JP2837921B2 - 毛髪分析法 - Google Patents
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
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Description
【発明の詳細な説明】 〔関連出願に対するクロス・リファレンス〕 本出願は、1988年７月６日出願の同時係属米国出願第
215,591号の一部継続出願であり、これは特に1987年12
月28日出願の同時係属米国出願第138,515号の一部継続
出願である。
215,591号の一部継続出願であり、これは特に1987年12
月28日出願の同時係属米国出願第138,515号の一部継続
出願である。
本発明は、分析物（analyte）の構造に影響を及ぼし
たり、または生物学的分析用プローブ、例えば抗体、RN
A/DNAおよびバイオリアクタープローブに対して不利に
なることなく、毛髪および他の角質化構造物、例えば指
爪および足指爪中に存在する有機分析物、例えば乱用薬
物の比較的迅速な可溶化および直接分析を果たす改良さ
れた分析法に関する。分析用プローブを、可溶化された
分析物含有溶液に直接添加し、分析物の正体並びに被検
者による消費の程度および持続期間を測定することによ
り直接分析することができる。
たり、または生物学的分析用プローブ、例えば抗体、RN
A/DNAおよびバイオリアクタープローブに対して不利に
なることなく、毛髪および他の角質化構造物、例えば指
爪および足指爪中に存在する有機分析物、例えば乱用薬
物の比較的迅速な可溶化および直接分析を果たす改良さ
れた分析法に関する。分析用プローブを、可溶化された
分析物含有溶液に直接添加し、分析物の正体並びに被検
者による消費の程度および持続期間を測定することによ
り直接分析することができる。
従来、微量金属の検出のための毛髪分析技術は個体の
栄養状態に基づく情報を提供するという趣旨で開発され
た。これらの技術の使用の難点は、血流から毛髪中に沈
着された微量金属と、例えば水や化粧品剤との外的接触
を通じて留められるようになった金属とを識別すること
の難しさである。結果として、これらの技術は栄養上の
問題を診断するための医療団体によっては有用とみなさ
れず、従って被験者により消費された特定の微量金属の
レベルを充分に正確に決定すると考えられていない。
栄養状態に基づく情報を提供するという趣旨で開発され
た。これらの技術の使用の難点は、血流から毛髪中に沈
着された微量金属と、例えば水や化粧品剤との外的接触
を通じて留められるようになった金属とを識別すること
の難しさである。結果として、これらの技術は栄養上の
問題を診断するための医療団体によっては有用とみなさ
れず、従って被験者により消費された特定の微量金属の
レベルを充分に正確に決定すると考えられていない。
従来の毛髪分析技術に伴う問題点のために、被検者中
に摂取された化学物質、例えば乱用薬物、薬剤および毒
性化学物質の検出のための尿および血液分析を頼みにし
ていた。しかしながら、これらの技術もまた、使用また
は暴露の持続期間および強度を確かめることができない
という欠点があることが知られている。尿および血液分
析は、せいぜい摂取された薬物または化学物質、例えば
乱用薬物に関する短期情報を提供できるに過ぎない。加
えて、そのような結果の解釈に伴う問題点も存在する。
例えば、尿中の摂取された化学物質の低レベルの検出
は、被検者が最近に少量の薬剤もしくは化学物質を摂取
したか、または数日前に多量を摂取したことを意味し得
る。従って、テストを繰返さずにこれらの方法を使って
慢性的薬物使用を測定することはできない。
に摂取された化学物質、例えば乱用薬物、薬剤および毒
性化学物質の検出のための尿および血液分析を頼みにし
ていた。しかしながら、これらの技術もまた、使用また
は暴露の持続期間および強度を確かめることができない
という欠点があることが知られている。尿および血液分
析は、せいぜい摂取された薬物または化学物質、例えば
乱用薬物に関する短期情報を提供できるに過ぎない。加
えて、そのような結果の解釈に伴う問題点も存在する。
例えば、尿中の摂取された化学物質の低レベルの検出
は、被検者が最近に少量の薬剤もしくは化学物質を摂取
したか、または数日前に多量を摂取したことを意味し得
る。従って、テストを繰返さずにこれらの方法を使って
慢性的薬物使用を測定することはできない。
乱用薬物、薬剤、毒性化合物等の使用の持続期間およ
び強度を共に測定でき、信頼性があり且つ正確な方法を
確立する課題に応答して、Dr.Werner A.Baumgartnerに
より行われた研究は、「アヘン製剤乱用経歴を測定する
ための毛髪のラジオイムノアッセイ」J.Nucl Med 20:74
9−752（1979）において報告されたように、薬物が毛髪
の合成の間に個体の毛髪線維内部に“トラップ”される
ので、哺乳類の体毛の分析を通して乱用薬物への暴露の
長期経歴が得られることを決定づけた。この点で、毛髪
はテープレコーダーのように働き、即ち、毛髪試料の区
間分析を通して過去の暴露経歴を判断できることが示さ
れた。前に血流中にあったヘロインは、毛髪が合成され
る時に毛髪中に沈着することがわかった。
び強度を共に測定でき、信頼性があり且つ正確な方法を
確立する課題に応答して、Dr.Werner A.Baumgartnerに
より行われた研究は、「アヘン製剤乱用経歴を測定する
ための毛髪のラジオイムノアッセイ」J.Nucl Med 20:74
9−752（1979）において報告されたように、薬物が毛髪
の合成の間に個体の毛髪線維内部に“トラップ”される
ので、哺乳類の体毛の分析を通して乱用薬物への暴露の
長期経歴が得られることを決定づけた。この点で、毛髪
はテープレコーダーのように働き、即ち、毛髪試料の区
間分析を通して過去の暴露経歴を判断できることが示さ
れた。前に血流中にあったヘロインは、毛髪が合成され
る時に毛髪中に沈着することがわかった。
従って、様々な化学物質、例えば乱用薬物、薬剤、毒
性化学物質等（以後ひとまとめにして“分析物”と称す
る）が毛髪の合成の間に毛髪によりトラップされるこ
と、およびそれら物質は本質的に毛髪の存続期間の間は
毛髪中に“閉じ込められる”ことがこの研究により発見
されそして次なる研究により確認された。このことは頭
髪および体毛並びに指爪などの他の角質化構造物につい
て当てはまることがわかった（Suzukiら、Forensic Sc
i.International,24:9−16,1984）。これらのトラップ
された物質は毛髪の外に洗い出すことが不可能であり、
そして毛髪線維の完全な破壊によってのみ放出される。
性化学物質等（以後ひとまとめにして“分析物”と称す
る）が毛髪の合成の間に毛髪によりトラップされるこ
と、およびそれら物質は本質的に毛髪の存続期間の間は
毛髪中に“閉じ込められる”ことがこの研究により発見
されそして次なる研究により確認された。このことは頭
髪および体毛並びに指爪などの他の角質化構造物につい
て当てはまることがわかった（Suzukiら、Forensic Sc
i.International,24:9−16,1984）。これらのトラップ
された物質は毛髪の外に洗い出すことが不可能であり、
そして毛髪線維の完全な破壊によってのみ放出される。
毛髪から分析物を抽出する従来技術の方法は、熱メタ
ノール溶液に毛髪を付すること（Baumgartnerら、J.Nuc
l Med 20,748,1979）およびアルカリ性または酸性媒質
中での毛髪の一晩のインキュベーション（D.Valente
ら、Clinical Chemistry,1952、第27巻、第11号、1981
年）を含んでいた。従来方法はまた、溶媒と共同してト
ラップされた分析物を放出させるための乳鉢および乳棒
の使用を含む。
ノール溶液に毛髪を付すること（Baumgartnerら、J.Nuc
l Med 20,748,1979）およびアルカリ性または酸性媒質
中での毛髪の一晩のインキュベーション（D.Valente
ら、Clinical Chemistry,1952、第27巻、第11号、1981
年）を含んでいた。従来方法はまた、溶媒と共同してト
ラップされた分析物を放出させるための乳鉢および乳棒
の使用を含む。
しかしながら、溶媒抽出法は、摂取された分析物の存
否および量を正確に測定することにおいて幾つかの問題
をかかえている。この問題の１つは、溶媒抽出法がしば
しば毛髪試料中に存在する全分析物のうち未知で且つ不
定の少量の部分しか取り出さないことである。更にその
ような方法は時間を浪費しがちであり、そして通常高い
温度を必要とし、分析物に損傷を与えるかもしれない。
別の欠点は、分析物が異なると異なる抽出溶媒を必要と
することである。例えば、モルヒネ、フェンシクリジン
（“PCP"）、コカインおよびマリファナを含有する毛髪
試料は、幾つかの異なる溶媒を用いて連続的に抽出しな
ければならず、特に、分析におもむく前に溶媒を蒸発さ
せなければならないので、非常に時間のかかる作業であ
る。
否および量を正確に測定することにおいて幾つかの問題
をかかえている。この問題の１つは、溶媒抽出法がしば
しば毛髪試料中に存在する全分析物のうち未知で且つ不
定の少量の部分しか取り出さないことである。更にその
ような方法は時間を浪費しがちであり、そして通常高い
温度を必要とし、分析物に損傷を与えるかもしれない。
別の欠点は、分析物が異なると異なる抽出溶媒を必要と
することである。例えば、モルヒネ、フェンシクリジン
（“PCP"）、コカインおよびマリファナを含有する毛髪
試料は、幾つかの異なる溶媒を用いて連続的に抽出しな
ければならず、特に、分析におもむく前に溶媒を蒸発さ
せなければならないので、非常に時間のかかる作業であ
る。
毛髪の分解および毛髪分析に関連する他の方法および
研究は次のものを含む： O.Suzukiらは、Elsevier Scientific Publishers Ire
land Ltd.,による刊行物の中で、切り取った爪または毛
髪中のメタアンフェタミンおよびアンフェタミンを検出
する方法を開示しており、この方法では該物質をまずメ
タノールと水の混合物中で洗浄し、そして水酸化ナトリ
ウム中に溶解し、次いで抽出された薬剤を分析した。
研究は次のものを含む： O.Suzukiらは、Elsevier Scientific Publishers Ire
land Ltd.,による刊行物の中で、切り取った爪または毛
髪中のメタアンフェタミンおよびアンフェタミンを検出
する方法を開示しており、この方法では該物質をまずメ
タノールと水の混合物中で洗浄し、そして水酸化ナトリ
ウム中に溶解し、次いで抽出された薬剤を分析した。
A.W.Holmesは、Textile Research Journal,706−712,
1964年８月の中で、酵素活性化剤として亜硫酸ナトリウ
ムを使ったパパインによるヒトの毛髪の分解を開示して
いる。
1964年８月の中で、酵素活性化剤として亜硫酸ナトリウ
ムを使ったパパインによるヒトの毛髪の分解を開示して
いる。
Annette M.Baumgartnerらは、Journal of Nuclear Me
dicine,20:748−752,1979の中で、毛髪を乳鉢と乳棒で
粉砕し次いでメタノールで処理することによる毛髪から
のモルヒネおよびヘロインの抽出法を開示している。
dicine,20:748−752,1979の中で、毛髪を乳鉢と乳棒で
粉砕し次いでメタノールで処理することによる毛髪から
のモルヒネおよびヘロインの抽出法を開示している。
D.Valenteらは、Clinical Chemistry、第27巻、第11
号、1981年の中で、毛髪を熱メタノールの処理にかけ、
乱用薬物の抽出を果たすDr.Baumgartnerの技術並びに酸
またはアルカリ性媒質中でモルヒネを抽出する著者の技
術を開示している。
号、1981年の中で、毛髪を熱メタノールの処理にかけ、
乱用薬物の抽出を果たすDr.Baumgartnerの技術並びに酸
またはアルカリ性媒質中でモルヒネを抽出する著者の技
術を開示している。
A.M.Baumgartnerらは、Journal of Forensic Science
s,p.576−81,1981年７月の中で、乳鉢と乳棒を用い続い
てメタノールで処理することによるPCPの抽出を開示し
ている。次いで抽出されたPCPをRIAで分析した。
s,p.576−81,1981年７月の中で、乳鉢と乳棒を用い続い
てメタノールで処理することによるPCPの抽出を開示し
ている。次いで抽出されたPCPをRIAで分析した。
Smithらは、Journal of Forensic Sciences、第26
巻、第３号、1981年７月、p.582−586の中で、フェノバ
ルビタールの存在についての毛髪の試験法を開示してお
り、この方法では、１本の太い毛髪を洗浄し、乾燥し、
2mmの長さに切り、そして0.2mlの0.1％SDS/塩溶液に添
加し、そしてラジオイムノアッセイにより試料を分析し
た。
巻、第３号、1981年７月、p.582−586の中で、フェノバ
ルビタールの存在についての毛髪の試験法を開示してお
り、この方法では、１本の太い毛髪を洗浄し、乾燥し、
2mmの長さに切り、そして0.2mlの0.1％SDS/塩溶液に添
加し、そしてラジオイムノアッセイにより試料を分析し
た。
W.A.Baumgartner,Blackらは、J.Nucl Med 23:790−89
2,1982年の中で、毛髪試料をエタノール中で還流するこ
とによる毛髪試料からのコカインの抽出次いでRIA分析
を開示している。
2,1982年の中で、毛髪試料をエタノール中で還流するこ
とによる毛髪試料からのコカインの抽出次いでRIA分析
を開示している。
Ishiyamaらは、Journal of Forensic Sciences、第28
巻、第２号、1983年４月、p.380−385の中で、１〜２の
pHで1.5N塩酸を使ってメタアンフェタミン常用者からの
毛髪を溶解せしめ、次いでガスクロマトグラフィーとマ
ススペクトロメトリーを使って分析する方法を開示して
いる。
巻、第２号、1983年４月、p.380−385の中で、１〜２の
pHで1.5N塩酸を使ってメタアンフェタミン常用者からの
毛髪を溶解せしめ、次いでガスクロマトグラフィーとマ
ススペクトロメトリーを使って分析する方法を開示して
いる。
K.Puschelらは、Forensic Science International,21
（1983）181−186の中で、水酸化ナトリウムと熱への暴
露による毛髪試料の溶解に続きRIAによるモルヒネの存
在についての分析を開示している。
（1983）181−186の中で、水酸化ナトリウムと熱への暴
露による毛髪試料の溶解に続きRIAによるモルヒネの存
在についての分析を開示している。
O.Suzukiらは、Journal of Forensic Sciences、第29
巻、第２号、1984年４月、p.611−617の中で、ガスクロ
マトグラフィーおよび化学的イオン化マススペクトロメ
トリーによる一本のヒト毛髪中のメタアンフェタミンお
よびアンフェタミンの検出法を開示している。
巻、第２号、1984年４月、p.611−617の中で、ガスクロ
マトグラフィーおよび化学的イオン化マススペクトロメ
トリーによる一本のヒト毛髪中のメタアンフェタミンお
よびアンフェタミンの検出法を開示している。
N.J.Haleyらは、Clin.Chem.31/10,1598−1600（198
5）の中で、ニコチンおよびコチニンについての毛髪の
分析を開示しており、ここでは洗浄した毛髪試料を、ゼ
ラチン、塩化ナトリウム、トリスおよびEDTAを含む緩衝
液中に溶解し、そしてpH 7.4に調整した。次いでラジオ
イムノアッセイにより試料を分析した。
5）の中で、ニコチンおよびコチニンについての毛髪の
分析を開示しており、ここでは洗浄した毛髪試料を、ゼ
ラチン、塩化ナトリウム、トリスおよびEDTAを含む緩衝
液中に溶解し、そしてpH 7.4に調整した。次いでラジオ
イムノアッセイにより試料を分析した。
Sramek,Baumgartnerらは、A.M.J.Psychiatry 142:8,1
985年８月の中で、メタノール抽出およびラジオイムノ
アッセイを用いる精神医学患者の毛髪の分析を開示して
いる。
985年８月の中で、メタノール抽出およびラジオイムノ
アッセイを用いる精神医学患者の毛髪の分析を開示して
いる。
Baumgartnerらは、Clinical Nuclear Medicine、第10
巻、1985年９月の中で、トラップされた乱用薬物の毛髪
からの抽出に続くRIA分析の恩典を開示している。
巻、1985年９月の中で、トラップされた乱用薬物の毛髪
からの抽出に続くRIA分析の恩典を開示している。
Gillらは、Nature、第318巻、p.577（1985）の中で、
全血、全精液、膣液、毛根、血痕および精液痕からDNA
を抽出するためのSDS/プロテイナーゼK/ジチオトレイト
ール混合物の利用を開示している。
全血、全精液、膣液、毛根、血痕および精液痕からDNA
を抽出するためのSDS/プロテイナーゼK/ジチオトレイト
ール混合物の利用を開示している。
Smithらは、J.Forensic Sci.1986,31（４）,1269−73
中で、RIAを使った汗、経血痕および毛髪中のコカイン
の検出を開示している。
中で、RIAを使った汗、経血痕および毛髪中のコカイン
の検出を開示している。
M.Margioらは、1986年６月25−26日Verona大学の国際
会議で“HPLCとMS/MSによるヘロイン常用者の毛髪中の
モルヒネおよび他のオピオイドの測定”において、毛髪
試料からモルヒネをアッセイする種々の方法を開示して
いる。
会議で“HPLCとMS/MSによるヘロイン常用者の毛髪中の
モルヒネおよび他のオピオイドの測定”において、毛髪
試料からモルヒネをアッセイする種々の方法を開示して
いる。
M.Margioらは、the Journal of Analytical Toxicolo
gy、第10巻、1986年７月/8月の中で、熱−酸加水分解、
プレカラムダンシル誘導体化、順相液体クロマトグラフ
ィーおよび蛍光検出による、ヘロイン常用者の毛髪中に
含まれるモルヒネの定量方法を開示している。
gy、第10巻、1986年７月/8月の中で、熱−酸加水分解、
プレカラムダンシル誘導体化、順相液体クロマトグラフ
ィーおよび蛍光検出による、ヘロイン常用者の毛髪中に
含まれるモルヒネの定量方法を開示している。
Smithらは、Journal of Forensic Sciences、第31
巻、第４号、1986年10月、p.1269−1273において、毛髪
試料をまず洗浄し、小断片に切り、機械的に６分間粉砕
し、エタノール中で還流しそしてラジオイムノアッセイ
を使って試料を分析することによる、薬物の存在につい
ての毛髪の分析方法を開示している。
巻、第４号、1986年10月、p.1269−1273において、毛髪
試料をまず洗浄し、小断片に切り、機械的に６分間粉砕
し、エタノール中で還流しそしてラジオイムノアッセイ
を使って試料を分析することによる、薬物の存在につい
ての毛髪の分析方法を開示している。
M.Michalodinitrakisは、Med.Sci.Law（1987）、第27
巻、第１号において、1.5N HClへ暴露し、pH値を１−
２に調整し、続いて0.01N HClと共に37℃にて１時間イ
ンキュベートすることで溶解された毛髪試料の分析から
ラット中のコカインを検出する方法を開示している。
巻、第１号において、1.5N HClへ暴露し、pH値を１−
２に調整し、続いて0.01N HClと共に37℃にて１時間イ
ンキュベートすることで溶解された毛髪試料の分析から
ラット中のコカインを検出する方法を開示している。
Pelliらは、Biomedical and Environmental Mass Spe
ctrometry、第14巻、63−68（1987）の中で、ヘロイン
常用者の毛髪中のモルヒネの同定方法を開示しており、
この方法では毛髪をジエチルエーテルと塩酸で処理し、
次いで乾燥した抽出物をメタノール中に溶解する。
ctrometry、第14巻、63−68（1987）の中で、ヘロイン
常用者の毛髪中のモルヒネの同定方法を開示しており、
この方法では毛髪をジエチルエーテルと塩酸で処理し、
次いで乾燥した抽出物をメタノール中に溶解する。
Higuchiらは、Nature、第332巻、p.543（1988）の中
で、複雑な化学的抽出法により消化物からDNAを抽出す
るために、ジチオトレイトール、プロテイナーゼＫおよ
び２％ドデシル硫酸ナトリウムの作用によりpH8にて毛
髪を溶解せしめる方法を開示している。
で、複雑な化学的抽出法により消化物からDNAを抽出す
るために、ジチオトレイトール、プロテイナーゼＫおよ
び２％ドデシル硫酸ナトリウムの作用によりpH8にて毛
髪を溶解せしめる方法を開示している。
獣皮の製革用の脱毛剤に関連し、そして脱毛工程にお
ける幾つかの酵素（パパインを含む）の利用を開示して
いる幾つかの特許、例えば、米国特許第3,986,929号、
第3,966,551号、第3,939,040号および第3,623,950号の
存在も注目される。
ける幾つかの酵素（パパインを含む）の利用を開示して
いる幾つかの特許、例えば、米国特許第3,986,929号、
第3,966,551号、第3,939,040号および第3,623,950号の
存在も注目される。
しかしながら、前記および他の従来方法は上記に記載
された理由でそして／または生物学的分析法の分析物プ
ローブ（例えば抗体）を劣化させるため不利であること
がわかり、それによりそういった高感度の分析技術を使
用することができない。
された理由でそして／または生物学的分析法の分析物プ
ローブ（例えば抗体）を劣化させるため不利であること
がわかり、それによりそういった高感度の分析技術を使
用することができない。
従って、被検者の毛髪、指爪、足指爪および皮膚など
身体の角質化構造物から或る種の分析物を迅速に且つ完
全に可溶化でき、そして着目の分析物および／または生
物学的分析法の分析物プローブを破壊することなく、被
検者における分析物の使用または暴露の持続期間および
分析物の正体の直接分析を可能にする分析物検出方法に
対する要望が存在する。
身体の角質化構造物から或る種の分析物を迅速に且つ完
全に可溶化でき、そして着目の分析物および／または生
物学的分析法の分析物プローブを破壊することなく、被
検者における分析物の使用または暴露の持続期間および
分析物の正体の直接分析を可能にする分析物検出方法に
対する要望が存在する。
本発明の目的は、薬物および化学物質の検出方法を提
供することである。
供することである。
本発明の別の目的は、薬物および化学物質の毛髪分析
法を提供することである。
法を提供することである。
本発明の別の目的は、頭髪および体毛並びに身体の他
の角質化構造物中の分析物を可溶化し、その正体を直接
分析し、そして適当であれば、被検者中の分析物の存続
期間および暴露の程度を測定する方法を提供することで
ある。
の角質化構造物中の分析物を可溶化し、その正体を直接
分析し、そして適当であれば、被検者中の分析物の存続
期間および暴露の程度を測定する方法を提供することで
ある。
本発明の更にもう１つの目的は、分析物に損傷を与え
ることなく毛髪の内部コアから分析物を可溶化する毛髪
分析法を提供することである。
ることなく毛髪の内部コアから分析物を可溶化する毛髪
分析法を提供することである。
本発明の更に別の目的は、非常に正確な生物学的分析
法の利用を実際上可能にするような信頼できる可溶化方
法および直接分析物検出方法を提供することである。
法の利用を実際上可能にするような信頼できる可溶化方
法および直接分析物検出方法を提供することである。
本発明の更に別の目的は、既知の毛髪分析法よりもず
っと短時間で実施できる信頼できる毛髪分析法を提供す
ることである。
っと短時間で実施できる信頼できる毛髪分析法を提供す
ることである。
上記および他の目的は、新規角質化構造物分析法によ
り達成され、該方法は、低酸化還元電位化合物、例えば
ジチオトレイトール（DTT）またはジチオエリトリトー
ル（DTE）、角質化構造物の溶解に適する酵素および角
質化構造物の試料を含有する混合物を調製し;DTTまたは
DTEが角質化構造物および／または酵素を活性化するの
を可能にし；酵素が角質化構造物の試料を少なくとも実
質的に溶解して角質消化溶液を形成せしめるのを可能に
し；そして角質消化溶液の一部を分析にかけ、存在する
のであれば、角質化構造物試料中の分析物の正体および
量を検出する；ことを含んで成る。
り達成され、該方法は、低酸化還元電位化合物、例えば
ジチオトレイトール（DTT）またはジチオエリトリトー
ル（DTE）、角質化構造物の溶解に適する酵素および角
質化構造物の試料を含有する混合物を調製し;DTTまたは
DTEが角質化構造物および／または酵素を活性化するの
を可能にし；酵素が角質化構造物の試料を少なくとも実
質的に溶解して角質消化溶液を形成せしめるのを可能に
し；そして角質消化溶液の一部を分析にかけ、存在する
のであれば、角質化構造物試料中の分析物の正体および
量を検出する；ことを含んで成る。
好ましい角質化構造物は毛髪である。酵素は、ペプチ
ダーゼ、エンドペプチダーゼおよびプロテアーゼから成
る群から選択され得、好ましくはパパイン、キモパパイ
ンまたはプロテイナーゼＫである。分析過程を加速する
ために、消化溶液に硫酸第二銅または亜ヒ酸ナトリウム
（Na2AsO2）を添加し、混合物中の干渉する過剰のジチ
オトレイトールまたはジチオエリトリトールを不活性化
することができる。好ましくは、可溶化された分析物の
分析はイムノアッセイのような生物学的分析法により行
われる。
ダーゼ、エンドペプチダーゼおよびプロテアーゼから成
る群から選択され得、好ましくはパパイン、キモパパイ
ンまたはプロテイナーゼＫである。分析過程を加速する
ために、消化溶液に硫酸第二銅または亜ヒ酸ナトリウム
（Na2AsO2）を添加し、混合物中の干渉する過剰のジチ
オトレイトールまたはジチオエリトリトールを不活性化
することができる。好ましくは、可溶化された分析物の
分析はイムノアッセイのような生物学的分析法により行
われる。
本発明によれば、前に分析物に暴露されていた個体、
例えば分析物を摂取していた個体の頭髪もしくは体毛ま
たは他の角質化構造物からの或る種の分析物の迅速且つ
完全な可溶化、次いで既知の生物学的分析用プローブ、
例えば迅速で且つ高感度のイムノアッセイによる分析物
の同定を可能にする方法が提供される。毛髪の内部から
の分析物の可溶化は、分析することになっている毛髪線
維の有機基質の内部にトラップされた分析物を損傷させ
ることなく達成され、そして生物学的分析法の逐次的利
用されるプローブ（例えば抗体）に影響することもな
い。本発明に係る毛髪分析法は更に、血液または尿試料
中の分析物の程度を測定する従来の分析物検出法におい
て必要とされるような繰返し試験を行うことなく、長期
間に渡る被検者における過去の使用パターンの検出を可
能にする。
例えば分析物を摂取していた個体の頭髪もしくは体毛ま
たは他の角質化構造物からの或る種の分析物の迅速且つ
完全な可溶化、次いで既知の生物学的分析用プローブ、
例えば迅速で且つ高感度のイムノアッセイによる分析物
の同定を可能にする方法が提供される。毛髪の内部から
の分析物の可溶化は、分析することになっている毛髪線
維の有機基質の内部にトラップされた分析物を損傷させ
ることなく達成され、そして生物学的分析法の逐次的利
用されるプローブ（例えば抗体）に影響することもな
い。本発明に係る毛髪分析法は更に、血液または尿試料
中の分析物の程度を測定する従来の分析物検出法におい
て必要とされるような繰返し試験を行うことなく、長期
間に渡る被検者における過去の使用パターンの検出を可
能にする。
更に詳しくは、本発明は、毛髪または他の角質化構造
物試料を構成しているタンパク質の迅速な酵素消化、次
いで酵素および関連酵素／基質活性化剤（DTTおよびDT
E）の効果的不活性化を含んで成る。得られた毛髪消化
溶液中に可溶化された分析物は、既知の生物学的分析用
プローブにより、好ましくはイムノアッセイのような高
感度のタンパク質ベースの分析技術により分析され得
る。毛髪中にトラップされた分析物の量は摂取した分析
物の量に正比例することがわかった。
物試料を構成しているタンパク質の迅速な酵素消化、次
いで酵素および関連酵素／基質活性化剤（DTTおよびDT
E）の効果的不活性化を含んで成る。得られた毛髪消化
溶液中に可溶化された分析物は、既知の生物学的分析用
プローブにより、好ましくはイムノアッセイのような高
感度のタンパク質ベースの分析技術により分析され得
る。毛髪中にトラップされた分析物の量は摂取した分析
物の量に正比例することがわかった。
本発明によれば、角質化構造物、例えば毛髪試料を、
特定の分析物に暴露されているかまたは摂取していると
疑われる被検者から回収する。好ましくは、毛髪試料を
まず既知の方法により洗浄し、実際の消費よりもむしろ
外的接触により毛髪表面に付着しているであろう分析物
または他の薬物もしくは化学物質を除去する。次いで毛
髪試料を特定の酵素／基質活性化剤と共に特定の酵素に
より処理し、ケラチンとして知られる毛髪線維の有機基
質の完全なまたは完全に近い溶解を達成させる。次いで
毛髪の有機基質内部に“トラップ”されている目的分析
物が溶液中に放出され、またはたとえタンパク質が結合
していたとしても、該分析物はタンパク質を基礎にした
分析法において使われる抗体を取得しやすい。本発明の
方法を充分に且つ正確に実施するために、角質化構造物
の完全な溶解が好ましい。
特定の分析物に暴露されているかまたは摂取していると
疑われる被検者から回収する。好ましくは、毛髪試料を
まず既知の方法により洗浄し、実際の消費よりもむしろ
外的接触により毛髪表面に付着しているであろう分析物
または他の薬物もしくは化学物質を除去する。次いで毛
髪試料を特定の酵素／基質活性化剤と共に特定の酵素に
より処理し、ケラチンとして知られる毛髪線維の有機基
質の完全なまたは完全に近い溶解を達成させる。次いで
毛髪の有機基質内部に“トラップ”されている目的分析
物が溶液中に放出され、またはたとえタンパク質が結合
していたとしても、該分析物はタンパク質を基礎にした
分析法において使われる抗体を取得しやすい。本発明の
方法を充分に且つ正確に実施するために、角質化構造物
の完全な溶解が好ましい。
毛髪試料の溶解に好ましい酵素は、ペプチダーゼ、エ
ンドペプチダーゼおよびプロテアーゼの酵素分類のもの
である。最も活性であり、従って本発明における使用に
好ましいのは、パパイン、キモパパインおよびプロテイ
ナーゼＫ酵素である。
ンドペプチダーゼおよびプロテアーゼの酵素分類のもの
である。最も活性であり、従って本発明における使用に
好ましいのは、パパイン、キモパパインおよびプロテイ
ナーゼＫ酵素である。
多くの他のプロテアーゼが低pH値（例えばpH7−９）
において本発明に従った方法に有効であることがわかっ
た。特に、プロテアーゼのタイプIV〔細菌性、ストレプ
トマイセス・セスピトサス（Streptomyces caespitosu
s）由来〕、タイプVIII〔バシラス・サブチリス（Bacil
lus subtilis）由来〕、タイプXI〔プロテイナーゼＫ、
真菌性、トリチラキウム・アルブム（Tritirachium alb
um）由来〕、タイプXIV〔プロナーゼ、ストレプトマイ
セス・グリセウス（Streptmyces griseus）由来〕、タ
イプXVI（バシラス・サブチリス由来）、タイプXVIII
〔ニューラーゼ、リゾプス（Rhizopus）種由来〕、タイ
プXIX〔アスペルギルス・ソヤエ（Aspergillus sojae）
由来〕、タイプXXI（ストレプトマイセス・グリセウス
由来）、タイプXXIV（細菌性）、タイプXXVII（ナガラ
ーゼ）、タイプIII（プロラーゼ）、タイプＸ（好熱性
細菌プロテアーゼ、サーモライシン）、およびタイプXX
III〔アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryza
e）由来〕が有効である。
において本発明に従った方法に有効であることがわかっ
た。特に、プロテアーゼのタイプIV〔細菌性、ストレプ
トマイセス・セスピトサス（Streptomyces caespitosu
s）由来〕、タイプVIII〔バシラス・サブチリス（Bacil
lus subtilis）由来〕、タイプXI〔プロテイナーゼＫ、
真菌性、トリチラキウム・アルブム（Tritirachium alb
um）由来〕、タイプXIV〔プロナーゼ、ストレプトマイ
セス・グリセウス（Streptmyces griseus）由来〕、タ
イプXVI（バシラス・サブチリス由来）、タイプXVIII
〔ニューラーゼ、リゾプス（Rhizopus）種由来〕、タイ
プXIX〔アスペルギルス・ソヤエ（Aspergillus sojae）
由来〕、タイプXXI（ストレプトマイセス・グリセウス
由来）、タイプXXIV（細菌性）、タイプXXVII（ナガラ
ーゼ）、タイプIII（プロラーゼ）、タイプＸ（好熱性
細菌プロテアーゼ、サーモライシン）、およびタイプXX
III〔アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryza
e）由来〕が有効である。
上記に記載したように、幾つかの当業界で知られる方
法は脱毛剤として使用するためのパパインの使用に備え
る。これらの脱毛法は、そり落とし（scrapping）また
は他の機械的手段による容易な除去を可能にする程充分
に柔軟にすることにより獣皮または皮膚から毛髪を除去
し、そして安くあまり効果的でないスルフヒドリル酵素
とチオグリコール酸またはシステインのような基質活性
化剤とを使用する。従って、これらの方法は部分的にし
か毛髪を分解せず、毛髪の完全な化学的溶解には向かな
い。毛髪の単なる柔軟化は、分析物の検出のための毛髪
分析を考慮に入れた方法において受け入れられなかっ
た。何故なら“トラップされた”分析物の完全な放出を
獲得するためには完全なまたはほとんど完全な毛髪溶解
だけが受け入れられるからである。更に、これらの脱毛
法において使われるスルフヒドリル酵素は、抗体のよう
なある種の生物学的分析用プローブにとって有害であ
る。
法は脱毛剤として使用するためのパパインの使用に備え
る。これらの脱毛法は、そり落とし（scrapping）また
は他の機械的手段による容易な除去を可能にする程充分
に柔軟にすることにより獣皮または皮膚から毛髪を除去
し、そして安くあまり効果的でないスルフヒドリル酵素
とチオグリコール酸またはシステインのような基質活性
化剤とを使用する。従って、これらの方法は部分的にし
か毛髪を分解せず、毛髪の完全な化学的溶解には向かな
い。毛髪の単なる柔軟化は、分析物の検出のための毛髪
分析を考慮に入れた方法において受け入れられなかっ
た。何故なら“トラップされた”分析物の完全な放出を
獲得するためには完全なまたはほとんど完全な毛髪溶解
だけが受け入れられるからである。更に、これらの脱毛
法において使われるスルフヒドリル酵素は、抗体のよう
なある種の生物学的分析用プローブにとって有害であ
る。
これらの脱毛法と異なり、本発明の方法は、基質およ
びスルフヒドリル（SH）酵素活性化剤としてジチオトレ
イトール（“DTT"または2,3−ジヒドロキシブタン−1,4
−ジチオール）またはそれの異性体であるジチオエリト
リトール（“DTE"または2,3−ジヒドロキシブタン−1,4
−ジチオール）を使う。驚くべきことに、DTTおよびDTE
が比較的短時間内で、例えば約３時間で毛髪を溶解させ
ることができる高活性の酵素をもたらし、毛髪消化溶液
中への分析物の放出をもたらすことがわかった。この酵
素の高活性は、少なくとも部分的には、DTTおよびDTEに
よる角質化構造物基質自体の活性化によるものであり、
おそらく角質化構造物中のジスルフィド結合の開裂にお
けるDTTおよびDTEの作用により酵素のアタックを促進す
るためであることがわかった。
びスルフヒドリル（SH）酵素活性化剤としてジチオトレ
イトール（“DTT"または2,3−ジヒドロキシブタン−1,4
−ジチオール）またはそれの異性体であるジチオエリト
リトール（“DTE"または2,3−ジヒドロキシブタン−1,4
−ジチオール）を使う。驚くべきことに、DTTおよびDTE
が比較的短時間内で、例えば約３時間で毛髪を溶解させ
ることができる高活性の酵素をもたらし、毛髪消化溶液
中への分析物の放出をもたらすことがわかった。この酵
素の高活性は、少なくとも部分的には、DTTおよびDTEに
よる角質化構造物基質自体の活性化によるものであり、
おそらく角質化構造物中のジスルフィド結合の開裂にお
けるDTTおよびDTEの作用により酵素のアタックを促進す
るためであることがわかった。
角質化構造物のタンパク質が完全にまたは少なくとも
実質的に溶解され、それにより溶液混合物中に分析物が
放出されたならば、抗体のような生物学的分析用プロー
ブに分析物をかけるために酵素および酵素／基質活性化
剤を不活性化することが必要であることがわかった。何
故なら、酵素および酵素／基質活性剤は、前に記載した
ように、分析法に関与するタンパク質物質の構造的完全
性を妨害し得るからである。
実質的に溶解され、それにより溶液混合物中に分析物が
放出されたならば、抗体のような生物学的分析用プロー
ブに分析物をかけるために酵素および酵素／基質活性化
剤を不活性化することが必要であることがわかった。何
故なら、酵素および酵素／基質活性剤は、前に記載した
ように、分析法に関与するタンパク質物質の構造的完全
性を妨害し得るからである。
パパインのようなスルフヒドリル（SH）−依存性酵素
を活性化する仕事は困難である。何故なら、毛髪消化段
階の後に酵素が放出された毛髪タンパク質および酵素／
基質活性化剤に存在しているスルフヒドリル基の“海
（sea）”の中に“埋もれる”からである。既知のスル
フヒドリル遮断剤は、分解された髪タンパク質およびDT
TまたはDTEと結合しがちであり、そして酵素の活性を遮
断するのに重要な酵素のスルフヒドリル部位に必ずしも
結合するとは限らないので、酵素を不活性化することに
おいて効果的でない。従って、酵素のスルフヒドリル基
がまだ活性であるならばタンパク質ベースの分析法を効
果的に利用することはできない。
を活性化する仕事は困難である。何故なら、毛髪消化段
階の後に酵素が放出された毛髪タンパク質および酵素／
基質活性化剤に存在しているスルフヒドリル基の“海
（sea）”の中に“埋もれる”からである。既知のスル
フヒドリル遮断剤は、分解された髪タンパク質およびDT
TまたはDTEと結合しがちであり、そして酵素の活性を遮
断するのに重要な酵素のスルフヒドリル部位に必ずしも
結合するとは限らないので、酵素を不活性化することに
おいて効果的でない。従って、酵素のスルフヒドリル基
がまだ活性であるならばタンパク質ベースの分析法を効
果的に利用することはできない。
驚くべきことに、DTTおよびDTEは、酵素および／また
は角質化構造物基質を活性化し、予想外に高い毛髪消化
活性を生じさせるだけでなく、酵素が毛髪タンパク質の
完全なまたはほとんど完全な溶解を果たした後で直接的
または間接的（酵素の自己不活性化）メカニズムにより
酵素を不活性化しようと自発的に作用することが発見さ
れた。典型的には、DTTまたはDTEの酵素不活性化作用
は、酵素への暴露後約４〜５時間以内に起こり、これは
酵素が毛髪試料の溶解を果たすのに充分な時間の量であ
る。酵素は一度不活性化されれば、新しいDTTまたはDTE
への暴露によって再び活性化したり復活したりできない
ことがわかっている。
は角質化構造物基質を活性化し、予想外に高い毛髪消化
活性を生じさせるだけでなく、酵素が毛髪タンパク質の
完全なまたはほとんど完全な溶解を果たした後で直接的
または間接的（酵素の自己不活性化）メカニズムにより
酵素を不活性化しようと自発的に作用することが発見さ
れた。典型的には、DTTまたはDTEの酵素不活性化作用
は、酵素への暴露後約４〜５時間以内に起こり、これは
酵素が毛髪試料の溶解を果たすのに充分な時間の量であ
る。酵素は一度不活性化されれば、新しいDTTまたはDTE
への暴露によって再び活性化したり復活したりできない
ことがわかっている。
少なくとも幾つかの非−スルフヒドリル依存性酵素、
例えばプロテイナーゼＫの、阻害剤フェニルメチルスル
ホニルクロライドによる不活性化は、該酵素がタンパク
質をベースにしたイムノアッセイ法に使われる抗体に対
して活性でないことがわかっているので通常必要とされ
ない。
例えばプロテイナーゼＫの、阻害剤フェニルメチルスル
ホニルクロライドによる不活性化は、該酵素がタンパク
質をベースにしたイムノアッセイ法に使われる抗体に対
して活性でないことがわかっているので通常必要とされ
ない。
毛髪消化溶液中に存在する活性なDTTおよびDTEは、暴
露される他のタンパク質、例えばラジオイムノアッセイ
において使われる抗体、の構造および活性に対する危険
要素となることもまたわかっている。従って、反応混合
物中のDTTまたはDTEが自発的に酵素を不活性しようと働
くだけでなくそれ自体が消化溶液中で自発的に不活性化
されることは更に驚くべき結果であった。典型的には、
DTTまたはDTEの自発的不活性化は、酵素への最初の暴露
の約14時間後に起こるが、これは使用する酵素およびDT
TまたはDTEの種々の濃度および量、pH、温度、毛髪試料
の量などに依存するであろう。
露される他のタンパク質、例えばラジオイムノアッセイ
において使われる抗体、の構造および活性に対する危険
要素となることもまたわかっている。従って、反応混合
物中のDTTまたはDTEが自発的に酵素を不活性しようと働
くだけでなくそれ自体が消化溶液中で自発的に不活性化
されることは更に驚くべき結果であった。典型的には、
DTTまたはDTEの自発的不活性化は、酵素への最初の暴露
の約14時間後に起こるが、これは使用する酵素およびDT
TまたはDTEの種々の濃度および量、pH、温度、毛髪試料
の量などに依存するであろう。
このように、本発明の方法によれば、比較的短時間、
例えば一晩で完全な毛髪消化が達成でき、そして放出さ
れた着目の分析物を含む毛髪消化溶液を翌朝タンパク質
ベースのリガンドアッセイ分析法に有効に且つ正確に直
接かけることができる。典型的には、毛髪試料の洗浄か
ら分析物の同定までの全方法は、約16−20時間もかから
ないであろう。一度酵素およびDTTまたはDTEが毛髪試料
と接触状態になれば、毛髪試料から分析物を放出させる
のに、該方法を行う個人による介入をほとんどまたは全
く必要としない。
例えば一晩で完全な毛髪消化が達成でき、そして放出さ
れた着目の分析物を含む毛髪消化溶液を翌朝タンパク質
ベースのリガンドアッセイ分析法に有効に且つ正確に直
接かけることができる。典型的には、毛髪試料の洗浄か
ら分析物の同定までの全方法は、約16−20時間もかから
ないであろう。一度酵素およびDTTまたはDTEが毛髪試料
と接触状態になれば、毛髪試料から分析物を放出させる
のに、該方法を行う個人による介入をほとんどまたは全
く必要としない。
あるいは、スルフヒドリル基に富む毛髪消化溶液への
硫酸第二銅の添加がDTTまたはDTEのスルフヒドリル基を
より迅速に不活性化させる作用をすることが発見され
た。よって、毛髪試料の消化およびDTTまたはDTEによる
酵素の不活性化後の毛髪消化混合物への少量の硫酸第二
銅の添加は、毛髪消化混合物を分析法にかけることがで
きる時間を有意に加速する。というのは、溶液への添加
後約14時間で起こるDTTまたはDTEの自己不活性化を待つ
必要がないからである。典型的には、酵素が毛髪試料を
溶解するのに充分な時間をもたせるように、酵素および
DTTまたはDTEを毛髪試料と接触せしめてから約４〜５時
間後に、約100μの硫酸第二銅（10mg/ml）が毛髪消化
混合物1mlに添加される。
硫酸第二銅の添加がDTTまたはDTEのスルフヒドリル基を
より迅速に不活性化させる作用をすることが発見され
た。よって、毛髪試料の消化およびDTTまたはDTEによる
酵素の不活性化後の毛髪消化混合物への少量の硫酸第二
銅の添加は、毛髪消化混合物を分析法にかけることがで
きる時間を有意に加速する。というのは、溶液への添加
後約14時間で起こるDTTまたはDTEの自己不活性化を待つ
必要がないからである。典型的には、酵素が毛髪試料を
溶解するのに充分な時間をもたせるように、酵素および
DTTまたはDTEを毛髪試料と接触せしめてから約４〜５時
間後に、約100μの硫酸第二銅（10mg/ml）が毛髪消化
混合物1mlに添加される。
同様に、本発明において亜ヒ酸ナトリウム（NaAsO2）
を利用して沈澱性化合物の形成により残りのDTTまたはD
TEを除去してもよい。典型的には、亜ヒ酸ナトリウムの
100mg/ml溶液100μを毛髪消化物溶液1mlに添加し、DT
TおよびDTEの不活性化を行う。
を利用して沈澱性化合物の形成により残りのDTTまたはD
TEを除去してもよい。典型的には、亜ヒ酸ナトリウムの
100mg/ml溶液100μを毛髪消化物溶液1mlに添加し、DT
TおよびDTEの不活性化を行う。
トラップされた分析物を放出させるための迅速で且つ
効果的な毛髪の可溶化が前記のようにして達成されたな
らば、次いで分析物混合物を当業界で知られているタン
パク質ベースの分析方法、例えばラジオイムノアッセイ
（“RIA"）による直接分析にかけることができる。その
ような方法は、RIAおよび関連するイムノアッセイまた
はリガンドアッセイが毛髪試料中に含まれる低濃度の分
析物を測定するのに必要な感度および簡便さを有してい
る現在唯一の既知の量産方法であるので、本発明におけ
る適用に好ましい。これらの方法を使うことは、RIAお
よび他のタンパク質ベースの分析法による分析にはわず
か約0.5〜1.0mgの毛髪が必要であるため好ましい。実
際、ある種の乱用薬物については、長さが約１インチの
１本または２本の毛髪ほどで本発明に係る方法による分
析が効果的に実施できることがわかった。
効果的な毛髪の可溶化が前記のようにして達成されたな
らば、次いで分析物混合物を当業界で知られているタン
パク質ベースの分析方法、例えばラジオイムノアッセイ
（“RIA"）による直接分析にかけることができる。その
ような方法は、RIAおよび関連するイムノアッセイまた
はリガンドアッセイが毛髪試料中に含まれる低濃度の分
析物を測定するのに必要な感度および簡便さを有してい
る現在唯一の既知の量産方法であるので、本発明におけ
る適用に好ましい。これらの方法を使うことは、RIAお
よび他のタンパク質ベースの分析法による分析にはわず
か約0.5〜1.0mgの毛髪が必要であるため好ましい。実
際、ある種の乱用薬物については、長さが約１インチの
１本または２本の毛髪ほどで本発明に係る方法による分
析が効果的に実施できることがわかった。
タンパク質をベースにした分析法の代わりに、クロマ
トグラフィー、マススペクトロメトリー等の機器手段を
含む別の分析法を利用することもできる。これらの分析
法はタンパク質ベースのものではないため、非タンパク
質ベースの分析技術を使う場合は酵素およびDTTおよびD
TEの不活性化の段階は必要でない。しかしながら、本発
明に従った抽出方法の速度および穏やかさ並びに“スパ
イク（spike）”の混入、即ち既知量の分析物の混入に
より抽出効率を定量できることで、目下開示している抽
出方法がガスクロマトグラフィーやマススペクトロメト
リーなどの機器分析法の選択方法にもなる。
トグラフィー、マススペクトロメトリー等の機器手段を
含む別の分析法を利用することもできる。これらの分析
法はタンパク質ベースのものではないため、非タンパク
質ベースの分析技術を使う場合は酵素およびDTTおよびD
TEの不活性化の段階は必要でない。しかしながら、本発
明に従った抽出方法の速度および穏やかさ並びに“スパ
イク（spike）”の混入、即ち既知量の分析物の混入に
より抽出効率を定量できることで、目下開示している抽
出方法がガスクロマトグラフィーやマススペクトロメト
リーなどの機器分析法の選択方法にもなる。
本発明に係る方法は、コカイン、モルヒネ／ヘロイ
ン、マリファナ、フェンシクリジンまたは“PCP"および
メタクワロンといった乱用薬物の使用または過去の使用
を検出するのに有効であることがわかった。更に、本発
明に係る方法は、ジゴキシンおよびアンフェタミンのよ
うな指定薬物並びにニコチンのような毒性化学物質の事
前使用を調べるのに有効であることがわかった。個体の
血流中に存在し、そして毛髪の合成の間に毛髪に運ばれ
るいずれの有機物質でも本発明の方法に従って抽出され
そして分析され得ることが予想される。
ン、マリファナ、フェンシクリジンまたは“PCP"および
メタクワロンといった乱用薬物の使用または過去の使用
を検出するのに有効であることがわかった。更に、本発
明に係る方法は、ジゴキシンおよびアンフェタミンのよ
うな指定薬物並びにニコチンのような毒性化学物質の事
前使用を調べるのに有効であることがわかった。個体の
血流中に存在し、そして毛髪の合成の間に毛髪に運ばれ
るいずれの有機物質でも本発明の方法に従って抽出され
そして分析され得ることが予想される。
本発明に係る方法を実施する上で、約50−200mg/10ml
水のDTTまたはDTE濃度が本発明において有効であること
が示されたが、約110mgのDTTまたはDTE/10mlの水の水性
溶液を使うのが好ましい。DTTまたはDTE対パパインまた
はキモパパインの重量比は約110:2（酵素純度が16−40B
AEE単位/mgタンパク質である時）であるのが好ましい
が、約110:1〜約110:4の範囲内のDTTまたはDTE対パパイ
ンまたはキモパパインの重量比において効果的な結果が
観察された。プロテイナーゼＫおよび他のプロテアーゼ
については、DTTまたはDTE対プロテイナーゼＫ（または
他のプロテアーゼ）の重量比が約1200:1（酵素純度が10
−20単位/mgタンパク質である時）であるのが好ましい
が、約1200:0.5〜約1200:2の重量比も有効であろう。
水のDTTまたはDTE濃度が本発明において有効であること
が示されたが、約110mgのDTTまたはDTE/10mlの水の水性
溶液を使うのが好ましい。DTTまたはDTE対パパインまた
はキモパパインの重量比は約110:2（酵素純度が16−40B
AEE単位/mgタンパク質である時）であるのが好ましい
が、約110:1〜約110:4の範囲内のDTTまたはDTE対パパイ
ンまたはキモパパインの重量比において効果的な結果が
観察された。プロテイナーゼＫおよび他のプロテアーゼ
については、DTTまたはDTE対プロテイナーゼＫ（または
他のプロテアーゼ）の重量比が約1200:1（酵素純度が10
−20単位/mgタンパク質である時）であるのが好ましい
が、約1200:0.5〜約1200:2の重量比も有効であろう。
毛髪タンパク質の濃度は、好ましくは、その後に使用
するタンパク質ベースの分析法において様々なマトリッ
クス効果を防ぐように約10mg毛髪/cc消化溶液で一定に
維持される。
するタンパク質ベースの分析法において様々なマトリッ
クス効果を防ぐように約10mg毛髪/cc消化溶液で一定に
維持される。
毛髪の酵素的消化は、本発明によれば、低温および中
性付近のpHにて行われるのが好ましい。この事について
は、酵素としてパパインまたはキモパパインを使う場合
には、約20℃〜約40℃の温度でそして約8.8〜10.5のpH
で該方法で行うのが好ましい。好ましくは、pHが約8.8
〜9.5である。最も好ましい態様においては、温度が約3
7℃でありそしてpHが約9.1である。
性付近のpHにて行われるのが好ましい。この事について
は、酵素としてパパインまたはキモパパインを使う場合
には、約20℃〜約40℃の温度でそして約8.8〜10.5のpH
で該方法で行うのが好ましい。好ましくは、pHが約8.8
〜9.5である。最も好ましい態様においては、温度が約3
7℃でありそしてpHが約9.1である。
酵素としてプロテイナーゼＫまたは他のプロテナーゼ
を使用する場合には、約20〜40℃および約７〜９のpHに
て該方法を行うのが好ましい。最も好ましい態様におい
ては、温度が約37℃でありそしてpHが約７である；この
条件下で、特定の分析物を損傷する危険が最小になる。
中性条件下で毛髪を溶解する他の酵素には、プロテアー
ゼのタイプXIV（プロナーゼ）、タイプVI、タイプVII
I、タイプXXVII（ナガラーゼ）、タイプXVIII（ニュー
ラーゼ）、タイプXXVIII、タイプXVI、タイプXXIおよび
タイプXXIIIが含まれる。
を使用する場合には、約20〜40℃および約７〜９のpHに
て該方法を行うのが好ましい。最も好ましい態様におい
ては、温度が約37℃でありそしてpHが約７である；この
条件下で、特定の分析物を損傷する危険が最小になる。
中性条件下で毛髪を溶解する他の酵素には、プロテアー
ゼのタイプXIV（プロナーゼ）、タイプVI、タイプVII
I、タイプXXVII（ナガラーゼ）、タイプXVIII（ニュー
ラーゼ）、タイプXXVIII、タイプXVI、タイプXXIおよび
タイプXXIIIが含まれる。
尿および血液分析のような他の利用可能な分析物検出
方法に対比して、本発明に係る方法は、ある期間に渡る
分析物への暴露の検出を可能にし、従って習慣的薬物使
用を検出する際に非常に有利である。毛髪は約0.3−0.4
mm/日または約1.0−1.3cm/月の速度で成長することが知
られているので、種々の長さの毛髪断片を評価すること
により、毛髪の長さと同じ位昔に遡って消費または暴露
を測定することが可能であり、そして高感度のタンパク
質ベースの分析法を使うことにより毛髪の小断片中に含
まれる少量の分析物試料の分析が可能になる。
方法に対比して、本発明に係る方法は、ある期間に渡る
分析物への暴露の検出を可能にし、従って習慣的薬物使
用を検出する際に非常に有利である。毛髪は約0.3−0.4
mm/日または約1.0−1.3cm/月の速度で成長することが知
られているので、種々の長さの毛髪断片を評価すること
により、毛髪の長さと同じ位昔に遡って消費または暴露
を測定することが可能であり、そして高感度のタンパク
質ベースの分析法を使うことにより毛髪の小断片中に含
まれる少量の分析物試料の分析が可能になる。
区分分析により、本発明の方法は、最後の使用後数日
から数ケ月または数年にさえも及ぶ期間の間の薬物使用
のパターンまたは他の物質の事前摂取の比較的不変の記
録および証拠を提出する。そのような暴露の経歴は、種
々の成長期間を表わす適当な毛髪小切片を分析すること
により、望み通り詳細に作られ得る。こうして、ある期
間に渡る事前使用およびそのような使用の程度が決定さ
れ得る。
から数ケ月または数年にさえも及ぶ期間の間の薬物使用
のパターンまたは他の物質の事前摂取の比較的不変の記
録および証拠を提出する。そのような暴露の経歴は、種
々の成長期間を表わす適当な毛髪小切片を分析すること
により、望み通り詳細に作られ得る。こうして、ある期
間に渡る事前使用およびそのような使用の程度が決定さ
れ得る。
本発明における使用には、その長さおよび入手しやす
さの点から頭髪が好ましいけれども、他のいずれの体毛
でも本発明の方法に使用することができる。従って、頭
をそることにより本発明の方法によるテストを回避する
ことはほとんど不可能である。
さの点から頭髪が好ましいけれども、他のいずれの体毛
でも本発明の方法に使用することができる。従って、頭
をそることにより本発明の方法によるテストを回避する
ことはほとんど不可能である。
しかしながら、パーマや毛染などの処理は本発明に係
る方法にかける毛髪の溶解速度を増加させ得る。ある場
合には、そのような処理のために、該方法を実施する前
に幾らか分析物が消失してしまうかもしれない。問題の
毛髪がそのように改質されている場合、消化速度の増加
が明らかになるので、既知の正常な毛髪溶解速度に基づ
いて適当な補正因子を適用し得る。
る方法にかける毛髪の溶解速度を増加させ得る。ある場
合には、そのような処理のために、該方法を実施する前
に幾らか分析物が消失してしまうかもしれない。問題の
毛髪がそのように改質されている場合、消化速度の増加
が明らかになるので、既知の正常な毛髪溶解速度に基づ
いて適当な補正因子を適用し得る。
幾つかの他の化粧品剤、例えば幾つかの柔軟剤は毛髪
を消化に対して耐性にさせ得る。そのような耐性は使用
される酵素の量を増やすことにより克服できる。好まし
くは、そういった消化に対する耐性に遭遇する時は酵素
としてプロテイナーゼＫが使われる。
を消化に対して耐性にさせ得る。そのような耐性は使用
される酵素の量を増やすことにより克服できる。好まし
くは、そういった消化に対する耐性に遭遇する時は酵素
としてプロテイナーゼＫが使われる。
あるいは、体毛を使用することが不可能である場合、
または毛髪の使用が望ましくない場合には、指爪、足指
爪および皮膚などの他の角質化組織を本発明に使用して
もよい。この事については、分析物を放出させるために
指爪および足指爪を溶解するのに必要とされるDTTまた
はDTE対酵素の有効比率は、上記で検討したような毛髪
に用いるものとほぼ同じである。本明細書中に記載の方
法に従って指爪または足指爪試料が溶解されたならば、
所望の分析法により、放出された分析物が分析され得
る。
または毛髪の使用が望ましくない場合には、指爪、足指
爪および皮膚などの他の角質化組織を本発明に使用して
もよい。この事については、分析物を放出させるために
指爪および足指爪を溶解するのに必要とされるDTTまた
はDTE対酵素の有効比率は、上記で検討したような毛髪
に用いるものとほぼ同じである。本明細書中に記載の方
法に従って指爪または足指爪試料が溶解されたならば、
所望の分析法により、放出された分析物が分析され得
る。
本発明の別の観点によれば、驚くべきことに毛髪中に
含まれるメラニン粒子を酵素（好ましくはパパイン）、
DTTまたはDTEおよびエチレンジアミン四酢酸（EDTA）の
共同作用により溶解できることが発見された。後者は約
5mg EDTA/ml消化溶液の濃度である。ある種の分析物ま
たはPCPなどの乱用薬物がメラニン粒子中に蓄積するこ
とが発見されたので、毛髪の消化溶液中に存在する該粒
子の溶解を果たすことにより、該粒子中に含まれる分析
物を同定できる。
含まれるメラニン粒子を酵素（好ましくはパパイン）、
DTTまたはDTEおよびエチレンジアミン四酢酸（EDTA）の
共同作用により溶解できることが発見された。後者は約
5mg EDTA/ml消化溶液の濃度である。ある種の分析物ま
たはPCPなどの乱用薬物がメラニン粒子中に蓄積するこ
とが発見されたので、毛髪の消化溶液中に存在する該粒
子の溶解を果たすことにより、該粒子中に含まれる分析
物を同定できる。
本発明のこの観点によれば、上記のようにして毛髪消
化溶液を得、そして毛髪消化溶液から例えば遠心により
メラニン粒子を回収する。次いでこのメラニン粒子をED
TA、酵素およびDTTまたはDTEと接触せしめメラニン粒子
から分析物を遊離させ、そして前記方法により分析物を
分析する。
化溶液を得、そして毛髪消化溶液から例えば遠心により
メラニン粒子を回収する。次いでこのメラニン粒子をED
TA、酵素およびDTTまたはDTEと接触せしめメラニン粒子
から分析物を遊離させ、そして前記方法により分析物を
分析する。
本発明に係る方法の使用から得られる恩恵は多数あ
る。本方法は特定の分析物への過去の暴露の迅速で且つ
正確な診断を提供する。問題の毛髪または角質化構造物
分析法は、非常に長期間に渡る消費または非消費の記録
を提供する。血液または尿分析の本当の意味を考える推
測作業は削除されるだろう。毛髪の収集は血液または尿
の収集よりも押しつけがましくなく且つ身体的に嫌悪を
起こさせることもなく、そして試料を変更または置換す
ることもできないし、予定されたテスト、例えば採用時
テストまたは年１回の身体検査の前の短期間の慎みまた
は“洗浄（flusing）”（過剰な液体の摂取）により検
出をくぐり抜けることもできない。試料は冷却しないで
無限に保存することができる。
る。本方法は特定の分析物への過去の暴露の迅速で且つ
正確な診断を提供する。問題の毛髪または角質化構造物
分析法は、非常に長期間に渡る消費または非消費の記録
を提供する。血液または尿分析の本当の意味を考える推
測作業は削除されるだろう。毛髪の収集は血液または尿
の収集よりも押しつけがましくなく且つ身体的に嫌悪を
起こさせることもなく、そして試料を変更または置換す
ることもできないし、予定されたテスト、例えば採用時
テストまたは年１回の身体検査の前の短期間の慎みまた
は“洗浄（flusing）”（過剰な液体の摂取）により検
出をくぐり抜けることもできない。試料は冷却しないで
無限に保存することができる。
本発明に係る方法は、角質化構造物、例えば毛髪の溶
解に有用であり、DNAのような天然に存在する毛髪の成
分の存在および構造を確かめるためにも利用することが
できる。
解に有用であり、DNAのような天然に存在する毛髪の成
分の存在および構造を確かめるためにも利用することが
できる。
次の例は本発明の幾つかの観点を説明するものであ
り、明細書および特許請求の範囲において示される本発
明を限定するものではない。
り、明細書および特許請求の範囲において示される本発
明を限定するものではない。
例1:毛髪試料からのコカインの抽出 コカイン常用者の疑いのある被検者から10mgの毛髪を
取り、そして37℃にて30分間水中で振とうすることによ
り洗浄した。10mlの蒸留水、110mgのジチオトレイトー
ル（2,3−ジヒドロキシブタン−1,4−ジチオール、クリ
ーランド試薬、Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO.から
入手）を添加した。DTT溶液を撹拌させながら15％水酸
化カリウムを滴加することにより溶液のpHを9.1に調整
した。80μのタイプIIIパパイン溶液（パパイナーゼE
C 3.4.22.2）（Sigma Chemical Co.から入手、タンパク
質mg当り16−40 BAEE単位の活性）を添加しながら撹拌
を続けた。該酵素溶液は酵素タンパク質30mg/ml水の濃
度であり、ここで酵素タンパク質1mgは16−40 BAEE単位
の活性を有する（1 BAEE単位は、pH6.2、25℃にて1.0μ
molのベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステルナト
リウム塩を加水分解するだろう）。
取り、そして37℃にて30分間水中で振とうすることによ
り洗浄した。10mlの蒸留水、110mgのジチオトレイトー
ル（2,3−ジヒドロキシブタン−1,4−ジチオール、クリ
ーランド試薬、Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO.から
入手）を添加した。DTT溶液を撹拌させながら15％水酸
化カリウムを滴加することにより溶液のpHを9.1に調整
した。80μのタイプIIIパパイン溶液（パパイナーゼE
C 3.4.22.2）（Sigma Chemical Co.から入手、タンパク
質mg当り16−40 BAEE単位の活性）を添加しながら撹拌
を続けた。該酵素溶液は酵素タンパク質30mg/ml水の濃
度であり、ここで酵素タンパク質1mgは16−40 BAEE単位
の活性を有する（1 BAEE単位は、pH6.2、25℃にて1.0μ
molのベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステルナト
リウム塩を加水分解するだろう）。
13×75mmのポリカーボネート試験管中でこの溶液1ml
に10mgの毛髪試料を添加した。この溶液を振とうさせな
がら37℃の湯浴中で２時間インキュベートし、そして振
とうを止めて37℃で一晩放置しておいた。溶解した毛髪
試料を含む溶液を2,000rpmで遠心し（Damon IECモデルC
RU 5,000遠心機）メラニン顆粒を除去した。1ccの毛髪
消化溶液に１モルのリン酸緩衝液（pH5.5）200μを添
加した。
に10mgの毛髪試料を添加した。この溶液を振とうさせな
がら37℃の湯浴中で２時間インキュベートし、そして振
とうを止めて37℃で一晩放置しておいた。溶解した毛髪
試料を含む溶液を2,000rpmで遠心し（Damon IECモデルC
RU 5,000遠心機）メラニン顆粒を除去した。1ccの毛髪
消化溶液に１モルのリン酸緩衝液（pH5.5）200μを添
加した。
この溶液100μをコカイン（ベンゾイルエクゴニン
等価物、または“BEE"）の存在についてRIAによりアッ
セイした。RIA分析は83.6ng BEE/10mg毛髪を示した。
等価物、または“BEE"）の存在についてRIAによりアッ
セイした。RIA分析は83.6ng BEE/10mg毛髪を示した。
例2:ジチオエリトリトールの添加 例１に記載の消化およびアッセイ方法を使って例１の
毛髪試料を分析した。ただしジチオトレイトール（DT
T）をジチオエリトリトール（DTE）に置き換えた。試料
をRIAによりアッセイすると、82ngをコカイン/10mgの毛
髪を示した。
毛髪試料を分析した。ただしジチオトレイトール（DT
T）をジチオエリトリトール（DTE）に置き換えた。試料
をRIAによりアッセイすると、82ngをコカイン/10mgの毛
髪を示した。
例3:硫酸第二銅の添加 毛髪試料を湯浴中で４時間消化した後、例１に記載し
たようにして調製した毛髪消化溶液1mlに10mg/mlの硫酸
第二銅溶液100μを添加した。この溶液を37℃で約30
分間振とうした後にリン酸緩衝液を添加しそしてRIAに
よりアッセイした。毛髪消化溶液100μをRIA分析にか
けると、85.0ngのコカイン（BEE）/10mgの毛髪を示し
た。
たようにして調製した毛髪消化溶液1mlに10mg/mlの硫酸
第二銅溶液100μを添加した。この溶液を37℃で約30
分間振とうした後にリン酸緩衝液を添加しそしてRIAに
よりアッセイした。毛髪消化溶液100μをRIA分析にか
けると、85.0ngのコカイン（BEE）/10mgの毛髪を示し
た。
例4:亜ヒ酸ナトリウムの添加 毛髪試料を湯浴中で４時間消化した後、例１に記載し
たようにして調製した毛髪消化溶液1mlに100mg/mlの亜
ヒ酸ナトリウム溶液100μを添加した。この溶液を37
℃にて30分間振とうした。RIAによるアッセイの前に1M
のリン酸緩衝液（pH6.5）200μを添加した。毛髪消化
溶液100μをRIA分析にかけると、82ngのコカイン（BE
E）/10mgの毛髪を示した。
たようにして調製した毛髪消化溶液1mlに100mg/mlの亜
ヒ酸ナトリウム溶液100μを添加した。この溶液を37
℃にて30分間振とうした。RIAによるアッセイの前に1M
のリン酸緩衝液（pH6.5）200μを添加した。毛髪消化
溶液100μをRIA分析にかけると、82ngのコカイン（BE
E）/10mgの毛髪を示した。
例5:ジチオトレイトール（DTT）による基質活性化 10mgの毛髪をpH9.1にて20時間の間11mgのDTTに暴露し
た。DTT溶液を除去し、そして例１に記載のDTTおよびパ
パインで置き換えた。DTTで前処理されずそして例１の
ようにして消化された対照の検体が１時間以内であるの
に比べて、この毛髪検体は10分以内に溶解した。このこ
とにより、DTTはスルフヒドリル−依存性酵素のパパイ
ンだけでなく、酵素基質である毛髪も同様に活性化する
ことが証明された。
た。DTT溶液を除去し、そして例１に記載のDTTおよびパ
パインで置き換えた。DTTで前処理されずそして例１の
ようにして消化された対照の検体が１時間以内であるの
に比べて、この毛髪検体は10分以内に溶解した。このこ
とにより、DTTはスルフヒドリル−依存性酵素のパパイ
ンだけでなく、酵素基質である毛髪も同様に活性化する
ことが証明された。
例6:プロテイナーゼＫを使った毛髪の消化および分析 コカイン常用者の疑いのある被検者から10mgの毛髪を
取り、そして水中で37℃にて60分間振とうすることによ
り洗浄した。10mlの0.05Mトリス緩衝液（pH7.0）に60mg
のジチオトレイトール（DTT）および20mgのドデシル硫
酸ナトリウム（ラウリル硫酸ナトリウム）を添加した。
溶液がpH7.0に緩衝化されたことを確かめるために溶液
のpHをチェックした。この溶液に0.5mgのプロテイナー
ゼＫ〔プロテアーゼタイプXI、Tritirachium album由
来、Sigma Chemical Co.から入手；酵素タンパク質1mg
は10−20単位の活性を有する;1単位は、37℃、pH7.5に
て１分間当り１μmol（181μｇ）のチロシンに相当する
発色をもたらすカゼインを加水分解する（Folin−Cioca
lteu試薬による発色）〕を添加した。
取り、そして水中で37℃にて60分間振とうすることによ
り洗浄した。10mlの0.05Mトリス緩衝液（pH7.0）に60mg
のジチオトレイトール（DTT）および20mgのドデシル硫
酸ナトリウム（ラウリル硫酸ナトリウム）を添加した。
溶液がpH7.0に緩衝化されたことを確かめるために溶液
のpHをチェックした。この溶液に0.5mgのプロテイナー
ゼＫ〔プロテアーゼタイプXI、Tritirachium album由
来、Sigma Chemical Co.から入手；酵素タンパク質1mg
は10−20単位の活性を有する;1単位は、37℃、pH7.5に
て１分間当り１μmol（181μｇ）のチロシンに相当する
発色をもたらすカゼインを加水分解する（Folin−Cioca
lteu試薬による発色）〕を添加した。
この溶液1mlに13×75mmのポリカーボネート試験管中
の毛髪試料10mgを添加した。この溶液を振とうしながら
37℃の湯浴中で１時間インキュベートし、次いで振とう
を止めて37℃にて一晩放置しておいた。溶解した毛髪試
料を含む溶液を2,000rpmで遠心し、メラニン顆粒を除去
した。1ccの毛髪消化溶液に100μの硫酸第二銅（10mg
/ml）を添加し、そしてこの溶液を37℃にて30分間振と
うした。次いで1Mのリン酸緩衝液（pH7.0）を添加し
た。
の毛髪試料10mgを添加した。この溶液を振とうしながら
37℃の湯浴中で１時間インキュベートし、次いで振とう
を止めて37℃にて一晩放置しておいた。溶解した毛髪試
料を含む溶液を2,000rpmで遠心し、メラニン顆粒を除去
した。1ccの毛髪消化溶液に100μの硫酸第二銅（10mg
/ml）を添加し、そしてこの溶液を37℃にて30分間振と
うした。次いで1Mのリン酸緩衝液（pH7.0）を添加し
た。
この溶液をRIAによりコカイン（ベンゾイルエクゴニ
ン等価物、またはBEE）の存在についてアッセイした。R
IA分析は31.2ngのBEE/10mgの毛髪を示した。
ン等価物、またはBEE）の存在についてアッセイした。R
IA分析は31.2ngのBEE/10mgの毛髪を示した。
例7:プロテイナーゼＫ消化のための毛髪の活性化におけ
るスルフヒドリル化合物の役割 DTTを削除したこと以外は例６に記載したのと同じ溶
液中で10mgの毛髪をインキュベートした。24時間の酵素
暴露の間に毛髪の消化が全く起こらなかった。それによ
り、基質活性化剤DTTによる毛髪試料の酵素活性化の必
要性が証明された。
るスルフヒドリル化合物の役割 DTTを削除したこと以外は例６に記載したのと同じ溶
液中で10mgの毛髪をインキュベートした。24時間の酵素
暴露の間に毛髪の消化が全く起こらなかった。それによ
り、基質活性化剤DTTによる毛髪試料の酵素活性化の必
要性が証明された。
例8:指爪の溶解 被検者から切り取った指爪試料10mgを得、そして洗剤
洗浄した。220mgのDTTを試験管中の10mlの水に添加し、
そして例１のようにpHを9.1に調整した。次に160μの
パパイン懸濁液を添加した。そしてこの溶液1.0mlを試
験管中の10mgの切り爪に加え、そして溶解するまで37℃
にて24時間振とうした。次いて上記のようにして消化溶
液をRIAにより分析した。
洗浄した。220mgのDTTを試験管中の10mlの水に添加し、
そして例１のようにpHを9.1に調整した。次に160μの
パパイン懸濁液を添加した。そしてこの溶液1.0mlを試
験管中の10mgの切り爪に加え、そして溶解するまで37℃
にて24時間振とうした。次いて上記のようにして消化溶
液をRIAにより分析した。
例9:区分分析の実施 ヘロイン常用者であると疑われる個体から長さ約6cm
の毛髪試料を得た。試料を注意深く３つの2cm切片に切
り分け、対応する切片を３本の別々の試験管に加えそし
て洗浄した。この毛髪試料を例１に記載の方法にかけ
た。ただし酵素としてパパインの代わりにキモパパイン
（EC 3.4.22.6）を使った。上記のようにして試料を一
晩振とうさせた。
の毛髪試料を得た。試料を注意深く３つの2cm切片に切
り分け、対応する切片を３本の別々の試験管に加えそし
て洗浄した。この毛髪試料を例１に記載の方法にかけ
た。ただし酵素としてパパインの代わりにキモパパイン
（EC 3.4.22.6）を使った。上記のようにして試料を一
晩振とうさせた。
RIA分析は３つの切片において、それぞれ13.5,5.7お
よび0ng/10mg毛髪のモルヒネ含量を示した。
よび0ng/10mg毛髪のモルヒネ含量を示した。
例10:消化耐性毛髪の溶解 柔軟剤で処理されている毛髪10mgを例６に記載の溶液
中で一晩インキュベートした。この毛髪試料は通常の20
時間では溶解しなかった。そこでより多い追加の量のプ
ロテイナーゼＫ、即ち1mgを、部分的に消化された試料
に添加した。試料は次の24時間内で溶解した。消化物を
遠心し、そして100μのCuSO4溶液（10mg/ml）を1mlの
上清に加え、これを37℃にて30分間振とうした。次いで
1Mのリン酸緩衝液（pH7）200μを添加した。生じた消
化物中に多量のプロテイナーゼＫがあるため、プロテイ
ナーゼ阻害剤としてエタノール中のフェニルメチルスル
ホニルクロライド20μを添加した後RIAによりアッセ
イした。
中で一晩インキュベートした。この毛髪試料は通常の20
時間では溶解しなかった。そこでより多い追加の量のプ
ロテイナーゼＫ、即ち1mgを、部分的に消化された試料
に添加した。試料は次の24時間内で溶解した。消化物を
遠心し、そして100μのCuSO4溶液（10mg/ml）を1mlの
上清に加え、これを37℃にて30分間振とうした。次いで
1Mのリン酸緩衝液（pH7）200μを添加した。生じた消
化物中に多量のプロテイナーゼＫがあるため、プロテイ
ナーゼ阻害剤としてエタノール中のフェニルメチルスル
ホニルクロライド20μを添加した後RIAによりアッセ
イした。
RIA分析は7.4ngのコカイン（BEE）/10mgの毛髪を示し
た。
た。
現在本発明の好ましい態様であると思われれものを記
載してきたが、明細書中に記載されそして特許請求の範
囲で定義されるような本発明から逸脱することなく、上
記態様において示された成分、条件および比率において
様々な変更を行い得ることは当業者にとって明らかであ
ろう。
載してきたが、明細書中に記載されそして特許請求の範
囲で定義されるような本発明から逸脱することなく、上
記態様において示された成分、条件および比率において
様々な変更を行い得ることは当業者にとって明らかであ
ろう。
Claims (7)
- 【請求項１】被検者の角質化構造物中に包埋されるよう
な被検者の血流に由来する有機分析物の分析方法であっ
て、 （ａ）角質の消化に適するプロテアーゼ、角質化構造物
の試料、ならびにジチオトレイトールおよびジチオエリ
トリトールから成る群から選択される薬剤を含んで成る
混合物を調製し； （ｂ）前記プロテアーゼが前記角質化構造物試料を少な
くとも実質的に溶解することを可能にして角質消化溶液
を形成せしめ； （ｃ）前記プロテアーゼと前記薬剤とが失活するのに十
分な時間経過させ；そして （ｄ）前記角質消化溶液の一部をイムノアッセイ法によ
る分析にかけ、存在するのであれば、前記角質化構造物
試料中の前記分析物の同定及び量を検出する； ことを含んで成る方法。 - 【請求項２】前記プロテアーゼがスルフヒドリル依存性
である、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】前記スルフヒドリル依存性プロテアーゼが
パパインである、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】前記プロテアーゼがプロテイナーゼＫであ
る、請求項１記載の方法。 - 【請求項５】前記角質化構造物が毛髪である、請求項１
記載の方法。 - 【請求項６】イムノアッセイによる分析の前に、前記薬
剤を不活性化させるために金属塩を前記角質消化溶液に
加える、請求項１記載の方法。 - 【請求項７】前記金属が銅である、請求項６記載の方
法。
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