CN102077094B - 固相多分析物测试 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于检测一种或多种分析物的存在和/或其量的组合物和方法，所述分析物包括例如滥用药物。组合物包含结合在一个例如颗粒或多孔板等固相上的两种或多种分析物。组合物和方法也可以同时、并行或连续测定样品中的两种或多种目标分析物的存在和/或量。

Description

固相多分析物测试
交互引用
根据35USC§119(e)的规定，本申请要求2008年4月29日提交的美国专利申请序列号61/048,892的优先权，其整体内容在此引用作为参考。
技术领域
本申请涉及测定样品(如身体样品或非身体样品)中一种或多种分析物(例如滥用药物、有毒化学品、处方药等)的存在和/或量的方法和组合物，并且更特定地为采用竞争性免疫测试来实现这一目标的方法和组合物。在一些实施方式中，方法和组合物可用于同时、并行或连续测定样品中两种或多种分析物的存在或量。本申请描述了包含结合在一个固相上的两种或多种不同分析物的固相分析物组合物，以及在竞争性免疫测试中使用来测定一种或多种目标分析物的存在和量的方法。
发明背景
例如放射免疫测试(RIA)和酶免疫测试(EIA)等免疫测试是用于测定样品中一种或多种目标分析物的存在、特性和量的有效方法。许多免疫测试将特异于目标分析物的抗体固定化在固相上，例如微孔板或珠子；检测所结合的抗体与样品中存在的分析物之间的结合，例如通过使用三明治测试。其他免疫测试将分析物固定化；这些免疫测试称为固相抗原或固相分析物免疫测试。在固相分析物免疫测试中，固相分析物与样品中存在的分析物竞争结合于特异于分析物的抗体。通常，在这样的固相分析物测试中，抗体是可以用一些方式检测的，例如它是被标记的，例如放射性、荧光、发光或酶(例如可以在存在合适底物时发生酶反应，产生颜色变化)标记的，或是它的存在可以通过本身被标记的第二抗体来检测。
为了测定特定的样品是否包含一种以上的目标分析物，以前的方法通常采用单独的固相组分(例如单独的微孔板或是几套微珠)，每种固相组分包含特异于一种特定分析物的结合抗体，或是每种固相组分包含单一类型的结合分析物。这样针对每种分析物需要单独的固相组分，使得多分析物测试昂贵、技术复杂并且花时间。需要能有一种有效且相对便宜的分析物检测方法，能够快速测定样品中一种或多种分析物的存在和/或量，包括例如滥用药物等分析物。
发明简述
免疫测试是检测样品中分析物的存在和/或量的有力工具。然而，能够检测样品中的多种分析物，通常需要使用多个单独的测试，例如每种目标分析物一个测试，这就提高了成本、时间和过程的技术复杂性，并且导致操作者可能在多个步骤中的一个步骤产生误差。发明者惊奇地发现使用包含结合在一个固相上的至少两种分析物的固相分析物组合物，能够提高多分析物测试的性能，表现出高灵敏度和高效率。本发明所述的多分析物测试很灵活，可以同时、连续或并行进行，从而降低成本、时间和过程的复杂性。
因此，本发明提供了一种测定样品中目标分析物的存在的方法，包括：
(a)使固相分析物组合物接触i)抗体，其中所述抗体特异于所述目标分析物；和ii)样品；其中所述固相分析物组合物包含结合在固相支持物上的至少两种不同的分析物，其中所述至少两种不同的分析物中的一种为目标分析物，以及
(b)测定样品中是否存在目标分析物。
在一些实施方式中，固相分析物组合物首先与样品相接触，然后与抗体相接触。在一些实施方式中，抗体可检测标记，例如，标有荧光、发光(包括化学发光或生物发光)、放射性或酶标记物等可检测标记物。在一些实施方式中，抗体没有被标记。
在一些实施方式中，方法包括去除没有结合于固相分析物组合物的抗体。
在一些实施方式中，方法包括如果存在分析物，测定分析物存在的量。
在一些实施方式中，通过比较样品中结合于固相分析物组合物的抗体产生的信号和不包含目标分析物的对照样品中结合于固相分析物组合物的抗体产生的信号来测定样品中存在分析物。
在一些实施方式中，结合于固相分析物组合物的抗体产生的信号是由抗体上的可检测标记物产生的。
在一些实施方式中，结合于固相分析物组合物的抗体产生的信号是由第二抗体与所述抗体结合产生的，其中所述第二抗体被可检测标记。
在一些实施方式中，可检测的标记物为荧光、发光(包括化学发光或生物发光)、放射性或酶标记物。
在一些实施方式中，方法还包括将固相分析物组合物与一个第二抗体相接触，其中第二抗体特异于结合于固相的至少第二个不同分析物，并且测定样品中是否存在第二分析物。
在方法的一些实施方式中，至少两种不同的分析物直接地或间接地非共价结合于固相。
在一些实施方式中，至少两种不同的分析物直接地或间接地共价结合于固相。
在一些实施方式中，至少两种不同的分析物通过吸附直接地或间接地结合于固相。
在一些实施方式中，至少两种不同的分析物是共价结合于结合剂，所述结合剂非共价地或通过吸附结合于固相。
在一些实施方式中，结合剂选自HSA和BSA。
在一些实施方式中，至少两种不同的分析物为滥用药物或其代谢物。滥用药物或其代谢物可选自可卡因、苯酰牙子碱、古柯乙烯(cocaethylene)、去甲可卡因(norcocaine)、PCP、苯丙胺、甲基苯丙胺、大麻素、THC、羧基-THC、海洛因、可待因、吗啡，6-单乙酰吗啡(MAM)、羟考酮、3，4-亚甲基二氧苯丙胺(MDA)或3，4-亚甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA)。
样品可为身体样品或来源于身体样品的样品。
身体样品可来源于人，并且为选自脑、心、肺、肾、肝、肌肉、骨、胃、肠和皮肤等的组织样品；选自尿、血液、血浆、血清、唾液、精液、痰、脑脊液、粘液、汗、玻璃液和乳汁等的生物液；和角质化结构。
固相支持物可为微孔板的微孔。
还提供了一种测定样品中多种(用数字“N”表示)不同的目标分析物的存在的方法，该方法包括：
(a)使固相分析物组合物接触i)多种抗体，其中所述多种抗体包含特异于每种不同目标分析物的抗体；和ii)样品；其中所述固相分析物组合物包含结合于固相支持物的至少“N”种不同的分析物，其中所述结合的至少“N”种不同的分析物包括多种目标分析物，以及
(b)测定多种目标分析物中每种不同的分析物是否存在于样品中。
在一些实施方式中，特异于各种不同目标分析物的抗体是可以分别检测的。在一些实施方式中，抗体用可检测的荧光、发光(包括化学发光或生物发光)、放射性或酶标记物标记。
在一些实施方式中，方法包括测定如果存在的每种不同目标分析物的量。
在一些实施方式中，通过比较样品中结合于固相分析物组合物的特异于一种特定目标分析物的抗体产生的信号和不包含特定目标分析物的对照样品中结合于固相分析物组合物的相同抗体产生的信号来测定样品中存在各种不同的目标分析物。
在一些实施方式中，多种抗体同时接触固相分析物组合物。
在一些实施方式中，多种抗体中的至少一种是在与多种抗体中的至少另一种抗体不同的时间接触固相分析物组合物。
还提供了一种包含至少两种不同的结合于固相的分析物的组合物。至少两种不同的分析物直接地或间接地共价结合于固相。至少两种不同的分析物直接地或间接地非共价结合于固相。
在一些实施方式中，组合物包含2-10种不同的结合于固相的分析物。在一些实施方式中，至少两种不同的分析物为滥用药物分析物或其代谢物。在一些实施方式中，至少两种不同的分析物选自可卡因、苯酰牙子碱、古柯乙烯、去甲可卡因、PCP、苯丙胺、甲基苯丙胺、大麻素、THC、羧基-THC、海洛因、可待因、吗啡，6-单乙酰吗啡(MAM)、羟考酮、3，4-亚甲基二氧苯丙胺(MDA)或3，4-亚甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA)。
还提供了一种试剂盒，其包含如本发明所述的组合物，以及至少一种特异于结合在固相上的两种不同分析物中至少一种的抗体。在一些实施方式中，试剂盒可包含至少一种特异于选自下组的分析物的抗体：可卡因、苯酰牙子碱、古柯乙烯、去甲可卡因、PCP、苯丙胺、甲基苯丙胺、大麻素、THC、羧基-THC、海洛因、可待因、吗啡，6-单乙酰吗啡(MAM)、羟考酮、3，4-亚甲基二氧苯丙胺(MDA)和3，4-亚甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA)。
还提供了一种测定样品中存在目标分析物或其一种或多种代谢物的方法，包括：
(a)使固相分析物组合物接触i)抗体，其中所述抗体特异于目标分析物，并且还能结合目标分析物的一种或多种代谢物；和ii)样品；其中所述固相分析物组合物包含结合在固相支持物上的至少两种不同的分析物，其中所述至少两种不同分析物中的一种为目标分析物，以及：
(b)测定样品中是否存在目标分析物或其一种或多种代谢物。
还提供了一种测定样品中存在一种目标药物类型的至少一个成员的方法，包括：
(a)使固相分析物组合物接触i)抗体，其中所述抗体特异于目标药物类型的成员，并且还能结合目标药物类型的一个或多个其他成员、或是目标药物类型的一个成员的一种或多种代谢物；和ii)样品；其中所述固相分析物组合物包含结合在固相支持物上的至少两种不同的分析物，其中所述至少两种不同分析物中的一种为目标药物类型的一个成员，以及：
(b)测定样品中是否存在目标药物类型的至少一个成员。
在任一种方法中，至少两种不同分析物可选自滥用药物、有毒化学品、环境化学品、石油产品、天然产物、有机化合物、营养物、处方药和非处方药，或是前述任一物质的代谢物、衍生物或分解产物。
在方法的一些实施方法中，至少两种不同分析物可选自：鸦片样物质、苯丙胺、NSAIDS、类固醇、大麻素、苯并二氮巴比妥盐、三环类和麻黄素，或是前述任一物质的代谢物、衍生物或分解产物。
在组合物的一些实施方式中，至少两种不同的分析物可选自滥用药物、有毒化学品、环境化学品、石油产品、天然产物、有机化合物、营养物、处方药和非处方药，或是前述任一物质的代谢物、衍生物或分解产物。
在组合物的一些实施方式中，至少两种不同分析物可选自：鸦片样物质、苯丙胺、NSAIDS、类固醇、大麻素、苯并二氮巴比妥盐、三环类和麻黄素，或是前述任一物质的代谢物、衍生物或分解产物。
在试剂盒的一些实施方式中，组合物包含至少两种选自下组的不同分析物：滥用药物、有毒化学品、环境化学品、石油产品、天然产物、有机化合物、营养物、处方药和非处方药，或是前述任一物质的代谢物、衍生物或分解产物。
在试剂盒的一些实施方式中，组合物包含至少两种选自下组的不同分析物：鸦片样物质、苯丙胺、NSAIDS、类固醇、大麻素、苯并二氮巴比妥盐、三环类和麻黄素，或是前述任一物质的代谢物、衍生物或分解产物。
除非另外说明，本发明所用的所有技术和科学术语具有本发明涉及的领域普通技术人员所通常了解的相同含义。尽管与本发明所述相似或等同的方法和材料也可用于这里所述方法的实践或测试，下面描述了合适的方法和材料。本发明提到的所有的出版物、专利申请、专利和其他参考文献在此整体引用作为参考。万一冲突，以本说明书为准，包括定义。此外，材料、方法和实施例只用于说明，而不用于限制本发明。
其他特性和优点将通过下列详细说明和权利要求而显现出来。
附图说明
图1为本发明提供的一种固相组合物(例如微孔板的微孔)的示意图，该固相组合物上结合有至少两种不同的分析物，在图中用三角形、正方形、圆形、菱形表示。示意图显示了本固相组合物和方法同时测定两种或多种分析物的存在和/或量的的能力。例如，样品中存在的菱形和三角形分析物与结合在固相上的菱形和三角形分析物分别竞争性结合特异于菱形和三角形分析物的标记的抗体，导致信号丢失，例如在洗涤步骤后。特异于菱形和三角形分析物的抗体可以进行差异标记(即这里分别用A和B标记物)，可以分开检测菱形和三角形分析物。
图2为显示采用本发明提供的固相组合物进行并行测试的示意图。在一个并行测试中，检测(或测试)样品中至少一种分析物的存在和/或量，采用本发明提供的固相组合物(例如一个结合有至少两种不同分析物的微孔，结合的分析物中至少一种为所测试的分析物)，至少一种不同分析物可用单独的固相组合物(例如，相邻的微孔同样带有至少两种不同的结合分析物，结合分析物中至少一种为所测试的至少一种不同分析物)来检测(或测试)。在图中，孔1和孔2都结合了相同的4种分析物。在孔1中，显示了检测样品中圆形分析物的竞争性测试，而在孔2(如相邻的孔)中，显示了检测样品中三角形分析物的竞争性测试。
图3为显示采用本发明提供的固相组合物进行连续测试的示意图。在连续测试中，采用本发明提供的固相组合物检测(或测试)样品中的至少一种分析物，接着用同一固相组合物检测(或测试)至少一种不同的分析物。例如，在图中，孔1首先用于在t＝1时检测圆形分析物，接着在t＝2时检测正方形分析物。在t＝2进行第二测试前，可以先去除特异于圆形分析物的抗体；在一些实施方式中，可以在第二测试中保留特异于圆形分析物的抗体，例如，如果它们与特异于正方形分析物的抗体是差异标记的，或是不会干扰正方形分析物的检测。
发明详述
本发明提供了采用带有结合于固相的至少两种不同分析物的固相分析物组合物，快速、灵敏且低成本检测样品中一种或多种不同分析物的材料和方法。材料和方法利用了两种或多种不同分析物结合于单个固相组分产生的惊人的效率和灵敏度。例如，每个微孔结合有相同的两种或多种不同分析物的微孔板，可用于在单个微孔中测定样品中两种或多种不同分析物的存在和/或量，通过在竞争性免疫测试中差异标记针对两种或多种目标分析物中每一种的抗体；通过探测每个特异性抗体的差异信号，确定其特异于的分析物的存在和/或量。
在其他实施方式中，固相分析物组合物可用于测定两种或多种不同分析物的存在和/或量，通过使用分开的(但是结合了同一套两种或多种分析物)固相分析物组合物和特异于目标分析物的合适的标记抗体分开检测(例如并行或平行测试)。在又一些其他实施方式中，相同的固相组合物可用于测定两种或多种不同分析物的存在和/或量，通过首先用固相分析物组合物采用特异于至少第一分析物的抗体来测定至少第一分析物的存在和/或量，然后用同一的固相分析物组合物采用特异于至少第二分析物的抗体来测定至少第二分析物的存在和/或量，例如可为立即检测或是在从第一测试中去除任何干扰性物质后检测。这样的测试形式可以称为连续测试。
组合物
本发明提供了用于检测样品中一种或多种不同目标分析物(例如确定其存在和/或量)的组合物。组合物包含一个结合了至少两种分析物的固相支持物，例如2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20种分析物或更多。在一些实施方式中，2-5种分析物结合于固相支持物。在其他实施方式中，5-10种分析物结合于固相支持物。这样的组合物在本发明中称为固相分析物组合物。
对于本领域普通技术人员而言显而易见，尽管组合物使得测定结合于固相支持物的总数为“N”的不同分析物的存在和/或量成为可能，一个人不需要测定(或评估)用给定固相分析物组合物能够测定的所有分析物的存在和/或量。例如，在一些实施方式中，它可用于测定仅一种目标分析物的存在和/或量。在其他实施方式中，它可用于首先测定一种或多种目标分析物是否存在，接着在测定第二或多种分析物是否存在。本发明所属的固相组合物可用于同时、并行或连续检测多达“N”种结合于固相的分析物。
如本发明所用，短语“测定存在”表示测定分析物是否存在。因此，如果测定一种分析物不存在，这样的行为也还包括在本短语中。
分析物可为任何化学品，包括滥用药物、有毒化学品、环境化学品(例如农药、除草剂和杀虫剂)、石油产品、天然产物、有机化合物、营养物、处方药和非处方药(例如镇痛剂、类固醇、麻醉剂、NSAIDS)，或是前述任一物质的代谢物、衍生物或分解产物。
在一些实施方式中，用于结合于固相支持物的分析物为药物，例如滥用药物，处方药或镇痛药。特定的目标药物类型包括鸦片样物质、类固醇、苯丙胺、大麻素、苯并二氮NSAIDS、巴比妥盐、三环类和麻黄素。
在一些实施方式中，目标分析物可选自：可卡因(以及代谢物苯酰牙子碱、古柯乙烯、去甲可卡因)，鸦片样物质及其代谢物(吗啡、海洛因、6-单乙酰吗啡、二乙酰吗啡、可待因、羟考酮、氢可待因酮、氢吗啡酮、羟吗啡酮和美沙酮)，苯环利定(PCP)，苯丙胺，甲基苯丙胺，MDMA(迷幻剂，亚甲基二氧甲基苯丙胺)，MDA(亚甲基二氧苯丙胺)，大麻素(及THC和羧基-THC代谢物)，丙氧芬，哌替啶，苯并二氮(阿普唑仑，氯氮卓，地西泮，劳拉西泮，氟硝西泮，三唑仑和舒乐安定)，巴比妥盐(甲基苯巴比妥，戊巴比妥)，卡立普多，曲马多，芬太尼，丁丙诺啡，纳曲酮，三环类，尼古丁(及其代谢产物可替宁)，eve(亚甲基二氧乙基苯丙胺)，麦角酸(LSD)，地高辛，哌醋甲酯，对乙酰氨基酚，水杨酸，氟西汀，舍曲林，右美沙芬，麻黄素，苯乙胺，伪麻黄碱和脱氧肾上腺素。
在一些实施方式中，结合于固相支持物的分析物可为滥用药物或其代谢物，并且可选自下列物质：可卡因、苯酰牙子碱、古柯乙烯、去甲可卡因、PCP、苯丙胺、甲基苯丙胺、大麻素、THC、羧基-THC、海洛因、可待因、吗啡，6-单乙酰吗啡(MAM)、羟考酮、3，4-亚甲基二氧苯丙胺(MDA)和3，4-亚甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA)。
在具体实施方式中，组合物可包含下列物质中的至少两种：可卡因、一种或多种鸦片样物质、PCP、苯丙胺和大麻素，结合于固相支持物。在具体实施方式中，两种或多种镇痛药物选自吗啡、可待因、羟考酮、羟吗啡酮、氢可待因酮、氢吗啡酮，可以结合于固相支持物。在一些实施方式中，两种或多种可卡因和一种鸦片样物质可以结合于固相支持物。
任何形式的样品都可用于测试一种或多种目标分析物的存在和/或量。在某些情况下，样品包含或可能包含一种或多种目标分析物，例如一种或多种滥用药物或有毒化学品。样品可为身体样品或非身体样品。身体样品可以为来自个体(例如人、小鼠、大鼠、猪、马、猴、兔、牛、绵羊或山羊)的样本。身体样品可为组织样品，例如脑、心、肺、肾、肝、肌肉、骨、胃、肠或皮肤的组织样品。身体样品可以从活检或从组织培养获得。身体样品可以包括生物液，例如尿、血液、血浆、血清、唾液、精液、痰、脑脊液、粘液、汗、乳汁、玻璃液等等。身体样品可为角质化结构，例如毛发、手指甲或脚趾甲。非身体样品可为例如土壤或水样品、植物样品、或无机材料样品，或是在研究或制造过程中得到的样品。
样品可以用作或者可以处理成为用于检测一种或多种分析物的最终样品。例如，样品可以被液化、浓缩、干燥、稀释、冻干、萃取、分馏、上层析柱、纯化、酸化、还原、降解、进行酶处理、或是用本领域普通技术人员已知的方式进行处理，从而释放出目标分析物。如果需要，样品可以为样品的组合(集合)，如从一个个体或是从一个制造过程中获得的。
样品可为各种物理状态，例如液体、固体、乳剂或凝胶。可小心处理样品以保持分析物的完整性。处理可以包括使用合适的缓冲液和/或抑制剂，例如某些生物酶的抑制剂。获知目标分析物和样品的性质，本领域的普通技术人员能够确定合适的条件。
如本发明所用，术语“固相”和“固相支持物”可以互换使用，并且指可以结合一种或多种分析物的任何固体或半固体材料，例如一种它们可以共价或非共价结合的材料，可为直接或间接结合；或是一种它们能够合为一体(例如物理包埋、吸附等)的材料；或是一种能够功能化以包含(例如结合)两种或多种分析物的材料。除了分析物，固相支持物还可包含各种材料，包括例如天然或合成的聚合物、树脂、金属或硅酸盐。
合适的固相支持物是本领域已知的，并且示例包括琼脂糖(商品名为Sepharose)；纤维素(例如羧甲基纤维素)；右旋糖酐(例如Sephadex)；聚丙烯酰胺；聚苯乙烯；聚乙二醇；树脂；硅酸盐；二乙烯基苯；甲基丙烯酸酯；聚甲基丙烯酸酯；玻璃；陶瓷；纸；金属；非金属；聚丙烯酰吗啉；聚酰胺；聚(四氟乙烯)；聚乙烯；聚丙烯；聚(4-甲基丁烯)；聚(乙烯对苯二酸酯)；人造丝，尼龙，聚(乙烯丁酸酯)；聚偏二氟乙烯(PVDF)；硅树脂；聚甲醛；醋酸纤维素，硝基纤维素，或两种或多种上述任意物质的组合。所需要的只是固相支持物中的材料或材料组合基本不会影响两种或多种分析物与特异于每个分析物的抗体之间的结合，例如在某些情况下只是最低限度的影响。
固相支持物可为各种物理形式，其包括例如膜；芯片；玻片(例如玻璃载玻片或盖玻片)；柱；空心、固体、半固体、带有孔或空腔的颗粒，例如珠子；凝胶；纤维包括光纤材料；基质；和样品容器。样品容器的非限制性例子包括样品孔、管子、毛细管、小瓶以及能够存放样品的任何其他容器、凹槽或纹齿。样品容器可以包含在一个多样品平台上，例如微孔板、玻片、微流体装置、多孔或微孔板等等。用于结合分析物的颗粒可为各种尺寸的，包括能在所需粘度的溶液中保持悬浮的颗粒，以及在所需粘度的溶液中容易沉淀的颗粒。可以选择颗粒，以使得容易从样品组成中分离颗粒，例如通过引入纯化标签用合适的标签结合材料来分离，利用顺磁性来进行磁性分离，等等。
通常，本发明描述的颗粒为球状。然而，颗粒可为如长方形或管状。在一些实施方式中，例如晶形颗粒，颗粒可为(规则的或不规则的)多面体形，例如立方形。在一些实施方式中，颗粒可为无定形的。
在一些实施方式中，颗粒混合物可基本为球形，基本为长方形，基本为管状，基本为多面体或基本为无定形。“基本为”表示颗粒混合物中超过30％(例如35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更多)为给定形状。
在一些实施方式中，颗粒的直径(或最长直线度)可在约1纳米到约1000纳米之间或更大。例如颗粒可为至少约1纳米到1000纳米(例如至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975或1000纳米)。在一些实施方式中，颗粒的直径(或其最长直线度)可为不超过1000纳米(例如，不超过975、950、925、900、875、850、825、800、775、750、725、700、675、650、625、600、575、550、525、500、475、450、425、400、375、350、325、300、275、250、225、200、175、150、125、100、75、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5纳米)。
生产固相支持物的合适方法，以及用于本发明所述的组合物和方法的固相支持物(例如颗粒)的其他例子，可在如PCT公报WO01/84157、WO99/30160、WO99/42838和WO06/078618中找到，这些公报都在此整体引用作为参考。
分析物可以用本领域普通技术人员已知的多种方式结合于固相支持物。例如，分析物可以共价或非共价地结合于固相支持物，可为直接的或间接的，例如通过接头、结合剂或结合对的成员。例如，分析物可以直接共价结合于固相支持物，例如通过分析物上的官能团和固相支持物上的官能团之间的化学键。任选地，分析物可为间接共价结合于固相支持物，例如分析物可以共价结合于接头或结合剂，接头或结合剂本身共价结合于固相支持物。在一些实施方式中，分析物直接非共价结合于固相支持物，例如分析物非共价结合于或吸附于固相支持物。在其他实施方式中，分析物间接非共价结合于固相支持物，例如共价结合于接头、结合剂和结合对，接头、结合剂和结合对非共价的结合于固相支持物。在所有情况下，与抗体对没有结合于固相的分析物的特异性相比，目标分析物和固相的结合应该基本不影响抗体对所结合的分析物的特异性，例如应该只是最低限度影响。
可用于将分析物共价结合于支持物的各种化学反应是本领域技术人员所熟知的(参见例如Hartmann等.(2002)J.Mater.Res.17(2)：473-478)。用于共价结合于支持物的官能团的示例包括烷基、硅羟基、羧基、羰基、羟基、酰胺、胺、氨基、醚、酯、环氧化物、氰酸酯，异氰酸酯，硫氰酸酯，巯基，二硫化物，氧化物，重氮化物，碘，磺酸基或具有化学或潜在化学反应能力的类似基团。
分析物可为非共价的结合于固相支持物，例如通过吸附或包被到固相支持物上，或是通过共价或非共价的结合于接头、结合剂或结合对成员，接头、结合剂和结合对成员本身非共价结合或结合于固相支持物。可用于将分析物结合于支持物的接头、结合剂或结合对成员的示例包括蛋白、有机聚合物(PEG及其衍生物)、以及小分子。特别优选的例子包括HSA、BSA、链霉亲和素、抗生物素蛋白、生物素、PEG、以及抗体或抗体片段。
例如，在一个优选实施方式中，分析物可以共价偶联到例如HSA或BSA等结合剂上，然后可将所得的共价偶联物用于非共价包被固相支持物。在另一个实施方式中，分析物可以共价偶联到生物素和抗生物素蛋白结合对的一个成员上；然后共价偶联物可非共价结合于结合对的另一个成员，所述另一个成员可以非共价的结合(例如包被)到固相支持物上。在其他实施方式中，分析物和结合对的一个成员的共价偶联物可以非共价的结合于结合对的另一个成员，所述另一个成员已经共价结合于固相支持物。
接头或结合剂也可用于将分析物共价结合于固态支持物。例如，分析物与如HSA或BSA等结合剂的共价偶联物可共价结合于固相支持物。
在一些实施方式中，固相支持物的表面可被修饰，以促进接头或结合剂的稳定连接。一般而言，熟练的技术人员可根据所需的应用，采取常规的方法来修饰固相支持物。下面为固相支持物修饰的非限制性例子。
例如，固相支持物的表面可以带有促进与分析物结合的涂层。一般而言，涂层是与分析物上的接头部分互补的。固相支持物的表面可以是酰胺化的，例如通过表面甲硅烷化，如采用三烷氧基氨基硅烷。硅烷处理的支持物也可用同双功能接头和异双功能接头衍生化。支持物可以是衍生化的，例如它带有羟基、氨基(如烷基胺)、羧基、N-羟基-琥珀酰亚胺酯、光激活基团、巯基、酮、或可用于反应的其他官能团。支持物可以结合覆膜进行衍生化，使得只有有限的区域(例如多孔测试板的某些孔)衍生化，或是化学蚀刻或紫外灯可用于从所选的区域去除衍生化。
官能团可以在第一固相支持物的制备过程中或之后整合到第一固相支持物上，而不是包被到表面上。通常选择将官能团溶解在第一固相支持物的一种或多种组分中，但可共价结合于第一固相支持物。
用于将分析物结合于固相支持物的其他方法，在如PCT公报WO01/84157、WO99/30160和WO06/078618中有描述，每个公报的内容都在此整体引用作为参考。
如本发明所述，两种或多种分析物是结合在固相支持物上的。两种或多种分析物中的每一种与固相支持物的结合类型可为相同的，或相对于其他分析物的结合不同的。例如，一种分析物可以直接共价结合，而另一个可为通过接头部分间接共价结合。在另一个实施方式中，一种分析物可以共价结合于如BSA等结合剂，结合剂非共价结合于固相支持物，而另一种分析物是直接共价结合于固相支持物。所需要的只是分开结合不会影响(例如基本不会影响)分析物与特异于分析物的抗体之间的结合。
包含结合于固相的两种或多种不同分析物的固相组合物可以惊人的牢固，例如可以在室温下长期稳定。在一些实施方式中，本发明所述的固相组合物可以是冷冻的、冻干的、或是固定化且存储在合适的条件下。条件应该使得分析物可以保持活力。
示例性的固相组合物在图1-3中阐明，并且在下文中描述。
应用
本发明所述的技术涉及测定一种或多种目标分析物的存在和/或量。一般而言，方法涉及竞争性免疫测试，这是本领域普通技术人员所熟知的方法。在本发明所用的竞争性免疫测试中，结合于固相的分析物与样品溶液(如测试样品)中存在的分析物竞争结合于抗体，例如标记的抗体。在将样品施用到固相组合物上之后抗体产生的信号可以与在将其施用到对照样品上后产生的信号、或施用测试样品前产生的信号相比，从而确定分析物的存在。重要地是，如果需要，本组合物和方法允许同时或连续检测两种或多种分析物，灵敏度高且来自其他分析物的干扰最小。
在方法中，固相分析物支持物是通过至少两种分析物结合于一个固相上制备的，所述固相例如颗粒或多孔板的多孔。然后，固相分析物支持物可与一种或多种抗体相接触，其中至少一种抗体是特异于结合于固相组合物的两种分析物中的一种，并且也与样品(如测试样品)相接触，样品可包含或疑似包含一种或多种目标分析物。通常，抗体被可检测标记(例如放射性的、荧光的、发光的或酶标记)，或是可以通过本领域普通技术人员已知的方法(例如酶扩增方法)使用与第一抗体结合的第二抗体来检测。在这些方法中，抗体与其特异于的分析物之间的相互作用产生可检测的信号，例如通过抗体上的可检测标记物或通过第二抗体上的标记物。信号可以用读数来测量分析物的存在或量。
方法中使用的抗体可为特异于目标分析物的任何抗体。该术语包括抗体或其分析物结合片段。术语也可包括人源化抗体，完全人源抗体，单链抗体，嵌合抗体，Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、Fv片段和scFv片段。针对目标分析物的抗体可以从多种商业来源获得，或者可以用本领域普通技术人员已知的方法来制备和分离，例如从产生抗体的宿主动物(例如，如大鼠、兔、小鼠、山羊、牛、马、狗、猫、绵羊、驴、鸡或人等哺乳动物)或细胞(例如杂交瘤)分离抗体。
在一些实施方式中，抗体是特异于目标分析物的，并且还能结合目标分析物的一种或多种代谢物。例如抗体可以特异性的针对可卡因，也能表现出与一种或多种可卡因代谢物的交叉反应结合。在这样的情况下，交叉反应结合应该足以用本发明所述的方法来检测一种或多种代谢物。
同样地，抗体可以特异于一种目标药物类型的一个成员，且也能与目标药物类型的一个或多个成员和/或其代谢物结合。例如，抗体可以特异于一种特定的鸦片样物质，也能表现出与其他鸦片样物质的交叉反应结合。在这样的情况下，交叉反应结合应该足以用本发明所述的方法来检测药物类型中的一种或多种药物或药物代谢物。
用于测定一种或多种分析物的存在和/或量的方法是如下进行的。如上所述，固相分析物组合物，例如包含每个微孔结合有至少两种不同分析物的微孔板，可以接触：i)至少一种抗体，其中至少一种抗体特异于一种目标分析物；以及ii)样品，如前所述。接触可以包括任何接触方法，例如手动移液、洗涤、机器人或自动分液装置，或是本领域普通技术人员已知的其他方式。接触方法中的常规注意事项，例如无菌技术或保持样品完整性的其他方法是本领域普通技术人员已知的。
固相分析物组合物可以首先与抗体相接触，然后与样品接触，或者反之亦然。已知量的抗体可以与固相组合物相接触，例如在定量方法中。
通常，抗体被可检测标记，并且标记物能够测定分析物的存在。例如，抗体被可检测地标记上了荧光、发光(包括化学发光或生物发光)、放射性或酶标记物。在其他情况下，抗体没有被标记，但可以通过使用第二抗体来检测，第二抗体本身被标记(例如酶标记)并且特异于第一抗体。在同时检测多种分析物的情况下，针对每个目标分析物的独立抗体优选是差异标记的，使得每样品可以与其他样品分开被检测，例如通过使用吸收/发射光谱不重叠的荧光标记物。用于检测的方法，包括自动化方法，是本领域普通技术人员所熟知的。
任一方法可以采用洗涤步骤，例如来去除没有结合于固相分析物组合物的抗体和分析物。合适的洗涤条件可由本领域普通技术人员来确定，并且应该基本不干扰抗体结合于固相的结合分析物，或仅是最低限度干扰。
通过利用测试的竞争性特性，可以确定样品中存在分析物。例如，通过比较由接触样品(如测试样品)后结合于固相分析物组合物的抗体产生的信号、和接触不包含目标分析物的对照样品后结合于固相分析物组合物的抗体产生的信号，可以确定分析物的存在。
在任何方法中，固相分析物组合物可以与第二抗体相接触，其中第二抗体是特异于结合在固相上的第二种不同的分析物。可以在与第一抗体相同的时间(例如在两个分析物的同时测试中)、或连续的(例如需要在测定第二分析物前确定第一分析物存在的测试中)接触第二抗体。本领域的普通技术人员会意识到，在方法中可以采用多达N种抗体，对应于与固相结合的分析物的数量，其中抗体群包括至少一种特异于每种结合的分析物的抗体。此外，当在同时测试中可以检测多达N种分析物时，在任何测试中可以检测任何较少数量的分析物，或者可以在一个同时或连续测试中检测任意的组合。另外，在某些实施方式中，例如采用微孔板的实施方式中，一个微孔可用于测试一种或多种目标分析物，而另一个微孔可用于测试相同的目标分析物组，、不同的目标分析物组、或是有交叉但不完全相同的目标分析物组。
试剂盒
本发明也提供了试剂盒，例如包括一种或多种本发明所述的固相分析物组合物的试剂盒。试剂盒可包含其他组分，包括缓冲液、试剂、使用说明、以及方法中使用的一种或多种抗体。在一些实施方式中，试剂盒中包含至少一种特异于选自下组的分析物的抗体：可卡因、苯酰牙子碱、古柯乙烯、去甲可卡因、PCP、苯丙胺、甲基苯丙胺、大麻素、THC、羧基-THC、海洛因、可待因、吗啡，6-单乙酰吗啡(MAM)、羟考酮、3，4-亚甲基二氧苯丙胺(MDA)和3，4-亚甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA)。在一些实施方式中，试剂盒可包含用于样品制备的其他试剂，包括提取或处理用于这些方法的样品的试剂。
实施例
实施例1从头发中还原性提取分析物，并且用结合有多种分析物的固相组合物来检测多种分析物
采用2008年4月29日与本发明同时提交的美国专利申请序列号《用于测定角质化结构中分析物的非蛋白水解法》(Non-ProteolyticMethodForTheDeterminationOfAnalytesInKeratinizedStructures)(公开了用于从头发中提取分析物的非蛋白水解还原性方法)中公开的萃取方法分析头发样品中是否存在多种分析物(如滥用药物)。采用这样的非蛋白水解还原性方法获得的结果也与采用如美国专利第6,022,693号、第6,350,582号和第6,949,344号中公开的方法(公开了用于从头发中提取分析物的蛋白水解和还原联合法)获得的结果进行比较。一旦提取，采用本发明公开的方法和组合物评估测试样品中是否存在多种滥用药物分析物，例如与结合有两种或多种分析物的固相、以及一种或多种第一抗体相接触，其中所述每种第一抗体特异于一种特定的分析物；然后检测每种第一抗体，例如通过第一抗体上的标记物或通过被标记的第二抗体来检测第一抗体。
I.溶液
用于消化头发样品的溶液：1.5％的二硫苏糖醇的水溶液，pH9.45-9.55用于中和消化的头发样品的溶液：
1.5％的氯化锌水溶液
2.1.0MBisTrispH7
3.临用前，将氯化锌1∶10稀释在Bis-Tris中
II.酶免疫测试(EIA)的分析物提取的处理过程
8mg头发样品放入装有0.8mL1.5％二硫苏糖醇溶液(pH9.5)的试管中，并且样品在37℃孵育2小时。样品用70μL氯化锌的Bis-Tris溶液中和，混合均匀并且离心。
III.采用多分析物包被的微孔板并且使用头发的二硫苏糖醇提取物的酶免疫测试(EIA)：可卡因、鸦片样物质、苯丙胺、PCP
A.微孔板的制备：用BSA-分析物偶联物包被
购自东海岸生物公司(EastCoastBiologicals)的目标药物的BSA(牛血清白蛋白)偶联物是配制在水中的。BSA偶联物(BSA-苯酰牙子碱、BSA-吗啡、BSA-PCP、BSA-甲基苯丙胺)是溶解在水中的，使得在50微升的药物偶联物溶液中每种分析物为1-10纳克。
为了包被各孔，向96孔微孔板(康宁科技公司(CorningScientific)的高结合力微孔板)的孔中加入50微升/孔药物偶联物溶液，该溶液含有苯酰牙子碱、吗啡、CPC和甲基苯丙胺的BSA-偶联物。板子加盖并且在摇床上室温下100转/分钟摇过夜。
在摇过夜后，去除分析物混合物，并且用PBS(磷酸缓冲盐水)洗涤各孔一次。为了封闭各孔，向所有孔中加入300微升含有1％BSA的PBS，微孔板在室温下摇4-6小时(旋转速度约100转/分钟)。
在封闭后，各孔用含有0.01％Tween-20的PBS洗涤6次。在洗涤后，将板子翻转并且在台面上轻拍，以去除液体。然后将板子保持翻转在实验台上干燥几个小时或过夜。干燥后，把它们放入干燥密封真空包装袋中；用真空泵从袋中抽走空气并且封住袋子进行储存。
B.分析
消化并且中和后的头发样品的等分试样在微孔板的孔中与针对目标分析物的合适第一抗体混合。在室温下孵育1小时后，在自动化洗板机上用PBS洗板。洗涤后，向孔中加入连有HRP(辣根过氧化物酶)的第二抗体(针对第一抗体的类型)，板子在室温下孵育1小时。再次洗板，并且底物(TMB、3，3’，5，5’-四甲基联苯氨)在孔中孵育30分钟。最后加入50微升4N的盐酸，并且读取620纳米的吸光度。
1.头发中的可卡因：固相分析物酶免疫测试(EIA)
固相抗原EIA得到的可卡因结果的例子
＊注释：EIA的B/Bo百分比-100％的阴性(Bo)值是样品中不含分析物的对照管，并且抗体对抗原表现出最大结合力。未知样品用阴性Bo的百分比来表示，称为“B/Bo百分比”。样品中分析物的浓度与B/Bo百分比值呈反比。阳性样品是含有等于或高于校正截断值的药物，并且B/Bo百分比等于或低于校正截断值的样品。
**COC＝可卡因；BE＝苯酰牙子碱；CE＝古柯乙烯；NOR＝去甲可卡因
2.头发中的鸦片样物质：固相抗原酶免病测试
固相分析物EIA得到的鸦片样物质的结果的例子
**MAM＝6-单乙酰吗啡
3.头发中的甲基苯丙胺/MDMA：固相分析物酶免疫测试
固相分析物EIA的甲基苯酰胺/MDMA(迷幻剂)的结果的例子
**METH＝甲基苯丙胺；AMP＝苯丙胺；MDA＝3，4-亚甲基二氧苯丙胺；MDMA＝3，4-亚甲基二氧甲基苯丙胺
实施例2：从头发中甲醇提取分析物，并且用结合有多种分析物的固相组合物末检测多种分析物
分析头发样品中是否存在多种分析物(如滥用药物)，采用如Yegles等在2007年CRC出版社出版的《头发中药物测试的分析和实践》第73-94页；Jurado，C在CRC出版社出版的《头发中药物测试的分析和实践》第95-125页；Cheze，M等在CRC出版社出版的《头发中药物测试的分析和实践》第163-185页(Yegles，etal.，in：AnalyticalandPracticalAspectsofDrugTestinginHair，CRCPress，2007，pp.73-94；Jurado，C.in：AnalyticalandPracticalAspectsofDrugTestinginHair，CRCPress，2007，pp.95-125；Cheze，M.etal.in：AnalyticalandPracticalAspectsofDrugTestinginHair，CRCPress，2007，pp.163-185)中所公开的甲醇提取方法。一旦提取，采用本发明所公开的方法和组合物来评估测试样品中是否存在多种滥用药物分析物，例如接触结合有两种或多种分析物的固相以及一种或多种第一抗体，每种第一抗体特异于一种特定分析物；然后检测每种第一抗体，例如通过第一抗体上的标记物或通过被标记的第二抗体来检测第一抗体。
I.溶液
酸化的甲醇：含1％盐酸的甲醇
II.用于酶免疫测试的分析物提取的处理过程
在螺纹盖的玻璃管中，2毫升酸化的甲醇加入到10-12毫克头发上。管子在60℃孵育过夜(16小时)。然后将甲醇移入一个干净的管子中，并且在50℃的加热模块上蒸发干燥头发。干燥的样品用PBS重新溶解，达到头发浓度为10毫克头发/毫升PBS。
III.采用多分析物包被的微孔板并且使用头发的甲醇提取物的酶免疫测试：可卡因、鸦片样物质、苯丙胺
对于EIA，过滤所有的试剂来避免细菌污染。
A.微孔板的制备：用BSA-分析物偶联物包被-COMBO板
如前文实施例1.III.A所述制备微孔板
B.分析
提取物的分析采用与分析消化的样品相同的方式进行
1.头发中的可卡因：采用甲醇提取的固相分析物酶免疫测试
固相分析物EIA得到的可卡因结果的例子
2.头发中的鸦片样物质：采用甲醇提取的固相分析物酶免疫测试
固相分析物EIA得到的鸦片样物质的结果的例子
3.头发中的甲基苯丙胺/MDMA：采用甲醇提取的固相分析物酶免疫测试
固相分析物EIA得到的甲基苯丙胺/MDMA(迷幻剂)的结果的例子
其他实施方式
已经描述了很多实施方式。然而，应该理解可以不超出本发明的主旨和范围进行各种各样的改变。因此，其它实施方式也包含在下列权利要求的范围内。

Claims (18)

1.一种测定样品中目标分析物的存在的方法，包括：
(a)使固相分析物组合物接触i)抗体，其中所述抗体特异于所述目标分析物；和ii)样品；其中所述固相分析物组合物通过将至少两种不同的分析物的混合物结合在其单个固相组分上形成，其中所述至少两种不同的分析物是滥用药物或其代谢物，其中所述至少两种不同的分析物中的一种为目标分析物，以及
(b)测定样品中是否存在所述目标分析物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相分析物组合物首先接触样品，然后接触抗体。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体被可检测标记。
4.如权利要求1所述的方法，还包括去除没有结合于固相分析物组合物的抗体。
5.如权利要求1所述的方法，还包括使固相分析物组合物接触第二抗体，其中所述第二抗体特异于结合于固相的至少第二种不同的分析物，并且测定样品中是否存在第二分析物。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少两种不同的分析物直接地或间接地非共价结合于固相，或所述至少两种不同的分析物直接地或间接地共价结合于固相。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述至少两种不同的分析物通过吸附直接地或间接地结合于固相。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述至少两种不同的分析物共价结合于结合剂，所述结合剂非共价地结合于固相。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述结合剂通过吸附结合于固相。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述结合剂选自HSA或BSA。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述滥用药物或其代谢物选自可卡因、苯酰牙子碱、古柯乙烯、去甲可卡因、PCP、苯丙胺、甲基苯丙胺、大麻素、THC、羧基-THC、海洛因、可待因、吗啡、6-单乙酰吗啡(MAM)、羟考酮、3,4-亚甲基二氧苯丙胺(MDA)或3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA)。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品为身体样品或来源于身体样品的样品。
13.一种测定样品中多种不同的目标分析物的存在的方法，所述多种用数字“N”表示，该方法包括：
(a)使固相分析物组合物接触i)多种抗体，其中所述多种抗体包含特异于各种不同目标分析物的抗体；和ii)样品；其中所述固相分析物组合物通过将至少“N”种不同的分析物的混合物结合于其单个固相组分上形成，其中所述至少两种不同的分析物是滥用药物或其代谢物，其中所述结合的至少“N”种不同的分析物包括多种目标分析物，以及
(b)测定多种目标分析物中各种不同目标分析物是否存在于样品中。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述特异于各种不同目标分析物的抗体是可分别检测的。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述多种抗体同时接触固相分析物组合物，或所述多种抗体中的至少一种在与多种抗体中的至少另一种抗体不同的时间接触固相分析物组合物。
16.一种通过将至少两种不同的分析物的混合物结合于单个固相组分上形成的组合物，其中所述至少两种不同的分析物是滥用药物或其代谢物。
17.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述至少两种不同的分析物直接地或间接地共价结合于固相，或所述至少两种不同的分析物直接地或间接地非共价结合于固相，或所述组合物包含2-10种不同的结合于固相的分析物，或所述至少两种不同的分析物选自可卡因、苯酰牙子碱、古柯乙烯、去甲可卡因、PCP、苯丙胺、甲基苯丙胺、大麻素、THC、羧基-THC、海洛因、可待因、吗啡，6-单乙酰吗啡(MAM)、羟考酮、3,4-亚甲基二氧苯丙胺(MDA)或3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA)。
18.一种试剂盒，其包含如权利要求16所述的组合物以及至少一种特异于结合在单个固相组分上作为混合物的两种不同分析物中至少一种的抗体。
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