BRPI0911552B1 - métodos para determinar a presença de um analito de interesse, e de uma pluralidade de analitos de interesse diferentes, e, composição - Google Patents

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Abstract

"métodos para determinar a presença de um analito de interesse, de uma pluralidade de analitos de interesse diferentes, e de pelo menos um membro de uma classe de drogas de interesse" composições e métodos para detectar a presença e/ou quantidade de um ou mais analitos, incluindo analitos tais como drogas de abuso, são fornecidos. as composições incluem dois ou mais analitos associados com uma fase sólida, por exemplo, uma partícula ou uma placa de reservatório múltiplo. as composições e métodos também permitem a determinação simultânea, em tandem ou serial da presença e/ou quantidade de dois ou mais analitos de interesse em uma amostra.

Description

“MÉTODOS PARA DETERMINAR A PRESENÇA DE UM ANALITO DE INTERESSE, E DE UMA PLURALIDADE DE ANALITOS DE INTERESSE DIFERENTES, E, COMPOSIÇÃO”
REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS [0001] Este pedido reivindica prioridade sob 35 USC §119(e) para o Pedido de Patente U.S. Serial No. 61/048.892, depositado em 29 de abril de 2008, os conteúdos inteiros dos quais são por meio deste incorporados por referência.
CAMPO TÉCNICO [0002] Esta divulgação diz respeito a métodos e composições para determinar a presença e/ou quantidade de um ou mais análitos (por exemplo, drogas de abuso, produtos químicos tóxicos, remédios de prescrição) em uma amostra (por exemplo, uma amostra corporal ou uma amostra não corporal), e mais particularmente aos métodos e composições para fazer os mesmos usando imunoensaios competitivos. Em algumas formas de realização, os métodos e composições podem ser usados para determinar a presença e/ou quantidade de dois ou mais análitos em uma amostra simultaneamente, em tandem ou em série. As composições de análito de fase sólida que compreendem dois ou mais análitos diferentes ligados a uma fase sólida são descritas, assim como métodos para usar as mesmas em imunoensaios competitivos, para determinar a presença e quantidade de um ou mais análitos de interesse. FUNDAMENTOS [0003] Imunoensaios tais como radioimunoensaios (RIA) e imunoensaios de enzima (EIA) são métodos úteis para determinar a presença, identidade, e quantidade de um ou mais análitos de interesse em uma amostra. Muitos imunoensaios imobilizam um anticorpo específico para um análito de interesse em uma fase sólida, por exemplo, uma microplaca ou pérola; a ligação entre o anticorpo ligado e o analito presente em uma amostra é detectada, tal como através do uso de um ensaio intercalado. Outros imunoensaios imobilizam o analito; estes imunoensaios podem ser aludidos como imunoensaios de antígeno de fase sólida ou analito de fase sólida. Nos imunoensaios de analito de fase sólida, o analito de fase sólida compete com o analito presente em uma amostra quanto a ligação a um anticorpo específico para o analito.
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Tipicamente em tais ensaios de analito de fase sólida, o anticorpo é detectável em algumas maneiras, por exemplo, o mesmo é rotulado, tal como radioativa, fluorescente, luminescente ou enzimaticamente (por exemplo, uma reação enzimática ocorre na presença de um substrato apropriado, resultando em uma mudança de cor) rotulado ou a sua presença é detectada via um anticorpo secundário que por si só é rotulado.
[0004] De modo a determinar se uma amostra particular conteve mais do que um analito de interesse, métodos anteriores tipicamente utilizaram componentes de fase sólida separadas (por exemplo, microplacas separadas ou conjuntos de micropérolas), com cada componente de fase sólida contendo um anticorpo específico ligado para um analito particular ou com cada componente de fase sólida contendo um único tipo de analito ligado. Uma tal necessidade para separar componentes de fase sólida para cada analito torna o ensaio de analito múltiplo caro, tecnicamente complexo, e consumidor de tempo. Existe uma necessidade quanto a um método de detecção de analito eficiente e relativamente barato que pode rapidamente determinar a presença e/ou quantidade de um ou mais analitos, incluindo analitos tais como drogas de abuso, em uma amostra.
SUMÁRIO [0005] Os imunoensaios são ferramentas poderosas para detectar a presença e/ou quantidade de analitos em ou suspeitos de estar em, uma amostra. A capacidade para detectar analitos múltiplos em uma amostra, entretanto, tipicamente requer o uso de ensaios separados múltiplos, por exemplo, um por analito de interesse, aumentando assim custo, tempo, e complexidade técnica do procedimento, e levando a erros de operador potenciais durante uma das etapas múltiplas. Os inventores surpreendentemente descobriram que o uso de composições de analito de fase sólida que compreendem pelo menos dois analitos ligados à fase sólida facilita o desempenho de ensaios de analito múltiplo exibindo altas sensibilidades e eficácias. Os ensaios de analito múltiplo aqui descritos são flexíveis, e podem ser realizados simultaneamente, em série ou em tandem, resultando em custo, tempo, e complexidade reduzidos do procedimento.
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3/33 [0006] Consequentemente, é aqui fornecido um método para determinar a presença de um analito de interesse em uma amostra que compreende:
(a) contatar uma composição de analito de fase sólida, em que a composição de analito de fase sólida compreende pelo menos dois analitos diferentes associados com um suporte de fase sólida, em que um dos pelo menos dois analitos diferentes é o analito de interesse, com:
i) um anticorpo, em que o anticorpo é específico para o analito de interesse; e ii) uma amostra; e (b) determinar se o analito de interesse está presente na amostra.
[0007] Em algumas formas de realização, a composição de analito de fase sólida é primeiro contatada com a amostra, e depois com o anticorpo. Em algumas formas de realização, o anticorpo é detectavelmente rotulado, por exemplo, detectavelmente rotulado com um rótulo fluorescente, luminescente (incluindo quimioluminescente ou bioluminescente), radioativo ou enzimático. Em algumas formas de realização, o anticorpo não é rotulado.
[0008] Em algumas formas de realização, o método compreende remover o anticorpo que não está ligado à composição de analito de fase sólida.
[0009] Em algumas formas de realização, o método compreende determinar a quantidade de analito presente, se o analito estiver presente.
[0010] Em algumas formas de realização, o analito é determinado estar presente na amostra pela comparação de um sinal gerado pelo anticorpo ligado à composição de analito de fase sólida na amostra com um sinal gerado pelo anticorpo ligado à composição de analito de fase sólida em uma amostra de controle que não compreende o analito de interesse.
[0011] Em algumas formas de realização, o sinal gerado pelo anticorpo ligado à composição de analito de fase sólida é derivado de um rótulo detectável no anticorpo. [0012] Em algumas formas de realização, o sinal gerado pelo anticorpo ligado à composição de analito de fase sólida é derivado da ligação de um anticorpo
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4/33 secundário ao anticorpo, em que o anticorpo secundário é detectavelmente rotulado. [0013] Em algumas formas de realização, o rótulo detectável é um rótulo fluorescente, luminescente (incluindo quimioluminescente ou bioluminescente), radioativo ou enzimático.
[0014] Em algumas formas de realização, o método compreende ainda contatar a composição de analito de fase sólida com um segundo anticorpo, onde o segundo anticorpo é específico para o pelo menos segundo analito diferente associado com a fase sólida, e determinar se o segundo analito está presente na amostra.
[0015] Em algumas formas de realização do método, os pelo menos dois analitos diferentes estão associados com a fase sólida de modo não covalente, direta ou indiretamente.
[0016] Em algumas formas de realização, os pelo menos dois analitos diferentes estão associados com a fase sólida de modo covalente, direta ou indiretamente.
[0017] Em algumas formas de realização, os pelo menos dois analitos diferentes estão associados com a fase sólida via adsorção, direta ou indiretamente.
[0018] Em algumas formas de realização, os pelo menos dois analitos diferentes são de modo covalente ligados a um agente de ligação que está associado com a fase sólida de modo não covalente ou via adsorção.
[0019] Em algumas formas de realização, o agente de ligação é selecionado de HSA e BSA.
[0020] Em algumas formas de realização, os pelo menos dois analitos diferentes são drogas de abuso ou metabólitos destas. Uma droga de abuso ou metabólitos destas podem ser selecionados de cocaína, benzoilecgonina, cocaetileno, norcocaína, PCP, anfetamina, metanfetamina, canabinóides, THC, carbóxi-THC, heroína, codeína, morfina, 6-monoacetilmorfina (MAM), oxicodona, 3,4metilenodioxianfetamina (MDA); e 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA).
[0021] Uma amostra pode ser uma amostra corporal ou uma amostra derivada de uma amostra corporal.
[0022] Uma amostra corporal pode ser de um ser humano, e é selecionado de uma amostra de tecido do cérebro, coração, pulmão, rim, fígado, músculo, osso,
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5/33 estômago, intestinos, e pele; um fluido biológico selecionado de urina, sangue, plasma, soro, saliva, sêmen, catarro, fluido espinhal cerebral, muco, suor, líquido vítreo, e leite; e uma estrutura queratinizada.
[0023] Um suporte sólido pode ser um micro-reservatório de uma microplaca. [0024] Também é fornecido um método para determinar a presença de uma pluralidade de analitos de interesse diferentes, representados pelo número “N”, em uma amostra, o método compreendendo:
(a) contatar uma composição de analito de fase sólida, em que a composição de analito de fase sólida compreende pelo menos “N” analitos diferentes associados com um suporte de fase sólida, em que os pelo menos “N” analitos diferentes associados incluem a pluralidade de analitos de interesse, com:
i) uma pluralidade de anticorpos, em que a pluralidade de anticorpos compreende um anticorpo específico para cada analito de interesse diferente; e ii) uma amostra; e (b) determinar se cada analito de interesse diferente na pluralidade está presente na amostra.
[0025] Em algumas formas de realização, os anticorpos específicos para cada analito de interesse diferente são separadamente detectáveis. Em algumas formas de realização, os anticorpos são detectavelmente rotulados com um rótulo fluorescente, luminescente (incluindo quimioluminescente ou bioluminescente), radioativo ou enzimático.
[0026] Em algumas formas de realização, o método inclui determinar a quantidade de cada analito de interesse diferente, se presente.
[0027] Em algumas formas de realização, cada analito de interesse diferente é determinado estar presente na amostra pela comparação de um sinal gerado pelo anticorpo específico para um analito de interesse particular ligado à composição de analito de fase sólida na amostra com um sinal gerado pelo mesmo anticorpo ligado à composição de analito de fase sólida em uma amostra de controle que não
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6/33 compreende o analito de interesse particular.
[0028] Em algumas formas de realização, a pluralidade de anticorpos é contatada com a composição de analito de fase sólida simultaneamente.
[0029] Em algumas formas de realização, pelo menos uma da pluralidade de anticorpos é contatada com a composição de analito de fase sólida em um tempo diferente do que pelo menos uma outra da pluralidade de anticorpos.
[0030] Também é fornecida uma composição que compreende pelo menos dois analitos diferentes associados com uma fase sólida. Os pelo menos dois analitos diferentes podem ser de modo covalente ligados à fase sólida, direta ou indiretamente. Os pelo menos dois analitos diferentes podem ser de modo não covalente ligados à fase sólida, direta ou indiretamente.
[0031] Em algumas formas de realização, uma composição compreende de 2 a 10 analitos diferentes associados com uma fase sólida. Em algumas formas de realização, os pelo menos dois analitos diferentes são analitos de droga de abuso ou metabólitos desta. Em algumas formas de realização, os pelo menos dois analitos diferentes são selecionados de cocaína, benzoilecgonina, cocaetileno, norcocaína, PCP, anfetamina, metanfetamina, canabinóides, THC, carbóxi-THC, heroína, codeína, morfina, 6-monoacetilmorfina (MAM), oxicodona, 3,4-metilenodióxianfetamina (MDA); e 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA).
[0032] É fornecido ainda um kit que compreende uma composição como aqui descrita, e pelo menos um anticorpo específico para pelo menos um dos dois analitos diferentes associados com a fase sólida. Em algumas formas de realização, o kit pode incluir pelo menos um anticorpo específico para um analito selecionado do grupo que consiste de: cocaína, benzoilecgonina, cocaetileno, norcocaína, PCP, anfetamina, metanfetamina, canabinóides, THC, carbóxi-THC, heroína, codeína, morfina, 6monoacetilmorfina (MAM), oxicodona, 3,4-metilenodióxi-anfetamina (MDA); e 3,4metilenodioximetanfetamina (MDMA).
[0033] Também é fornecido um método para determinar a presença de um analito de interesse ou um ou mais metabólitos destes em uma amostra que compreende:
(a) contatar uma composição de analito de fase sólida, em que a
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7/33 composição de analito de fase sólida compreende pelo menos dois analitos diferentes associados com um suporte de fase sólida, em que um dos pelo menos dois analitos diferentes é o analito de interesse, com:
i) um anticorpo, em que o anticorpo é específico para o analito de interesse e é capaz ainda de ligar-se a um ou mais metabólitos do analito de interesse; e ii) uma amostra; e (b) determinar se o analito de interesse ou um ou mais metabólitos deste estão presentes na amostra.
[0034] É fornecido ainda um método para determinar a presença de pelo menos um membro de uma classe de droga de interesse em uma amostra que compreende:
(a) contatar uma composição de analito de fase sólida, em que a composição de analito de fase sólida compreende pelo menos dois analitos diferentes associados com um suporte de fase sólida, em que um dos pelo menos dois analitos diferentes é um membro da classe de droga de interesse, com:
i) um anticorpo, em que o anticorpo é específico para o membro da classe de droga de interesse e é capaz ainda de ligar-se a um ou mais outros membros da classe de droga de interesse ou a um ou mais metabólitos de um membro da classe de droga de interesse; e ii) uma amostra; e (b) determinar se pelo menos um membro da classe de droga de interesse está presente na amostra.
[0035] Em qualquer um dos métodos, os pelo menos dois analitos diferentes podem ser selecionados de drogas de abuso, produtos químicos tóxicos, produtos químicos ambientais, produtos de petróleo, produtos naturais, compostos orgânicos, nutrientes, medicações com prescrição e de venda livre (do inglês, over-the-counter) ou metabólitos, derivados ou produtos da decomposição de qualquer um dos precedentes.
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8/33 [0036] Em algumas formas de realização dos métodos, os pelo menos dois analitos diferentes podem ser selecionados de opióides, anfetaminas, NSAIDS, esteróides, canabinóides, benzodiazepinas, barbituratos, tricíclicos, e efedrinas ou metabólitos, derivados ou produtos da ruptura de qualquer um dos precedentes.
[0037] Em algumas formas de realização das composições, os pelo menos dois analitos diferentes podem ser selecionados de drogas de abuso, produtos químicos tóxicos, produtos químicos ambientais, produtos de petróleo, produtos naturais, compostos orgânicos, nutrientes, medicações com prescrição e de venda livre ou metabólitos, derivados ou produtos de decomposição de qualquer um dos precedentes.
[0038] Em algumas formas de realização das composições, os pelo menos dois analitos diferentes são selecionados de opióides, anfetaminas, NSAIDS, esteróides, canabinóides, benzodiazepinas, barbituratos, tricíclicos, e efedrinas ou metabólitos, derivados ou produtos de decomposição de qualquer um dos precedentes.
[0039] Em algumas formas de realização dos kits, a composição compreende pelo menos dois analitos diferentes selecionados de drogas de abuso, produtos químicos tóxicos, produtos químicos ambientais, produtos de petróleo, produtos naturais, compostos orgânicos, nutrientes, medicações com prescrição e de venda livre ou metabólitos, derivados ou produtos da decomposição de qualquer um dos precedentes.
[0040] Em algumas formas de realização dos kits, a composição compreende pelo menos dois analitos diferentes selecionados de opióides, anfetaminas, NSAIDS, esteróides, canabinóides, benzodiazepinas, barbituratos, tricíclicos, e efedrinas ou metabólitos, derivados ou produtos da decomposição de qualquer um dos precedentes.
[0041] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos ou científicos aqui usados têm o mesmo significado como habitualmente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual esta divulgação pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou teste dos métodos presentemente descritos, métodos e materiais
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9/33 adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência em suas totalidades. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, controlarão. Além disso, os materiais, métodos, e exemplos são apenas ilustrativos e não intencionados a serem limitantes.
[0042] Outras características e vantagens estarão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada, e das reivindicações.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0043] A FIG. 1 é um esquemático de uma composição de fase sólida aqui fornecida (por exemplo, um micro-reservatório de uma microplaca) tendo pelo menos dois analitos diferentes ligados a ela, representados na figura pelos triângulos, quadrados, círculos, diamantes. O esquemático demonstra a capacidade das presentes composições de fase sólida e métodos para determinar a presença e/ou quantidade de dois ou mais analitos simultaneamente. Por exemplo, os analitos de diamante e triângulo presentes em uma amostra competem com os analitos de diamante e triângulo ligados à fase sólida para ligar-se a anticorpos rotulados específicos para os analitos de diamante e triângulo, respectivamente, resultando em uma perda de sinal, por exemplo, depois de uma etapa de lavagem. Os anticorpos específicos para os analitos de diamante e triângulo podem ser diferentemente rotulados (isto é, como rótulos A e B aqui, respectivamente), permitindo a detecção separada dos analitos de diamante e triângulo.
[0044] A FIG. 2 é um esquemático que demonstra um ensaio em tandem usando as composições da fase sólida aqui fornecidas. Em um ensaio em tandem, a presença e/ou quantidade de pelo menos um analito em uma amostra é detectada (ou testada) usando uma composição de fase sólida aqui fornecida (por exemplo, um microreservatório tendo pelo menos dois analitos diferentes ligados a ele, com pelo menos um dos analitos ligados sendo aquele que está sendo testado), enquanto o pelo menos um analito diferente é detectado (ou testado) usando uma composição de fase sólida separada (por exemplo, um micro-reservatório adjacente tendo os mesmos pelo menos dois analitos diferentes ligados a ele, com pelo menos um dos analitos ligados
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10/33 sendo o pelo menos um analito diferente testado). Na figura, tanto o reservatório 1 quanto o reservatório 2 têm os mesmos quatro analitos ligados a eles. No reservatório 1, um ensaio competitivo para detectar o analito de círculo em uma amostra é demonstrado, enquanto no reservatório 2 (por exemplo, um reservatório adjacente), um ensaio competitivo para detectar o analito de triângulo em uma amostra é demonstrado.
[0045] A FIG. 3 é um esquemático que demonstra um ensaio em série usando as composições de fase sólida aqui fornecidos. Em um ensaio em série, pelo menos um analito em uma amostra é detectado (ou testado) usando uma composição de fase sólida aqui fornecida, seguido pela detecção de (ou teste para) pelo menos um analito diferente usando a mesma composição de fase sólida. Por exemplo, na figura, o reservatório 1 é primeiro usado para detectar um analito de círculo em t = 1, seguido pela detecção de um analito de quadrado em t = 2. Os anticorpos específicos para o analito de círculo podem ser removidos antes da execução do segundo ensaio em t = 2; em algumas formas de realização, os anticorpos específicos para o analito de círculo podem permanecer durante o segundo ensaio, por exemplo, se eles são diferencialmente rotulados a partir de anticorpos específicos para o analito de quadrado ou de outro modo não interferem com a detecção do analito de quadrado. DESCRIÇÃO DETALHADA [0046] São aqui fornecidos materiais e métodos para a detecção rápida, sensível, e eficaz em custo de um ou mais analitos diferentes em uma amostra usando uma composição de analito de fase sólida tendo pelo menos dois analitos diferentes associados com uma fase sólida. Os materiais e métodos levam a vantagem das eficiências e sensibilidades surpreendentes geradas pela ligação de dois ou mais analitos diferentes a um componente de fase sólida única. Por exemplo, uma microplaca em que cada micro-reservatório tem os mesmos dois ou mais analitos diferentes ligados a eles podem ser usados para determinar a presença e/ou quantidade dos dois ou mais analitos diferentes em uma amostra em um único microreservatório pelo uso de um anticorpo diferentemente rotulado para cada um dos dois ou mais analitos de interesse em um imunoensaio competitivo; pela sondagem quanto
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11/33 ao sinal diferencial de cada anticorpo específico, a presença e/ou quantidade do analito para o qual o mesmo é específico podem ser determinadas.
[0047] Em outras formas de realização, as composições de analito de fase sólida podem ser usadas para determinar a presença e/ou quantidade de dois ou mais analitos diferentes detectando-se separadamente os dois ou mais analitos diferentes usando composições de analito de fase sólida separadas (mas tendo o mesmo conjunto de dois ou mais analitos ligados) e o anticorpo específico apropriado rotulado para o analito de interesse (por exemplo, um ensaio em tandem ou lado a lado). Já em outras formas de realização, a mesma composição de fase sólida pode ser usada para determinar a presença e/ou quantidade de dois ou mais analitos diferentes usando-se primeiro a composição de analito de fase sólida para determinar a presença e/ou quantidade de pelo menos um primeiro analito usando um anticorpo específico para o pelo menos primeiro analito, e depois usando a mesma composição de fase sólida para determinar a presença e/ou quantidade do pelo menos segundo analito usando um anticorpo específico para o pelo menos segundo analito, por exemplo, imediatamente ou depois da remoção de quaisquer substâncias interferentes do primeiro ensaio. Tais formatos de ensaio podem ser aludidos como ensaios em série. Composições [0048] São aqui fornecidas composições úteis para detectar (por exemplo, determinar a presença e/ou quantidade de) um ou mais analitos diferentes de interesse em uma amostra. As composições incluem um suporte de fase sólida associado com pelo menos dois analitos, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 analitos ou mais. Em algumas formas de realização, de 2 a 5 analitos são associados com o suporte de fase sólida. Em outras formas de realização, 5 a 10 analitos são associados com o suporte de fase sólida. Tais composições são aqui aludidas como composições de analito de fase sólida.
[0049] Como estará evidente a aqueles tendo habilidade comum na técnica, embora as composições tornem possível determinar a presença e/ou quantidade do número total de analitos diferentes (“N”) associados com o suporte de fase sólida, não se necessita determinar (ou avaliar) a presença e/ou quantidade de todos os analitos
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12/33 que são possíveis de serem determinados com uma dada composição de analito de fase sólida. Por exemplo, em algumas formas de realização, pode ser útil determinar a presença e/ou quantidade de apenas um analito de interesse. Em outras formas de realização, pode ser útil primeiro determinar se um ou mais analitos de interesse está/estão presente(s), seguido pela determinação de se um segundo ou mais analitos está/estão presente(s). As composições de fase sólida aqui descritas facilitam a detecção simultânea, em tandem ou serial de até os números de analitos “N” associados com a fase sólida.
[0050] Como aqui usado, as frases “determinar a presença” e “determinando a presença” significam determinar se um analito está presente ou não. Assim, se um analito é determinado estar ausente, uma tal atividade seria ainda abrangidas pelas frases.
[0051] Um analito pode ser qualquer produto químico, incluindo drogas de abuso, produtos químicos tóxicos, produtos químicos ambientais (por exemplo, pesticidas, herbicidas, inseticidas), produtos de petróleo, produtos naturais, compostos orgânicos, nutrientes, medicações com prescrição ou de venda livre (por exemplo, medicações para a dor, esteróides, narcóticos, NSAIDS) ou metabólitos, derivados ou produtos da decomposição de qualquer um dos precedentes.
[0052] Em algumas formas de realização, os analitos para a associação com um suporte de fase sólida são drogas, tais como drogas de abuso, medicações com prescrição ou medicações para a dor. As classes de droga particulares de interesse incluem opióides, esteróides, anfetaminas, canabinóides, benzodiazepinas, NSAIDS, barbituratos, tricíclicos, e efedrinas.
[0053] Em algumas formas de realização, um analito de interesse pode ser selecionado de:
[0054] cocaína (e metabólitos benzoilecgonina, cocaetileno, e norcocaína), opióides e metabólitos destes (morfina, heroína, 6-mono-acetilmorfina, diacetilmorfina, codeína, oxicodona, hidrocodona, hidromorfona, oximorfona, e metadona), fenciclidina (PCP), anfetaminas, metanfetaminas, MDMA (ecstase, metilenodióxi-metanfetamina), MDA (metilenodioxianfetamina), canabinóides (e os
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13/33 metabólitos THC e carbóxi-THC), propoxifeno, meperidina, benzodiazepinas (alprazolam, clordiazepóxido, diazepam, lorazepam, flunitrazepam, triazolom, e estazolam), barbituratos (mefobarbital, pentobarbital), carisoprodol, tramadol, fentanil, buprenorfina, naltrexona, tricíclicos, nicotina (e seu metabólito cotinina), eve (metilenodióxi-etilanfetamina), ácido lisérgico (LSD), digoxina, metilfenidato, acetaminofeno, salicilatos, fluoxetina, sertralina, dextrometorfan, efedrina, fenetilaminas, pseudoefedrina, e sinefrina.
[0055] Em algumas formas de realização, os analitos para a associação com um suporte de fase sólida são drogas de abuso ou metabólitos destas, e podem ser selecionados dos seguintes: cocaína, benzoilecgonina, cocaetileno, norcocaína, PCP, anfetamina, metanfetamina, canabinóides, THC, carbóxi-THC, heroína, codeína, morfina, 6-monoacetilmorfina (MAM), oxicodona, 3,4-metilenodióxi-anfetamina (MDA); e 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA).
[0056] Em formas de realização particulares, uma composição pode incluir pelo menos dois de: cocaína, um ou mais opióides, PCP, anfetaminas, e canabinóides associados com o suporte sólido. Em formas de realização particulares dois ou mais de medicações de controle da dor selecionado de morfina, codeína, oxicodona, oximorfona, hidrocodona ou hidromorfona podem estar associados com o suporte sólido. Em algumas formas de realização, dois ou mais de cocaína e um opióide podem estar associados com o suporte sólido.
[0057] Qualquer tipo de amostra pode ser testado quanto a presença e/ou quantidade de um ou mais analitos de interesse. Em certos casos, uma amostra contém ou é suspeita conter um ou mais analitos de interesse, tais como uma ou mais drogas de abuso ou produtos químicos tóxicos. Uma amostra pode ser uma amostra corporal ou uma amostra não corporal. Uma amostra corporal pode ser um espécime obtido de um indivíduo (por exemplo, um ser humano, camundongo, rato, porco, cavalo, macaco, coelho, vaca, ovelha ou cabra). Uma amostra corporal pode ser uma amostra de tecido, tal como uma amostra de tecido do cérebro, coração, pulmões, rins, fígado, músculo, osso, estômago, intestinos ou pele. Uma amostra corporal pode ser obtida pela biópsia ou a partir da cultura de tecido. Uma amostra corporal pode
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14/33 incluir um fluido biológico tal como urina, sangue, plasma, soro, saliva, sêmen, catarro, fluido cerebrospinal, muco, suor, leite, fluido vítreo e outros. Uma amostra corporal pode ser uma estrutura queratinizada, tal como cabelo, uma unha da mão ou uma unha do pé. Uma amostra não corporal pode ser, por exemplo, uma amostra de solo ou água, uma amostra de planta, uma amostra de material inorgânico ou uma amostra de uma pesquisa ou processo de fabricação.
[0058] Uma amostra pode ser usada como tal ou pode ser tratada para resultar em uma amostra final para a detecção do um ou mais analitos. Por exemplo, uma amostra pode ser liquefeita, concentrada, secada, diluída, liofilizada, extraída, fracionada, submetida à cromatografia, purificada, acidificada, reduzida, degradada, submetida ao tratamento enzimático ou de outro modo tratado em modos conhecidos por aqueles tendo habilidade comum na técnica de modo a liberar um analito de interesse. Se desejado, uma amostra pode ser uma combinação (reunião) de amostras, por exemplo, de um processo individual ou de um processo de fabricação. [0059] Uma amostra pode estar em uma variedade de estados físicos, por exemplo, líquido, sólido, emulsão ou gel. As amostras podem ser tratadas com o cuidado habitual para preservar a integridade do analito. O tratamento pode incluir o uso de tampões e/ou inibidores apropriados, tais como inibidores de certas enzimas biológicas. Uma pessoa tendo habilidade comum na técnica será capaz de determinar as condições apropriadas dados os analitos de interesse e a natureza da amostra.
[0060] Como aqui usado, os termos “fase sólida” e “suporte de fase sólida” são usados intercambiavelmente, e referem-se a qualquer material sólido ou semi-sólido com que dois ou mais analitos podem estar associados, por exemplo, um material ao qual eles podem ser ligados de modo covalente ou de modo não covalente, direta ou indiretamente ou um material em que eles podem ser incorporados (por exemplo, aprisionamento físico, adsorção, etc.) ou um material que pode ser funcionalizado para incluir (por exemplo, para associar com) os dois ou mais analitos. Além dos analitos, um suporte de fase sólida pode conter uma variedade de materiais incluindo, por exemplo, um polímero natural ou sintético, resina, metal ou silicato.
[0061] Os suportes de fase sólida adequados são conhecidos na técnica e
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15/33 ilustrativamente incluem agaroses (comercialmente disponíveis como Sepharose); celuloses (por exemplo, uma carboximetil celulose); dextranos, (tais como Sephadex); poliacrilamidas; poliestirenos; polietileno glicóis; resinas; silicatos; divinilbenzenos; metacrilatos; polimetacrilatos; vidro; cerâmicas; papéis; metais; metalóides; poliacriloilmorfolidase; poliamidas; poli(tetrafluoroetilenos); polietilenos; polipropilenos; poli(4-metilbutenos); poli(tereftalatos de etileno); raions; náilons; poli(butiratos de vinila); difluoretos de polivinilideno (PVDF); siliconas; poliformaldeídos; acetatos de celulose; nitroceluloses ou combinações de dois ou mais de qualquer um dos precedentes. Tudo que é requerido é que o material ou combinação de materiais no suporte de fase sólida não interfira substancialmente, por exemplo, em alguns casos apenas minimamente interfira, com a ligação entre os dois ou mais analitos e o anticorpos específico para cada analito.
[0062] Um suporte de fase sólida pode ter uma variedade de formatos físicos, que podem incluir por exemplo, uma membrana; um chip; uma lâmina (por exemplo, uma lâmina ou lamínula de vidro); uma coluna; uma partícula oca, sólida, semi-sólida, contendo poro ou cavidade tal como uma pérola; um gel; uma fibra incluindo um material de fibra óptica; uma matriz; e um receptáculo de amostra. Os exemplos não limitantes de receptáculos incluem reservatórios de amostra, tubos, capilares, frascos e quaisquer outros vasos, ranhuras ou indentação capazes de conter uma amostra. Um receptáculo de amostra pode estar contido em uma plataforma de amostra múltipla, tal como uma microplaca, lâmina, dispositivo microfluídicos, placa de multireservatório ou micro-reservatório, e outros. Uma partícula à qual um analito está associado pode ter uma variedade de tamanhos, incluindo partículas que permanecem em suspensão em uma solução de viscosidade desejada, assim como partículas que facilmente precipitam em uma solução de viscosidade desejada. As partículas podem ser selecionadas para facilidade de separação de constituintes de amostra, por exemplo, pela inclusão de rótulos de purificação para a separação com um material que se liga ao rótulo adequado, propriedades paramagnéticas para a separação magnética, e outros.
[0063] No geral, uma partícula aqui descrita tem uma forma esférica. Entretanto,
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16/33 uma partícula pode ser, por exemplo, oblonga ou como tubo. Em algumas formas de realização, por exemplo, uma partícula de forma cristalina, a partícula pode ter forma poliédrica (irregular ou regular), tal como uma forma de cubo. Em algumas formas de realização, uma partícula pode ser amorfa.
[0064] Em algumas formas de realização, uma mistura de partícula pode ser substancialmente esférica, substancialmente oblonga, substancialmente como tubo, substancialmente poliédrica ou substancialmente amorfa. Por “substancialmente” é intencionado que a mistura de partícula seja mais do que 30 (por exemplo, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 ou mais) % de uma dada forma. [0065] Em algumas formas de realização, o diâmetro (ou dimensão reta mais longa) da partícula pode estar entre cerca de 1 nm a cerca de 1000 nm ou maior. Por exemplo, uma partícula pode ter pelo menos cerca de 1 nm a cerca de 1000 nm (por exemplo, de pelo menos cerca de dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975 ou 1000 nm). Em algumas formas de realização, uma partícula pode ter não mais do que 1000 nm (por exemplo, não mais do que 975, 950, 925, 900, 875, 850, 825, 800, 775, 750, 725, 700, 675, 650, 625, 600, 575, 550, 525, 500, 475, 450, 425, 400, 375, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 175, 150, 125, 100, 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 ou cinco nm) no diâmetro (ou na sua dimensão mais reta).
[0066] Métodos adequados para produzir suportes de fase sólida, assim como exemplos adicionais de suportes de fase sólida (por exemplo, partículas) para o uso nas composições e métodos aqui descritos, podem ser encontrados, por exemplo, nas Publicações PCT Nos. WO 01/84157, WO 99/30160, WO 99/42838, e WO 06/078618, as divulgações de cada uma das quais são incorporadas por referência em sua totalidade.
[0067] Um analito pode ser associado com um suporte de fase sólida em vários modos conhecidos por aqueles tendo habilidade comum na técnica. Por exemplo, um analito pode ser de modo covalente ou de modo não covalente ligado a um suporte de fase sólida, direta ou indiretamente, tal como através de um ligante, agente de
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17/33 ligação ou membro de um par de ligação. Por exemplo, um analito pode ser de modo covalente diretamente ligado a um suporte de fase sólida, por exemplo, através de uma ligação química entre um grupo funcional no analito e um grupo funcional no suporte de fase sólida. Alternativamente, um analito pode ser de modo covalente indiretamente ligado a um suporte de fase sólida, por exemplo, um analito pode ser covalentemente ligado a um ligante ou agente de ligação, que por si só é covalentemente ligado ao suporte de fase sólida. Em algumas formas de realização, um analito é de modo não covalente diretamente ligado a um suporte de fase sólida, por exemplo, associação não covalente ou adsorção do analito no suporte de fase sólida. Em outras formas de realização, um analito é indiretamente de modo não covalente ligado a um suporte de fase sólida, por exemplo, é covalentemente ligado a um ligante, agente de ligação ou membro de um par de ligação, que não se associa de covalentemente com o suporte de fase sólida. Em todos os casos, a associação de um analito de interesse com uma fase sólida não deve afetar substancialmente, por exemplo, deve afetar apenas minimamente, a especificidade de um anticorpo para o analito associado quando comparado com a especificidade para o analito quando o mesmo não está associado com uma fase sólida.
[0068] Uma variedade de reações químicas úteis para ligar de modo covalente um analito a um suporte é bem conhecida por aqueles habilitados na técnica (ver, por exemplo, Hartmann et al. (2002) J. Mater. Res. 17(2): 473-478). Os exemplos ilustrativos de grupos funcionais úteis para a ligação covalente a um suporte incluem alquila, Si-OH, carbóxi, carbonila, hidroxila, amida, amina, amino, éter, éster, epóxidos, cianato, isocianato, tiocianato, sulfidrila, dissulfeto, óxido, diazo, iodo, sulfônico ou grupos similares tendo reatividade química ou química potencial.
[0069] Um analito pode ser de não covalentemente ligado a um suporte sólido, tal como através da adsorção a ou revestimento sobre o suporte de fase sólida ou através da associação covalente ou não covalente com um ligante, agente de ligação ou membro de um par de ligação, que por si só não são covalentemente ligados ou associados com o suporte sólido. Os exemplos ilustrativos de ligantes, agentes de ligação ou membros de pares de ligação úteis para a associação de analitos a um
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18/33 suporte incluem proteínas, polímeros orgânicos (PEG e derivados deste), e moléculas pequenas. Os exemplos preferidos particulares incluem HSA, BSA, estreptavidina, avidina, biotina, PEG, e anticorpos ou fragmentos de anticorpo.
[0070] Por exemplo, em uma forma de realização preferida, um analito pode ser covalentemente conjugado a um agente de ligação tal como HSA ou BSA, e depois o conjugado covalente resultante pode ser usado para revestir de modo não covalente um suporte sólido. Em uma outra forma de realização, um analito pode ser covalentemente conjugado a um membro de um par de ligação de biotina e avidina; O conjugado covalente pode depois não covalentemente ligar-se ao outro membro do par de ligação, que pode não estar covalentemente associado com (por exemplo, revestido sobre) um suporte sólido. Em outras formas de realização, um conjugado covalente de um analito com um membro de um par de ligação pode ligar-se de modo não covalente ao outro membro do par de ligação, que foi covalentemente ligado ao suporte sólido.
[0071] Ligantes ou agentes de ligação também podem ser úteis para ligar covalentemente um analito a um suporte sólido. Por exemplo, um conjugado covalente de um analito com um agente de ligação tal como HSA ou BSA podem ser covalentemente ligados ao suporte sólido.
[0072] Em algumas formas de realização, a superfície do suporte de fase sólida pode ser modificada para facilitar a ligação estável de ligantes ou agentes de ligação. No geral uma pessoa habilitada na técnica pode usar métodos de rotina para modificar um suporte de fase sólida de acordo com a aplicação desejada. Os seguintes são exemplos não limitantes de modificações de suporte de fase sólida.
[0073] A superfície do suporte de fase sólida, por exemplo, pode ter um revestimento que facilite a ligação ao analito. No geral, o revestimento será um que seja complementar a uma porção ligante no analito. A superfície de um suporte de fase sólida pode ser amidada, por exemplo, pela sililação da superfície, por exemplo, com trialcoxiaminossilano. Os suportes tratados com silano também podem ser derivatizados com ligantes homobifuncionais e heterobifuncionais. O suporte pode ser derivatizado, por exemplo, de modo que o mesmo tenha um grupo hidróxi, um amino
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19/33 (por exemplo, alquilamino), carboxila, éster de N-hidróxi-succinimidila, grupo fotoativável, sulfidrila, cetona ou outro grupo funcional disponível para a reação. Os suportes podem ser derivatizados com uma máscara de modo a derivatizar apenas áreas limitadas (por exemplo, certos reservatórios de uma placa de ensaio de reservatório múltiplo) ou uma gravação química ou luz UV podem ser usados para remover a derivatização de regiões selecionadas.
[0074] Os grupos funcionais, ao invés de serem revestidos na superfície, podem ser incorporados no primeiro suporte de fase sólida durante ou depois da preparação do primeiro suporte de fase sólida. Os grupos funcionais são usualmente escolhidos para dissolver em um ou mais componentes do primeiro suporte de fase sólida mas podem ser covalentemente ligados ao primeiro suporte de fase sólida.
[0075] Os métodos adicionais para ligar um analito a um suporte de fase sólida são descritos, por exemplo, no Pedido PCT Nos. WO 01/84157, WO 99/30160, e WO 06/078618, as divulgações de cada um dos quais são incorporados por referência em sua totalidade.
[0076] Como aqui descrito, dois ou mais analitos são associados com o suporte de fase sólida. O tipo de associação de cada um dos dois ou mais analitos com o suporte de fase sólida podem ser os mesmos ou diferentes em relação à associação dos outros analitos. Por exemplo, um analito pode ser de modo covalente diretamente ligado, enquanto um outro é de modo covalente indiretamente ligado através de uma porção ligante. Em uma outra forma de realização, um analito pode ser covalentemente ligado a um agente de ligação tal como BSA, que é não covalentemente ligado a um suporte de fase sólida, enquanto um outro analito é de modo covalente diretamente ligado ao suporte de fase sólida. Tudo que é requerido é que as associações separadas não interfiram (por exemplo, não interfiram substancialmente) com a ligação de um analito com o anticorpo específico para o analito.
[0077] As composições de fase sólida que compreendem dois ou mais analitos diferentes associados com a fase sólida podem ser surpreendentemente robustas, por exemplo, podem ser estáveis por um período prolongado de tempo na temperatura
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20/33 ambiente. Em algumas formas de realização, as composições de fase sólida aqui descritas podem ser congeladas, liofilizadas ou imobilizadas e armazenadas sob condições apropriadas. As condições devem ser tais como para permitir que os analitos retenham atividade.
[0078] As composições de fase sólida exemplares são apresentadas nas FIGs. 1 a 3 e são descritas abaixo.
Aplicações [0079] A tecnologia aqui descrita diz respeito a determinar a presença e/ou quantidade de um ou mais analitos de interesse. No geral, os métodos envolvem imunoensaios competitivos, que são métodos bem conhecidos por aqueles tendo habilidade comum na técnica. Nos imunoensaios competitivos aqui utilizados, um analito ligado a uma fase sólida compete com um analito presente em uma solução de amostra (por exemplo, uma amostra de teste) quanto à ligação a um anticorpo, tal como um anticorpo rotulado. O sinal gerado pelo anticorpo depois da aplicação da amostra à composição de fase sólida pode ser comparado com aquele gerado depois da aplicação de uma amostra de controle ou antes da aplicação da amostra de teste, permitindo a determinação da presença de um analito. Importantemente, as presentes composições e métodos surpreendentemente permitem a detecção simultânea ou serial de dois ou mais analitos, se desejado, com alta sensibilidade e interferência mínima dos outros analitos.
[0080] Nos métodos, um suporte de analito de fase sólida é preparado pela associação de uma fase sólida, tal como uma partícula ou reservatório múltiplo de uma placa de reservatório múltiplo, com pelo menos dois analitos. O suporte de analito de fase sólida é depois contatado com um ou mais anticorpos, em que pelo menos um anticorpo é específico para um dos dois analitos associados com a composição sólida, e também contatada com uma amostra (por exemplo, uma amostra de teste), que pode conter ou pode ser suspeita conter um ou mais analitos de interesse. Tipicamente, o anticorpo é detectavelmente rotulado (por exemplo, radioativa, fluorescente, luminescente ou enzimaticamente) ou pode ser detectado via o uso de um anticorpo secundário que se liga ao primeiro anticorpo usando métodos (por
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21/33 exemplo, métodos de amplificação enzimática) conhecido por aqueles tendo habilidade comum na técnica. Em tais métodos, a interação do anticorpo com o analito para o qual o mesmo é específico resulta na geração de um sinal detectável, por exemplo, via o rótulo detectável no anticorpo ou via um rótulo no anticorpo secundário. O sinal é medido como uma leitura da presença ou quantidade do analito.
[0081] Um anticorpo para o uso nos métodos pode ser qualquer anticorpo que seja específico para um analito de interesse. O termo inclui um anticorpo ou fragmento de ligação de analito deste. O termo também abrange um anticorpo humanizado, um anticorpo totalmente humano, um anticorpo de cadeia única, um anticorpo quimérico, um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, um fragmento Fab', um fragmento Fv, e um fragmento scFv. Os anticorpos para um analito de interesse podem ser obtidos comercialmente a partir de várias fontes ou podem ser preparados e isolados usando métodos conhecidos por aqueles tendo habilidade comum na técnica, por exemplo, isolando o anticorpo de um animal hospedeiro (por exemplo, um mamífero tal como um rato, coelho, camundongo, cabra, vaca, cavalo, cão, gato, ovelha, burro, galinha ou um ser humano) ou célula (por exemplo, um hibridoma) que produza o anticorpo.
[0082] Em algumas formas de realização, o anticorpo é específico para o analito de interesse e é capaz ainda de ligar-se a um ou mais metabólitos do analito de interesse. Por exemplo, um anticorpo pode ser específico para cocaína, embora possa demonstrar ligação reativa cruzada com um ou mais dos metabólitos da cocaína. Em tais casos, a ligação reativa cruzada deve ser suficiente para detectar o um ou mais metabólitos usando os métodos aqui descrito.
[0083] Similarmente, um anticorpo pode ser específico para um membro de uma classe de droga de interesse e pode ser capaz ainda de ligar-se a um ou mais membros da classe de droga de interesse e/ou seus metabólitos. Por exemplo, um anticorpo pode ser específico para um opióide particular, embora possa demonstrar ligação reativa cruzada a outros opióides. Em tais casos, a ligação reativa cruzada deve ser suficiente para detectar a uma ou mais drogas ou metabólitos de droga dentro da classe de droga usando os métodos aqui descritos.
[0084] Um método para determinar a presença e/ou quantidade de um ou mais
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22/33 analitos é realizada como segue. Uma composição de analito de fase sólida, como descrita acima, tal como uma microplaca que compreende um micro-reservatório tendo pelo menos dois analitos diferentes associados com cada micro-reservatório, é contatada com i) pelo menos um anticorpo, em que o pelo menos um anticorpo é específico para um analito de interesse; e ii) uma amostra, como anteriormente descrito. Contatar pode incluir qualquer método de contatar, por exemplo, pipetagem manual, lavagem, mecanismos de dispensa robótica ou automatizados ou outros métodos conhecidos por aqueles tendo habilidade comum na técnica. O cuidado de rotina nos métodos de contatar, por exemplo, técnicas estéreis ou outros métodos para preservar a integridade da amostra são entendidos por aqueles tendo habilidade comum na técnica.
[0085] A composição de analito de fase sólida pode ser primeiro contatada com o anticorpo, e depois com a amostra ou vice-versa. Uma quantidade conhecida de anticorpo pode ser contatada com a composição de fase sólida, por exemplo, em métodos quantitativos.
[0086] Tipicamente, o anticorpo é detectavelmente rotulado e o rótulo possibilita a determinação da presença do analito. Por exemplo, o anticorpo pode ser detectavelmente rotulado com um rótulo fluorescente, luminescente (incluindo quimioluminescente ou bioluminescente), radioativo ou enzimático. Em outros casos, o anticorpo não é rotulado, mas é detectado via o uso de um anticorpo secundário que por si só é rotulado (por exemplo, enzimaticamente rotulado) e que é específico para o primeiro anticorpo. Nos casos onde analitos múltiplos são detectados simultaneamente, os anticorpos separados para cada analito de interesse são de modo preferível diferencialmente rotulados de modo que cada um possa ser detectado separadamente dos outros, por exemplo, através do uso de rótulos fluorescentes tendo espectros de absorção/emissão não sobrepostos. Os métodos para detecção, incluindo métodos automatizados, são bem conhecidos por aqueles tendo habilidade comum na técnica.
[0087] Qualquer um dos métodos podem utilizar o uso de uma etapa de lavagem, por exemplo, para remover anticorpo e analitos não ligados à composição de analito
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23/33 de fase sólida. As condições de lavagem adequadas podem ser determinadas por aqueles tendo habilidade comum na técnica e não devem interferir substancialmente ou apenas interferir minimamente, com a ligação do anticorpo ao analito associado na fase sólida.
[0088] O analito pode ser determinado estar presente na amostra tirando-se vantagem da natureza competitiva do ensaio. Por exemplo, o analito pode ser determinado estar presente pela comparação de um sinal gerado pelo anticorpo (por exemplo, a partir de um rótulo fluorescente no anticorpo) ligado à composição de analito de fase sólida depois de contatar com a amostra (por exemplo, a amostra de teste) com um sinal gerado pelo anticorpo ligado à composição de analito de fase sólida depois de contatar com uma amostra de controle que não compreende o analito de interesse.
[0089] Em qualquer método, a composição de analito de fase sólida pode ser contatada com um segundo anticorpo, onde o segundo anticorpo é específico para um segundo analito diferente associado com a fase sólida. O segundo anticorpo pode ser contatado ao mesmo tempo como o primeiro anticorpo (por exemplo, em um ensaio simultâneo por dois analitos) ou em série (por exemplo, em ensaios em que é desejado para determinar a presença de um primeiro analito antes da determinação de um segundo analito). Como uma pessoa tendo habilidade comum na técnica reconhecerá, de modo concebível até N anticorpos, correspondendo ao número de analitos associados com a fase sólida, podem ser utilizados no método, onde a população de anticorpo inclui pelo menos um anticorpo específico para cada analito associado. Além disso, embora até N analitos possam ser detectados em um ensaio simultâneo, qualquer número menor pode ser detectado em qualquer ensaio ou qualquer combinação pode ser detectada, por exemplo, em um ensaio simultâneo ou em série. Além disso, em certas formas de realização, tais como aquelas que utilizam placas de micro-reservatório, um micro-reservatório pode ser usado para testar quanto a um ou mais analitos de interesse, enquanto um outro micro-reservatório pode ser usado para testar quanto ao mesmo conjunto de analitos de interesse, um conjunto diferente de analitos de interesse ou um conjunto sobreposto mas não idêntico de
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24/33 analitos de interesse.
Kits [0090] Também são aqui fornecidos kits, tais como kits que incluem uma ou mais composições de analito de fase sólida aqui descritas. Os kits podem incluir componentes adicionais, incluindo tampões, reagentes, instruções para o uso, e um ou mais anticorpos para o uso nos métodos. Em algumas formas de realização, pelo menos um anticorpo específico para um analito selecionado do grupo que consiste de cocaína, benzoilecgonina, cocaetileno, norcocaína, PCP, anfetamina, metanfetamina, canabinóides, THC, carbóxi-THC, heroína, codeína, morfina, 6-monoacetilmorfina (MAM), oxicodona, 3,4-metilenodióxi-anfetamina (MDA); e 3,4metilenodioximetanfetamina (MDMA) é incluído em um kit. Em algumas formas de realização, os kits podem incluir reagentes adicionais para a preparação de amostra, incluindo reagente para extrair ou tratar uma amostra para o uso nos métodos.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1: Extração Redutiva de Analitos de Cabelo e Detecção de Analitos Múltiplos Usando Composições de Fase Sólida Tendo Analitos Múltiplos Ligados às Mesmas [0091] As amostras de cabelo foram analisadas quanto a presença de analitos múltiplos (por exemplo, drogas de abuso) usando métodos de extração como divulgados no Pedido U.S. Ser. No. , intitulado “Non-Proteolytic Method For The Determination Of Analytes In Keratinized Structures,” (que divulgam métodos redutivos não proteolíticos para extrair analitos de cabelo), depositado simultaneamente com esta em 29 de abril de 2008. Os resultados obtidos usando tais métodos redutivos não proteolíticos também foram comparados com os resultados obtidos usando métodos como divulgados nas Pat. U.S. Nos. 6.022.693; 6.350.582; e 6.949.344 (que divulgam métodos proteolíticos e redutivos combinados para extrair analitos de cabelo). Uma vez extraídas, as amostras de teste foram avaliadas quanto a presença de analitos múltiplos de droga de abuso usando os métodos e composições aqui divulgados, por exemplo, contatadas com uma fase sólida tendo ligados a ela dois ou mais analitos e com um ou mais anticorpos primários, cada um
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25/33 específico para um analito particular; cada anticorpo primário é depois detectado, por exemplo, através de um rótulo no anticorpo primário ou através da detecção do anticorpo primário via um anticorpo secundário rotulado.
I. Soluções [0092] Solução para Digerir uma Amostra de Cabelo: solução a 1,5 % de Ditiotreitol em água, pH 9,45 a 9,55 [0093] Solução para Neutralizar uma Amostra de Cabelo Digerida:
1. 5 % de Cloreto de Zinco em água.
2. 1,0 M de Bis Tris pH 7
3. Imediatamente antes do uso, diluir o Cloreto de Zinco 1:10 no Bis-Tris.
II. Procedimento de Tratamento para a Extração de Analito para Imunoensaio de Enzima (EIA) [0094] 8 mg de amostras de cabelo foram colocadas em tubos de teste com 0,8 ml de solução a 1,5 % de Ditiotreitol, pH 9,5, e as amostras incubadas a 37° C por 2 horas. As amostras foram neutralizadas com 70 pl de Cloreto de Zinco em Bis-Tris, bem misturadas e centrifugadas.
III. Imunoensaio de enzima (EIA) Usando Microplacas Revestidas com Analito Múltiplo e Usando Extratos de Ditiotreitol de Cabelo: Cocaína, Opióides, Anfetaminas, PCP.
A. Preparação de Microplacas: Revestimento com Conjugados de BSA-Analito [0095] Conjugados em BSA (Albumina Sérica Bovina) das drogas de interesse adquiridos da East Coast Biologicals foram preparados em água. Os conjugados de BSA (BSA-benzoilecgonina, BSA-morfina, BSA-PCP, BSA-metanfetamina) foram dissolvidos em água tal que de 1 a 10 ng de cada um dos analitos estivessem presentes em 50 pl de solução de conjugado de droga.
[0096] Para revestir os reservatórios, cinquenta pl por reservatório da solução de conjugado de droga contendo conjugados em BSA de benzoilecgonina, morfina, PCP, e metanfetamina foram adicionados aos reservatórios em uma microplaca de 96 reservatórios (microplaca de alta ligação da Corning Scientific). A placa foi coberta e colocada em um rotor durante a noite na temperatura ambiente (RT) com rotação a
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26/33 cerca de 100 ciclos/min.
[0097] Depois da rotação durante a noite, a mistura de analito foi removida e os reservatórios lavados uma vez com PBS (solução salina tamponada com fosfato). Para bloquear os reservatórios, 300 pl de PBS contendo 1 % de BSA foram adicionados a todos os reservatórios, e as microplacas giradas na temperatura ambiente por 4 a 6 horas (velocidade de rotação de cerca de 100 ciclos/min).
[0098] Depois do bloqueio, os reservatórios foram lavados 6 vezes com PBS contendo 0,01 % de Tween-20. Depois de lavar, as placas foram invertidas e batidas contra a bancada para remover qualquer líquido. As placas foram depois deixadas invertidas para secar na bancada por umas poucas horas ou durante a noite. Quando secas, elas foram colocadas em bolsas dessecadas seláveis a vácuo; o ar foi retirado da bolsa com uma bomba de vácuo e a bolsa foi selada para armazenagem.
B. Análise [0099] As alíquotas das amostras de cabelo digeridas e neutralizadas foram combinadas nos reservatórios da microplaca com um anticorpo primário apropriado direcionado contra o(s) analito(s) de interesse. Depois de uma incubação de 1 hora na temperatura ambiente, as placas foram lavadas com PBS em um lavador de placa automatizado. A seguir da lavagem, o anticorpo secundário (direcionado contra as espécies de anticorpo primário) ligados a HRP (peroxidase de rábano) foi adicionado aos reservatórios e as placas incubadas na temperatura ambiente por uma hora. As placas foram lavadas mais uma vez, e o substrato (TMB, 3,3’,5,5’-trimetilbenzidina) incubado nos reservatórios por 30 minutos. Finalmente, 50 pl de HCl 4 N foram adicionados e a absorbância lida a 620 mu.
1. Cocaína no cabelo: Imunoensaio de enzima de analito de fase sólida (EIA)
Resultado de Exemplo para Cocaína pelo Analito EIA de Fase Sólida
Amostra Porcentagem * Resultados de MS**, ng/10 mg de cabelo
Negativo (Bo) 100 COC BE CE NOR
Corte (5 ng/10 mg de cabelo) 53,9
Amostra Positiva 59498 12,5 31,6 13 6,3 1,1
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Amostra 59501 Positiva 22,3 12,7 0,7 0 0
Amostra 59571 Positiva 27,8 9,4 1,3 0 0,3
Amostra 59718 Negativa 97,5
Amostra 59708 Negativa 91,3
Amostra 58714 Negativa 94,6
Controle menos 50 % 61,5
Controle mais 50 % 44
*Nota: Porcentagem B/Bo para EIA -- O valor Negativo (Bo) de 100 % é o tubo de referência não contendo nenhum analito na amostra e exibe ligação máxima de anticorpo para antígeno. As amostras desconhecidas são expressadas como porcentagem do Negativo Bo, chamada “Porcentagem B/Bo.” As concentrações de analito na amostras variam inversamente com os valores de Porcentagem B/Bo. Uma Amostra Positiva é uma contendo droga igual a ou maior do que o calibrador de corte e assim uma Porcentagem B/Bo igual ou mais baixa do que o calibrador de corte. **COC = cocaína; BE = benzoilecgonina; CE = cocaetileno; NOR = norcocaína
2. Opióides no cabelo: Imunoensaio de Enzima de Antígeno na Fase Sólida
Resultado de Exemplo para Opióides pelo Analito EIA de Fase Sólida
Amostra Porcentagem * Resultados de MS**, ng/10 cabelo ) mg de
Negativo (Bo) 100 Codeín a Morfina MAM Oxicodo na
Corte (2 ng/10 mg de cabelo) 43,9
Amostra 59028 Positiva 7,7 0,8 7,9 7,8 0,3
Amostra 58641 Positiva 13,3 3,6 48,8 85,4 0,8
Amostra 58714 Positiva 11,9 4,3 21,3 5,4 0
Amostra 42621 Negativa 92,8
Amostra 42625 Negativa 98,2
Amostra Negativa 93,6
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42644
Controle menos 50 % 66,3
Controle mais 50 % 28,9
** MAM = 6-monoacetilmorfina
3. Metanfetamina/MDMA no cabelo: Imunoensaio de enzima em analito de fase sólida
Resultado de Exemplo para Metanfetamina/MDMA (Ecstasy) pelo Analito EIA de
Fase Sólida
Amostra Porcentagem* Resultados de MS**, ng/10 mg de cabelo
Negativo (Bo) 100 MET AMP MDMA MDA
Corte (5 ng/10 mg de cabelo) 49
Amostra Positiva 59708 11,3 2,6 0 214 6,7
Amostra Positiva 59714 14,4 26,9 3,8 0 0
Amostra Positiva 59718 47,2 6,7 0,7 0 0
Amostra Negativa 42625 100,5
Amostra Negativa 42642 102,2
Amostra Negativa 42655 97,9
Controle menos 50 % 67,2
Controle mais 50 % 39
**MET = metanfetamina; AMP = anfetamina; MDA = 3,4-metilenodioxianfetamina;
MDMA = 3,4-metilenodioximetanfetamina
EXEMPLO 2: Extração em Metanol de Analitos de Cabelo e Detecção de Analitos Múltiplos Usando Composições de Fase Sólida Tendo Analitos Múltiplos Ligados às Mesmas [0100] Amostras de cabelo foram analisadas quanto a presença de analitos múltiplos (por exemplo, drogas de abuso) usando métodos de extração metanólica como divulgados em Yegles, et al., em: Analytical and Practical Aspects of Drug Testing in Hair, CRC Press, 2007, pp. 73 - 94; Jurado, C. em: Analytical and Practical Aspects of Drug Testing in Hair, CRC Press, 2007, pp. 95-125; Cheze, M. et al. em:
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Analytical and Practical Aspects of Drug Testing in Hair, CRC Press, 2007, pp. 163 185). Uma vez extraídas, as amostras de teste foram avaliadas quanto à presença de analitos múltiplos de droga de abuso usando os métodos e composições aqui divulgados, por exemplo, contatadas com uma fase sólida tendo ligados à mesma dois ou mais analitos e com um ou mais anticorpos primários, cada um específico para um analito particular; cada anticorpo primário é depois detectado, por exemplo, através de um rótulo no anticorpo primário ou através da detecção do anticorpo primário via um anticorpo secundário rotulado.
I. Soluções [0101] Metanol Acidificado: Metanol com 1 % de HCl.
II. Procedimento de Tratamento para a Extração de Analito para Imunoensaio de Enzima [0102] Dois ml de Metanol acidificado foram adicionados a 10 a 12 mg de cabelo em tubos de vidro com tampa de rosca. Os tubos foram incubados a 60° C durante a noite (16 horas). O metanol foi removido em um tubo limpo e o cabelo secado pela evaporação em um bloco de aquecimento a 50° C. As amostras secadas foram reconstituídas em PBS a uma concentração de cabelo de 10 mg de cabelo/ml de PBS.
III. Imunoensaio de Enzima usando Microplacas Revestidas com Analito Múltiplo e Usando Extratos em Metanol de Cabelo: Cocaína, Opióides, Anfetaminas [0103] Para EIA, todos os reagentes são filtrados para evitar contaminação bacteriana.
A. Preparação de Microplacas: Revestimento com Conjugados de BSA-Analito - Placa COMBO [0104] Microplacas foram preparadas como descrito acima no Exemplo 1.III.A.
B. Análise [0105] A análise dos extratos foi realizada da mesma maneira como a análise das amostras digeridas.
1. Cocaína no cabelo: Imunoensaio de Enzima em Analito de Fase Sólida Usando Extração em Metanol
Resultado de Exemplo para Cocaína pelo Analito EIA de Fase Sólida
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Amostra Resultados de MS, ng/10 mg de cabelo amostra
Porcentagem Resultado COC BE CE NOR
Negativo (Bo) 100
Corte (5 ng/10 mg de cabelo) 41,5
Amostra Positiva 60303 3,0 POS 174,1 14,5 20,9 2,5
Amostra Positiva 60304 3,6 POS 118,7 33,5 0 2,3
Amostra Positiva 60312 4,9 POS 70,5 26,8 0,2 2,3
Amostra Positiva 60373 8,3 POS 26 6,1 2,3 0,4
Amostra Negativa 42642 92,8
Amostra Negativa 42647 85,6
Amostra Negativa 42650 87,4
Amostra Negativa 42677 90,2
Amostra Negativa 42777 94,0
Controle menos 50 % 53,1
(2,5 ng/10 mg de cabelo)
Controle mais 50 % 36,1 POS
(7,5 ng/10 mg de cabelo)
2. Opióides no cabelo: Imunoensaio de enzima em Analito de Fase Sólida Usando
Extração em Metanol
Resultado de Exemplo para Opióides pelo Analito EIA de Fase Sólida
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Resultados de MS, ng/10 mg de cabelo amostra
Porcentagem Resultado Codeína Morfina 6MAM Oxicodo na
Negativo (Bo) 100
Corte (2 ng/10 mg de cabelo) 29,6
Amostra Positiva 60370 5,7 POS 0 10,5 38,9 71
Amostra Positiva 60575 27,3 POS 2,2 1,8 0 1
Amostra Positiva 60482 16,4 POS 0,4 1,5 3,7 0
Amostra Negativa 42642 108,8
Amostra Negativa 42647 105,7
Amostra Negativa 42650 88,9
Amostra Negativa 42677 105,7
Amostra Negativa 42777 112,1
Controle menos 50 % 47,7
(2,5 ng/10 mg de cabelo)
Controle mais 50 % 20,1 POS
(7,5 ng/10 mg de cabelo)
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3. Metanfetamina/MDMA no cabelo: Imunoensaio de enzima em Analito de Fase
Sólida Usando Extração em Metanol
Resultado de Exemplo para Metanfetamina/MDMA (Ecstasy) pela Analito EIA de
Fase Sólida
Resultados de MS, ng/10 mg de cabelo
Porcentagem Resultado Met Amp MDM A MDA
Negativo (Bo) 100
Corte (5 ng/10 mg de cabelo) 46,7
Amostra Positiva 60320 25,4 POS 17,5 0,8
Amostra Positiva 60360 12,9 POS 22,8 0,8 120 21
Amostra Positiva 60435 25,4 POS 15 2,6
Amostra Positiva 60448 20,3 POS 3,3 0,1 182,1 8,9
Amostra Negativa 42642 92,2
Amostra Negativa 42647 94,1
Amostra Negativa 42650 94,1
Amostra Negativa 42677 95,7
Amostra Negativa 42777 95,3
Controle menos 50 % 54
(2,5 ng/10 mg de cabelo)
Controle mais 50 % 41,4 POS
(7,5 ng/10 mg de cabelo)
OUTRAS FORMAS DE REALIZAÇÃO [0106] Várias formas de realização foram descritas. Não obstante, será entendido que várias modificações podem ser feitas sem divergir do espírito e escopo da
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33/33 divulgação aqui fornecida. Consequentemente, outras formas de realização estão dentro do escopo das seguintes reivindicações.

Claims (29)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para determinar a presença de um analito de interesse em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) contatar uma composição de analito de fase sólida, em que a composição de analito de fase sólida compreende pelo menos dois analitos diferentes ligados a um receptáculo de fase sólida, em que os pelo menos dois analitos diferentes são drogas de abuso ou metabólitos destas e são ligadas ao dito receptáculo de fase sólida como uma mistura, em que ainda um daquele pelo menos dois analitos diferentes é o analito de interesse, com:
    i) um anticorpo, em que o anticorpo é específico para o analito de interesse; e ii) uma amostra; e (b) determinar se o analito de interesse está presente na amostra.
  2. 2. Método para determinar a presença de um analito de interesse em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) contatar uma composição de analito de fase sólida, em que a composição de analitos de fase sólida compreende pelo menos dois analitos diferentes ligados a um receptáculo de fase sólida, em que os pelo menos dois analitos diferentes são medicações com prescrição ou de venda livre ou metabólitos destes e são ligados ao dito receptáculo de fase sólida como uma mistura, em que ainda um daquele pelo menos dois analitos diferentes é o analito de interesse, com:
    i) um anticorpo, em que o anticorpo é específico para o analito de interesse; e ii) uma amostra; e (b) determinar se o analito de interesse está presente na amostra, preferencialmente em que o anticorpo é detectavelmente rotulado.
  3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a composição de analito de fase sólida é primeiro contatada com a amostra, e depois com o anticorpo.
  4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de
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    2/7 que o anticorpo é detectavelmente rotulado.
  5. 5. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda remover o anticorpo que não está ligado à composição de analito de fase sólida.
  6. 6. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda contatar a composição de analito de fase sólida com um segundo anticorpo, onde o segundo anticorpo é específico para o pelo menos segundo analito diferente ligado a fase sólida, e determinar se o segundo analito está presente na amostra.
  7. 7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os pelo menos dois analitos diferentes estão ligados a fase sólida de modo não covalente, direta ou indiretamente, ou em que os pelo menos dois analitos diferentes são ligados à fase sólida de modo covalente, direta ou indiretamente, ou em que os pelo menos dois analitos diferentes são ligados à fase sólida via adsorção, direta ou indiretamente, ou em que os pelo menos dois analitos diferentes são conectados de modo covalente a um agente de ligação que é ligado à fase sólida de modo não covalente ou via adsorção.
  8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação é selecionado de HSA e BSA.
  9. 9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as drogas de abuso ou metabólitos das mesmas são selecionados de cocaína, benzoilecgonina, cocaetileno, norcocaína, PCP, anfetamina, metanfetamina, canabinóides, THC, carbóxi-THC, heroína, codeína, morfina, 6-monoacetilmorfina (MAM), oxicodona, 3,4-metilenodioxianfetamina (MDA); e 3,4metilenodioximetanfetamina (MDMA).
  10. 10. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as medicações com prescrição ou de venda livre ou metabólitos destes são selecionados do grupo consistindo de: opióides, esteroides, anfetaminas, canabinóides, benzodiazepinas, NSAIDs, barbituratos, tricíclicos, e efedrinas.
  11. 11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de
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    3/7 que a composição de analito de fase sólida compreende pelo menos três analitos diferentes ligados a um receptáculo de fase sólida, em que os pelo menos três analitos diferentes são drogas de abuso ou metabólitos destes, ou em que a composição de analito de fase sólida compreende pelo menos quatro analitos diferentes ligados a um receptáculo de fase sólida, em que os pelo menos quatro analitos diferentes são drogas de abuso ou metabólitos destes, ou em que a composição de analitos de fase sólida compreende pelo menos cinco analitos diferentes ligados a um receptáculo de fase sólida, em que os pelo menos cinco analitos diferentes são drogas de abuso ou metabólitos destes.
  12. 12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pelo menos duas drogas de abuso ou metabólitos destes são selecionados do grupo consistindo de: cocaína, um opióide, PCP, anfetaminas, e canabinóides, ou em que a pelo menos duas das drogas de abuso ou metabólitos destes são selecionados do grupo consistindo de: morfina, codeína, oxicodona, oximorfona, hidrocodona, ou hidromorfona, ou em que a pelo menos duas drogas de abuso ou metabólitos destes são selecionados do grupo consistindo de: cocaína e um opióide.
  13. 13. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a composição de analito de fase sólida compreende pelo menos três analitos diferentes ligados a um receptáculo de fase sólida, em que os pelo menos três analitos diferentes são medicações com prescrição ou de venda livre ou metabólitos destes, ou em que a composição de analito de fase sólida compreende pelo menos quatro analitos diferentes ligados a um receptáculo de fase sólida, em que os pelo menos quatro analitos diferentes são medicações com prescrição ou de venda livre ou metabólitos destes, ou em que a composição de analitos de fase sólida compreende pelo menos cinco analitos diferentes ligados a um receptáculo de fase sólida, em que os pelo menos cinco analitos diferentes são medicações com prescrição ou de venda livre ou metabólitos destes.
  14. 14. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as pelo menos duas medicações com prescrição ou de venda livre ou metabólitos destes são selecionados do grupo consistindo de: opióides, esteroides,
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    4/7 anfetaminas, e benzodiazepinas, ou em que as pelo menos duas medicações com prescrição ou de venda livre ou metabólitos destes são selecionados do grupo consistindo de: esteroides e benzodiazepinas.
  15. 15. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra corporal ou uma amostra derivada de uma amostra corporal.
  16. 16. Método para determinar a presença de uma pluralidade de analitos de interesse diferentes, representados pelo número “N”, em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) contatar uma composição de analito de fase sólida, em que a composição de analito de fase sólida compreende pelo menos “N” analitos diferentes ligados à um receptáculo de fase sólida, em que os pelo menos “N” analitos diferentes são drogas de abuso ou metabólitos destes e são ligados ao dito receptáculo de fase sólida como uma mistura, em que ainda os pelo menos “N” analitos diferentes ligados incluem a pluralidade de analitos de interesse, com:
    i) uma pluralidade de anticorpos, em que a pluralidade de anticorpos compreende um anticorpo específico para cada analito de interesse diferente; e ii) uma amostra; e (b) determinar se cada analito de interesse diferente na pluralidade está presente na amostra.
  17. 17. Método para determinar a presença de uma pluralidade de analitos de interesse diferentes, representados pelo número “N”, em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) contatar uma composição de analito de fase sólida, em que a composição de analito de fase sólida compreende pelo menos “N” analitos diferentes ligados à um receptáculo de fase sólida, em que os pelo menos “N” analitos diferentes são medicações com prescrição ou de venda livre ou metabólitos destes e são ligados ao dito receptáculo de fase sólida como uma mistura, em que ainda os pelo menos “N” analitos diferentes ligados incluem a pluralidade de analitos de interesse, com:
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    5/7
    i) uma pluralidade de anticorpos, em que a pluralidade de anticorpos compreende um anticorpo específico para cada analito de interesse diferente; e ii) uma amostra; e (b) determinar se cada analito de interesse diferente na pluralidade está presente na amostra.
  18. 18. Método de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que os anticorpos específicos para cada analito de interesse diferente são separadamente detectáveis.
  19. 19. Método de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de anticorpos é contatada com a composição de analito de fase sólida simultaneamente, ou em que pelo menos um da pluralidade de anticorpos é contatada com a composição de analito de fase sólida em um tempo diferente do que pelo menos uma outra da pluralidade de anticorpos.
  20. 20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma estrutura queratinizada.
  21. 21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que a amostra é cabelo.
  22. 22. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos dois analitos diferentes ligados à um receptáculo de fase sólida, em que os pelo menos dois analitos diferentes são analitos de droga de abuso ou metabólitos destes e são ligados ao dito receptáculo de fase sólida como uma mistura.
  23. 23. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos dois analitos diferentes ligados à um receptáculo de fase sólida, em que os pelo menos dois analitos são medicações de prescrição ou de venda livre ou metabólitos destes e são ligados ao dito receptáculo de fase sólida como uma mistura.
  24. 24. Composição de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que os pelo menos dois analitos diferentes são ligados de modo covalente à fase sólida, direta ou indiretamente, em que os pelos menos dois analitos diferentes são ligados de modo não covalente à fase sólida, direta ou indiretamente, ou compreendendo de 2 a 10 analitos diferentes ligados a uma fase sólida, ou em que
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    6/7 os pelo menos dois analitos diferentes são selecionados de cocaína, benzoilecgonina, cocaetileno, norcocaina, PCP, anfetamina, metanfetamina, canabinóides, THC, carbóxi-THC, heroína, codeína, morfina, 6-monoacetilmorfina (MAM), oxicodona, 3,4-metilenodióxi-anfetamina (MDA) e 3,4metilenodioximetanfetamina (MDMA).
  25. 25. Composição de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que os pelo menos dois analitos diferentes são ligados de modo covalente à fase sólida, direta ou indiretamente, em que os pelos menos dois analitos diferentes são ligados de modo não covalente à fase sólida, direta ou indiretamente, ou compreendendo de 2 a 10 analitos diferentes ligados à fase sólida, ou em que os pelos menos dois analitos diferentes são selecionados do grupo consistindo de: opiódes, esteroides, anfetaminas, canabinóides, benzodiazepinas, NSAIDS, barbituratos, tricíclicos, e efedrinas.
  26. 26. Composição de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a composição de analito de fase sólida compreende pelo menos três analitos diferentes ligados a um receptáculo de fase sólida, em que os pelo menos três analitos diferentes são drogas de abuso ou metabólitos destes, ou em que a composição de analito de fase sólida compreende pelo menos quatro analitos diferentes ligados a um receptáculo de fase sólida, em que os pelo menos quatro analitos diferentes são drogas de abuso ou metabólitos destes, ou em que a composição de analitos de fase sólida compreende pelo menos cinco analitos diferentes ligados a um receptáculo de fase sólida, em que os pelo menos cinco analitos diferentes são drogas de abuso ou metabólitos destes.
  27. 27. Composição de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a composição de analito de fase sólida compreende pelo menos três analitos diferentes ligados a um receptáculo de fase sólida, em que os pelo menos três analitos diferentes são medicações com prescrição ou de venda livre ou metabólitos destes, ou em que a composição de analito de fase sólida compreende pelo menos quatro analitos diferentes ligados a um receptáculo de fase sólida, em que os pelo menos quatro analitos diferentes são medicações com prescrição ou de
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    7/7 venda livre ou metabólitos destes, ou em que a composição de analitos de fase sólida compreende pelo menos cinco analitos diferentes ligados a um receptáculo de fase sólida, em que os pelo menos cinco analitos diferentes são medicações com prescrição ou de venda livre ou metabólitos destes.
  28. 28. Composição de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a pelo menos duas drogas de abuso ou metabólitos destes são selecionadas do grupo consistindo de: cocaína, um opióide, PCP, anfetaminas, e canabinóides, ou em que a pelo menos duas das drogas de abuso ou metabólitos destes são selecionados do grupo consistindo de: morfina, codeína, oxicodona, oximorfona, hidrocodona, ou hidromorfona, ou em que a pelo menos duas drogas de abuso ou metabólitos destes são selecionados do grupo consistindo de: cocaína e um opióide.
  29. 29. Composição de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que as pelo menos duas medicações com prescrição ou de venda livre ou metabólitos destes são selecionados do grupo consistindo de: opióides, esteroides, anfetaminas, e benzodiazepinas, ou em que as pelo menos duas medicações com prescrição ou de venda livre ou metabólitos destes são selecionados do grupo consistindo de: esteroides e benzodiazepinas.
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