005] Em resposta aos problemas de estabelecer um método confiável e preciso que pudesse medir tanto a duração quanto a intensidade de analitos de interesse, o trabalho realizado pelo Dr. Werner A. Baumgartner, como relatado em “Radioimmunoassay of Hair for Determining Opiate Abuse Histories”, J. Nucl Med 20: 749-752 (1979), determinou que histórias de longa duração de exposição às drogas de abuso podem ser obtidas através da análise de cabelos do corpo de mamíferos, visto que estas substâncias são “aprisionadas” dentro das fibras de cabelo individuais durante a síntese das fibras. A este respeito, o cabelo foi mostrado atuar como um gravador de fita, isto é, histórias de exposição passadas podem ser avaliadas através da análise seccional de amostras de cabelo. Por exemplo, foi descoberto que a morfina, uma vez na corrente sanguínea, encontrará o seu caminho no cabelo conforme o cabelo é sintetizado.

[0006] Uma variedade de produtos químicos, incluindo drogas de abuso, foi determinada ser aprisionada pelo cabelo durante a sua síntese; estas substâncias são “prendidas” no cabelo essencialmente durante a duração da presença do cabelo no corpo. Isto foi descoberto ser verdadeiro para os cabelos da cabeça e do corpo assim como para outras estruturas queratinizadas tais como unhas das mãos; ver Suzuki et al., Forensic Sci. International, 24: 9-16, 1984. Estas substâncias aprisionadas não podem ser removidas pela lavagem do cabelo, e foram anteriormente consideradas ser completamente liberadas apenas na destruição completa ou quase completa, da fibra de cabelo.

[0007] Métodos anteriores de extrair um analito do cabelo incluíram submeter o cabelo a soluções de metanol quente ou incubação de cabelo por horas (usualmente durante a noite) em um meio alcalino ou ácido; Yegles, et al., em: Analytical and Practical Aspects of Drug Testing in Hair, CRC Press, 2007, pp. 73 a 94; Jurado, C. em: Analytical and Practical Aspects of Drug Testing in Hair, CRC Press, 2007, pp. 95-125; Cheze, M. et al. em: Analytical and Practical Aspects of Drug Testing in Hair, CRC Press, 2007, pp. 163 - 185). Métodos anteriores também incluíram o uso de sonificação ou um almofariz e pistilo em conjunção com um solvente para ajudar na extração.

[0008] Os procedimentos de extração com solvente podem sofrer de vários problemas em determinar acuradamente a presença e quantidade de um analito ingerido. Um destes problemas é que os métodos de extração com solvente frequentemente removem apenas uma pequena fração desconhecida e variável do analito total presente na amostra de cabelo. Uma outra desvantagem é que analitos diferentes podem requerer solventes diferentes ou tempos e temperatura diferentes para a extração. Além disso, para a análise pelo imunoensaio os solventes necessitam ser evaporados, e muitos dos solventes são tóxicos e nocivos.

[0009] Outros métodos anteriores utilizaram uma combinação de tratamentos proteolíticos e redutivos para digerir completamente e reduzir as estruturas queratinizadas de modo a liberar o um ou mais analitos. Ver, por exemplo, as Pat. U.S. Nos. 5.466.579, 5.324.642, 6.022.693, 6.582.924, e 6.949.344, que são aqui incorporadas por referência, e que fornecem métodos de detecção exemplares para os ensaios tanto de triagem quanto confirmatórios para analitos de interesse, incluindo métodos de imunoensaio tais como radioimunoensaio e métodos de imunoensaio de enzima. Tais métodos de tratamento proteolíticos e redutivos combinados, embora eficientes, são relativamente caros devido ao custo da enzima proteolítica, que pode também interferir nos ensaios de detecção de analito subsequentes clivando-se proteoliticamente as sondas de detecção de analito tais como anticorpos, impedindo deste modo o uso de certas técnicas analíticas altamente sensíveis ou que requerem o uso de etapas intermediárias de neutralização de protease, separação ou purificação.

[0010] Assim, existe uma necessidade quanto a um método de detecção de analito eficiente e relativamente barato que possa rápida e completamente liberar analitos das estruturas queratinizadas do corpo tais como o cabelo, unhas das mãos e unhas dos pés, e que podem permitir a determinação direta da identidade dos analitos e a sua duração de uso em um paciente, sem destruir ou interferir com os analitos de interesse e/ou sondas de detecção de analito tais como métodos de imunoensaio.

SUMÁRIO

[0011] Estruturas queratinizadas tais como o cabelo são macromontagens complexas de cadeias de polipeptídeo de queratina que são reticuladas com numerosas ligações de dissulfeto, tanto intramolecular quanto intermolecularmente, para fornecer a rigidez e força da estrutura final. O cabelo, por exemplo, é composto de cadeias de polipeptídeo de queratina em espiral espiralada que se montam para formar uma “protofibrila;” várias protofibrilas são depois enfeixadas em um círculo em torno de duas ou mais protofibrilas para formar um cabo de filamento múltiplo conhecido como a “microfibrila;” centenas de tais microfibrilas quando juntas resultam em um feixe fibroso chamado uma “macrofibrila.” As macrofibrilas formam as camadas do córtex (ou o corpo principal) da fibra de cabelo.

[0012] Um analito de interesse pode ser aprisionado em uma das estruturas queratinizadas do paciente conforme estas estruturas crescem. Nos métodos anteriores para detectar analitos embutidos em tais estruturas, métodos tanto proteolíticos quanto redutivos foram usados para digerir totalmente e romper a estrutura queratinizada, clivando a cadeia principal proteinácea de queratina (por exemplo, romper as ligações de amida (ligação de peptídeo) na queratina) e reduzir as ligações de dissulfeto intra- e intermoleculares para sulfidrilas, resultando no desenrolamento, enrolamento, e ruptura peptídica destas macroestruturas de proteína complexa. Foi surpreendentemente descoberto pelos presentes inventores que tal clivagem proteolítica da estrutura queratinizada não é necessária para liberação dos analitos embutidos, e que o tratamento da estrutura queratinizada com um agente redutor tal como Ditiotreitol (“DTT”) na ausência de uma enzima proteolítica é suficiente para liberar os analitos em uma maneira quantitativa quando comparada com métodos anteriores. Assim, os inventores descobriram que a sinergia previamente descrita entre um agente redutor tal como DTT e uma enzima proteolítica, em que cada agente facilitou a penetração adicional e atividade do outro agente dentro da estrutura do cabelo, embora útil, não é requerida para resultar na liberação dos analitos de interesse. O método resultante é eficaz tanto em custo quanto em tempo em relação aos métodos anteriores, enquanto fornece ainda a detecção sensível de um ou mais analitos de interesse. Além disso, o método resultante pode ser usado tanto em ensaios de triagem quanto confirmatórios para analitos de interesse e, por via de exemplo, também é compatível com imunoensaio.

[0013] Consequentemente, é aqui fornecido um método para determinar a presença de um analito em uma amostra de estrutura queratinizada de um paciente que compreende: (a) fornecer uma amostra de estrutura queratinizada opcionalmente lavada; (b) contatar a amostra queratinizada com uma solução aquosa de um agente redutor, onde o contatar não cliva proteoliticamente a estrutura queratinizada, para resultar em uma solução de teste; e (c) determinar se o analito está presente na solução de teste da etapa (b). O método pode compreender ainda determinar a quantidade do analito na solução de teste, se o analito está presente. Em algumas formas de realização, o método pode compreender ainda desativar o agente redutor residual presente na solução de teste da etapa (b) antes da etapa (c), onde o desativar não cliva proteoliticamente a estrutura queratinizada, para resultar em uma solução de teste desativada, e determinar se o analito está presente na solução de teste desativada. Em algumas formas de realização, o método pode compreender ainda purificar a solução de teste da etapa (b) para separar a amostra queratinizada residual da solução de teste, onde a purificação não cliva proteoliticamente a estrutura queratinizada, para resultar em uma solução de teste purificada, e determinar se o analito está presente na solução de teste purificada.

[0014] Também é fornecido um método para determinar a presença de um analito em uma amostra de estrutura queratinizada de um paciente, o método consistindo essencialmente de: (a) fornecer uma amostra de estrutura queratinizada opcionalmente lavada; (b) contatar a amostra queratinizada com uma solução aquosa de um agente redutor para resultar em uma solução de teste; (c) desativar o agente redutor residual na solução de teste de (b) para resultar em uma solução de teste desativada; (d) purificar a solução de teste desativada da etapa (c) para remover a amostra queratinizada residual e para resultar em uma solução de teste desativada, purificada; e (e) determinar se o analito está presente na solução de teste desativada, purificada da etapa (d). Em algumas formas de realização, o método pode compreender ainda determinar a quantidade do analito na solução de teste desativada, purificada, se o analito está presente.

[0015] Também é fornecido um método para determinar a presença de um analito em uma amostra de estrutura queratinizada de um paciente que compreende: (a) fornecer uma amostra de estrutura queratinizada opcionalmente lavada; (b) contatar a amostra queratinizada com uma solução aquosa de um agente redutor para resultar em uma solução de teste; e (c) determinar se o analito está presente na solução de teste,

[0016] onde o método não compreende contatar a amostra de estrutura queratinizada com uma enzima proteolítica. O método pode compreender ainda determinar a quantidade do analito na amostra de teste, se o analito estiver presente, e/ou desativar o agente redutor residual na solução de teste, e/ou purificar a solução de teste para remover a amostra queratinizada residual.

[0017] É fornecido ainda um método para determinar a presença de um analito em uma amostra de estrutura queratinizada de um paciente que compreende: (a) fornecer uma amostra de estrutura queratinizada opcionalmente lavada; (b) contatar a amostra queratinizada com uma solução aquosa de um agente redutor para resultar em uma solução de teste; e (c) determinar se o analito está presente na solução de teste,

[0018] onde o método não compreende clivar proteoliticamente a amostra de estrutura queratinizada. O método pode compreender ainda determinar a quantidade do analito na amostra de teste, se o analito estiver presente, e/ou desativar o agente redutor residual na solução de teste, e/ou purificar a solução de teste para remover a amostra queratinizada residual.

[0019] Também é fornecido um método para determinar a presença de um analito em uma amostra de estrutura queratinizada de um paciente que compreende: (a) fornecer uma amostra de estrutura queratinizada opcionalmente lavada; (b) tratar a amostra de estrutura queratinizada em um tal modo como para reduzir ligações de dissulfeto presentes na amostra de estrutura queratinizada mas não clivar ligações de peptídeo na amostra, para resultar em uma solução de teste; e (c) determinar se o analito está presente na solução de teste. O método pode incluir ainda determinar a quantidade do analito na amostra de teste, se o analito estiver presente, e/ou desativar o agente redutor residual na solução de teste, e/ou purificar a solução de teste para remover a amostra queratinizada residual.

[0020] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, o agente redutor pode compreender DTT ou DTE.

[0021] Em qualquer um dos métodos, a etapa de desativação pode compreender contatar a solução de teste com uma solução aquosa de um sal de metal, onde o cátion de metal do sal é selecionado do grupo que consiste de Cu++, Zn++, Mn++, Fe+++, Fe++, Pb++, Cd++, Hg++, Ag++, As+++, e Co++.

[0022] Em qualquer um dos métodos, a etapa de purificação pode compreender separar, filtrar ou centrifugar a solução de teste.

[0023] Em qualquer um dos métodos, o analito pode ser determinado estar presente ou não usando um imunoensaio específico para o analito; e em qualquer um dos métodos, o imunoensaio específico para o analito pode incluir usar um anticorpo específico para o analito. Em algumas formas de realização, o imunoensaio é um radioimunoensaio. Em algumas formas de realização, o imunoensaio é um imunoensaio de enzima.

[0024] Em algumas formas de realização do método, um analito é determinado estar presente ou não usando uma técnica de espectrometria de massa.

[0025] Em algumas formas de realização, um analito é determinado estar presente ou não usando uma técnica cromatográfica.

[0026] Em algumas formas de realização dos métodos, o pH no qual a etapa de contatar ou a etapa de tratar são realizadas está entre cerca de 5,0 e cerca de 10,5, por exemplo, o pH no qual as etapas de contatar ou de tratar são realizadas está entre cerca de 5 a cerca de 8,8 ou entre cerca de 8,8 e cerca de 10,5.

[0027] Em algumas formas de realização do método, a temperatura no qual a etapa de contatar ou tratar são realizadas está entre cerca de 20° C e cerca de 40° C.

[0028] Em algumas formas de realização do método, as etapas de contatar ou de tratar ocorrem por um período de tempo de cerca de 0,5 horas a cerca de 12 horas, por exemplo, por um período de tempo de cerca de 1 a cerca de 5 horas ou por um período de tempo de cerca de 2 horas.

[0029] Em algumas formas de realização, o analito é uma droga de abuso ou metabólito desta, um remédio de prescrição ou metabólito deste, uma medicação para dor ou metabólito deste, um nutriente ou um analito endógeno ou uma forma salina de qualquer um dos precedentes.

[0030] Uma droga de abuso ou metabólito desta podem ser selecionados do grupo que consiste de: cocaína, benzoilecgonina, cocaetileno, norcocaína, PCP, anfetamina, metanfetamina, canabinóide, THC, carbóxi-THC, heroína, codeína, morfina, 6-monoacetilmorfina (MAM), oxicodona, 3,4-metilenodioxianfetamina (MDA); e 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA).

[0031] Uma amostra de estrutura queratinizada pode compreender cabelo, uma unha da mão ou uma unha do pé.

[0032] Em algumas formas de realização, a amostra de estrutura queratinizada, por exemplo, amostra de cabelo, é lavada.

[0033] Em algumas formas de realização, a droga de abuso ou metabólito desta, remédio de prescrição ou metabólito deste ou medicação para a dor ou metabólito desta é um opióide, canabinóide, NSAID, esteróide, anfetamina, benzodiazepina, barbiturato, tricíclico ou efedrina ou metabólito desta.

[0034] A menos que de outro modo definido, tos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como habitualmente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual esta divulgação pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes a aqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou teste dos métodos presentemente descritos, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência em sua totalidade. No caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo as definições, controlarão. Além disso, os materiais, métodos, e exemplos são apenas ilustrativos e não intencionados a serem limitantes.

[0035] Outras características e vantagens estarão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada, e das reivindicações.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

[0036] As FIGs. 1 e 2 demonstram vistas em seção transversal de cabelo para demonstrar como a sua macroestrutura complexa resulta da montagem de várias estruturas menores (hélices alfa de queratina; protofibrilas enroladas em espiral, microfibrilas, e macrofibrilas), Todas as quais são extensivamente reticuladas com ligações de dissulfeto.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0037] São aqui fornecidos métodos que permitem a liberação rápida de um ou mais analitos do cabelo da cabeça ou corpo ou outras estruturas queratinizadas de um indivíduo (que anteriormente ingeriu um ou mais dos analitos), seguido pela identificação do um ou mais analitos pelas técnicas analíticas conhecidas, incluindo, por exemplo, ensaios de receptor altamente sensíveis, imunoensaios ou técnicas instrumentais tais como espectrometria de massa ou espectrofotometria de absorção atômica. A liberação do um ou mais analitos em uma solução de redução do interior da estrutura queratinizada ocorre sem danificar o analito e sem causar efeitos nocivos sobre uma sonda de detecção de analito subsequentemente usada (por exemplo, um anticorpo). Os métodos também permitem a detecção de padrões de uso passados em um paciente em períodos prolongados de tempo sem realizar testes repetidos como é necessário em métodos de teste convencionais que medem o teor do analito em amostras de sangue, urina ou fluido oral. Como anteriormente conhecido, a quantidade de analito aprisionada no cabelo do mesmo indivíduo é diretamente proporcional à quantidade de analito ingerido, e uma análise seccional de uma amostra de cabelo pode fornecer informação sobre o uso histórico.

[0038] Nos métodos, uma amostra de uma estrutura queratinizada, por exemplo, cabelo, é primeiro coletada de um paciente, por exemplo, um paciente que pode ter ingerido um analito particular ou é suspeito de assim fazê-lo. Como aqui usado, o termo “analito” refere-se a qualquer composto, seja endogenamente produzido ou exogenamente introduzido em um paciente.

[0039] Assim, em algumas formas de realização, um analito de interesse pode ser exogenamente introduzido no paciente, isto é, não normalmente presente no paciente, mas introduzido através de um método exógeno, tal como via inalação, administração parenteral (por exemplo, vias IV, transdérmica, subcutânea ou IM) ou ingestão (por exemplo, vias oral, bucal ou transmucósica). Como aqui usado, um metabólito ou produto da degradação de um analito exogenamente introduzido é um analito exógeno de interesse, a despeito do fato de que o mesmo seja endogenamente fabricado in vivo em um paciente, porque o mesmo foi derivado de um analito exogenamente introduzido.

[0040] Em algumas formas de realização, um analito de interesse pode ser uma droga de abuso exogenamente introduzida, medicação de prescrição, medicação para a dor, composto orgânico, nutriente, metal, produto químico tóxico, pesticida ou um metabólito ou produto da degradação destes. Os exemplos de drogas de abuso, medicações para a dor ou medicações de prescrição ou metabólitos destas, incluem um opióide, canabinóide, NSAID, esteróide, anfetamina, benzodiazepina, barbiturato, tricíclico ou efedrina ou metabólito destes.

[0041] Os exemplos específicos incluem: cocaína (e metabólitos benzoilecgonina, cocaetileno, e norcocaína), opióides e metabólitos destes (morfina, heroína, 6-monoacetilmorfina, diacetilmorfina, codeína, oxicodona, hidrocodona, hidromorfona, oximorfona, e metadona), canabinóides, fenciclidina (PCP), anfetaminas, metanfetaminas, MDMA (ecstasy, metilenodióxi-metanfetamina), MDA (metilenodióxi-anfetamina), maconha (e metabólitos THC e carbóxi-THC), propoxifeno, meperidina, benzodiazepinas, carisoprodol, tramadol, fentanil, buprenorfina, naltrexona, tricíclicos, nicotina (e seu metabólito cotinina), eve (metilenodióxi-etilanfetamina), flunitrazepam, ácido lisérgico (LSD), digoxina, metilfenidato, acetaminofeno, salicilatos, fluoxetina, sertralina, dextrometorfano, efedrina, fenetilaminas, pseudoefedrina, e sinefrina. Pesticidas incluem, sem limitação, paration, malation, clorpirifos, diazinon, diclorvos, e tetraclorvinfos.

[0042] Em outras formas de realização, um analito de interesse é endogenamente produzido, por exemplo, em uma quantidade que se correlaciona com a presença ou ausência de um estado de doença ou estado metabólico de um paciente. Os exemplos de analitos endógenos incluem ésteres de ácido graxo (por exemplo, como marcadores do consumo de álcool); cromo (por exemplo, como medição da tolerância à glicose e diabete tipo 2); glicose (por exemplo, como medição da tolerância à glicose e diabete tipo 2); e grupos glicosila (por exemplo, como uma medição da hiperglicemia crônica).

[0043] A amostra queratinizada pode varia em tamanho de cerca de 4 a cerca de 16 mg por ml de solução de agente redutor, por exemplo, de cerca de 5 a cerca de 12 mg, de cerca de 6 a cerca de 10 mg, de cerca de 7 a cerca de 15 mg, de cerca de 5 a cerca de 10 mg ou de cerca de 8 a cerca de 14 mg por ml de solução de agente redutor. A amostra pode ser primeiro lavada pelos métodos conhecidos para remover analitos ou contaminantes que possam ter sido depositado sobre a superfície pelo contato externo ao invés de pelo consumo real.

[0044] A amostra de estrutura queratinizada é depois tratada para liberar analitos aprisionados. Importantemente, o método de tratamento da estrutura queratinizada não inclui contatar a estrutura queratinizada com uma ou mais enzimas proteolíticas, tais como papaína, quimopapaína, e proteinase K. Assim, o método de tratamento não cliva proteoliticamente ligações de peptídeo (amida) na estrutura, por exemplo, não os cliva substancialmente. Em algumas formas de realização, o método reduz, por exemplo, reduz substancialmente, as ligações de dissulfeto presentes na amostra de estrutura queratinizada mas não cliva as ligações de peptídeo (por exemplo, não as clivam substancialmente) na amostra. Tipicamente, o método de tratamento compreende uma etapa de redução, uma etapa de desativação opcional, e uma etapa de purificação opcional (por exemplo, separação, filtração ou centrifugação).

[0045] Na etapa de redução, a amostra é contatada com uma solução de um agente redutor (solução redutora), tal como Ditiotreitol (“DTT”), de modo a reduzir ligações de dissulfeto inter- e intra-moleculares na macroestrutura da queratina, liberando deste modo o analito aprisionado. Em algumas formas de realização, a amostra de estrutura queratinizada pode ser contatada com uma solução redutora consistindo essencialmente do agente redutor ou pode ser contatada com uma solução redutora que não compreende uma enzima proteolítica. Em algumas formas de realização, a etapa de contatar não resulta na ruptura substancial de ligações da cadeia principal de peptídeo (isto é, ligações de amida) nas cadeias polipeptídicas de queratina.

[0046] Depois de ser contatada com a solução redutora, a amostra de estrutura queratinizada reduzida pode ser opcionalmente tratada para desativar o agente redutor residual. Como com a etapa de contatar, a etapa de desativação é realizada na ausência de uma enzima proteolítica (por exemplo, em uma solução consistindo essencialmente do agente de desativação ou em uma solução que não compreende uma enzima proteolítica).

[0047] De modo a determinar a presença e opcionalmente a concentração de um ou mais analitos, uma amostra de teste podem ser tiradas da amostra de estrutura queratinizada tratada, depois da etapa de contatar com a solução redutora ou depois da etapa de desativação opcional. A amostra pode ser removida diretamente, depois da etapa de desativação opcional ou depois de uma etapa de purificação opcional (por exemplo, separação, centrifugação ou filtração) para remover a amostra queratinizada residual reduzida.

[0048] O agente redutor para a inclusão na solução redutora pode ser qualquer agente redutor capaz de reduzir ligações de dissulfeto em estruturas queratinizadas. Os exemplos típicos incluem DTT (2,3 diidroxibutano-1,4-ditiol) ou seu isômero DTE (2,3 diidroxibutano-1,4-ditiol), tioglicolato, cisteína, sulfitos, bissulfitos, sulfetos, bissulfetos ou TCEP (tris(2-carboxietil)fosfina) ou formas salinas de qualquer um dos precedentes. TCEP pode ser particularmente útil nos ensaios realizados em faixas de pH baixos, por exemplo, de 5,5 a cerca de 8.

[0049] Tipicamente, a concentração do agente redutor em solução aquosa durante a etapa de contatar é de cerca de 1 a cerca de 20 g/L, por exemplo, de cerca de 1 a cerca de 15, de cerca de 2 a cerca de 14, de cerca de 5 a cerca de 15, de cerca de 10 a cerca de 18, de cerca de 3 a cerca de 12, de cerca de 4 a cerca de 8, g/L. Como uma pessoa tendo habilidade comum na técnica reconheceria, a quantidade de agente redutor pode variar com base na duração do tempo de reação e da metodologia de detecção a ser usada.

[0050] Em algumas formas de realização, os métodos podem ser conduzidos na ou próximo da temperatura ambiente e próximo ao pH neutro. Por exemplo, o método pode ser realizado em uma temperatura entre cerca de 20 °C e 60 °C (por exemplo, de cerca de 20, 25, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 ou 60° C) e em um pH entre cerca do pH 5 e cerca de 10,5. Em algumas formas de realização, o pH do método está entre cerca de 8,8 e 9,7 (por exemplo, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,45, 9,5, 9,55, 9,6, 9,65) e o método ocorre em uma temperatura de cerca de 37° C. Em outras formas de realização, por exemplo, onde um analito de interesse ou metabólito ou produto da degradação deste é sensível aos pHs básicos, um pH mais baixo pode ser usado, por exemplo, entre cerca de 5 e cerca de 8,7 (por exemplo, de cerca de 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2, 8,4, 8,6 ou 8,7). As condições de reação apropriadas, incluindo temperatura, tempo, e pH de reação, podem ser facilmente determinados por aqueles tendo habilidade comum na técnica. Para informação adicional, ver, por exemplo, as Pat. U.S. Nos. 5.466.579, 5.324.642, 6.022.693, 6.582.924 e 6.949.344, que são aqui incorporadas por referência, e que debatem métodos para preservar a estrutura química de um analito de interesse (por exemplo, metabólitos de heroína, cocaína) pela realização dos ensaios em pHs mais baixos.

[0051] DTT e DTE são particularmente úteis como agentes redutores. Foi descoberto que o uso de DTT ou DTE nos processos descritos resulta na liberação dos analitos aprisionados dentro de um período relativamente curto de tempo (dependendo da quantidade e tipo de amostra queratinizada), por exemplo, em cerca de 0,5 a cerca de quatro horas ou de cerca de 1 a cerca de 3 horas ou de cerca de 1,5 a cerca de 2,5 horas. Em certas formas de realização, o tratamento por cerca de 2 horas é suficiente, por exemplo, por cerca de 5 a 15 mg de amostra queratinizada tal como cabelo.

[0052] Uma vez que o um ou mais analitos foram liberados na mistura de solução, o agente redutor ativo residual pode ser opcionalmente desativado pelos métodos conhecidos por aqueles tendo habilidade comum na técnica, incluindo simplesmente esperar um período suficiente de tempo para a desativação ocorrer naturalmente. Tipicamente este período de tempo é de cerca de 2 a cerca de 14 horas depois do contato inicial do agente redutor com a amostra queratinizada, dependendo da concentração e quantidade de agente redutor utilizadas, do pH, temperatura, tamanho de amostra, etc.

[0053] Alternativamente, como conhecido por aqueles tendo habilidade comum na técnica, o agente redutor residual pode ser desativado com a adição de certos íons metálicos, tipicamente na forma de sais de metal, à solução redutora. A adição de quantidades baixas, por exemplo, de cerca de 0,1 a cerca de 1,0 g/L na solução de amostra final, de tais sais de metal à solução redutora depois de contatá-la com a amostra pode significantemente acelerar o tempo no qual a amostra reduzida pode ser submetida ao método de detecção de analito, visto que não é necessário esperar que o agente redutor desative a si mesmo. Mais eficazes são certos sais de metal que não precipitam da solução depois de ligar quimicamente com, e desativar o agente redutor, tal como DTT ou DTE. Pode ser útil evitar a precipitação na solução redutora porque tal precipitação resultaria em uma perda de analito pela adsorção ao precipitado ou aprisionamento nesse ponto ou causaria a interferência pela obstrução de particulado de métodos de leitura ótica.

[0054] Em certas formas de realização, a precipitação também é prevenida mantendo-se o pH da solução redutora de cerca de 6 a cerca de 8, e o mais preferivelmente de cerca de 7. Um modo que isto pode ser realizado é pela adição de uma base molar de BIS-TRIS para manter o pH em cerca de 7. Um pH de cerca de 7 também é um pH útil para o desempenho de certos métodos de detecção de analito, tais como radioimunoensaio (RIA) ou imunoensaio de enzima.

[0055] Além dos sais de Cu++ (por exemplo, sulfato de cobre) como descrito nas Pat. U.S. Nos. 5.466.579 e 5.324.642, os sais de Zn++ (por exemplo, sulfato de zinco e nitrato de zinco); Mn++ (por exemplo, sulfato de manganês); Fe+++ (por exemplo, sulfato férrico e cloreto férrico); e Fe++ (por exemplo, sulfato ferroso) são eficazes. Também são eficazes os sais de Pb++ (por exemplo, acetato de chumbo e nitrato de chumbo); Cd++ (por exemplo, cloreto de cádmio); Hg++ (por exemplo, cloreto mercúrico); Ag++ (por exemplo, nitrato de prata); e Co++ (por exemplo, cloreto de cobalto). Ver, por exemplo, as Pat. U.S. Nos. 6.022.693 e 6.350.582.

[0056] Em certas formas de realização, um sal de arsenito, tal como arsenito de sódio (NaAsO2), pode ser utilizado para remover o agente redutor residual (por exemplo, DTT ou DTE) pela formação de um composto precipitável. Tipicamente, 100 microlitros de uma solução de 100 mg/ml de arsenito de sódio são adicionados a 1 ml de solução de digestão de cabelo (concentração final de cerca de 10 g/L) para efetuar a desativação do agente redutor. Entretanto, arsenito não é preferido porque um precipitado pode desenvolver, desse modo potencialmente adsorvendo ou aprisionando o analito. Tipicamente, de cerca de 0,1 a cerca de 1 mg (por exemplo, de cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1 mg) de um sal de metal em solução pode ser adicionado a cerca de 0,8 a cerca de 1,6 ml (por exemplo, de cerca de 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 ou 1,6 ml) de solução redutora em um período de tempo de cerca de 1 a cerca de 5 (por exemplo, de cerca de 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 ou 5) horas depois de contatar a amostra com a solução redutora. Tipicamente, a desativação é rapidamente completada, por exemplo, em menos do que cerca de 30 minutos, tal como em menos do que cerca de 20 min., menos do que cerca de 10 min., menos do que cerca de 5 min. ou menos do que cerca de 2 min.

[0057] Uma vez que o tratamento da amostra é completa, a solução de amostra queratinizada reduzida pode ser submetida à análise direta pelos métodos de detecção de analito reconhecidos na técnica, incluindo ensaios de receptor, métodos analíticos com base em proteína tais como imunoensaio incluindo radioimunoensaio (RIA) ou imunoensaio de enzima (EIA), e/ou métodos instrumentais tais como técnicas cromatográficas de espectroscopia de massa ou absorção atômica. Assim, surpreendentemente foi descoberto que o agente redutor pode destruir as ligações de dissulfeto de queratina mas não destrói as proteínas IgG (anticorpos) utilizadas em um imunoensaio.

[0058] Em formas de realização particulares, métodos instrumentais podem ser usados para confirmar resultados positivos obtidos em métodos de imunoensaio. Porque estes métodos não são fundamentados em proteína, a etapa de desativação de agente redutor não é necessária. A velocidade e suavidade do método de tratamento e a capacidade para quantificar eficiência através da inclusão de um “reforço,” isto é, a inclusão de uma quantidade conhecida de analito deuterado, torna o método de tratamento presentemente divulgado também o método de escolha para os métodos de análise instrumental tais como cromatografia gasosa, cromatografia líquida e espectrometria de massa.

[0059] O método pode ser usado para detectar o uso e uso anterior de qualquer analito de interesse anteriormente descrito, incluindo drogas de abuso tais como cocaína, morfina/heroína e outros opióides, canabinóides, maconha, fenciclidina ou “PCP,” metaqualona, e anfetaminas. Além disso, o método pode ser eficaz em determinar o uso anterior de drogas de prescrição tais como digoxina, metadona e benzodiazepinas. É considerado que qualquer analito, particularmente qualquer analito orgânico, presente na corrente sanguínea de um indivíduo que é transferido para o cabelo durante a sua síntese pode ser extraído e analisado de acordo com os métodos aqui descritos.

[0060] Em certas formas de realização um detergente pode ser usado para ajudar na liberação de um ou mais analitos de interesse. Certos compostos de detergente biológicos úteis para a solubilização de componentes de membrana biológica ajudam na liberação dos analitos em um pH relativamente baixo enquanto não interfere com a redução ou detecção subsequente do analito. Estes detergentes biológicos podem ajudar no tratamento de uma amostra queratinizada em um pH na faixa de cerca de 5 a cerca de 10,5. Os detergentes adequados incluem detergentes de ácido biliar, tais como ácido glicocólico, ácido cólico, ácido taurocólico, ácido desoxicólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurodesoxicólico e sais destes, incluindo sais de sódio. Outros detergentes para o uso nos métodos são sulfo-betaínas, tais como os Zwittergents® e betaínas, tais como Empigen BB (N-dodecil-N,N- dimetilglicina) (todos disponíveis da Calbiochem Corp., La Jolla, CA). Outros detergentes incluem alquilglicosídeos, incluindo hexil-beta-D-glicopiranosídeo, heptil- beta-D-glicopiranosídeo, octil-beta-D-glicopiranosídeo, nonil-beta-D-glico- piranosídeo, decil-beta-D-glicopiranosídeo, dodecil-beta-D-maltosídeo e octil-beta-D- tioglicopiranosídeo (OSGP). Misturas de alquilglicosídeos, tais como o produto ELUGENT® (Calbiochem), também são eficazes.

[0061] Particularmente preferidos são os ácidos biliares, ácido cólico e ácido glicocólico, que ajuda na digestão de cabelo em um pH na faixa de cerca de 6,3 a cerca de 8. Os desoxicolatos tais como o ácido desoxicólico e ácido glicodesoxicólico são eficazes em ajudar na digestão de cabelo em um pH acima cerca de 7.

[0062] Os detergentes podem ser usados no padrão industrial de triagem de cinco drogas para as drogas de abuso mais comuns nos Estados Unidos, isto é, maconha, cocaína, fenciclidina, metanfetamina e opióides, medidos usando os métodos aqui descrito. Assim, eles não impactam nenhum dos analitos ou anticorpos envolvidos na triagem de cinco drogas, e não resultam em falsos negativos ou positivos. Os detergentes particulares mais eficazes para o uso na triagem de cinco drogas são colato, desoxicolato, ácido cólico, ácido desoxicólico, octil-beta-D-glicopiranosídeo e octil-beta-D-tioglicopiranosídeo. Os detergentes do ácido biliar, alquilglicosídeos, sulfobetaínas e betaínas são preferidos quando uma triagem é realizada que inclui cocaína, opióides, fenciclidina, anfetaminas e aminas simpatomiméticas. Em uma triagem unicamente para cocaína, os detergentes preferidos são ácido cólico, Zwittergents®, alquilglicóides, e N-dodecil-N,N dimetilglicina.

[0063] Na prática, o detergente biológico é misturado com a solução redutora aquosa antes do contato da solução com a amostra queratinizada em uma faixa de temperatura de cerca de 30 a cerca de 40° C. Tipicamente, de cerca de 1 a 2 mg de detergente biológico são adicionados para cerca de 1 ml de solução redutora.

[0064] Informação adicional sobre os métodos aqui descritos, incluindo o uso de detergentes biológicos, resinas trocadoras de íon (por exemplo, para remover substâncias interferentes), e faixas de pH variáveis para a digestão, pode ser encontrada nas Pat. U.S. Nos. 6.022.693 e 6.350.582, aqui incorporadas por referência.

[0065] Os benefícios a serem obtidos a partir dos métodos presentemente divulgados são muitos, incluindo uma determinação imediata, precisa, e barata de exposição anterior a um analito particular. O método pode fornecer um registro de consumo ou não consumo, em períodos muito longos de tempo. Pela remoção de qualquer uma das etapas de tratamento proteolítico, tanto os custos de um método proteolítico quanto certas interferências com agentes de detecção de analito biológico são reduzidos. Surpreendentemente, uma interação sinergística entre uma enzima proteolítica e um agente redutor para a difusão de cada agente na estrutura do cabelo não é requerida para a liberação eficiente de analitos de interesse. Além disso, a coleta de cabelo é menos intrusiva e menos fisicamente repulsiva do que a coleta de sangue ou urina, e amostras não podem ser alteradas ou substituídas, nem podem a detecção ser evitada pela abstenção de curta duração ou “inundação” (ingestão de fluido excessiva) antes de um teste programado, por exemplo, teste de pré-utilização ou examinação física anual. As amostras podem ser armazenadas indefinidamente sem refrigeração. Finalmente, os métodos facilitam tanto os ensaios de triagem quanto os confirmatórios para detectar um analito de interesse.

[0066] Os seguintes exemplos são intencionados a serem ilustrativos e não limitam as reivindicações.

EXEMPLOS EXEMPLO I: Radioimunoensaios de Digestões Não Proteolíticas de Amostras de cabelo

[0067] A 8 mg de amostras de cabelo em tubos de teste 1,6 ml de Ditiotreitol a 6 % (pH 9,5) foram adicionados e as amostras incubadas a 37° C por 2 horas. As amostras foram depois neutralizadas com 140 μl de Bis Tris a 1,0 M (pH 7) contendo 6 % de Sulfato de Cobre Pentaidratado, misturadas, e centrifugadas. Os sobrenadantes foram amostrados para serem ensaiados quanto Cocaína, Opióides, PCP, Anfetaminas, e Canabinóides.

[0068] Os radioimunoensaios foram realizados combinando-se alíquotas de amostra com droga rotulada com I125 e um anticorpo primário direcionado contra a droga. A droga rotulada e não rotulada na amostra compete quanto aos sítios de ligação no anticorpo primário. Depois da incubação, um segundo anticorpo direcionado contra o anticorpo primário foi adicionado para precipitar a droga ligada ao anticorpo. Depois da centrifugação e decantagem dos sobrenadantes líquidos, as frações ligadas ao precipitado foram contadas em um contador gama. RESULTADOS DE COCAÍNA DO EXEMPLO *Resultado de RIA comparativo usand o os métodos descritos nas Pat. U.S. Nos.; 5.324.642 e 6.350.582. * *MS = Quantificação espectrométrica de massa de droga presente na amostra. COC = cocaína; BE = benzoilecgonina; CE = cocaetileno; NOR = norcocaína Nota: Explicação de B/Bo Percentual para os ensaios de RIA - O valor (Bo) Negativo de 100 % é o valor para o tubo de referência não contendo nenhum analito na amostra e exibe ligação máxima de anticorpo ao traçador radioativo. As amostras desconhecidas são expressadas como porcentagem do Bo Negativo, chamada de “B/Bo Percentual.” As concentrações de analito nas amostras variam inversamente com valores B/Bo Percentuais. Uma amostra positiva é uma contendo droga igual a ou maior do que o calibrador de corte e assim um B/Bo Percentual igual a ou mais baixo do que o calibrador de corte. RESULTADOS DE OPIÓIDE DE EXEMPLO *Resultado de RIA comparativo usando os métodos descritos nas Pat. U.S. Nos.; 5.324.642 e 6.350.582. * *MS = Quantificação espectrométrica de massa de droga presente na amostra. MAM = 6-monoacetilmorfina RESULTADOS DE EXEMPLO PARA PCP *Resultado de RIA comparativo usando os métodos d escritos nas Pat. U.S. Nos.; 5.324.642 e 6.350.582. * *MS = Quantificação espectrométrica de massa de droga presente na amostra. PCP = fenciclidina RESULTADOS DE EXEMPLO PARA ANFETAMINAS *Resultado de RIA comparativo usando os métodos descritos nas Pat. U.S. Nos.; 5.324.642 e 6.350.582. MDMA = 3,4-metilenodioximetanfetamina

EXEMPLO II: Imunoensaio de Enzimas De Digestões Não Proteolíticas De Amostras de Cabelo Usando Microplacas Revestidas de Anticorpo Comercialmente Disponíveis

[0069] A 8 mg de amostras de cabelo nos tubos de teste 0,8 ml de 1,5 % de Ditiotreitol (pH 9,5) foi adicionada e as amostras incubadas a 37° C por 2 horas. As amostras foram depois neutralizadas com 70 μl de 1,0 Bis-Tris (pH 7) contendo 1,25 % de Zinco, misturadas, e centrifugadas. Os sobrenadantes foram amostrados para serem ensaiados quanto a PCP (fenciclidina) em uma microplaca revestida com anticorpo. Depois de 1 hora de incubação de amostra nos reservatórios, os reservatórios foram esvaziados e lavados uma vez antes da adição de HRP- antígeno e continuação do método descrito pelo vendedor (Cozart Industries). RESULTADOS DO EXEMPLO PARA PCP **MS = Quantificação espectrométrica de massa de droga presente na amostra. PCP = fenciclidina

EXEMPLO III: Análise Instrumental de Digestão Não Proteolítica de pH baixo de Amostras de Cabelo

[0070] A 12 mg de cabelo em tubos de teste foi adicionado 1,2 ml de uma solução Bis-Tris de 1,0 M (pH 5,5) contendo 12 % de Ditiotreitol e 0,2 % de Ciclidina. As amostras são incubadas durante a noite (8 a 12 horas) a 37° C com agitação a 120 oscilações/minuto. Os sobrenadantes destas amostras digeridas são analisados depois da limpeza/extração pelos procedimentos analíticos subsequentes (por exemplo, MS).

EXEMPLO IV: Demonstração de que o Agente Redutor (por exemplo, DTT) é o Ingrediente Ativo nas Digestões

[0071] Para demonstrar que DTT é o ingrediente ativo nos métodos de digestão não proteolíticos presentemente descritos, uma alíquota de uma amostra de cabelo positiva em codeína foi contatada com uma solução tamponada com Tris no pH 9,5 (não contendo nenhum DTT), e uma outra alíquota da amostra foi contatada solução no pH 9,5 contendo 6 gramas de DTT/L. A solução de pH 9,5 sem DTT recuperou 2,36 ng de codeína por 10 mg de cabelo, enquanto que a solução no pH 9,5 contendo DTT recuperou 19,34 ng de codeína por 10 mg de cabelo.

OUTRAS FORMAS DE REALIZAÇÃO

[0072] Várias formas de realização foram descritas. Não obstante, será entendido que várias modificações podem ser feitas sem divergir do espírito e escopo da divulgação aqui fornecida. Consequentemente, outras formas de realização estão dentro do escopo das seguintes reivindicações.

Claims

1. Método para determinar a presença de um analito em uma amostra de estrutura queratinizada de um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer uma amostra de estrutura queratinizada opcionalmente lavada; (b) contatar a amostra queratinizada com uma solução aquosa de um agente redutor, em que o agente redutor compreende DTT ou DTE e em que a ligação de peptídeo da estrutura queratinizada permanece intacta após o contato e em que a etapa de contatar é realizada em um pH de 8,8 a 10,5, para resultar em uma solução de teste; e (c) determinar se o analito está presente na solução de teste da etapa (b).

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, para determinar a presença de um analito em uma amostra de estrutura queratinizada de um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer uma amostra de estrutura queratinizada opcionalmente lavada; (b) tratar a amostra de estrutura queratinizada de tal modo a reduzir as ligações de dissulfeto presentes na amostra de estrutura queratinizada, mas permitir as ligações de peptídeo na amostra de permanecer intactas, para resultar em uma solução de teste, em que a etapa de tratar é realizada em um pH de 8,8 a 10,5; e (c) determinar se o analito está presente na solução de teste.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, para determinar a presença de um analito em uma amostra de estrutura queratinizada de um indivíduo, caracterizado pelo fato de que consiste essencialmente de: (a) fornecer uma amostra de estrutura queratinizada opcionalmente lavada; (b) contatar a amostra queratinizada com uma solução aquosa de um agente redutor para resultar em uma solução de teste, em que a etapa de contatar é realizada em um pH de 8,8 a 10,5; (c) desativar o agente redutor residual na solução de teste de (b) para resultar em uma solução de teste desativada; (d) purificar a solução de teste desativada da etapa (c) para remover a amostra queratinizada residual e para resultar em uma solução de teste desativada, purificada; e (e) determinar se o analito está presente na solução de teste desativada, purificada da etapa (d).

4. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda determinar a quantidade do analito na amostra de teste, se o analito estiver presente.

5. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda desativar o agente redutor residual na solução de teste.

6. Método de acordo com as reivindicações 3 ou 5, caracterizado pelo fato de que a etapa de desativação compreende contatar a solução de teste com uma solução aquosa de um sal de metal, em que o cátion de metal do sal é selecionado do grupo que consiste em Cu++, Zn++, Mn++, Fe+++, Fe++, Pb++, Cd++, Hg++, Ag++, As+++, e Co++.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda purificar a solução de teste para remover a amostra queratinizada residual.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 6, caracterizado pelo fato de que a etapa de purificação compreende separar, filtrar ou centrifugar a solução de teste.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o analito é determinado estar presente ou não usando um imunoensaio específico para o analito.

10. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o imunoensaio específico para o analito compreende o uso de um anticorpo específico para o analito.

11. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o imunoensaio é um radioimunoensaio.

12. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o imunoensaio é um imunoensaio de enzima.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o analito é determinado estar presente ou não usando uma técnica de espectrometria de massa.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o analito é determinado estar presente ou não usando uma técnica cromatográfica.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o pH no qual a etapa de contatar ou a etapa de tratar são realizadas está entre pH 8,8 e 9,7.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o pH no qual a etapa de contatar ou de tratar é realizada está entre pH 8,8 a 9,5.

17. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o pH no qual a etapa de contatar ou de tratar é realizada está entre pH 9,4 e 9,7.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a temperatura na qual as etapas de contatar ou tratar são realizadas está entre 20° C e cerca de 40° C.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a etapa de contatar ou de tratar ocorre por um período de tempo de 0,5 horas a 12 horas.

20. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a etapa de contatar ou de tratar ocorre por um período de tempo de 1 a 5 horas.

21. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a etapa de contatar ou de tratar ocorre por um período de tempo de 2 horas.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o analito é uma droga de abuso ou metabólito da mesma, um remédio de prescrição ou metabólito do mesmo, uma medicação para dor ou metabólito da mesma, um nutriente ou um analito endógeno ou uma forma salina de qualquer um dos precedentes.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a droga de abuso ou metabólito da mesma é selecionada(o) do grupo que consiste em: cocaína, benzoilecgonina, cocaetileno, norcocaína, PCP, anfetamina, metanfetamina, canabinóide, THC, carbóxi-THC, heroína, codeína, morfina, 6-monoacetilmorfina (MAM), oxicodona, 3,4-metilenodioxianfetamina (MDA); e 3,4-metilenodioxi- metanfetamina (MDMA).

24. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a droga de abuso ou metabólito da mesma, remédio de prescrição ou metabólito do mesmo ou medicação para a dor ou metabólito do mesmo é um opióide, canabinóide, NSAID, esteróide, anfetamina, benzodiazepina, barbiturato, tricíclico ou efedrina ou metabólito dos mesmos.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a amostra de estrutura queratinizada compreende cabelo, uma unha da mão ou uma unha do pé.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a amostra de estrutura queratinizada compreende cabelo.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a amostra de cabelo é lavada.